CN102321634A - 一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法。根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法包括以下步骤：1)构建包含水貂肠炎细小病毒VP2基因或优化基因的杆状病毒转移载体，其中，是按家蚕的密码子频率进行密码子优化；2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的水貂肠炎细小病毒VP2蛋白组装的空衣壳抗原颗粒，收获并纯化所表达的抗原。本发明方法可以大幅度降低水貂肠炎细小病毒VP2抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。

Description

一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法。

背景技术

水貂病毒性肠炎，是由水貂肠炎细小病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)引起的以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性和高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率。在自然条件下，不同品种和不同年龄的水貂均有感染性，幼貂的感染性极强，病貂的年龄愈小，死亡率愈高。幼貂发病率为50％-60％，致死率高达90％，成年貂多呈慢性经过或隐性感染，发病率为13.8％-85.4％，死亡率高达80％。由MEV引起的水貂病毒性肠炎存在于世界各养貂国家，本病最早于1949年由Schofield报道于加拿大(Schofield F W，Vims enteritis in mink.Am Vet，30：651-654，1949)，1952年由Wills分离鉴定了病原，并命名为水貂肠炎病毒。随着毛皮动物饲养业的发展，病毒性肠炎己经成为危害水貂饲养业的三大疫病之一，给养貂业带来巨大的经济损失(高云等，水貂病毒性肠炎(MEV)流行病学调查及防治，特产科学实验，(4)33-34.1984)。

MEV病毒呈20面立体对称结构，直径20nm～24nm，无囊膜，其基因组为单股线性DNA分子，基因组长约5064nt，是动物DNA病毒中最小的。水貂肠炎细小病毒VP2蛋白是该病毒的主要结构蛋白，病毒的主要抗原位点均在VP2蛋白上，VP2几个碱基和氨基酸的改变就会影响病毒的生物学特征(Steinel A，et a1，Genetic characterizatinn offeline parvovirus sequences from various carnivores，J Gen ViroL，81(2)：345-350，2000)。MEV不能在鸡胚组织中增殖，能在猫肾细胞系等多种猫源细胞培养物及水貂肾、脾、心肌细胞株培养中增殖，产生细胞病变(吴志明等，动物疫病防控知识宝典，北京：中国农业出版社，358-360，2006)。MEV的血凝性较弱，仅在4℃，pH6.0～7.2条件下对猪和恒河猴的红细胞有凝集作用，也能凝集马和猫的红细胞，但Rivera等分离的MEV-S株对猪、猴或马、牛、恒河猴的红细胞均不表现凝集作用(廖国安，水貂病毒性肠炎，中国预防兽医学报，12(2)：53-55，1990)。

患此病的水貂主要的症状是腹泻，临床上分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。最急性病貂只表现拒食，不见肠炎症状，于12-24h死亡。根据病变特点可作出初步诊断，结合实验室检测病死水貂组织中的病毒抗原进行确诊，主要用血凝实验(HA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫电镜技术及分子生物学方法。

目前，MEV基因工程疫苗研究仍然存在一些问题：大肠杆菌表达的MEV-VP2蛋白具有不可溶性及免疫效果相对较差的缺点，其应用前景并不乐观；重组病毒疫苗存在向环境扩散经遗传修饰的生物体安全问题；采用转基因植物生产MEV-VP2蛋白的表达水平目前还不理想；因而研制MEV安全、高效的新型疫苗势在必行。

近年来，应用病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗的抗原载体越来越受到广大科学家的重视。VLPs常可以诱导产生较灭活疫苗和可溶性多肽更为强烈的体液免疫应答，因为其表面是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原呈递过程来呈递糖蛋白抗原的，而该法提呈引起的免疫应答优于溶解状态，故在保护作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫应答可望更接近自然感染，这样，病毒样颗粒更有可能广泛用于疫苗的研制。而且，VLPs由于不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原载体(Nagesha H S，Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers，ArchVirol，144：2429-2439，1999)。

昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)自1983年建立以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)，已有近千种外源基因在该系统中得到表达。其优点为：A：BEVS表达效率高，表达产物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似；B：家蚕杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；C：应用晚晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使重组基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平；D：借多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达2个或更多个外源蛋白，研究肽链超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能；E：杆状病毒对脊椎动物无病原性，家蚕没有与人畜共患的疾病，被认为遗传学上是安全的表达载体(景志忠等，中国兽医科技，31：43-45，2001)。

