CN103429611A - 用于治疗和预防流感感染的新的血凝素5(h5)蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的血凝素H5蛋白、编码所述H5蛋白的核酸及载体，以及包含所述H5蛋白、编码所述H5蛋白的核酸或载体中任一者的疫苗。此外，本发明也涉及所述成分中的任一者用于人类及动物的医药用途，特别是用于治疗和预防北非源H5N1流感病毒感染的用途。
Description
序列表
根据U.S.37C.F.R.1.821-1.825，本申请包括序列表。本申请所附的序列表，在此将其整体引入作为参考。
发明领域
本发明涉及医药领域，优选涉及传染病领域。特别地，本发明涉及流感蛋白；编码所述蛋白的核酸分子及载体；和疫苗。更特别的是，本发明涉及所述蛋白、核酸分子、载体或疫苗中任一项用于治疗和/或预防流感感染，优选北非源H5N1感染，和进一步用于预防流感病毒的种内及种间传播的用途。
背景技术
流感感染仍然是动物和人类的重要感染。流感是由经历连续抗原性变异/修饰且占据动物宿主的病毒引起。因此，未来可能发生新的流行病及大流行，且难以实现此疾病的根除。流感病毒是本领域熟知的且详述于(例如)可供进一步参考的P.Palese，Nature Medicine，第10卷，第12期，第S82至S86页(2004年12月)中。简言之，流感A病毒的基因组由八个单链片段组成，并且病毒颗粒在其表面上具有两种主要糖蛋白：血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。在流感病毒之间因存在至少16种不同的血凝素(H1-H16)及9种不同的神经氨酸酶(N1-N9)亚型而存在相当多的抗原变异。
已证明流感病毒中的H5N1型禽流感病毒可感染禽类、猪和人类。所述病毒也可从禽类物种直接传染给人类(Claas等，Lancet1998，351：472；Suarez等，J.Virol.1998，72：6678；Subbarao等，Science1998，279：393；Shortridge，Vaccine1999，17(增刊1)：S26-S29)。已知人类临床病例的死亡率接近约50%。
上一个世纪，猪一直是流感大流行的重要媒介。猪、骆驼和海豹，优选猪，可充当禽流感病毒的“混合室”，并因此代表一种越过禽类(流感病毒的天然宿主)至哺乳动物的物种障碍的潜在风险因素。这种跨物种传播常通过易感动物(例如猪)被已知的哺乳动物(猪)流感病毒与禽流感病毒双重感染而发生。此双重感染有可能形成能引起人或猪大流行的新重组病毒。然而，最近有迹象表明，当前禽类H5病毒株与哺乳动物流感病毒的重组不会形成强毒性重组体。另一方面，禽流感病毒可感染猪并通过自发突变而变得顺应于猪。一旦病毒在猪(或其它哺乳动物)群体内引起横向感染，则将越过关键障碍。
目前大多数东南亚猪已被邻近的家禽饲养场的禽流感(H5流感)病毒株感染。由于这些感染迄今为止都是亚临床的，因此其仅可通过实验室方法诊断并因此常常被忽视。这带来以下高风险：这些亚临床感染猪为病毒适应哺乳动物系统、在猪群内传播以及感染人类提供了机会。
当前流感疫苗包括亚单位疫苗(Babai等，Vaccine1999，17(9-10)：1223-1238；Crawford等，Vaccine1999，17(18)：2265-2274；Johansson等，Vaccine1999，17(15-16)：2073-2080)、减毒疫苗(Horimoto等，Vaccine2004，22(17-18)：2244-2247)、DNA疫苗(Watabe等，Vaccine2001，19(31)：4434-4444)及灭活流感疫苗(Cao等，Vaccine1992，10(4)：238-242)，其中灭活流感疫苗以商业规模最广泛使用(Lipatov等，J Virol2004，78(17)：8951-8959)。
亚单位疫苗、重组血凝素和神经氨酸酶(Babai等，Vaccine1999，17(9-10)：1223-1238；Crawford等，Vaccine1999，17(18)：2265-2274；Johansson等，Vaccine1999，17(15-16)：2073-2080)有可能成为灭活疫苗的颇受关注的替代物，但目前尚未作为商用疫苗投入使用。这些疫苗制剂显然比灭活疫苗安全。此外，亚单位疫苗并不对流感病毒内部蛋白产生抗体反应，因此使得能够区分接种动物和感染动物(Crawford等，Vaccine1999，17(18)：2265-2274)。
血凝素蛋白是流感病毒表面与受体结合并与膜融合的糖蛋白，是中和感染力的抗体的标靶。H5N1的完整血凝素蛋白(HA)由568个氨基酸组成，分子量为56kDa。HA分子由HA1及HA2亚单位组成，HA1亚单位介导最初与细胞膜的接触而HA2负责膜融合(Chizmadzhev，Bioelectrochemistry2004，63(1-2)：129-136)。
杆状病毒/昆虫细胞系统已用于表达从禽流感亚型分离的血凝素基因(Babai等，Vaccine1999，17(9-10)：1223-1238；Crawford等，Vaccine1999，17(18)：2265-2274；Johansson等，Vaccine1999，17(15-16)：2073-2080)；New等，BMC Mircobiology2006，6(16)：doi：10.1186/1471-2180-6-16)。然而，这些重组蛋白似乎任何时候都不具有保护性，或者至少对一些物种仅具有较低效力(Treanor等，Vaccine2001，19：1732-1737)。
此外，自2006年H5N1禽流感病毒已经从亚洲蔓延到北非，而且特别是H5N1毒株已在北非国家，如埃及和苏丹发展，这些在此统称为“北非源H5N1”。这些北非源H5N1中任一者引起的感染不能使用针对H5N1的常规药物或疫苗充分治疗或预防。因此，特别需要蛋白、核酸分子、载体和疫苗用于特定治疗和预防北非源H5N1毒株引起的流感感染。
此外，需要提供更多的改良疫苗及疫苗接种新方法，尤其是在北非国家，以便为控制流感感染及对疾病负荷(disease load)产生正面影响而提供更好的方法。
发明内容
在本发明的实施例之前，应了解，如本文中及随附的权利要求中所使用，单数形式“一”及“该”包括复数提及物，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，提及“一种制剂”包括复数种所述制剂；提及“该载剂”是指本领域技术人员已知一种或多种载剂及其均等物，诸如此类。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语具有的含义与普通熟习本发明所属技术者通常所了解的含义相同。除非另外指明或本领域技术人员另外得知，否则所有给定范围及值可变化1-5%，因此术语“约”在本说明书中省去。尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文所述方法及物质相似或相当的任何方法及物质，但优选的方法、装置及物质现加以描述。为描述并揭示可配合本发明使用的如出版物中所报导的物质、赋形剂、载剂及方法的目的，本文中所提及的所有出版物以引用的方式并入本文中。不应认为本文中认可本发明无权优先于先前发明的此类披露内容。
通过本说明及权利要求中的特征性实施例获得上述技术问题的解决方法。
高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒广泛分布于北非(特别是埃及)的家禽业的不同隔离区中。在本发明的工作中，仅检测了属于2.2.1分支的病毒。这些病毒可分为遗传上和抗原上不同的两个亚群(分支A和B)。分支A和B是在密集饲养的家禽中共同循环和持续进化的。这两种亚型表现出进化迅速并且出现抗原变异体是可能的。
进行了测序分析，所有分析的病毒的HA(血凝素)序列分入2.2.1分支。数据分析指出，在北非循环的2.2.1病毒在遗传上和抗原上是异源的。在北非2.2.1分支中可以确定两个主要的基因群，命名为分支A和分支B。
然而，与分支A相比，分支B型病毒在检测的标本中是最常见。事实上，在检测的67个序列中，50个(75%)在分支B中和17个(25%)在分支A中。分支A是异源的并且包括分离自北非的病毒。这群病毒，本文命名为A1，是不断进化的并且似乎成为分支A内的主导群体。分支B是一个在持续发散进化的病毒单系群。在此分支中可以确定单独的分支。目前，分支B显示出不同的遗传特性，并且根据世界卫生组织的命名法，可以将其归类为一个新出现的不同分支。
基于分支B病毒的初步分析表明，在此分支中已经发生了一些额外的氨基酸(AA)突变(13-23)。基于血凝交叉抑制的实验室测试表明，分支B与A在抗原上是不同的，与遗传学数据相支持。
事实上，对分支A和分支B两种流行原型毒株进行的序列分析发现了在HA分子中的12个氨基酸差异。12个差异中的10个位于对抗原性(如血凝抑制(HI)分析所显示)和宿主受体结合亲和力有影响的受体结合位点(RBS)。
本发明是基于令人惊奇的发现，基于获得的所述信息的特定蛋白、核酸分子、和载体可作为有效的疫苗来治疗和预防北非源H5N1病毒引起的流感感染。
流感蛋白及编码所述蛋白的核酸分子
在一个方面中，本发明涉及流感病毒H5蛋白，其中所述H5蛋白具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、和181N，其中所述术语“145(-)”，或修饰145(-)，分别表示在H5的第145位的氨基酸被删除，或者
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K或
(c)氨基酸145L、172T、254V、和
其中所述H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1中所例示的氨基酸位置。在本发明的上下文中，根据(a)所述的H5蛋白是分支A蛋白，而根据(b)或(c)所述的H5蛋白是分支B蛋白。
在本发明的上下文中，应该理解，术语“氨基酸”特别是指氨基酸残基或分别指已通过肽键共价连接到另两个氨基酸(如果该氨基酸位于肽序列的N-末端或C端)或另一个氨基酸的氨基酸。
本发明还涉及一种H5蛋白，其包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。优选地，H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:8、13或40所示的任一序列至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源的序列。特别地，优选的是包含SEQ ID NO:13所列的氨基酸序列或由其组成的H5蛋白。
根据本发明，优选由下述氨基酸序列组成或包含下述氨基酸序列的蛋白，所述序列与SEQ ID NO:40所示的序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。由于其具有分支A和B特征的组合，这样的蛋白可作为针对北非源的H5N1病毒引起的流感感染的有效的通用疫苗。
在一个优选的实施方案中，本发明的H5蛋白具有氨基酸239N。术语“239N”示例性意味着在239位(根据SEQ ID NO:1的氨基酸位置的编号)编码氨基酸天冬酰胺(N)。换言之，如果提及“具有氨基酸239N的H5蛋白”，则该H5氨基酸分支在氨基酸239位(根据SEQ ID NO:1的氨基酸位置的编号)通常编码的丝氨酸应由天冬酰胺(N)替代。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的H5蛋白不包含A型流感H5N1血凝素信号序列，其中所述H5蛋白A型流感H5N1血凝素的信号序列优选分别包括含16个N-末端氨基酸(单字母代码)MEKIVLLLAIVSLVKS(SEQID NO:44)或M1E2K3I4V5L6L7L8A9I10V11S12L13V14K15S16或由其组成，其中所述N-末端前16个氨基酸位置的编号是指如SEQ ID NO1例示的第1-16位氨基酸，即SEQ ID NO:1中所列的序列(三个字母代码)Met GluLys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser(SEQ ID NO:44)。
在进一步优选的实施方案中，本发明的H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。其中SEQ ID NO:2-40所示的序列由氨基酸D17开始，并且其中第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17。
表B提供与SEQ ID NO:2-39所示序列的变体对应的代表性序列SEQ IDNO:55-92，其中SEQ ID NO:55-92由如本文所提及的SEQ ID NO:2-39的相应氨基酸D17开始；且表D提供SEQ ID NO:40序列的代表性变体，即SEQID NO:131，其中所述变体序列如本文所提及的由氨基酸D17开始。
在一个实施例中，本发明的H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与多肽序列
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPTNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKNNAYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGDCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDCFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMV(SEQ ID NO：45）
