CN101121938B - 一种口蹄疫抗原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达口蹄疫抗原的方法，包括：将口蹄疫不同的基因组合分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移载体；用所构建的转移载体转染杆状病毒进行DNA重组，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行口蹄疫抗原表达；收集并纯化所表达的口蹄疫抗原。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产口蹄疫抗原，所制备的抗原安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。本发明制备口蹄疫抗原的方法无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少，其生产成本也显著低于传统制备口蹄疫抗原的方法，，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。

Description

一种口蹄疫抗原的制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备抗原的方法，尤其涉及一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达口蹄疫抗原的方法，属于基因工程领域。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。该病一旦爆发将对发病国造成巨大的经济损失，世界各国对该病的研究极为重视，国际兽医局将其列为A类传染病之首。口蹄疫属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，有A、O、C、Asia I、SA T1、SA T2和SA T3型7个血清型。目前我国口蹄疫的防制仍以预防为主。尽管传统疫苗在口蹄疫预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的口蹄疫分子疫苗仍显得非常必要。
随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达口蹄疫基因，可望达到大幅度提高口蹄疫抗原产量、降低生产成本的目的(Conneely O.M.，Biotechnology in the Feed Industry，T.P.Lyons(Ed)，Alltech Technical Publications.Nicholasville，K Y.57-66，1992)。
杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。利用此系统来生产口蹄疫抗原的优点在于：1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平。因而可大大降低口蹄疫抗原的生产成本并使通过基因工程方法大规模生产口蹄疫抗原成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为所表达的口蹄疫抗原具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性提供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达口蹄疫抗原的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种制备口蹄疫抗原的方法，包括：将口蹄疫不同的基因组合分别克隆到杆状病毒运载载体中，获得转移载体；用所获得的转移载体转染杆状病毒进行DNA重组，获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行口蹄疫抗原表达；收获并纯化所表达的抗原。
其中，所述的口蹄疫不同的基因组合优选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的碱基序列；
所述的杆状病毒运载载体优选自AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlucBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、pAc373，pAcAB3、pAcAB 4，PAcAS3，pAcC129，pAcC4，DZI，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF 8，pAcMP1、pAcMP2，pAcRP23、pAcRP 25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51，pAcVC2、pAcVC 3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、pBac2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985，pVTBac，pBM030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为pVL1393。
所构建的转移载体优选为pVL1393(P1-2A3C)、pVL1393(ORF)或pVL1393(VP1)。
所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、或TeNPV，优选为家蚕杆状病毒Bm-NPV-ZJ8；
所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种：(1)家蚕核型多角体病毒rBmNPV(ORF)，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1980；保藏时间是：2007年3月20日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；(2)家蚕核型多角体病毒rBmNPV(P1-2A3C)，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1979；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；(3)家蚕核型多角体病毒rBmNPV(VP1)，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1975；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
所述的昆虫宿主选自包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamiacynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更优选为家蚕(Bombyx mori)。
所述的感染是指重组杆状病毒通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体(更优选为：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含口蹄疫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆)；其中，所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。
本发明采用基因重组技术，将来源于口蹄疫病毒的不同基因组合，包括P1-2A3C、ORF、VP1构建到各种杆状病毒运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使口蹄疫病毒不同的基因组合，包括ORF、P1-2A3C、VP1基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，将口蹄疫病毒不同的基因组合，包括P1-2A3C、ORF、VP1整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产口蹄疫病毒抗原。
本发明中最优选的一个技术方案是：将SEQ ID NO：1(P1-2A3C)、SEQ IDNO：3(ORF)或SEQ ID NO：5(VP1)所示的碱基序列插入到运载载体pVL1393上，再通过体内重组将全长P1-2A3C、ORF、VP1基因转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带口蹄疫不同基因组合的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)。当rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)在蚕体内复制时，ORF、P1-2A3C、VP1在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生口蹄疫抗原。在感染3-6天(最佳为5天)后收集含口蹄疫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，每毫升蚕血淋巴可产生10毫克以上的口蹄疫抗原，杀灭感染性病原后，经过蛋白纯化后便得到安全、高效的口蹄疫抗原，此种抗原可用于制备疫苗。
本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产口蹄疫抗原，其生产成本显著低于传统的制备口蹄疫抗原方法(例如通过细胞繁殖病毒制备口蹄疫抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕已经我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。
总体而言，本发明方法可以大幅度降低口蹄疫抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。
附图说明
图1、口蹄疫病毒P1-2A3C在家蚕幼虫中的表达。
图2、口蹄疫病毒P1-2A3C在家蚕蛹中的表达。
图3、口蹄疫病毒全长ORF在家蚕幼虫中的表达。
图4、口蹄疫病毒全长ORF在家蚕蛹中的表达。
图5、口蹄疫病毒VP1在家蚕幼虫中的表达。
图6、口蹄疫病毒VP1在家蚕蛹中的表达。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
试验材料
1.大肠杆菌株E.coli TG1和DH5α购自Promega公司；运载载体pVL1393(购自Invitrogen公司)、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8由中国农业科学院生物技术研究所保存；口蹄疫病毒由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫国家参考实验室保存；抗原检测试剂盒由中国农业科学院兰州兽医研究所制备，家蚕品种JY1由中国农业科学院生物技术研究所保存。
2.酶与试剂：限制性内切酶、连接酶为Promega公司产品。
3.生化试剂：IPTG、X-Gal为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4 DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen公司，细胞培养基TC-100购于Sigma公司。
4.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家蚕细胞培养基为TC-100。
5.口蹄疫病毒基因不同组合表达产物的动物实验在中国农业科学院兰州兽医研究所动物隔离实验室进行。
实施例1口蹄疫抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验
1、P1-2A、3C基因的克隆和序列分析
1.1目的基因的获得
设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出口蹄疫病毒抗原蛋白P1-2A基因与非结构蛋白3C基因。
所设计的抗原蛋白P1-2A基因和非结构蛋白3C基因的扩增引物为，
P1-2A上游：5’-ATAGGATCCACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGCC-3’，
BamH I酶切位点
P1-2A下游：5’-CGCGAATTCTGACATGTCCTCCTGCATCTGGTTG-3’。
EcoR I酶切位点
3C上游：5’-GCGGAATTCAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGT-3’。
EcoR I酶切位点
3C下游：5’-ATAAGATCTCTACTCGTGGTGTGGTTCGGGAT-3’
BglII酶切位点
从口蹄疫病毒细胞培养液中提取总RNA。将提取的总RNA用Oligo(dT)18引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：
表1PCR反应条件
  加入物   体积
  灭菌ddH<sub>2</sub>O   33μl
  10×PCR Buffer   5μl
  2.5mM dNTP   4μl
  25mMMgCl<sub>2</sub>   3μl
  5‘引物   1μl
  3‘引物   1μl
  模板DNA   2μl
  Taq酶   1μl
  Total   50μl
PCR反应过程：94℃变性10分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃8分钟，共30个循环。最后延伸反应10分钟。
1.2.PCR产物的纯化
将PCR扩增的P1-2A、3C基因产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约2.4kb、0.7kb的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下：切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μl玻璃奶(Glass milk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进一步分析。
1.3.酶切与连接反应
酶切反应：纯化后的P1-2A用BamHI和EcoRI双酶切分析，反应总体积为50μl，其中纯化的PCR产物10μl，10×酶相应缓冲液5μl，两种酶各为1μl，无菌水补足体积。37℃反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65℃灭活10分钟。
连接反应：连接总体积15μl，PCR产物8μl，载体1μl，5×T4 DNA连接缓冲液3μl，T4 DNA连接酶1μl，无菌水补足体积，12～14℃连接过夜。
用相同的方法酶切3C、pGEM-3Z，并进行连接反应。
1.4.大肠杆菌的遗传转化
用75mM CaCl2制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤3中制备的连接混合物5μl，加到200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激2分钟，迅速置于冰上1～2分钟，加入已温育至37℃的LB培养基500μl，37℃培养1小时，取100～200μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。
1.5.质粒DNA的制备
(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃培养过夜。
(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3500rpm离心4min，去上清。
