CN108118032A - 猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒2型毒株的筛选方法，并且利用该方法筛选的毒株制备疫苗。其制备疫苗的步骤是：1)培养Vero细胞，接入猪流行性腹泻病毒；将培养物反复冻融离心，收集上清冻存备用；2)加入甲醛溶液至甲醛，摇匀后放入37℃温箱中，每隔3h摇匀一次，灭活48h；3)加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为千分之三，以中和甲醛，将中和过的病毒液抽取少许按正常接毒方式接入细胞，进行培养；4)在灭活的病毒上清液中加入灭菌剂，充分摇匀后分装，即为猪流行性腹泻病毒灭活苗。本发明所制备的灭活疫苗与现有猪流感疫苗不同，其可以免疫基因2型的猪流行性腹泻病毒，并且该疫苗可以产生较高的中和抗体，对仔猪有较强的保护作用。

Description

猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制
技术领域
本发明涉及生物疫苗领域，特别涉及猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的致病因子。PEDV一直是在东亚(包括我国)和东南亚危害养猪业最严重的几种猪病毒之一，主要以仔猪的腹泻、呕吐、脱水以及引发哺乳仔猪高致死率为主要特征，给养猪业带来了严重危害。基因1型(G1)PEDV在70年代于欧洲首次发现，随后在东亚几个养猪大国相继报道。自2010年秋以来，猪流行性腹泻病在中国大江南北爆发，造成7日龄内的仔猪死亡率高达80-100％，给养猪业带来了极大灾难，随即又在韩国、日本、泰国等亚洲国家出现。2014年，仔猪腹泻重创日本，疫情暴发当月就造成7万多头仔猪死亡。
自2013年5月起，此前从未在美国本土发现的PEDV引发美国多个猪场爆发初生仔猪腹泻及死亡，横扫从中西部到东海岸的43个州，导致10日龄以内仔猪的死亡率高达100％，仅2013年美国死亡仔猪近600万头。目前PED已经蔓延至加拿大和墨西哥。目前，该病已引起世界性的关注。
目前流行于中国与美国的PEDV同属于基因2型(G2)，而G2又可以进一步分为两个亚型，G2a和G2b；基因1型(G1)病毒则包括了PEDV的原型株CV777和早期分离的毒株及其疫苗株，同样也分为两个基因亚型G1a和G1b。G1和G2的主要差异在于S基因上的S1出现了可能的抗原变异。
目前，国内生产的PEDV灭活或弱毒疫苗是基于基因1型的，以CV777为原型的PEDV毒株；而我国目前普遍流行的是PEDV基因2型毒株。由于病毒发生变异，基于传统基因1型PEDV毒株所研制的疫苗的使用效果不佳，亟待2型毒株疫苗推出。
发明内容
本发明的目的在于猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制。
本发明所采取的技术方案是：猪流行性腹泻病毒2型毒株的筛选方法，其步骤是：
1)用PBS将猪场采集的RT-PCR诊断为阳性粪拭子重悬，离心后取重悬液上清接种T25细胞瓶培养的Vero细胞，37℃培养观察；
2)将接种粪拭子悬液后出现细胞病变的Vero细胞反复冻融3次后，离心取上清50μl，接种细胞培养皿培养的Vero细胞，37℃恒温培养，36h后用抗PEDV S1蛋白的单克隆抗体作为一抗、Alexa Flour 596标记的羊抗鼠二抗进行IFA鉴定；
3)鉴定为阳性的病毒液取上清，接种T25细胞培养瓶培养的Vero细胞；37℃恒温培养72h，细胞出现大量病变，反复冻融细胞离心取上清，-80℃保存病毒液。
优选的，判断细胞病变的方法是，细胞颗粒增多，局部细胞界线不清，继之出现含10-25个多核的融合细胞，并可见有空斑样小区，在小区中有融解的多颗粒的多核细胞，空斑区扩展，形成较大的空隙区，最后细胞开始脱落，72h后Vero细胞有合胞体出现。
