CN101553248B

CN101553248B - 新的h5蛋白、其编码核酸、载体及它们的医药用途

Info

Publication number: CN101553248B
Application number: CN2007800401310A
Authority: CN
Inventors: 埃里克·M·沃恩; 保利诺·C·冈萨雷斯-赫尔南德兹; 于尔根·德姆根
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2027-10-26
Also published as: CN101553248A; AR063427A1; CL2007003102A1; UA99117C2; TW200825099A; ZA200902023B; TWI413647B

Abstract

本发明系关于新颖的血凝素H5蛋白、编码所述H5蛋白的核酸及载体，以及包含所述H5蛋白、编码所述H5蛋白的核酸或载体中之任一者的疫苗。此外，本发明亦系关于所述组合物中之任一者用于人类及动物之医药用途。

Description

新的H5蛋白、其编码核酸、载体及它们的医药用途

技术领域

本发明系关于医药领域，优选系关于传染病领域。尤其，本发明系关于流感蛋白；编码所述蛋白质的核酸分子及载体；及疫苗。更尤其，本发明系关于所述蛋白质、核酸分子、载体或疫苗中之任一者用于治疗及预防流感感染，进一步用于预防流感病毒之种内及种间传播的用途。

背景技术

流感感染仍然为动物及人类之重要感染。流感系由经历连续抗原性变异/修饰且占据动物宿主的病毒引起。因此，未来可能发生新的流行病及大流行，且难以实现该疾病之根除。流感病毒是本领域熟知的且详述于(例如)可供进一步参考之P.Palese，Nature Medicine第10卷，第12期，第S82至S86页(2004年12月)中。简而言之，流感A病毒之基因组系由八个单链节段组成，且病毒颗粒在其表面上具有两种主要糖蛋白：血凝素(H)及神经氨酸酶(N)。在流感病毒之间因存在至少16种不同的血凝素(H1至H16)及9种不同的神经氨酸酶(N1至N9)亚型而存在相当多的抗原变异。

已证明流感病毒中的H5N1型禽流感病毒可感染禽类、猪及人类。所述病毒亦可自禽类物种直接传染给人类(Claas等人，Lancet 1998，351：472；Suarez等人，J.Virol.1998，72：6678；Subbarao等人，Science 1998，279：393；Shortridge，Vaccine 1999，17(增刊1)：S26-S29)。已知人类临床病例之死亡率接近约50％。

上一个世纪，猪一直为流感大流行之重要媒介。猪、骆驼及海豹(以猪为优选)可充当禽流感病毒之′混合室′，且因此代表一种越过禽类(流感病毒之天然宿主)至哺乳动物之物种障碍之潜在风险因素。这种跨物种传播常通过易感动物(例如猪)被已知的哺乳动物(猪)流感病毒与禽流感病毒双重感染而发生。此双重感染有可能形成能引起人或猪大流行的新重组病毒。然而，最近有迹象表明，当前禽类H5病毒株与哺乳动物流感病毒之重组不会形成强毒性重组体。另一方面，禽流感病毒可感染猪且藉由自发突变而变得顺应于猪。一旦病毒在猪(或其它哺乳动物)群体内引起横向感染，则将越过关键障碍。

目前大多数东南亚猪已被邻近的家禽饲养场的禽(H5)流感病毒株感染。由于这些感染迄今为止都是亚临床的，因此其仅可藉由实验室方法诊断并因此常常被忽视。这带来以下高风险：这些亚临床感染猪为病毒适应哺乳动物系统、在猪群内传播以及感染人类提供了机会。

当前流感疫苗包括亚单位疫苗(Babai等人，Vaccine 1999，17(9-10)：1223-1238；Crawford等人，Vaccine 1999，17(18)：2265-2274；Johansson等人，Vaccine 1999，17(15-16)：2073-2080)、减毒疫苗(Horimoto等人，Vaccine 2004，22(17-18)：2244-2247)、DNA疫苗(Watabe等人，Vaccine 2001，19(31)：4434-4444)及灭活流感疫苗(Cao等人，Vaccine 1992，10(4)：238-242)，其中灭活流感疫苗以商业规模最广泛使用(Lipatov等人，J Virol 2004，78(17)：8951-8959)。

亚单位疫苗、重组血凝素及神经氨酸酶(Babai等人，Vaccine 1999，17(9-10)：1223-1238；Crawford等人，Vaccine 1999，17(18)：2265-2274；Johansson等人，Vaccine 1999，17(15-16)：2073-2080)有可能成为灭活疫苗的颇受关注的替代物，单目前尚未作为商用疫苗投入使用。这些疫苗制剂显然比灭活疫苗安全。此外，亚单位疫苗并不对流感病毒内部蛋白产生抗体反应，因此使得能够区分接种动物和感染动物(Crawford等人，Vaccine 1999，17(18)：2265-2274)。

血凝素蛋白是流感病毒表面与受体结合并与膜融合的糖蛋白，是中和感染力的抗体的攻击标靶。H5N1的完整血凝素蛋白(HA)系由568个氨基酸组成，分子量为56kDa。HA分子系由HA1及HA2亚单位组成，HA1亚单位介导最初与细胞膜的接触而HA2负责膜融合(Chizmadzhev，Bioelectrochemistry 2004，63(1-2)：129-136)。

杆状病毒/昆虫细胞系统已用于表达从禽流感亚型分离的血凝素基因(Babai等人，Vaccine 1999，17(9-10)：1223-1238；Crawford等人，Vaccine 1999，17(18)：2265-2274；Johansson等人，Vaccine 1999，17(15-16)：2073-2080)；New等人，BMC Mircobiology 2006，6(16)：doi：10.1186/1471-2180-6-16)。然而，这些重组蛋白似乎任何时候都不具有保护性，或者至少对一些物种仅具有较低效力(Treanor等人，Vaccine 2001，19：1732-1737)。

因此，需要提供更多的改良疫苗及疫苗接种新方法，以便为控制流感感染及对疾病负荷(disease load)产生正面影响而提供更好的方法。

发明内容

在本发明之实施例之前，应了解，如本文中及随附申请专利范围中所使用，单数形式″一″及″该″包括复数提及物，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，提及″一种制剂″包括复数种所述制剂；提及该″载剂″系指本领域技术人员已知之一或多种载剂及其均等物，诸如此类。除非另外定义，否则本文中所使用之所有技术及科学术语具有的含义与普通熟习本发明所属技术者通常所了解之含义相同。除非另外指明或本领域技术人员另外得知，否则所有给定范围及值可变化1至5％，因此术语″约″在本说明书中省去。尽管可在本发明之实施或测试中使用与本文所述所述方法及物质相似或相当的任何方法及物质，但优选的方法、装置及物质现加以描述。为描述并揭示可配合本发明使用之如出版物中所报导之物质、赋形剂、载剂及方法之目的，本文中所提及之所有出版物以引用的方式并入本文中。不应认为本文中认可本发明无权优先于先前发明之此类披露内容。

藉由本说明及申请专利范围中之特征性实施例获得上述技术问题之解决方法。

流感蛋白及编码所述蛋白质的核酸分子

本发明涉及流感病毒的H5蛋白，该蛋白具有氨基酸223N及修饰328K+，其中氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。优选地，本发明之该H5蛋白及其它任何H5蛋白为经分离的H5蛋白。已惊人地发现，与在位置223及328/329上不具有相应氨基酸的H5蛋白相比，具有上述修饰的H5蛋白具有更高的抗原性。

本文术语″血凝素5(H5)″或″禽流感病毒之H5″或″H5蛋白″是指(但不限于)任何天然存在的H5蛋白及H5蛋白之任何经修饰形式(包括H5蛋白之任何缺失、取代及/或插入突变体)，其中所述H5蛋白具有氨基酸223N及修饰328K+。