具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。其中该序列与SEQ ID NO:8的变体对应，其中所述变体由SEQ ID NO:8的氨基酸D17开始，其中N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17。
因此在另一个实施例中，本发明的H5蛋白优选包含下述氨基酸序列或由其组成：与多肽序列
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTNAQDILEKTHNGKLCDLGGVKPLILRDCSVAGMLLGNPMCDEFPNVSEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNNYEELKHLLSRINRFEKIQIIPKSSWPDHEASLGVSSACPYQGGPSFYRNVVWLIKKNDTYPTIKESYHNTNQEDLLVLWCIHHPNNEEEQKRIYKNPTTYVSVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRVEFFWTILKSNDTINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCSTKCQTPIGAINTSMPFHNINPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGEGRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLEKRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVRNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI,(SEQ ID NO:46)
具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。其中该序列与由氨基酸D17开始的SEQ IDNO:13对应，其中第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17。
因此可以理解的是，术语“SEQ ID NO:2-40的变体”，优选地也指由SEQD NO:2-40的氨基酸D17开始的变体序列，而且其中所述由氨基酸D17开始的SEQ ID NO:2-39的变体序列列于表B并与SEQ ID NO:55-92相对应，且其中由氨基酸D17开始的SEQ ID NO:40的序列具有序列
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVACWLLGNPMCDEFPNVSEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNNYEELKHLLSRINRFEKIQIIPKSSWPDHEASLGVSSACPYQGGPSFYRNVVWLIKKNNTYPTIKESYHNTNQEDLLVLWGIHHPNDEEEQTEIYKNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRVEFFWTILKSNDTINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGEGRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLEKRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELCNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLES1GTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNCSLQCRICI(SEQ ID NO:47)
在进一步优选的实施方案中，本发明的H5蛋白包括全长的C-末端序列，其中所述全长C-末端序列优选地对应于氨基酸527到568，其中所述氨基酸位置的编号是指SEQ ID NO:40所例示序列的氨基酸位置527-568。因此优选的全长C-末端序列是序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:48),
其中在进一步优选的实施方案，苯丙氨酸残基(F)是丝氨酸(S)残基或另一个优选实施方案，其中序列IMVA(SEQ ID NO:49)由序列IMMA(SEQ ID NO:50)取代。因此，优选的全长C-末端序列是序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:51)或序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO：52）或序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:53).
在又一个优选的实施方案中，本发明的H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示序列、与对应于SEQ ID NO:2-40由氨基酸D17开始并另外包括全长C-末端序列的变体的SEQ ID NO:47、93-130所示序列中的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。其中第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17，且其中全长C-末端序列对应于氨基酸527到568，其中所述氨基酸位置的编号是指SEQID NO:40所示序列的氨基酸位置527-568。
表C提供代表序列SEQ ID NO:93-130，其中所述序列由氨基酸D17开始并包括如本文所述的全长C-末端序列；且表D提供代表序列SEQ ID NO:131，其中所述序列由SEQ ID NO:40的氨基酸D17开始并包括如本文所述的全长C-末端序列。
在一个实施例中，本发明的H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与多肽序列
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPTNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKNNAYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWCIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGDCNTKCQTPIGAINSSMPFHMIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDCVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELCNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID N0.45)
具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。其中所述序列对应于由氨基酸D17开始并另外包括全长C-末端序列的SEQ ID NO:8，其中所述第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17，且其中全长C-末端序列对应于氨基酸527到568，更优选氨基酸534-568，其中所述氨基酸位置的编号是指SEQ ID NO:40所示序列的氨基酸位置527-568，或更优选氨基酸位置534-568。在此，可将此序列SEQ ID NO:45和具有不同C-末端序列的序列称为“SEQ ID NO:8的变体”。
因此，可以进一步理解的是，术语“SEQ ID NO:2-40的变体”也优选是指由氨基酸D17开始并具有全长C-末端序列的序列SEQ ID NO:2-40，并且其中由氨基酸D17开始并具有全长C-末端序列的序列SEQ ID NO:2-39在表C中给出，且由氨基酸D17开始并具有全长C-末端序列的所述序列SEQ IDNO:40在表D中给出。
如本文使用的术语“SEQ ID NO:2-40所示的变体序列”或“SEQ IDNO:2-40的变体序列”，优选还涉及分别在表B或表C中所述序列，以及，另外在表D中所列序列。
根据本发明，特别可以理解的是，如本文提及的术语“与……100%同源”与术语“相同的”是同义词。
优选地，本发明的这种H5蛋白和任何其他的H5蛋白是分离的H5蛋白。人们已经发现，与不具有相应的氨基酸的H5蛋白相比，具有上述修饰的H5蛋白具有高度抗原性。
如本文使用的术语“血凝素5(H5)”或“禽流感病毒H5”或“H5蛋白”是指(但不限于)任何天然存在的H5蛋白和H5蛋白的任何经修饰形式，包括H5蛋白的任何缺失、取代和/或插入突变体，其中所述H5蛋白具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，其中所述术语“145(-)”是指在H5的第145位氨基酸缺失，或者
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K或
(c)氨基酸145L、172T、254V、
或者，更优选，具有
(d)氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N、或
(e)氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(f)氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H、254V。
本文使用的H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置。SEQ ID NO:1代表病毒株1709-6(一个古老的用于评价疫苗的官方埃及原型株)的血凝素的氨基酸序列。换言之，若提及位置113的氨基酸(氨基酸113)，则是指与SEQ ID NO:1中的氨基酸113对应的氨基酸残基。然而，此并非是指本发明的H5蛋白具有与SEQ ID NO:1一致的氨基酸序列。其仅表明本发明H5蛋白的对应氨基酸编码这里明确提及的氨基酸残基。在此情况下，氨基酸113为天冬酰胺(N)。例如，术语“113N”指位置113(根据SEQ IDNO:1的氨基酸位置编号)的氨基酸编码天门冬氨酸(D)。换言之，若提及“具有氨基酸113D的H5蛋白”，则表明，在氨基酸位置113(根据SEQ ID NO:1的氨基酸位置编号)，正常情况下H5氨基酸分子所编码的天冬酰胺应被天门冬氨酸(D)取代。术语“145(-)”或“修饰145(-)”是指，在H5蛋白的第145位氨基酸(根据SEQ ID NO:1的氨基酸位置编号)所述位置的氨基酸(在SEQ IDNO:1中是丝氨酸残基)分别被删除或缺失。然而，大多数已知H5序列在第145位氨基酸编码丝氨酸。在上述任一种情况下，术语修饰145(-)是指，通常在所述位置侧翼的残基(例如，在SEQ ID NO.1中的丝氨酸144和甘氨酸146)直接连接(例如，为Serine144和Glycine145)。例如，使用SEQ ID NO:1，修饰后的序列将包括序列丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-缬氨酸(ASGV)(SEQ IDNO:54)。
此外，本文所述的术语“血凝素5(H5)”或“禽流感病毒H5”或“H5蛋白”是指但不限于任何天然存在的H5蛋白和H5蛋白的任何修饰形式，包括H5蛋白的任何缺失、取代和/或插入突变体，其中那些H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。优选地，H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:8、13或40所示的任一序列至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源的序列。特别地，最优选的是包含SEQID NO:13所列的氨基酸序列或由其组成的H5蛋白。
因此，本发明涉及H5蛋白及H5蛋白的任何修饰形式，包括H5蛋白的任何缺失、取代和/或插入突变体，其中所述H5蛋白具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，其中所述术语“145(-)”是指在H5的第145位氨基酸缺失，或者
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(c)氨基酸145L、172T、254V、
其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置；或
(d)其中H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。
优选地，H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:8、13或40所示的任一序列至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源的序列，且最优选的是包含SEQ IDNO:13所列的氨基酸序列或由其组成的H5蛋白。
不言而喻，如本文中所提供的任一种H5蛋白具有抗原性，此是指其在对流感病毒的标准血凝素抑制试验中展示抗原特性。
根据另一实施方案，本发明也涉及H5蛋白的任何部分，此部分是指在标准血凝素抑制试验中展示抗原特性、且至少具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，其中所述术语“145(-)”是指在H5的第145位氨基酸缺失，或者