优选的，IFA鉴定的标准是：细胞病变是由PEDV引起，则病变处的细胞呈现特异性的绿色荧光。
猪流行性腹泻病毒2型疫苗的制备方法，其步骤是：
1)培养Vero细胞，接入猪流行性腹泻病毒，接种后逐日观察细胞病变，当细胞出现至80％细胞病变时，收取接毒细胞；将培养物反复冻融离心，收集上清即为病毒液，冻存备用；
2)向上述制备的病毒液中无菌加入40％的甲醛溶液至甲醛终浓度为千分之三，摇匀后放入37℃温箱中，每隔3h摇匀一次，灭活48h；
3)向灭活的病毒液中加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为千分之三，以中和甲醛，将中和过的病毒液抽取少许按正常接毒方式接入细胞，进行培养，盲传三代观察应无细胞病变，同时正常病毒液对照；
4)在灭活的病毒上清液中加入灭菌剂，充分摇匀后分装，即为猪流行性腹泻病毒灭活苗。
优选的，Vero细胞长成90％单层时接入猪流行性腹泻病毒。
优选的，猪流行性腹泻病毒接入量为5％。
优选的，灭活的病毒上清液中加入的灭菌剂是氢氧化铝。
优选的，所述猪流行性腹泻病毒需经过传代培养40代。
本发明的有益效果是：本发明所制备的灭活疫苗与现有猪流感疫苗不同，其可以免疫基因2型的猪流行性腹泻病毒，并且该疫苗可以产生较高的中和抗体，对仔猪有较强的保护作用。
具体实施方式
(一)猪流行性腹泻病毒的分离与鉴定
1、病毒的分离、培养
用400μl 1×PBS将猪场采集的RT-PCR诊断为阳性粪拭子重悬，离心后取重悬液上清接种T25细胞瓶培养的Vero细胞，37℃培养观察。细胞病变的特征，首先是细胞颗粒增多，局部细胞界线不清，继之出现含10-25个多核的融合细胞，并可见有空斑样小区，在小区中有融解的多颗粒的多核细胞，空斑区逐渐扩展，形成较大的空隙区，最后细胞开始脱落。72h后Vero细胞有合胞体出现，说明有病毒感染细胞并增殖使Vero细胞产生细胞病变。
2、PEDV的IFA鉴定
将接种粪拭子悬液后出现细胞病变的Vero细胞反复冻融3次后，离心取上清50μl，接种35mm细胞培养皿培养的Vero细胞，37℃恒温培养。36h后用抗PEDV S1蛋白的单克隆抗体作为一抗、Alexa Flour 596标记的羊抗鼠二抗进行IFA鉴定。结果显示，病变处的细胞呈现特异性的绿色荧光，正常细胞无可见荧光，说明该细胞病变是由PEDV引起。
3、病毒扩繁
取初代的病毒液上清400μl，接种T25细胞培养瓶培养的Vero细胞。37℃恒温培养72h，细胞出现大量病变，反复冻融细胞离心取上清，-80℃保存病毒液。
4、病毒全基因组扩增
根据PEDV参考序列，将PEDV全长基因组序列分成8段，分别命名为F1、F2……F8，并针对该8段基因序列设计引物。
Trizol法提取病毒液中病毒基因组RNA，用设计合成的8对引物通过RT-PCR扩增PEDV全长基因组的8个片段，8个DNA片段平均大小在3.5Kb左右。分别克隆该8个DNA片段，并将阳性克隆质粒送测序以获得病毒基因组全长序列。
5、PEDV全基因组序列确定及分析
通过对PEDV全长基因组8个片段阳性质粒进行测序，并将测序结果进行拼接，获得PEDV全长基因组序列。将该PEDV全长基因组序列与Genebank上已公布PEDV序列进行比对并绘制进化树。通过分析结果可以看出，本次实验分离到的毒株归属于基因型Ⅱ型。
6、细胞传代
将分离的病毒在vero细胞上连续传代，从第1代传至第40代，观察病毒的毒价曲线，发现第40代及其后病毒毒价基本稳定，将第40代病毒液用于疫苗的制备。
7、无菌检验
按照《中国兽药典》方法对该病毒进行无菌、支原体检查，结果表明无支原体和其它微生物污染。
8、病毒滴度测定
(1)Vero细胞准备