本文所用H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置。SEQ ID NO：1代表病毒株鸭/China/E319-2/03的血凝素的氨基酸序列(但缺少氨基末端信号肽)。换而言之，若提及位置223的氨基酸(氨基酸223)，则是指与SEQ ID NO：1中之氨基酸223对应的氨基酸残基。然而，此并非是指本发明的H5蛋白具有与SEQ ID NO：1一致的氨基酸序列。其仅是指本发明H5蛋白的对应氨基酸编码这里明确提及的氨基酸残基。在此情况下，氨基酸223为丝氨酸(S)。例如，术语″223N″或″155N″分别指，位置223及155(根据SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号)的氨基酸编码天冬酰胺(N)。换而言之，若提及″具有氨基酸223N的H5蛋白″，则表明，在氨基酸位置223(根据SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号)，正常情况下编码丝氨酸的H5氨基酸分子应被天冬酰胺(N)取代。术语″328K+″或″修饰328K+″是指，在H5蛋白之氨基酸位置328(根据SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号)插入第二个赖氨酸(K+)。天然情况下，位置328及329的氨基酸序列编码赖氨酸-赖氨酸，未插入其它赖氨酸(K)。然而，大多数已知H5序列在氨基酸位置328及329编码赖氨酸-精氨酸。在上述任一种情况下，术语328K+修饰是指，应将第二个赖氨酸(K)插入位置328的赖氨酸与位置329的精氨酸之间。于是，修饰后的序列应读成赖氨酸-赖氨酸-精氨酸(KKR)。

因此，本发明系关于H5蛋白及H5蛋白之任何经修饰形式(包括H5蛋白之任何缺失、取代及/或插入突变体)，其中所述H5蛋白具有氨基酸223N及修饰328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。不言而喻，如本文中所提供之任一种H5蛋白具有抗原性，此是指其在对流感病毒之标准血凝素抑制试验中展示抗原特性。

根据另一实施例，本发明亦系关于H5蛋白之任何部分，此部分是指在标准血凝素抑制试验中展示抗原特性、且至少具有氨基酸223N及修饰328K+的任何肽片段，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。

若H5蛋白在标准血凝素抑制试验(例如，如实例2中所述)中抑制凝血，则其展示抗原特性。H5蛋白的该抗原部分通常包含编码H5蛋白的氨基酸序列中的200、180、160、150、140、130、120、110或最优选105个毗邻氨基酸，所述H5蛋白是指上述经过修饰或未经修饰、在实例2所述标准血凝素抑制试验中展示抗原特性的蛋白。标准血凝素抑制试验例如亦描述于可供进一步参考之Stephenson等人，Virus Research，第103卷，第91-95页(2004)中。然而，实施例2所述HI试验应被理解为与本文所述本发明所有方面有关的参考试验：

简而言之，进行HI试验以检测HA特异性抗体之存在。异源H5N2病毒(A/鸡/Mexico/232/94)以四个血凝单位[4 HA单位]之浓度用于HI试验中。随后在U形底微量滴定板中，将PBS中之连续两倍稀释血清液与等体积(25μL)(含有4 HA单位)之病毒混合，且在室温(约25℃)培育30分钟。将PBS中之浓度为0.5％之鸡红细胞添加至含有血清-病毒之孔中且在室温下培育40分钟。以观测到血凝抑制的最高血清稀释度之倒数确定HI效价。

值得注意的是，Haesebrouck及Pensaert(1986)发现″针对攻击病毒之HI效价与防御攻击之保护之间可能存在关联″。Haesebrouck及Pensaert(1986)亦测定，HI效价＞40的猪″完全抵抗攻击且在受攻击下呼吸道中不发生病毒复制″。因此，在经疫苗接种之猪中形成＞40之HI效价将与保护作用有关。(F.Haesebrouck及M.B.Pensaert，1986)。预先用灭活流感H1N1疫苗免疫之肥育猪之气管内攻击的效应(Veterinary Microbiology，11(1986)239-249)。须假设等值或至少差不多等值的H5 HI效价亦将对猪产生防御禽流感病毒的完全免疫保护。较低效价至少引起经接种之动物之血清转化且产生对所述动物之部分免疫保护，此亦可大大降低大流行之风险。

此外，本发明的H5蛋白的抗原部分包括(但不限于)H5蛋白之缺失突变体，其包含：

i.围绕且包括氨基酸223N之氨基酸序列中之至少35、30、25、20、18、15、13、10、9个或最优选8个毗邻氨基酸；及

ii.围绕且包括氨基酸修饰328K+之氨基酸序列中之至少35、30、25、20、18、15、13、10、9个或最优选8个毗邻氨基酸；且

iii.其中H5蛋白之该抗原部分中之任一者可在实施例2所述标准血凝素抑制试验中展示血凝素抑制。

优选地，围绕氨基酸223N及/或328K+之所述氨基酸系由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4编码。

此外，本发明之优选H5蛋白为：

i.上述任一种具有氨基酸223N及修饰328K+的所述H5蛋白；

ii.上述任一种具有氨基酸94N/223N及修饰328K+的所述H5蛋白；

iii.具有氨基酸223N及修饰328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，该分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

iv.具有氨基酸94N/223N及修饰328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，该分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

v.具有氨基酸155N/223N及修饰328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，该分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

vi.具有氨基酸120N/155N/223N及修饰328K+的任何禽源H5蛋白，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，该分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

vii.具有修饰94N/223N及修饰328K+的任何H5蛋白；或

viii.具有修饰94N/155N/223N及修饰328K+的任何H5蛋白；或；

ix.具有修饰94N/120N/155N/223N及修饰328K+的任何H5蛋白；或

x.具有修饰223N、修饰328K+及选自以下氨基酸簇(amino acid clusters)中之一或多者的任何H5蛋白：

a.aa 93-95： GNF

b.aa 123-125：SDH

c.aa 128-130：SSG

d.aa 138-140：GSS

e.aa 226-228：MDF

f.aa 270-272：EVE

g.aa 309-311：NKL；或

xi.具有氨基酸223N及修饰328K+及选自以下氨基酸簇中之一或多者的任何H5蛋白：

a.aa 93-95： GNF

b.aa 128-130：SSG

c.aa 138-140：GSS；或

xii.具有SEQ ID NO：4之氨基酸序列的任何H5蛋白。

此外，如本文中所提供之优选H5蛋白包括以下文献所述的H5蛋白：Hoffmann等人，PNAS，第106卷，第36期，第12915-12920页(2005年9月6日)，其中所述H5蛋白包括如上所述之修饰中之一或多者，至少包括氨基酸223N及修饰328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ IDNO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。该参考文献之揭示内容将以引用方式全文并入本文中。

此外，如本文中所提供之优选H5蛋白包括包含含有氨基酸223N及修饰328K+之肽的H5蛋白，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)，及：

i.SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6之氨基酸序列；或

ii.具有与i)之多肽至少85％序列同源性、更优选至少约90％序列同源性、甚至更优选至少约95％序列同源性、甚至更优选至少约97％序列同源性、甚至更优选至少约98％序列同源性且甚至更优选至少约99％序列同源性并在如上所述之标准血凝素抑制试验中展示血凝素抑制的任何肽；或

iii.i)或ii)之多肽之任何抗原部分，其包含i)或ii)之肽中之任一者的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9或最优选8个毗邻氨基酸。

iv.i)、ii)或iii)之任何肽，其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、223N、223N或120N/155N。

v.i)、ii)、iii)或iv)之任何肽，其具有选自以下氨基酸簇中之一或多者：

a.aa 93-95： GNF

b.aa 123-125：SDH

c.aa 128-130：SSG

d.aa 138-140：GSS

e.aa 226-228：MDF

f.aa 270-272：EVE

g.aa 309-311：NKL；或

vi.i)、ii)、iii)或iv)之任何肽，其具有选自以下氨基酸簇中之一或多者：

a.aa 93-95：GNF

b.aa 128-130：SSG

c.aa 138-140：GSS。

本文所用之″序列同源性″系指测定两个序列之相关性的方法。为测定序列同源性，将两个或两个以上的序列优化对齐，且必要时引入空位(gap)。与序列一致性形成对比，在测定序列同源性时，保守性氨基酸取代视为匹配。换而言之，为获得具有与参考序列之95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中85％、优选90％、甚至更优选95％之氨基酸残基或核苷酸必须与其它氨基酸或核苷酸匹配或包含其它氨基酸或核苷酸之保守性取代，或者可将参考序列中全部氨基酸残基或核苷酸(不包括保守性取代)之至多15％、优选至多10％、甚至更优选至多5％量的氨基酸或核苷酸插入参考序列中。优选地，同源序列包含至少一段50个核苷酸、甚至更优选100个核苷酸、甚至更优选250个核苷酸、甚至更优选500个核苷酸。此对齐后，逐位确定序列同源性，例如，若核苷酸或氨基酸残基在特定位置处一致，则序列在彼位置上″同源″。接着将所述位置一致之总数除以参考序列中核苷酸或氨基酸残基之总数以得到序列同源性％。序列同源性可容易地藉由已知方法计算，所述方法包括(但不限于)以下文献中所述之所述方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.N.编，Oxford University Press，NewYork(1988)，Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.，及Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.及Devereux，J.编，M.StocktonPress，New York(1991)；及Carillo，H.及Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，所述文献之教示内容以引用方式并入本文中。设计序列同源性之优选测定方法以使所测试之序列之间达成最大匹配。序列同源性测定方法可编程为可公开获得之测定指定序列之间的序列一致性的计算机程序。所述程序之实例包括(但不限于)GCG程序套件(Devereux，J.等人，NucleicAcids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990))。BLASTX程序可公开获自NCBI及其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda，MD20894，Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，所述文献之教示内容以引用方式并入本文中)。所述程序利用预设空位权重使序列最优选对齐，以使指定序列与参考序列之间达成最高水平的序列同源性。