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(c)氨基酸145L、172T、254V、
其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置。
若H5蛋白在标准血凝素抑制试验中抑制凝血，则其展示抗原特性。H5蛋白的该抗原部分通常包含编码H5蛋白的氨基酸序列中的200、180、160、150、140、130、120、110或最优选105个连续氨基酸，所述H5蛋白是指上述经过修饰或未经修饰、在实例2所述标准血凝素抑制试验中展示抗原特性的蛋白。标准血凝素抑制试验例如也描述于可供进一步参考的Stephenson等，Virus Research，第103卷，第91-95页(2004)中。然而，下文所述HI试验应被理解为与本文所述本发明所有方面有关的参考试验。
简言之，进行HI试验以检测HA特异性抗体的存在。异源H5N1病毒以四个血凝单位[4HA单位]的浓度用于HI试验中。随后在U形底微量滴定板中，将PBS中的连续两倍稀释血清液与等体积(25μL)(含有4HA单位)的病毒混合，且在室温(约25°C)培育30分钟。将PBS中浓度为0.5%的鸡红细胞添加至含有血清-病毒的孔中且在室温下培育40分钟。以观测到血凝抑制的最高血清稀释度的倒数确定HI效价。
值得注意的是，Haesebrouck及Pensaert(1986)发现“针对攻击(challenge)病毒的HI效价与防御攻击的保护之间可能存在关联”。Haesebrouck及Pensaert(1986)也测定了HI效价≥40的猪“完全抵抗攻击且在受攻击的呼吸道中不发生病毒复制”。因此，在经疫苗接种的猪中形成≥40的HI效价将与保护作用有关。(参见F.Haesebrouck及M.B.Pensaert，1986)。预先用灭活流感H1N1疫苗免疫的肥育猪的气管内攻击的效应(Veterinary Microbiology，11(1986)239-249)。须假设等值或至少接近等值的H5HI效价也将对猪产生防御禽流感病毒的完全免疫保护。较低效价至少引起经接种的动物的血清转化且产生对所述动物的部分免疫保护，这也可大大降低大流行的风险。
此外，本发明的H5蛋白的抗原部分包括(但不限于)H5蛋白的缺失突变体，其包含：
i.SEQ ID NO:2-40的任一氨基酸序列；
ii.与i)所述多肽具有至少85%，优选95%，进一步更优选96%，进一步更优选97%，进一步更优选98%，进一步更优选99%，最优选100%序列同源并在标准血凝素抑制试验中包含血凝素抑制作用的任一多肽；或
iii.包含i)或ii)所述任一多肽的至少334个连续氨基酸的i)或ii)所述多肽的任一部分，并且其中任一多肽在标准血凝素抑制试验中包含血凝素抑制作用。
优选地，本发明的H5蛋白的抗原部分包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:8、13、或40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。且最优选的，其中这样的H5蛋白包含SEQ ID NO:13所列的氨基酸序列或由其组成。
在本发明中的术语“修饰”，特别也是指氨基酸取代。例如，在SEQ IDNO.1所示的上下文中，术语“113D”是指氨基酸取代N113D，即第113位的氨基酸天冬酰胺(N)被氨基酸天门冬氨酸(D)取代。
本文所使用的“序列同源性”是指测定两个序列的相关性的方法。为测定序列同源性，将两个或两个以上的序列优化对齐，且必要时引入空位(gap)。与序列一致性形成对比，在测定序列同源性时，保守性氨基酸取代视为匹配。换言之，为获得具有与参考序列的95%序列同源的多肽或多核苷酸，参考序列中85%、优选90%、甚至更优选95%的氨基酸残基或核苷酸必须与其它氨基酸或核苷酸匹配或包含其它氨基酸或核苷酸的保守性取代，或者可将参考序列中全部氨基酸残基或核苷酸(不包括保守性取代)的至多15%、优选至多10%、甚至更优选至多5%量的氨基酸或核苷酸插入参考序列中。优选地，同源序列包含至少一段50个核苷酸、甚至更优选100个核苷酸、甚至更优选250个核苷酸、甚至更优选500个核苷酸。此对齐后，逐位确定序列同源性，例如，若核苷酸或氨基酸残基在特定位置处一致，则序列在彼位置上“同源”。接着将所述位置一致的总数除以参考序列中核苷酸或氨基酸残基的总数以得到序列同源性%。序列同源性可容易地藉由已知方法计算，所述方法包括(但不限于)以下文献中所述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.N.编，Oxford University Press，NewYork(1988)，Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编，Academic Press，NewYork(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.，及Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.及Devereux，J.编，M.StocktonPress，New York(1991)；及Carillo，H.及Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，所述文献的教示内容以引用方式并入本文中。设计序列同源性的优选测定方法以使所测试的序列之间达成最大匹配。序列同源性测定方法可编程为可公开获得的测定指定序列之间的序列一致性的计算机程序。所述程序的实例包括(但不限于)GCG程序套件(Devereux，J.等，NucleicAcids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990))。BLASTX程序可公开获自NCBI及其它来源(BLASTManual，Altschul，S.等，NCVI NLM NIH Bethesda，MD20894，Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，所述文献的教示内容以引用方式并入本文中)。所述程序利用预设空位权重使序列最优选对齐，以使指定序列与参考序列之间达成最高水平的序列同源性。
本发明的另一个优选的方面是使用具有氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，或优选具有氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N的H5蛋白在治疗或预防北非源的分支A H5N1病毒感染的方法中的用途，其中修饰145(-)表示删除H5的第145位氨基酸，并且其中所述的H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置，并且其中将所述H5蛋白给药于需要其的个体。
在此方面，即特别是治疗或预防北非源的分支A H5N1病毒感染，优选的是如果所使用的H5蛋白包括一个连续的氨基酸序列或由其组成，所述序列是与SEQ ID NO:2-12或35或36中任一序列至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或者特别优选100%同源的或相同的序列。
同样地，将编码任何这样的H5蛋白(例如SEQ ID NO:41所示的序列的核酸分子)或包含所述核酸分子的载体用于如下所述的方法中：通过将所述分子或载体给药于需要其的个体，用于治疗或预防分支A H5N1病毒感染的方法。
在本发明中，术语“北非源的分支A H5N1病毒”或“分支A病毒”分别特别地涉及任何包括H5蛋白的H5N1流感病毒，所述H5蛋白具有氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，或优选具有氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，其中修饰145(-)表示删除H5的第145位氨基酸，并且其中所述的H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQID NO:1所例示的氨基酸位置。
更特别地，术语“北非源的分支A H5N1病毒”或“分支A病毒”分别涉及任何包含H5蛋白的H5N1流感病毒，所述H5蛋白与SEQ ID NO:2-12，或35或36中任一序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或者特别优选100%同源性。
本发明的另一个优选的方面是具有氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或优选具有氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G的H5蛋白，或具有氨基酸145L、172T、254V或优选具有氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H、254V的H5蛋白在治疗或预防北非源的分支B H5N1病毒感染的方法中的用途，其中所述的H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQID NO:1所例示的氨基酸位置，并且其中将所述H5蛋白给药于需要其的个体。
在此方面，即特别是治疗或预防北非源的分支B H5N1病毒感染，优选的是如果所使用的H5蛋白包括一个连续的氨基酸序列或由其组成，所述序列是与SEQ ID NO:13-34或37-39中任一序列至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或者特别优选100%同源的或相同的序列。
同样在此方面，将编码任何这样的H5蛋白(例如SEQ ID NO:42所示的序列的核酸分子)或包含所述核酸分子的载体用于如下所述的方法中：通过将所述分子或载体给药于需要其的个体，用于治疗或预防北非源的分支BH5N1病毒感染的方法。
在本发明中，术语“北非源的分支B H5N1病毒”或“分支B病毒”分别特别地涉及任何包括H5蛋白的H5N1流感病毒，所述H5蛋白具有氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或优选具有氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G，或具有氨基酸145L、172T、254V或优选具有氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H、254V，其中所述的H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置。
更特别地，术语“北非源的分支B H5N1病毒”或“分支B病毒”分别涉及任何包含H5蛋白的H5N1流感病毒，所述H5蛋白与SEQ ID NO:13-34或37-39中任一序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或者特别优选100%同源性。
本发明的一个特别优选的方面是包含与SEQ ID NO:40具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或者特别优选100%同源的或相同的连续氨基酸序列或由其组成的H5蛋白在治疗或预防北非源的分支A H5N1病毒感染的方法中的用途，并且其中将所述H5蛋白给药于需要其的个体。
同样在此方面，将编码任何这样的H5蛋白(例如SEQ ID NO:43所示的序列的核酸分子)或包含所述核酸分子的载体用于如下所述的方法中：通过将所述分子或载体给药于需要其的个体，用于治疗或预防北非源的分支AH5N1病毒和/或分支B病毒感染的方法。
根据进一步的实施方案，本发明也涉及编码上述任一H5蛋白的核酸分子。优选地，所述核酸分子为RNA、DNA或拷贝(c)DNA分子。因此，本发明涉及编码H5蛋白及H5蛋白的任何修饰形式(包括H5蛋白的任何缺失、取代和/或插入突变体)的核酸分子，优选cDNA分子，其中所述H5蛋白具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，其中所述术语“145(-)”是指在H5的第145位氨基酸缺失，或者
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K,或
(c)氨基酸145L、172T、254V、
或者，更优选，具有
(d)氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N、或
(e)氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(f)氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H、254V。
并且其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置。
此外，本发明涉及核酸分子，优选为编码H5蛋白或H5蛋白的任何修饰形式(包括任何H5蛋白的缺失，取代和/或插入突变体)的H5蛋白的cDNA分子，其中所述H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。优选地，所述H5蛋白由下述氨基酸序列组成或包含下述氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:8、13或40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性。并且这样的H5蛋白特别更优选包含SEQ ID NO:13所列的氨基酸序列或由其组成。