家蚕BmNPV表达系统(家蚕生物反应器)自1984年开发以来已在医学、兽医学和农业上得到广泛的应用。如口蹄疫病毒等数十种动物病毒抗原蛋白先后被表达和纯化，其中相当一部分正在进行商品化开发(李志勇等，Plos one，e2273，2008，木村滋，昆虫生物工厂[M]，日本：工业调查会，2000，124-127)。

现今家蚕杆状病毒表达系统的有关技术已相对成熟，该系统表达外源基因，不仅经济、高效，而且可提供一条新的技术途径。利用家蚕生物反应器生产水貂肠炎细小病毒VP2抗原，保证其具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性，为水貂肠炎细小病毒疫苗的商业生产奠定基础。

发明内容

本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达水貂肠炎细小病毒VP2抗原并能自主组装成MEV病毒空衣壳颗粒的方法。

本发明的另一目的是提供水貂肠炎细小病毒VP2优化基因。

本发明的再一目的是提供包含水貂肠炎细小病毒VP2基因或上述优化基因的杆状病毒转移载体、及重组杆状病毒。

本发明的再一目的是提供制备水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的昆虫生物反应器。

本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原。

本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原作为疫苗的应用。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒VP2优化基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步，本发明提供了包含水貂肠炎细小病毒VP2基因或上述优化基因的杆状病毒转移载体。

本发明还提供了通过使用上述的杆状病毒转移载体感染杆状病毒获得的重组杆状病毒。

本发明还提供了制备水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的昆虫生物反应器，通过使用上述重组杆状病毒感染昆虫宿主获得。

因此，根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法包括以下步骤：

1)构建包含水貂肠炎细小病毒VP2基因或上述优化基因的杆状病毒转移载体，其中，是按家蚕的密码子频率进行密码子优化；

2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；

3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；

4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的水貂肠炎细小病毒VP2蛋白组装的空衣壳抗原颗粒，收获并纯化所表达的抗原。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的水貂肠炎细小病毒VP2基因的原始序列及经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其编码的病毒VP2的氨基酸序列SEQ ID NO.3。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法包括，其中，所述的杆状病毒转移载体优选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bacto Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII(pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、或pUAC-5，或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为pVL1393杆状病毒运载载体。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所构建的转移载体为带有水貂肠炎细小病毒VP2基因原始序列的载体pVL1393-MEV-VP2和带有水貂肠炎细小病毒VP2基因经密码子优化后序列的载体pVL1393-MEV-VP2-O。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的杆状病毒优选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV，更优选为家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述的重组杆状病毒选自以下任意一种重组病毒：(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-MEV-VP2，(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-MEV-VP2-O。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的昆虫宿主选自鳞翅目昆虫，如家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoplca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothisvirescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更优选为家蚕(Bombyx mori)。

根据本发明的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体(更优选为：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含MEV-VP2抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆)；其中，所述的蛹体最优为1-2天的早期嫩蛹。

本发明采用基因重组技术，对水貂肠炎细小病毒(MEV)的VP2蛋白基因序列进行密码子优化，将该蛋白的原始序列(SEQ ID NO：1)及优化后的序列(SEQ ID NO：2)克隆到杆状病毒转移载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，使MEV-VP2蛋白的原始序列及优化后的序列整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒；重组病毒可通过添食或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产水貂肠炎细小病毒VP2抗原。

根据本发明的优选实施方式，对水貂肠炎细小病毒(MEV)的VP2衣壳蛋白基因序列进行密码子优化，将该蛋白的原始序列及优化后的序列，即SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的碱基序列克隆到杆状病毒运载载体pVL1393上，再通过体内重组将水貂肠炎细小病毒VP2蛋白基因的原始序列及密码子优化后的序列VP2-O分别转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带水貂肠炎细小病毒VP2基因的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2)和rBmNPV(MEV-VP2-O)；将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(MEV-VP2)和rBmNPV(MEV-VP2-O)；当rBmNPV(MEV-VP2)和rBmNPV(MEV-VP2-O)在蚕体内复制时，VP2及VP2-O基因在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下高效表达，并能自我组装成为病毒样粒子；在感染3-6天(最佳为5天，25度饲养温度)后收集含水貂肠炎细小病毒VP2抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，经过辐射照射杀灭杆状病毒、蛋白纯化后便得到安全、高效的水貂肠炎细小病毒VP2空衣壳抗原颗粒，此抗原可用于制备预防水貂病毒性肠炎的疫苗。

本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产水貂肠炎细小病毒VP2抗原，其生产成本显著低于传统的制备水貂肠炎细小病毒VP2抗原的方法，建厂，三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。