正常培养的传代Vero细胞，在长满准备传代时，按照正常传代方法传代，配置好细胞悬液，反复吹吸均匀后，利用细胞计数器计数。在96孔板上，用移液枪每孔滴加200μL(每孔细胞数量约105)，滴加好后，放入37℃，5％C02培养箱中培养24小时后，当细胞长满至单层，准备接毒，测定毒价。
(2)滴度测定
将准备测定毒价的病毒分装小样，在EP管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1～10-10：每个EP管中加入DMEM900μL，共10管，吸取病毒液100μL，加入第1管中，振荡器混匀后，此管为10-1，再从10-1管中吸取100μL加入第2管中，振荡器混匀后，此管为10-2，再吸取100μL加入第3管中，以此类推，稀释到10-10。将稀释好的病毒接种到96孔细胞培养板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种100μL。37℃感作1h后，将病毒液弃去，加入200μL的细胞维持液，留两列作为正常细胞对照，放入培养箱培养。逐日观察并记录结果，观察7天，结果计算按Reed-Muench方法。
经测定，病毒滴度为107.2TCID50/ml。
(二)灭活疫苗的制备
1、病毒培养
复苏Vero细胞，经扩增，在Vero细胞长成90％单层时，采用5％的量接入猪流行性腹泻病毒，接种后逐日观察细胞病变(CPE)，当细胞出现至80％CPE时，收取接毒细胞。将培养物反复冻融3次后，12000r/min，4℃离心10min，收集上清即为病毒液，-80℃冻存备用。
2、病毒灭活
病毒灭活前测TCID50向上述制备的病毒液中无菌加入40％的甲醛溶液至甲醛终浓度为千分之三，摇匀后放入37℃温箱中，每隔3h摇匀一次，灭活48h。
3、病毒液的灭活检验
向灭活的病毒液中加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为千分之三，以中和甲醛，将中和过的病毒液抽取少许按正常接毒方式接入细胞，进行培养，盲传三代观察应无细胞病变，同时正常病毒液对照。
4、疫苗制备
在灭活的病毒上清液中加入灭菌的氢氧化铝胶，使其终含量为20％，充分摇匀后分装，即为猪流行性腹泻病毒氢氧化铝灭活苗。
(三)动物试验
1、灭活疫苗安全性试验
随机选择3日龄新生仔猪5头，免疫前检测血清中的PEDV抗体及抗原，均为阴性。对各头仔猪进行双倍剂量(4ml/头)进行接种，接种方式为后海穴注射。观察疫苗接种后14天内动物是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，对疫苗的安全性进行研究。具体观察新生仔猪体温、采食饮水及是否有腹泻症状。
结果显示，新生仔猪接种疫苗后，没有观察到任何临床异常，采食饮水、体温正常，没有腹泻，健康状况良好，未发现任何局部反应和全身反应。因此，猪流行性腹泻病毒灭活疫苗对新生仔猪是安全的。
2、免疫原性试验
(1)分组与免疫
将25头4周龄健康断奶仔猪分成5组，其中3组分别接种已制备的3批次灭活疫苗，剩下的两组，其中一组接种商品化灭活疫苗，另一组不接种作为对照。接种方式：将灭活苗按2ml/头的剂量，分别接种试验仔猪，接种方式为后海穴注射，2周后以同等剂量二免。分组的具体情况见下表。
分组 免疫疫苗
第一组 灭活疫苗第一批
第二组 灭活疫苗第二批
第三组 灭活疫苗第三批
第四组 商品化灭活疫苗
第五组 不接种
(2)样品采集
首免后14d、21d、28d采血，分离血清，测定血清中和抗体。血清中的中和抗体检测方法见中华人民共和国兽药典，2010年版，三部，附录，固定病毒稀释血清法。计算每组仔猪血清中中和抗体滴度的平均值。
(3)试验结果
