CN107073101A - 猪流行性腹泻病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于针对猪流行性腹泻病毒相关疾病而对猪进行防护的疫苗。所述疫苗通常包括灭活的/灭活的PEDV(例如，经化学灭活的PED病毒)、和/或重组PEDV抗原和佐剂。还提供了针对PEDV相关疾病而对猪进行防护的方法以及用于产生猪流行性腹泻病毒疫苗的方法。

Description

猪流行性腹泻病毒疫苗
序列表
本申请含有依照37C.F.R.1.821–1.825的序列表。伴随本申请的序列表以其整体援引加入本文。
发明背景
发明领域：
本发明涉及猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗(特异于美国目前地方性的分离株)，其能够减少由PEDV所引起的疾病的临床迹象。由于在小于10天大的小猪中的高死亡率(高达100％)，该疾病在美国猪产业中是经济问题。
相关技术描述：
猪流行性腹泻病毒是包膜的、正义单链RNA病毒，其在猪中引起急性腹泻、呕吐、和脱水。其首先在欧洲发现，但是在许多亚洲国家已经日益成为问题，包括韩国、中国、日本、菲律宾、和泰国。2013年四月，在美国中西部的猪中出现了PEDV，迅速在全国扩散。到2013年十月，在18个州的猪牧群中检测到了PEDV。PEDV感染在经济上的影响已经很严重。已经鉴别出PEDV的北美分离株(Huang,等人2013；Stevenson等人2013)，然而在美国还没有完全许可的疫苗可以商业购买。因此，对于能够针对PEDV相关疾病而对猪进行防护的疫苗的开发一直存在需求。开发出有效针对新兴的北美PEDV毒株将会是有利的，其能够经粘膜途径(口服或鼻内)以及肠胃外方法(例如肌肉内、皮下或静脉内)施用。
PEDV是冠状病毒亚科(Coronavirinae)的甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus)的成员(Bridgen等人1993)，并且于1971年首先在英格兰、以及随后在其他国家得到鉴别，如比利时、中国、匈牙利、意大利、日本、韩国、和泰国(Oldham J.1972；Pensaert和De BouckP.1978；Chen等人2008；Nagy等人1996；Martelli等人2008；Takahashi等人1983；Chae等人2000；和Puranaveja等人2009)。此科的其它成员包括猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、血凝性脑脊髓炎冠状病毒(PHE)、和传染性胃肠炎病毒(TGEV)。虽然PEDV和TGEV病毒相关并且临床迹象非常相似，但是却没有免疫交叉防护。
PEDV是具有大约28kb、正义、单链的RNA基因组的包膜的病毒，有5’帽和3’多聚腺苷酸化尾(Pensaert和De Bouck P.1978)。该基因组包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR、和至少七个开放阅读框(ORF)，其编码4个结构蛋白(刺突(S)、包膜(E)、膜(M)、和核衣壳(N))以及3个分结构蛋白(复制酶1a和1b以及ORF3)；这些以5’-复制酶(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’的次序安排在基因组上(Oldham J.1972；和Bridgen等人1993)。三种经表征得最早出现的北美PEDV基因组序列明尼苏达MN(GenBank:KF468752.1)、爱荷华IA1(GenBank:KF468753.1)、和爱荷华IA2(GenBank:KF468754.1)，具有28,038核苷酸(nt)的相同大小，除了聚腺苷酸尾，并与原型PEDVCV777毒株(GenBank:AF353511.1)共享基因组组织。这三种北美PEDV序列具有99.8至99.9％的核苷酸相同性。具体而言，毒株MN和IA2在整个基因组仅有11个核苷酸的差异。
PEDV的S蛋白是由1,383个氨基酸(aa)组成的I型糖蛋白。所述S蛋白基于其与其它冠状病毒S蛋白的同源性而被分为S1(1-789aa)和S2(790-1,383aa)结构域(Chang等人；2002；Cruz等人，1994；Godet等人1994；Jackwood等人2001；Sturman和Holmes；1984；和Sun等人2008)。S蛋白在冠状中是表面蛋白，其中其在以下方面发挥作用：调节与宿主细胞受体糖蛋白相互作用以介导病毒进入，以及在天然宿主中刺激中和抗体的诱导。因而S糖蛋白是开发针对PEDV的有效疫苗时的首要靶标.
PEDV的M蛋白是在病毒组装过程中发挥重要作用的最富集的包膜组分，且还诱导中和病毒的抗体。同样PEDV的N蛋白，其结合毒粒RNA为核衣壳提供结构基础，对于诱导细胞介导的免疫也重要(Saif,L.1993)。
PEDV中唯一的附加基因是ORF3。虽然附加基因一般保持在野生毒株中，但ORF3的改变被认为会影响毒力；已经使用细胞培养调适来改变ORF3基因以便降低毒力(Song等人2003)。实际上，通过对ORF3基因的研究，研究者们从2006年起已经在中国的经免疫猪牧群中对PEDV的新遗传组的出现制作了图表。这些毒株的系统发生学研究以及PDEV在中国的地理学再现已经证明了引起毁灭性的肠道疾病的那些野生毒株其ORF3在遗传上与欧洲毒株和疫苗毒株不同(Park等人2011)。
众所周知PEDV的不同毒株存在着变化水平的毒力。在1980年代和1990年代，PEDV流行遍布欧洲，其中在这些国家如比利时、英格兰、德国、法国、荷兰、和瑞士。在欧洲病例报道的频率随后逐渐变少和/或由PEDV所引起的疾病在经济上的重要性还不足以启动疫苗的商业开发(Song和Park 2012)。虽然PEDV的爆发在中国自1980年代起就有记载，但是2010年起出现的与腹泻大规模爆发相关联的PEDV变体毒株更加急性且严重。因而对疫苗开发的试验主要在亚洲国家完成(Song和Park 2012)。2010年起出现的变体据报道在哺乳小猪中有80-90％的发病率以及50-90％的死亡率(Bi等人2012；Pan等人2012；和Li等人1012)。最近的证据表明中国出现的毒性形式的PEDV可能是活疫苗毒株进化的结果(Chen等人2010)。
由于肠道疾病影响猪的肠，PEDV经排泄物-口暴露传播。受污染的卡车和设备对于幼小动物是常见的感染源。PEDV感染的临床迹象与传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染类似(Pijpers等人1993)。在三周大以及更小的猪中，可以出现最快可在PEDV感染后24小时见到的导致100％死亡率的临床迹象(包括极性水性、腹泻、呕吐、和脱水)。PEDV感染的饲养和培育猪(feeder and grower pigs)，以及母猪和公猪，可发展出腹泻和呕吐。动物也可显示出厌食症的迹象而且困倦。对于较大的猪的完全的影响还需要确定，但是饲养效率的降低、需要更多日期才上市、以及受感染动物对于继发性感染的易感性都是可能的。对于母猪，身体状况的降低可对生育表现有负面影响。据报道有迹象表明PEDV会在北美牧群中盛行，导致持续腹泻和其它攻击。
感染了PEDV的动物的肠中的总体和组织学变化在美国与在中国观察到的那些类似；基本上病毒破坏了猪肠的绒毛，从而不能吸收营养。Huang等人2012，报道了在明尼苏达和爱荷华爆发的遭受该疾病的动物具有局限于小肠的总体病理性病变，并且小肠特征为肿胀有黄色液体的薄的半透明肠壁。组织学评估反映出小肠的区域具有绒毛钝化和融合以及固有层绒毛的最小淋巴浸润。
Huang等人2013表征了美国爆发的PEDV的三种不同毒株–一个来自明尼苏达以及两个来自爱荷华，分别命名为MN(GenBank登记号:KF468752)以及IA1(GenBank登记号:KF468753)和IA2(GenBank登记号:KF48754)。Huang的系统发生学调查将PEDV毒株分组为落入两个不同遗传组，命名为遗传组1(G1)和遗传组2(G2)。刺突基因的N-末端结构域(NTD)中的显著变化区分了遗传组1和2。Huang等人2013，提出N-末端结构域(NTD)的第二缺失区(DR2)表现出具有比DR1更高程度的抗原性变化，表明新兴的北美毒株可能与G1a疫苗毒株有较低的抗原性关联。
遗传组1包括至少三种不同的聚类(cluster)1a、1b、和R。亚组1a包括早期的欧洲、中国、和韩国分离株，例如，原型CV777毒株(比利时，1978，GenBank:AF353511.1)以及毒株LZC(中国甘肃，2006；GenBank:EF185992)和SM98(韩国，1998；GenBank:GU937797.1)。亚组1b含有5种毒株-一种来自韩国(DR13减毒的疫苗毒株，GenBank:JQ023162.1)以及其它的来自中国的，其通过共同的“遗传标签”nsp3中的8-aa缺失和C-末端处的大ORF3缺失而相互关联。组“R”与其它遗传组的重组体相关。然而，新出现的PEDV毒株，包括自2010年起在中国出现的那些以及2013年起在北美出现的那些，属于遗传组G2a。中国毒株AH2012(GenBank登记号:KC210145)和北美毒株共有若干独特的核苷酸变化而一起归属于遗传组2a。毒株MN和IA2与AH2012的核苷酸相同性为99.6％，而毒株IA1与AH2012的核苷酸相同性则为99.5％。研究者推测类AH2012病毒可能传播至中国东部地区，又继而转移至美国，并且最可能是北美毒株的最接近的祖先。遗传组2a的成员与遗传组1a的原型PEDV毒株CV777仅仅具有大约96.9％的相似性(Bridgen,等人1993；Huang等人2013；GenBank:AF353511.1)。因而，在历史上的CV777衍生的G1a毒株或DR13衍生的G1b毒株基础上的减毒PEDV疫苗，可能在抗原性上与新兴的中国和北美G2a PEDV毒株相关性较低，因而可能是不佳的疫苗候选。
紧密相关的北美分离株US/Colorado/2013(GenBank登记号:KF272920.1)也由Marthaler等人，2013报道。与上文的北美分离株相似，CO/13的完整PEDV基因组与GenBank中可得的其它完整PEDV基因组有着96.5-99.5％的核苷酸相同性，其中与中国毒株AH2012(GenBank登记号KC210145)有着最高的核苷酸相同性(99.5％)。其是2a遗传组的成员。CO/13的完整基因组与PEDV参照毒株CV777的比较，证明了CO/13含有1-nt插入(在位置48处)以及5’UTR中5个核苷酸的缺失(在位置73和83至86处)。此北美病毒在S1内(基因组位置20,696和21,125处)展现出提高的多样性，具有若干插入/缺失而仅有82％的核苷酸相同性。
已经开发了若干PEDV疫苗，其在基因组序列、递送模式、和效力方面有不同。已经将欧洲CV777毒株的细胞培养调适用于PEDV已严重爆发的亚洲国家。这些自1990年代其就已经在使用。
在1980年代早期，日本的研究者从受感染猪分离了引起PED的病毒毒株83P-5。Kusanagi等人1989，分离了该毒株并将其在Vero细胞中进行了调适。经细胞培养调适的PEDV(P-5V)(83P-5)的减毒病毒疫苗自1997年起就已经在日本的母猪中使用。经100次-传代的83P-5毒株在日本经Nisseiken Co.,Ltd.许可用作减毒的PEDV疫苗(Sato等人2011)。据报道83P-5毒株的调适和减毒在S蛋白的细胞外部分显示出突变(序列与减毒的DR13毒株具有序列相似性)(Sato等人2011；参见100次传代的毒株83P-5刺突基因序列，GenBank:AB548621.1)。虽然此后者疫苗被认为是有效的，但并不是所有的母猪都能够将免疫性传给它们的小猪(Usami等人1998)。日本毒株和欧洲毒株是遗传组G1a或G1b的成员。如上文所讨论的，与新出现的遗传组2a的中国毒株相比，这些减毒的疫苗毒株与多样化的北美毒株相关性较低。
用减毒的韩国PEDV毒株(DR13(传代水平100)(GenBank:JQ023162.1)，遗传组G1b的成员)的口服疫苗已经显示出作为疫苗有效。该病毒毒株自2004年起在韩国得到许可并用作口服疫苗，而且在2011年于菲律宾登记并市售(Song和Park 2012)。然而，据报道减毒DR13并不显著改变受攻击小猪的病毒脱落期–表明免疫防护并不完全。此外，用高度减毒的PEDV口服免疫仅在很高剂量的疫苗时才赋予防护(Song和Park 2012)。
其它已知的疫苗包括PT-100(ChoongAng Vaccine Laboratories，韩国，灭活PEDV和TGEV疫苗的组合)，以及PED(灭活的PEDV疫苗)。由ChoongAng Vaccine Laboratories提供的毒株和亚型还未知。还有另外一个韩国公司Komipharm International Co.，提供了一系列灭活的、活的、以及组合疫苗，以商品名销售，其包括遗传组G1a的PEDV毒株SM98P。中国的Qilu Animal HealthProducts Factory，也在中国销售组合灭活疫苗，其含有PEDV和TGEV(其毒株和亚型未知)。
因此，需要的是特异于目前于北美盛行的分离株的PEDV疫苗，其能够减少由PEDV引起的疾病的临床迹象，并在经免疫动物中诱导防护性免疫，在经免疫动物中诱导病毒脱落(viral shedding)的减少。
发明概述
本发明提供了克服本领域中缺陷的免疫原性组合物、疫苗、以及相关方法。本发明涉及免疫原性组合物，其包括失活的/灭活的和/或重组形式的包膜(+)单链RNA病毒(猪流行性腹泻病毒，或PEDV)。具体而言，本申请提供了用于针对PEDV北美分离株相关疾病而对猪提供防护的疫苗。本发明的PEDV分离株BI1251-125-10(本文称作“125-10”)(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:15)是有毒性的北美RNA病毒毒株，其具有与遗传组2a经报道的其它北美PEDV类似的遗传谱。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包含失活的/灭活的PEDV(例如，化学灭活的PEDV分离株125-10(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:15))并且通常还包括佐剂。所述疫苗还可以包括其它组分，如防腐剂、抗微生物剂、稳定剂(例如可提高疫苗保存期的稳定剂、乳剂、以及针对其它猪病原体的抗原。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包含刺突抗原，其在一个非限制性的实例中于昆虫细胞中经重组杆状病毒表达，所述重组杆状病毒表达改造的PEDV刺突蛋白(例如，编码氨基酸序列(SEQ ID NO:9)的改造的刺突核酸序列(SEQ ID NO:8))，以及通常还包括佐剂。所述疫苗还可包括其它组分，如防腐剂、稳定剂、和针对其它猪病原体的抗原。
适宜用于本发明的优选刺突核酸序列是编码刺突多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2、6、8、和/或13具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％，更优选至少90％、91％、92％、93％、和94％，最优选至少95％、96％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％，99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.99％的序列相同性。如本文所用，应特别理解术语“序列与SEQ ID NO:X相同”或者“相同的SEQ ID NO:X”分别等价于术语“与SEQ ID NO:X的序列在SEQ ID NO:X的长度上的序列相同性”或者“与SEQ ID NO:X的序列在SEQ ID NO:X的长度上相同”，其中在此背景下“X”是选自1、2、6，8、13和15的任何整数。
适宜用于本发明的优选刺突多肽具有SEQ ID NO:3、7、9和/或14中所示序列的多肽，与SEQ ID NO:3、7、9和/或14具有至少80％的同源性，例如与SEQ ID NO:3、7、9和/或14具有至少85％的同源性，如与SEQ ID NO:3、7、9和/或14具有至少85％的同源性，如与SEQID NO:3、7、9和/或14具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:3、7、9和/或14具有至少95％、至少98％或至少99％的同源性。
术语“疫苗”和“免疫原性组合物”在本文中广义地定义为是指可施用形式的任何类型的生物物质，其能够在接种了该疫苗的动物中刺激免疫应答。疫苗一般而言可以基于病毒本身(例如灭活的/失活的或减毒的)或者病毒的免疫原性(抗原性)组分。在本发明一个实施方案中，所述疫苗(免疫原性组合物)优选包括灭活的/失活形式的病毒物质、或者作为亚单位疫苗存在的病毒的抗原性部分。在本文中，术语“防护”当与疫苗关联使用时，是指与所讨论的疾病或病症相关联的任何症状的改善(部分或完全)。因而，由本发明疫苗的PEDV对猪进行防护一般会导致病毒脱落和/或一或多种与PEDV感染相关联的临床症状(例如急性水性腹泻、急性呕吐、脱水、厌食症、困倦、抑郁、和高死亡率(在低于10天大的小猪中))的减少。
本领域技术人员会理解本文所使用的组合物可以掺入已知可注射的、生理学可接受的无菌溶液。为制备随时可用的肠胃外注射或灌注溶液，水成等渗溶液，例如盐水或血浆蛋白溶液，是轻易可得的。另外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可包括兽医可接受的载剂、稀释剂、等渗剂、稳定剂、或佐剂。
本发明的方法包括但不限于，在对象中激发针对PEDV感染的免疫应答的方法，包括向所述对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含失活的/灭活的PEDV、减毒的PEDV、和/或刺突抗原。优选地，所述免疫应答针对超过一种PEDV的血清型、或毒株而激发。本发明的组合物可用于防止PEDV感染。优选地，此种免疫应答降低一或多种临床迹象的发生率或严重性，所述临床迹象是与一或多种PEDV血清型的感染相关或由其所引起的。
在本文中，本发明的组合物可以施用的适宜的对象或有需要的对象包括有需要对病毒相关的感染、疾病、或病症进行预防性治疗的动物。通过使用本发明的组合物或方法而在其中刺激免疫应答的动物包括家畜如猪、牛、家禽(例如，鸡、鸭、鹅、或火鸡)、山羊、和绵羊，以及家庭动物如小鼠、兔、狗、猫、和马。优选的动物包括猪类、鼠类、马类、兔类、和牛类。最优选地，在猪中刺激免疫应答。
本发明还提供了降低与PEDV感染相关联的或由其所引起的一或多种临床迹象的发生率或严重性的方法，包括施用本发明的免疫原性组合物的步骤，其包含失活的/灭活的PEDV疫苗和/或组合有本文提供的刺突抗原以及优选的载剂分子，从而使PEDV感染的临床迹象的发生率和严重性，与未施用本文提供的免疫原性组合物的对象相比，降低至少10％、优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少50％、更优选至少70％、最优选100％。此类临床迹象包括水性腹泻、呕吐、和脱水。任何这些临床迹象可缘于PEDV(具有遗传组2a或者任何其它PEDV遗传组包括G1a、G1b、或G2b)的感染。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括PEDV经化学灭活的形式。特别期望包括化学灭活的PEDV(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15)病毒的疫苗。可以使用本领域技术人员已知的许多化学灭活剂来将病毒灭活。乙烯亚胺以及相关衍生物，如二乙烯亚胺(“BEI”)和乙酰乙烯亚胺，是用于将PED病毒灭活的适宜化学灭活剂的实例。其它化学灭活剂，例如，β-丙内酯或醛类(如甲醛和戊二醛)，也可以用于灭活病毒。
本发明的免疫原性组合物和/或疫苗一般包括期望可具有生物粘附性质的佐剂，特别是当病毒被设计为能够在鼻内施用时。适宜的佐剂的实例包括交联的烯式不饱和羧酸聚合物，如交联的丙烯酸聚合物。如本文所用术语“交联的丙烯酸聚合物”是指从单体混合物(包括丙烯酸作为混合物中主要单体)所形成的聚合物和共聚物。适宜的交联丙烯酸聚合物的实例包括以商品名934P和971市售的那些(可得自B.F.Goodrich Co.，克里夫兰，俄亥俄州)。用于本发明疫苗的一种特别事宜的佐剂是交联的丙烯酸聚合物，其具有不超过约20,000cPs(于20rpm作为pH 7.5 1.0wt.％的水溶液进行测量)的布鲁克菲尔德粘度(Brookfield viscosity)。当期望有生物粘附佐剂时，有利的时可使用具有至少大约50达因/cm2的生物粘附性质(在两片新鲜切除的兔胃组织之间测量，通过美国专利号4,615,697中所述的程序来确定)的佐剂。
本发明还涉及对对象进行免疫的方法，包括向对象施用本文所描述的任何免疫原性组合物。
术语"免疫"涉及通过向待免疫对象施用免疫原性组合物而进行的主动免疫，由此引起针对此免疫原性组合物中所包括的抗原的免疫学应答。
优选地，免疫导致牧群中特定PEDV感染发生率的减少，或者导致由特定PEDV感染所引起的或与其相关的临床迹象严重性的降低。
另外，对于需要本文所提供的免疫原性组合物的对象进行的免疫，导致防止对象受PEDV感染的侵袭。更优选地，免疫导致有效的、长效的、针对PEDV感染的免疫学应答。应理解所述时间段将持续超过2个月、优选超过3个月、更优选超过4个月、更优选超过5个月、更优选超过6个月。应理解免疫可能并不是在所有经免疫的对象中都有效。
优选地，此背景所面对的是这样的对象的牧群，其正常情况下(也即没有免疫)，会发展出正常会由PEDV感染引起或与其相关的临床迹象。对象的牧群是否经有效免疫可以由本领域技术人员不经过多的劳动来进行确定。优选地，如果在至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、更优选至少95％以及最优选100％的给定牧群的对象中，与没有接受免疫的或者接受了本发明之前可用的免疫原性组合物免疫的对象(但随后受到特定PEDV的感染)相比，临床迹象的发生率或严重性减少了至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％以及最优选100％，则免疫是有效的。
用于在有需要的对象中防止PEDV所引起的临床迹象的方法，或者用于针对PEDV相关疾病而对猪进行防护的方法，包括向猪施用含有失活的/灭活的PEDV和/或刺突抗原的免疫原性组合物和/或疫苗。所述疫苗可使用许多方法来进行施用，包括鼻内、口服和/或肠胃外(例如肌肉内)施用。在所述方法的一个实施方案中，例如，将含有灭活PEDV的疫苗肌肉内施用一或多次(例如，以2-4周的间隔)。在所述方法另一实施方案中，例如，将含有灭活PEDV的疫苗口服施用一或多次(例如，以2-4周的间隔)。在另外的实施方案中，口服施用可以随后是和/或先于至少一次肌肉内施用(例如，肠胃外施用疫苗之后和/或之前2-4周)。理想地，给定牧群中的所有猪都以规定的间隔进行了疫苗接种，以便防止疾病症状的扩散。
还提供了产生失活的/灭活的PEDV疫苗的方法。所述方法通常包括用PED病毒来接种类人猿细胞，例如，用PED病毒SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15。将经接种的类人猿细胞温育，一般至少是直至观察到CPE(通常是在37℃24至120小时)，继而再从经温育的细胞收获PED病毒(例如，通过倒出并过滤培养液)。所收获的含病毒液体可以用化学灭活剂来处理，如二乙烯亚胺，以形成失活的/灭活的PED病毒。通常，灭活的病毒经进一步加工，例如，通过浓缩以及与其它组分混合，来产生商业制剂。例如，含有灭活病毒的液体可以经浓缩并与佐剂和/或针对一或多种其它猪病原体的抗原混合。
还提供了产生重组表达的刺突抗原疫苗的方法，其中是经表达改造的PEDV刺突蛋白的重组杆状病毒在昆虫细胞中产生的。一个示例性实施方案中的方法包括将PEDV刺突编码序列(SEQ ID NO:7)(经改造以去除PEDV刺突的信号肽、跨膜结构域、和c-末端结构域)克隆至载体中(VSVG-PEDVS-VSVG DNA序列(SEQ ID NO:8))，并共转染Sf9昆虫细胞。对于灭活的重组PEDV材料，用5mM BEI将PEDV杆状病毒收集物灭活24小时，澄清并经0.45μm过滤。通常，灭活的病毒经进一步加工，例如，通过浓缩以及与其它组分混合，来产生商业制剂。例如，含有灭活病毒的液体可以经浓缩并与佐剂和/或针对一或多种其它猪病原体的抗原混合.
