CN1748795A - 多价禽流感重组活载体疫苗 - Google Patents

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CN1748795A CN 200410011097 CN200410011097A CN1748795A CN 1748795 A CN1748795 A CN 1748795A CN 200410011097 CN200410011097 CN 200410011097 CN 200410011097 A CN200410011097 A CN 200410011097A CN 1748795 A CN1748795 A CN 1748795A
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金宁一
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Abstract

一种多价禽流感重组活载体疫苗，属于生物技术领域，特别是涉及一种重组禽流感疫苗。本发明的目的在于提供共表达H5亚型AIV、H7亚型AIV嵌合蛋白与细胞因子鸡白细胞介素18(chIL－18)的多价禽流感重组活载体疫苗。

Description

多价禽流感重组活载体疫苗
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种重组禽流感疫苗。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种家禽和野禽的感染和/或疾病综合征。鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。感染后可表现为亚临床感染(隐性感染)、低致病力毒株引起的轻微呼吸道消化道症状、产蛋下降至高致病力毒株引起的急性高致死性疾病等到多种形式。高致病力禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)的感染可导致75％～100％的死亡率，自Perroncito于1878首次报道在意大利发生禽流感以来，本病不断蔓延，目前世界许多国家和地区包括北美、南美、北非、中东、远东、英国和前苏联等均有本病暴发和流行的报道。该病被国际兽医局(OIE)规定为A类传染病，并被列为国际生物武器公约动物类传染病之一，我国也将其列为一类动物疫病。
禽流感是一种毁灭性的疾病，每一次严重的暴发都会给养禽业造成巨大的经济损失，给社会带来很大的影响。自1959年世界首次报道了HPAI在家禽中暴发以来，至少有20次HPAI大暴发，如1983年美国宾夕法尼亚州，暴发HPAI，耗资6000万美元，扑杀1700万只鸡，而消费者更是支出了3.49亿美元用于补贴生产者的损失；1997年中国香港AIV事件中，特区政府耗资1亿港币，扑杀了150万只鸡，并且首次出现了人被感染的病例；2001年香港再度发现H5 HPAI，特区政府又斥资8000万港币扑杀120万只鸡。2003年荷兰暴发H7N7HPAI，扑杀2800万只鸡，荷兰及周边国家禽产品贸易停顿；2003年末，巴基斯坦暴发禽流感，导致大批鸡死亡，经分析为高致病性毒株H5N1型，在短短的时日内迅速蔓延至包括中国在内的亚洲10多个国家和地区，造成上百万家禽死亡。并出现人被感染病例，仅越南全国患者总数就多达248人，其中有36人死亡，对人类健康造成很大的威胁。
在我国，虽然流行的多为低致病力毒株AIV，但若长期在缺乏免疫力、又无适当防疫措施的鸡群中流行，则会使鸡群的死淘率增加，产蛋量减少(产蛋率可由90％～95％急剧下降到20％)，给养鸡业造成的损失仍是相当惨重的，这严重地影响了我国禽类产品的国际贸易和国际信誉。更为重要的是，现已有明显的迹象表明，AIV已影响到了公共卫生问题。公共卫生专家警告说，要防止携带人型流感病毒的人再感染上AIV，因为这两种病毒在同一个人上发生重组突变后就有可能产生新的更难控制的毒株，那将会对人类健康造成很大的威胁，一些学者已经预测，下次全球范围内的流感大流行，极有可能起源与亚洲地区。
鉴于AI对养禽业发展和人类健康均构成严重威胁，AI疫苗的(研制)防治工作越来越受重视。目前预防AI主要是使用灭活油乳剂疫苗，但这一途径生产的疫苗成本高，使用不便，疫苗应用后会产生针对AIV HA和NP蛋白的抗体，从而严重影响现有条件下的禽流感免疫监测和流行病学调查等，并可能造成人为散毒。鸡痘病毒作为较成熟的重组病毒疫苗载体已成功地用于多种病原保护性抗原的表达，并接种机体后显示出良好的免疫原性。AIV的HA是主要的保护性抗原，以表达各种亚型AIV-HA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)疫苗免疫均可对同一亚型的不同毒株(包括高、低致病力毒株)的攻击产生近100％的免疫保护，而且不会干扰禽流感疫情的监测，具有较好的应用前景。用于构建重组鸡痘病毒的载体一般为鸡痘病毒疫苗株，虽然它们的毒副作用小、安全性高，但仍有一定的残留毒性，表现为对雏鸡的体重增长和免疫应答的抑制作用。因此，近年来许多研究者探索了多种途径来降低载体鸡痘病毒的毒副作用，其中之一就是在重组疫苗中引入细胞因子，如IL-2和IFN-γ，用以构建共表达保护性抗原和细胞因子的重组鸡痘病毒。此外，引入细胞因子还有可能增强疫苗的免疫效力。因此，这一方法成为近年来研制安全、高效鸡痘病毒重组疫苗的有效途径之一。
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)表达载体系统是类似于金丝雀痘病毒载体的又一种动物病毒载体。FPV作为载体具有与金丝雀痘病毒载体相同的优点，此外，相比于金丝雀痘病毒载体，其基因组结构更为庞大，能容纳较大的外源基因而不丧失其感染性；被表达的外源蛋白，在感染细胞中能忠实地进行修饰，如糖基化、羧基化等；外源基因的表达产物具有良好的免疫原性，可诱导机体产生持续时间较长的细胞免疫和体液免疫；严格的胞浆内复制，避免了病毒基因重组入宿主细胞染色体的可能性，消除了重组病毒应用后对人畜的潜在威胁。
技术内容：
本发明的目的在于提供共表达H5亚型AIV、H7亚型AIV嵌合蛋白与细胞因子鸡白细胞介素18(chIL-18)的多价禽流感重组活载体疫苗。