通过对免疫仔猪进行抗体检测，结果显示：免疫了病毒灭活疫苗的第一、二、三组，首免后14d至28d，抗体迅速上升，抗体效价可达1：305、1：290、1：281，3批次疫苗抗体效价无明显差异。商品化灭活疫苗首免后28d,抗体效价达1：125，可见病毒灭活疫苗免疫后仔猪血清中平均中和抗体是商品化疫苗免疫后仔猪的2倍以上。
3、仔猪攻毒保护实验
(1)试验分组与攻毒
将上述试验仔猪，首免28d采血后，连同对照组仔猪，进行攻毒保护试验。攻毒前每头仔猪口服100IU青链霉素。攻毒方法：每头仔猪口服0.5ml病毒液(105TCID50/头)。攻毒后仔猪采用人工牛乳饲养。攻毒后观察14天，每日定时观察，记录动物发病及死亡情况。并对死亡仔猪进行剖检。
(2)攻毒结果
对死亡仔猪进行剖检，尸体消瘦、皮肤暗灰色。整个小肠肠管扩张，内容物稀薄，呈黄色、泡沫状，肠壁缺乏弹性，变薄有透明感，肠粘膜绒毛严重萎缩。呈猪流行性腹泻临床症状。
结果显示，未免疫仔猪攻毒后全部死亡，商品化灭活苗对猪流行性腹泻病毒保护率为40％，灭活疫苗三批次保护效率为100％，对猪流行性腹泻病毒2型毒株有较好的保护作用。

Claims (8)

1.猪流行性腹泻病毒2型毒株的筛选方法，其步骤是：
1)用PBS将猪场采集的RT-PCR诊断为阳性粪拭子重悬，离心后取重悬液上清接种Vero细胞，37℃培养观察；
2)将接种粪拭子悬液后出现细胞病变的Vero细胞冻融后，离心取上清，接种Vero细胞，37℃恒温培养，36h后用抗PEDV S1蛋白的单克隆抗体作为一抗、羊抗鼠二抗进行IFA鉴定；
3)鉴定为阳性的病毒液取上清，接种Vero细胞；37℃恒温培养72h，冻融细胞离心取上清，-80℃保存病毒液。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，判断细胞病变的方法是，细胞颗粒增多，局部细胞界线不清，继之出现含10-25个多核的融合细胞，并可见有空斑样小区，在小区中有融解的多颗粒的多核细胞，空斑区扩展，形成较大的空隙区，最后细胞开始脱落，72h后Vero细胞有合胞体出现。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，IFA鉴定的标准是：细胞病变是由PEDV引起，则病变处的细胞呈现特异性的绿色荧光。
4.猪流行性腹泻病毒2型疫苗的制备方法，其步骤是：
1)培养Vero细胞，接入猪流行性腹泻病毒，接种后逐日观察细胞病变，当细胞出现至80％细胞病变时，收取接毒细胞；将培养物冻融离心，收集上清即为病毒液，冻存备用；
2)向上述制备的病毒液中无菌加入40％的甲醛溶液至甲醛终浓度为千分之三，摇匀后放入37℃温箱中，每隔3h摇匀一次，灭活48h；
3)向灭活的病毒液中加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为千分之三，以中和甲醛，将中和过的病毒液接入细胞，进行培养，盲传三代观察应无细胞病变，同时正常病毒液对照；
4)在灭活的病毒上清液中加入灭菌剂，充分摇匀后分装，即为猪流行性腹泻病毒灭活苗。
5.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，Vero细胞长成90％单层时接入猪流行性腹泻病毒。
6.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，猪流行性腹泻病毒接入量为5％。
7.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，灭活的病毒上清液中加入的灭菌剂是氢氧化铝。
8.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒由权利要求1～3所述的筛选方法得到，并经过传代培养40代。
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