本申请还涉及试剂盒，其包括组合：(1)能够将疫苗施用给猪的分配器；和(2)含有化学灭活的PEDV和/或重组刺突抗原的疫苗(能够针对PEDV相关疾病提供防护)。所述试剂盒可包括分配器(其能够将其内含物分配为小滴，例如，作为气雾、喷雾和/或液体小滴)，以及疫苗形式(其能够针对PEDV相关疾病提供防护，例如当鼻内和/或肌肉内施用时)。
在本申请全文中，文字是指本发明组合物和/或相关方法的各种实施例。所描述的各种实施方案是要提供许多说明性的实例，而不应理解为供选择的种类。而是，应当注意本文提供的对各种实施方案的描述可具有重叠的范围。本文所讨论的实施方案仅仅是说明性的而不是要对本发明的范围进行限定。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且包括其是用于进一步说明本发明的特定方面。通过参考一或多个这些附图，结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1PEDV1251-125-10(125-10)基因组(SEQ ID NO:1)和最接近的中国PEDV毒株AH2012(GenBank登记号:KC210145)(SEQ ID NO:10)的DNA比对。
图2PEDV1251-125-10(125-10)基因组(SEQ ID NO:1)与最接近的北美PEDV毒株Colorado 2013(GenBank登记号:KF272920)(SEQ ID NO:11)的DNA比对。
图3经比对的PEDV1251-125-10(125-10)刺突蛋白(SEQ ID NO:14)和对应于北美Colorado毒株的最接近的GenBank序列(GenBank登记号:AGO58924)(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列比对。
图4抗-PEDV-IgG ELISA数据的图示(D-1、14、28和49的组最小均方±标准误差抗-PEDV-IgG S:P比例)。
图5抗-PEDV-IgA ELISA数据的图示(D-1、14、28和49的组最小均方±标准误差抗-PEDV-IgA S:P比例)。
发明详述
本发明提供了免疫原性组合物，其包括失活的/灭活的形式的PEDV和/或重组表达的PEDV-刺突抗原。所述疫苗设计为用于针对PEDV相关疾病而猪进行防护。所述疫苗通常包括经化学灭活形式的PEDV，而包括经化学失活的/灭活的PEDV病毒的那些是特别期望的。在另一实施方案中，所述疫苗包括重组表达的刺突抗原，其例如在昆虫细胞中经过重组杆状病毒(表达经改造的PEDV刺突蛋白)而生成。
本发明的一个实施方案可以是包含一或多种PEDV基因型2a的抗原的疫苗。在优选的实施方案中，PEDV是北美来源的。更优选地，北美基因型的PEDV是任何这样的PEDV：由SEQID NO:1编码的、或包含序列SEQ ID NO:1的序列的、和/或包含SEQ ID NO:1的RNA等价物的；其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同、和/或与SEQ ID NO:1的RNA等价物至少99％相同；其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码；由SEQ ID NO:15所编码的；或者其序列与SEQ IDNO:15至少99％相同。
在本发明另外的实施方案中，所述疫苗是重组疫苗或灭活疫苗。在本发明示例性的实施方案中，PEDV经化学灭活，例如通过用化学灭活剂来处理，所述化学灭活剂包括选自以下组的化合物：乙烯亚胺、二乙烯亚胺、乙酰乙烯亚胺以及其混合物。在优选的实施方案中，PEDV通过用二乙烯亚胺处理而被化学灭活。
在本发明另外的实施方案中，所述疫苗还包含佐剂。在优选的实施方案中，所述佐剂是基于的水包油乳剂。
在本发明一个实施方案中，所述疫苗是重组疫苗。在优选的实施方案中，该重组疫苗包含选自以下组的一或多种免疫原性组分：编码PEDV刺突蛋白的分离核酸，其中重组刺突多肽与SEQ ID NO:3、7、9或14具有至少90％的同源性；包含a)的分离核酸的载体；由a)的核酸所编码的重组PEDV刺突蛋白；和/或其任意组合。任选地，该重组疫苗包含药物可接受的载剂和/或赋形剂。在一个实施方案中所述赋形剂是一或多种佐剂。优选地，所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
在本发明的另一方面，所述重组疫苗还包含一或多种额外的抗原，例如，所述额外的抗原可以是PEDV的结构蛋白M、E、或N。
在另一实施方案中，所述重组疫苗包含免疫原性组分，其可以是分离的核酸、载体、重组的PEDV刺突蛋白、和/或后者中至少两种的组合。
本发明的实施方案还包括用于防止临床迹象和/或用于针对PEDV相关疾病而对猪进行防护的方法，包括向该猪施用本文所述的任何灭活的/失活的和/或重组疫苗。例如，所施用疫苗包含基因型2a的PEDV的一或多种抗原。在优选的实施方案中，PEDV是北美来源的。更优选地，北美基因型的PEDV是由SEQ ID NO:1的序列编码的或者包含SEQ ID NO:1的序列的任何PEDV；其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同；其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；和/或其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码。
在另一实施方案中，所述方法包括施用包含一或多种免疫原性组分的疫苗，所述一或多种免疫原性组分是选自以下组的PEDV：由SEQ ID NO:1所编码的、或包含SEQ ID NO:1的序列、和/或包含RNA等价物(SEQ ID NO:16)；其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同、和/或与RNA等价物(SEQ ID NO:15)至少99％相同；其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码；由SEQ ID NO:15所编码的；或其序列与SEQ ID NO:15至少99％相同。
在另一实施方案中，所述方法包括施用包含一或多种免疫原性组分的疫苗，所述一或多种免疫原性组分选自以下组：编码PEDV刺突蛋白的分离核酸，其中重组刺突多肽与SEQ ID NO:3、7、9或14具有至少90％的同源性；包含a)的分离核酸的载体；由a)的核酸所编码的重组PEDV刺突蛋白；和其任意组合。
本发明的另一实施方案包括用于针对PEDV相关疾病的猪进行疫苗接种的试剂盒，其包含：能够将疫苗施用给猪的分配器；和如本文所描述的PEDV疫苗。
本发明的实施方案包括用于产生权利要求5的猪流行性腹泻疫苗的方法，包括：(a)用PEDV接种类人猿细胞；(b)温育所述经接种的类人猿细胞；(c)从所述经温育的细胞收集PEDV；和(d)用化学灭活剂处理所收集的细胞(优选用选自以下组的化合物：乙烯亚胺、二乙烯亚胺、乙酰乙烯亚胺或其混合物)，以形成灭活的PEDV疫苗。在优选的实施方案中，所述方法包括这样的PEDV：包含由SEQ ID NO:1所编码的序列、或包含SEQ ID NO:1的序列、和/或包含SEQ ID NO:1的RNA等价物的；其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同、和/或与SEQ IDNO:1的RNA等价物至少99％相同；其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码；由SEQ ID NO:15所编码的；或其序列与SEQ ID NO:15至少99％相同。
在一个实施方案中，所述方法包括包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:15的遗传组2a的PEDV。在所述方法另外的实施方案中，经接种的类人猿细胞是Vero细胞。在所述方法优选的实施方案中，所述化学灭活剂包括二乙烯亚胺。所述方法可还包含将佐剂添加至PEDV疫苗，优选地，所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
本发明的另一实施方案包括产生重组疫苗的方法，包括：在宿主细胞中表达PEDV的一或多种抗原；和从表达PEDV的细胞收集一或多种抗原。在一个此种实施方案中，所述方法可包括一或多种包含编码PEDV刺突蛋白的分离核酸的抗原，其中重组刺突多肽与SEQ IDNO:3、7、9或14具有至少90％的同源性；包含a)的分离核酸的载体；由a)的核酸所编码的重组PEDV刺突蛋白；和其任意组合。在一个示例性实施方案中，PEDV的一或多种抗原由重组杆状病毒载体表达。所述方法可包括在昆虫细胞中表达的PEDV的一或多种抗原。一个实施方案还包含将佐剂添加至PEDV疫苗，优选其中所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
以更广义的术语，许多本领域技术人员已知的化学灭活剂可用于灭活病毒。乙烯亚胺以及相关衍生物，如二乙烯亚胺(BEI)和乙酰乙烯亚胺，是用于灭活PED病毒的适宜化学灭活剂的实例。其它化学灭活剂，例如β-丙内酯、醛类(如甲醛)和/或洗涤剂(例如，洗涤剂、X、或烷基三甲基铵盐)也可用于灭活病毒。灭活可以用本领域技术人员已知的标准方法来进行。可以在周期性的时间间隔取样品并测定其残余活病毒。在适宜的细胞系上监测细胞病理效应和/或用适宜的单克隆或多克隆抗体进行荧光染色，可用于监测残余活病毒的存在。
用BEI灭活可以通过将母液BEI溶液(例如，通过将0.1-0.2M 2-溴-乙胺氢溴酸盐添加至0.1-0.2N的水成NaOH而形成的溶液)与病毒液混合至大约1-5mM BEI的终浓度来实现。通常是通过将BEI-病毒混合物保持在35-40℃(例如37℃)持续混合24-72小时来进行灭活。可以通过添加硫代硫酸钠溶液至超过BEI浓度的终浓度(例如以BEI体积的17％添加硫代硫酸钠，以中和过量的BEI)随后进行混合，从而使病毒灭活停止。
本发明的免疫原性组合物通常包括佐剂，以及如果需要则包括一或多种乳化剂如洗涤剂，掺入至失活的/灭活的PEDV。适宜的佐剂包括，例如，维生素E醋酸酯增溶物、氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、(矿物)油乳剂、非离子洗涤剂、角鲨烯和皂苷类。其它可使用的佐剂包括基于油的佐剂如弗氏完全佐剂(FCA)、和弗氏不完全佐剂(FIA)。据发现交联的烯式不饱和羧酸聚合物，如971聚合物，是用于本发明灭活的PEDV免疫原性组合物的特别适宜的佐剂。
适宜的水包油乳剂的实例有基于的佐剂，如(水包油乳剂)、具有溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)的(水包油))、具有专有免疫刺激剂的(水包油))、具有交联的聚合物的(水包油构成的双佐剂))、和(无动物来源组分的水包油乳剂)(MVP Technologies,Inc.Omaha,Nebr.,USA)。包含灭活的PEDV或重组PEDV蛋白的药物/疫苗组合物，已经用水包油乳剂有效地佐剂化，优选是用此类基于的佐剂、更优选是用(无动物来源组分的水包油乳剂)和(无动物来源组分的水包油乳剂)。
一般而言有利的是将本发明的组合物配制为剂量单位的形式，以方便施用以及剂量的一致性。剂量单位的形式如本文所用是指物理上分离的单位，适合作为单位剂量用于待治疗的哺乳动物对象；每个单位含有预先确定的量的活性材料(经计算可产生期望的治疗效果)结合所需的药物载剂。剂量单位形式的失活的/灭活的PEDV和/或重组表达的PEDV抗原的规格由以下因素规定以及取决于以下因素，其中有：(a)所述活性材料的独特特征和所要实现的特定治疗效果；(b)混合此种用于治疗疾病的活性材料的技术中固有的限制；和(c)要施用所述剂量单位形式的方式。
主要的活性成分通常与适宜的药物可接受的载剂进行混合，以方便地且有效地以有效量施用(以本文所公开的剂量单位的形式)。剂量单位形式可例如含有范围在1至大约5个相对功效单位(“RPU”)的量的PEDV抗原。抗原的此种量一般存在于从大约1至大约25/ml的载剂中。在含有补充活性成分的组合物的情形中，剂量是通过参照所述补充活性成分通常的剂量以及施用方式来确定的。
本发明的疫苗通常包括与药物可接受的载剂配制的灭活PEDV。适宜于可注射用途的药物形式通常包括无菌水成溶液(当水可溶时)或分散液以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。期望所述制剂应当是无菌的并且是液体(达到存在容易的注射性的程度)。剂量形式应当在制造和储存条件下稳定，并且通常针对微生物如细菌和真菌的污染作用而进行了防腐。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其适宜的混合物以及植物油。一种可能的载剂为生理盐溶液。可以通过例如使用包被如卵磷脂、通过保持所需要的颗粒大小(若是分散液的情况)、以及通过使用表面活性剂，来保持溶液适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，以带来对于微生物作用的预防，例如，对羟苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠)、新霉素(deomycin)、庆大霉素等等。在许多情况下，可优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。如果需要的话，可以通过在组合物中使用延缓吸收的物质，以带来对可注射组合物延长的吸收，例如，使用单硬脂酸铝和明胶。
可以通过将灭活的病毒以期望的量掺入至适宜的溶剂(根据需要具有上文列数的各种其它成分)中来制备无菌可注射溶液，随后进行过滤灭菌。一般而言，可以通过将各种活性成分掺入至无菌载剂(其含有基本分散介质和上文列举的那些中的所需成分)中来制备分散液。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其产生活性成分的粉末外加任何另外的期望成分(来自其此前经无菌过滤的溶液)。
还可以有利地将稳定剂添加至本发明的组合物以改善灭活病毒的稳定性。适宜的稳定剂包括，例如甘油/EDTA、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白质(如白蛋白或或酪蛋白)、以及蛋白降解产物(例如部分水解的明胶)。如果需要的话，制剂可以通过本领域已知的方法来进行缓冲，其中使用试剂如碱性金属磷酸盐，例如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾和/或磷酸二氢钾。其它试剂，如乙醇或丙二醇，可用于提高疫苗制剂中成分的可溶性和/或溶液的稳定性。可用于本发明制剂的另外的添加剂包括常规的抗氧化剂和常规的螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。
本发明的组合物和方法可通过以下实施例来进行说明，给出其是用于说明本发明以及有助于教导本领域技术人员如何制备和使用本发明。这些实施例不是要以任何方式来缩窄或者限制本发明的范围。
本发明的实践将会利用，除非另有明示，常规的分子生物学技术、微生物学技术、重组DNA技术、蛋白化学和免疫学，其在本领域技术人员的能力范围之内。此类技术在文献中有完整的解。参见例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Vols.I,II and III,Second Edition(1989)；DNA Cloning,Vols.Iand II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Animal CellCulture(R.K.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986)；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series,Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Proteinpurification methods-a practical approach(E.L.V.Harris and S.Angal,eds.,IRLPress at Oxford University Press)；以及Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell eds.,1986,Blackwell ScientificPublications)。
需要理解的是此发明并不局限于特定的DNA、RNA、多肽序列、或过程参数，因为其当然会发生变化。还应理解本文所使用的术语仅用于描述本发明特定实施方案的目的，而并不是要进行限定。必须要注意的是，如本说明书以及所附权利要求中所用，单数形式的"a"、"an"和"the"包括其复数参照，除非上下文另有清楚明示。因而，例如，提到"抗原"包括两种或更多种抗原的混合物；提到"赋形剂"包括一或多种赋形剂的混合物，等等。
定义:
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语具有本发明提交时所属领域内技术人员通常所理解的相同含义。术语的含义和范围应当是清楚的；然而，如果有任何潜在歧义的情况，本文提供的定义优先于任何字典的或外部的定义。另外，除非上下文另有要求，单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。在本文中，使用“或”意味着“和/或”除非另有陈述。另外，使用术语“包括”，以及其它形式如“包含”和“含有”并不是限制性的。本文提到的所有专利和出版物援引加入本文。
“针对疾病的防护(预防)”、“防护性免疫”、“功能性免疫”以及类似的表述意指通过施用一或多种本发明的治疗性组合物、或其组合而产生的针对疾病或病症的应答，其导致与暴露于疾病或感染的未受免疫对象中预期的相比更少的有害作用。也就是说，感染的有害作用的严重性在经疫苗接种的对象中减轻。感染在经疫苗接种的对象中可以被减少、延缓、或者可能得以完全防止(预防)。在本文中，当要意指完全感染时，会明确提到。如果未提到完全防止感染，则该术语包括部分防止。
在本文中，“临床迹象发生率和/或严重性的降低”或“临床症状的减少”意指但却不限于，减少组中受感染对象的数目、减少或消除展现感染临床迹象的对象的数目、或者降低一或多个对象中出现的任何临床迹象的严重性(与野生型感染相比)。例如，其应该是指任何病原体负载的减少、病原体脱落的减少、病原体传播的减少、或PEDV的任何临床迹象症状的减少。优选这些临床迹象在一或多个接受本发明治疗组合物的对象中减少了至少10％(相较于未接受所述组合物且受感染的对象)。更优选临床迹象在接受本发明治疗组合物的对象中减少了至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、以及更优选至少50％。
术语“提高的防护”在本文中意指但却不限于，在经疫苗接种的对象组中对比未经疫苗接种的对象对照组中，与感染性物质(优选PEDV)相关的一或多种临床症状分别有统计学的显著减少。术语“临床症状的统计学显著减少”意指但却不限于，在受感染性物质攻击之后，经疫苗接种的对象组中至少一种临床症状的发生频率，比未经疫苗接种的对照组相比，至少低10％、优选20％、更优选30％、更优选50％、以及更优选70％。
“长效防护”应当是指持续至少3周的“改善的效力”，但更优选至少3个月、更优选至少6个月。在家畜的情况中，最优选所述长效防护应当持续直至动物上市卖肉的平均年龄。
“免疫原性或免疫学组合物”是指物质的组合物，包含至少一种猪流行性腹泻病毒、或其免疫原性部分，其在宿主中诱发免疫学应答(对所述组合物的细胞或抗体介导的免疫应答)。在本发明优选的实施方案中，免疫原性组合物诱导免疫应答，以及更优选地，赋予针对PEDV感染的一或多种临床迹象的防护性免疫。
如本文所用的免疫原性组合物还是指，包含本文所描述的任何PEDV刺突蛋白的组合物。根据另外的实施方案，此类免疫原性组合物还包含表达所述PEDV刺突蛋白的病毒载体的至少一部分(优选重组杆状病毒)。此外，所述免疫原性组合物可包含i)上文所述的任何PEDV蛋白，优选以上文所述的浓度，ii)表达所述PEDV刺突蛋白的病毒载体的至少一部分(优选重组杆状病毒)，和iii)一部分细胞培养上清。
因而根据一个方面，本发明涉及在猪牧群中降低PEDV感染百分比的方法，包括向所述猪施用有效量的PEDV刺突抗原或包含PEDV抗原的免疫原性组合物的步骤，其中所述PEDV抗原是重组PEDV刺突抗原，优选表达PEDV刺突蛋白的杆状病毒。优选这些重组或杆状病毒表达具有如本文所述序列的PEDV刺突。
"免疫应答"或“免疫学应答”意指但却不限于，发展出针对感兴趣组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫或免疫学应答包括但不限于，一或多种以下效应：针对感兴趣组合物或疫苗中包括的抗原多个抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒T细胞的产生或激活。优选地，宿主将展示出治疗性或防护性免疫学(记忆)应答，从而将会增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。此种防护将会通过以下来证明：症状数目的减少、症状严重性的降低、或与病原体感染相关的一或多种症状的缺乏、病毒血症发作的延迟、病毒持续性的降低、整体病毒负载的降低和/或病毒排出的减少。
如本文所用，“药物或兽医学接受的载剂”包括任何的或者所有的溶剂、分散介质、包被、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、坑细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸附延缓剂，等等。在一些优选的实施方案中，以及特别是包括冻干的免疫原性组合物的那些，用于本发明的稳定剂包括用于冻干或者冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。“佐剂”如本文所用，可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷类，例如Quil A，QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)，GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham，AL)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂.