本发明是用Sal I和EcoR V把H5亚型AIV HA基因从pUCm-H5质粒释出，去磷和补平，用Sma I消化pUTA2质粒，去磷，把该AIV HA基因插入到线性化的pUTA2质粒载体复合启动子下游，构建pUTA2-H5重组质粒。
本发明携带H5亚型AIV HA基因重组活载体疫苗------pUTA2-H5，其基因序列是：No.1
本发明用Sal I和Hind III消化pUCm-IL18质粒，回收IL-18片段；用Sal I和Hind III消化pUTA-16-LacZ质粒，把IL-18片段定向到克隆于该表达载体单一启动子下游，构建pUTAL-IL18重组质粒；然后用Sal I和EcoRV把H5亚型AIV HA基因从pUCm-H5质粒切出，去磷和补平。用Sma I消化已构建好的pUTAL-IL18，去磷，把该AIV HA基因插入到线性化的pUTAL-IL18质粒载体复合启动子下游，构建pUTAL-H5-IL18重组质粒。
本发明用Sal I和Hind III消化pUCm-IL18质粒，回收IL-18片段；用Sal I和Hind III消化pUTA-16-LacZ质粒，把IL-18片段定向到克隆于该表达载体单一启动子下游，构建pUTAL-IL18重组质粒；并用Sma I线性化用Sal I和BamHI消化pMD18-T-H7质粒，回收H7亚型AIV HA基因片段并补平；用BamHI消化pUCm-H5，补平后与上述H7亚型AIV HA基因片段连接，筛选插入方向与PUCm-H5中HA基因表达方向相同的重组质粒，使H7亚型AIV HA基因片段与H5亚型AIV HA基因片段共同拥有一个完整的阅读框架，从而构建出pUCm-H5-H7重组质粒；用Sal I和EcoR V消化pUCm-H5-H7，切出H5-H7基因片段并补平，之后连接到线性化的pUTAL-IL18重组质粒，使其位于该载体的复合启动子的下游从而构建出pUTAL-H5-H7-IL18重组转移载体。
本发明的优点和积极效果为：
1、本发明得到的三种重组鸡痘病毒能单独表达H5亚型AIV HA基因、共表达H5亚型AIV HA基因和chIL-18基因、共表达H5HA-H7HA融合蛋白基因和chIL-18基因，且表达的蛋白可分别与相应的单克隆抗体发生特异性反应。
2、本发明得到的三种重组鸡痘病毒免疫鸡后，可产生有效的体液免疫和细胞免疫。
3、本发明得到的三种重组鸡痘病毒对实验动物是安全的。
4、本发明得到的三种重组鸡痘病毒具有很好的遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失。
5、本发明所使用的目的基因为HPAIV的HA基因，从而构建的重组鸡痘病毒可作为我国预防HPAIV的活载体疫苗或作好疫苗的物质储备工作。
6、本发明中重组鸡痘病毒表达的细胞因子chIL-6起到了免疫佐剂的作用。
附图说明：
图1是本发明重组质粒pUTA2-H5构建流程图；
图2是本发明重组质粒pUTAL-H5-IL18构建流程图；
图3是本发明重组质粒pUTAL-H5-H7-IL18构建流程图。
具体实施方式：
本发明是用Sal I和EcoRV把H5亚型AIV HA基因从pUCm-H5质粒释出，去磷和补平，用Sma I消化pUTA2质粒，去磷，把该AIV HA基因插入到线性化的pUTA2质粒载体复合启动子下游，构建pUTA2-H5重组质粒。
本发明携带H5亚型AIV HA基因重组活载体疫苗------pUTA2-H5，其基因序列是：No.1
本发明用Sal I和Hind III消化pUCm-IL18质粒，回收IL-18片段；用Sal I和Hind III消化pUTA-16-LacZ质粒，把IL-18片段定向到克隆于该表达载体单一启动子下游，构建pUTAL-IL18重组质粒；然后用Sal I和EcoRV把H5亚型AIV HA基因从pUCm-H5质粒切出，去磷和补平。用Sma I消化已构建好的pUTAL-IL18，去磷，把该AIV HA基因插入到线性化的pUTAL-IL18质粒载体复合启动子下游，构建pUTAL-H5-IL18重组质粒。
本发明用Sal I和Hind III消化pUCm-IL18质粒，回收IL-18片段；用Sal I和Hind III消化pUTA-16-LacZ质粒，把IL-18片段定向到克隆于该表达载体单一启动子下游，构建pUTAL-IL18重组质粒；并用Sma I线性化用Sal I和BamHI消化pMD18-T-H7质粒，回收H7亚型AIV HA基因片段并补平；用BamHI消化pUCm-H5，补平后与上述H7亚型AIV HA基因片段连接，筛选插入方向与PUCm-H5中HA基因表达方向相同的重组质粒，使H7亚型AIV HA基因片段与H5亚型AIV HA基因片段共同拥有一个完整的阅读框架，从而构建出pUCm-H5-H7重组质粒；用Sal I和EcoRV消化pUCm-H5-H7，切出H5-H7基因片段并补平，之后连接到线性化的pUTAL-IL18重组质粒，使其位于该载体的复合启动子的下游从而构建出pUTAL-H5-H7-IL18重组转移载体。
1.分子生物学常规的基因操作
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等均参照《分子克隆实验指南》(金冬雁、黎孟枫等译，第二版，科学出版社，1992)相关章节进行。
2.重组表达质粒的构建
2.1嵌合基因H5-H7-HA中间质粒的构建
用Sal I和BamHI消化pMD18-T-H7质粒，回收H7亚型AIV HA基因片段并补平。用BamHI消化pUCm-H5，补平后与上述H7亚型AIV HA基因片段连接，筛选插入方向与pUCm-H5中HA基因表达方向相同的重组质粒，使H7亚型AIV HA基因片段与H5亚型AIVHA基因片段共同拥有一个完整的阅读框架，从而构建出pUCm-H5-H7重组质粒。
2.2含细胞因子chIL-18重组鸡痘病毒载体质粒的构建
用Sal I和Hind III消化pUCmIL18质粒后，回收chIL-18片段，用SalI和HindIII消化pUTA-16-LacZ质粒，把chIL-18片段定向克隆于该表达载体单一启动子下游，购建pUTAL-IL18重组质粒。
2.3共表达重组质粒的构建