此外，优选的H5蛋白包括包含如上所述之328K+修饰及表1中所提供之氨基酸序列的H5蛋白或其任何免疫原部分：

表1：H5抗原

#表1中所指氨基酸位置系指SEQ ID NO：1中所例示之位置。换而言之，表1中氨基酸223系指SEQ ID NO：1序列中氨基酸223。

-是指此位置的氨基酸与参考序列相比有不同。

此外，本发明亦系关于至少具有氨基酸223N及修饰328K+的H5蛋白，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)，且包含：

i.具有以下NCBI登录号之序列的肽：AAT65209、CAJ32556、ABC47656、CAF21874、CAF21870、AAC58998、AAC58997、AAC58996、AAC58994、AAC58993、AAC58992、AAC58991、AAC58990、AAC58995、AAS45134、AAN17270、AAN17269、AAN17268、AAN17267、AAN17266、AAN17265、AAN17264、AAN17263、AAN17262、AAN17261、AAN17260、AAN17259、AAN17257、AAN17256、AAN17255、AAN17254、AAA43083、AAA43082、AAB19079、BAE48696、BAE48693、BAE48696、BAE48695、BAE48694、BAE48692、BAE48691、BAE48690、BAE48689、BAE48688、BAE48687、BAE48686、BAE48685、BAE48684、BAE48683、AAC58999、ABC72082、AAV91149、AAP71993、AAP71992、AAP71991、AAP71990、AAP71989、AAP72011、AAP72010、AAP72009、AAP72008、AAP72007、AAP72006、AAP72005、AAP72004、AAP72003、AAP72002、AAP72001、AAP72000、AAP71999、AAP71998、AAP71997、AAP71996、AAP71995、AAP71994、AAF99718、ABF58847、AAG38534、AAC32102、AAC32099、AAL75847、AAC32101、AAC32098、AAC32088、AAC32078、AAR99628、AAC32100、AAM49555、AAL75843、AAL75839、AAD13573、AAD13568、AAF04720、AAF04719、AAC34263、AAR16155、AAD13574、AAD13570、AAD13575、AAD13572、AAD13569、AAD13567、AAD13566、AAK57506、AAG01225、AAG01215、AAG01205、AAG01195或ABD83813，它们如上述修饰，此是指这些序列包括上述223N及328K+修饰，这些修饰并不是野生型序列的组成部分；或

ii.具有与i)之多肽之至少85％序列同源性、更优选至少约90％序列同源性、甚至更优选至少约95％序列同源性、甚至更优选至少约97％序列同源性、甚至更优选至少约98％序列同源性且甚至更优选至少约99％序列同源性且在如上所述之标准血凝素抑制试验中展示血凝素抑制的任何肽；

iii.i)或ii)之肽中之任一者，其具有氨基酸36T、36K、83A、83T、83D、86A、86V、120N、120S、155N、155S、156A、156T、189R、189K、212K、212R、212E、263A、263T或120N/155N；或

iv.i)、ii)或iii)之所述肽中之任一者，其具有选自以下氨基酸簇中之一或多者：

a.aa 93-95： GNF

b.aa 123-125：SDH

c.aa 128-130：SSG

d.aa 138-140：GSS

e.aa 226-228：MDF

f.aa 270-272：EVE

g.aa 309-311：NKL；或

a.aa 93-95： GNF

b.aa 128-130：SSG

c.aa 138-140：GSS。

根据另一实施例，本发明亦系关于编码上述H5蛋白中之任一者的核酸分子。优选地，所述核酸分子为RNA、DNA或拷贝(c)DNA分子。因此，本发明系关于核酸分子，优选编码H5蛋白及H5蛋白之任何修饰形式(包括H5蛋白之任何缺失、取代及/或插入突变体)的cDNA分子，其中所述H5蛋白具有氨基酸223N及修饰328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。

根据另一实施例，本发明亦系关于核酸分子，优选编码H5蛋白之任何部分的cDNA分子，其是指编码在上述标准血凝素抑制试验中展示抗原特性且至少具有氨基酸223N及修饰328K+之任何肽片段的cDNA分子，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。通常，编码H5蛋白的抗原部分的所述核酸分子包含编码上述经修饰或未经修饰且在如本文所述之标准血凝素抑制试验中展示抗原特性的H5蛋白的核苷酸序列中之600、540、480、450、420、390、360、330或最优选315个毗邻核苷酸。

H5蛋白的抗原部分之其它实施例在上文中加以描述。构建任何所述核酸分子(优选编码上述H5蛋白的抗原部分的cDNA分子)已为本领域技术人员所共知。此亦包括(但不限于)构建编码上述H5蛋白的抗原部分(包括H5蛋白之缺失突变体)的核酸分子(优选cDNA分子)，其包含：

i.围绕且包括编码氨基酸223N之编码序列的核苷酸序列中之至少105、90、75、60、48、45、39、30、27或最优选24个毗邻核苷酸；及

ii.围绕且包括编码修饰328K+之编码序列的核苷酸序列中之至少105、90、75、60、48、45、39、30、27或最优选24个毗邻核苷酸；且

iii.其中H5蛋白之该抗原部分中之任一者在实施例2所述标准血凝素抑制试验中展示血凝素抑制。

优选地，围绕编码氨基酸223N及/或328K+之核苷酸的所述核苷酸编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4。

此外，本发明之编码H5蛋白之优选核酸分子为：

i.上述编码氨基酸223N及修饰328K+的所述核酸分子中之任一者；

ii.上述编码氨基酸94N/223N及修饰328K+的所述核酸分子中之任一者；

iii.编码氨基酸223N及修饰328K+的任何禽源核酸分子，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，所述分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

iv.编码氨基酸94N/223N及修饰328K+的任何禽源核酸分子，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，所述分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

v.编码氨基酸155N/223N及修饰328K+的任何禽源核酸分子，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，所述分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

vi.编码具有氨基酸120N/155N/223N及修饰328K+之禽源H5蛋白的任何核酸分子，其中禽源是指H5序列来源于一种病毒分离株，所述分离株最初是从感染5型禽流感病毒的禽类分离的；或

vii.编码具有修饰94N/223N及修饰328K+的H5蛋白的任何核酸分子；或

viii.编码具有修饰94N/155N/223N及修饰328K+的H5蛋白的任何核酸分子；或

ix.编码具有修饰94N/120N/155N/223N及修饰328K+的H5蛋白的任何核酸分子；或

x.编码具有修饰223N、修饰328K+及选自以下氨基酸簇中之一或多者的H5蛋白的任何核酸分子：

a.aa 93-95： GNF

b.aa 123-125：SDH

c.aa 128-130：SSG

d.aa 138-140：GSS

e.aa 226-228：MDF

f.aa 270-272：EVE

g.aa 309-311：NKL；或

xi.编码具有氨基酸223N、修饰328K+及选自以下氨基酸簇中之一或多者的H5蛋白的任何核酸分子：

a.aa 93-95： GNF

b.aa 128-130：SSG

c.aa 138-140：GSS；或

xii.编码具有SEQ ID NO：4之氨基酸序列的H5蛋白的任何核酸分子。

此外，如本文中所提供之优选H5蛋白包括以下文献所述的H5蛋白：Hoffmann等人，PNAS，第106卷，第36期，第12915-12920页(2005年9月6日)，其中所述H5蛋白包括如上所述之修饰中之一或多者，至少包括氨基酸223N及修饰328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ IDNO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。此参考文献之揭示内容将以引用方式全文并入本文中。因此，根据另一实施例，本发明亦系关于任何核酸分子，优选编码以下文献所述之所述蛋白质中之任一者的cDNA分子：Hoffmann等人，PNAS，第106卷，第36期，第12915-12920页(2005年9月6日)，其中所述H5蛋白包括上述修饰中之一或多者，至少包括氨基酸223N及修饰328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQ ID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)。