根据进一步的实施方案，本发明也涉及编码上述H5蛋白任一部分的核酸分子，优选cDNA分子，所述“编码H5蛋白任一部分”是表示编码在如上文所述的标准血凝素抑制分析中显示抗原特性的任何肽片段，并具有
其中所述H5蛋白具有
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N，其中所述术语“145(-)”是指在H5的第145位氨基酸缺失，或者
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K,或
(c)氨基酸145L、172T、254V、
或者，更优选，具有
(d)氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T、181N、或
(e)氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(f)氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H、254V。
并且其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置。通常这种编码H5蛋白抗原部分的核酸分子包括编码以上提到的修饰或未修饰的H5蛋白的600、540、480、450、420、390、360、330或最优选315个连续核苷酸的核苷酸序列，并且在如上文所述的标准血凝素抑制分析中显示抗原特性。
根据进一步的实施方案，本发明也涉及编码上述H5蛋白任一部分的核酸分子，优选cDNA分子，所述“编码H5蛋白任一部分”是表示编码在如上文所述的标准血凝素抑制分析中显示抗原特性的任何肽片段，其中所述H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。优选地，所述H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:8、13、40所示的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%或特别优选100%同源性的序列。并且这样的H5蛋白特别更优选包含SEQ ID NO:13所列的氨基酸序列或由其组成。
H5蛋白的抗原部分的进一步实施例如上文所描述。构建任何这样的编码如上文所描述的H5蛋白的抗原部分的核酸分子，优选cDNA分子是本领域技术人员的常识。这方面的知识也包括但不限于构建编码如上文所描述的H5蛋白的抗原部分的核酸分子，优选cDNA分子的构建。
优选和示例性地，所述核酸分子包含SEQ ID NO:41-43中任一项所示的核酸序列或由其组成。
将上述任何修饰引入核苷酸序列(包括流感病毒的H5蛋白的编码序列)内的方法是本领域熟知的。完整流感病毒的基因组序列可根据本发明加以修饰，例如根据可供进一步参考的US6,951,754中所述的方法加以修饰。
此外，可利用此项技术技能范围内的传统分子生物学、微生物学及重组DNA技术修饰编码本文中所述的抗原的核酸序列。所述技术已详释于文献中。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；DNACloning：A Practical Approach，第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Transltion[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等编，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.1994)。
根据另一实施方案，本发明还涉及包含上述核酸分子中任一者的载体。换言之，本发明涉及包括上述任何该H5蛋白或其部分的编码序列的载体。优选地，该载体为使上述任何该H5蛋白或其部分得到表达的表达载体。本发明的载体为适于在活体外或活体内转染或感染细菌、酵母或动物细胞的所述载体。
载体及用于制备和/或使用表达载体(或重组体)的方法可依据或类似于以下文献中所揭示的与DNA表达载体相关的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号；PCT出版物WO94/16716、WO96/39491、WO95/30018；Paoletti，“Applications of pox virus vectorstovaccination：An update，”PNAS USA93：11349-11353，1996年10月；Moss，“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety，”PNAS USA93：11341-11348，1996年10月；Smith等，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编者)，Methodsin Molecular Biology39，“Baculovirus Expression Protocols”(1995HumanaPress Inc.)；Smith等，“Production ofHuman Beta Interferon in InsectCellsInfected with a Baculovirus Expression Vector”.Molecular and CellularBiology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等，“Strong andRegulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in InfectCells with aBaculovirus vector，”Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第399-406页；EPA0370573；美国申请案第920,197号(1986年10月16日申请)；EP专利出版物第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman，“The function of herpes simplex virus genes：Aprimer forgenetic engineering of novel vectors，”PNAS USA93：11307-11312，1996年10月；Andreansky等，“The application of genetically engineeredherpes simplexviruses to the treatment of experimental brain tumors，”PNASUSA93：11313-11318，1996年10月；Robertson等，“Epstein-Barr virusvectors for genedelivery to B lymphocytes”，PNAS USA93：11334-11340，1996年10月；Frolov等，“Alphavirus-based expression vectors：Strategiesandapplications，”PNAS USA93：11371-11377，1996年10月；Kitson等，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号、WO98/00166；已受理的美国申请案第08/675,556号、第08/675,566号(两者均于1996年7月3日申请)(重组腺病毒)；Grunhaus等，1992，“Adenovirus ascloningvectors，”Seminars in Virology(第3卷)，第237-52页，1993；Ballay等，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页；Graham，Tibtech8，85-87，1990年4月；Prevec等，J.Gen Virol.70，42434；PCT WO91/11525；Felgner等，(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259：1745-49，1993及McClements等,“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D orglycoprotein B，alone or in combination，induces protective immunity in animalmodels of herpessimplex virus-2disease”，PNAS USA93：11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号；以及WO90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等，Nature；及Furth等，Analytical Biochemistry等。也可参见WO98/33510；Ju等，Diabetologia，41：736-739，1998(豆状病毒表达系统)；Sanford等，美国专利第4,945,050号；Fischbach等(Intracel)，WO90/01543；Robinson等，seminars in Immunology第9卷，第271-283页(1997)(DNA载体系统)；Szoka等，美国专利第号(将DNA插入活细胞内的方法)；McCormick等，美国专利第5,677,178号(细胞病病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因传递的载体)以及本文中所引用的其它文件。
病毒载体及DNA载体(DNA质粒)均可以有利地用于实施本发明，所述病毒载体例如选自猪疱疹病毒(诸如Aujeszky氏疾病病毒)、猪腺病毒、和痘病毒(尤其牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒及猪痘病毒)。
本发明H5蛋白的制备方法
根据另一方面，本发明提供制备和/或回收高产量重组H5蛋白的方法：i)用含有H5DNA编码序列的重组病毒载体感染培养中的易感细胞，其中所述重组病毒载体表达H5蛋白；和ii)然后从细胞培养物中回收H5蛋白。H5蛋白的高产量是指(但不限于)约20μg/mL细胞培养物以上、优选约25μg/mL以上、进一步更优选约30μg/mL以上、进一步更优选约40μg/mL以上、进一步更优选约50μg/mL以上、进一步更优选约60μg/mL以上、进一步更优选约80μg/mL以上、进一步更优选约100μg/mL以上、进一步更优选约150μg/mL以上、最优选约190μg/mL以上。
根据一个优选实施方案，通过收获表达H5蛋白的全(亦即完整)SF+细胞来回收H5蛋白。
优选细胞为所述易受含有H5DNA并表达H5蛋白的适当重组病毒载体感染的细胞。优选地，所述细胞为昆虫细胞，且更优选地，其包括以商标SF+昆虫细胞(Protein Sciences Corporation，Meriden，CT)出售的昆虫细胞。优选的细胞培养物的细胞数约0.3-2.0×106个细胞/mL，更优选约0.3-1.9×106个细胞/mL、进一步更优选约0.4-1.8×106个细胞/mL、进一步更优选约0.45-1.7×106个细胞/mL，最优选约0.5-1.5×106个细胞/mL。
优选病毒载体包括杆状病毒，例如BaculoGold(BDBiosciencesPharmingen，San Diego，CA)，尤其是在制备细胞为昆虫细胞的情况下。尽管杆状病毒表达系统为优选的，但本领域技术人员应了解，其它表达系统可用于本发明的目的，也即用于使H5表达至细胞培养物的上清液中。所述其它表达系统可能需要使用信号序列以使H5表达至培养基中。
适当的生长培养基也可由本领域技术人员确定，优选生长培养基为无血清昆虫细胞培养基，诸如Excell420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa，KS)等培养基。
当用于感染易感细胞时，含有H5DNA序列的重组病毒载体优选感染复数(MOI)约0.03-1.5、更优选约0.05-1.3、进一步更优选约0.09-1.1，最优选约0.1-1.0。优选地，上述MOI是针对1mL细胞培养液而言。优选地，本文中所述方法包含：用MOI(感染复数)约0.03-1.5、更优选约0.05-1.3、进一步更优选约0.09-1.1、最优选约0.1-1.0的含H5DNA并表达H5蛋白的重组病毒载体感染0.35-1.9×106个细胞/mL、进一步更优选约0.4-1.8×106个细胞/mL、进一步更优选约0.45-1.7×106个细胞/mL且最优选约0.5-1.5×106个细胞/mL。
接着将受感染细胞培育至多10天、更优选约2-10天、进一步更优选约4-9天，最优选约5-8天。优选的培育条件包括温度约22-32°C、更优选约24-30°C、进一步更优选约25-29°C、进一步更优选约26-28°C，最优选约27°C。优选地，接种后观测到SF+细胞具有被杆状病毒诱导的特征性变异。此种观测包括感染后监测细胞密度变化及存活力降低。已发现，感染后3-5天观测到峰值病毒效价，且细胞中的H5蛋白表达在第5天与第8天之间和/或在细胞存活力降至小于10%时达到峰值。
因此，本发明一方面提供制备和/或回收重组H5蛋白(优选为上述量)的方法：i)用具有上述MOI的重组病毒载体感染培养中的大量易感细胞(见上文)；ii)由重组病毒载体表达H5蛋白；及iii)尔后收集感染后5-8天的细胞，和/或收集细胞存活力降至小于10%时的细胞，从中回收H5蛋白。优选地，重组病毒载体为含有H5DNA编码序列的重组杆状病毒且所述细胞为SF+细胞。此外，优选定期检查培养物受污染的宏观及微观迹象或感染后细胞形态的异常变化。应弃去任何呈现任何污染的培养物。