总体而言，本发明方法可以大幅度降低水貂肠炎细小病毒VP2抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。

附图说明

图1为家蚕生物反应器表达的MEV-VP2病毒样粒子的电镜扫描图；

图2为家蚕生物反应器表达的MEV-VP2免疫金标记电镜扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图详细产生本发明，本领域的普通技术人员可以理解这些实例完全是例证性的，不限制本发明的保护范围。

实验材料

克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；原核表达载体pET-28a⁺、受体菌E.coliTOP10和BL21(DE3)均为常规菌株购自Novagen公司，，运载载体pVL1393购自于Invitrogen公司；水貂肠炎细小病毒VP2基因的原始序列是取自发病动物粪便中提取模板D N A，经PCR扩增并克隆到载体上得到，密码子优化后的序列VP2-O直接基因合成得到；家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8由中国科学院生命科学院吴祥甫研究员惠赠，中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保；高表达家蚕品种JY1由中国农业科学院蚕业科学研究所选育，中国农业科学院生物技术研究所保存。

酶与试剂：所用限制性内切酶和配套的缓冲液均购自Promega公司；T4DNALigase及缓冲液为Promega公司产品；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs购自Sigma公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGenBiotech公司产品。

生化试剂：bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N，N，N′，N′-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)、细胞培养基TC-100购自GIBCO公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；琼脂粉为日本进口分装；Ni-NTA树脂、Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物均由三博远志生物技术有限责任公司合成

培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕细胞培养基为TC-100培养基。

水貂肠炎细小病毒VP2基因表达产物的动物实验在隔离实验室进行。

实施例1、水貂肠炎细小病毒VP2基因的原始序列在家蚕生物反应器中的可溶性表达及表达产物的检测

1、水貂肠炎细小病毒VP2基因克隆测序

取发病水貂粪便，反复冻融数次后，取5000rpm离心10分钟后的上清液，加入等体积的裂解缓冲液(20mmol Tris，20mmol EDTA，1％SDS)，然后加入蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，56℃水浴30min。用等体积的Tris-cl饱和酚、酚/氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，12000rpm，离心5min。取上清加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min，12000rpm，10min，弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤1次，自然干燥后，加入100μl TER(含RNase)溶解。

设计引物，通过PCR的方法扩增出水貂肠炎细小病毒VP2基因的原始序列(SEQID NO：1)。所设计特异引物为：

MEV-VP2-F：5′-GCGGATCCAACATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3′(BamHI)MEV-VP2-R：5′-GCTCTAGATTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTT-3′(Xba I)。

PCR扩增结束后，取5.0uL反应产物进行1.0％的TAE琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含有0.5μg/mL的溴化乙锭，电泳缓冲液为0.5×TAE，100V，大约20min后于紫外凝胶成像系统观察片段大小，与标准的DNA Marker比较，结果显示成功扩增MEV-VP2基因，大小与预期一致。

纯化回收PCR产物与克隆载体(pMD18-T vector)连接，取连接产物加入感受态细胞(E.coli)中。鉴定选出阳性重组质粒，取少量鉴定为阳性克隆菌液送至北京三博远志生物技术有限公司测序部进行测序，测序结果用DNAStar、DNAMAN等软件对序列进行比对分析。结果显示PCR扩增的序列与理论序列一致，没有移码或突变，得SEQ IDNO.1，进行蛋白翻译后得SEQ ID NO.3。

2、杆状病毒转移载体pVL1393-MEV-VP2的构建

测序鉴定正确的重组质粒pMD-18T-MEV-VP2用BamH I和Xba I双酶，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。真核表达载体质粒pVL1393作同样酶切处理。酶切回收的MEV-VP2目的片段与酶切后的转移载体pVL1393连接。重组质粒经酶切和基因测序进行鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-MEV-VP2。

3、家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备

按GIBCO公司产品说明配制培养基，在27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8感染对数生长期的蚕细胞BmN，感染复数为1，3～4天后收集病毒感染液，离心(5000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，抽提病毒DNA，放4℃保存备用。

4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2)的构建和获得

接种大约1×10⁶细胞于15cm²培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2μg杆状病毒转移载体pVL1393-MEV-VP2DNA和5ul脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μlFBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmNPV(MEV-VP2)的筛选。将不含有多角体的空斑挑选出来，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2)。

将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmNPV(MEV-VP2)。

利用PCR方法分析外源基因整合，寡核苷酸引物为：

MEV-VP2-F：5′-GCGGATCCAACATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3′(BamH I)