将上述任何修饰引入核苷酸序列(包括流感病毒的H5蛋白之编码序列)内的方法是本领域熟知的。完整流感病毒之基因组序列可根据本发明加以修饰，例如根据可供进一步参考之US 6,951,754中所述的方法加以修饰。

此外，可利用此项技术技能范围内之传统分子生物学、微生物学及重组DNA技术修饰编码本文中所述的抗原的核酸序列。所述技术已详释于文献中。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；DNA Cloning：A Practical Approach，第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Transltion[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人编，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.1994)。

根据另一实施例，本发明亦系关于包含上述核酸分子中之任一者的载体。换而言之，本发明系关于包括上述任何该H5蛋白或其部分之编码序列的载体。优选地，该载体为使上述任何该H5蛋白或其部分得到表达的表达载体。本发明的载体为适于在活体外或活体内转染或感染细菌、酵母或动物细胞的所述载体。

载体及用于制备及/或使用表达载体(或重组体)的方法可依据或类似于以下文献中所揭示之与DNA表达载体相关的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号；PCT出版物WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti，″Applications of pox virus vectors tovaccination：An update，″PNAS USA 93：11349-11353，1996年10月；Moss，″Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety，″PNAS USA 93：11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编者)，Methods in Molecular Biology 39，″Baculovirus Expression Protocols″(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，″Production ofHuman Beta Interferon in InsectCells Infected with a Baculovirus Expression Vector″.Molecular and CellularBiology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，″Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in InfectCells with a Baculovirus vector，″Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第399-406页；EPA0 370 573；美国申请案第920,197号(1986年10月16日申请)；EP专利出版物第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman，″The function of herpes simplex virus genes：Aprimer for genetic engineering of novel vectors，″PNAS USA 93：11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，″The application of genetically engineeredherpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors，″PNASUSA 93：11313-11318，1996年10月；Robertson等人，″Epstein-Barr virusvectors for gene delivery to B lymphocytes″，PNAS USA 93：11334-11340，1996年10月；Frolov等人，″Alphavirus-based expression vectors：Strategies andapplications，″PNAS USA 93：11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号、WO 98/00166；已受理之美国申请案第08/675,556号、第08/675,566号(两者均于1996年7月3日申请)(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，″Adenovirus as cloningvectors，″Seminars in Virology(第3卷)，第237-52页，1993；Ballay等人，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页；Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70，42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人，(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259：1745-49，1993及McClements等人，″Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B，alone or in combination，induces protective immunity in animal models of herpessimplex virus-2 disease″，PNAS USA 93：11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号；以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature；及Furth等人，Analytical Biochemistry等。亦可参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia，41：736-739，1998(豆状病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)，WO 90/01543；Robinson等人，seminars in Immunology第9卷，第271-283页(1997)(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第号(将DNA插入活细胞内的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病病毒之使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因传递的载体)以及本文中所引用之其它文件。

病毒载体及DNA载体(DNA质粒)都可以有利地用于实施本发明，所述病毒载体例如选自猪疱疹病毒(诸如Aujeszky氏疾病病毒)、猪腺病毒、和痘病毒(尤其牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒及猪痘病毒)。

本发明H5蛋白的制备方法

根据另一方面，本发明提供制备及/或回收高产量重组H5蛋白的方法：i)用含有H5 DNA编码序列的重组病毒载体感染培养中的易感细胞，其中所述重组病毒载体表达H5蛋白；及ii)尔后自细胞培养物中回收H5蛋白。H5蛋白之高产量是指(但不限于)约20μg/ml细胞培养物以上、优选约25μg/ml以上、甚至更优选约30μg/ml以上、甚至更优选约40μg/ml以上、甚至更优选约50μg/ml以上、甚至更优选约60μg/ml以上、甚至更优选约80μg/ml以上、甚至更优选约100μg/ml以上、甚至更优选约150μg/ml以上、最优选约190μg/ml以上。

根据一优选实施例，藉由收获表达H5蛋白之全(亦即完整)SF+细胞来回收H5蛋白。

优选细胞为所述易受含有H5 DNA并表达H5蛋白的适当重组病毒载体感染之细胞。优选地，所述细胞为昆虫细胞，且更优选地，其包括以商标SF+昆虫细胞(Protein Sciences Corporation，Meriden，CT)出售的昆虫细胞。优选的细胞培养物的细胞数约0.3-2.0×10⁶个细胞/ml，更优选约0.3-1.9×10⁶个细胞/ml、甚至更优选约0.4-1.8×10⁶个细胞/ml、甚至更优选约0.45-1.7×10⁶个细胞/ml，最优选约0.5-1.5×10⁶个细胞/ml。

优选病毒载体包括杆状病毒，诸如BaculoGold(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)，尤其是在制备细胞为昆虫细胞的情况下。尽管杆状病毒表达系统为优选的，但本领域技术人员应了解，其它表达系统可用于本发明之目的，亦即用于使H5表达至细胞培养物之上清液中。所述其它表达系统可能需要使用信号序列以使H5表达至培养基中。

适当生长培养基亦可由本领域技术人员确定，优选生长培养基为无血清昆虫细胞培养基，诸如Excell 420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa，KS)及类似培养基。

当用于感染易感细胞时，含有H5 DNA序列的重组病毒载体优选感染复数(MOI)约0.03-1.5、更优选约0.05-1.3、甚至更优选约0.09-1.1，最优选约0.1-1.0。优选地，上述MOI是针对1mL细胞培养液而言。优选地，本文中所述方法包含：用MOI(感染复数)约0.03-1.5、更优选约0.05-1.3、甚至更优选约0.09-1.1、最优选约0.1-1.0的含H5 DNA并表达H5蛋白的重组病毒载体感染0.35-1.9×10⁶个细胞/ml、甚至更优选约0.4-1.8×10⁶个细胞/ml、甚至更优选约0.45-1.7×10⁶个细胞/ml且最优选约0.5-1.5×10⁶个细胞/ml。

接着将受感染细胞培育至多10天、更优选约2-10天、甚至更优选约4-9天，最优选约5-8天。优选的培育条件包括温度约22-32℃、更优选约24-30℃、甚至更优选约25-29℃、甚至更优选约26-28℃，最优选约27℃。优选地，接种之后观测到SF+细胞具有被杆状病毒诱导的特征性变异。此种观测包括感染后监测细胞密度变化及存活力降低。已发现，感染后3-5天观测到峰值病毒效价，且细胞中的H5蛋白表达在第5天与第8天之间且/或在细胞存活力降至小于10％时达到峰值。

因此，本发明一方面提供制备及/或回收重组H5蛋白(优选为上述量)的方法：i)用具有上述MOI的重组病毒载体感染培养中的大量易感细胞(见上文)；ii)由重组病毒载体表达H5蛋白；及iii)尔后收集感染后5-8天的细胞，且/或收集细胞存活力降至小于10％之时的细胞，从中回收H5蛋白。优选地，重组病毒载体为含有H5 DNA编码序列的重组杆状病毒且所述细胞为SF+细胞。此外，优选定期检查培养物受污染之宏观及微观迹象或感染后细胞形态之异常变化。任何呈现任何污染的培养物应弃去。

为回收在免疫原性或免疫组合物(诸如疫苗)中使用的H5蛋白，优选包括灭活步骤以便将病毒载体灭活。

″免疫原性或免疫组合物″系指包含至少一种抗原的物质组合物，该抗原可在宿主体内引发对目标组合物或疫苗的免疫反应，是细胞性免疫反应及/或抗体介导之免疫反应。通常，″免疫反应″包括(但不限于)以下效应中之一或多者：产生或活化特异性针对包含于目标组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞及/或细胞毒性T细胞及/或γ-δT细胞。优选地，宿主可呈现治疗性或保护性免疫反应，以便增强对新感染之抵抗力及/或降低疾病之临床严重程度。此保护作用表现为受感染宿主通常所呈现之症状减少或消失、恢复时间加快及/或受感染宿主之病毒效价降低。