为回收在免疫原性或免疫组合物(例如疫苗)中使用的H5蛋白，优选包括灭活步骤以便将病毒载体灭活。
“免疫原性或免疫组合物”是指包含至少一种抗原的物质组合物，该抗原可在宿主体内引发对目标组合物或疫苗的免疫反应，是细胞性免疫反应和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于以下效应中的一种或多种：产生或活化特异性针对包含于目标组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主可呈现治疗性或保护性免疫反应，以便增强对新感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重程度。此保护作用表现为受感染宿主通常所呈现的症状减少或消失、恢复时间加快和/或受感染宿主的病毒效价降低。
因此，本发明还涉及制备和/或回收重组H5蛋白(优选为上述量)的方法：i)用具有上述MOI的重组病毒载体感染培养中的大量易感细胞(见上文)；ii)由重组病毒载体表达H5蛋白；及iii)尔后收集感染后5-8天的细胞，和/或收集细胞存活力降至小于10%时的细胞，从中回收H5蛋白；及iv)将重组病毒载体灭活。
优选地，此灭活是在即将进行过滤步骤之前进行或在过滤步骤刚结束之后进行，过滤步骤之后为优选灭活时间。任何传统灭活方法可用于本发明的目的。因此，灭活可通过化学和/或物理处理来进行。在优选形式中，测定所收获液体的体积且使温度介于约32-42°C之间、更优选介于约34-40°C之间且最优选介于约35-39°C之间。优选灭活方法包括添加环化二乙烯亚胺(binary ethylenimine，BEI)，该物质浓度优选为约1mM至约20mM、优选为约2mM至约10mM、进一步更优选为约2mM至约8mM、进一步更优选为约3mM至约7mM、最优选为约5mM。举例而言，灭活包括将优选为约0.4M的2-溴伸乙基胺氢溴化物溶液(其已在0.3N NaOH中环化为0.2M二乙烯亚胺BEI)添加至液体中以得到最终浓度约5mM的BEI。优选地，接着将液体连续搅拌72-96小时，且可将经灭活的收获液体在-40°C或-40°C以下冷冻储存或在约1-7°C之间储存。灭活完成后，添加硫代硫酸钠溶液(优选为1.0M)以中和任何残余BEI。优选地，硫代硫酸钠的添加量与灭活之前所添加的BEI的量相当。举例而言，在添加BEI至最终浓度为5mM的情况下，添加1.0M硫代硫酸钠溶液以得到最终最小浓度5mM以中和任何残余BEI。
因此，本发明的另一方面涉及一种如下制备重组H5蛋白(优选为上述量)的方法：i)用具有上述MOI的重组病毒载体感染培养中的大量易感细胞(见上文)；ii)由重组病毒载体表达H5蛋白；及iii)之后收集感染后5-8天的细胞，和/或收集细胞存活力降至小于10%时的细胞，从中回收H5蛋白；及iv)将重组病毒载体灭活。优选地，重组病毒载体为含有H5DNA编码序列的杆状病毒且所述细胞为SF+细胞。优选灭活步骤为上述步骤。优选地，灭活是在约35-39°C且在2mM至8mM BEI存在下、甚至更优选在约5mM BEI存在下进行。
根据本发明的另一方面，上述方法也包括步骤iv)后的中和步骤。此步骤v)包含添加中和溶液中的灭活剂的等量试剂。优选地，若灭活剂为BEI，则优选添加等量的硫代硫酸钠。因此，根据另一方面，当灭活剂为BEI时，步骤v)包含添加硫代硫酸钠溶液直至最终浓度为约1mM至约20mM、优选约2mM至约10mM、甚至更优选约2mM至约8mM、甚至更优选约3mM至约7mM、最优选约5mM。
在优选形式中且尤其在以免疫原性组合物(例如疫苗)使用重组H5蛋白的形式中，每一批所收获的H5蛋白通过在具有贴壁依赖性、且易被杆状病毒感染的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中传代来测试灭活。在此测试的一种优选形式中，将150cm2的适当细胞培养单层用1.0mL经灭活的H5液体接种且在25-29°C下维持14天，期间至少传代两次。在维持期结束时，对细胞单层检查H5杆状病毒所特有的致细胞病变作用(CPE)。优选地，也使用阳性病毒对照。这样的对照可由以下物质组成：一份经未灭活的参考H5杆状病毒接种的Sf9细胞培养物及一瓶尚未接种的Sf9细胞。培育和传代后，经BEI处理的病毒液中不存在受病毒感染的细胞说明灭活测试令人满意。经参考病毒接种的对照细胞应呈现H5杆状病毒所特有的CPE而未接种烧瓶应不呈现任何H5杆状病毒CPE迹象。或者，在维持期结束时，可收集上清液样本且将其接种于Sf996孔板上，该孔板已装载Sf9细胞，接着在25-29°C下维持5-6天。接着将孔固定，用偶联FITC的抗-H5抗体或抗杆状病毒特异性蛋白(亦即gp64)的任何标记抗体染色。经BEI处理的病毒液中不存在CPE、H5表达或杆状病毒特异性蛋白(亦即gp64)的表达说明灭活测试令人满意。经参考病毒接种的对照细胞应呈现CPE及IFA活性，而未接种烧瓶应不呈现任何H5杆状病毒CPE迹象且不含IFA活性。
因此，本文所述另一方面涉及用于测定表达H5蛋白的重组病毒载体的灭活有效性的灭活测试，其包含以下步骤：i)使含有重组病毒载体的培养液的至少一部分与优选如上所述的灭活剂接触；ii)添加优选如上所述的中和剂以中和灭活剂；及iii)通过如上所述的试验测定残余感染性。
灭活后，可以多种方式测定样本中重组H5蛋白的相对量。优选量化方法包括SDS-PAGE密度测定法、ELISA和动物接种研究，其使已知疫苗量与临床结果(血清学等)相关。当利用SDS-PAGE量化时，将含有未知量的重组H5蛋白的样本物质连同含有各种已知量的重组H5蛋白的样本一起在凝胶上展开。接着可基于已知样本形成标准曲线，且可通过与此标准曲线比较来测定未知样本中重组H5的量。由于ELISA通常公认为抗原量化的行业标准，因此优选利用ELISA进行量化。
包含H5蛋白或编码所述蛋白的核酸分子或载体的疫苗
根据另一方面，本发明涉及通常包含以下物质的疫苗或药物组合物：
i.一或多种本文所述H5蛋白；
ii.一或多种如本文所述的编码任何所述H5蛋白的核酸分子；和/或
iii.一或多种本文所述载体，其包含如本文所述的任一种所述核酸分子且编码如本文所述的任何所述H5蛋白；及
iv.药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
如本文所述的术语“药物组合物”、“药物/疫苗组合物”包括(但不限于)用于减少或预防感染的疫苗或用于治疗和减轻感染的组合物。
编码流感血凝素的基于核酸的疫苗(优选cDNA疫苗)的制备例如描述于以下参考文献中：Deck等，Vaccine1997；15(1)：71-78；Ulmer等，Science1993；259：1745-1749；Ulmer等，Vaccine1994；12(16)：1541-1544。任何所述方法可用于制备编码如本文所述的流感H5蛋白的基于核酸的疫苗，优选cDNA疫苗。
此外，包含本文所述H5蛋白或其部分的疫苗可由传统方法制备，例如由重组表达技术或由生物化学纯化及分离技术制备。重组表达技术(包括在昆虫细胞中表达)是本领域熟知的且例如描述于以下参考文献中：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)ColdSpring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；DNA Cloning：APracticalApproach，第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；Animal CellCulture[R.I.Freshney编(1986)]；ImmobilizedCells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.1994)。成熟的重组表达系统的其它实例有，细菌表达系统如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；基于酵母的表达系统如酿酒酵母(S.cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或哺乳动物细胞表达系统如基于BHK、CHO和/或NS0的表达系统。所述系统是本领域熟知的且一般可(例如)经由ClontechLaboratories，Inc.4030Fabian Way，Palo Alto，California94303-4607，USA购得。其它表达策略例如描述于Lüschow等，Vaccine第19期(2001)，第4249-4259页或Veit等，PNAS第103卷(2006)，第8197-8202页中。此外，重组腺伴随病毒系统为成熟系统且描述于例如可供进一步参考的US5,436,146或WO200203872中。此外，基于牛痘(痘)病毒的表达系统(例如，如可供进一步参考的US6,265,183中所述)也为成熟系统且适于制备本发明用的重组抗原、抗原组合物。其它适当表达系统利用重组的乳多空病毒(如SV40)、禽痘病毒、假型狂犬病病毒及逆转录病毒。
本文所述相关药物/疫苗组合物也可包含：含有本文所述H5蛋白的灭活病毒，含有本文所述H5蛋白的活病毒的非致病形式、含有本文所述H5蛋白的病毒制剂和/或病毒片段。
本领域技术人员已知可以与抗原一起包含于所述组合物/疫苗中的其它组分(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences.(1990)，第18版，MackPubl.，Easton)。本领域技术人员可使用已知的生理学上可接受的无菌可注射溶液。需要制备即用溶液(a ready-to-use solution)时，可以很容易地获得盐水或相应血浆蛋白溶液之类的等渗水溶液。药物组合物/疫苗可以是冻干制剂或干燥制剂，如试剂盒(kit of parts)的形式，它们可在无菌条件下于临用前用已知的注射液重建。
此外，本发明的药物/疫苗组合物可包括一或多种兽医学上可接受的载剂。本文中，“兽医学上可接受的载剂”包括(但不限于)任何及所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂尤其可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
本文所用的防腐剂是指抗微生物活性剂，例如庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)等。具体地，制备一种多剂量组合物最优选添加防腐剂。所述抗微生物活性剂的浓度足以有效防止目标组合物受任何微生物污染或抑制目标组合物内任何微生物生长。
本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂苷(例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液，其中基于Emulsigen的佐剂是本发明特别优选的。
乳液尤其可基于轻质液状石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃(尤其异丁烯或癸烯)的寡聚反应所产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其是异硬脂酸酯。油可与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，尤其脱水山梨糖醇酯、二缩甘露糖醇酯(例如脱水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羟基硬脂酸酯(其视情况经乙氧基化)；及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等，The Theory andPracticalApplication of Adjuvants(Stewart-Tull编，D.E.S.).John Wiley andSons，NY，第51-94页(1995)及Todd等，Vaccine15：564-570(1997)。适当水包油型乳液的实例为基于Emulsigen的佐剂，例如 (MVP Laboratories，Inc.Omaha，NE，USA)。已经发现，包含H5蛋白、优选本文所述重组H5蛋白的药物/疫苗组合物可以被水包油型乳液，优选为所述基于Emulsigen的佐剂，更优选
及
有效辅佐。
此外，可使用M.Powell及M.Newman所编的“Vaccine Design，TheSubunitand Adjuvant Approach”第147页所述的SPT乳液及该书第183页所述的乳液MF59。
佐剂的另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及顺丁烯二酸酐与链烯基衍生物的共聚物的化合物。有益的佐剂化合物为丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其与糖或多元醇的聚乙烯基醚形成的交联物。所述化合物称为卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基、优选不超过8个羟基的多羟基化合物交联的所述丙烯酸聚合物，至少三个羟基中的氢原子可置换为具有至少2个碳原子的不饱合脂族基。优选基团为含有2至4个碳原子的所述基团，例如乙烯基、烯丙基及其它烯键式不饱合基团。不饱合基团本身可含有其它取代基，例如甲基。以商品名Carbopol(BFGoodrich，Ohio，USA)销售的产品尤其适用。其与烯丙基蔗糖或烯丙基异戊四醇交联。其中可提及Carbopol974P、934P及971P。最优选为使用Carbopol971P。在顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物。所述聚合物溶解于水中可产生酸溶液，使该酸溶液中和，优选中和至生理pH值，以便得到佐剂溶液，再向其中加入免疫原性、免疫性或疫苗性组合物。