MEV-VP2-R：5′-GCTCTAGATTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTT-3′(Xba I)。

PCR产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。

5、MEV-VP2在家蚕蛹和蚕体中高效表达

所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵rBmNPV(MEV-VP2)，4-5天后收集发病蚕血及蚕蛹，-20℃冻存用于检测。

6、MEV-VP2病毒样颗粒的初步纯化

将含表达有MEV-VP2的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1∶9)在匀浆器中研磨后，超声破碎，12000rpm离心以去除碎片，上清用0.45μm滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×10⁵g超高速离心3小时。用含0.1M NaCl的Tris-HCL(PH7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，即得到病毒样粒子，纯度可达85％以上。

7、表达产物的检测

(1)ELISA及Western blotting检测

ELISA方法检测MEV-VP2抗原蛋白在蚕血(和蚕蛹)中表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血(和蚕蛹)作为阴性对照，原核表达的MEV-VP2蛋白免疫新西兰大白兔之后的兔血清为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗。将发病蚕血(和蚕蛹)用包被液做梯度稀释，从50×两倍倍比稀释到6400倍，各取100μL包被到酶标板上。结果如表1，表明MEV-VP2基因在家蚕中表达量高，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。

表1  ELISA检测家蚕生物反应器表达的VP2蛋白

Western blotting结果表明在重组病毒感染后家蚕血淋巴及蚕蛹样品中可检测到65kD左右的特异性条带。

(2)蚕蛹表达MEV-VP2抗原的血凝实验检测

取猪红细胞于阿氏液中保存，用20被体积的生理盐水洗涤红细胞三次，最后将红细胞用生理盐水配成1％悬液。在U形板的每空加入灭菌的生理盐水50ul；取50μl稀释50倍的蚕蛹样品加入第1孔内，混匀后，吸取50μl后加入到第二孔中，如此连续稀释至适当比例，最后一孔吸取50μl液体弃掉；另取两孔为生理盐水对照，阴性蚕血按相同方法稀释。每孔加入50μl 1％猪红细胞悬液，混匀后，4℃下反应45分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。实验结果显示蚕血及蚕蛹表达产物的病毒粒子经初步纯化后的样品稀释到25600倍时仍为阳性。

8、动物免疫实验及病毒攻击保护实验

选取血凝抑制抗体效价(HI)≤1∶4的3～4月龄健康水貂为实验对象。取5只进行注射免疫(粗纯化的5微克VP2抗原与等体积的油佐剂混合后皮下肌肉注射，1ml/只)，5只进行口服免疫(粗纯化的VP2抗原与等体积的含30％脂肪酸和10％蜂胶的乳化剂混合混合，经超声波乳化后灌喂)，5只进行MEV病毒细胞灭活疫苗免疫(阳性对照)，5只不免疫(阴性对照)。免疫21天后取血，进行ELISA抗体效价检测，注射和口服均产生针对VP2蛋白的抗体，注射组效价可达3200倍以上，口服组效价也达到近1600倍，对照组均没有检测到抗体。取血后进行强毒攻击实验，并每天收取粪便进行检测。实验组注射和口服抗原的水貂均没有出现发病迹象，所有粪便样品中均不存在MEV病毒粒子，而对照组攻毒后第4天开始出现厌食、呕吐，初期排稀便，之后出现套管样便和血便，体温升高40℃左右，表现典型的水貂病毒性肠炎症状，攻毒后1周内全部死亡。剖检水貂尸体发现脱水、消瘦，肠道充血。测定接毒后的试验水貂粪便，从第三天开始检测到MEV病毒并逐渐增多，其HA滴度均在1∶512以上。实验结果显示用家蚕生物反应器表达的水貂肠炎细小病毒VP2组装的病毒空衣壳抗原粒子无论注射还是口服，均能使水貂体内产生保护抗体，避免受到病毒攻击。

实施例2、水貂肠炎细小病毒VP2基因经密码子优化后的序列VP2-O在家蚕生物反应器中的可溶性表达及表达产物的检测

1、MEV-VP2基因序列的优化及鉴定

对实施例1测得的水貂肠炎细小病毒VP2基因原始序列根据家蚕密码子偏好性进行密码子优化，不改变氨基酸序列，优化后序列VP2-O如SEQ ID NO：2所示，原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列或者甚至解除翻译装置，优化后序列CAI值由0.85提高为0.89，调整了GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期，GC含量由35.21％调整为48.83％，那些影响mRNA稳定性及其与核糖体结合的茎环结构被破坏，直接合成优化后的序列VP2-O克隆到载体pUC57上，两端分别带有BamHI、XbaI酶切位点，经测序得SEQ ID No.2和翻译后得SEQ ID No.3。