(3)加入Solution I 150μl，混匀后置于冰上15min。
(4)加入Solution II 300μl，氯仿150μl，轻轻混匀后静置5min。
(5)加入Solution III 450μl，混匀后置于冰上15min。
(6)11000g离心10min，上清移入新管。
(7)加入异丙醇450μl，混匀后置于4℃ 15min。
(8)11000g离心6min，去上清。
(9)加入TER 250μl，混匀后置于37℃ 20min。
(10)加入PPt Buffer 300～350μl，混匀后静置15min。
(11)11000g离心6min，去上清。
(12)加入75％乙醇400μl。
(13)11000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1×TE Buffer 40μl溶解，于-20℃保存。
1.6.重组子的鉴定
用BamHI/EcoRI双酶切1.5中制备的质粒DNA，电泳后出现约2.4kb、0.7kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒pGEM-3Z(P1-2A)。用EcoRI/BglII酶切1.5中制备的质粒DNA，电泳后出现0.7kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒pGEM-3Z(3C)。将重组质粒pGEM-3Z(P1-2A)、pGEM-3Z(3C)进行双向测序。P1-2A3C基因序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
2、转移载体pVL1393(P1-2A3C)的构建
将1.6中所制备的质粒pGEM-3Z(P1-2A)用BamHI和EcoRI双酶切，用1.2中的方法纯化P1-2A基因片段，与经BamHI和EcoRI双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(P1-2A)。将1.6中制备的质粒pGEM-3Z(3C)用EcoRI和BglII双酶切，按1.2的方法纯化3C基因片段，与经EcoRI和BglII双酶切的杆状病毒转移质粒pVL1393(P1-2A)连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(P1-2A3C)。
3、家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备
按GIBCO公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2 N NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，3～4天后收集病毒感染液，离心(5000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3 M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。
4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)的构建和获得
4.1重组杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8 DNA，2μg重组转移质粒pVL1393(P1-2A3C)DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)的筛选和纯化
接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)(其微生物保藏号是：CGMCC NO.1979)。
4.3重组病毒rBmNPV(P1-2A3C)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(P1-2A3C)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(P1-2A3C)。
4.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为：
5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3’
5’-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3’
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
5、P1-2A3C基因在家蚕中的表达
本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕接种约1.0×105rBmNP(P1-2A3C)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。96孔酶标板用兔抗口蹄疫阳性血清包被，4℃过夜。脱脂奶粉封闭后，将口蹄疫阳性抗原、感染rBmNPV(P1-2A3C)家蚕收获的蚕血、感染Bm-NPV-ZJ8的家蚕收获的蚕血做2倍梯度稀释。37℃作用1h后，洗涤，加入豚鼠抗FMDV阳性血清，37℃作用1h。洗涤后加入HRP-兔抗豚鼠IgG，37℃作用1h。加入底物OPD-H2O2，于37℃作用15min，用终止液结束反应，于λ492nm处测定OD值。结果如图1所示从感染rBmNPV(P1-2A3C)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
6、P1-2A3C基因在家蚕蛹体中表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕蛹接种约1.0×105rBmNPV(P1-2A3C)，4-5天后收集发病蚕蛹血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图2所示从感染rBmNPV(P1-2A3C)的家蚕蛹中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原的OD值变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
7、口蹄疫抗原的纯化
称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/L NaCl，pH8.0)洗至基线稳定。分别将上述5和6中所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液，收集至第一峰下降，将所收集的蛋白洗脱液合并，得纯化的口蹄疫抗原。
8、动物免疫实验及病毒攻击保护实验
将收集的纯化抗原与等体积油佐剂混合。取3ml/头颈部肌肉免疫牛。实验组免疫5头牛，设立2头牛的对照组。在注射疫苗前，采用世界动物卫生组织标准方法液相阻断ELISA法对侯选牛进行抗体水平的检测，挑选其效价低于1/8的牛在兰州兽医研究所的隔离动物房进行实验
收集免疫后21 d的牛血清，采用液相阻断ELISA法检测牛血清中的抗FMDV抗体水平，所有的实验动物都取得了较高的抗体水平。采用10,000BID50的同源病毒接种牛舌，连续观测10d，检测唇部及四蹄发病情况，实验组的5头动物获得了全部保护，而对照组动物全部发病。
实施例2口蹄疫抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验
1、口蹄疫病毒全长ORF的克隆和序列分析
设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出口蹄疫病毒全长ORF(SEQ ID NO：3)。
所设计的扩增全长ORF的扩增引物为，
ORF：5’-GCGACTAGTACCATGGAATTCACACTTCACAACGGTGAG-3’，
Spe I酶切位点
ORF：5’-ATAGCGGCCGCAGGGATTATGCGTCACCGCACAC-3’。
Not I酶切位点
从口蹄疫病毒细胞培养液中提取总RNA。将提取的总RNA用Oligo(dT)18引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：
表2 PCR反应条件
    加入物     体积
    灭菌ddH<sub>2</sub>O     33μl
    10×PCR Buffer     5μl
    2.5mM dNTP     4μl
    25Mm MgCl<sub>2</sub>     3μl
    5‘引物     1μl
    3‘引物     1μl
    加入物     体积
    模板DNA     2μl
    Taq酶     1μl
    Total     50μl
PCR反应过程：94℃变性10分钟；94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 8分钟，共30个循环。最后延伸反应10分钟。
2、转移载体pVL1393(ORF)的构建
将中扩增得到的ORF按实施例1中1.2的方法纯化，用SpeI和NotI双酶切后，与经XbaI和NotI双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(ORF)。将重组质粒pVL1393(ORF)进行双向测序。ORF基因序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)的构建和获得
3.1、重组杆状病毒rBmNPV(ORF)的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8 DNA，2μg重组转移质粒pVL1393(ORF)DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5 ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)的筛选和纯化
接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)(其微生物保藏号是：CGMCC NO.1980)。
3.3重组病毒rBmNPV(ORF)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ORF)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(ORF)。
3.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为：
5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3’
5’-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3’
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
4、ORF在家蚕中的表达
本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕接种约1.0×105rBmNPV(ORF)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。96孔酶标板用兔抗FMDV阳性血清包被，4℃过夜。脱脂奶粉封闭后，将FMDV抗原、感染rBmNPV(ORF)家蚕收获的蚕血、感染Bm-NPV-ZJ8的家蚕收获的蚕血做2倍梯度稀释。37℃作用1h后，洗涤，加入豚鼠抗FMDV阳性血清，37℃作用1h。洗涤后加入HRP-兔抗豚鼠IgG，37℃作用1h。加入底物OPD-H2O2，于37℃作用15min，用终止液结束反应，于λ492nm处测定OD值。结果如图3所示从感染rBmNPV(ORF)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原的OD值变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的10倍以上，而对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
5、ORF在家蚕蛹体中表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，饷食后48h选择平均体重相同的蚕蛹，每头蚕蛹接种约1.0×105pfu rBmNPV(ORF)，4-5天后收集发病蚕蛹血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图4所示从感感染rBmNPV(ORF)的蚕蛹中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的10倍以上，而对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
6、抗原纯化
称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/L NaCl，pH8.0)洗至基线稳定。分别将4和5所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液，收集至第一峰下降，合并蛋白洗脱液，得纯化抗原。
7、动物免疫实验及病毒攻击保护实验
将6所收集的纯化抗原与等体积油佐剂混合。取3ml/头颈部肌肉免疫牛。实验组免疫5头牛，设立2头牛的对照组。在注射疫苗前，采用世界动物卫生组织标准方法液相阻断ELISA法对侯选牛进行抗体水平的检测，挑选其效价低于1/8的牛在兰州兽医研究所的隔离动物房进行实验。
收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻断ELISA法检测牛血清中的抗FMDV抗体水平，所有的实验动物都取得了较高的抗体水平。采用10,000BID50的同源病毒接种牛舌，连续观测10d，检测唇部及四蹄发病情况，实验组的5头动物获得了4头保护，而对照组动物全部发病。
实施例3口蹄疫抗原的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验
1、FMDV VP1基因的克隆和序列分析
设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出口蹄疫病毒VP1基因。
所设计的扩增VP1基因的扩增引物为，
VP1上游：5’-ATAGGATCCACCATGGCCACCACTACCGGCGAGTCAG-3’，
BamH I酶切位点
VP1下游：5’-CGCGAATTCTTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3’。
EcoR I酶切位点
从口蹄疫病毒细胞培养液中提取总RNA。将提取的总RNA用Oligo(dT)18引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：
表3PCR反应条件
    加入物     体积
    灭菌ddH<sub>2</sub>O     33μl
    10×PCR Buffer     5μl
    2.5 Mm dNTP     4μl
    25 MmMgCl<sub>2</sub>     3μl
    5‘引物     1μl
    3‘引物     1μl
    模板DNA     2μl
    Taq酶     1μl
    Total     50μl
PCR反应过程：94℃变性10分钟；94℃ 1分钟，58℃ 1分，72℃ 1分钟，共30个循环。最后延伸反应10分钟。
2、转移载体pVL1393(VP1)的构建
按实施例1中1.2的方法纯化1所获得VP1基因片段，用BamHI和EcoRI双酶切后，与经同样双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载pVL1393(VP1)。将重组质粒pVL1393(VP1)进行双向测序。VP1基因序列及氨基酸序列分别见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)的构建和获得