其它适当佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质胺佐剂、大肠杆菌热不稳定性肠毒素(重组体或其它形式)、霍乱毒素或胞壁酰二肽。
优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约500μg至约5mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约750μg至约2.5mg的量添加。最优选地，佐剂以每剂量约1mg的量添加。
药物/疫苗组合物可进一步包括一或多种其它免疫调节剂，例如白介素、干扰素或其它细胞因子。药物/疫苗组合物也可包括庆大霉素及硫柳汞。尽管适用于本发明的上下文中的佐剂及添加剂的量及浓度可易于由本领域技术人员确定，但本发明的组合物可以是，在1ml剂量的疫苗组合物中包含约50μg至约2000μg佐剂且优选约250μg佐剂。在另一个优选实施方案中，本发明涵盖包含约1μg/ml至约60μg/ml抗生素且更优选小于约30μg/ml抗生素的疫苗组合物。
因此，根据进一步的实施方案，本发明也涉及药物/疫苗组合物，其包含：
I)治疗有效量的如本文所述的任一种流感病毒H5蛋白，和
II)如上所述分药学上可接受的佐剂。
优选地，佐剂是选自下组：
a)
一种水包油型乳液(o/w)；
b)
一种具有二甲基二-十八烷基溴化铵(DDA)的水包油(o/w)乳液；
c)Polygen：一种共聚物；
d)
一种具有专有免疫刺激剂的水包油型(o/w)乳液；
e)Carbigen为一种交联聚合物；
f)
一种包含具有交联聚合物的水包油型(o/w)乳液的双重佐剂；和
g)ISA70为一种油包水型(w/o)乳液。
最优选地，所述佐剂为水包油型乳液，例如选自以下的基于emulsigen的佐剂：
和最优选将
和
用于本发明的配制剂中。
根据另一方面，如本文中所提供的药物/疫苗组合物包含一种或多种抗原。优选地，所述抗原为禽类或哺乳动物病原体的抗原。根据另一实施方案，所述抗原为其它流感抗原，例如流感病毒的血凝素H3、H7、H9或其它任何血凝素。这(些)其它抗原可以是纯化形式、作为抗原制剂的一部分添加，以经灭杀微生物的形式或以经修饰的活微生物的形式添加。
本文术语“抗原”是指(但不限于)肽、多肽、糖肽或多糖，其能够与免疫系统的抗原识别分子(例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性交互作用以便在该抗原所给予的宿主中引发、活化或刺激针对该抗原的免疫反应。术语“抗原”也指核酸分子，优选为DNA分子或RNA分子，其各自编码且表达能够与免疫系统的抗原识别分子(例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性交互作用的肽、多肽或糖肽，以便引发、活化或刺激针对由该核酸分子所编码的抗原的免疫反应。用于制备根据本发明使用的药物组合物的抗原为微生物或该微生物的抗原部分和/或制剂。就此而言，本文术语“免疫”是指(但不限于)任何引起或增强免疫反应的情况。术语“免疫反应”已于上文中加以描述。
流感疫苗的给药策略是本领域熟知的。灭活病毒疫苗及减毒病毒疫苗的粘膜接种策略也包括在本发明内。尽管粘膜可通过局部传递疫苗而被锁定目标，但多种策略均已用于将免疫原性蛋白传递至粘膜。
在具体实施方案中，可将疫苗与霍乱毒素(例如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合体)混合或作为结合型或嵌合型融合蛋白给药(Hajishengallis，JImmunol.，154：4322-32，1995；Jobling和Holmes，Infect Immun.，60：4915-24，1992)。基于使用霍乱毒素B亚单位的粘膜疫苗已加以描述(Lebens和Holmgren，Dev Biol Stand82：215-27，1994)。在另一实施方案中，可制备与热不稳定性肠毒素(LT)的混合物用于粘膜接种。
其它粘膜免疫策略包括将病毒囊封于微囊中(US5,075,109、US5,820,883和US5,853,763)和使用免疫增强性膜质载体(WO98/0558)。经口给药的免疫原的免疫原性可通过使用红细胞(rbc)或rbc碎片(US5,643,577)或通过使用蓝舌病抗原(US5,690,938)而得以增强。
根据另一方面，本发明涉及一种制备如上所述的药物/疫苗组合物的方法，优选为一种制备包含如上所述的经杆状病毒表达的重组H5蛋白的疫苗的方法。通常，此方法包括以下步骤：i)将构建体转染至病毒内，其中该构建体包含如本文所述的重组H5cDNA；ii)用经转染的病毒感染生长培养基中的细胞；iii)使病毒表达如本文所述的重组H5蛋白；iv)自培养物回收经表达的H5蛋白；及v)通过将经表达的H5蛋白与适当佐剂和/或其它药学上可接受的载剂混和而制备组合物。
优选佐剂为上述佐剂。因此，根据另一方面，用于激发抗流感感染的免疫反应的抗原组合物(例如疫苗)的制备方法包含i)制备和回收H5蛋白，和ii)将该蛋白与适当佐剂混合。
此外，本发明的疫苗组合物也可包括稀释剂、等渗剂、稳定剂和/或防腐剂。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂特别可包括无机盐或有机盐(例如氯化钠)、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖、糖类、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖。稳定剂特别包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。适当佐剂为上述佐剂。
所述H5蛋白、核酸分子、载体及疫苗中任一者的医药用途
如本文中所提供的H5蛋白、编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码本文所述任何H5蛋白)的载体以及包含该H5蛋白、核酸分子或载体中任一者的任何药物/疫苗组合物可用作药物，优选用于治疗和预防由流感病毒、最优选由流感A病毒引起的感染。如本文中所提供的H5蛋白、编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码如本文所述的任何所述H5蛋白)的载体以及包含如本文所述的H5蛋白、核酸分子或载体中的任一者的任何药物/疫苗组合物可用于人类的治疗或预防且可用于兽医药物中。当用于兽医药物中时，优选为治疗禽类，优选鸟、鸡、鸭、火鸡等动物；以及哺乳动物，优选猪、牛、马、海豹、骆驼、狗、猫、仓鼠、小鼠等动物。
因此，根据另一方面，本发明涉及如本文中所提供的H5蛋白、编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码如本文所述的任何所述H5蛋白)的载体以及包含如本文所述H5蛋白、核酸分子或载体中的任一者的任何药物/疫苗组合物的用途，其可用作药物、优选用作人类药物和/或兽医药物。
此外，如本文中所提供的H5蛋白、如本文所述的编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码任何该H5蛋白)的载体可用于制备如本文所述的药物组合物，以便预防或治疗由流感病毒引起的感染。如上所述，所述药物组合物/疫苗组合物可用于人类的治疗和/或预防以及动物的治疗和/或预防，所述动物例如禽类，优选鸟、鸡、鸭、火鸡等动物，以及哺乳动物，优选猪、牛、马、海豹、骆驼、狗、猫、仓鼠、小鼠等动物。
根据本发明，如本文所述的H5蛋白用于制备预防或治疗由流感病毒引起的感染的药物组合物是优选的，所述感染优选是由于北非源H5N1病毒引起的感染，特别是由于包含H5蛋白的病毒引起的感染，所述H5蛋白与SEQID NO:2-40所列的任一序列，优选与SEQ ID NO:8、13或40所列序列具有至少95%，优选96%，更优选为97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的同源性。特别优选的是使用SEQ ID NO:8、13或40所列序列编码的H5蛋白。
因此，可以理解的是，本发明的术语“北非源H5N1”特别是指包含H5蛋白的H5N1病毒，所述H5蛋白与SEQ ID NO:2-40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的同源性。优选地，本发明的“北非源H5N1”特别是指包含H5蛋白的H5N1病毒，所述H5蛋白与SEQ ID NO:8、13或40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的同源性。根据进一步优选的实施方案，本发明的术语“北非源H5N1”特别是指包含H5蛋白的H5N1病毒，所述H5蛋白与SEQ IDNO:13所列序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的同源性。根据进一步优选的实施方案，本发明的术语“北非源H5N1”特别是指包含H5蛋白的H5N1病毒，所述H5蛋白与SEQ ID NO:8所列序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的同源性。
因此，如本文所述的短语“北非源H5N1的感染”特别是指上述病毒的感染。
本发明还涉及本发明的核酸分子，例如包含SEQ ID NO:41-43所列核酸序列中的任一项或由其组成的核酸分子，用于制备预防或治疗由流感病毒引起的感染的药物组合物的用途，优选由北非源H5N1病毒引起的感染，特别是由包含下述H5蛋白的病毒引起的感染，所述H5蛋白与SEQ ID NO:2-40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选为97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的同源性，其中SEQ ID NO:8、13或40所列序列是特别优选的。
同样地，本发明包括本发明的载体用于制备预防或治疗病毒性流感，优选北非源H5N1引起的感染的药物组合物的用途。特别是编码所描述的任何H5蛋白的载体。
如本文中所提供的H5蛋白、如本文所述的编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码任何所述H5蛋白)的载体可用于制备如本文所述的药物组合物，该药物组合物适于治疗和预防优选由禽、猪或人类流感病毒或其任何组合或杂交的流感病毒感染。
根据另一方面，本发明也涉及一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中该方法包含将治疗有效量的本文所述H5蛋白给予需要该治疗的受检者。此外，本发明也涉及一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中该方法包含将治疗有效量的如本文所述的编码如本文所述的任何H5蛋白的任何H5核酸分子或载体给予需要该治疗的受检者。此外，本发明也涉及一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中该方法包含将治疗有效量的包含如本文所述的任何该H5蛋白、核酸分子或载体的疫苗给予需要该治疗的受检者。有需要的受检者可为人类以及动物，优选为禽类，甚至更优选为鸟、鸡、鸭、火鸡；或哺乳动物，优选为猪、牛、马、海豹、骆驼、狗、猫、仓鼠、小鼠等动物。
优选地，当对鸡进行接种时，可在1日龄时或1日龄之后(例如在10日龄时，或在1日龄至10日龄时，或在10日龄时或10日龄之后)使用本文所述H5蛋白接种。
可通过给予任何H5蛋白、编码该任何H5蛋白的核酸分子或载体或如本文所述的任何药物/疫苗组合物治疗的流感感染优选为由禽、猪或人类流感病毒或其任何组合或杂交引起。
根据另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含：i)如本文所述的该H5蛋白、编码任何该H5蛋白的核酸分子或载体或包含如本文所述的该H5蛋白、核酸分子或载体中任一者的任何药物/疫苗组合物中的任一者；及ii)指示该H5蛋白、核酸分子、载体或疫苗用于治疗或预防由流感病毒引起的感染的用途的包装插页。当对鸡进行接种时，可在1日龄时或1日龄之后使用本文所述H5蛋白接种。
根据另一实施方案，试剂盒包含禽类或哺乳动物病原体的至少另一种抗原及指示彼另外抗原的医药、人类或兽医学用途的信息。
实施例
以下实施例阐述本发明的优选物质及方法。然而应了解，所述实施例仅为说明而提供，且不应视为对本发明的整体范围的限制。
实施例1
A.埃及分离株的分子信息
信息是基于G.Cattoli博士提出的分类方案，先前已报道的北非地区的HP AIV H5N1分支2.2.1。目前，遗传变体已经产生亚系A和B，其是在2010年在埃及流传。上面提到的分类符合可在WHO网站“www.who.int./csr/disease/avian_influenza/guidelines/nomenclature/en/”获得的国际指引。
a)北非分离株之间的同源性。
对于从2010年的阳性样品中的H5血凝素基因的序列，每一个亚系内成对的核苷酸距离是在0.5-1.4的范围内，这小于1.5%(序列是98.5%以上相似)。
以上值是根据WHO/FAO/OIE的指引，按照定义以分类新分离株作为可能的亚系的标准。
对于2010年北非的分支2.2.1流行，亚系A和亚系B的序列间的相似百分比是在96-98%之间。
b)埃及分离株H5N1与其他H5N1之间的差异。
在下表中列出了与H5N1原型株相应序列相比较，从2010年高致病性禽流感(HPAI)H5N1，目前流传于北非的亚系A和亚系B的代表性序列的相似百分比。