分别用Sal I和EcoRV双酶切质粒pUCm-H5和pUCm-H5-H7，回收H5-HA和H5-H7-HA嵌合基因，用Klenow补平后分别与经SmaI酶切并去磷的pUTAIL-18相连接，同时H5-HA也与经Sma I酶切并去磷的pUTA2相连接，构建pUTA2-H5、pUTAL-H5-IL18和pUTAL-H5-H7-IL18共表达重组鸡痘病毒载体质粒。
3.同源重组及重组病毒的筛选、纯化
3.1FPV毒价测定
用于同源重组的FPV经细胞传代复壮，计算空斑形成单位(Plaqueforming units，PFU)，并用HE染色，鉴定病毒。将FPV按102～106稀释倍数接种于传代生长的6×30mm培养板CEF单层，补加含1％甲基纤维素和1％小牛血清(FCS)的MEM作为维持液，37℃，5％CO2培养120h后，弃培养液，PBS(pH7.2)洗2次，室温下1％甲醛固定15min，自来水洗涤，0.1％结晶紫染色5min，自来水洗涤，统计病毒空斑数计算出每毫升病毒液中所含的PFU。
PFU＝(病毒空斑数×稀释倍数)/染毒体积(ml)
3.2体内同源重组
质粒转染细胞采用脂质体法：于6×30mm培养板中接种传代的CEF 1×105～3×105个/ml，当细胞长至80％融合时，感染0.1MOI(Multiplicity of infection)的FPV，37℃，5％CO2吸附2h后，与在室温下作用15～30min的转染试剂DOTAP和重组质粒的混合物共转染。即在500μl MEM中，加入15μl DOTAP Liposomal，轻轻混匀，另取500μl MEM加入重组质粒DNA 10μg混匀。然后将后者滴加于前一液体中轻轻混匀，室温下作用15～30min。转染后12～18h，更换新鲜配制的含2％FCS的MEM，继续培养48～72h，收获病毒，测重组病毒的毒价。
3.3重组病毒的筛选和纯化
在6×30mm培养板制备CEF单层，在接毒前24h用含40μg/mlBrdU(5-溴脱氧核糖尿苷)的MEM营养液培养，然后按10MOI接种重组表达质粒转染后收获的病毒，5％CO2吸附2h后，再用含40μg/mlBrdU的MEM营养液培养120h，收获细胞。重复上述实验，然后将收获细胞反复冻融三次，在无BrdU的营养液中培养，待细胞出现病变后，分别挑出单个病毒蚀斑，纯化3次后，分别进行扩毒。用无BrdU的MEM营养液培养，待出现细胞病变后挑出单个病毒蚀斑，并分别进行扩毒。
4.重组病毒的PCR鉴定
收集重组病毒感染的CEF，用TRIZOL LS Reagent按说明书指示提取细胞总RNA，用H5 AIV HA基因特异引物和chIL-18基因特异引物进行RT-PCR。
chIL-18引物三条：
上游引物P0  5′-GTGTGCAGTACGGCTTAGAGAA-3′，
上游引物P1  5′-TAAGCTTGAGATGGAATGCGATGCCTTTTG-3′，
上游引物P2  5′-ATCATAGGTTGTGCCTTTCATTA-3′。
H5HA引物两条：
上游引物Y1  5′-AAAATGGAGAGAATAGTGCTT-3′，
上游引物Y2  5′-CTACAATCTGAACTCAATAAAT-3。′
5.重组病毒表达产物的检测
5.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
将扩增后的纯化重组病毒，以10MOI分别接种于10ml培养瓶1×106个/ml CEF细胞中，同时设FPV对照和细胞对照，至细胞出现明显病变时，弃培养液，用1ml 37℃预热的TEN(40mmol/L Tris.ClpH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脱细胞，收集于Eppendorf管中，3000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗一次，加60μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris.Cl，pH7.4，1mmol/L MgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000rpm离心5min，-20冻存。
取30μl细胞裂解液与等量2×样品缓冲液(100mmol/L Tris.Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，使用前加入2.5％β-巯基乙醇)混匀，于10％凝胶进行SDS-PAGE电泳。
5.2免疫印迹(Western blot)
经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris.ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5～10min，AIV阳性标准血清用封闭缓冲液稀释(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3～5次，碱性磷酸酶标记的羊抗鸡IgY(1∶1000)室温感作2h，洗涤3～5次后，每次5～10min，用10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/LNaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris.Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5gNBT，70％二甲基甲酰胺)，混匀后再加33μl BCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，显色10～20min，用蒸馏水中止反应。
6.重组病毒表达外源蛋白的稳定性
将获得的重组病毒，用CEF细胞连续传10代，分别用第5和第10代重组病毒以10MOI的量接种同等量的CEF细胞，对收获的细胞总蛋白作SDS-PAGE和Western blot分析，检测目的蛋白的相对表达量。
7.重组病毒的免疫原性研究
7.1重组病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18、rFPV-H5HA和鸡痘病毒wt-FPV的毒价测定