3.1重组杆状病毒rBmNPV(VP1)的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8 DNA，2μg重组转移质粒pVL1393(VP1)DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)的筛选和纯化
接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)(其微生物保藏号是：CGMCC NO.1975)。
3.3重组病毒rBmNPV(VP1)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(VP1)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(VP1)。
3.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为：
5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3’
5’-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3’
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
4、VP1在家蚕中的表达
本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕，每头蚕接种约1.0×105rBmNPV(VP1)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图5所示从感染rBmNPV(VP1)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律阳性与对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
5、VP1基因在家蚕蛹体中表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，饷食后48h选择平均体重相同的蚕蛹，每头蚕蛹接种约1.0×105rBmNPV(VP1)，4-5天后收集发病蚕血淋巴，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。结果如图6所示从感染rBmNPV(ORF)的家蚕中收获的血淋巴OD值随倍比稀释度的增加逐渐下降，其变化规律与阳性对照传统细胞苗病毒抗原变化规律相同。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
6、抗原纯化
称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH 8.0)洗至基线稳定。分别将4和5所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液，收集至第一峰下降，合并蛋白洗脱液，得纯化抗原。
7、动物免疫实验及病毒攻击保护实验
将4或5收集的蚕血淋巴经超声波破碎，弃细胞碎片后，与等体积油佐剂混合。取3ml/头颈部肌肉免疫牛。实验组免疫5头牛，设立2头牛的对照组。在注射疫苗前，采用世界动物卫生组织标准方法液相阻断ELISA法对侯选牛进行抗体水平的检测，挑选其效价低于1/8的牛在兰州兽医研究所的隔离动物房进行实验
收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻断ELISA法检测牛血清中的抗口蹄疫抗体水平，所有的实验动物都取得了较高的抗体水平。采用10,000BID50的同源病毒接种牛舌，连续观测10d，检测唇部及四蹄发病情况，实验组的5头动物有4头得到保护，而对照组动物全部发病。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所  中国农业科学院生物技术研究所
<120>一种口蹄疫抗原的制备方法
<130>P0278
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3024
<212>DNA
<213>Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3024)
<223>
<400>1
gga gcc ggg caa tcc agc ccg gcg act ggg tca cag aac cag tca ggc    48
Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly
1               5                   10                  15
aac act gga agc atc atc aac aac tac tac atg cag caa tac cag aac    96
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn
            20                  25                  30
tcc atg gac aca caa ctt gga gac aac gct att agc gga ggc tcc aac    144
Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn
        35                  40                  45
gaa ggt tcc act gac acc acc tcc aca cac aca aac act acc caa aac    192
Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Thr Thr Gln Asn
    50                  55                  60
aac gat tgg ttc tcg cgc ctg gct agt tcc gcc ttc agc gga ctg ttc    240
Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe
65                  70                  75                  80
ggc gcg ctt ctg gct gac aag aaa acg gaa gaa aca act ttg ctt gaa    288
Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu
                85                  90                  95
gac cgc atc ctt acc acc agg aac ggc cac acg acg tcg acg acc cag    336
Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln
            100                 105                 110
tcg agc gtt ggc gtg aca tac ggt tac gct gtg gct gag gac gcg gta    384
Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp Ala Val
        115                 120                 125
tca gga cct aac acc tca ggt ctc gag acc cgt gtt caa caa gcg gag    432
Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Gln Gln Ala Glu
    130                 135                 140
cgg ttc ttc aaa aag cac ttg ttt gat tgg aca ccg aat ttg gct ttt    480
Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asn Leu Ala Phe
145                 150                 155                 160
gga tac tgt cac tac ctg gaa ctc ccc act gag cac aaa ggt gtg tat    528
Gly Tyr Cys His Tyr Leu Glu Leu Pro Thr Glu His Lys Gly Val Tyr
                165                 170                 175
ggc agt ctc atg gac tcg tac gcc tac atg aga aac ggg tgg gac ata    576
Gly Ser Leu Met Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Ile
            180                 185                 190
gag gtg act gct gtt gga aac cag ttc aac ggc ggt tgt ctc ctt gtt    624
Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val
        195                 200                 205
gca ctt gtg cca gag ctg aag agc ctt gac act cgg cag aaa tac caa    672
Ala Leu Val Pro Glu Leu Lys Ser Leu Asp Thr Arg Gln Lys Tyr Gln
    210                 215                 220
ctg acc ctt ttc ccc cat cag ttc atc aac cca cgc acc aac atg acg    720
Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr
225                 230                 235                 240
gcc cac atc aac gtg ccc ttt ata ggt gtt aac agg tat gac cag tac    768
Ala His Ile Asn Val Pro Phe Ile Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr
                245                 250                 255
atg ctc cac aaa ccg tgg acg ctt gtt gtg atg gtg gtg gcc cca ctc    816
Met Leu His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu
            260                 265                 270
act gtc aag act ggt ggc tct gaa cag atc aag gtc tac atg aat gca    864
Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met Asn Ala
        275                 280                 285
gca ccg acc tac gta cac gtg gca ggg gag ctc ccc tcg aaa gag ggg    912
Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly
    290                 295                 300
ata gtt ccc gtt gcg tgt gcg gac ggt tac ggt aac atg gtg acc acg    960
Ile Val Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val Thr Thr
305                 310                 315                 320
gac ccg aaa act gcc gac cca gtg tac ggg aaa gtg ttc aac ccc ccc    1008
Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro
                325                 330                 335
cgg acg aat ctc ccc ggg cgc ttc aca aac ttc ctt gat gtc gcg gag    1056
Arg Thr Asn Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu
            340                 345                 350
gcg tgt cca acc ttc ctc cgc ttc gga gaa gta cca ttt gtg aag acg    1104
Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro Phe Val Lys Thr
        355                 360                 365
gtg aac tct ggt gac cgt ttg cta gcc aag ttt gat gtc tcg ctc gct    1152
Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu Ala
    370                 375                 380
gcg ggc cat atg tcc aac acc tac ttg gct ggt ctg gcg cag tac tac    1200
Ala Gly His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr
385                 390                 395                 400
aca cag tac agt ggt acc atg aat gtt cac ttc atg ttc acc ggg ccc    1248
Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met Asn Val His Phe Met Phe Thr Gly Pro
                405                 410                 415
acg gat gcc aag gcc cgg tac atg gtg gcc tac att cct ccc ggc atg    1296
Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly Met
            420                 425                 430
aca ccg ccc aca gac cct gag cgc gcc gcc cac tgt atc cac tcc gag    1344
Thr Pro Pro Thr Asp Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile His Ser Glu
        435                 440                 445
tgg gac act ggt cta aac tcc aaa ttc acc ttt tcc ata ccc tac ctc    1392
Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Leu
    450                 455                 460
tct gct gct gac tac gca tac acc gcc tct gac acg gcg gag acc aca    1440
Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Thr
465                 470                 475                 480
agt gtg caa gga tgg gtg tgc atc tac cag atc acc cac ggc aag gct    1488
Ser Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly Lys Ala
                485                 490                 495
gaa gga gac gca ctg gtc gtt tct gtc agc gcc ggc aaa gac ttt gag    1536
Glu Gly Asp Ala Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu
            500                 505                 510
ttt cgc ctg ccc gtt gac gcg cgc cgg caa acc acc act acc ggc gag    1584
Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Arg Gln Thr Thr Thr Thr Gly Glu
        515                 520                 525
tca gca gac ccg gta aca acc acg gtc gag aac tac gga gga gaa act    1632
Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr
    530                 535                 540
cag aca gcc agg cgg ctt cac act gat gtt gcc ttc gtt ctt gac agg    1680
Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val Ala Phe Val Leu Asp Arg
545                 550                 555                 560
ttt gtg aaa ctc act gca ccc aag aac att cag acc ctt gac ctc atg    1728
Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ile Gln Thr Leu Asp Leu Met
                565                 570                 575
caa att ccc tca cac acg ctg gtt gga gca ctg ctg cgg tct gcg acg    1776
Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr
            580                 585                 590
tac tac ttc tca gac ctg gag gtt gcg att gtc cac aca ggc ccg atc    1824
Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Ile Val His Thr Gly Pro Ile
        595                 600                 605
acc tgg gtg ccc aac ggc tcg ccc aag gat gct cta gac aac cag acc    1872
Thr Trp Val Pro Asn Gly Ser Pro Lys Asp Ala Leu Asp Asn Gln Thr
    610                 615                 620
aac cca act gcc tac cag aag caa cct gtc acc cgc ttg gcg ctc ccc    1920
Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Val Thr Arg Leu Ala Leu Pro
625                 630                 635                 640
tac acc gcc ccc cat cgt gtg ctg gcg aca gtg tac aac ggg aag acg    1968
Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr
                645                 650                 655
acg tac ggg gaa aca acc gcg cgg cgt ggc gat acg gcg gcc ctt gca    2016
Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala Arg Arg Gly Asp Thr Ala Ala Leu Ala
            660                 665                 670
caa aga ctg agt ggg cgg ctg ccc acc tca ttt aac tac ggc gct gta    2064
Gln Arg Leu Ser Gly Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val
        675                 680                 685
aag gct gaa acc atc act gag ctt ttg att cgc atg aaa cgt gcg gag    2112
Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg Ala Glu
    690                 695                 700
aca tac tgc cct agg cct ttg cta gct ctt gac acc act cag gac cgc    2160
Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg
705                 710                 715                 720
cgt aaa cag aag atc att gca cct gga aag cag atg gtg aac ttt gac    2208
Arg Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Gly Lys Gln Met Val Asn Phe Asp
                725                 730                 735
ctg ctc aag ttg gca gga gac gtc gag tcc aac cct ggg ccc ttc ttc    2256
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe Phe
            740                 745                 750
ttc tcc gac gtc agg tcg aat ttt tcc aag ctg gtt gaa acc atc aac    2304
Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Glu Thr Ile Asn
        755                 760                 765
cag atg cag gag gac atg tca gaa ttc aag aaa cct gtc gct ttg aaa    2352
Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Glu Phe Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys
    770                 775                 780
gtg aaa gca aag aac ttg att gtc act gag agt ggt gct ccc ccg act    2400
Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr
785                 790                 795                 800
gac ttg caa aag atg gtc atg ggt aac acc aag cct gtt gag ctc atc    2448
Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile
                805                 810                 815
ctc gac ggg aag acg gtg gcc atc tgc cgc gcc acc gga gtg ttt ggt    2496
Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Arg Ala Thr Gly Val Phe Gly
            820                 825                 830
act gcc tac ctt gtt cct cgt cat ctc ttc gca gag aag tat gac gag    2544
Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Glu
        835                 840                 845
atc atg ctg gac ggc aga gcc atg aca gac agt gac tac aga gtg ttt    2592
Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe
    850                 855                 860
gag ttt gag att aaa gta aaa gga cag gac atg ctc tca gac gcc gcg    2640
Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala
865                 870                 875                 880
ctc atg gtg ctc cac cgt ggg aat cgc gtg cgg gac atc acg aag cac    2688
Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His
                885                 890                 895
ttc cgt gat gtg gca aga atg cag aaa ggc acc ccc gtc gtc ggc gta    2736
Phe Arg Asp Val Ala Arg Met Gln Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val
            900                 905                 910
atc aac aac gct gat gtt ggg aga ctg att ttc tct ggt gag gcc ctt    2784
Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu
        915                 920                 925
acc tac aag gac att gta gtg tgc atg gac gga gac acc atg ccc ggc    2832
Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly
    930                 935                 940
ctc ttc gcc tac aaa gct gcc acc aag gca ggt tac tgt gga gga gcc    2880
Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala
945                 950                 955                 960
gtt ctt gca aag gac gga gcc gag act ttc atc gtt ggc act cac tct    2928
Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Glu Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser
                965                 970                 975
gca ggt ggc aat gga gtt gga tac tgc tca tgc gtt tcc agg tct atg    2976
Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met
            980                 985                 990