| 代表性毒株 | 亚系A | 亚系B |
| 分支1(越南-1304-2004) | 94.5 | 93.3 |
| 分支2.3.4(安徽-1-2005) | 94.3 | 92.8 |
| 分支2.1(印度尼西亚-5-2005) | 94.8 | 94 |
c)氨基酸序列
由IZSVe(Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie)提供的38个序列列于下方和序列表中。
B.疫苗菌株的选择、序列中的相关动机的鉴定标准
标准1。
与系统发育分析相关的遗传距离。在系统发育树中类群的分离支持根据H5HA序列推断的最远的相关分离株。选择最远的分离株。
标准2。
在2010年的采样中每个亚系的频率。这个频率不涉及样本代表HPAIH5N1病毒的区域流行的程度。在整个2010年的数据集中每一个亚系的患病率是挑选分离株和将其作为新的攻击株提出的基础。
另外，将基于序列的分析用于确认系统发育结果。认为受体结合位点(RBS)内部或周围的H5HA序列的改变对于定义新的疫苗株是重要的。下面表1和表2显示了抗原序列变体。
期望共有序列结合了所有可用序列的性质。由于不明的原因共有序列不存在于自然界中，在此情况下该共有序列成为用于疫苗的表达平台，并为表达可以提供独特的抗原特性的蛋白提供了机会。
表1.当分支A(1709-1)和分支B(1709-6)之间的氨基酸出现差异时，所述差异的位置
表2.分支B中，在2008原型株(1709-6)与某些最近的(2010)分支B分离株(1556-)之间的氨基酸差异的位置
C.攻击株的选择的鉴定标准
选择攻击菌株的标准与上文所述的疫苗株的标准基本上是相同的。
标准1。
与系统发育分析相关的遗传距离。在系统发育树中类群的分离支持根据H5HA序列推断的最远的相关分离株。选择最远的分离株。
标准2。
在2010年的采样中每个亚系的频率。这个频率不涉及样本代表HPAIH5N1病毒的区域流行的程度。在整个2010年的数据集中每一个亚系的患病率是挑选分离株和将其作为新的攻击株提出的基础。
另外，将基于序列的分析用于确认系统发育结果。认为受体结合位点(RBS)内部或周围的H5HA序列的改变对于定义新的疫苗株是重要的。下面表1和表2显示了抗原序列变体。
表1描述了当分支A(1709-1)和分支B(1709-6)之间的氨基酸(AA)出现差异时所述差异的位置；表2描述了在分支B中，2008原型株(1709-6)和某些最近的(2010)分支B分离株(1553)之间的氨基酸差异的位置。
D.构建编码及表达HA H5抗原的重组杆状病毒
如下生成含有H5HA抗原的重组杆状病毒：化学合成H5HA(SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:40)的编码序列且将其亚克隆入转移载体pVL1392(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)内。接着用
(Sigma)杆状病毒DNA将含有编码各H5HA抗原的基因的pVL1392质粒共转染入Sf9昆虫细胞(BD Biosciences Pharmingen)内以生成含有H5HA基因的重组杆状病毒。将含有编码H5HA的基因的重组杆状病毒进行空斑纯化，并且将主种子病毒(Master Seed Virus；MSV)于SF+细胞株上繁殖，制成等分试样且在-70°C储存。用上述H5HA杆状病毒感染昆虫细胞以生成MSV或工作种子(Working Seed)，结果是所述病毒表达H5HA抗原，这通过用多克隆血清或单克隆抗体经间接荧光抗体试验或Western blot法检测得到。
用适量重组杆状病毒(分别为各抗原序列的H5HA)接种后，接着将含有SF+细胞(Protein Sciences，Inc.，Meriden，CT)的旋转瓶在27±2°C培育7天，期间以100rpm搅拌。所述旋转瓶使用通气盖以使空气流动。收获含有经杆状病毒感染的SF+细胞的粗制全细胞培养物及各培养物的细胞培养上清液。
E.HI数据：埃及H5分离株与BEST H5(现有的构建体)疫苗的血清学 反应对比
在下表中，显示了在3周龄时用BEST AI+ND KV(BaculovirusExpressions System Technology and Newcastle Disease，灭活病毒)疫苗接种的鸡的组的HI效价和相应的GMT(几何平均效价)的值。用上述埃及HPAIH5N1毒株攻击相同的实验组，并且包括了保护的水平以确认抗体的水平与高度保护有关。
下表描述：疫苗原型包括触发良好的免疫反应的H5HA抗原。以抗体水平检测，从10日龄时接种的鸡的HI效价展示出高于4logsBASE2的值。在表中，显示了每种接种疫苗的动物和相应的每组GMT的原始数据。这证实了，在使用下面显示的毒株攻击前，两组的抗体水平带来了保护作用。毒株包括最近的2010年野外分离HP H5N1AIV(“1553-2”)，和埃及政府用于评估疫苗批次的官方毒株(“1709-6”)。
实施例2
包含不同HA H5抗原的药物组合物(疫苗)的制备
收获由基于杆状病毒的表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5HA蛋白。在10mM环化二乙烯亚胺(BEI)(最终浓度)存在下、在约32°C-39°C将杆状病毒灭活72-96小时。灭活完成后，添加0.3M硫代硫酸钠溶液直至最终浓度为10mM，以中和任何残余BEI。中和后，添加各种佐剂并生成以下疫苗/药物组合物。
疫苗
系列501-507对应于相同抗原H5HA分支A，其使用7种不同佐剂制剂。系列508-514对应于使用抗原H5HA分支B的相应系列。系列515-521对应于使用抗原H5HA共同分支的相应系列。系列522-528对应于使用抗原H5 HA分支WHO的相应系列。
实施例3
对鸟进行接种以防御禽流感
引论
此研究的目的是测定含有重组H5血凝素抗原粗提取物的实验性疫苗在鸡体内诱导血凝抑制(HI)效价并针对高致病性(HP)H5N1禽流感病毒(AIV)提供保护的能力。此外，用传统灭活疫苗
AI(Boehringer IngelheimVetmedica，Mexico)作为对照。
研究设计：
1日龄或10日龄的SPF鸟(15-25只)各自独立地用0.2或0.5ml的不同实验性疫苗在颈背部通过皮下途径接种；实验期间所有鸟隔离饲养。不限量提供食物和水。接种后第21日用H5N1高致病性禽流感病毒株进行攻击。
接种后第7、14和21日，自鸟颈静脉放血获得血清样本。所得血清在4°C储存，直至进行如上所述的血凝抑制(HI)测试以获得抗体效价。
疫苗及攻击病毒：
独立评价四种不同配制剂：
i.H5HA分支A：按照Boehringer Ingelheim Vetmedica的方法，将H5HA抗原配制在油乳液中。
ii.H5HA分支B：按照Boehringer Ingelheim Vetmedica的方法，将H5HA抗原配制在油乳液中。
iii.H5HA共有分支：按照Boehringer Ingelheim Vetmedica的方法，将H5HA抗原配制在油乳液中。
iv.H5HA分支WHO：按照Boehringer Ingelheim Vetmedica的方法，将H5HA抗原配制在油乳液中。
用禽流感Boehringer Ingelheim Vetmedica油乳液疫苗作为对照(
AI，Boehringer Ingelheim Vetmedica，Mexico)。
对于经过接种和未经接种的鸡，每只经鼻内途径接种0.2ml含106.0EID-50/ml的H5N1攻击病毒进行攻击。攻击后，记录病征和死亡率。接种后第10日，将所有幸存的鸡按照动物实验程序施以人道安乐死。
原型、剂型和临床研究的实验设计的实施例
为每个BEST(杆状病毒表达系统技术)-埃及构建体制备包括500HAU/剂量(HAU=血凝素单元)的水/油乳液。基于最近的讨论预见了三种构建体。10日龄时，每只SPF(无特定病原体)鸡在颈背部通过皮下途径以0.5ml每种疫苗原型接种一次。
保护的阳性对照是在颈背部皮下给药0.5ml
(Boehringer Ingelheim Vetmedica,Mexico)进行接种。
每只鸟经口鼻用10-6EID50/0.1ml的病毒剂量攻击。使用埃及(A/鸡/埃及/1063/2010)攻击的毒株进行实验感染。
结果：
根据OIE的标准阳性血清效价被认为是log24。基于这个标准，血清学结果是阳性的。在1日龄或10日龄接种的鸡中，均在用H5HA抗原配制的疫苗中观察到最好的血清效价。使用
疫苗观察到最低的血清效价。在攻击研究中观察到所有的疫苗原型带来了充分的保护。而攻击研究中使用
疫苗给药时，无论是在1或10日龄均观察到最低的防护。
序列表(SEQ ID NO:1-43)中：
SEQ ID NO:1对应于H5N1“1709-6”的H5序列，
SEQ ID NO:2对应于H5N1“1553-1/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:3对应于H5N1“1553-15/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:4对应于H5N1“2095-50/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:5对应于H5N1“3982-2/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:6对应于H5N1“3982-5/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:7对应于H5N1“3982-7/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:8对应于H5N1“3982-8/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:9对应于H5N1“3982-9/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:10对应于H5N1“3982-12/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:11对应于H5N1“3982-20/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:12对应于H5N1“3982-44/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:13对应于H5N1“1553-2/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:14对应于H5N1“1553-6/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:15对应于H5N1“1553-13/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:16对应于H5N1“1553-26/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:17对应于H5N1“1553-28/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:18对应于H5N1“2095-39/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:19对应于H5N1“2095-46/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:20对应于H5N1“2095-49/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:21对应于H5N1“2095-65/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:22对应于H5N1“2095-68/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:23对应于H5N1“2095-70/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:24对应于H5N1“2095-73/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:25对应于H5N1“2095-75/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:26对应于H5N1“3982-3/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:27对应于H5N1“3982-4/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:28对应于H5N1“3982-13/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:29对应于H5N1“3982-14/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:30对应于H5N1“3982-19/B3”的H5序列，
SEQ ID NO:31对应于H5N1“3982-21/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:32对应于H5N1“3982-43/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:33对应于H5N1“3982-50/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:34对应于H5N1“3982-52/B1”的H5序列，