将重组病毒及鸡痘病毒282E4在SPF鸡胚成纤维细胞上扩增，扩增原液用Hanks液作1∶10、1∶100、1∶1000等10倍倍比稀释，选取几个适当的稀释度接种细胞，每个稀释度至少接种3瓶，0.2ml/每瓶，作用1.5h后，铺置含中性红的营养琼脂，等凝固后，置37℃并含5％的CO2培养箱中继续培养，进行蚀斑计数，并计算病毒的含量。
7.2攻毒用AIV Isolate(H5N1)的LD50和ELD50测定
把H5N1 AIV Isolate用SPF鸡胚成纤维细胞扩增后，取扩增原液用灭菌生理盐水作10倍倍比稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9四个稀释度，各接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚经尿囊腔注射0.1ml，每天观察，去除24h内死亡鸡胚，记录每组其余死亡鸡胚数，共观察4天，按Reed和Muench方法分析H5N1 AIV Isolate鸡胚半数致死量(ELD50)。
用灭菌生理盐水将上述H5N1 AIV Isolate细胞培养物作10倍倍比稀释，取培养毒分别按10-3、10-4、10-5、10-6稀释后，经胸部肌肉注射接种3～4周龄SPF鸡，每只鸡0.1ml，每个剂量接种5只，去除24h内死亡鸡，观察记录雏鸡死亡数，观察6天，计算各稀释度死亡率。按Reed和Muench方法分析半数致死量(LD50)。
7.3重组病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA诱生的HI抗体水平的检测
100只1日龄SPF鸡随机分成5组，每组20只，1～4组分别经翅皮下刺种rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18、rFPV-H5HA和wt-FPV各106PFU，第5组接种0.2ml PBS。接种当日采集各组鸡血清，测定针对H5亚型AIV特异性血凝抑制抗体(HI)滴度，之后于免疫后第7d、14d、21d采集血清，测定针对H5亚型AIV特异性血凝抑制抗体(HI)滴度(以log2表示)。以上述各疫苗免疫1日龄商品蛋鸡，免疫剂量、途径及分组状况同上。免疫后7d、14d、21d和28d采集血清，测定HI滴度。
7.4免疫与攻毒
50只1日龄SPF鸡随机分成5组，每组10只，1～3组分别经翅皮下刺种rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18、rFPV-H5HA各106PFU，第4组接种H5亚型AIV全病毒灭活疫苗0.5ml，第5组接种0.2ml PBS。免疫21d后，用103ELD50 AIV Isolate强毒肌肉注射进行攻击，统计2周内发病及死亡鸡数，计算保护率。
80只1日龄Leghorn商品蛋鸡雏随机分成8组，每组10只，分群饲养，1周龄免疫。1～3组分别经翅皮下刺种106PFU的rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA；4～6组分别经翅皮下刺种104的PFU rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA；第7、8组为对照组，第7组肌肉注射0.5ml H5亚型AIV全病毒灭活疫苗，第8组接种0.2mlPBS。免疫3周后，每组10只，置于负压隔离器中，用103ELD50AIVIsolate强毒肌肉注射进行攻击，统计2周内发病及死亡鸡数，计算保护率。
保护率＝[(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]×100％
7.5脾脏免疫学指标的检测
7.5.1脾脏单淋巴细胞悬液制备
免疫后14d，取各免疫组及对照组鸡，每组10只，无菌采集脾脏，置于盛有RPMI 1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目铜网过滤制成单细胞悬液，1500rpm，离心5min，弃上清。用Hanks液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI 1640培养液中，计数，调至2×107个/ml备用。
7.2.2淋巴细胞的诱导培养
取96孔培养板加入50μl ConA(40mg/L)，每个样本均设3个复孔并设对照。向每孔中加入上述淋巴细胞悬液50μl，使每孔中培养液总体积为100μl。将培养板置于5％CO2 90％湿度42℃培养76h后，每孔加入0.50μci 3H-TdR(稀释为20μl，用无血清的RPMI 1640配制)，继续培养6h。使用多头细胞收集器将细胞培养物收集至GF/C玻璃纤维滤膜上，60℃2h烤干，放入闪烁瓶中，每瓶加入5ml闪烁液，静置1h后用闪烁计数仪测定cpm值。计算刺激指数(SI)：
SI＝实验孔cpm值/对照孔cpm值
7.6重组病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA免疫SPF雏鸡后对体重增长的影响
100只1日龄SPF鸡随机分成5组，每组20只，1～4组分别经翅皮下刺种rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18、rFPV-H5HA和wt-FPV各106PFU，第5组接种0.2ml PBS。分别于接种后7d和14d称重。用SPSS软件对各组鸡的体重作方差分析。
7.7重组病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA免疫攻毒后泄殖腔排毒率检测
对7.3中免疫攻毒的8组Longhorn商品蛋鸡雏，选择106PFUrFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18、rFPV-H5HA及灭活苗免疫鸡，在攻毒后第7天从各组鸡泄殖腔中采集棉拭子样品，用鸡胚分离法进行AIV分离，测定各组鸡泄殖腔排毒率：
排毒率＝泄殖腔病毒分离为阳性的鸡数/试验鸡总数。
检测结果：
获得的三种重组鸡痘病毒pUTA2-H5、pUTAL-H5-IL18和pUTAL-H5-H7-IL18提取基因组后进行RT-PCR扩增，均得预期大小的目的片段。Western blot检测均为阳性结果，说明构建的重组鸡痘病毒可分别表达H5亚型AIV HA、H5-IL18和H5-H7-IL-18。三种重组鸡痘病毒免疫鸡后，均可产生有效的体液免疫和细胞免疫，且重组病毒具有良好的遗传稳定性，另外含细胞因子chIL-18的两种重组鸡痘病毒免疫鸡后，能减轻鸡痘病毒载体对雏鸡体重增长的抑制作用。