ctg ctc aaa atg aag gca cac atc gat ccc gaa cca cac cac gag tag    3024
Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro His His Glu
        995                 1000                1005
<210>2
<211>1007
<212>PRT
<213>Foot-and-mouth disease virus
<400>2
Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly
1               5                   10                  15
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn
            20                  25                  30
Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn
        35                  40                  45
Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Thr Thr Gln Asn
    50                  55                  60
Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe
65                  70                  75                  80
Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu
                85                  90                  95
Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln
            100                 105                 110
Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp Ala Val
        115                 120                 125
Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Gln Gln Ala G1u
    130                 135                 140
Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asn Leu Ala Phe
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Cys His Tyr Leu Glu Leu Pro Thr Glu His Lys Gly Val Tyr
                165                 170                 175
Gly Ser Leu Met Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Ile
            180                 185                 190
Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val
        195                 200                 205
Ala Leu Val Pro Glu Leu Lys Ser Leu Asp Thr Arg Gln Lys Tyr Gln
    210                 215                 220
Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr
225                 230                 235                 240
Ala His Ile Asn Val Pro Phe Ile Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr
                245                 250                 255
Met Leu His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu
            260                 265                 270
Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met Asn Ala
        275                 280                 285
Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly
    290                 295                 300
Ile Val Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val Thr Thr
305                 310                 315                 320
Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro
                325                 330                 335
Arg Thr Asn Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu
            340                 345                 350
Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro Phe Val Lys Thr
        355                 360                 365
Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu Ala
    370                 375                 380
Ala Gly His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr
385                 390                 395                 400
Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met Asn Val His Phe Met Phe Thr Gly Pro
                405                 410                 415
Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly Met
            420                 425                 430
Thr Pro Pro Thr Asp Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile His Ser Glu
        435                 440                 445
Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Leu
    450                 455                 460
Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Thr
465                 470                 475                 480
Ser Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly Lys Ala
                485                 490                 495
Glu Gly Asp Ala Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu
            500                 505                 510
Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Arg Gln Thr Thr Thr Thr Gly Glu
        515                 520                 525
Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr
    530                 535                 540
Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val Ala Phe Val Leu Asp Arg
545                 550                 555                 560
Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ile Gln Thr Leu Asp Leu Met
                565                 570                 575
Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr
            580                 585                 590
Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Ile Val His Thr Gly Pro Ile
        595                 600                 605
Thr Trp Val Pro Asn Gly Ser Pro Lys Asp Ala Leu Asp Asn Gln Thr
    610                 615                 620
Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Val Thr Arg Leu Ala Leu Pro
625                 630                 635                 640
Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr
                645                 650                 655
Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala Arg Arg Gly Asp Thr Ala Ala Leu Ala
            660                 665                 670
Gln Arg Leu Ser Gly Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val
        675                 680                 685
Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg Ala Glu
    690                 695                 700
Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg
705                 710                 715                 720
Arg Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Gly Lys Gln Met Val Asn Phe Asp
                725                 730                 735
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe Phe
            740                 745                 750
Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Glu Thr Ile Asn
        755                 760                 765
Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Glu Phe Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys
    770                 775                 780
Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr
785                 790                 795                 800
Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile
                805                 810                 815
Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Arg Ala Thr Gly Val Phe Gly
            820                 825                 830
Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Glu
        835                 840                 845
Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe
    850                 855                 860
Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala
865                 870                 875                 880
Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His