因此，本发明亦系关于制备及/或回收重组H5蛋白(优选为上述量)的方法：i)用具有上述MOI的重组病毒载体感染培养中的大量易感细胞(见上文)；ii)由重组病毒载体表达H5蛋白；及iii)尔后收集感染后5-8天的细胞，且/或收集细胞存活力降至小于10％之时的细胞，从中回收H5蛋白；及iv)将重组病毒载体灭活。

优选地，此灭活系在即将进行过滤步骤之前进行或在过滤步骤刚结束之后进行，过滤步骤之后为优选灭活时间。任何传统灭活方法可用于本发明之目的。因此，灭活可藉由化学及/或物理处理来进行。在优选形式中，测定所收获流体之体积且使温度介于约32-42℃之间、更优选介于约34-40℃之间且最优选介于约35-39℃之间。优选灭活方法包括添加环化二乙烯亚胺(binary ethylenimine，BEI)，此物质浓度优选为约1mM至约20mM、优选为约2mM至约10mM、甚至更优选为约2mM至约8mM、甚至更优选为约3mM至约7mM、最优选为约5mM。举例而言，灭活包括将优选为约0.4M之2-溴伸乙基胺氢溴化物溶液(其已在0.3N NaOH中环化为0.2M二乙烯亚胺BEI)添加至流体中以得到最终浓度约5mM之BEI。优选地，接着将流体连续搅拌72-96小时，且可将经灭活之收获流体在-40℃或-40℃以下冷冻储存或在约1-7℃之间储存。灭活完成后，添加硫代硫酸钠溶液(优选为1.0M)以中和任何残余BEI。优选地，硫代硫酸钠的添加量与灭活之前所添加之BEI的量相当。举例而言，在添加BEI至最终浓度为5mM之情况下，添加1.0M硫代硫酸钠溶液以得到最终最小浓度5mM以中和任何残余BEI。

因此，本发明之另一方面系关于一种如下制备重组H5蛋白(优选为上述量)的方法：i)用具有上述MOI的重组病毒载体感染培养中的大量易感细胞(见上文)；ii)由重组病毒载体表达H5蛋白；及iii)尔后收集感染后5-8天的细胞，且/或收集细胞存活力降至小于10％之时的细胞，从中回收H5蛋白；及iv)将重组病毒载体灭活。优选地，重组病毒载体为含有H5DNA编码序列的杆状病毒且所述细胞为SF+细胞。优选灭活步骤为上述步骤。优选地，灭活系在约35-39℃且在2mM至8mM BEI存在下、甚至更优选在约5mM BEI存在下进行。

根据本发明之另一方面，上述方法亦包括步骤iv)之后的中和步骤。此步骤v)包含添加中和溶液中之灭活剂的等量试剂。优选地，若灭活剂为BEI，则优选添加等量之硫代硫酸钠。因此，根据另一方面，当灭活剂为BEI时，步骤v)包含添加硫代硫酸钠溶液直至最终浓度为约1mM至约20mM、优选约2mM至约10mM、甚至更优选约2mM至约8mM、甚至更优选约3mM至约7mM、最优选约5mM。

在优选形式中且尤其在以免疫原性组合物(诸如疫苗)使用重组H5蛋白之形式中，每一批所收获的H5蛋白通过在具有贴壁依赖性、且易被杆状病毒感染的昆虫细胞(诸如Sf9细胞)中传代来测试灭活。在此测试之一优选形式中，将150cm²之适当细胞培养单层用1.0mL经灭活之H5流体接种且在25-29℃下维持14天，期间至少传代两次。在维持期结束时，对细胞单层检查H5杆状病毒所特有之致细胞病变作用(CPE)。优选地，亦使用阳性病毒对照。此等对照可由以下各物组成：一份经未灭活之参考H5杆状病毒接种之Sf9细胞培养物及一瓶尚未接种之Sf9细胞。培育及传代之后，经BEI处理之病毒流体中不存在受病毒感染之细胞说明灭活测试令人满意。经参考病毒接种之对照细胞应呈现H5杆状病毒所特有之CPE而未接种烧瓶应不呈现任何H5杆状病毒CPE迹象。或者，在维持期结束时，可收集上清液样本且将其接种于Sf9 96孔板上，该孔板已装载Sf9细胞，接着在25-29℃下维持5-6天。接着将孔固定，用偶联FITC的抗-H5抗体或抗杆状病毒特异性蛋白(亦即gp64)的任何标记抗体染色。经BEI处理之病毒流体中不存在CPE、H5表达或杆状病毒特异性蛋白(亦即gp64)之表达说明灭活测试令人满意。经参考病毒接种之对照细胞应呈现CPE及IFA活性，而未接种烧瓶应不呈现任何H5杆状病毒CPE迹象且不含IFA活性。

因此，本文所述另一方面系关于用于测定表达H5蛋白之重组病毒载体之灭活有效性的灭活测试，其包含以下步骤：i)使含有重组病毒载体之培养流体之至少一部分与优选如上所述之灭活剂接触；ii)添加优选如上所述之中和剂以中和灭活剂；及iii)藉由如上所述之试验测定残余感染性。

灭活之后，可以多种方式测定样本中重组H5蛋白之相对量。优选量化方法包括SDS-PAGE密度测定法、ELISA及动物接种研究，其使已知疫苗量与临床结果(血清学等)相关。当利用SDS-PAGE量化时，将含有未知量之重组H5蛋白的样本物质连同含有各种已知量之重组H5蛋白的样本一起在凝胶上展开。接着可基于已知样本形成标准曲线，且可藉由与此标准曲线比较来测定未知样本中重组H5之量。由于ELISA通常公认为抗原量化之行业标准，因此优选利用ELISA进行量化。

包含H5蛋白或编码所述蛋白质的核酸分子或载体的疫苗

根据另一方面，本发明系关于通常包含以下物质的疫苗或药物组合物：

i.一或多种本文所述H5蛋白；

ii.一或多种如本文所述之编码任何所述H5蛋白的核酸分子；及/或

iii.一或多种本文所述载体，其包含如本文所述之任一种所述核酸分子且编码如本文所述之任何所述H5蛋白；及

iv.可药用载剂及/或赋形剂。

如本文所述之术语″药物组合物″、″药物/疫苗组合物″包括(但不限于)用于减少或预防感染的疫苗或用于治疗及减轻感染的物质组合物。

编码流感血凝素的基于核酸的疫苗(优选cDNA疫苗)的制备例如描述于以下参考文献中：Deck等人，Vaccine 1997；15(1)：71-78；Ulmer等人，Science 1993；259：1745-1749；Ulmer等人，Vaccine 1994；12(16)：1541-1544。任何所述方法可用于制备编码如本文所述之流感H5蛋白的基于核酸的疫苗，优选cDNA疫苗。

此外，包含本文所述H5蛋白或其部分的疫苗可藉由传统方法制备，例如藉由重组表达技术或藉由生物化学纯化及分离技术制备。重组表达技术(包括在昆虫细胞中表达)是本领域熟知的且例如描述于以下参考文献中：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；DNA Cloning：APractical Approach，第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编(1986)]；ImmobilizedCells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.1994)。成熟的重组表达系统的其它实例有，细菌表达系统如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；基于酵母之表达系统如酿酒酵母(S.cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或哺乳动物细胞表达系统如基于BHK、CHO及/或NS0的表达系统。所述系统是本领域熟知的且一般可(例如)经由Clontech Laboratories，Inc.4030Fabian Way，Palo Alto，California 943 03-4607，USA购得。其它表达策略例如描述于Lüschow等人，Vaccine第19期(2001)，第4249-4259页或Veit等人，PNAS第103卷(2006)，第8197-8202页中。此外，重组腺伴随病毒系统为成熟系统且描述于例如可供进一步参考之US 5,436,146或WO200203872中。此外，基于牛痘(痘)病毒之表达系统(例如，如可供进一步参考之US6,265,183中所述)亦为成熟系统且适于制备本发明用的重组抗原、抗原组合物。其它适当表达系统利用重组的乳多空病毒(如SV40)、禽痘病毒、假型狂犬病病毒及逆转录病毒。