研究结果表明，三种重组鸡痘病毒是一种安全、有效的基因工程活载体疫苗，具有开发成为用于AIV预防性疫苗的良好前景。
                   序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
<120>多价禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗
<210>1
atg gag aga ata gtg ctt ctt ctt gca ata gtc agt ctt gtt aaa agt    48
Met Glu Arg Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca gag cag gtt    96
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc caa gac ata    144
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
ctg gaa aag aca cac aac ggg aag ctc tgc gat cta gat gga gtg aag    192
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc ctc gga aac    240
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
cct atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct tac ata gtg    288
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
gag aag gac agt cca gcc aat gac ctc tgt tac cca ggg gat ttc aac    336
Glu Lys Asp Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
            100                 105                 110
gac tat gaa gaa ctg aaa cac cta ttg agc aga ata aac cat ttt gag    384
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asr His Phe Glu
        115                 120                 125
aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc aat cat gaa gcc tca    432
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
tca ggg gtg agc tca gca tgt cca tac aat ggg aag ccc tcc ttt ttc    480
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Lys Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
aga aat gtg gta tgg ctt att aaa aag aac agt gca tac cca aca ata    528
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg gta ctg tgg    576
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aaa ctc tat caa    624
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
aac cca acc acc tat att tcc gtt gga aca tca aca cta aac ctg aga    672
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Leu Arg
    210                 215                 220
ttg gtc cca aaa ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg caa agt gga    720
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
aga ata gag ttc ttc tgg aca att tta aaa ccg aat gat gcc atc aat    768
Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
ttc gag agt aat ggg aat ttc att gct cca gaa tat gca tac aaa att    816
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
gtc aag aaa ggg gac tca gca att atg aaa agt gaa ttg gaa tat ggt    864
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
aac tgc aac acc aag tgt caa act cca atg ggg gcg ata aac tct agt    912