所述乳剂可以具体地基于轻液体石蜡油(欧洲药典(European Pharmacopea)类型)；类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯；得自烯烃(特别是异丁烯或癸烯)的寡聚化的油；含有线性烃基的酸或者醇的酯，更特别是植物油，油酸乙酯，丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)，甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分枝的脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。所述油与乳化剂组合使用以形成乳剂。所述乳化剂优选是非离子表面活性剂，特别是山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(例如脱水甘露醇油酸酯)、乙二醇的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯、和油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟硬脂酸的酯，其任选经乙氧基化的，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物区块，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter等人TheTheory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley and Sons,NY,pp51-94(1995)和Todd等人Vaccine 15:564-570(1997)。示例性的佐剂有在“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”edited byM.Powell and M.Newman,Plenum Press,1995中的147页描述的SPT乳剂，以及同一本书中183页描述的乳剂MF59。
适宜的水包油乳剂的实例有基于的佐剂，如(水包油乳剂o/w)，(具有溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)的水包油(o/w))，(具有专有免疫刺激剂的水包油(o/w))，(由水包油(o/w)与交联的聚合物构成的双佐剂)，和(无动物来源组分的水包油乳剂)(MVP Laboratories，Inc。Omaha，Nebr.，USA)。包含灭活的PEDV或重组PEDV蛋白的药物/疫苗组合物，已经用水包油乳剂有效佐剂化，优选用此类基于的佐剂，更优选用(水包油乳剂o/w)和/或(无动物来源组分的水包油乳剂)。
用于兽医疫苗的适宜的吸附氢氧化铝凝胶的实例包括REHYDRAGEL-LV；REHYDRAGEL-HPA；REHYDRAPHOS(General Chemical,Berkeley Heights,New Jersey,USA)。
佐剂另外的例子有选自丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物和马来酸酐和链烯烃衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂混合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其是经交联的(尤其是与糖或聚醇的聚链烯基醚)。这些化合物已知为术语卡波姆(Phameuropa Vol.8，No.2，June 1996)。本领域技术人员还可参见美国专利号2,909,462，其描述了此类丙烯酸聚合物，与具有至少3个羟基(优选不超过8个)的多羟基化化合物交联，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪烃基取代。优选的是含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基类，烯丙基类和其它乙烯不饱和基团。不饱和基团本身可含有其它取代，如甲基。以CARBOPOL.RTM的名称出售的产品(也已知为聚丙烯酸)；(BF Goodrich，Ohio，USA)是特别适宜的。它们与烯丙基蔗糖交联或与烯丙基季戊四醇交联。其中，可以提到的有CARBOPOL.RTM.974P(也已知为聚丙烯酸)，CARBOPOL.RTM.934P(也已知为聚丙烯酸)和CARBOPOL.RTM.971P(也已知为聚丙烯酸)。最优选的是使用CARBOPOL.RTM.971P(也已知为聚丙烯酸)。在马来酸酐合链烯烃衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)其是马来酸酐和的乙烯共聚物。这些聚合物在水中溶解导致酸溶液，其将会被中和至优选生理pH，以便提供佐剂溶液(免疫原性、免疫学或疫苗组合物将会掺入其中)。
其它适宜的佐剂包括但不限于，RIBI佐剂体系(Ribi Inc.)、Block共聚合物(CytRx，Atlanta Ga.)、SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)、单磷酰基脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素(重组的或者其它的)、霍乱毒素、或胞壁酰二肽等。
预期可以每剂量大约100μg至大约10mg的量来添加佐剂，优选每剂量大约100μg至大约10mg的量，更优选每剂量大约500μg至大约5mg的量，更优选每剂量大约750μg至大约2.5mg的量，以及最优选每剂量大约1mg的量。或者，佐剂浓度可以为大约0.01至50％，优选浓度为大约2％至30％，更优选浓度为大约5％至25％，更优选浓度为大约7％至22％，以及最优选浓度为大约10％至20％(基于最终产物的体积)。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油，等等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇、和乳糖，等等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱性盐，等等。
“分离的”意指“通过人工之手”从其天然状态改变，也即如果其在自然中发生，其已经从其原始环境中改变或者移出，或者二者都发生。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态共存在的材料分开的同样的多核苷酸或多肽是“分离的”，如该术语本文所用。
“安全性”是指疫苗接种后在经接种的动物中不利后果的缺乏，包括但不限于：基于病毒的疫苗潜在的回变为有毒力，临床上显著的副作用如持续的、全身性病态或者在疫苗施用位点处不可接受的炎症。
术语“疫苗接种”或“接种疫苗”或者其变体，如本文所用意指但却不限于，包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，当将其施用至动物时，会在动物中激发、或者能够激发(直接地或间接地)针对PEDV的免疫应答。
“死亡率”，在本发明的背景下，是指由PEDV感染所引起的死亡，并且包括当感染非常严重以至于要将动物处死以避免其受罪并为其生命提供人道的终止这样的情形。
在本文中，“有效剂量”意指但却不限于，激发、或能够激发免疫应答的抗原的量，所述免疫应答在抗原所施用的动物中产生临床症状的减少。
如本文所用，术语“有效量”在针对组合物的背景下，意指免疫原性组合物弄够诱导免疫应答的量，所述免疫应答降低感染的发生率或者降低感染的严重性或减少动物中疾病的发生。具体而言，有效量是指每剂量的集落形成单位(CFU)。或者，在治疗的背景下，术语“有效量”是指足以实现以下目的的治疗的量：降低或缓解疾病或病症(或者一或多种其症状)的严重性或持续时间，防止疾病或病症的进展，引起疾病或病症的退化，防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作、或进行，或者增强或改善另一种治疗或治疗剂的预防或疗效。
“序列相同性”如本领域内所知是指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，也即参考序列和要与所述参考序列进行比较的给定序列。在已将序列进行最佳比对以提供最高程度的序列相似性之后，通过将给定序列与参考序列比较来确定序列相同性(由所述序列串之间的匹配确定)。经过此种比对，在位置对位置的基础上确定序列相同性，例如，如果在特定位置处的核苷酸或氨基酸残基是相同的，则序列在该位置处是“相同的”。继而将此种位置相同性的总数目除以参考序列中核苷酸或残基的总数目，来得到％序列相同性。序列相同性可以容易地通过已知方法来进行计算，包括但不限于，以下中所描述的：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,ed.,OxfordUniversity Press,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of SequenceData,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,NewYork(1991)；以及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其中的教导援引加入本文。确定序列相同性的优选方法设计为给出测试序列之间最大的匹配。确定序列相同性的方法在公众可得的确定给定序列之间序列相同性的计算机程序中进行了优化。此类程序的实例包括但不限于，GCG程序包(Devereux,J.,等人Nucleic AcidsResearch,12(1):387(1984))，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。所述BLAST程序公众可得自NCBI和其它来源(BLASTManual,Altschul,S.等人NCVI NLM NIH Bethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人J.Molec.Biol.，215:403-410(1990)，其教导援引加入本文)。这些程序最优化地使用缺省缺口权重来比对序列，以便给出给定和参考序列之间最高水平的序列相同性。作为说明，对于多核苷酸具有与参考核苷酸序列至少例如85％、优选90％、更优选95％的“序列相同性”的核苷酸序列，也就是说给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了给定多核苷酸序列在参考核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括最多15个、优选最多10个、更优选最多5个点突变。换句话说，在多核苷酸中，其核苷酸序列相对于参考序列具有至少85％、优选90％、更优选95％的相同性时，则参考序列中最多15％、优选10％、更优选5％的核苷酸可以被缺失或由另一核苷酸取代，或者参考序列中总核苷酸的最多15％、优选10％、更优选5％的数目的核苷酸可以被插入至参考序列中。参考序列的这些突变可以在参考序列的5'或3'末端的位置、或那些末端位置之间的任何地方发生，在参考序列中的核苷酸之间单个散布或者在参考序列内一或多个连续的组中分布。类似地，对于多肽具有与参考氨基酸序列为至少例如85％、优选90％、更优选95％序列相同性的氨基酸序列，也就是说所述多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同，除了给定多肽序列在参考序列的每100个氨基酸中可包括最多15个、优选最多10个、更优选最多5个氨基酸改变。换句话说，为了获得与参考序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列相同性的多肽序列，则参考序列中最多15％、优选最多10％、更优选最多5％的氨基酸残基可以被缺失或由另一氨基酸取代，或者参考序列中总氨基酸数目的最多15％、优选最多10％、更优选最多5％的数目氨基酸可以被插入至参考序列中。参考序列的这些改变可以在氨基酸序列的氨基或羧基末端、或者在那些末端位置之间的任何地方发生，在参考序列的残基中单个散布或则在参考序列内一或多个连续的组中分布。优选地，不相同的残基位置与保守氨基酸取代有区别。然而，当确定序列同源性时，保守取代并不包括在匹配中.
“保守取代”是指氨基酸残基被具有类似特征或性质(包括大小、疏水性等)的另一氨基酸残基取代，从而使整体的功能性并不显著改变。
“序列同源性”，如本文所用，是指用于确定扣除保守取代的两个序列之间相关性的方法。为了确定序列同源性，将两个或更多个序列进行最佳比对，并在必要时引入缺口。换句话说，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽，则参考序列中85％、优选90％、更优选95％的氨基酸残基必须匹配或者包含另一氨基酸的保守取代，或参考序列中总氨基酸残基(不包括保守取代)的最多15％、优选最多10％、更优选最多5％数目的氨基酸，可以被插入至参考序列中。优选同源序列包含至少50个氨基酸的区段、更优选100个氨基酸的区段、更优选250个氨基酸的区段、更优选500个氨基酸的区段。
术语"序列相同性"和"百分比相同性"在本文可互换使用。对于本发明的目的，在本文中定义了，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比相同性，将序列进行最佳比较目的的比对(例如，可以在第一个氨基酸或核酸的序列中引入缺口以便与第二个氨基酸或核酸序列有最佳比对)。继而将对应氨基酸或核苷酸位置处的氨基酸和核苷酸残基进行比较。当第一序列中的位置由与第二序列中相应位置处相同的氨基酸或核苷酸残基占据，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比相同性是序列所共享的相同位置数目的函数(也即，％相同性＝相同位置的数目/位置的总数目(也即重叠位置)x 100)。优选地，两个序列是同样长度。当序列相同性用于针对蛋白时，认识到不相同的残基位置常常是由保守氨基酸取代来区别的，其中氨基酸残基由其它具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，并且因此并不改变该分子的功能性质。当序列差别在于保守取代时，则所述的序列相同性由于取代的保守性质而进行上调。区别在于保守取代的序列被称为是具有"序列相似性"或"相似性"。
序列比较可以在进行比较的两个序列的全长上进行，或者在两个序列的片段上进行。通常，序列比较将会在进行比较的两个序列的全长上进行。然而，序列相同性可以在例如20个、50个、100个或更多个氨基酸残基的区域上进行。
技术人员会注意到有若干不同的计算机程序可用来确定两个序列之间的同源性。比如，两个序列之间序列的比较和百分比相同性的确定可以使用数学算法来实现。在优选的实施方案中，两个氨基酸或核酸序列之间的百分比相同性是使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定的，其已经并入到Accelrys GCG软件包中的GAP程序中(可得自http://www.accelrys.com/products/gcg/)，其中使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6、或4的缺口权重以及1、2、3、4、5、或6的长度权重。技术人员会理解所有这些不同的参数将会产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的整体百分比相同性不会有显著改变。
本发明的蛋白序列或核酸序列还可用作"查询序列"来针对公共数据库进行搜索，以便例如鉴别出其它的家族成员或者相关序列。此类搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTP程序(版本2.0)来进行。BLAST蛋白搜索可以用BLASTP程序来进行，得分＝50，字符长度＝3，来获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口的比对用于比较的目的，可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，BLASTP和BLASTN)的缺省参数。参见National Center forBiotechnology Information的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
本发明要求保护的PEDV应当也涵盖PEDV分离株1251-125-10(“125-10”)的变体以及其亚片段的变体。此类变体具有与Oklahoma毒株(SEQ ID NO 1和15)的特征基本上相同的免疫学性质。术语“具有基本上相同的免疫学性质”涵盖了(但是并不局限于)所述变体在治疗或预防有PEDV引起的临床迹象时(如下文所述)基本上是有效的或者在改善效力参数方面(如下文所述)是基本上有效的。
针对序列SEQ ID NO:1、2、3、6、7、8、9、14和15(例如，多肽或核酸序列)的术语"变体"是要意指实质上相似的序列。对于包含开放阅读框的核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码与天然蛋白相同的氨基酸序列的那些序列。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，如例如，通过使用定点诱变产生的那些，和对于开放阅读框，编码天然蛋白，以及编码出于密码子优化的目的而相对于天然蛋白具有氨基酸取代的多肽的那些。一般而言，本发明的核苷酸序列变体与参考序列相比将具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、更优选至少90％、91％、92％、93％、或94％、以及最优选至少95％、96％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.99％得序列相同性(使用标准参数的所述比对程序)。
术语“遗传组”如本领域内所知是指属内相关的病毒；其还可以进一步细分至遗传聚类。经鉴别的PEDV遗传组包括G1组，其包含亚组G1a、G1b、R(减毒的/调适的)；和G2组，其包含亚组G2a、和G2b。G2a遗传组的成员包括中国毒株AH2012(GenBank登记号:KC210145)和北美毒株，共享若干独特的核苷酸改变。分别对于AH2012，毒株MN和IA2具有99.6％而毒株IA1具有99.5％的核苷酸相同性。研究者已经推测类AH2012病毒可能传播至东部中国区域，并继而转移至美国，而且最可能是北美毒株最紧密的祖先。遗传组2a的成员与遗传组1a的原型PEDV毒株CV777仅具有大约96.9％得相似性(Bridgen,等人1993；Huang等人2013；GenBank:AF353511.1)。由此，基于历史上的CV777衍生的G1a毒株或DR13衍生的G1b毒株的减毒PEDV疫苗在抗原性上与新出现的中国和北美G2a PEDV毒株相关性较低。
紧密相关的北美分离株US/Colorado/2013(GenBank登记号:KF272920.1)也已由Marthaler等人2013报道。与上述北美分离株一样，CO/13的完整PEDV基因组与GenBank中可用的其它完整PEDV基因组具有96.5至99.5％的核苷酸相同性，与中国毒株AH2012(GenBank登记号KC210145)具有最高的核苷酸相同性(99.5％)。中国毒株AH2012是2a遗传组的成员。北美分离株CO/13的完整基因组与PEDV参考毒株CV777的比较显示，CO/13含有1个核苷酸的插入(在位置48处)以及在5′UTR有5个核苷酸的缺失(在位置73和83至86处)，而刺突基因含有16个核苷酸的插入(位置20804，20810之20820，20843，和21053至21055)以及7个核苷酸的缺失(位置20853和21118至21124)。
术语“北美来源的PEDV”意指包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:15的PEDV分离株，和/或任何这样的PEDV分离株：与SEQ ID NO:1具有至少99％的序列相同性、和/或与SEQ IDNO:1的RNA等价物至少99％相同、和/或其中刺突蛋白由SEQ ID NO:13编码的PEDV分离株、和/或其中刺突蛋白与SEQ ID NO:13具有至少98％序列相同性的任何PEDV分离株、和/或其中所表达刺突蛋白与SEQ ID NO:14具有至少90％同源性的任何PEDV分离株。
术语“进化枝(clade)”如本领域内所知是指由祖先和其所有后代组成的组，系统发生树中的单一“分枝”。所述祖先可以是，作为实例的个体、群体或物种。遗传组可包括多个进化枝，例如AH2012与北美分离株就在不同的进化枝中。
根据另外的实施方案，本发明还涉及包含任何本文所述此类核酸分子的载体。换句话说，本发明涉及载体，起包括任何此类刺突、M、E、N PEDV蛋白或其部分的编码序列。优选地，所述载体是表达载体，其允许任何此类刺突、M、E、和/或N PEDV蛋白或蛋白部分的表达。本发明的载体是适宜用于(体外或体内)对细菌、酵母或动物细胞进行转染或感染的那些。
用于制备和/或使用载体(或重组体)来表达的载体和方法可以是以下中公开的方法或者与其类似：美国专利号4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425、PCT公开WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,"Applications of poxvirus vectors to vaccination:An update,"PNAS USA 93:11349-11353,October 1996；Moss,"Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,"PNAS USA 93:11341-11348,October 1996；Smith等人,美国专利号4,745,051(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(Editor),Methods in MolecularBiology 39,"Baculovirus Expression Protocols"(1995Humana Press Inc.)；Smith等人,"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector",Molecular and Cellular Biology,December,1983,Vol.3,No.12,p.2156-2165；Pennock等人,"Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector,"Molecular and Cellular Biology March 1984,Vol.4,No.3,p.406；EPA0 370 573；美国专利申请号920,197,1986年10月16日提交；EP专利申请号265785；美国专利号4,769,331(重组疱疹病毒)；Roizman,"The function of herpes simplex virus genes:A primerfor genetic engineering of novel vectors,"PNAS USA 93:11307-11312,October1996；Andreansky等人,"The application of genetically engineered herpes simplexviruses to the treatment of experimental brain tumors,"PNAS USA 93:11313-11318,October1996；Robertson等人,"Epstein-Barr virus vectors for gene deliveryto B lymphocytes",PNAS USA 93:11334-11340,October 1996；Frolov等人,"Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,"PNAS USA93:11371-11377,October 1996；Kitson等人,J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利申请号5,591,439,5,552,143；WO 98/00166；许可的美国申请序列号08/675,556,和08/675,566，都于1996年7月3日提交(重组腺病毒)；Grunhaus等人,1992,"Adenovirus as cloningvectors,"Seminars in Virology(Vol.3)p.237-52,1993；Ballay等人EMBO Journal,vol.4,p.3861-65,Graham,Tibtech 8,85-87,April,1990；Prevec等人,J.Gen Virol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；和McClements等人,"Immunization with DNA vaccines encodingglycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,induces protectiveimmunity in animal models of herpes simplex virus-2disease",PNAS USA 93:11414-11420,October 1996；和美国专利申请号5,591,639、5,589,466、和5,580,859,以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人,Nature,和Furth等人,Analytical Biochemistry,涉及DNA表达载体，等。也参见WO 98/33510；Ju等人,Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人,美国专利号4,945,050；Fischbachet等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人,Seminars in Immunologyvol.9,pp.271-283(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人,美国专利号4,394,448(将DNA插入活细胞的方法)；McCormick等人,美国专利号5,677,178(细胞病理病毒的用途)；和美国专利号5,928,913(用于基因递送的载体)；以及本文引用的其它文献。
优选的病毒载体包括杆状病毒如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,Calif.)，特别是当生产细胞是昆虫细胞时。虽然优选杆状病毒表达系统，但是本领域技术人员会理解其它系统也对于本发明的目的也可发挥作用，也即将HG表达至细胞培养的上清中。此类其它表达系统可需要使用信号序列，以便引起H5表达至培养基中。
有效剂量:
本文所述的化合物可以治疗有效的剂量施用至对象，以防止PEDV相关的疾病。剂量将取决于接受疫苗的宿主，以及因素如宿主的大小、重量、和年龄。
本发明免疫原性组合物要应用于制剂的确切的量，将取决于施用的途径以及对象的性质(例如，年龄、大小、疾病的阶段/水平)，并且应当根据施行者的判断以及依照标准临床技术的每个对象的状况。有效免疫量是足以在对象中治疗或预防PEDV感染性疾病的量。
可以在用组合物免疫之后，通过使用任何本领域已知的免疫测定监测测试对象的免疫应答，来确定组合物的免疫原性。体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫的产生可以用来作为免疫应答的指示。测试对象可包括动物如猪、小鼠、仓鼠、狗、猫、兔、奶牛、马、绵羊、家禽(例如鸡、鸭、鹅、和火鸡)、以及人类。