SEQ ID NO:35对应于H5N1“3982-55/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:36对应于H5N1“3982-56/A1”的H5序列，
SEQ ID NO:37对应于H5N1“3982-78/B2”的H5序列，
SEQ ID NO:38对应于H5N1“4794-17/B”的H5序列，
SEQ ID NO:39对应于H5N1“4794-18/B”的H5序列，
SEQ ID NO:40对应于由SEQ ID NO:43翻译的H5序列，
SEQ ID NO:41编码H5N1“3982-8/A1”的H5序列(SEQ ID NO:8)，
SEQ ID NO:42编码H5N1“1553-2/B1”的H5序列(SEQ ID NO:13)，和
SEQ ID NO:43对应于对编码SEQ ID NO：2-39的38个H5HA基因序列进行分析后获得的共有序列。
表A：下表是对齐的SEQ ID NOs：2-39所示序列，其中使用氨基酸的单字母代码。
表B：下列展示了SEQ ID NO:55-92，其对应于由N-末端氨基酸D17开始的SEQ ID NO:2-39所示的变体序列，其中所述第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17。
表C：下列展示了SEQ ID NO:93-130，其对应于由N-末端氨基酸D17开始并具有全长C-末端序列的SEQ ID NO:2-39所示的变体序列，其中所述第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17，并且其中全长C-末端序列对应于氨基酸527-568，其中所述氨基酸位置的编号是指SEQ ID NO:40所示序列的氨基酸位置527-568。
表D：展示了序列SEQ ID NO:131，其对应于由N-末端氨基酸D17开始的SEQ ID NO:40所示的变体序列，其中所述第一个N-末端氨基酸位置的编号(D17)是指SEQ ID NO:1所例示序列的氨基酸位置17。
应理解的是表D中提供的序列(SEQ ID NO:131)是由N-末端氨基酸D17开始并具有全长C-末端序列的SEQ ID NO:40所示序列的变体。
Claims (25)
1.流感病毒H5蛋白，其中所述H5蛋白包括：
(a)氨基酸113D、126H、145(-)、156R、160F、167T和181N，其中修饰145(-)是指在H5的第145位氨基酸缺失，或
(b)氨基酸87P、145L、172T、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(c)氨基酸145L、172T、和254V，
并且其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO:1所例示的氨基酸位置；或
(d)其中H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%或特别优选100%同源性的序列。
2.权利要求1所述的流感病毒H5蛋白，其中所述H5蛋白具有
(a)氨基酸87L、113D、126H、145(-)、156R、160F、167T和181N，或
(b)氨基酸87P、113N、126R、145L、160Y、172T、181H、201E、206I、208K、254T、341G和421K，或
(c)氨基酸87L、113N、126R、145L、156G、160Y、172T、181H和254V，和/或其中所述H5蛋白包含多肽，所述多肽包含：
i.SEQ ID NO:2-40的任一氨基酸序列；
ii.与i)所述多肽具有至少85%，优选至少95%，进一步更优选至少96%，进一步更优选至少97%，进一步更优选至少98%，进一步更优选至少99%，最优选100%同源性并在标准血凝素抑制试验中具有血凝素抑制活性的任一多肽；或
iii.包含i)或ii)所述任一多肽的至少334个连续氨基酸的i)或ii)所述多肽的任一部分，并且其中所述任一多肽在标准血凝素抑制试验中具有血凝素抑制活性。
和/或
其中所述H5蛋白包含下述连续氨基酸序列或由其组成：与SEQ IDNO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，进一步更优选至少98%，进一步更优选至少99%，最优选100%同源性的序列。
3.权利要求1或2所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ ID NO:8、13、40所示的任一序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，最优选100%同源性的序列，且特别优选包含SEQ ID NO:13所列的氨基酸序列或由其组成的H5蛋白。
4.权利要求1-3任一项所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白具有氨基酸239N。
5.权利要求1-4任一项所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白不包含流感A H5N1血凝素信号序列。
6.权利要求1-5任一项所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白的序列由N-末端氨基酸D17开始，其中所述D17编号对应于SEQ ID NO:1。
7.权利要求1-6任一项所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与选自SEQ ID NO:55-131所示序列的序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或特别优选100%同源性的序列。
8.权利要求1-7任一项所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白包含全长C-末端序列，其中所述全长C-末端序列优选为序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWNICSMGSLQCRICI(SEQ ID NO:51)
或序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO:52)
或序列
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLrMCSNGSLQCRiCI(SEQ ID NO:53)。
9.权利要求1-8任一项所述的H5蛋白，其中所述H5蛋白包含下述氨基酸序列或由其组成：与选自SEQ ID NO:55-131所示的序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%，或特别优选100%同源性的序列。
10.权利要求1-9任一项所述的H5蛋白，其用于治疗或预防以下感染的方法中
(A)被北非源分支A H5N1病毒感染，即被包含具有权利要求1或2的(a)所述氨基酸的H5蛋白的H5N1病毒感染，或被包含权利要求2或3所涉及的SEQ ID NO:2-12或35或36所列序列中任一者的H5蛋白的H5N1病毒感染，
该方法中给予具有权利要求1或2的(a)所述氨基酸的H5蛋白，或给予具有权利要求2或3所涉及的SEQ ID NO:2-12或35或36所列序列中任一者的H5蛋白，
(B)被北非源分支B H5N1病毒感染，即被包含具有权利要求1或2的(b)或(c)所述氨基酸的H5蛋白的H5N1病毒感染，或被包含权利要求2或3所涉及的SEQ ID NO:13-34或37-39所列序列中任一者的H5蛋白的H5N1病毒感染，
该方法中给予具有权利要求1或2的(b)或(c)所述氨基酸的H5蛋白，或给予具有权利要求2或3所涉及的SEQ ID NO:13-34或37-39所列序列中任一者的H5蛋白，或
(C)被所述北非源分支A H5N1病毒和/或分支B H5N1病毒感染，该方法中给予权利要求1-3任一项所涉及的SEQ ID NO:40所示序列的H5蛋白。
11.核酸分子，其中所述核酸分子编码权利要求1-10任一项的H5蛋白，并且其中所述H5蛋白特别包含下述氨基酸序列或由其组成：与SEQ IDNO:2-40所示的任一序列具有至少95%，优选至少96%，更优选至少97%，且更优选至少98%，且更优选至少99%或特别优选100%同源性的序列，并且其中所述核酸分子优选包含SEQ ID NO:41-43所示的任一序列或由其组成。
12.载体，其包含权利要求11所述的核酸分子。
13.疫苗，其包含：
a.权利要求1-10任一项所述的H5蛋白、权利要求11所述的核酸分子或权利要求12所述的载体；和
b.药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
14.权利要求13所述的疫苗，其中所述赋形剂是一种或多种佐剂，并且其中所述佐剂优选是基于Emulsigen的佐剂，和/或其中所述疫苗包含一种或多种抗原，其中所述另外的抗原优选是禽类病原体抗原或哺乳动物病原体的抗原，特别是流感病毒的H1、H3、H7或H9。
15.一种生产权利要求1-10任一项所述的H5蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.分离或扩增编码所述H5蛋白的核酸；
b.将所述H5编码核酸克隆至表达载体内；和
c.表达所述H5蛋白。
16.权利要求15所述的方法，其中所述表达载体是重组杆状病毒和/或其中所述H5蛋白在昆虫细胞中表达。
17.一种生产包含权利要求1-10任一项所述的H5蛋白的疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.获得权利要求1-10任一项所述的H5蛋白；和
b.将步骤a)的H5蛋白与药学上可接受的载剂和/或赋形剂混合。
18.一种生产包含权利要求11所述的H5核酸或权利要求12所述的载体的疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.获得权利要求11所述的H5核酸分子或权利要求12所述的载体；
b.将步骤a)的H5核酸分子或载体与药学上可接受的载剂和/或赋形剂混合。
19.下述物质用作药物的用途，
a.权利要求1-10任一项所述的H5蛋白，
b.权利要求11所述的核酸分子，
c.权利要求12所述的载体，
d.权利要求13或14所述的疫苗。
20.权利要求1-10任一项所述的H5蛋白在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗由病毒性流感引起的感染，优选由北非源H5N1病毒引起的感染，特别是由包含下述H5蛋白的病毒引起的感染，所述H5蛋白与SEQ ID NO:2-40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选为97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的序列同一性，并且其中优选由包含下述H5蛋白的病毒引起的感染，所述H5蛋白与SEQ ID NO:8、13或40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的序列同一性。
21.权利要求11所述的核酸分子在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗由病毒性流感引起的感染，优选由北非源H5N1病毒引起的感染，特别是由包含下述H5蛋白的病毒引起的感染，所述H5蛋白与SEQ ID NO:2-40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选为97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的序列同一性。
22.权利要求12所述的载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗由病毒性流感引起的感染，优选由北非源H5N1病毒引起的感染，特别是由包含下述H5蛋白的病毒引起的感染，所述H5蛋白与SEQID NO:2-40所列的任一序列具有至少95%，优选96%，更优选97%，且更优选98%，且更优选99%，或者特别优选100%的序列同一性。
23.权利要求20-22任一项所述的用途，其中所述病毒性流感感染由禽流感病毒、猪流感病毒、或人流感病毒、或它们的任何组合或杂交所引起。
24.一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中所述方法包括对需要治疗的受试者给予治疗有效量的权利要求1-10任一项所述的H5蛋白，
或
其中所述方法包括对需要治疗的受试者给予治疗有效量的权利要求11所述的H5核酸或权利要求12所述的载体，
或
其中所述方法包括对需要治疗的受试者给予治疗有效量的权利要求13或14所述的疫苗，
并且其中所述任一方法中所述流感感染特别是由禽流感病毒、猪流感病毒、或人流感病毒、或它们的任何组合或杂交所引起。
25.试剂盒，其包含：
a.权利要求1-10任一项所述的H5蛋白、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述的载体或权利要求13或14所述的疫苗；和
b.包装插页，其指示用a)的H5蛋白、核酸分子、载体或疫苗治疗或预防由流感病毒引起的感染的用途，
并且其中所述试剂盒优选包含至少一种另外的禽类病原体抗原或哺乳动物病原体抗原。
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