2、杆状病毒转移载体pVL1393-MEV-VP2-O的构建

按实施例1的方法，将鉴定正确的重组质粒pUC57-MEV-VP2-O用BamH I和Xba I双酶切，电泳回收目的片段，与pVL1393载体在T4连接酶的作用下进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞后，提取质粒进行酶切及测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-MEV-VP2-O。

3、家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备

同实施例1。

4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2-O)的构建和获得

接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2-O)。

将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(MEV-VP2-O)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(MEV-VP2-O)。利用PCR方法分析外源基因整合，寡核苷酸引物为：按优化的VP2-O基因序列内部设计两条鉴定序列：

VP2-O-F：5′-AACAGGAGATATTCAACGTAGTG-3′；

VP2-O-R：5′-GTATGTGTTGAAGATGTTCGTG-3′。

PCR结果证明获得了重组病毒。

5、MEV-VP2-O在家蚕蛹和蚕体中高效表达

所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10⁵rBmNPV(MEV-VP2-O)，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。

6、MEV-VP2-O病毒样颗粒的初步纯化。

方法同实施例1。

7、水貂肠炎细小病毒检测抗体的制备

在MEV-VP2-O基因内部设计一对引物，扩增241-1290bp共1050bp长的序列，扩增氨基酸位点为81-430。引物如下：

MEV-F：5′-CGGGATCCAGGGTGGTTGTCAACAATATGG-3′，(BamH I)

MEV-R：5′-CAAGCTTCTAGAGGACGTTGTCATTGGTAAC-3′，(HindIII)

(1)重组质粒pMD-18T-MEV的构建

以质粒pUC57-MEV-VP2-O为模板，PCR扩增目的片段，PCR纯化产物与克隆载体pMD-18T连接，得到重组质粒pMD-18T-MEV。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑斑培养进行重组质粒的鉴定，细胞破碎法快速鉴定后挑取质粒带退后的菌株，碱裂解法提取重组质粒用Bam HI/Hind III进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的重组菌菌液送北京三博远志生物技术有限公司进行DNA测序。结果表明重组质粒pMD-18T-MEV中的目的序列与先前质粒序列一致，没有发生移码突变并含有设计的酶切位点。

(2)重组质粒pET-28a-MEV的构建

测序正确的重组质粒pMD-18T-MEV经Bam HI/Hind III双酶切消化后，回收目的片段，将其连接到已被Bam HI/Hind III双酶切消化的表达载体pET-28a上，连接产物转化Top10感受态细胞，挑斑后先进行细胞破碎法快速鉴定，而后碱法少量快速抽提重组质粒pET-28a-MEV，用Bam HI/Hind III双酶切鉴定。结果显示目的片段已成功插入pET-28a的多克隆位点。

(3)重组质粒pET-28a-MEV在大肠杆菌中诱导表达

酶切正确的上述重组质粒pET-28a-MEV转化BL21感受态细胞，IPTG诱导4h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，结果显示与未诱导对照相比，出现明显表达条带。经超声破碎后，SDS-PAGE电泳分析显示表达的融合蛋白以包涵体形式存在。

(4)融合蛋白的纯化及其抗体的制备

挑取成功重组的表达菌株单菌落振荡培养后进行大量诱导表达，采用处理包涵体蛋白的相关溶液与方法将包涵体溶解后，用Ni⁺-NTA树脂层析柱纯化蛋白，分别用脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度洗脱，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析目标蛋白在洗脱液中的分布情况。结果显示脲NTA-100进行洗脱时，洗脱峰最大且条带单一。用灭菌小刀割下纯化条带蛋白，并切成1mm³的小胶块，进行质谱分析，方法为二级质谱的数据库搜索鉴定法，结果显示，样品蛋白序列检测覆盖率39.75％，有7段连续6个氨基酸以上的匹配，所以能够确定纯化蛋白就是目标基因的表达产物。将纯化的蛋白经超滤管浓缩至浓度大于1mg/ml，取至少3mg的融合蛋白进行SDS-PAGE后，割下目的条带，把胶粒磨碎后送于中科院动物实验中心，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