本文所述相关药物/疫苗组合物亦可包含：含有本文所述H5蛋白的灭活病毒，含有本文所述H5蛋白的活病毒的非致病形式、含有本文所述H5蛋白的病毒制剂及/或病毒片段。

本领域技术人员已知可以与抗原一起包含于所述组合物/疫苗中的其它组分(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.(1990)，第18版，MackPubl.，Easton)。本领域技术人员可使用已知的生理学上可接受之无菌可注射溶液。需要制备即用溶液(a ready-to-use solution)时，可以很容易地获得盐水或相应血浆蛋白溶液之类的等渗水溶液。药物组合物/疫苗可以是冻干制剂或干燥制剂，如组配试剂盒的形式，它们可在无菌条件下于临用前用已知的注射液重建。

此外，本发明之药物/疫苗组合物可包括一或多种兽医学上可接受之载剂。本文中，″兽医学上可接受之载剂″包括(但不限于)任何及所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂及类似载剂。

稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油及类似物。等渗剂尤其可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。

本文所用之防腐剂系指抗微生物活性剂，诸如庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)及类似物。具体地，制备一种多剂量组合物最优选添加防腐剂。所述抗微生物活性剂的浓度足以有效防止目标组合物受任何微生物污染或抑制目标组合物内任何微生物生长。

本文所用之″佐剂″可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂苷(例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。

乳液尤其可基于轻质液状石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油，诸如角鲨烷或角鲨烯；烯烃(尤其异丁烯或癸烯)之寡聚反应所产生之油；含有直链烷基之酸或醇之酯，尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇之酯，尤其异硬脂酸酯。油可与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，尤其脱水山梨糖醇酯、二缩甘露糖醇酯(例如脱水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羟基硬脂酸酯(其视情况经乙氧基化)；及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and PracticalApplication of Adjuvants(Stewart-Tull编，D.E.S.).John Wiley and Sons，NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15：564-570(1997)。适当水包油型乳液之实例为基于Emulsigen的佐剂，诸如

EMULSIGEN-

EMULSIGEN-

EMULSIGEN-(MVP Laboratories，Inc.Omaha，NE，USA)。意外发现，包含H5蛋白、优选本文所述重组H5蛋白的药物/疫苗组合物可以被水包油型乳液，优选为所述基于Emulsigen的佐剂，更优选

及EMULSIGEN-有效辅佐。

此外，可使用M.Powell及M.Newman所编之″Vaccine Design，TheSubunit and Adjuvant Approach″第147页所述之SPT乳液及该书第183页所述之乳液MF59。

佐剂之另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及顺丁烯二酸酐与链烯基衍生物之共聚物的化合物。有益的佐剂化合物为丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，尤其与糖或多元醇的聚乙烯基醚形成的交联物。所述化合物称为卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基、优选不超过8个羟基之多羟基化合物交联的所述丙烯酸聚合物，至少三个羟基中之氢原子可置换为具有至少2个碳原子的不饱合脂族基。优选基团为含有2至4个碳原子的所述基团，例如乙烯基、烯丙基及其它烯键式不饱合基团。不饱合基团本身可含有其它取代基，诸如甲基。以商品名Carbopol(BF Goodrich，Ohio，USA)销售的产品尤其适用。其与烯丙基蔗糖或烯丙基异戊四醇交联。其中可提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选为使用Carbopol 971P。在顺丁烯二酸酐与烯基衍生物之共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)为顺丁烯二酸酐与乙烯之共聚物。所述聚合物溶解于水中可产生酸溶液，使该酸溶液中和，优选中和至生理pH值，以便得到佐剂溶液，再向其中加入免疫原性、免疫性或疫苗性组合物。

其它适当佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质胺佐剂、大肠杆菌热不稳定性肠毒素(重组体或其它形式)、霍乱毒素或胞壁酰二肽。

优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg之量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg之量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约500μg至约5mg之量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约750μg至约2.5mg之量添加。最优选地，佐剂以每剂量约1mg之量添加。

药物/疫苗组合物可进一步包括一或多种其它免疫调节剂，诸如白介素、干扰素或其它细胞因子。药物/疫苗组合物亦可包括庆大霉素及硫柳汞。尽管适用于本发明之上下文中的佐剂及添加剂之量及浓度可易于由本领域技术人员确定，但本发明的组合物可以是，在1ml剂量的疫苗组合物中包含约50μg至约2000μg佐剂且优选约250μg佐剂。在另一优选实施例中，本发明涵盖包含约1μg/ml至约60μg/ml抗生素且更优选小于约30μg/ml抗生素的疫苗组合物。

因此，根据另一实施例，本发明亦系关于药物/疫苗组合物，其包含：

i.治疗有效量之如本文所述之任一种流感病毒H5蛋白，其中该H5蛋白具有氨基酸223N及修饰328K+，其中H5蛋白的氨基酸位置编号是指SEQID NO：1所例示的氨基酸位置且其中修饰328K+是指在H5蛋白之氨基酸位置328上插入第二个赖氨酸(K+)；及

ii.如上所述之可药用佐剂。

优选地，佐剂系选自由以下各物组成之群：

a)：一种水包油型乳液(o/w)；

b)EMULSIGEN-

：一种具有溴化二甲基二-十八烷基铵(DDA)之水包油(o/w)乳液；

c)Polygen：一种共聚物；

d)EMULSIGEN-

一种具有专有免疫刺激剂的水包油型(o/w)乳液；

e)Carbigen为一种交联聚合物；

f)EMULSIGEN-

：一种包含具有交联聚合物之水包油型(o/w)乳液的双重佐剂；

g)ISA 70为一种油包水型(w/o)乳液。

最优选地，所述佐剂为水包油型乳液，诸如选自以下的基于emulsigen的佐剂：EMULSIGEN-

EMULSIGEN-

EMULSIGEN-

及EMULSIGEN-

最优选及EMULSIGEN-

用于本发明之配制剂中。

根据另一方面，如本文中所提供之药物/疫苗组合物包含一或多种抗原。优选地，所述抗原为禽类或哺乳动物病原体的抗原。根据另一实施例，所述抗原为其它流感抗原，诸如流感病毒之血凝素H3、H7、H9或其它任何血凝素。该(等)其它抗原可以是纯化形式、作为抗原制剂之一部分添加，以经灭杀微生物之形式或以经修饰之活微生物之形式添加。

本文术语″抗原″是指(但不限于)肽、多肽、糖肽或多糖，其能够与免疫系统的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性交互作用以便在该抗原所施用之宿主中引发、活化或刺激针对该抗原的免疫反应。术语″抗原″亦指核酸分子，优选为DNA分子或RNA分子，其各自编码且表达能够与免疫系统的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性交互作用的肽、多肽或糖肽，以便引发、活化或刺激针对由该核酸分子所编码的抗原的免疫反应。用于制备根据本发明使用之药物组合物的抗原为微生物或该微生物的抗原部分及/或制剂。就此而言，本文术语″免疫″是指(但不限于)任何引起或增强免疫反应的情况。术语″免疫反应″已于上文中加以描述。

流感疫苗之投药策略是本领域熟知的。灭活病毒疫苗及减毒病毒疫苗之粘膜接种策略也包括在本发明内。尽管粘膜可通过局部传递疫苗而被锁定目标，但多种策略皆已用于将免疫原性蛋白传递至粘膜。

在具体实施例中，可将疫苗与霍乱毒素(诸如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合体)混合或作为结合型或嵌合型融合蛋白投药(Hajishengallis，JImmunol.，154：4322-32，1995；Jobling及Holmes，Infect Immun.，60：4915-24，1992)。基于使用霍乱毒素B亚单位之粘膜疫苗已加以描述(Lebens及Holmgren，Dev Biol Stand 82：215-27，1994)。在另一实施例中，可制备与热不稳定性肠毒素(LT)之混合物用于粘膜接种。

其它粘膜免疫策略包括将病毒囊封于微囊中(US 5,075,109、US5,820,883及US 5,853,763)及使用免疫增强性膜质载剂(WO 98/0558)。经口投药之免疫原之免疫原性可藉由使用红细胞(rbc)或rbc碎片(US 5,643,577)或藉由使用蓝舌病抗原(US 5,690,938)而得以增强。

根据另一方面，本发明系关于一种制备如上所述之药物/疫苗组合物的方法，优选为一种制备包含如上所述之经杆状病毒表达之重组H5蛋白的疫苗的方法。通常，此方法包括以下步骤：i)将构建体转染至病毒内，其中该构建体包含如本文所述之重组H5 cDNA；ii)用经转染之病毒感染生长培养基中之细胞；iii)使病毒表达如本文所述之重组H5蛋白；iv)自培养物回收经表达的H5蛋白；及v)藉由将经表达的H5蛋白与适当佐剂及/或其它可药用载剂掺混而制备组合物。