                885                 890                 895
Phe Arg Asp Val Ala Arg Met Gln Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val
            900                 905                 910
Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu
        915                 920                 925
Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly
    930                 935                 940
Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala
945                 950                 955                 960
Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Glu Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser
                965                 970                 975
Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met
            980                 985                 990
Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile  Asp Pro Glu Pro His  His Glu
        995                 1000                 1005
<210>3
<211>6990
<212>DNA
<213>Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(6990)
<223>
<400>3
atg agc acg act gat tgt ttt atc gct ttg ttg tac gct ttt aga gag    48
Met Ser Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Leu Tyr Ala Phe Arg Glu
1               5                   10                  15
atc aaa aca ctg ttc tta tca cgt gca caa ggc aag atg gaa ttc aca    96
Ile Lys Thr Leu Phe Leu Ser Arg Ala Gln Gly Lys Met Glu Phe Thr
            20                  25                  30
ctt cac aac ggt gag aag aaa aca ttc tac tcc agg ccc aat aac cac    144
Leu His Asn Gly Glu Lys Lys Thr Phe Tyr Ser Arg Pro Asn Asn His
        35                  40                  45
gac aac tgc tgg ttg aac acc atc ctc cag ttg ttt agg tac gtc gat    192
Asp Asn Cys Trp Leu Asn Thr Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Asp
    50                  55                  60
gaa cct ttc ttc gac tgg gtc tac aac tcc ccc gag aat ctc aca ctt    240
Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Asn Ser Pro Glu Asn Leu Thr Leu
65                  70                  75                  80
gat gcc atc aaa caa ctg gaa gaa att act ggt ctt gag ctg cac gag    288
Asp Ala Ile Lys Gln Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu Glu Leu His Glu
                85                  90                  95
ggt gga cca ccc gct ctc gtt att tgg aac atc aaa cac ctg ctc agc    336
Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His Leu Leu Ser
            100                 105                 110
acc gga atc ggc acc gct tcg cga ccc agc gaa gtg tgc atg gta gac    384
Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Met Val Asp
        115                 120                 125
ggg acg gac atg tgt ttg gct gac ttc cat gct ggc att ttc ctg aaa    432
Gly Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys
    130                 135                 140
gga cag gaa cac gct gtg ttc gcc tgc gtc acc tcc aat ggg tgg tac    480
Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asn Gly Trp Tyr
145                 150                 155                 160
gcg att gac gac gaa gac ttt tac ccc tgg acg ccg gac ccg tcc gac    528
Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp Pro Ser Asp
                165                 170                 175
gtt ctg gtg ttt gtc ccg tac gat caa gag cca ctc aac gga gaa tgg    576
Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn Gly Glu Trp
            180                 185                 190
aaa gca aag gtc cag aga cgg ctc aga gga gcc ggg caa tcc agc ccg    624
Lys Ala Lys Val Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro
        195                 200                 205
gcg act ggg tca cag aac cag tca ggc aac act gga agc atc atc aac    672
Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn
    210                 215                 220
aac tac tac atg cag caa tac cag aac tcc atg gac aca caa ctt gga    720
Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly
225                 230                 235                 240
gac aac gct att agc gga ggc tcc aac gaa ggt tcc act gac acc acc    768
Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr
                245                 250                 255
tcc aca cac aca aac act acc caa aac aac gat tgg ttc tcg cgc ctg    816
Ser Thr His Thr Asn Thr Thr Gln Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu
            260                 265                 270
gct agt tcc gcc ttc agc gga ctg ttc ggc gcg ctt ctg gct gac aag    864
Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys
        275                 280                 285
aaa acg gaa gaa aca act ttg ctt gaa gac cgc atc ctt acc acc agg    912
Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg
    290                 295                 300
aac ggc cac acg acg tcg acg acc cag tcg agc gtt ggc gtg aca tac    960
Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr
305                 310                 315                 320
ggt tac gct gtg gct gag gac gcg gta tca gga cct aac acc tca ggt    1008
Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly
                325                 330                 335
ctc gag acc cgt gtt caa caa gcg gag cgg ttc ttc aaa aag cac ttg    1056
Leu Glu Thr Arg Val Gln Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu
            340                 345                 350
ttt gat tgg aca ccg aat ttg gct ttt gga tac tgt cac tac ctg gaa    1104
Phe Asp Trp Thr Pro Asn Leu Ala Phe Gly Tyr Cys His Tyr Leu Glu
        355                 360                 365
ctc ccc act gag cac aaa ggt gtg tat ggc agt ctc atg gac tcg tac    1152
Leu Pro Thr Glu His Lys Gly Val Tyr Gly Ser Leu Met Asp Ser Tyr
    370                 375                 380
gcc tac atg aga aac ggg tgg gac ata gag gtg act gct gtt gga aac    1200
Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Ile Glu Val Thr Ala Val Gly Asn
385                 390                 395                 400
cag ttc aac ggc ggt tgt ctc ctt gtt gca ctt gtg cca gag ctg aag    1248
Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Leu Val Pro Glu Leu Lys
                405                 410                 415
agc ctt gac act cgg cag aaa tac caa ctg acc ctt ttc ccc cat cag    1296
Ser Leu Asp Thr Arg Gln Lys Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln
            420                 425                 430
ttc atc aac cca cgc acc aac atg acg gcc cac atc aac gtg ccc ttt    1344
Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Asn Val Pro Phe
        435                 440                 445
ata ggt gtt aac agg tat gac cag tac atg ctc cac aaa ccg tgg acg    1392
Ile Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Met Leu His Lys Pro Trp Thr
    450                 455                 460
ctt gtt gtg atg gtg gtg gcc cca ctc act gtc aag act ggt ggc tct    1440
Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser
465                 470                 475                 480
gaa cag atc aag gtc tac atg aat gca gca ccg acc tac gta cac gtg    1488
Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met Asn Ala Ala Pro Thr Tyr Val His Val
                485                 490                 495
gca ggg gag ctc ccc tcg aaa gag ggg ata gtt ccc gtt gcg tgt gcg    1536
Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Ala
            500                 505                 510
gac ggt tac ggt aac atg gtg acc acg gac ccg aaa act gcc gac cca    1584
Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro
        515                 520                 525
gtg tac ggg aaa gtg ttc aac ccc ccc cgg acg aat ctc ccc ggg cgc    1632
Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro Arg Thr Asn Leu Pro Gly Arg
    530                 535                 540
ttc aca aac ttc ctt gat gtc gcg gag gcg tgt cca acc ttc ctc cgc    1680
Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg
545                 550                 555                 560
ttc gga gaa gta cca ttt gtg aag acg gtg aac tct ggt gac cgt ttg    1728
Phe Gly Glu Val Pro Phe Val Lys Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu
                565                 570                 575
cta gcc aag ttt gat gtc tcg ctc gct gcg ggc cat atg tcc aac acc    1776
Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu Ala Ala Gly His Met Ser Asn Thr
            580                 585                 590
tac ttg gct ggt ctg gcg cag tac tac aca cag tac agt ggt acc atg    1824
Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met
        595                 600                 605
aat gtt cac ttc atg ttc acc ggg ccc acg gat gcc aag gcc cgg tac    1872
Asn Val His Phe Met Phe Thr Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr
    610                 615                 620
atg gtg gcc tac att cct ccc ggc atg aca ccg ccc aca gac cct gag    1920
Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly Met Thr Pro Pro Thr Asp Pro Glu
625                 630                 635                 640
cgc gcc gcc cac tgt atc cac tcc gag tgg gac act ggt cta aac tcc    1968
Arg Ala Ala His Cys Ile His Ser Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser
                645                 650                 655
aaa ttc acc ttt tcc ata ccc tac ctc tct gct gct gac tac gca tac    2016
Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr
            660                 665                 670
acc gcc tct gac acg gcg gag acc aca agt gtg caa gga tgg gtg tgc    2064
Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Thr Ser Val Gln Gly Trp Val Cys
        675                 680                 685
atc tac cag atc acc cac ggc aag gct gaa gga gac gca ctg gtc gtt    2112
Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly Lys Ala Glu Gly Asp Ala Leu Val Val
    690                 695                 700
tct gtc agc gcc ggc aaa gac ttt gag ttt cgc ctg ccc gtt gac gcg    2160
Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala
705                 710                 715                 720
cgc cgg caa acc acc act acc ggc gag tca gca gac ccg gta aca acc    2208
Arg Arg Gln Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr
                725                 730                 735
acg gtc gag aac tac gga gga gaa act cag aca gcc agg cgg ctt cac    2256
Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His
            740                 745                 750
act gat gtt gcc ttc gtt ctt gac agg ttt gtg aaa ctc act gca ccc    2304
Thr Asp Val Ala Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro
        755                 760                 765
aag aac att cag acc ctt gac ctc atg caa att ccc tca cac acg ctg    2352
Lys Asn Ile Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu
    770                 775                 780
gtt gga gca ctg ctg cgg tct gcg acg tac tac ttc tca gac ctg gag    2400
Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu
785                 790                 795                 800
gtt gcg att gtc cac aca ggc ccg atc acc tgg gtg ccc aac ggc tcg    2448
Val Ala Ile Val His Thr Gly Pro Ile Thr Trp Val Pro Asn Gly Ser
                805                 810                 815
ccc aag gat gct cta gac aac cag acc aac cca act gcc tac cag aag    2496
Pro Lys Asp Ala Leu Asp Asn Gln Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys
            820                 825                 830
caa cct gtc acc cgc ttg gcg ctc ccc tac acc gcc ccc cat cgt gtg    2544
Gln Pro Val Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val
        835                 840                 845
ctg gcg aca gtg tac aac ggg aag acg acg tac ggg gaa aca acc gcg    2592
Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala
    850                 855                 860
cgg cgt ggc gat acg gcg gcc ctt gca caa aga ctg agt ggg cgg ctg    2640
Arg Arg Gly Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Gly Arg Leu
865                 870                 875                 880
ccc acc tca ttt aac tac ggc gct gta aag gct gaa acc atc act gag    2688
Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu
                885                 890                 895
ctt ttg att cgc atg aaa cgt gcg gag aca tac tgc cct agg cct ttg    2736
Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu
            900                 905                 910
cta gct ctt gac acc act cag gac cgc cgt aaa cag aag atc att gca    2784
Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Lys Ile Ile Ala
        915                 920                 925
cct gga aag cag atg gtg aac ttt gac ctg ctc aag ttg gca gga gac    2832
Pro Gly Lys Gln Met Val Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
    930                 935                 940
gtc gag tcc aac cct ggg ccc ttc ttc ttc tcc gac gtc agg tcg aat    2880
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn
945                 950                 955                 960
ttt tcc aag ctg gtt gaa acc atc aac cag atg cag gag gac atg tca    2928
Phe Ser Lys Leu Val Glu Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser
                965                 970                 975
aca aaa cac gga ccc gac ttt aac cgg ttg gtg tct gca ttt gag gaa     2976
Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu
            980                 985                 990
ctg gcc act gga gtg aag gct atc  agg acc ggc ctc gac  gag gcc aaa   3024
Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile  Arg Thr Gly Leu Asp  Glu Ala Lys
        995                 1000                 1005
ccc tgg  tac aag ctc atc aag  ctc cta agc cgc ctg  tca tgc atg      3069
Pro Trp  Tyr Lys Leu Ile Lys  Leu Leu Ser Arg Leu  Ser Cys Met
    1010                 1015                 1020
gcc gct  gta gca gca cgg tca  aag gac cca gtc ctt  gtg gcc atc      3114
A1a Ala  Val Ala Ala Arg Ser  Lys Asp Pro Val Leu  Val Ala Ile
    1025                 1030                 1035
atg ctg  gct gac acc ggc ctt  gag att ctg gac agc  acc ttt gtc      3159
Met Leu  Ala Asp Thr Gly Leu  Glu Ile Leu Asp Ser  Thr Phe Val
    1040                 1045                 1050