测试对象的免疫应答可以通过各种手段进行分析，如：所得的免疫血清对免疫原性缀合物的反应性，通过已知技术来测定，如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、病毒中和等；或者，通过防护经免疫宿主免受病原体感染和/或经免疫宿主中由于病原体感染所致症状的减轻(由本领域已知的任何方法确定)，以测定感染性疾病物质的水平，如，病毒水平(例如，通过培养来自对象的样品)，或本领域已知的其它技术。也可以通过测量免疫球蛋白所针对的抗原得水平，来确定感染性疾病物质的水平。感染性疾病物质水平的降低或者感染性疾病的改善表明，组合物是有效的。
在体内用于动物之前，可以在体外测试本发明治疗剂(therapeutic)的治疗或预防活性。例如，可以用于确定具体治疗剂的施用是否有指示的体外测定，包括体外细胞培养测定，其中将来自细胞系的细胞或者从患有特定疾病或病症的对象培养的细胞暴露于治疗剂又或者被施用治疗剂，并且观测治疗剂对于细胞的作用。
或者，可以通过使治疗剂接触细胞(从对象培养的或者来自培养的细胞系)来对治疗剂进行测定，其中所述细胞易受感染性疾病物质的感染但是却还未受到感染性疾病物质的感染，将细胞暴露于感染性疾病物质，并继而确定接触了治疗剂的细胞的感染率是否低于未接触治疗剂的细胞的感染率。可以通过本领域任何已知方法，来测定细胞受感染性疾病物质的感染。
另外，可以在治疗之前、期间、或之后以适当的时间间隔，通过测量动物模型中或人类对象中抗体所针对的分子的水平，来对治疗剂进行评估。所述分子的量的任何变化或者变化的缺失，可以进行鉴别并与对象的治疗的作用相关联。所述分子的水平可以通过本领域已知的任何方法来确定。
在使用本发明的方法和组合物使动物疫苗接种了PEDV之后，可以使用本领域中已知的任何结合测定，来评估所得的抗体与所述特定分子之间的结合。也可以进行这些测定来筛选对特定抗原展现出较高亲和性或特异性的抗体。
施用至对象:
施用的优选途径包括但不限于鼻内、口服、皮内、和肌肉内。技术人员会意识到本发明的组合物也可以在一个、两个或更多个剂量中施用，以及通过其它途径施用。例如，此类其它途径包括：皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心脏内、小叶内、髓内、肺内、和阴道内。取决于治疗期望的持续时间和效果，本发明的组合物可以施用一次或若干次，还有间歇式地，比如在每天的基础上并以不同的剂量施用若干天、若干周或若干个月。
包括以下实施例是用来证明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当理解，下文实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明实践中作用良好的技术，并因而可以认为构成了其实践的优选模式。然而，本领域技术人员在知晓本公开后，应理解可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并依然获得同样的或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1:灭活的PEDV毒株的分离和产生
为了产生猪流行性腹泻病毒疫苗，首先产生了灭活的病毒、PEDV(分离株)的主要种毒培养物。从此主要种毒培养出PEDV的培养物并继而灭活。接着将灭活的病毒培养物与佐剂混合，以便产生猪流行性腹泻病毒疫苗。使用了以下方法来产生猪流行性腹泻病毒疫苗。
在2013年获取了展现极端腹泻的动物或者来自动物的组织。从这些动物产生了来自粘膜刮片的匀浆，经0.2微米注射过滤器过滤，并将过滤物用于接种非洲绿猴(AfricanGreen Monkey)肾细胞(VERO)。在PEDV维持培养基的存在下培养病毒，所述PEDV维持培养基含有经修改的MEM、猪胰蛋白酶、胰蛋白胨磷酸盐液、酵母提取物和HEPES缓冲液。通过检查特征性的合胞体形成和细胞单层的融合来对病毒的生长进行评估和可视化。使用基于Illumina的MiSeq技术来对CPE阳性材料进行了测序。
为了产生PEDV主要种毒病毒培养物(“PEDVMSV”)，将猪流行性腹泻病毒毒株(分离株)(PEDV分离株)在BI VERO细胞中分离并在BI Vero细胞中传递了总共19次，并继而使病毒在2013EU Vero细胞中生长直至传代30。将病毒的第30次传代稀释并静置作为主要种毒病毒，命名为PEDVKV-1251-125-10-OK。
通过用PEDVKV-1251-125-10-OK MSV在PEDV维持培养基中感染2013EU Vero细胞，而从主要种毒病毒中产生了PEDV(KV-1251-125-10-OK，在本文称作“125-10”)的培养物，其中所述PEDV维持培养基含有经修改的最低必需培养基(Minimal Essential Media)、猪胰蛋白酶(10μg/ml)、胰蛋白胨磷酸盐液(0.3％)、酵母提取物(0.02％)和1M HEPES缓冲液(2.5％)。通常是用PEDV(125-10)MSV以104TCID50/850cm2滚瓶的最低剂量来感染所述2013EU Vero细胞。此类培养物可以在无菌一次性滚瓶中或微载体珠上进行生长。将培养物在36℃±2℃温育24至48小时直至观测到细胞病理效应(“CPE”)。通常，特征性的合胞体可以在感染的12小时内见到，从24-48小时合胞体扩展以及细胞单层融合，随后是细胞的脱离(sloughing)。在温育期间，监测培养物中PEDV诱导的CPE，以确保纯的PEDV毒株。如果观测到非典型CPE或者存在污染的任何宏观或围观证据，则将培养物丢弃。将纯病毒培养物无菌收集至无菌聚丙烯大瓶中。将病毒冻融以释放细胞相关的毒粒，并通过离心或者经0.45微米随后再0.2微米的过滤器过滤而使其澄清。测试了大量的病毒收集液，以在灭活前确保没有支原体。未理解灭活的收集液被储存在-70℃或更低。
确定了收集液的体积并使液体的温度达到36±2℃。将0.4M的2-溴乙烯胺(BEA)溶液与0.3N NaOH的母液混合，以产生二乙烯亚胺(BEI)母液，继而将其添加至收集液以提供5mM的BEI终浓度。将液体持续搅拌最少24小时。添加用于提供5mM最低终浓度的1.0M硫代硫酸钠溶液，以中和任何残余的BEI。经灭活的液体对于长期储存可以储存在-70±3℃或者短期储存在4±3℃。
在用BEI处理后，测试培养物诱导PEDV典型的CPE的能力，以确保病毒的灭活。通过将BEI处理过的病毒液穿过Vero细胞并检查所述Vero细胞是否有任何病毒感染来完成此任务。经BEI处理的培养液通常储存在-70℃或更低，直至已完成灭活测定。
通过将灭活的PEDV培养物与佐剂以20％的包含率彻底混合以形成散装系列(bulk serial)，从而将灭活的病毒配制为经佐剂化的疫苗。将所述散装系列保存在2-8℃直至含有1至10个剂量的小瓶中(@每剂量2.0ml)。
实施例2:PEDV分离株1251-125-10“125-10”的基因组序列
样品制备和分析:在提取之前，将病毒组织培养物用DNase和RNase的混合液(cocktail)进行预处理，以去除残余的宿主细胞基因组核酸。接着使用Qiagen病毒RNA提取试剂盒(Cat#52906)从经过核酸酶处理的样品中提取病毒基因组RNA。提取之后，将样品再次用DNase处理以进一步富集病毒基因组RNA。随后，经随机引导逆转录和Klenow片段处理而将病毒基因组RNA转化为双链cDNA(ds cDNA)。继而使用NextEraXT文库制备试剂盒(Cat#FC-131-1024)，使用所述ds cDNA产物产生用于基于Illumina MiSeq的测序的文库。每个样品都用独特的标签在5’-和3’-末端进行条码标记，以使得生物信息学错置(mis-binning)的可能最小化。此文库使用500-循环试剂盒(Cat#MS-102-2003)在MiSeq上运行，并使用NextGene(版本2.3.4)和Sequencher软件(版本5.1)组合来分析数据。高质量序列选择为含有超过25的中位Q-得分的那些，并用3’-末端不超过3个未呼应碱基或者3个连续碱基测得低于16的Q-得分的截断值来进行削减。继而将序列重新组装(使用在35bp区段上85％或更高的标准)以产生每个毒株可能的PEDV完全基因组。继而将每个可能的完整基因组序列通过基于模板的比对来进行了验证，以便验证单核苷酸多态性(SNP)或者可变的小插入/缺失。
对于样品1251-125-10，在削减掉低质量数据后，生成了总共570,253个序列，平均长度为136bp。那些序列中；484,247个(84.9％)组装至27,995bp长的单一重叠群27,995bp中，其经BLASTn分析显示出与单链RNA甲型冠状病毒PEDV有高度相同性。总共11个位置在单个核苷酸或者小插入/缺失处展示出多态性，这些在表1中列出。
表1:分离株1251-125-10“125-10”中的多态性残基
将1251-125-10的可能的完整/接近完整的PEDV基因组(SEQ ID NO:1)与PEDV的最接近的中国AH2012(GenBank登记号:KC210145)和北美Colorado 2013分离株(GenBank登记号:AGO58924)进行比对(参见图1和图2)。与两个分离株的相同性都超过了99.2％，表明与两个毒株(都属于遗传组2a)非常接近的关系。
接下来，检查了免疫原性刺突蛋白序列与更大的GenBank的PEDV刺突蛋白存储的蛋白相同性/相似性。再次，经提交的最接近的GenBank分离株衍生自存放于明尼苏达大学兽医诊断实验室的北美Colorado 2013毒株(GenBank登记号:AGO58924)，展现出超过99.5％的相同性(1380/1386相同氨基酸)(图3)。6个氨基酸变化中，1个是由于位置23,101处的多态性，其在位置838处大部分中编码CGA(Arg)或者在小部分中编码CAA(Gln)。所述北美Colorado 2013毒株在此位置处含有Gln。
实施例3:监测病毒灭活的方法
通过在Vero细胞中传代而测试了每个批次的PEDV病毒或汇集的灭活。75cm2的24小时细胞培养物用2.0mL的灭活PEDV液接种，并保持在36±3℃48小时。一个烧瓶的Vero细胞保持未接种。作为阳性病毒对照，一个Vero细胞培养用阳性对照PEDV进行了接种。在温育期结束时，检查了细胞单层中对于PEDV典型的CPE。将材料冷冻并熔解三次，并接着将2ml的每种材料接种至一天龄的Vero细胞。该培养应当在37±2℃保持48小时。在第二次传代后，进行了第三次传代。在温育和传代之后，在经BEI处理的病毒液中受病毒感染的细胞的缺失(通过免疫荧光染色的缺失而确定)构成了令人满意的灭活测试。接种了阳性对照病毒的对照细胞应显示出PEDV典型的CPE，而未经接种的烧瓶则不会显示出PEDV CPE的证据。
实施例4:编码和表达PEDV刺突抗原的重组杆状病毒的构建
在昆虫细胞中，通过经表达改造的PEDV刺突蛋白的重组杆状病毒生成BaculoDisplay-刺突抗原。简言之，使用特异性的引物(正向引物:SEQ ID NO:4和反向引物:SEQ ID NO:5)，从诊断样品中克隆编码PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:3)的核酸序列(SEQID NO:2)。将克隆的PEDV刺突编码序列进行改造，以去除PEDV刺突信号肽、跨膜结构域、和c-末端结构域(SEQ ID NO:6)。这些结构域通过重叠延伸PCR用来自疱疹性口炎病毒G蛋白(VSVG)的等价结构域替换。用互补的限制性位点将VSVG-PEDVS-VSVG编码序列(SEQ ID NO:8)转移至杆状病毒转移载体(pVL1393)中。表达经改造刺突蛋白(SEQ ID NO:9)的VSVG-PEDV-VSVG刺突编码序列的pVL1393载体，被用于与FlashBAC ULTRA杆状病毒DNA一起共转染Sf9昆虫细胞。扩增了重组杆状病毒并检查PEDV刺突蛋白表达(通过IFA和蛋白印迹(使用PEDV-特异性血清))。所述PEDV刺突蛋白在100,000g的离心步骤之后，显示出与杆状病毒颗粒共沉积(co-pellet)，表明其与杆状病毒相关联。
实施例5:包含PEDV刺突抗原的药物组合物(疫苗)的制备
对于灭活的PEDV材料，使用5mM BEI将PEDV病毒收集物灭活最少24小时，澄清并经0.45μm过滤。
在中和后，添加各种佐剂并产生了如下的疫苗/药物组合物。
实施例6:用灭活的PEDV和杆状病毒刺突疫苗接种猪以及对血清学应答的评估
此研究的目的是证明灭活的PEDV病毒用于防护经疫苗接种的猪的免疫原性。本研究中所使用的疫苗包括灭活的PED病毒和BaculoDisplay-刺突(Baculo-S)蛋白构建物。所述灭活的PEDV疫苗和BaculoDisplay-刺突(Baculo-S)蛋白疫苗都用佐剂化。此前的攻击研究已经显示出，临床防护与用PEDV攻击21天后血液中检测的IgA和IgG应答之间有强正相关(De Arriba等人2002)。因此，通过IgG和IgAELISA分析评估了每种原型疫苗的血清学应答。另外，在血清上完成了病毒中和测定。
实验设计:将实验设计为评估了对两种原型PEDV疫苗的血清学应答。
将18只猪(在D-1时，28±7天龄)随机分至三个处理组(参见表2)，并在此研究期间关在单一房间中。在D0、14和28用安慰剂或者一或多种PEDV原型疫苗，对动物进行肌肉内免疫接种。从D0至D49每天监测猪的临床迹象。从D0-D4、D14-18、以及D28-D32，监测直肠温度和注射部位来评估疫苗的安全性。在D-1、3、14、17、28、31和49，从小猪取排泄物、口和鼻擦拭样品(swabs)以及血清。在D-1、14、28和49取的血清样品通过ELISA筛选抗-PEDV-IgG，以及通过FFN测定筛选中和抗体的存在。在D-1、D3、17和31收集的排泄物样品和血清通过PCR进行评估，以确认两个原型都不能在猪中复制。将来自D14、28和49的排泄物样品储存在-70℃用于未来可能的评估。在D49，将动物人道处死并尸检。
表2.实验设计总结
原型疫苗:表4a和b描述了原型疫苗。对于安慰剂处理，施用了2ml的产物PBS。在昆虫细胞中，经表达改造的PEDV刺突蛋白的重组杆状病毒来生成BaculoDisplay-刺突抗原。简言之，使用特异性的引物，从诊断样品中克隆编码PEDV刺突蛋白的编码序列。将克隆的PEDV刺突编码序列进行改造，以去除PEDV刺突信号肽、跨膜结构域、和c-末端结构域(SEQID NO:7)。这些结构域通过重叠延伸PCR用来自疱疹性口炎病毒G蛋白(VSVG)的等价结构域替换(SEQ ID NO:8)。用互补的限制性位点将VSVG-PEDVS-VSVG编码序列转移至杆状病毒转移载体(pVL1393)中。含有VSVG-PEDV-VSVG刺突编码序列的pVL1393载体，被用于与FlashBAC ULTRA杆状病毒DNA一起共转染Sf9昆虫细胞。扩增了重组杆状病毒并检查PEDV刺突蛋白表达(通过IFA和蛋白印迹(使用PEDV-特异性血清))。所述PEDV刺突蛋白在100,000g的离心步骤之后，显示出与杆状病毒颗粒共沉积，表明其与杆状病毒相关联。对于灭活的PEDV材料，使用5mM BEI将PEDV病毒收集物灭活24小时，澄清并经0.45μm过滤。
表4a.PEDV原型疫苗材料总结–灭活的病毒收集物
表4b.PEDV原型疫苗材料总结–BaculoDisplay-刺突
PEDV疫苗接种:在D0、14和28，研究者或设计者将疫苗材料施用至所有猪。每只猪接收了2ml的BEI灭活的PEDV疫苗、1ml的BaculoDisplay-刺突原型、或2ml的安慰剂(肌肉内，使用适宜于其年龄的无菌针头和注射器)。在D0和D28，将疫苗给予至右颈肌肉组织以及在D14给予至左颈肌肉组织。
组织收集:评估猪的宏观病变。在尸检表上记录异常。收集了小肠和结肠的新鲜样品以及肺、心、脾、肾、小肠、结肠和肝的固定切片。新鲜样品在完成此研究后储存在BIVI-Ames-70℃最少6个月。固定切片在完成此研究后储存在BIVI-Ames室温最少6个月。
病毒测定:PEDVRT-PCR:通过RT-PCR筛选样品，如表3中所述。使用定量一步RT-PCR试剂盒(ISCRIPTTM One-Step RT-PCR kit for probes；BioRad,cat No.170-8895)来进行此测定。引物、探针和Ultramer的序列信息如下:PEDV-qPCR-probe，5’-6-FAM/ACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACAT-3’BHQ_1(SEQ ID NO:16)；PEDV-qPCR-F，5’-TATAGTGGGTGTTATTTCTAGTT-3’(SEQ ID NO:17)；PEDV-qPCR-R，5’-GCCAATACTGCCAGATTTACA-3’(SEQ ID NO:18)，PEDV-ultramer，5’-TGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAGCTCCACTTTTAACAGTACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTCTAATTGTACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTATGTCCCAT-3’(SEQ ID NO:19)。在25μl的反应中进行实时RT-PCR，其中所述25μl的反应中含有2μl提取的总核酸、0.75μl的探针(4μM)、0.5μl的每种引物(10μM)、12.5μl的2XRT-PCR混合物，0.5μl ISCRIPTTM逆转录酶和8.25μl的DEPC-处理的水。使用CFX96实时PCR检测(BioRad)在如下条件下进行反应：在50℃初始逆转录30min，随后是在95℃初始变性5min，40个循环的95℃变性15s以及退火并在57℃延伸30s。使用CFX Manager软件(版本2.1，BioRad)分析光学数据。对于每次确定，使用循环阈值(Ct)确定模式的回归设定来自动计算阈值线。使用基线减除模式自动完成基线减除。具有低于10的基线终值的曲线经人工关联。样品在单一反应中进行并使用基于Ultramer的标准曲线来确定定量的量且报告为每微升基因组拷贝数(gc/μl)。40循环后没有检测到的样品认为是阴性的。
抗-PEDV-IgG ELISA:通过ELISA来筛选样品，如表3中所述。对于测定，将平板用4ng/μl的PEDV-1251-125-2在37℃包被一小时。在洗涤后，将孔用100μl ofa 1:100稀释的血清样品(对于IgG测定)包被并在37℃温育一小时。在洗涤后，将孔用0.05％无脂奶封闭，并在37℃温育一小时。在洗涤后，将孔用100μl的1:10,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的-山羊-抗-猪-IgG来包被，并在37℃温育一小时。在洗涤后，将平板用3,5,3’,5’-四甲基联苯胺扩展5分钟并再450nm测量光密度(OD)之前用2M H2SO4终止反应。样品在双份孔中运行并将结果报道为平均样品对阳性(S:P)比例。因为还没有产生对于ELISA的阳性对比阴性解释的截断值，具有大于两个较高的标准偏差外加最高的对照组均值之和的S:P比例的样品被认为是阳性的(S:P比例>0.28或>0.16对于IgG测定)。
PEDV荧光聚焦测定:PEDV FFN测定的运行由双份血清稀释系列组成，通过使用细胞培养调适的PEDV毒株的病毒中和测定来在96孔平板形式中进行筛选。效价报道为显示出相较于阴性对照荧光聚焦减少90％的最大血清稀释。对于每个样品，将双份孔效价进行平均。
数据的统计学分析:使用JMP 9.0.3(SAS Institute,Inc.,Cary,NorthCarolina,USA)由监测者来进行数据分析。对于所有分析，低于0.05的p-值认为是显著的。对于数据的重复测量(血清学)，进行了方差的多元分析(使用时间作为模型中的重复变量)。如果注意到了显著的p-值，使用组作为独立因子进行单向ANOVA；每天进行了分别的分析。如果注意到了显著的p-值；用Wilcoxon调整的成对比较对组均值之间成对的差异进行了评估。
血清学:PEDV荧光聚焦中和(FFN)测定:个体动物的结果参见表5。BEI-VH组中的所有动物显示了中和效价四倍的提高，而组2中七个动物仅有两个具有类似的应答。对照动物没有可检测的中和效价。
表5.D-1、14、28和49研究的PEDV荧光聚焦中和测定结果。强调的细胞表示效价大于0
抗-PEDV-IgG ELISA:个体动物的样品对比阳性(S:P)比例在下表6中列出。组1(BEI-VH)中所有动物都在D28具有可检测的IgG应答，其至少比对照组的平均S:P比例高两个标准偏差。相反，组2(Baculo-S)中仅有两个动物具有可检测的IgG应答而且仅在接受了三个剂量的疫苗之后。组最小均方S:P比例±标准误差在图4中给出。在D28，组1(BEI-VH)中的动物相较于组2和组3具有显著更高的S:P比例(p<0.01，Wilcoxon调整的成对比较)。
表6.在D-1、14、28和49的个体抗-PEDV-IgG S:P比例。
强调的值表明S:P比例至少比对照组D49的S:P比例高两个标准偏差
PEDV病毒血症/脱落:为了评估疫苗接种后脱落和病毒血症的潜在可能，在免疫接种后第4天(D3、D18和D31)通过RT-PCR筛选血清和排泄物样品中存在的PEDVRNA。在任何样品中都未检测到PEDVRNA。
结论:基于上述研究组合的血清学数据(IgG和FFN)，BacuoloDisplay方法表达的三个剂量的PEDV刺突蛋白，以每剂量866μg以及经佐剂化并不能产生一致的血清学应答。在此情形中，应答的缺乏表明疫苗免疫原性不足(也即蛋白并未以足够的量递送或者使用了不适宜的佐剂)或者重组刺突蛋白的确认与野生型病毒并不相似。
相反地，抗-PEDVIgG和FFN血清学数据并不表明两个或三个剂量的BEI灭活的PEDV病毒收集物(以5.6log/剂量提供并经佐剂化)能够一致地在幼小猪中激发血清学应答。然而，经疫苗接种的动物中的平均抗-PEDV-IgG S:P比例与施用反馈材料的动物相比较低。具体而言，在来自取样前施用了反馈材料的一个牧群的45个动物中，发现平均抗-PEDV-IgG S:P比例(±标准偏差)为0.90±0.20，相较而言经疫苗接种动物中为0.69±0.12(数据未显示)。另外，经过与Eric Nelson博士的私人沟通，此研究中七个经疫苗接种动物里有五个的FFN效价低于通常在反馈施用后所见到的效价。
实施例7:BEI灭活的PEDV的效力(三种剂量、各种佐剂)
(研究2013131)Troy Kaiser
以下研究评估了用三个2-mL剂量的灭活PEDV疫苗进行的疫苗接种，当以14天的间隔施用于三周龄的猪时，是否能够激发免疫应答。主要的结果是通过荧光聚焦中和(FFN)测试的血清学。
研究组包括:T01＝PBS(n＝10)；T02＝6.04log TCID50/ml BEI PEDV+20％(n＝18)；T03＝6.04log TCID50/ml BEI PEDV+10％(n＝20)；T04＝6.04log TCID50/ml BEI PEDV+15％T05＝6.04log TCID50/ml BEI PEDV+5％S:P油(n＝20)。
表7.疫苗制剂和对照
在D0，在猪的右颈肌肉内施用2-mL的处理。在D14于左颈施用第二处理，以及在D28对所有组在右颈施用第三处理。在D-1、D13、D27、D42、和D49收集血液样品。用FFN测试血清的PEDV中和抗体。
血清学:两次疫苗接种后在11.2％的猪中发生了血清转化，而当施用了三次PEDV疫苗(经20％Emulsigen BCL佐剂化)后则有55.6％的猪发生了血清转化(T02；表8)。所有处理组中，血清阳性猪的几何平均效价≥1:20都在下表8中给出。所有猪根据处理组的效价频率分布在表9中给出。
表8.血清学应答的猪根据组的血清阳性猪的比例和几何平均效价
组 具有≥1:20应答的猪 几何平均效价
T01 0/10(0％) 不适用
T02 10/18(55.6％) 1:45.9
T03 6/20(30％) 1:44.8
T04 2/20(10％) 1:40.0
T05 2/20(10％) 1:56.6
表9.按照组的效价频率分布
*最大效价在D42或D49
结论：两次剂量后在11.2％的T02猪中发生血清转化，而当用实验疫苗疫苗接种三次时在55.6％的猪中发生血清转化，其中所述实验疫苗配制为6.04log10TCID50/mL PEDV，用二乙烯亚胺灭活，以及经20％Emulsigen BCL佐剂化。此研究中收集的数据表明此实验疫苗激发了支持要求合理效力预期的免疫应答。
实施例8:杆状病毒疫苗的效力(两种剂量，各种佐剂)
研究2014236Kara Claxton
以下研究评估了，对于用两个2-mL剂量的灭活猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗、或杆状病毒构建物疫苗所进行的疫苗接种的血清学应答(在将疫苗施用于三周龄猪后测量)。主要结果是通过荧光聚焦中和(FFN)测试的血清学(对于疫苗接种后从经处理的猪中收集的血清样品)。
研究组包括:T01＝PBS(n＝10)；T02＝6.93log TCID50/ml BEI PEDV+20％(n＝20)；T03＝杆状病毒具有PEDV刺突Ag(n＝9)；6x浓缩的杆状病毒具有PEDV刺突Ag(n＝10)；胰蛋白酶杆状病毒具有PEDV刺突Ag(n＝10)；和有条件许可的灭活阳性对照疫苗(POS CON)(n＝10)。在D0，在猪的右颈肌肉内施用2-mL的处理。在D14于左颈给T01-T05施用第二处理而在D21给T06施用。
表10:疫苗制剂和对照
BEI＝二乙烯亚胺
*PEDV刺突信号序列和C-末端尾被杆状病毒gp64的等价物所替换。重组PEDv刺突-Display杆状病毒在昆虫细胞中产生。收集感染的培养物并通过离心和0.2-μm过滤来进行澄清。经澄清的收集物材料在37℃用5mM BEI灭活72小时，继而通过离心和0.2-μm过滤澄清。
血清学:在20％的经PEDv疫苗(由20％Emulsigen BCL佐剂化)(T02；表11)疫苗接种的猪中发生疫苗接种后血清转化(D28&D35)，而对于经胰蛋白酶培养的PEDV刺突-杆状病毒(T05；表11)疫苗接种的猪则有60％发生疫苗接种后血清转化(D28&D35)。在所有处理组中，血清阳性猪的几何平均效价≥1:20都在表11中给出。所有猪根据处理组的效价频率分布在表12中给出。
表11:血清学应答的猪根据组的血清阳性猪的比例和几何平均效价
组 具有≥1:20应答的猪 几何平均效价
T01 0/10(0％) 不适用
T02 4/20(20％) 1:30.7
T03 0/9(0％) 不适用
T04 0/10(0％) 不适用
T05 6/10(60％) 1:35.5
T06 7/10(70％) 1:41.9
表12:按照组的效价频率分布
结论:两次施用实验疫苗后在20％的T02猪中发生血清转化，其中所述实验疫苗配制为6.93log10TCID50/mL，PEDV用BEI灭活，以及经20％Emulsigen BCL佐剂化。在施用两次实验重组胰蛋白酶培养的杆状病毒疫苗(以PEDV刺突糖蛋白配制)后，在60％的T05猪中发生血清转化。
实施例9:效力研究
POC效力(研究2014030)Abby Patterson
以下研究设计为用于评估灭活疫苗和其它原型疫苗在母猪中的效力。主要结果参数为在用猪流行性腹泻病毒(PEDV)攻击之后的小猪死亡率。次要结果参数为孕猪血清学(dam serology)。测量的其它参数包括：疫苗接种后母猪中的临床迹象(包括ISL)；疫苗接种后母猪中的PEDV脱落(经qRT-PCR)；小猪中的临床迹象；和小猪中的PEDV血清学。
产仔前四周和两周(D0和D14)，通过三种途径(肌肉内、鼻内和口服)对每个妊娠期孕猪施用了2mL的以下处理中的一种：T01(阴性对照，NC)磷酸盐缓冲盐水；T02(BEI-VH)经20％Emulsigen BCL佐剂化；T03(严格对照，SC)用作未经疫苗接种的/未受攻击的对照。每组使用了8只动物，除了T06使用4只动物。在D35或D36，用1mL的2.0log10TCID50/mL PEDV病毒收集物口服攻击猪。在攻击阶段期间每天观测孕猪和猪的临床迹象(呕吐和腹泻)。在产仔前四周和两周(D0和D14)、对小猪进行攻击前那天(D34或D35)、以及测试结束那天(D57)从孕猪收集血清.