优选佐剂为上述佐剂。因此，根据另一方面，用于激发抗流感感染之免疫反应的抗原组合物(诸如疫苗)的制备方法包含i)制备及回收H5蛋白，及ii)将此蛋白与适当佐剂混合。

此外，本发明的疫苗组合物亦可包括稀释剂、等渗剂、稳定剂及/或防腐剂。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油及类似物。等渗剂尤其可包括无机盐或有机盐(例如氯化钠)、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖、糖类、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之碱金属盐。适当佐剂为上述佐剂。

所述H5蛋白、核酸分子、载体及疫苗中之任一者之医药用途

如本文中所提供的H5蛋白、编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码本文所述任何H5蛋白)的载体以及包含该H5蛋白、核酸分子或载体中之任一者的任何药物/疫苗组合物可用作药物，优选用于治疗及预防由流感病毒、最优选由流感A病毒引起的感染。如本文中所提供的H5蛋白、编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码如本文所述之任何所述H5蛋白)的载体以及包含如本文所述之该H5蛋白、核酸分子或载体中之任一者之任何药物/疫苗组合物可用于人类之治疗或预防且可用于兽医药物中。当用于兽医药物中时，优选为治疗禽类，优选鸟、鸡、鸭、火鸡及类似动物；以及哺乳动物，优选猪、牛、马、海豹、骆驼、狗、猫、仓鼠、小鼠及类似动物。

因此，根据另一方面，本发明系关于如本文中所提供的H5蛋白、编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码如本文所述之任何所述H5蛋白)的载体以及包含如本文所述之该H5蛋白、核酸分子或载体中之任一者之任何药物/疫苗组合物的用途，其可用作药物、优选用作人类药物及/或兽医药物。

此外，如本文中所提供的H5蛋白、如本文所述之编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码任何该H5蛋白)的载体可用于制备如本文所述之药物组合物，以便预防或治疗由流感病毒引起的感染。如上所述，所述药物组合物/疫苗组合物可用于人类之治疗及/或预防以及动物之治疗及/或预防，所述动物诸如禽类，优选鸟、鸡、鸭、火鸡及类似动物，以及哺乳动物，优选猪、牛、马、海豹、骆驼、狗、猫、仓鼠、小鼠及类似动物。

如本文中所提供的H5蛋白、如本文所述之编码任何所述H5蛋白的核酸分子、包含任何所述核酸分子(编码任何所述H5蛋白)的载体可用于制备如本文所述之药物组合物，该药物组合物适于治疗及预防优选由禽、猪或人类流感病毒或其任何组合或混合之流感病毒感染。

根据另一方面，本发明亦系关于一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中该方法包含将治疗有效量之本文所述H5蛋白投与需要该治疗之受检者。此外，本发明亦系关于一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中该方法包含将治疗有效量的如本文所述之编码如本文所述之任何H5蛋白的任何H5核酸分子或载体投与需要该治疗之受检者。此外，本发明亦系关于一种治疗或预防流感病毒感染的方法，其中该方法包含将治疗有效量之包含如本文所述之任何该H5蛋白、核酸分子或载体的疫苗投与需要该治疗之受检者。有需要之受检者可为人类以及动物，优选为禽类，甚至更优选为鸟、鸡、鸭、火鸡；或哺乳动物，优选为猪、牛、马、海豹、骆驼、狗、猫、仓鼠、小鼠及类似动物。

优选地，当对鸡进行接种时，可在1日龄时或1日龄之后(例如在10日龄时，或在1日龄至10日龄时，或在10日龄时或10日龄之后)使用本文所述H5蛋白接种。

可藉由投与任何H5蛋白、编码该任何H5蛋白的核酸分子或载体或如本文所述之任何药物/疫苗组合物治疗的流感感染优选系由禽、猪或人类流感病毒或其任何组合或混合引起。

根据另一方面，本发明系关于组配试剂盒，其包含：i)如本文所述之该H5蛋白、编码任何该H5蛋白的核酸分子或载体或包含如本文所述之该H5蛋白、核酸分子或载体中任一者之任何药物/疫苗组合物中的任一者；及ii)指示该H5蛋白、核酸分子、载体或疫苗用于治疗或预防由流感病毒引起的感染之用途的包装插页。当对鸡进行接种时，可在1日龄时或1日龄之后使用本文所述H5蛋白接种。

根据另一实施例，彼组配试剂盒包含禽类或哺乳动物病原体之至少另一种抗原及指示彼另外抗原之医药、人类或兽医学用途的信息。

实施例

以下实施例阐述本发明之优选物质及方法。然而应了解，所述实施例仅为说明而提供，且不应视为对本发明之整体范围之限制。

实施例1

构建编码及表达HA H5抗原的重组杆状病毒

如下生成含有H5 HA抗原的重组杆状病毒：化学合成H5 HA(SEQ IDNO：2)之编码序列且将其再克隆入转移载体pVL1392(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)内。藉由使用寡核苷酸引物及

定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)生成H5 HA MutK+(SEQ ID NO：4)且将其再克隆入转移载体pVL 1392(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)内。接着用

(Sigma)杆状病毒DNA将含有编码H5 HA抗原(SEQ ID NO：2)及H5 HA MutK+抗原(SEQ ID NO：4)之基因的pVL1392质粒共转染入Sf9昆虫细胞(BD Biosciences Pharmingen)内以生成含有编码SEQID NO：2之基因H5 HA及编码SEQ ID NO：4之基因H5 HA mutK+的重组杆状病毒。将含有编码H5 HA(SEQ ID NO：2)及H5 HA MutK+(SEQ ID NO：4)之基因的重组杆状病毒进行空斑纯化，且将主种子病毒(Master Seed Virus；MSV)于SF+细胞株上繁殖，制成等分试样且在-70℃储存。昆虫细胞为生成MSV或工作种子病毒(Working Seed Virus)的目的而感染了上述H5 HA杆状病毒，结果所述细胞表达H5 HA抗原(SEQ ID NO：2)及H5 HA MutK+抗原(SEQ ID NO：4)，这通过用多克隆血清或单克隆抗体经间接荧光抗体试验或Western印迹法检测。

用适量重组杆状病毒(分别为H5 HA及H5 HA MutK+)接种后，接着将含有SF+细胞(Protein Sciences，Inc.，Meriden，CT)的旋转瓶在27±2℃培育7天，期间以100rpm搅拌。所述旋转瓶使用通气盖以使空气流动。收获含有经杆状病毒感染之SF+细胞的粗制全细胞培养物及各培养物之细胞培养上清液。

实施例2

制备包含HA H5抗原之药物组合物(疫苗)

收获由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5HA蛋白及H5 HA Mutk+蛋白。将杆状病毒在5mM环化二乙烯亚胺(BEI)(最终浓度)之存在下、在约32℃-39℃灭活72至96小时。灭活完成后，添加0.3M硫代硫酸钠溶液直至最终浓度为5mM，以中和任何残余BEI。中和后，添加各种佐剂且生成以下疫苗/药物组合物。

疫苗

通用产物名称	501
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Emulsigen佐剂。

通用产物名称	502
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Emulsigen-D佐剂。

通用产物名称	503
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Polygen佐剂。

通用产物名称	504
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Emulsigen-P佐剂。

通用产物名称	505
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Carbigen佐剂。

通用产物名称	506
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及

上清液。该疫苗辅以Emulsigen-75佐剂。

通用产物名称	507
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以ISA 70佐剂。

通用产物名称	508
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA mutK+蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Emulsigen佐剂。

通用产物名称	509
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA mutK+蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Emulsigen-D佐剂。

通用产物名称	510
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA mutK+蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Polygen佐剂。

通用产物名称	511
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA mutK+蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。疫苗佐以Emulsigen-P佐剂。

通用产物名称	512
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA mutK+蛋白。

配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Carbigen佐剂。

通用产物名称	513
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA mutK+蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以Emulsigen-75佐剂。

通用产物名称	514
		抗原	由基于杆状病毒之表达系统在昆虫细胞中表达的粗制全细胞H5 HA K+蛋白。
配制剂	实验性疫苗，其包含表达重组H5 HA的培养的昆虫细胞及上清液。该疫苗辅以ISA 70佐剂。