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
atg cca ttc cac aac ata cac cct ctc acc atc ggg gaa tgc ccc aaa    960
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
tat gtg aaa tca aac aga tta gtc ctt gcg act ggg ctc aga aat acc    1008
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr
                325                 330                 335
cct cat aga gag aga aga aga aaa aag aga gga cta ttt gga gct ata    1056
Pro His Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
gca ggt ttt ata gag gga gga tgg cag gga atg gta gat ggt tgg tat    1104
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
ggg tac cac cat agc aat gag cag ggg agt gga tac gct gca gac aaa    1152
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
gaa tcc gct caa aag gca ata gat gga gtc acc aat aag gtc aac tcg    1200
Glu Ser Ala Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
atc att gac aaa atg aac act cag ttt gag gcc gtt gga cgg gaa ttt    1248
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
aat aac tta gaa agg agg ata gaa aat tta aac aag aag atg gaa gac    1296
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
gga ttc cta gat gtc tgg act tat aat gct gaa ctt ctg gtt ctc atg    1344
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
gaa aat gag agg act cta gac ttt cat gac tca aat gtc agg aac ctt    1392
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Arg Asn Leu
    450                 455                 460
tac gac aag gtc cga cta cag ctt agg gat aat gca aag gag ctg ggt    1440
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
aat ggt tgt ttc gag ttc tat cac aaa tgt gat aat gaa tgt atg gaa    1488
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
agt gta aaa aac gga acg tat gac tac ccg cag tat tca gaa gaa gca    1536
Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
aga cta aac aga gag gaa ata agt gga gta aaa ttg gaa tca atg gga    1584
Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly
        515                 520                 525
act tac caa ata ctg tca att tat tca aca gtg gcg agt tcc cta gca    1632
Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
ctg gca atc atg gta gct ggt cta tct tta tgg atg tgc tcc aat gga    1680
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
tcg tta cag tgc aga att tgc atc taa                                1707
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565

Claims (4)

1、一种多价禽流感重组活载体疫苗，其特征在于：用Sal I和EcoRV把H5亚型AIV HA基因从pUCm-H5质粒释出，去磷和补平，用Sma I消化pUTA2质粒，去磷，把该AIV HA基因插入到线性化的pUTA2质粒载体复合启动子下游，构建pUTA2-H5重组质粒。
2、根据权利要求1所述的多价禽流感重组活载体疫苗，其中携带H5亚型AIV HA基因重组活载体疫苗------pUTA2-H5，其基因序列是：
atg gag aga ata gtg ctt ctt ctt gca ata gtc agt ctt gtt aaa agt      48
Met Glu Arg Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca gag cag gtt      96