(5)多克隆抗体效价检测

4次免疫后获得多克隆抗体，用纯化的融合蛋白作包被抗原，用PBS稀释不同倍数100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200的多克隆抗血清作一抗，间接ELISA检测法测抗体效价，免疫前血清作阴性对照，测量OD492。(阳性-空白)/(阴性-空白)≥2.1，即为阳性。结果显示：自制的抗体在抗原蛋白浓度为10μg/ml时抗体的效价可达1∶3200。

8、表达产物的检测

(1)ELISA及Western blotting检测

方法同实施例1，实验结果如表2，表明优化后的MEV-VP2-O基因在家蚕(血和蛹)中的表达量比未优化的MEV-VP2基因高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。

表2  ELISA检测家蚕生物反应器中表达的MEV-VP2-O

Western blotting结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴和蚕蛹样品中均可检测到65kD左右的特异性条带。

(2)家蚕中表达的经序列优化后的水貂肠炎细小病毒VP2抗原的血凝实验检测方法同实施例1，实验结果显示蚕血及蚕蛹样品稀释至51200倍时仍为阳性。

(3)电镜及胶体金免疫电镜观察

将纯化后的MEV-VP2样品用水稀释10倍，放上铜网，滤纸吸干液体后用ddH₂O滴洗后再用滤纸吸干，将铜网置于醋酸铀液滴上，滤纸吸干液体后放入新的醋酸铀液滴上，重复3次后电镜观察，如图1，可观察到水貂肠炎细小病毒衣壳粒子，大小与预期相符。样品用水稀释40倍后放铜网，滤纸吸干液体后用ddH₂O滴洗后再用滤纸吸干，将铜网置于稀释的一抗液滴上约3min，滴洗后滤纸吸干，置于稀释的胶体金二抗液滴上，滴洗吸干后铜网置于醋酸铀液滴上，洗染3次后电镜观察，如图2，可观察到吸附胶体金的病毒样粒子。表明水貂肠炎细小病毒VP2蛋白能自主在家蚕体内组装为病毒空衣壳粒子。

9、动物免疫及攻毒实验

方法同实施例1，免疫21天后取血，进行ELISA抗体效价检测，注射和口服均产生针对VP2蛋白的抗体，注射组效价可达3200倍以上，口服组效价也达到近1600倍，对照组均没有检测到抗体。取血后进行强毒攻击实验，并每天收取粪便进行检测。实验组注射和口服抗原的水貂均没有出现发病迹象，所有粪便样品中均不存在MEV病毒粒子，没有出现血凝现象。而对照组攻毒后第4天开始出现厌食、呕吐，初期排稀便，之后出现套管样便和血便，体温升高40℃左右，表现典型的水貂病毒性肠炎症状，攻毒后1周内全部死亡。剖检水貂尸体发现脱水、消瘦，肠道充血。测定接毒后的试验水貂粪便，从第三天开始检测到MEV病毒并逐渐增多，其HA滴度均在1∶512以上。实验结果显示用家蚕生物反应器表达的水貂肠炎细小病毒VP2抗原无论注射还是口服，均能使水貂体内产生保护抗体，避免收到病毒攻击。实验表明MEV-VP2基因经序列优化后的表达产物与野生型VP2蛋白具有等同的功效，但表达量比野生型高出2～3倍。

Claims (10)

1.一种水貂肠炎细小病毒VP2优化基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.一种重组杆状病毒，其特征在于，通过使用包含水貂肠炎细小病毒VP2基因或权利要求1所述优化基因的杆状病毒转移载体DNA与杆状病毒DNA进行重组或转座反应后而获得。

3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒为包含水貂肠炎细小病毒VP2基因的重组家蚕核型多角体病毒BmNPV，或包含权利要求1所述优化基因的重组家蚕核型多角体病毒BmNPV。

4.一种制备水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的昆虫生物反应器，其特征在于，通过使用表达水貂肠炎细小病毒VP2基因或权利要求1所述优化基因的重组杆状病毒感染昆虫宿主获得。

5.一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)构建包含水貂肠炎细小病毒VP2基因或权利要求1所述优化基因的杆状病毒转移载体；

2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒进行共转染，获得重组杆状病毒；

3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；

4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的水貂肠炎细小病毒VP2蛋白组装的空衣壳抗原颗粒，收获并纯化所表达的抗原。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV，优选为家蚕核型多角体病毒BmNPV。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主选自鳞翅目昆虫，优选为家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoplca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothiszea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)，更优选为家蚕。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述的昆虫宿主是家蚕幼虫和蛹，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆。

9.根据权利要求5～8任一项所述的方法制备的水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原。

10.权利要求9所述水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原作为水貂病毒性肠炎疫苗的应用。

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