实施例3

对猪进行接种以防御禽流感

1.引论

此研究之目的系测定含有重组H5血凝素(HA)抗原之粗提取物之实验性疫苗在猪体内诱导血凝抑制(HI)效价的能力。用H5 HA抗原评价各种佐剂。

此研究中评价的HA H5原型(prototype)含有来自传统H5 HA或H5 HAMutK+的抗原。传统H5 HA系源自A/鸭/China/E319-2/03，而H5 HA MutK+是传统H5 HA经改造后在S120N、D150N、S223N及328mutK+含有三个特定氨基酸变异。其亦含有氨基酸94N。H5 HA Mut K+中之特定氨基酸变异产生更类似于A/HK/213/03之HA的H5 HA。目前认为A/HK/213/03之H5HA之氨基酸组成有助于H5 HA之抗体识别。

2.研究设计：

表1：研究概述

研究开始时，仔猪为3周±5日龄。研究开始时，仔猪在临床上为健康的。在研究第0日、第21日及第35日获得血样。

在研究第1日至第35日每日观测全部研究动物之一般健康状况。在每次接种后七天，每天查看注射部位且记录可见到的反应。在研究日第35日动物研究期结束时，对全部动物施以人道安乐死。

3.疫苗

用实施例2所述的疫苗501至514进行猪接种研究。

4.血凝素抑制试验

在第0日及第21日用含有H5 HA之原型对猪进行接种。在第0日、第21日、第35日收集猪血清以便藉由血凝抑制(HI)试验进行评价。进行HI试验以检测HA特异性抗体之存在。异源H5N2病毒(A/鸡/Mexico/232/94)系以四个血凝单位[4 HA单位]之浓度用于HI试验中。随后在U形底微量滴定板中，将在PBS中连续两倍稀释之血清液与等体积(25μL)(含有4 HA单位)之病毒混合，且在室温(约25℃)培育30分钟。将PBS中之浓度为0.5％之鸡红细胞添加至含有血清-病毒之孔中，室温培育40分钟。以观测到血凝抑制的最高血清稀释度之倒数确定HI效价。

5.结果

HI测试使用Mexican政府法定(official)之H5N1抗原(A/鸡/Mexico/232/94)[4 HA单位]，接种方案为第0日及第21日1×1mL。

BIV H5(来源于流感A病毒(A/鸭/China/E319-2/03(H5N1))

BIV H5 K+(突变之BIV H5，有S120N、D155N、S223N，且增添328K+)

结果证明，大多数疫苗组合物在被接种的猪中引发免疫反应。尤其，大多数疫苗组合物引起血清转化，这意味着，大多数被接种的猪针对HI试验所用禽流感病毒产生特异性抗体。总之，这些结果清楚且无疑地证明，本发明极其奏效。藉由用禽流感病毒之相关抗原对猪进行接种，可大大降低猪(即第二物种的动物)被禽流感病毒(即第一物种的病原体)广泛流行性感染之风险。这已得到清楚证明。此外，依据此接种概念，禽流感病毒向哺乳动物(包括人类)传播并适应的情况大大减少。猪是禽病原体(包括禽流感病毒)最重要的贮主(reservoir)之一。若病毒在猪体内的复制以及由此而及的禽流感对猪适应的风险大大降低且得以控制，则禽流感病毒对人类适应之风险亦大大降低。在施用抗原产生较低HI效价(是指效价低于30)之情况下，需要用抗原进一步加强免疫，以进一步提高HI效价且增强被接种的猪体内的免疫保护。因此，效价低并不是指无法获得保护，其仅表明可能需要进一步加强免疫以促进免疫反应。被接种的猪体内可测量到免疫反应，这一事实证明，本发明是极其有效的。换而言之，本文所提供之实验清楚且无疑地证明，本发明奏效。

实施例4

对鸟进行接种以防御禽流感

1.引论

此研究之目的系测定含有重组H5mutk+血凝素(H5 HA mutk+)抗原之粗提取物之实验性疫苗在鸡体内诱导血凝抑制(HI)之能力。用传统重组H5抗原(H5 HA)以及灭活疫苗

AI(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Mexico)作为对照。此外，用H5 HA抗原评价多种佐剂。

2.研究设计：

1日龄或10日龄的SPF鸟(15-25只)各自独立地用0.5ml不同实验性疫苗在颈背部藉由皮下途径接种；实验期间所有鸟隔离饲养。不限量提供食物及水。接种后第31日或第32日，用H5N2高致病性禽流感病毒株进行攻击。

接种后第15日、第30日，自鸟颈静脉放血获得血清样本。所得血清在4℃储存，直至进行实施例3所述血凝抑制(HI)测试以获得抗体效价。

3.疫苗及攻击病毒：

独立评价四种不同配制剂：

1.传统油乳液H5HA Mut k+：按照Boehringer Ingelheim Vetmedica的方法，将H5 HA mutk+抗原配制在油乳液(弗氏不完全佐剂(Freund incompleteadjuvant))中。

2.Seppic H5HAMut k+：根据供货商的建议，将H5 HAmutk+抗原与非传统的佐剂(ISA 206，W/O/W，获自Seppic)一起配制。

3.H5HA传统油乳液：按照Boehringer Ingelheim Vetmedica的方法，将H5 HA抗原配制在油乳液(弗氏不完全佐剂)中。

4.Seppic H5HA：根据供货商的建议，将H5 HA抗原与非传统的佐剂(ISA 206，W/O/W，获自Seppic)一起配制。

用禽流感Boehringer Ingelheim Vetmedica油乳液疫苗作为对照

AI(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Mexico)。

对于经过接种及未经接种的鸡，每只经鼻内途径接种0.2ml 10^6.7 CEID的H5N2攻击病毒进行攻击。攻击后，记录病征及死亡率。接种后第10日，将所有幸存的鸡按照动物实验程序施以人道安乐死。

4.结果：

结果描述于下表中：

阳性血清效价根据OIE标准而考虑log₂ 4。基于此标准，血清学结果为阴性，但与基线相比时，观测到某些阳性值。在1日龄或10日龄接种的鸟体内观测到，与油佐剂及与H5HA Mut k+抗原一起配制的疫苗具有最好的血清学效价。在与Seppic及与H5HA抗原一起配制的原型中观测到最低的血清学效价。在攻击研究中观测到，疫苗原型提供保护作用，用传统油乳液疫苗与H5HAMut k+抗原一起配制时尤其如此。攻击研究中观测到SeppicH5HA具有最低的保护作用，死亡率为68％。相比之下，10日接种的鸟相比于1日龄接种的鸟，观测到最高的血清学效价。

序列表

<110>贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)

<120>新的H5蛋白、其编码核酸、载体及它们的医药用途

<130>Case 1-2150

<150>60/863142

<151>2006-10-27

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>551

<212>PRT

<213>禽流感病毒

<400>1

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<210>2

<211>567

<212>PRT

<213>鸭流感病毒

<400>2

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<210>3

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<212>PRT

<213>鸭流感病毒

<400>3

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<211>568

<212>PRT

<213>禽流感病毒

<400>4

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<212>PRT

<213>禽流感病毒

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<213>鸭流感病毒

<400>6

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275 280 285

Val Glu

290

Claims

1.禽流感病毒H5蛋白，其中该H5蛋白由SEQ ID NO：4之氨基酸序列组成。

2.核酸分子，其编码权利要求1的H5蛋白。

3.载体，其包含权利要求2的核酸分子。

4.疫苗，其包含：

a.权利要求1的H5蛋白；及

b.可药用载剂及/或赋形剂。

5.权利要求4的疫苗，其中该赋形剂为一或多种佐剂。

6.权利要求5的疫苗，其中所述佐剂为基于Emulsigen的佐剂。

7.制备权利要求1的H5蛋白的方法，包括以下步骤：

a.分离或扩增编码该H5蛋白的核酸；

b.将该H5编码核酸克隆至表达载体内；

c.表达该H5蛋白。

8.权利要求7的方法，其中该表达载体为重组杆状病毒。

9.权利要求7或8的方法，其中该H5蛋白在昆虫细胞中表达。

10.制备包含权利要求1的H5蛋白的疫苗的方法，包括：

a.获得权利要求1的H5蛋白；

b.将步骤a)的H5蛋白与可药用载剂及/或赋形剂混合。

11.权利要求1的H5蛋白用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防或治疗由病毒性流感引起的感染。

12.权利要求11的用途，其中该病毒性流感感染由禽流感病毒、猪流感病毒、或人流感病毒、或它们的任何组合或杂种引起。