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc caa gac ata      144
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
ctg gaa aag aca cac aac ggg aag ctc tgc gat cta gat gga gtg aag      192
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc ctc gga aac      240
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
cct atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct tac ata gtg      288
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
gag aag gac agt cca gcc aat gac ctc tgt tac cca ggg gat ttc aac      336
Glu Lys Asp Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
            100                 105                 110
gac tat gaa gaa ctg aaa cac cta ttg agc aga ata aac cat ttt gag    384
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc aat cat gaa gcc tca    432
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
tca ggg gtg agc tca gca tgt cca tac aat ggg aag ccc tcc ttt ttc    480
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Lys Pro Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
aga aat gtg gta tgg ctt att aaa aag aac agt gca tac cca aca ata    528
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg gta ctg tgg    576
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aaa ctc tat caa    624
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
aac cca acc acc tat att tcc gtt gga aca tca aca cta aac ctg aga    672
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Leu Arg
    210                 215                 220
ttg gtc cca aaa ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg caa agt gga    720
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
aga ata gag ttc ttc tgg aca att tta aaa ccg aat gat gcc atc aat    768
Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
            245                     250                 255
ttc gag agt aat ggg aat ttc att gct cca gaa tat gca tac aaa att    816
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
gtc aag aaa ggg gac tca gca att atg aaa agt gaa ttg gaa tat ggt    864
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
aac tgc aac acc aag tgt caa act cca atg ggg gcg ata aac tct agt    912
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
atg cca ttc cac aac ata cac cct ctc acc atc ggg gaa tgc ccc aaa    960
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
tat gtg aaa tca aac aga tta gtc ctt gcg act ggg ctc aga aat acc    1008
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr
                325                 330                 335
cct cat aga gag aga aga aga aaa aag aga gga cta ttt gga gct ata    1056
Pro His Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