在D0和D14，将PEDV原型疫苗施用于母猪。在每次疫苗接种时，母猪接受总共6mL的疫苗，其中通过肌肉内、鼻内和口服途径施用2mL。对于肌肉内施用途径，将2mL的注射给予颈部耳下的肌肉组织中。用于施用的颈部位点在初始和加强疫苗接种时进行改变。对于口服施用途径，使用附着至注射器的8Fr聚丙烯导管(2.7mm直径，254mm长)将2ml递送至尾口咽(caudal oropharynx)。对于鼻内途径，使用附着至注射器的4.5英寸导管将1ml注射至每个鼻孔内。
表13:实验疫苗和对照产品
表14:攻击材料
疫苗效力:猪死亡率:在用毒性PEDV分离株攻击后的猪死亡率是用于评估疫苗效力的主要结果参数。在攻击时段期间基于组的死亡率总结在下文列出。在T01(NC)中55％的死亡率以及所有幼仔都受影响，则认为攻击是足够有毒力的。相较于T01(NC)，T02(BEI-VH)证明了猪死亡率的数字上的降低，具有0.20(-0.550，0.586)的PF(95％CI)。该降低并不显著，因为95％CI(-0.550，0.586)包括了0。
在此研究中显现出了额外的-二项变异，当使用潜在的二项分布时，导致了T02(BEI-VH)PF宽广的置信区间。在组中的幼仔之间死亡率变化很大，包括对于T02(BEI-VH)从0％到100％。
在尸检时取了肠样品或者肠内含物并通过qRT-PCR测试来检测PEDV抗原。在峰值死亡率时段期间从动物测试的样品中，在55.5％的样品中检测到PEDV。
表15:
*基于T01(NC)受影响比例。
**NC＝未计算。T02(BEI-VH)基于研究设计的可能的置信区间
母猪血清学:荧光聚焦中和(FFN)测定：用FFN测定来评估疫苗接种和攻击后的孕猪病毒中和应答。基于组列出的几何平均效价在下文给出(对于从母猪收集血液的日期)。
在两个剂量的疫苗之后，T02(BEI-VH)中2/8(25％)的母猪具有可检测水平的中和抗体。可检测水平的中和抗体未在任何其它组观测到。
在侧面曝光于PEDV之后，暴露处理组中所有的母猪都具有可检测水平的中和抗体。T03(SC)组中的动物在整个试验期间都保持血清阴性。在D57(暴露后大约21天)的几何平均效价表明疫苗接种导致了数量上更高的效价(相较于T01(NC))。T02(BEI-VH)组中的母猪具有613的GMT，这与T01(NC)中母猪200的GMT相比是大约三倍高的效价(p＝0.005)。由于T02(BEI-VH)组中多个样品在所测试的最高稀释(1:640)中具有可检测的中和抗体，这些结果很可能代表了组之间差异的保守估计。
表16:
当所有值<20时，几何平均效价表示为<20。否则，<20的值对于GMT计算设定为10
**D57GMT对于T01(NC)和T02(BEI-VH)是回变换的(back-transformed)最小二乘法均值
基于S1的ELISA数据:使用基于S1的ELISA来评估疫苗接种和攻击后孕猪对于PEDV-刺突蛋白的应答。对于初乳、乳汁、和血清的测定结果基于组而列出(对于收集样品的日期)。
在对猪进行攻击时，T02(BEI-VH)中的母猪在血清中具有显著更高的几何平均效价(相较于T01(NC)中的母猪)(p＝0.0005)。在暴露于PEDV之后，在两组之间注意到了较大的显著差异(p<0.0001)。
抗-PEDVIgA在初乳和在乳汁中几何平均效价的显著差异，在T02(BEI-VH)与T04(NC)之间没有观测到。
表17:
*GMT对于T01(NC)和T02(BEI-VH)是回变换的最小二乘法均值
猪血清学:在尸检时从猪收集血清来评估中和抗体的存在。下表给出了基于组的阳性猪的几何平均FFN效价。该表还包括了检测频率(表示为具有大于或等于20的GMT的猪的数目对比所测试的动物数)。对所有可用样品进行了测试。来自许多猪的样品由于死亡和尸检之间时间的差异而不能获得。
通过死亡率状况(死亡:是/否)和分组(整体)而对FFN效价进行的描述统计在下表中列出。整体上，在疫苗接种组中相似比例的猪有血清转化(或者具有母体的抗体)，无论尸检时间如何。然而，在T01(NC)中，相较于在研究期间都存活的猪(43％)，测试结束前死亡的猪中有较高百分比具有效价(88％)。
当观察基于组的整体猪效价时，死亡比例估计与T02(BEI-VH)的整体组FFN百分比负相关。
表18:
组 猪(死亡＝是) 猪(死亡＝否) 整体 死亡比例估计
NC 55(28/32；88％) 33(9/21；43％) 63(37/53；59％) 0.55
BEI-VH 44(23/42；55％) 50(9/16；56％) 64(32/58；55％) 0.44
*GMT(效价>20的动物数/测试的总猪数；百分比)；注意并未从所有的猪获得血清
攻击后临床观察:猪排泄物得分:下文列出了在猪中观察到排泄物异常期间的描述统计，基于组和死亡率状况(死亡:是/否)。整体上，在具有相同死亡率的猪中排泄物异常得分的中位期间在组之间是类似的。在死亡的或处死的动物中，有数目上较短的排泄物异常得分的中位期间。此趋势在T01(NC)的猪中最明显，且可能是由于这些动物中大部分在攻击后的第一周内死亡。
表19:
猪中排泄物得分的严重性在下文频率表中总结。在所有处理组中高比例的猪(>91％)在攻击后的至少一次观察期间给出了2的排泄物得分。
表20:
结论:在T02(BEI-VH)中相较于T01(NC)组观察到了猪死亡率20％的降低。在此研究中尝试了三种施用途径。虽然使用了3种途径，并未预期IM之外的途径回有助于基于佐剂和疫苗制剂的T02(BEI-VH)的效力。整体上，灭活的PEDV(经20％佐剂化)疫苗，具有6.04log TCID50/ml的最小灭活前效价，表现出在小猪和母猪中诱导更好的免疫应答。优选的疫苗接种方案是IM施用途径用于3周龄或更大的小猪，三次2ml的剂量以2-周的时间间隔。疫苗接种后母猪中的临床迹象在T02(BEI-VH)中未观察到，并且在其它处理组中是有限的。疫苗接种的使用似乎并未影响出生存活猪的百分比(数据未显示)。
通过两种分别的测定(聚焦荧光中和，基于S1的ELISA)评估孕猪血清学作为次要参数。两种测定都表明了在疫苗接种和暴露后T02(BEI-VH)中效价的显著提升(相较于T01(NC))。由于FFN测定的已知局限，也用基于S1的ELISA测试了样品。选择此种ELISA是因为刺突蛋白的S1结构域预期会含有中和表位。
在侧面暴露于PEDV之后，再暴露的处理组中所有的动物都具有可检测水平的中和抗体。T02(BEI-VH)中的母猪相较于T01(NC)动物具有大约三倍高的的效价。这表明了使用疫苗刺激了初始的初级应答，并在暴露于攻击病毒之后导致更大的次级应答。由于T02(BEI-VH)组中多个样品在所测试的最高稀释(1:640)具有可检测的中和抗体，这些结果很可能代表了这些结果很可能代表了组之间差异的保守估计。
表21:猪死亡率和母猪血清学数据总结如下
本文所公开和要求保护的所有组合物和方法在本公开的基础上可以进行制备和执行而无需进行过量的实验。虽然本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的术语来进行了描述，但是本领域技术人员会理解可以对所述组合物和方法以及对本文所述方法中的步骤和步骤的顺序进行改变，而不偏离本发明的构思、主旨和范围。更具体而言，某些化学上和生理学上相关的物质明显可以用来取代本文所描述的物质，而又实现相同的或相似的结果。所有此类本领域技术人员知晓的相似取代和修改都认为是在所附权利要求所限定的本发明的主旨、范围和构思之内的。
以下参考文献，在对本文所阐述的内容提供示例性的程序或其它细节补充的程度上，明确援引加入本文。
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序列表
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<151> 2014-04-03
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27995
<212> DNA
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 1
gactcttgtc tactcaattc aactaaacga aattccttgt ccttccggcc gcatgtccat 60
gctgctggaa gctgacgtgg aatttcatta ggtttgctta agtagccatc gcaagtgctg 120
tgctgtcctc tagttcctgg ttggcgttcc gtcgccttct acatactaga caaacagcct 180
tcctccggtt ccgtctgggg gttgtgtgga taactagttc cgtctagttt gaaaccagta 240
actgtcggct atggctagca accatgttac attggctttt gccaatgatg cagaaatttc 300
agcttttggc ttttgcactg ctagtgaagc cgtctcatac tattctgagg ccgccgctag 360
tggatttatg caatgccgtt tcgtgtcctt cgatctcgct gacactgttg agggattgct 420
tcccgaagac tatgtcatgg tggtggtcgg cactaccaag cttagtgcgt atgtggacac 480
ttttggtagc cgccccaaaa acatttgtgg ttggctgtta ttttctaact gtaattactt 540
cctcgaagag ttagagctta cttttggtcg tcgtggtggt aacatcgtgc cagttgacca 600
atacatgtgt ggcgctgacg gtaaacctgt tcttcaggaa tccgaatggg agtatacaga 660
tttctttgct gactccgaag acggtcaact caacattgct ggtatcactt atgtgaaggc 720
ctggattgta gagcgatcgg atgtctctta tgcgagtcag aatttaacat ctattaagtc 780
tattacttac tgttcaacct atgagcatac ttttcctgat ggtactgcca tgaaggttgc 840
acgtactcca aagattaaga agactgttgt cttgtctgag ccacttgcta ctatctacag 900
ggaaattggt tctccttttg tggataatgg gagcgatgct cgttctatca ttaagagacc 960
agtgttcctc cacgcttttg ttaagtgtaa gtgtggtagt tatcattgga ctgttggtga 1020
ttggacttcc tatgtctcca cttgctgtgg ctttaagtgt aagccagtcc ttgtggcttc 1080
atgctctgct acgcctggtt ctgttgtggt tacgcgcgct ggtgctggca ctggtgttaa 1140
gtattacaac aacatgttcc tgcgccatgt ggcagacatt gatgggttgg cattctggcg 1200
aattctcaag gtgcagtcca aagacgacct cgcttgctct ggtaaattcc ttgaacacca 1260
tgaggaaggt ttcacagatc cttgctactt tttgaatgac tcgagcattg ctactaagct 1320
caagtttgac atccttagtg gcaagttttc tgatgaagtc aaacaagcta tctttgctgg 1380
tcatgttgtt gttggcagcg cgmtcgttga cattgttgac gatgcactgg gacagccttg 1440
gtttatacgt aagcttggtg accttgcaag tgcagcttgg gagcagctta aggctgtcgt 1500
tagaggcctt aacctcctgt ctgatgaggt cgtgctcttt ggcaaaagac ttagctgtgc 1560
cactcttagt atcgttaacg gtgtttttga gttcatcgcc gaagtgcctg agaagttggc 1620
tgcggctgtt acagtttttg tcaacttctt gaatgagctt tttgagtctg cctgtgactg 1680
cttaaaggtc ggaggtaaaa cctttaacaa ggttggctct tatgttcttt ttgacaacgc 1740
attggttaag cttgtcaagg caaaagttcg cggcccacga caggcaggtg tttgtgaagt 1800
tcgttacaca agccttgtta ttgggagtac taccaaggtg gtttccaagc gcgttgaaaa 1860
tgccaatgtg aatctcgtcg tcgttgacga ggatgtgacc ctcaacacca ctggtcgtac 1920
agttgttgtt gacggacttg cattcttcga gagtgacggg ttttacagac atcttgctga 1980
tgctgacgtt gtcattgaac atcctgttta taagtctgct tgtgagctca agccagtttt 2040
tgagtgtgac ccaatacctg attttcctat gcctgtggcc gctagtgttg cagagctttg 2100
tgtgcaaact gatctgttgc ttaaaaatta caacactcct tataaaactt acagctgcgt 2160
tgtgagaggt gataagtgtt gtatcacttg caccttacat ttcacagcac caagttatat 2220
ggaggctgct gctaattttg tagacctctg taccaagaac attggtactg ctggttttca 2280
tgagttttac attacggccc atgaacaaca ggatctgcaa gggttcgtaa ccacttgttg 2340
cacgatgtca ggttttgagt gttttatgcc tataatccca cagtgtccag cagtgcttga 2400
agagattgat ggtggtagca tctggcggtc ttttatcact ggtcttaata caatgtggga 2460
tttttgcaag catcttaaag tcagctttgg actagatggc attgttgtca ctgtagcacg 2520
caaatttaaa cgacttggtg ctctcttggc agaaatgtat aacacttacc tttcaactgt 2580
ggtggaaaac ttggtactgg ccggtgttag cttcaagtat tatgccacca gtgtcccaaa 2640
aattgttttg ggctgttgtt ttcacagtgt taaaagtgtt cttgcaagtg ccttccagat 2700
tcctgtccag gcaggcgttg agaagtttaa agtcttcctt aactgtgttc accctgttgt 2760
accacgtgtc attgaaactt cttttgtgga attagaagag acgacattta aaccaccagc 2820
actcaatggt agtattgcta ttgttgatgg ctttgctttc tattatgatg gaacactata 2880
ctatcccacc gatggtaata gcgttgttcc tatctgcttt aagaagaaag gtggtggtga 2940
tgtcaaattc tctgatgaag tctctgttaa aaccattgac ccagtttata aggtctccct 3000
tgaatttgag ttcgagtctg agactattat ggctgtgctt aataaggctg ttggtaattg 3060
tatcaaggtt acaggtggtt gggacgatgt tgttgagtat atcaatgttg ccattgaggt 3120
tcttaaagat cacatcgatg tgcctaagta ctacatctat gatgaggaag gtggcaccga 3180
tcctaatctg cccgtaatgg tttctcagtg gccgttgaat gatgacacga tctcacagga 3240
tctgcttgat gttgaagttg ttactgatgc gccagttgat ttcgagggtg atgaagtaga 3300
ctcctctgac cctgwtaagg tggcagacgt ggctaactct gagcctgagg atgacggtct 3360
taatgtagct cctgaaacaa atgtagagtc tgaagttgag gaagttgccg caaccttgtc 3420
ctttaaagat acaccttcca cagttactaa ggatcctttt gcttttgact ttgcaagcta 3480
tggaggactt aaggttttaa gacaatctca taacaactgc tgggttactt ctaccttggt 3540
gcagctacaa ttgcttggca tcgttgatga ccctgcaatg gagcttttta gtgctggtag 3600
agttggtcca atggttcgca aatgctatga gtcacaaaag gctatcttgg gatctttggg 3660
tgatgtgtcg gcttgcctag agtctctgac taaggaccta cacacactta agattacctg 3720
ttctgtagtc tgtggttgtg gtactggtga acgtatctat gatggttgtg cttttcgtat 3780
gacgccaact ttggaaccgt tcccatatgg tgcttgtgct cagtgtgctc aagttttgat 3840
gcacactttt aaaagtattg ttggcaccgg catcttttgt cgagatacta ctgctctctc 3900
cttggattct ttggttgtaa aacctctttg tgcggctgct tttataggca aggatagtgg 3960
tcattatgtc actaactttt atgatgctgc tatggctatt gatggttatg gtcgtcatca 4020
gataaagtat gacacactga acactatttg tgttaaagac gttaattgga cagcaccttt 4080
tgtcccagac gttgagcctg tattggagcc tgttgtcaaa cctttctatt cttataagaa 4140
tgttgatttt taccaaggag attttagtga ccttgttaaa cttccatgtg attttgttgt 4200
taatgctgca aatgagaatt tgtctcacgg tggcggcata gcaaaggcca ttgatgttta 4260
taccaagggc atgttgcaga agtgctcgaa tgattacatt aaagcacacg gtcccattaa 4320
agttggacgt ggtgtcatgt tggaggcatt aggtcttaag gtctttaatg ttgttggtcc 4380
acgtaagggt aagcatgcac ctgagcttct tgttaaggct tataagtccg tttttgctaa 4440
ttcaggtgtt gctcttacac ctttgattag tgttggaatt tttagtgttc ctttggaaga 4500
atctttatct gcttttcttg catgtgttgg tgatcgccac tgtaagtgct tttgttatag 4560
tgacaaagag cgcgaggcga tcattaatta catggatggc ttggtagatg ctattttcaa 4620
agatgcactt gttgatacta ctcctgtcca ggaagatgtt caacaagttt cacaaaaacc 4680
agttttgcct aattttgaac ctttcaggat tgaaggtgct catgctttct atgagtgcaa 4740
ccctgaaggt ttgatgtcat taggtgctga caagctggtg ttgtttacaa attccaattt 4800
ggatttttgt agcgttggta agtgtcttaa caatgtgact ggcggtgcat tgcttgaagc 4860
cataaatgta tttaaaaaga gtaacaaaac agtgcctgct ggcaactgtg ttacttttga 4920
gtgtgcagat atgatttcta ttactatggt agtattgcca tctgacggtg atgctaatta 4980
tgacaaaaat tatgcacgcg ccgtcgtcaa ggtatctaag cttaaaggca agttattgct 5040
tgctgttggt gatgccatgt tgtattccaa gttgtcccac ctcagcgtgt taggtttcgt 5100
atccacacct gatgatgtgg agcgtttcta cgcaaataag agtgtggtta ttaaagttac 5160
tgaggataca cgtagtgtta agactgttaa agtagaatcc actgttactt atggacaaca 5220
aattggacct tgtcttgtta atgacaccgt tgtcacagac aacaaacctg ttgttgctga 5280
tgttgtagct aaggttgtac caagtgctaa ttgggattca cattatggtt ttgataaggc 5340
tggtgagttc cacatgctag accatactgg gtttgccttt cctagtgaag ttgttaacgg 5400
taggcgtgtg cttaaaacca cagataataa ctgttgggtt aatgttacat gtttacaatt 5460
acagtttgct agatttaggt tcaagtcagc aggtctacag gctatgtggg agtcctattg 5520
tactggtgat gttgctatgt ttgtgcattg gttgtactgg cttactggtg ttgacaaagg 5580
tcagcctagt gattcagaaa atgcacttaa catgttgtct aagtacattg ttcctgctgg 5640
ttctgtcact attgaacgtg tcacgcatga cggttgttgt tgtagtaagc gtgttgtcac 5700
tgcaccagtt gtgaatgcta gcgtgttgaa gcttggcgtc gaggatggtc tttgtccaca 5760
tggtcttaac tacattgaca aagttgttgt agttaaaggt actacaattg ttgtcaatgt 5820
tggaaaacct gtagtggcac catcgcacct ctttcttaag ggtgtttcct acacaacatt 5880
cctagataat ggtaacggtg ttgccggcca ttatactgtt tttgatcatg acactggtat 5940
ggtgcatgat ggagatgttt ttgtaccagg tgatctcaat gtgtctcctg ttacaaatgt 6000
tgtcgtctca gagcagacgg ctgttgtgat taaagaccct gtgaagaaag tagagttaga 6060
cgctacaaag ctgttagaca ctatgaatta tgcatcggaa agattctttt cctttggtga 6120
ttttatgtca cgtaatttaa ttacagtgtt tttgtacatc cttagtattt tgggtctctg 6180
ttttagggcc tttcgtaaga gggatgttaa agttctagct ggtgtacccc aacgtactgg 6240
tattatattg cgtaaaagtg tgcgctataa tgcaaaggct ttgggtgtct tcttcaagct 6300
aaaactttat tggttcaaag ttcttggtaa gtttagtttg ggtatttatg cattgtatgc 6360
attactattc atgacaatac gctttacacc tataggtggc cctgtttgtg atgatgttgt 6420
tgctggttat gctaattcta gttttgacaa gaatgagtat tgcaacagtg ttatttgtaa 6480
ggtctgtctc tatgggtacc aggaactttc ggacttctct cacacacagg tagtatggca 6540
acaccttaga gacccattaa ttggtaatgt gatgcctttc ttttatttgg catttctggc 6600
aatttttggg ggtgtttatg taaaggctat tactctctat tttattttcc agtatcttaa 6660
catacttggt gtgtttttgg gcctacaaca gtccatttgg tttttgcagc ttgtgccttt 6720
tgatgtcttt ggtgacgaga tcgtcgtctt tttcatcgtt acacgcgtat tgatgttcct 6780
taagcatgtt ttccttggct gcgataaggc atcttgtgtg gcttgctcta agagtgctcg 6840
ccttaagcgc gttcctgtcc agactatttt tcagggtact agcaaatcct tctacgtaca 6900
tgccaatggt ggttctaagt tctgtaagaa gcacaatttc ttttgtttaa attgtgattc 6960
ttatggtcca ggctgcactt ttattaatga cgtcattgca actgaagttg gtaatgttgt 7020
caaacttaat gtgcaaccga caggtcctgc cactattctt attgacaagg ttgaattcag 7080
taatggtttt tactatcttt atagtggtga cacattttgg aagtacaact ttgacataac 7140
agataacaaa tacacttgca aagagtcact taaaaattgt agcataatca cagactttat 7200
tgtttttaac aataatggtt ccaatgtaaa tcaggttaag aatgcatgtg tgtatttttc 7260
acagatgctt tgtaaacctg ttaagttagt ggactcagcg ttgttggcca gtttgtctgt 7320
tgattttggt gcaagcttac atagtgcttt tgttagtgtg ttgtcgaata gttttggcaa 7380
agacctgtca agttgtaatg acatgcagga ttgcaagagc acattgggtt ttgatgatgt 7440
accattggat acctttaatg ctgctgttgc tgaggctcat cgttacgatg tcctcttgac 7500
tgacatgtcg ttcaacaatt ttaccaccag ttatgcaaaa ccagaggaaa aacttcccgt 7560
ccatgacatt gccacgtgta tgcgtgtagg tgccaagatt gttaatcata acgttcttgt 7620
caaggatagt atacctgtgg tgtggcttgt acgtgatttc attgcccttt ctgaagaaac 7680
taggaagtac attattcgta cgactaaagt taagggtata accttcatgt tgacctttaa 7740
tgattgtcgt atgcatacta ccatacctac tgtttgcatt gcaaataaga agggtgcagg 7800
tcttcctagt ttttcaaagg ttaagaaatt cttctggttt ttgtgtctgt tcatagttgc 7860
tgttttcttt gcactaagct tttttgattt tagtactcag gttagcagtg atagtgatta 7920
tgacttcaag tatattgaga gtggccagtt gaagactttt gacaatccac ttagttgtgt 7980
gcataatgtc tttagtaact tcgaccagtg gcatgatgcc aagtttggtt tcacccccgt 8040
caacaatcct agttgtccta tagtcgttgg tgtatcagac gaagcgcgca ctgttccagg 8100
tatcccagca ggtgtttatt tagctggtaa aacacttgtt tttgctatta acaccatttt 8160
tggtacatct ggtttgtgct ttgatgctag tggcgttgct gataagggcg cttgcatttt 8220
taattcggct tgcaccacat tatctggttt gggtggaact gctgtctact gttataagaa 8280
tggtctagtt gaaggtgcta aactttatag tgagttggca cctcatagct actataaaat 8340
ggtagatggt aatgctgtgt ctttacctga aattatctca cgcggctttg gcatccgtac 8400
tatccgtaca aaggctatga cctactgtcg cgttggccag tgtgtgcaat ctgcagaagg 8460
tgtttgtttt ggcgccgata gattctttgt ctataatgca gaatctggtt ctgactttgt 8520
ttgtggcaca gggctcttta cattgttgat gaacgttatt agtgtttttt ccaagacagt 8580
accagtaact gtgttgtctg gtcaaatact ttttaattgc attattgctt ttgctgctgt 8640
tgcggtgtgt ttcttattta caaagtttaa gcgcatgttc ggtgatatgt ctgttggcgt 8700
tttcactgtc ggtgcttgta ctttgttgaa caatgtttcc tacattgtaa cacagaacac 8760
acttggcatg ttgggctatg caactttgta ctttttgtgc actaaaggtg ttagatatat 8820
gtggatttgg catttgggat ttttgatctc atatatactt attgcaccat ggtgggtttt 8880
gatggtttat gccttttcag ccatttttga gtttatgcct aaccttttta agcttaaggt 8940
ttcaacacaa ctttttgagg gtgacaagtt cgtaggctct tttgaaaatg ctgcagcagg 9000
tacatttgtg cttgatatgc atgcctatga gagacttgcc aactctatct caactgaaaa 9060
actgcgtcag tatgctagta cttacaataa gtacaagtat tattcaggca gtgcttcaga 9120
ggctgattac aggcttgctt gttttgccca tttggccaag gctatgatgg attatgcttc 9180
taatcacaac gacacgttat acacaccacc cactgtgagt tacaattcaa ctctacaggc 9240
tggcttgcgt aagatggcac aaccatctgg tgttgttgag aagtgcatag ttcgtgtttg 9300
ctatggtaat atggctctta atggcctatg gcttggtgat actgttatct gcccacgcca 9360
tgttatagcg tctagtacta ctagcactat agattatgac tatgcccttt ctgttttacg 9420
cctcyacaac ttctccattt catctggtaa tgttttccta ggtgttgtgg gtgtaaccat 9480
gcgaggtgct ttgttgcaga taaaggttaa tcaaaacaat gtccacacgc ctaagtacac 9540
ctatcgcaca gttagaccgg gtgaatcttt taatatcttg gcgtgctatg atggttctgc 9600
agctggtgtt tacggcgtta acatgcgctc taattacact attagaggct cgttcattaa 9660
tggcgcttgt ggttcacctg gttataacat taacaatggt accgttgagt tttgctattt 9720
acaccagctt gaacttggtt caggctgtca tgttggtagc gacttagatg gtgttatgta 9780
tggtggttat gaggaccaac ctactttgca agttgaaggc gctagtagtc tgtttacaga 9840
gaatgtgttg gcatttcttt atgcagcact cattaatggt tctacctggt ggcttagttc 9900
ttctaggatt gctgtagaca ggtttaatga gtgggctgtt cataatggta tgacaacagt 9960
agttaatact gattgctttt ctattcttgc tgctaagact ggtgttgatg tacaacgttt 10020
gttggcctca atccagtctc tgcataagaa ttttggtgga aagcaaattc ttggctatac 10080
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cagccgatgt tcaggttgac cgtctcatca ccggcagatt atcagcactt aatgcttttg 23880
ttgctcaaac cctcactaag tatactgagg ttcaggctag caggaagtta gcacagcaaa 23940
aggttaatga gtgcgttaaa tcgcaatccc agcgttatgg tttttgtggt ggtgatggcg 24000
agcacatttt ctctctggta caggcagcac ctcagggcct gctgttttta catacagtac 24060
ttgtaccgag tgattttgta gatgttattg ccatcgctgg cttatgcgtt aacgatgaaa 24120
ttgccttgac tctacgtgag cctggcttag tcttgtttac gcatgaactt caaaatcata 24180
ctgcgacgga atattttgtt tcatcgcgac gtatgtttga acctagaaaa cctaccgtta 24240
gtgattttgt tcaaattgag agttgtgtgg tcacctatgt caatttgact agagaccaac 24300
taccagatgt aatcccagat tacatcgatg ttaacaaaac acttgatgag attttagctt 24360
ctctgcccaa tagaactggt ccaagtcttc ctttagatgt ttttaatgcc acttatctta 24420
atctcactgg tgaaattgca gatttagagc agcgttcaga gtctctccgt aatactacag 24480
aggagctcca aagtcttata tataatatca acaacacact agttgacctt gagtggctca 24540
accgagttga gacatatatc aagtggccgt ggtgggtttg gttgattatt ttcattgttc 24600
tcatctttgt tgtgtcatta ctagtgttct gctgcatttc cacgggttgt tgtggatgct 24660
gcggctgctg ctgtgcttgt ttctcaggtt gttgtagggg tcctagactt caaccttacg 24720
aagtttttga aaaggtccac gtgcagtgat gtttcttgga ctttttcaat acacgattga 24780
cacagttgtc aaagatgtct caaagtctgc taacttgtct ttggatgctg tccaagagtt 24840
ggagctcaat gtagttccaa ttagacaagc ttcaaatgtg acgggttttc ttttcaccag 24900
tgtttttatc tacttctttg cactgtttaa agcgtcttct ttgaggcgca attatattat 24960
gttggcagcg cgttttgctg tcattgttct ttattgccca cttttatatt attgtggtgc 25020
atttttagat gcaactatta tttgttgcac acttattcaa agtcggtggc aggctttgtt 25080
tagtctgctt ttactcctgg cgctataaaa atgcgctctt tattattttt aatactacga 25140
cactttcttt cctcaatggt aaagcagctt attatgacgg caaatccatt gtgattttag 25200
aaggtggtga ccattacatc acttttggca actcttttgt tgcttttgtt agtagcatcg 25260
acttgtatct agctatacgt gggcggcaag aagctgacct acagctgttg cgaactgttg 25320
agcttcttga tggcaagaag ctttatgtct tttcgcaaca tcaaattgtt ggcattacta 25380
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tacacaccta tagggcgttt gtatagagtt tataagtctt acatgcaaat agaccccctc 25620
cctagtactg ttattgacgt ataaacgaaa tatgtctaac ggttctattc ccgttgatga 25680
ggtgattcaa caccttagaa actggaattt cacatggaat atcatactga cgatactact 25740
tgtagtgctt cagtatggcc attacaagta ctctgcgttc ttgtatggtg tcaagatggc 25800
tattctatgg atactttggc ctcttgtgtt agcactgtca ctttttgatg catgggctag 25860
ctttcaggtc aattgggtct tttttgcttt cagcatcctt atggcttgca tcactcttat 25920
gctgtggata atgtactttg tcaatagcat tcggttgtgg cgcaggacac attcttggtg 25980
gtctttcaat cctgaaacag acgcgcttct cactacttct gtgatgggcc gacaggtctg 26040
cattccagtg cttggagcac caactggtgt aacgctaaca ctccttagtg gtacattgct 26100
tgtagagggc tataaggttg ctactggcgt acaggtaagt caattaccta atttcgtcac 26160
agtcgccaag gccactacaa caattgtcta cggacgtgtt ggtcgttcag tcaatgcttc 26220
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gcccctctta gggttactaa tgacaaaccc ctttctaagg tacttgcaaa taatgctgta 26460
cccactaata aaggaaataa ggaccagcaa attggatact ggaatgagca aattcgctgg 26520
cgcatgcgcc gtggtgagcg aattgaacaa ccttccaatt ggcatttcta ctacctcgga 26580
acaggacctc acgccgacct ccgctatagg actcgtactg agggtgtttt ctgggttgct 26640
aaagaaggcg caaagactga acccactaac ctgggtgtca gaaaggcgtc tgaaaagcca 26700
attattccaa atttctctca acagcttccc agcgtagttg agattgttga acctaacaca 26760
cctcctactt cacgtgcaaa ttcacgtagc aggagtcgtg gtaatggcaa caacaggtcc 26820
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tctcgtaacc agtccaagaa cagaaaccag tcaaatgacc gtggtggtgt aacatcacgc 27000
gatgatctgg tggctgctgt caaggatgcc cttaaatctt tgggtattgg cgaaaaccct 27060
gacaagctta agcaacagca gaagcccaaa caggaaaggt ctgacagcag cggcaaaaat 27120
acacctaaga agaacaaatc cagagccact tcgaaagaac gtgacctcaa agacatccca 27180
gagtggagga gaattcccaa gggcgaaaat agcgtagcag cttgcttcgg acccagggga 27240
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tctgatccaa atgtagagct tcttgtttca caggtggatg catttaaaac tgggaatgca 27480
aaaccccaga gaaagaagga aaagaagaay aagcgtgaaa ccacgcagca gctgaatgaa 27540
gaggccatct acgatgatgt gggtgtgcca tctgatgtga ctcatgccaa tttggaatgg 27600
gacacagctg ttgatggtgg tgacacggcc gttgaaatta tcaacgagat cttcgacaca 27660
ggaaattaaa caatgtttga ctggcttatc ctggctatgt cccagggtag tgccattaca 27720
ctgttattac tgagtgtttt tctagcgact tggctgctgg gctatggctt tgccctctaa 27780
ctagcggtct tggtcttgca cacaacggta agccagtggt aatgtcagtg caagaaggat 27840
attaccatag cactgtcatg aggggaacgc agtacctttt catctaaacc tttgcacgag 27900
taatcaaaga tccgcttgac gagcctatat ggaagagcgt gccaggtatt tgactcaagg 27960
actgttagta actgaagacc tgacggtgtt gatat 27995
<210> 2
<211> 4159
<212> DNA
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 2
atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60
caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120
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tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300
gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360
gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420
gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480
catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540
tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600
ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca tgcttaatgt tactagtgct 660
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cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840
gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900
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tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680
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atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt 1860
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ttagctacca ttagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640
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<212> PRT
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
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Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
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Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
50 55 60
Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
65 70 75 80
Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser
85 90 95
Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala
100 105 110
Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
115 120 125
Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr
130 135 140
Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
145 150 155 160
His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
165 170 175
Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val
180 185 190
Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr
195 200 205
Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys
260 265 270
Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg
305 310 315 320
Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val
325 330 335
Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser
340 345 350
Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln
355 360 365
Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val
370 375 380
Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile
385 390 395 400
Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu
405 410 415
Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp
420 425 430
Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp
435 440 445
Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys
450 455 460
Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu
465 470 475 480
Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu
485 490 495
Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe
500 505 510
Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn
515 520 525
Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val
530 535 540
Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr
580 585 590
Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu
595 600 605
Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys
610 615 620
Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp
625 630 635 640
Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly
645 650 655
Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala
660 665 670
Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn
675 680 685
Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu
690 695 700
Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu
705 710 715 720
Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr
725 730 735
His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser
740 745 750
Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln
755 760 765
Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile
770 775 780
Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr
785 790 795 800
Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn
805 810 815
Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr
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Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val
835 840 845
Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile
850 855 860
Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val
865 870 875 880
Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe
885 890 895
Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr
900 905 910
Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp
915 920 925
Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val
930 935 940
Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly
945 950 955 960
Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr
965 970 975
Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu
980 985 990
Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly
995 1000 1005
Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln
1010 1015 1020
Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val
1025 1030 1035
Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr
1040 1045 1050
Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp
1055 1060 1065
Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val
1070 1075 1080
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys
1100 1105 1110
Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln
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Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu
1130 1135 1140
Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu
1145 1150 1155
Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys
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Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val
1175 1180 1185
Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe
1190 1195 1200
Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser
1205 1210 1215
Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu
1220 1225 1230
Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val
1235 1240 1245
Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr
1250 1255 1260
Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn
1265 1270 1275
Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu
1280 1285 1290
Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn
1295 1300 1305
Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr
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Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu
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Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly
1340 1345 1350
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
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gcggccgcac tgcacgtgga ccttttc 27
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<211> 3912
<212> DNA
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 6
gatgtcacca ggtgctcagc taacactaat tttaggcggt tcttttcaaa atttaatgtt 60
caggcgcctg cagttgttgt actgggcggt tatctaccta ttggtgaaaa ccagggtgtc 120
aattcaactt ggtactgtgc tggccaacat ccaactgcta gtggcgttca tggtatcttt 180
gttagccata ttagaggtgg tcatggcttt gagattggca tttcgcaaga gccttttgac 240
cctagtggtt accagcttta tttacataag gctactaacg gtaacactaa tgctactgcg 300
cgactgcgca tttgccagtt tcctagcatt aaaacattgg gccccactgc taataatgat 360
gttacaacag gtcgtaattg cctatttaac aaagccatcc cagctcatat gagtgaacat 420
agtgttgtcg gcataacatg ggataatgat cgtgtcactg tcttttctga caagatctat 480
tatttttatt ttaaaaatga ttggtcccgt gttgcgacaa agtgttacaa cagtggaggt 540
tgtgctatgc aatatgttta cgaacccacc tattacatgc ttaatgttac tagtgctggt 600
gaggatggta tttcttatca accctgtaca gctaattgca ttggttatgc tgccaatgta 660
tttgctactg agcccaatgg ccacatacca gaaggtttta gttttaataa ttggtttctt 720
ttgtccaatg attccacttt ggtgcatggt aaggtggttt ccaaccaacc attgttggtc 780
aattgtcttt tggccattcc taagatttat ggactaggcc aatttttctc ctttaatcaa 840
acgatcgatg gtgtttgtaa tggagctgct gtgcagcgtg caccagaggc tctgaggttt 900
aatattaatg acacctctgt cattcttgct gaaggctcaa ttgtacttca tactgcttta 960
ggaacaaatt tttcttttgt ttgcagtaat tcctcaaatc ctcacttagc caccttcgcc 1020
atacctttgg gtgctaccca agtaccctat tattgttttc ttaaagtgga tacttacaac 1080
tccactgttt ataaattctt ggctgtttta cctccaaccg tcagggaaat tgtcatcacc 1140
aagtatggtg atgtttatgt caatgggttt ggatacttgc atctcggttt gttggatgct 1200
gtcacaatta atttcactgg tcatggcact gacgatgatg tttctggttt ttggaccata 1260
gcatcgacta attttgttga tgcactcatc gaagttcaag gaaccgccat tcagcgtatt 1320
ctttattgtg atgatcctgt tagccaactc aagtgttctc aggttgcttt tgaccttgac 1380
gatggttttt accctatttc ttctagaaac cttctgagtc atgaacagcc aatttctttt 1440
gttactctgc catcatttaa tgatcattct tttgttaaca ttactgtatc tgcttccttt 1500
ggtggtcata gtggtgccaa ccttattgca tctgacacta ctatcaatgg gtttagttct 1560
ttctgtgttg acactagaca atttaccatt tcactgtttt ataacgttac aaacagttat 1620
ggttatgtgt ctaaatcaca ggacagtaat tgccctttca ccttgcaatc tgttaatgat 1680
tacctgtctt ttagcaaatt ttgtgtttcc accagccttt tggctagtgc ctgtaccata 1740
gatctttttg gttaccctga gtttggtagt ggtgttaagt ttacgtccct ttactttcaa 1800
ttcacaaagg gtgagttgat tactggcacg cctaaaccac ttgaaggtgt cacggacgtt 1860
tcttttatga ctctggatgt gtgtaccaag tatactatct atggctttaa aggtgagggt 1920
atcattaccc ttacaaattc tagctttttg gcaggtgttt attacacatc tgattctgga 1980
cagttgttag cctttaagaa tgtcactagt ggtgctgttt attctgttac gccatgttct 2040
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tctaattgta cagagcctgt gttggtgtat agtaacatag gtgtttgtaa atctggcagt 2220
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acgcctgtta gtgttgattg tgccacatat gtttgtaatg gtaactctcg ttgtaaacaa 2400
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atcccagatt acatcgatgt taacaaaaca cttgatgaga ttttagcttc tctgcccaat 3720
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<211> 1304
<212> PRT
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 7
Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser
1 5 10 15
Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly Gly Tyr Leu
20 25 30
Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly
35 40 45
Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Val Ser His Ile
50 55 60
Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp
65 70 75 80
Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr
85 90 95
Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser Ile Lys Thr
100 105 110
Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu
115 120 125
Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser Val Val Gly
130 135 140
Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp Lys Ile Tyr
145 150 155 160
Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Lys Cys Tyr
165 170 175
Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr
180 185 190
Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Gln Pro
195 200 205
Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Glu
210 215 220
Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu
225 230 235 240
Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln
245 250 255
Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu
260 265 270
Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly Val Cys Asn Gly
275 280 285
Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp
290 295 300
Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu
305 310 315 320
Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asn Pro His Leu
325 330 335
Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val Pro Tyr Tyr Cys
340 345 350
Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala
355 360 365
Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp
370 375 380
Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala
385 390 395 400
Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly
405 410 415
Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu Val
420 425 430
Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser
435 440 445
Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr
450 455 460
Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe
465 470 475 480
Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp
500 505 510
Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe
515 520 525
Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser
530 535 540
Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp
545 550 555 560
Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser
565 570 575
Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val
580 585 590
Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr
595 600 605
Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr
610 615 620
Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly
625 630 635 640
Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr
645 650 655
Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly Ala
660 665 670
Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Val
675 680 685
Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr Phe
690 695 700
Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn Asp Gly
705 710 715 720
Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys
725 730 735
Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Ser Gly Gln Val Lys
740 745 750
Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn Phe Ser
755 760 765
Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr Asn Thr Pro Val Ser
770 775 780
Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn Ser Arg Cys Lys Gln
785 790 795 800
Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr Ile Glu Ser Ala Leu
805 810 815
Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Ser Met Leu Thr
820 825 830
Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser Ser Phe Asn Gly
835 840 845
Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Asp Pro
850 855 860
Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu
865 870 875 880
Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr Val Asp Glu Asp Tyr
885 890 895
Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp Leu Val Cys Ala Gln
900 905 910
Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val Val Asp Ala Glu Lys
915 920 925
Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Met Val Leu Gly Gly
930 935 940
Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr Ala Val Gln Ala Arg
945 950 955 960
Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu Gln Arg Asn Gln Gln
965 970 975
Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly Asn Ile Thr Ser Ala
980 985 990
Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr Ser Lys Gly Leu Asn
995 1000 1005
Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu Val Val Asn Ser
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Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr Val Gln Leu Gln His Asn
1025 1030 1035
Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser Arg Leu
1040 1045 1050
Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly
1055 1060 1065
Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys
1070 1075 1080
Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val
1085 1090 1095
Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln Arg Tyr Gly Phe Cys Gly
1100 1105 1110
Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu Val Gln Ala Ala Pro Gln
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Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu Val Pro Ser Asp Phe Val
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Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys Val Asn Asp Glu Ile Ala
1145 1150 1155
Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val Leu Phe Thr His Glu Leu
1160 1165 1170
Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe Val Ser Ser Arg Arg Met
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Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser Asp Phe Val Gln Ile Glu
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Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu Thr Arg Asp Gln Leu Pro
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Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn Lys Thr Leu Asp Glu
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Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr Gly Pro Ser Leu Pro Leu
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Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu Ile Ala
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<211> 4131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
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gttgagacat atatcaagtg gaaaagctct attgcctctt ttttctttat catagggtta 4020
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accaagaaaa gacagattta tacagacata gagatgaacc gacttggaaa g 4131
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<211> 1377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
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Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
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50 55 60
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65 70 75 80
Ile Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile
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Glu His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val
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325 330 335
Val Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn
340 345 350
Ser Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr
355 360 365
Gln Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr
370 375 380
Val Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val
385 390 395 400
Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His
405 410 415
Leu Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr
420 425 430
Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val
435 440 445
Asp Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr
450 455 460
Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp
465 470 475 480
Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His
485 490 495
Glu Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser
500 505 510
Phe Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala
515 520 525
Asn Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys
530 535 540
Val Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn
545 550 555 560
Ser Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr
565 570 575
Leu Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser
580 585 590
Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro
595 600 605
Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr
610 615 620
Lys Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr
625 630 635 640
Asp Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr
645 650 655
Gly Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu
660 665 670
Ala Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys
675 680 685
Asn Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser
690 695 700
Glu Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser
705 710 715 720
Leu Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe
725 730 735
Tyr His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr
740 745 750
Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser
755 760 765
Gln Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser
770 775 780
Ile Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu
785 790 795 800
Tyr Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly
805 810 815
Asn Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys
820 825 830
Thr Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu
835 840 845
Val Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr
850 855 860
Ile Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly
865 870 875 880
Val Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser
885 890 895
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly
900 905 910
Thr Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala
915 920 925
Asp Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly
930 935 940
Val Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly
945 950 955 960
Gly Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser
965 970 975
Tyr Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val
980 985 990
Leu Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile
995 1000 1005
Gly Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser
1010 1015 1020
Gln Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys
1025 1030 1035
Val Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu
1040 1045 1050
Thr Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile
1055 1060 1065
Asp Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln
1070 1075 1080
Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe
1085 1090 1095
Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg
1100 1105 1110
Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser
1115 1120 1125
Gln Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser
1130 1135 1140
Leu Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val
1145 1150 1155
Leu Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu
1160 1165 1170
Cys Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu
1175 1180 1185
Val Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr
1190 1195 1200
Phe Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val
1205 1210 1215
Ser Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn
1220 1225 1230
Leu Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp
1235 1240 1245
Val Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg
1250 1255 1260
Thr Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu
1265 1270 1275
Asn Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser
1280 1285 1290
Leu Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile
1295 1300 1305
Asn Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr
1310 1315 1320
Tyr Ile Lys Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile
1325 1330 1335
Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His
1340 1345 1350
Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr
1355 1360 1365
Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1370 1375
<210> 10
<211> 28039
<212> DNA
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 10
acttaaaaag attttctatc tacggatagt tagctctttt tctagactct tgtctactca 60
attcaactaa acgaaatttt gtccttccgg ccgcatgtcc atgctgctgg aagctgacgt 120
ggaatttcat taggtttgct taagtagcca tcgcaagtgc tgtgctgtcc tctagttcct 180
ggttggcgtt ccgtcgcctt ctacatacta gacaaacagc cttcctccgg ttccgtctgg 240
gggttgcgtg gataactagt tccgtctagt ttgaaaccag taactgtcgg ctatggctag 300
caaccaagtc acattggctt ttgccaatga tgcagaaatt tcagcttttg gcttttgcac 360
tgctagtgaa gccgtctcat actattctga ggccgccgct agtggattta tgcaatgccg 420
tttcgtgtcc ttcgatctcg ctgacactgt tgagggattg cttcccgaag actatgtcat 480
ggtggtggtc ggcactacca agcttagtgc gtatgtggac acttttggta gccgccccag 540
aaacatttgt ggttggctgt tattttctaa ctgtaattac ttcctcgaag agttagagct 600
cacttttggt cgtcgtggtg gtaacatcgt gccagttgac caatacatgt gtggcgctga 660
cgggaaacct gttcttcagg aatccgagtg ggagtataca gacttttttg ctgactccga 720
agacggtcaa ctcaacattg ctgggatcac ttatgtgaag gcctggattg tagagcgatc 780
ggacgtctct tatgcgagtc agaatttaac atctattaag tctattactt actgttcaac 840
ctatgagcat acttttcctg atggtactgc catgaaggtt gcacgtactc caaagattaa 900
gaagactgtt gtcttgtctg agccacttgc tactatctac agggaaattg gttctccttt 960
tgtggataat gggagcgatg ctcgttctat cattaagaga ccagtgttcc tccacgcttt 1020
tgttaagtgt aagtgtggta gttatcattg gactgttggt gattggactt cctatgtctc 1080
cacttgctgt ggctttaagt gtaagccagt ccttgtggct tcatgctctg ctacgcctgg 1140
ttctgttgtg gttacgcgcg ctggtgctgg cactggtgtt aagtattaca acaacatgtt 1200
cctgcgccat gtggcagaca ttgatgggtt ggcattctgg cgaattctta aggtgcagtc 1260
caaagacgac ctcgcttgct ctggtaaatt ccttgaacac catgaggaag gtttcacaga 1320
tccttgctac tttttgaatg actcgagcat tgctactaag ctcaagtttg acatccttag 1380
tggcaagttt tctgatgaag tcaaacaagc tatctttgct ggtcatgttg ttgttggcag 1440
tgcgctcgtt gacattgttg acgatgcact gggacagcct tggtttatac gtaagcttgg 1500
tgaccttgca agtgcagctt gggagcagct taaggctgtc gttagaggcc ttaacctcct 1560
gtctgatgag gtcgtgctct ttggcaaaag acttagctgt gccactctta gtatcgttaa 1620
cggtgttttt gagtttatcg ccgaagtgcc agagaagttg gctgcggctg ttacagtttt 1680
tgtcaacttc ttgaatgagc tttttgagtc tgcctgtgac tgcttaaagg tcggaggtaa 1740
aacctttaac aaggttggct cctatgtcct ttttgacaac gcattggtta agcttgtcaa 1800
ggcaaaagtt cgcggcccac gacaggcagg tgtttgtgaa gttcgttaca caagccttgt 1860
tattgggagt actaccaagg tggtttccaa gcgcgttgaa aatgccaatg tgaatctcgt 1920
cgtcgttgac gaggatgtga ccctcaacac cactggtcat acagttgttg ttgacggact 1980
tgcattcttc gagagtgacg ggttttacag acatcttgct gatgctgacg ttgtcattga 2040
acatcctgtt tataagtctg cttgtgagct caagccagtt tttgagtgtg atccaatacc 2100
tggttttcct atgcctgtgg ccgctagtgt tgcagagctt tgtgtgcaaa ctgatctgtt 2160
gcttaaaaat tacaacactc cttataaaac ttacagctgc gttgtgagag gtgataagtg 2220
ttgcatcact tgcaccttac atatcacagc accaagttat atggaggatg ctgctaattt 2280
tgtagacctc tgtaccaaga acattggtac tgctggtttt catgagtttt acattacggc 2340
ccatgaacaa caggatctgc aagggttcgt aaccacttgt tgcacgatgt caggttttga 2400
gtgttttatg cctataatcc cacagtgtcc agcagtgctt gaagagattg atggtggtag 2460
catctggcgg tcttttatca ctggtcttaa tacaatgtgg gatttttgca agcatcttaa 2520
agtcagcttt ggactagatg gcattgttgt cactgtagca cgcaaattta aacgacttgg 2580
tgctctcttg gcagaaatgt ataacactta cctttcaact gtggtggaaa acttggtact 2640
ggccggtgtt agcttcaagt attatgccac cagtgtccca aaaattgttt tgggctgttg 2700
ttttcacagt gttaaaagtg ttcttgcaag tgccttccag attcctgtcc aggcaggcat 2760
tgagaagttt aaagtcttcc ttaactgtgt tcaccctgtt gtaccacgcg tcattgaaac 2820
ttcttttgtg gaattagaag agacgacatt taaaccacca gcactcaatg gtagtattgc 2880
tattgttgat ggctttgctt tctattatga tggaacacta tactatccca ccgatggtaa 2940
tagtgttgtg cctatttgtt ttaagaagaa gggtggtggt gatgtcaaat tctctgatga 3000
agtctctgtt agaaccattg acccagttta taaggtctcc cttgaatttg agttcgagtc 3060
tgagactatt atggctgtgc ttaataaggc tgttggtaat cgtatcaagg ttacaggtgg 3120
ttgggacgat gttgttgagt atatcaacgt tgccattgag gttcttaaag atcatatcga 3180
tgtgcctaag tactacatct atgatgagga aggtggcacc gatcctaatc ttcccgtaat 3240
ggtttctcag tggccgttga atgatgacac gatctcacag gatctgcttg atgtggaagt 3300
tgttactgat gcaccaattg atttcgaggg tgatgaagta gactcctctg accctgataa 3360
ggtggcagat gtggctaact ctgagcctga ggatgatggt cctaatgtag ctcctgaaac 3420
aaatgtagag tctgaagttg aggaagttgc cgcaaccttg tcttttatta aagatacacc 3480
ttccacagtt actaaggatc cttttgcttt tgactttgca agctatggag gacttaaggt 3540
tttaagacaa tctcataaca actgctgggt tacttctacc ttggtgcagc tacaattgct 3600
tggcatcgtt gatgaccctg caatggagct ttttagtgct ggtagagttg gtccaatggt 3660
tcgcaaatgc tatgagtcac aaaaggctat cttgggatct ttgggtgatg tgtcggcttg 3720
cctagagtct ctgactaagg acctacacac acttaagatt acctgttctg tagtctgtgg 3780
ttgtggtact ggtgaacgta tctatgaggg ttgtgctttt cgtatgacgc caactttgga 3840
accgttccca tatggtgctt gtgctcagtg tgctcaagtt ttgatgcaca cttttaaaag 3900
tattgttggc accggcatct tttgtcgaga tactactgct ctctccttgg attctttggt 3960
tgtaaaacct ctttgtgcgg ctgcttttat aggcaaggat agtggtcatt atgtcactaa 4020
cttttatgat gctgctatgg ctattgatgg ttatggtcgt catcagataa agtatgacac 4080
actgaacact atttgtgtta aagacgttaa ttggacagca ccttttgtcc cagacgttga 4140
gcctgtattg gagcctgttg tcaaaccttt ctattcttat aagaatgttg atttttacca 4200
aggagatttt agtgaccttg ttaaacttcc atgtgatttt gttgttaatg ctgcaaatga 4260
gaatttgtct cacggtggcg gcatagcaaa ggccattgat gtttatacca agggcatgtt 4320
gcagaagtgc tcgaatgatt acattaaagc acacggtccc attaaagttg gacgtggtgt 4380
catgttggag gcattaggtc ttaaggtctt taatgttgtt ggtccacgta agggtaagca 4440
tgcacctgag cttcttgtta aggcttataa gtccgttttt gctaattcag gtgttgctct 4500
tacacctttg attagtgttg gaatttttag tgttcctttg gaagaatctt tatctgcttt 4560
tcttgcatgt gttggtgatc gccactgtaa gtgcttttgt tatagtgaca aagagcgcga 4620
ggcgatcatt aattacatgg atggcttggt agatgctatt ttcaaagatg cgcttgttga 4680
tactactcct gtccaggaag atgttcaaca agtttcacaa aaaccagttt tgcctaattt 4740
tgaacctttc aggattgaag gtgctcatgc tttctatgag tgcaaccctg aaggtttgat 4800
gtcattaggt gctgacaagc tggtgttgtt tacaaattcc aatttggatt tttgtagcgt 4860
tggtaagtgt cttaacaatg tgaccggcgg tgcattgctt gaagccataa atgtatttaa 4920
aaagagtaac aaaacagtgc ctgctggcaa ctgtgttact tttgagtgtg cagacatgat 4980
ttctattact atggtagtat tgccatctga tggtgatgct aattatgaca aaaattatgc 5040
acgcgccgtc gtcaaggtat ctaagcttaa aggcaagtta ttgcttgctg ttggtgatgc 5100
cacgttgtat tccaagttgt cccacctcag cgtggtaggt ttcgtatcca cacctgatga 5160
tgtggagcgt ttctacgcaa ataagagtgt ggttattaaa gtcactgagg atacacgtag 5220
tgttaaggct gttaaagtag aatccactgt tacttatgga caacaaattg gaccttgtct 5280
tgttaatgac accgttgtca cagacaacaa acctgttgtt gctgatgttg tagctaaggt 5340
tgtaccaagt gctaattggg attcacatta tggttttgat aaggctggtg agttccacat 5400
gctagaccat actgggtttg cctttcctag tgaagttgtt aacggtaggc gtgtgcttaa 5460
aaccacagat aataactgtt gggttaatgt tacatgttta caattacagt ttgctagatt 5520
taggttcaag tcagcaggtc tacaggctat gtgggagtcc tattgtactg gtgatgttgc 5580
tatgtttgtg cattggttgt actggcttac tggtgttgac aaaggtcagc ctagtgattc 5640
agaaaatgca cttaacatgt tgtccaagta cattgtttct gctggttctg tcactattga 5700
acgtgtcacg catgacggct gttgttgtag taagcgtgtt gtcactgcac cagttgtgaa 5760
tgctagcgta ttgaagcttg gcgtcgagga tggtctttgt ccacatggtc ttaactacat 5820
tgacaaagtt gttgtagtca aaggtactac aattgttgtc aatgttggaa aacctgtagt 5880
ggcaccatca cacctctttc ttaagggtgt ttcttacaca acattcctag ataatggtaa 5940
cggtgttgtc ggccattata ctgtttttga tcatgacact ggtatggtgc atgatggaga 6000
tgcttttgta ccgggtgatc tcaatgtatc tcctgttaca aatgttgtcg tctcagagca 6060
gacggctgtt gtgattaaag accctgtgaa gaaagtagag ttagacgcta caaagctgtt 6120
agacactatg aattatgcat cggaaagatt cttttccttt ggtgatttta tgtcacgtaa 6180
tttaattaca gtgtttttgt acatccttag tattttgggt ctctgtttta gggcctttcg 6240
taagagggat gttaaagttc tagctggtgt accccaacgt actggtatta tattgcgtaa 6300
aagtgtgcgc tataatgcaa aggctttggg tgtcttcttc aagctaaaac tttattggtt 6360
caaagttctt ggtaagttta gtttgggtat ttatgcattg tatgcattac tattcatgac 6420
aatacgcttt acacctatag gtggccctgt ttgtgatgat gttgttgctg gttatgctaa 6480
ttctagtttt gacaagaatg agtattgcaa cagtgttatt tgtaaggtct gtctctatgg 6540
gtaccaggaa ctttcggact tctctcacac acaggtagta tggcaacacc ttagagaccc 6600
attaattggt aatgtgatgc ctttctttta tttggcattt ctggcaattt ttgggggtgt 6660
ttatgtaaag gctattactc tctattttat tttccagtat cttaacattc ttggtgtgtt 6720
tttgggccta caacagtcca tttggttttt gcagcttgtg ccttttgatg tctttggtga 6780
cgagatcgtc gtctttttca tcgttacacg cgtattgatg ttccttaagc atgttttcct 6840
tggctgcgat aaggcatctt gtgtggcttg ctctaagagt gctcgcctta agcgcgttcc 6900
tgtccagact atttttcagg gtactagcaa atccttctac gtacatgcca atggtggttc 6960
taagttctgt aagaagcaca atttcttttg tttaaattgt gattcttatg gtccaggctg 7020
cacttttatt aatgacgtca ttgcaactga agttggtaat gttgtcaaac ttaatgtgca 7080
accgacaggt cctgccacta ttcttattga caaggttgaa ttcagtaatg gtttttacta 7140
tctttatagt ggtgacacat tttggaagta caactttgac ataacagata acaaatacac 7200
ttgcaaagag tcacttaaaa attgtagcat aatcacagac tttattgttt ttaacaataa 7260
tggttccaat gtaaatcagg ttaagaatgc atgtgtgtat ttttcacaga tgctttgtaa 7320
acctgttaag ttagtggact cagcgttgtt ggccagtttg tctgttgatt ttggtgcaag 7380
cttacatagt gcttttgtta gtgtgttgtc gaatagtttt ggcaaagacc tgtcaagttg 7440
taatgacatg caggattgca agagcacatt gggttttgat gatgtaccat tggatacctt 7500
taatgctgct gttgctgagg ctcatcgtta cgatgtcctc ttgactgaca tgtcgttcaa 7560
caattttacc accagttatg caaaaccaga ggaaaaactt cccgtccatg acattgccac 7620
gtgtatgcgt gtaggtgcca agattgttaa tcataacgtt cttgtcaagg atagtatacc 7680
tgtggtgtgg cttgtacgtg atttcattgc cctttcggaa gaaactagga agtacattat 7740
tcgtacgact aaagttaagg gtataacctt catgttgacc tttaatgatt gtcgtatgca 7800
tactaccata cctactgttt gcattgcaaa taagaagggt gcaggtcttc ctagtttttc 7860
aaaggttaag aaattcttct ggtttttgtg tctgttcata gttgctgttt tctttgcact 7920
aagctttctt gattttagta ctcaggttag cagtgatagc gattatgact tcaagtatat 7980
tgagagtggc cagttgaaga cttttgacaa tccacttagt tgtgtgcata atgtctttag 8040
taacttcgac cagtggcatg atgccaagtt tggtttcacc cccgtcaaca atcctagttg 8100
tcctatagtc gttggtgtgt cagacgaagc gcgcactgtt ccaggtatcc cagcaggtgt 8160
ttatttagct ggtaaaacac ttgtttttgc tattaacacc atttttggta catctggttt 8220
gtgctttgat gctagtggcg ttgctgataa gggcgcttgc atttttaatt cggcttgcac 8280
cacattatct ggtttgggtg gaactgctgt ctactgttat aagaatggtc tagttgaagg 8340
tgctaaactt tatagtgagt tggcacctca tagctactat aaaatggtag atggtaatgc 8400
tgtgtcttta cctgaaatta tctcacgcgg ctttggcatc cgtactatcc gtacaaaggc 8460
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cgatagattc tttgtctata atgcagaatc tggttctgac tttgtttgtg gcacagggct 8580
ctttacattg ttgatgaacg ttattagtgt tttttccaag acagtaccag taactgtgtt 8640
gtctggtcaa atacttttta attgcattat tgcttttgct gctgttgcgg tgtgtttctt 8700
atttacaaag tttaagcgca tgttcggtga tatgtctgtt ggcgttttca ctgtcggtgc 8760
ttgtactttg ttgaacaatg tttcctacat tgtaacacag aacacacttg gcatgttggg 8820
ctatgcaact ttgtactttt tgtgcactaa aggtgttaga tatatgtgga tttggcattt 8880
gggatttttg atctcatata tacttattgc accatggtgg gttttgatgg tttatgcctt 8940
ttcagccatt tttgagttta tgcctaacct ttttaagctt aaggtttcaa cacaactttt 9000
tgagggtgac aagttcgtag gctcttttga aaatgctgca gcaggtacat ttgtgcttga 9060
tatgcatgcc tatgagagac ttgccaactc tatctcaact gaaaaactgc gtcagtatgc 9120
tagtacttac aataagtaca agtattattc aggcagtgct tcagaggctg attacaggct 9180
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catttcatct ggtaatgttt tcctaggtgt tgtgggtgta accatgcgag gtgctttgtt 9540
gcagataaag gttaatcaaa acaatgtcca cacgcctaag tacacctatc gcacagttag 9600
accgggtgaa tcttttaata tcttggcgtg ctatgatggt tctgcagctg gtgtttacgg 9660
cgttaacatg cgctctaatt acactattag aggctcgttc attaatggcg cttgtggttc 9720
acctggttat aacattaaca atggtaccgt tgagttttgc tatttacacc agcttgaact 9780
tggttcaggc tgtcatgttg gtagcgactt agatggtgtt atgtatggtg gttatgagga 9840
ccaacctact ttgcaagttg aaggcgctag tagtctgttt acagagaatg tgttggcatt 9900
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agacaggttt aatgagtggg ctgttcataa tggtatgaca acagtagtta atactgattg 10020
cttttctatt cttgctgcta agactggtgt tgatgtacaa cgtttgttgg cctcaatcca 10080
gtctctgcat aagaattttg gtggaaagca aattcttggc tatacctcgt tgacagatga 10140
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gttgaccgtc tcatcaccgg cagattatca gcacttaatg cttttgttgc tcaaaccctc 23940
actaagtata ctgaggttca ggctagcagg aagctagcac agcaaaaggt taatgagtgc 24000
gttaaatcgc aatctcagcg ttatggtttt tgtggtggtg atggcgatca cattttctct 24060
ctggtacagg cagcacctca gggcctgctg tttttacata cagtacttgt accgggtgat 24120
tttgtagatg ttattgccat cgctggctta tgcgttaacg atgaaattgc cttgactcta 24180
cgtgagcctg gcttagtctt gtttacgcat gaacttcaaa atcatactgc gacggaatat 24240
tttgtttcat cgcgacgtat gtttgaacct agaaaaccta ccgttagtga ttttgttcaa 24300
attgagagtt gtgtggtcac ctatgtcaat ttgactagag accaactacc agatgtaatc 24360
ccagattaca tcgatgttaa caaaacactt gatgagattt tagcttctct gcccaataga 24420
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attgcaaatt tagagcagcg ttcagagtct ctccgtaata ctacagagga gctccaaagt 24540
cttatacata atatcaacaa cacactagtt gaccttgagt ggctcaaccg agttgagaca 24600
tatatcaagt ggccgtggtg ggtttggttg gttattttta ttgttctcat ctttgttgtg 24660
tcattactag tgttctgctg catttccacg ggttgttgtg gatgctgcgg ctgctgctgt 24720
gcttgttttt caggttgttg taggggtcct agacttcaac cttacgaagt ttttgaaaag 24780
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ttccaattag acaagcttca aatgtgacgg gttttctttt caccagtgtt tttatctact 24960
tctttgcact gtttaaagcg tcttctttga ggcgcaatta tattatgttg gcagcgcgtt 25020
ttgctgtcat tgttctttat tgcccacttt tatattattg tggtgcattt ttagatgcaa 25080
ctattatttg ttgcacactt attggcaggc tttgtttagt ctgcttttac tcctggcgct 25140
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cagcttacta tgacggcaaa tccattgtga ttctagaagg tggtgactat tacatcactt 25260
ttgggaactc ttttgttgct ttcgttagta gcattgactt gtatctagct atacgtgggc 25320
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tagacgagta tgctacaatt agtgaatgat aatggtctag tagttaatgt tatactttgg 25500
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tgtgttagca ctgtcacttt ttgacgcatg ggctagcttt caggtcaatt gggtcttttt 25920
tgctttcagc atccttatgg cttgcatcac tcttatgctg tggataatgt actttgtcaa 25980
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tggcgtacag gtaagtcaat tacctaattt cgtcacagtc gccaaggcca ctacaacaat 26220
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ctatatggaa gagcgtgcca ggtatttgac tcaaggactg ttagtaactg aagacctgac 28020
ggtgttgata tggatacac 28039
<210> 11
<211> 28038
<212> DNA
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 11
acttaaaaag attttctatc tacggatagt tagctctttt tctagactct tgtctactca 60
attcaactaa acgaaatttt gtccttccgg ccgcatgtcc atgctgctgg aagctgacgt 120
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ttaactctgc tattggtaat ataacttcag cctttgagag tgttaaagag gctattagtc 23700
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ttgaccgtct catcaccggc agattatcag cacttaatgc ttttgttgct caaaccctca 23940
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<210> 12
<211> 1386
<212> PRT
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<400> 12
Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
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Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
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Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
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Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
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Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
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Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser
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Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
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Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
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His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
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Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val
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Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe
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Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys
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Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro
275 280 285
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Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val
325 330 335
Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser
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355 360 365
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Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu
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435 440 445
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Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu
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Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu
485 490 495
Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe
500 505 510
Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn
515 520 525
Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val
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545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu
565 570 575
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Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn
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Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe
885 890 895
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Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly
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Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr
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Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val
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Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
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<210> 14
<211> 1386
<212> PRT
<213> Porcine epidemic diarrhea virus
<220>
<221> MOD_RES
<222> (838)..(838)
<223> Any amino acid
<400> 14
Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
50 55 60
Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
65 70 75 80
Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser
85 90 95
Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala
100 105 110
Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
115 120 125
Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Ile
130 135 140
Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
145 150 155 160
His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
165 170 175
Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val
180 185 190
Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr
195 200 205
Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys
260 265 270
Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg
305 310 315 320
Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val
325 330 335
Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser
340 345 350
Pro Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln
355 360 365
Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val
370 375 380
Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile
385 390 395 400
Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu
405 410 415
Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp
420 425 430
Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp
435 440 445
Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys
450 455 460
Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu
465 470 475 480
Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu
485 490 495
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500 505 510
Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn
515 520 525
Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val
530 535 540
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545 550 555 560
Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu
565 570 575
Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr
580 585 590
Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly
645 650 655
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660 665 670
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865 870 875 880
Ser Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe
885 890 895
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900 905 910
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930 935 940
Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly
945 950 955 960
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965 970 975
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
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1040 1045 1050
Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp
1055 1060 1065
Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val
1070 1075 1080
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
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1325 1330 1335
Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly
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1385
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 15
gacucuuguc uacucaauuc aacuaaacga aauuccuugu ccuuccggcc gcauguccau 60
gcugcuggaa gcugacgugg aauuucauua gguuugcuua aguagccauc gcaagugcug 120
ugcuguccuc uaguuccugg uuggcguucc gucgccuucu acauacuaga caaacagccu 180
uccuccgguu ccgucugggg guugugugga uaacuaguuc cgucuaguuu gaaaccagua 240
acugucggcu auggcuagca accauguuac auuggcuuuu gccaaugaug cagaaauuuc 300
agcuuuuggc uuuugcacug cuagugaagc cgucucauac uauucugagg ccgccgcuag 360
uggauuuaug caaugccguu ucguguccuu cgaucucgcu gacacuguug agggauugcu 420
ucccgaagac uaugucaugg ugguggucgg cacuaccaag cuuagugcgu auguggacac 480
uuuugguagc cgccccaaaa acauuugugg uuggcuguua uuuucuaacu guaauuacuu 540
ccucgaagag uuagagcuua cuuuuggucg ucgugguggu aacaucgugc caguugacca 600
auacaugugu ggcgcugacg guaaaccugu ucuucaggaa uccgaauggg aguauacaga 660
uuucuuugcu gacuccgaag acggucaacu caacauugcu gguaucacuu augugaaggc 720
cuggauugua gagcgaucgg augucucuua ugcgagucag aauuuaacau cuauuaaguc 780
uauuacuuac uguucaaccu augagcauac uuuuccugau gguacugcca ugaagguugc 840
acguacucca aagauuaaga agacuguugu cuugucugag ccacuugcua cuaucuacag 900
ggaaauuggu ucuccuuuug uggauaaugg gagcgaugcu cguucuauca uuaagagacc 960
aguguuccuc cacgcuuuug uuaaguguaa gugugguagu uaucauugga cuguugguga 1020
uuggacuucc uaugucucca cuugcugugg cuuuaagugu aagccagucc uuguggcuuc 1080
augcucugcu acgccugguu cuguuguggu uacgcgcgcu ggugcuggca cugguguuaa 1140
guauuacaac aacauguucc ugcgccaugu ggcagacauu gauggguugg cauucuggcg 1200
aauucucaag gugcagucca aagacgaccu cgcuugcucu gguaaauucc uugaacacca 1260
ugaggaaggu uucacagauc cuugcuacuu uuugaaugac ucgagcauug cuacuaagcu 1320
caaguuugac auccuuagug gcaaguuuuc ugaugaaguc aaacaagcua ucuuugcugg 1380
ucauguuguu guuggcagcg cgmucguuga cauuguugac gaugcacugg gacagccuug 1440
guuuauacgu aagcuuggug accuugcaag ugcagcuugg gagcagcuua aggcugucgu 1500
uagaggccuu aaccuccugu cugaugaggu cgugcucuuu ggcaaaagac uuagcugugc 1560
cacucuuagu aucguuaacg guguuuuuga guucaucgcc gaagugccug agaaguuggc 1620
ugcggcuguu acaguuuuug ucaacuucuu gaaugagcuu uuugagucug ccugugacug 1680
cuuaaagguc ggagguaaaa ccuuuaacaa gguuggcucu uauguucuuu uugacaacgc 1740
auugguuaag cuugucaagg caaaaguucg cggcccacga caggcaggug uuugugaagu 1800
ucguuacaca agccuuguua uugggaguac uaccaaggug guuuccaagc gcguugaaaa 1860
ugccaaugug aaucucgucg ucguugacga ggaugugacc cucaacacca cuggucguac 1920
aguuguuguu gacggacuug cauucuucga gagugacggg uuuuacagac aucuugcuga 1980
ugcugacguu gucauugaac auccuguuua uaagucugcu ugugagcuca agccaguuuu 2040
ugagugugac ccaauaccug auuuuccuau gccuguggcc gcuaguguug cagagcuuug 2100
ugugcaaacu gaucuguugc uuaaaaauua caacacuccu uauaaaacuu acagcugcgu 2160
ugugagaggu gauaaguguu guaucacuug caccuuacau uucacagcac caaguuauau 2220
ggaggcugcu gcuaauuuug uagaccucug uaccaagaac auugguacug cugguuuuca 2280
ugaguuuuac auuacggccc augaacaaca ggaucugcaa ggguucguaa ccacuuguug 2340
cacgauguca gguuuugagu guuuuaugcc uauaauccca caguguccag cagugcuuga 2400
agagauugau ggugguagca ucuggcgguc uuuuaucacu ggucuuaaua caauguggga 2460
uuuuugcaag caucuuaaag ucagcuuugg acuagauggc auuguuguca cuguagcacg 2520
caaauuuaaa cgacuuggug cucucuuggc agaaauguau aacacuuacc uuucaacugu 2580
gguggaaaac uugguacugg ccgguguuag cuucaaguau uaugccacca gugucccaaa 2640
aauuguuuug ggcuguuguu uucacagugu uaaaaguguu cuugcaagug ccuuccagau 2700
uccuguccag gcaggcguug agaaguuuaa agucuuccuu aacuguguuc acccuguugu 2760
accacguguc auugaaacuu cuuuugugga auuagaagag acgacauuua aaccaccagc 2820
acucaauggu aguauugcua uuguugaugg cuuugcuuuc uauuaugaug gaacacuaua 2880
cuaucccacc gaugguaaua gcguuguucc uaucugcuuu aagaagaaag guggugguga 2940
ugucaaauuc ucugaugaag ucucuguuaa aaccauugac ccaguuuaua aggucucccu 3000
ugaauuugag uucgagucug agacuauuau ggcugugcuu aauaaggcug uugguaauug 3060
uaucaagguu acaggugguu gggacgaugu uguugaguau aucaauguug ccauugaggu 3120
ucuuaaagau cacaucgaug ugccuaagua cuacaucuau gaugaggaag guggcaccga 3180
uccuaaucug cccguaaugg uuucucagug gccguugaau gaugacacga ucucacagga 3240
ucugcuugau guugaaguug uuacugaugc gccaguugau uucgagggug augaaguaga 3300
cuccucugac ccugwuaagg uggcagacgu ggcuaacucu gagccugagg augacggucu 3360
uaauguagcu ccugaaacaa auguagaguc ugaaguugag gaaguugccg caaccuuguc 3420
cuuuaaagau acaccuucca caguuacuaa ggauccuuuu gcuuuugacu uugcaagcua 3480
uggaggacuu aagguuuuaa gacaaucuca uaacaacugc uggguuacuu cuaccuuggu 3540
gcagcuacaa uugcuuggca ucguugauga cccugcaaug gagcuuuuua gugcugguag 3600
aguuggucca augguucgca aaugcuauga gucacaaaag gcuaucuugg gaucuuuggg 3660
ugaugugucg gcuugccuag agucucugac uaaggaccua cacacacuua agauuaccug 3720
uucuguaguc ugugguugug guacugguga acguaucuau gaugguugug cuuuucguau 3780
gacgccaacu uuggaaccgu ucccauaugg ugcuugugcu cagugugcuc aaguuuugau 3840
gcacacuuuu aaaaguauug uuggcaccgg caucuuuugu cgagauacua cugcucucuc 3900
cuuggauucu uugguuguaa aaccucuuug ugcggcugcu uuuauaggca aggauagugg 3960
ucauuauguc acuaacuuuu augaugcugc uauggcuauu gaugguuaug gucgucauca 4020
gauaaaguau gacacacuga acacuauuug uguuaaagac guuaauugga cagcaccuuu 4080
ugucccagac guugagccug uauuggagcc uguugucaaa ccuuucuauu cuuauaagaa 4140
uguugauuuu uaccaaggag auuuuaguga ccuuguuaaa cuuccaugug auuuuguugu 4200
uaaugcugca aaugagaauu ugucucacgg uggcggcaua gcaaaggcca uugauguuua 4260
uaccaagggc auguugcaga agugcucgaa ugauuacauu aaagcacacg gucccauuaa 4320
aguuggacgu ggugucaugu uggaggcauu aggucuuaag gucuuuaaug uuguuggucc 4380
acguaagggu aagcaugcac cugagcuucu uguuaaggcu uauaaguccg uuuuugcuaa 4440
uucagguguu gcucuuacac cuuugauuag uguuggaauu uuuaguguuc cuuuggaaga 4500
aucuuuaucu gcuuuucuug cauguguugg ugaucgccac uguaagugcu uuuguuauag 4560
ugacaaagag cgcgaggcga ucauuaauua cauggauggc uugguagaug cuauuuucaa 4620
agaugcacuu guugauacua cuccugucca ggaagauguu caacaaguuu cacaaaaacc 4680
aguuuugccu aauuuugaac cuuucaggau ugaaggugcu caugcuuucu augagugcaa 4740
cccugaaggu uugaugucau uaggugcuga caagcuggug uuguuuacaa auuccaauuu 4800
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cauaaaugua uuuaaaaaga guaacaaaac agugccugcu ggcaacugug uuacuuuuga 4920
gugugcagau augauuucua uuacuauggu aguauugcca ucugacggug augcuaauua 4980
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ugaggauaca cguaguguua agacuguuaa aguagaaucc acuguuacuu auggacaaca 5220
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uggugaguuc cacaugcuag accauacugg guuugccuuu ccuagugaag uuguuaacgg 5400
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ccuagauaau gguaacggug uugccggcca uuauacuguu uuugaucaug acacugguau 5940
ggugcaugau ggagauguuu uuguaccagg ugaucucaau gugucuccug uuacaaaugu 6000
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cgcuacaaag cuguuagaca cuaugaauua ugcaucggaa agauucuuuu ccuuugguga 6120
uuuuauguca cguaauuuaa uuacaguguu uuuguacauc cuuaguauuu ugggucucug 6180
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uauuauauug cguaaaagug ugcgcuauaa ugcaaaggcu uugggugucu ucuucaagcu 6300
aaaacuuuau ugguucaaag uucuugguaa guuuaguuug gguauuuaug cauuguaugc 6360
auuacuauuc augacaauac gcuuuacacc uauagguggc ccuguuugug augauguugu 6420
ugcugguuau gcuaauucua guuuugacaa gaaugaguau ugcaacagug uuauuuguaa 6480
ggucugucuc uauggguacc aggaacuuuc ggacuucucu cacacacagg uaguauggca 6540
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aauuuuuggg gguguuuaug uaaaggcuau uacucucuau uuuauuuucc aguaucuuaa 6660
cauacuuggu guguuuuugg gccuacaaca guccauuugg uuuuugcagc uugugccuuu 6720
ugaugucuuu ggugacgaga ucgucgucuu uuucaucguu acacgcguau ugauguuccu 6780
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ccuuaagcgc guuccugucc agacuauuuu ucaggguacu agcaaauccu ucuacguaca 6900
ugccaauggu gguucuaagu ucuguaagaa gcacaauuuc uuuuguuuaa auugugauuc 6960
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caaacaguua ugguuaugug ucuaaaucac aggacaguaa uugcccuuuc accuugcaau 22320
cuguuaauga uuaccugucu uuuagcaaau uuuguguuuc caccagccuu uuggcuagug 22380
ccuguaccau agaucuuuuu gguuacccug aguuugguag ugguguuaag uuuacguccc 22440
uuuacuuuca auucacaaag ggugaguuga uuacuggcac gacuaaacca cuugaaggug 22500
ucacggacgu uucuuuuaug acucuggaug uguguaccaa guauacuauc uauggcuuua 22560
aaggugaggg uaucauuacc cuuacaaauu cuagcuuuuu ggcagguguu uauuacacau 22620
cuguuucugg acaguuguua gccuuuaaga augucacuag uggugcuguu uauucuguua 22680
cgccauguuc uuuuucagag caggcugcau auguugauga ugauauagug gguguuauuu 22740
cuaguuuguc uagcuccacu uuuaacagua cuagggaguu gccugguuuc uucuaccauu 22800
cuaaugaugg cucuaauugu acagagccug uguuggugua uaguaacaua gguguuugua 22860
aaucuggcag uauuggcuac gucccaucuc agucuggcca agucaagauu gcacccacgg 22920
uuacugggaa uauuaguauu cccaccaacu uuaguaugag uauuaggaca gaauauuuac 22980
agcuuuacaa cacgccuguu aguguugauu gugccacaua uguuuguaau gguaacucuc 23040
guuguaaaca auuacucacc caguacacug cagcauguaa gaccauagag ucagcauuac 23100
racucagcgc uaggcuugag ucuguugaag uuaacucuau gcuuacuauu ucugaagagg 23160
cucuacaguu agcuaccauu aguucguuua auggugaugg auauaauuuu acuaaugugc 23220
uggguguuuc uguguaugau ccugcaaggg gcaggguggu acaaaaaagg ucuuuuauug 23280
aagaccugcu uuuuaauaaa gugguuacua auggccuugg uacuguugau gaagacuaua 23340
agcgcuguuc uaauggucgc ucuguggcag aucuagucug ugcacaguau uacucuggug 23400
ucaugguacu accugguguu guugacgcug agaagcuuca cauguauagu gcgucucuca 23460
ucggugguau ggugcuagga gguuuuacuu cugcagcggc auugccuuuu agcuaugcug 23520
uucaagcuag acucaauuau cuugcucuac agacggaugu ucuacagcgg aaccagcaau 23580
ugcuugcuga gucuuuuaac ucugcuauug guaauauaac uucagccuuu gagaguguua 23640
aagaggcuau uagucaaacu uccaaggguu ugaacacugu ggcucaugcg cuuacuaagg 23700
uucaagaggu uguuaacucg cagggugcag cuuugacuca acuuaccgua cagcugcaac 23760
acaacuucca agccauuucu aguucuauug augacauuua cucucgacug gacauucuuu 23820
cagccgaugu ucagguugac cgucucauca ccggcagauu aucagcacuu aaugcuuuug 23880
uugcucaaac ccucacuaag uauacugagg uucaggcuag caggaaguua gcacagcaaa 23940
agguuaauga gugcguuaaa ucgcaauccc agcguuaugg uuuuuguggu ggugauggcg 24000
agcacauuuu cucucuggua caggcagcac cucagggccu gcuguuuuua cauacaguac 24060
uuguaccgag ugauuuugua gauguuauug ccaucgcugg cuuaugcguu aacgaugaaa 24120
uugccuugac ucuacgugag ccuggcuuag ucuuguuuac gcaugaacuu caaaaucaua 24180
cugcgacgga auauuuuguu ucaucgcgac guauguuuga accuagaaaa ccuaccguua 24240
gugauuuugu ucaaauugag aguugugugg ucaccuaugu caauuugacu agagaccaac 24300
uaccagaugu aaucccagau uacaucgaug uuaacaaaac acuugaugag auuuuagcuu 24360
cucugcccaa uagaacuggu ccaagucuuc cuuuagaugu uuuuaaugcc acuuaucuua 24420
aucucacugg ugaaauugca gauuuagagc agcguucaga gucucuccgu aauacuacag 24480
aggagcucca aagucuuaua uauaauauca acaacacacu aguugaccuu gaguggcuca 24540
accgaguuga gacauauauc aaguggccgu gguggguuug guugauuauu uucauuguuc 24600
ucaucuuugu ugugucauua cuaguguucu gcugcauuuc cacggguugu uguggaugcu 24660
gcggcugcug cugugcuugu uucucagguu guuguagggg uccuagacuu caaccuuacg 24720
aaguuuuuga aaagguccac gugcagugau guuucuugga cuuuuucaau acacgauuga 24780
cacaguuguc aaagaugucu caaagucugc uaacuugucu uuggaugcug uccaagaguu 24840
ggagcucaau guaguuccaa uuagacaagc uucaaaugug acggguuuuc uuuucaccag 24900
uguuuuuauc uacuucuuug cacuguuuaa agcgucuucu uugaggcgca auuauauuau 24960
guuggcagcg cguuuugcug ucauuguucu uuauugccca cuuuuauauu auuguggugc 25020
auuuuuagau gcaacuauua uuuguugcac acuuauucaa agucgguggc aggcuuuguu 25080
uagucugcuu uuacuccugg cgcuauaaaa augcgcucuu uauuauuuuu aauacuacga 25140
cacuuucuuu ccucaauggu aaagcagcuu auuaugacgg caaauccauu gugauuuuag 25200
aaggugguga ccauuacauc acuuuuggca acucuuuugu ugcuuuuguu aguagcaucg 25260
acuuguaucu agcuauacgu gggcggcaag aagcugaccu acagcuguug cgaacuguug 25320
agcuucuuga uggcaagaag cuuuaugucu uuucgcaaca ucaaauuguu ggcauuacua 25380
augcugcauu ugacucaauu caacuagacg aguaugcuac aauuagugaa ugauaauggu 25440
cuaguaguua auguuauacu uuggcuuuuc guacucuuuu uccugcuuau uauaagcauu 25500
acuuucgucc aauugguuaa ucugugcuuc acuugucacc gguuguguaa uagcgcaguu 25560
uacacaccua uagggcguuu guauagaguu uauaagucuu acaugcaaau agacccccuc 25620
ccuaguacug uuauugacgu auaaacgaaa uaugucuaac gguucuauuc ccguugauga 25680
ggugauucaa caccuuagaa acuggaauuu cacauggaau aucauacuga cgauacuacu 25740
uguagugcuu caguauggcc auuacaagua cucugcguuc uuguauggug ucaagauggc 25800
uauucuaugg auacuuuggc cucuuguguu agcacuguca cuuuuugaug caugggcuag 25860
cuuucagguc aauugggucu uuuuugcuuu cagcauccuu auggcuugca ucacucuuau 25920
gcuguggaua auguacuuug ucaauagcau ucgguugugg cgcaggacac auucuuggug 25980
gucuuucaau ccugaaacag acgcgcuucu cacuacuucu gugaugggcc gacaggucug 26040
cauuccagug cuuggagcac caacuggugu aacgcuaaca cuccuuagug guacauugcu 26100
uguagagggc uauaagguug cuacuggcgu acagguaagu caauuaccua auuucgucac 26160
agucgccaag gccacuacaa caauugucua cggacguguu ggucguucag ucaaugcuuc 26220
aucuggcacu gguugggcuu ucuauguccg guccaaacac ggcgacuacu cagcugugag 26280
uaauccgagu ucgguucuca cagauaguga gaaagugcuu cauuuagucu aaacagaaac 26340
uuuauggcuu cugucaguuu ucaggaucgu ggccgcaaac gggugccauu aucccucuau 26400
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auuauuccaa auuucucuca acagcuuccc agcguaguug agauuguuga accuaacaca 26760
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primer"
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polynucleotide"
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<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
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Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr
1 5

Claims (49)

1.疫苗，包含基因型2a的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种抗原。
2.权利要求1的疫苗，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)是北美来源。
3.权利要求2的疫苗，其中所述北美基因型的猪流行性腹泻病毒(PEDV)是任何这样的PEDV：
(a)其由SEQ ID NO:1所编码、和/或包含SEQ ID NO:1的序列和/或包含SEQ ID NO:1的RNA等价物；
(b)其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同和/或与SEQ ID NO:1的RNA等价物至少99％相同；
(c)其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；
(d)其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码；
(e)其由SEQ ID NO:15编码；或
(f)其序列与SEQ ID NO:15至少99％相同。
4.权利要求1的疫苗，其中所述疫苗是重组疫苗或灭活疫苗。
5.权利要求1的疫苗，其中所述疫苗是灭活疫苗。
6.权利要求5的疫苗，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)是任何这样的PEDV:
(a)其由SEQ ID NO:1所编码和/或包含SEQ ID NO:1的序列、和/或包含SEQ ID NO:1的RNA等价物；
(b)其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同、和/或与SEQ ID NO:1的RNA等价物至少99％相同；
(c)其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；
(d)其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码；
(e)其由SEQ ID NO:15编码；和/或
(f)其序列与SEQ ID NO:15至少99％相同。
7.权利要求5的疫苗，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)经化学灭活。
8.权利要求7的疫苗，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)通过用化学灭活剂处理而被化学灭活，所述化学灭活剂包括选自以下组的化合物：乙烯亚胺、二乙烯亚胺、乙酰乙烯亚胺、以及其混合物。
9.权利要求8的疫苗，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)通过用二乙烯亚胺处理而被化学灭活。
10.权利要求5的疫苗，其中所述疫苗还包含佐剂。
11.权利要求10的疫苗，其中所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
12.权利要求6的疫苗，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)包含SEQ ID NO:1、和/或包含SEQ ID NO:1的RNA等价物。
13.权利要求4的疫苗，其中所述疫苗是重组疫苗。
14.权利要求13的疫苗，其中该重组疫苗包含选自以下组的一或多种免疫原性组分：
(a)编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突蛋白的抗原的分离核酸，其中重组刺突多肽与SEQ ID NO:3、7、9或14具有至少90％的同源性；
(b)包含a)的分离核酸的载体；
(c)由a)的核酸所编码的重组PEDV刺突蛋白；和
(d)其任意组合。
15.权利要求13的疫苗，其中该疫苗包含药物可接受的载剂和/或赋形剂。
16.权利要求15的疫苗，其中所述赋形剂是一或多种佐剂。
17.权利要求16的疫苗，其中所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
18.权利要求13的疫苗，其中所述疫苗还包含一或多种额外的抗原。
19.权利要求18的疫苗，其中所述额外的抗原是猪流行性腹泻病毒(PEDV)的结构蛋白M、E、或N。
20.权利要求14的疫苗，其中免疫原性组分是所述分离核酸。
21.权利要求14的疫苗，其中免疫原性组分是所述载体。
22.权利要求14的疫苗，其中免疫原性组分是重组猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突蛋白。
23.权利要求14的疫苗，其中免疫原性组分是组合。
24.保护猪免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的方法，包括向该猪施用权利要求1的疫苗。
25.保护猪免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的方法，包括向该猪施用权利要求5的疫苗。
26.保护猪免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的方法，包括向该猪施用权利要求13的疫苗。
27.权利要求24的方法，其中该疫苗包含选自以下组的一或多种免疫原性组分：
(a)其由SEQ ID NO:1编码、和/或包含SEQ ID NO:1的序列、和/或包含SEQ ID NO:1的RNA等价物；
(b)其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同、和/或与SEQ ID NO:1的RNA等价物至少99％相同；
(c)其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；
(d)其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码；
(e)其由SEQ ID NO:15编码；和
(f)其序列与SEQ ID NO:15至少99％相同。
28.权利要求25的方法，其中该疫苗包含选自以下组的一或多种免疫原性组分:
(a)其由SEQ ID NO:1的序列编码的或者包含SEQ ID NO:1的序列；
(b)其序列与SEQ ID NO:1至少99％相同；
(c)其刺突蛋白由SEQ ID NO:2、6、8、或13的核酸序列所编码；和
(d)其刺突蛋白由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码。
29.权利要求26的方法，其中该重组疫苗包含选自以下组的一或多种免疫原性组分:
(a)编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突蛋白的抗原的分离核酸，其中重组刺突多肽与SEQ ID NO:3、7、9或14具有至少90％的同源性；
(b)包含a)的分离核酸的载体；
(c)由a)的核酸所编码的重组PEDV刺突蛋白；和
(d)其任意组合。
30.用于接种猪使其免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的试剂盒，其包含:
(a)能够将疫苗施用给猪的分配器；和
(b)权利要求1的疫苗。
31.用于接种猪使其免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的试剂盒，其包含:
(a)能够将疫苗施用给猪的分配器；和
(b)权利要求5的疫苗。
32.用于接种猪使其免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的试剂盒，其包含:
(a)能够将疫苗施用给猪的分配器；和
(b)权利要求13的疫苗。
33.用于产生权利要求5的猪流行性腹泻疫苗的方法，包括:
(a)用猪流行性腹泻病毒(PEDV)接种类人猿细胞；
(b)温育所述经接种的类人猿细胞；
(c)从所述温育的细胞收集猪流行性腹泻病毒(PEDV)；和
(d)用化学灭活剂处理所收集的细胞，优选用选自以下组的化合物:乙烯亚胺、二乙烯亚胺、乙酰乙烯亚胺或其混合物，以形成灭活的PEDV疫苗。
34.权利要求33的方法，其中所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)包含:
(a)序列，其由SEQ ID NO:1的序列编码的或者包含SEQ ID NO:1的序列；
(b)序列，其与SEQ ID NO:1至少99％相同；
(c)刺突蛋白，其由SEQ ID NO:2、6、8、或13所编码；
(d)刺突蛋白，其由与SEQ ID NO:2、6、8、或13至少90％相同的核酸序列所编码。
35.权利要求34的方法，其中所述遗传组2a的猪流行性腹泻病毒(PEDV)包含SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:1的RNA等价物。
36.权利要求33的方法，其中所述类人猿细胞是Vero细胞。
37.权利要求33的方法，其中所述化学灭活剂包括二乙烯亚胺。
38.权利要求33的方法，还包括将佐剂添加至猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗。
39.权利要求38的方法，还包括将佐剂添加至猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗，其中所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
40.用于产生权利要求13的重组疫苗的方法，包括:
(a)在宿主细胞中表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种抗原；和
(b)收集猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞的所述一或多种抗原。
41.权利要求40的方法，其中所述一或多种抗原包括:
(a)编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突蛋白的抗原的分离核酸，其中重组刺突多肽与SEQ ID NO:3、7、9或14具有至少90％的同源性；
(b)包含a)的分离核酸的载体；
(c)由a)的核酸所编码的重组PEDV刺突蛋白；和
(b)其任意组合。
42.权利要求40的方法，其中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种重组抗原由重组杆状病毒载体表达。
43.权利要求42的方法，其中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种重组抗原由昆虫细胞表达。
44.权利要求43的方法，还包括将佐剂添加至猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗。
45.权利要求44的方法，还包括将佐剂添加至猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗，其中所述佐剂是基于水包油乳剂的佐剂。
46.权利要求1的疫苗，其中基因型2的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种抗原是基因型2a的猪流行性腹泻病毒(PEDV)。
47.用作药物用途的基因型2a的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种抗原，其中所述PEDV的一或多种抗原优选选自以下组：基因型2a的PEDV，其中所述PEDV任选是权利要求2、3或6-9任一项的PEDV；基因型2a的PEDV的一或多种免疫原性组分，其中所述PEDV的一或多种免疫原性组分任选是权利要求27-29或46任一项的一或多种免疫原性组分。
48.权利要求1-23或46任一项的疫苗，用于保护猪免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病的方法。
49.基因型2a的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的一或多种抗原用于制备药物的用途，所述药物用于保护猪免受猪流行性腹泻病毒(PEDV)相关疾病，其中所述PEDV的一或多种抗原优选选自以下组：基因型2a的PEDV，其中所述PEDV任选是权利要求2、3或6-9任一项的PEDV；基因型2a的PEDV的一或多种免疫原性组分，其中所述PEDV的一或多种免疫原性组分任选是权利要求27-29或46的一或多种免疫原性组分。
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