gca ggt ttt ata gag gga gga tgg cag gga atg gta gat ggt tgg tat    1104
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
ggg tac cac cat agc aat gag cag ggg agt gga tac gct gca gac aaa    1152
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
gaa tcc gct caa aag gca ata gat gga gtc acc aat aag gtc aac tcg    1200
Glu Ser Ala Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
atc att gac aaa atg aac act cag ttt gag gcc gtt gga cgg gaa ttt    1248
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405         410                         415
aat aac tta gaa agg agg ata gaa aat tta aac aag aag atg gaa gac    1296
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
gga ttc cta gat gtc tgg act tat aat gct gaa ctt ctg gtt ctc atg    1344
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
gaa aat gag agg act cta gac ttt cat gac tca aat gtc agg aac ctt    1392
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Arg Asn Leu
    450                 455                 460
tac gac aag gtc cga cta cag ctt agg gat aat gca aag gag ctg ggt    1440
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
aat ggt tgt ttc gag ttc tat cac aaa tgt gat aat gaa tgt atg gaa    1488
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
agt gta aaa aac gga acg tat gac tac ccg cag tat tca gaa gaa gca    1536
Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
aga cta aac aga gag gaa ata agt gga gta aaa ttg gaa tca atg gga    1584
Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly
        515                 520                 525
act tac caa ata ctg tca att tat tca aca gtg gcg agt tcc cta gca    1632
Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
ctg gca atc atg gta gct ggt cta tct tta tgg atg tgc tcc aat gga    1680
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
tcg tta cag tgc aga att tgc atc taa                                1707
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565
3、根据权利要求1所述的多价禽流感重组活载体疫苗，其特征在于：用Sal I和Hind III消化pUCm-IL18质粒，回收IL-18片段；用Sal I和Hind III消化pUTA-16-LacZ质粒，把IL-18片段定向到克隆于该表达载体单一启动子下游，构建pUTAL-IL18重组质粒；然后用Sal I和EcoR V把H5亚型AIV HA基因从pUCm-H5质粒切出，去磷和补平。用Sma I消化已构建好的pUTAL-IL18，去磷，把该AIVHA基因插入到线性化的pUTAL-IL18质粒载体复合启动子下游，构建pUTAL-H5-IL18重组质粒。
4、根据权利要求1所述的多价禽流感重组活载体疫苗，其特征在于：用Sal I和Hind III消化pUCm-IL18质粒，回收IL-18片段；用Sal I和Hind III消化pUTA-16-LacZ质粒，把IL-18片段定向到克隆于该表达载体单一启动子下游，构建pUTAL-IL18重组质粒；并用Sma I线性化用Sal I和BamHI消化pMD18-T-H7质粒，回收H7亚型AIV HA基因片段并补平；用BamHI消化pUCm-H5，补平后与上述H7亚型AIV HA基因片段连接，筛选插入方向与PUCm-H5中HA基因表达方向相同的重组质粒，使H7亚型AIV HA基因片段与H5亚型AIVHA基因片段共同拥有一个完整的阅读框架，从而构建出pUCm-H5-H7重组质粒；用Sal I和EcoRV消化pUCm-H5-H7，切出H5-H7基因片段并补平，之后连接到线性化的pUTAL-IL18重组质粒，使其位于该载体的复合启动子的下游从而构建出pUTAL-H5-H7-IL18重组转移载体。
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