gtg aag  aag atc tcc gac tcg  ctc tcc agt ctc ttt  cac gtg cca      3204
Val Lys  Lys Ile Ser Asp Ser  Leu Ser Ser Leu Phe  His Val Pro
    1055                 1060                 1065
gcc ccc  gtc ttc agt ttc gga  gct ccg atc ctg ttg  gcc ggg ttg      3249
Ala Pro  Val Phe Ser Phe Gly  Ala Pro Ile Leu Leu  Ala Gly Leu
    1070                 1075                 1080
gtc aaa  gtc gcc tcg agt ttc  ttc cgg tcc aca ccc  gaa gac ctt      3294
Val Lys  Val Ala Ser Ser Phe  Phe Arg Ser Thr Pro  Glu Asp Leu
    1085                 1090                 1095
gag aga  gcg gag aaa cag ctc  aaa gca cgt gac atc  aat gac ata      3339
Glu Arg  Ala Glu Lys Gln Leu  Lys Ala Arg Asp Ile  Asn Asp Ile
    1100                 1105                 1110
ttc gcc  att ctc aag aac ggc  gag tgg ttg gtc aaa  ctg att ctt      3384
Phe Ala  Ile Leu Lys Asn Gly  Glu Trp Leu Val Lys  Leu Ile Leu
    1115                 1120                 1125
gcc atc  cgc gac tgg atc aag  gca tgg atc gcc tca  gaa gaa aag      3429
Ala Ile  Arg Asp Trp Ile Lys  Ala Trp Ile Ala Ser  Glu Glu Lys
    1130                 1135                 1140
ttt gtc  acc atg aca gac ctg  gtg cct ggc atc ctt  gaa aag cag      3474
Phe Val  Thr Met Thr Asp Leu  Val Pro Gly Ile Leu  Glu Lys Gln
    1145                 1150                 1155
cgg gac  ctc aac gac cca agc  aag tac aag gag gcc  aag gag tgg      3519
Arg Asp  Leu Asn Asp Pro Ser  Lys Tyr Lys Glu Ala  Lys Glu Trp
    1160                 1165                 1170
cta gac  aac gcg cgc caa gcg  tgt ttg aag agc ggg  aac acc cac      3564
Leu Asp  Asn Ala Arg Gln Ala  Cys Leu Lys Ser Gly  Asn Thr His
    1175                 1180                 1185
atc gca  aac ctt tgc aaa gtg  gtt gcc cca gca ccc  agc agg tcg      3609
Ile Ala  Asn Leu Cys Lys Val  Val Ala Pro Ala Pro  Ser Arg Ser
    1190                 1195                 1200
agg ccc  gaa ccc gtg gtc gtt  tgc ctc cgt ggc aaa  tcg ggc cag      3654
Arg Pro  Glu Pro Val Val Val  Cys Leu Arg Gly Lys  Ser Gly Gln
    1205                 1210                 1215
ggt aag  agc ttc ctt gcg aac  gtg ctt gca caa gca  att tca acc      3699
Gly Lys  Ser Phe Leu Ala Asn  Val Leu Ala Gln Ala  Ile Ser Thr
    1220                 1225                 1230
cac ttc  act ggc aga act gat  tca gtt tgg tac tgc  cca cct gac      3744
His Phe  Thr Gly Arg Thr Asp  Ser Val Trp Tyr Cys  Pro Pro Asp
    1235                 1240                 1245
cct gat  cac ttc gac ggt tac  aac caa cag acc gtt  gta gtg atg      3789
Pro Asp  His Phe Asp Gly Tyr  Asn Gln Gln Thr Val  Val Val Met
    1250             1255                     1260
gat gat  ttg ggc cag aac ccc  gac ggg aag gac ttc  aag tac ttc    3834
Asp Asp  Leu Gly Gln Asn Pro  Asp Gly Lys Asp Phe  Lys Tyr Phe
    1265             1270                     1275
gcc caa  atg gtt tca acc acg  ggg ttc atc ccg ccc  atg gct tca    3879
Ala Gln  Met Val Ser Thr Thr  Gly Phe Ile Pro Pro  Met Ala Ser
    1280             1285                     1290
ctc gaa  gac aaa ggc aaa cct  ttc aac agc aag gtc  atc atc gcc    3924
Leu Glu  Asp Lys Gly Lys Pro  Phe Asn Ser Lys Val  Ile Ile Ala
    1295             1300                     1305
acc acc  aac ctg tac tcg ggt  ttc acc ccg aga act  atg gtg tgc    3969
Thr Thr  Asn Leu Tyr Ser Gly  Phe Thr Pro Arg Thr  Met Val Cys
    1310             1315                     1320
cct gat  gca ctg aac cga agg  ttc cac ttc gac att  gac gtg agc    4014
Pro Asp  Ala Leu Asn Arg Arg  Phe His Phe Asp Ile  Asp Val Ser
    1325             1330                     1335
gcc aag  gac ggg tat aaa att  aac aac aaa ttg gac  att acc aaa    4059
Ala Lys  Asp Gly Tyr Lys Ile  Asn Asn Lys Leu Asp  Ile Thr Lys
    1340             1345                     1350
gct ctt  gaa gac acc cac acc  aac cct gtg gca atg  ttt aaa tac    4104
Ala Leu  Glu Asp Thr His Thr  Asn Pro Val Ala Met  Phe Lys Tyr
    1355             1360                     1365
gac tgt  gcc ctt ctc aac ggc  atg gcc gtc gaa atg  aag aga atg    4149
Asp Cys  Ala Leu Leu Asn Gly  Met Ala Val Glu Met  Lys Arg Met
    1370             1375                     1380
caa caa  gac atg ttc aag cct  caa ccg ccc ctc cag  aac gtc tac    4194
Gln Gln  Asp Met Phe Lys Pro  Gln Pro Pro Leu Gln  Asn Val Tyr
    1385             1390                     1395
cag ctt  gtt cag gag gtg att  gac cgg gtc gag ctc  cac gag aag    4239
Gln Leu  Val Gln Glu Val Ile  Asp Arg Val Glu Leu  His Glu Lys
    1400             1405                     1410
gtg tcg  agc cac ccg att ttt  aaa cag atc tct att  cct tcc caa    4284
Val Ser  Ser His Pro Ile Phe  Lys Gln Ile Ser Ile  Pro Ser Gln
    1415             1420                     1425
aag tct  gtg ctg tac ttt ctc  att gag aag ggc cag  cac gaa gca    4329
Lys Ser  Val Leu Tyr Phe Leu  Ile Glu Lys Gly Gln  His Glu Ala
    1430             1435                     1440
gca att  gaa ttc ttt gag ggg  atg gtg cac gac tcc  atc aag gag    4374
Ala Ile  Glu Phe Phe Glu Gly  Met Val His Asp Ser  Ile Lys Glu
    1445             1450                     1455
gag ctc  cgg cct ctc att caa  cag acc tca ttt gtg  aag cgc gct    4419
Glu Leu  Arg Pro Leu Ile Gln  Gln Thr Ser Phe Val  Lys Arg Ala
    1460             1465                     1470
ttc aag  cgc ctg aag gaa aac  ttt gag ata gtt gcc  ctg tgt ttg    4464
Phe Lys  Arg Leu Lys Glu Asn  Phe Glu Ile Val Ala  Leu Cys Leu
    1475             1480                     1485
act ctt  ttg gca aac ata gtg  atc atg atc cgc gag  act cgc aag    4509
Thr Leu  Leu Ala Asn Ile Val  Ile Met Ile Arg Glu  Thr Arg Lys
    1490             1495                     1500
agg cag  caa atg gtg gat gat  gca gtg aat gag tac  att gag aag    4554
Arg Gln  Gln Met Val Asp Asp  Ala Val Asn Glu Tyr  Ile Glu Lys
    1505             1510                     1515
gca aac  atc acc acg gat gac  aag act ctt gac gag  gcg gaa aag    4599
Ala Asn  Ile Thr Thr Asp Asp  Lys Thr Leu Asp Glu  Ala Glu Lys
    1520             1525                     1530
aac cct  ttg gaa acc agc ggt  gcc acc act gtt ggt  ttc aga gag    4644
Asn Pro  Leu Glu Thr Ser Gly  Ala Thr Thr Val Gly  Phe Arg Glu
    1535                 1540                 1545
aaa act  ctc ccg ggg cac aag  gcg agt gat gac gtg  aac tcc gag    4689
Lys Thr  Leu Pro Gly His Lys  Ala Ser Asp Asp Val  Asn Ser Glu
    1550                 1555                 1560
ccc gcc  aaa tcc gtg gaa gaa  caa cca caa gct gaa  gga ccc tac    4734
Pro Ala  Lys Ser Val Glu Glu  Gln Pro Gln Ala Glu  Gly Pro Tyr
    1565                 1570                 1575
gcc gga  cca ctc gag cgt cag  aaa cct ctg aaa gtg  aga gcc aag    4779
Ala Gly  Pro Leu Glu Arg Gln  Lys Pro Leu Lys Val  Arg Ala Lys
    1580                 1585                 1590
ctc ccg  cag cag gag ggg ccc  tac gct ggt ccg atg  gag aga cag    4824
Leu Pro  Gln Gln Glu Gly Pro  Tyr Ala Gly Pro Met  Glu Arg Gln
    1595                 1600                 1605
aaa ccg  ctg aaa gtg aaa gca  aaa gcc ccg gtc gtt  aag gaa gga    4869
Lys Pro  Leu Lys Val Lys Ala  Lys Ala Pro Val Val  Lys Glu Gly
    1610                 1615                 1620
cct tac  gaa gga ccg gtc aag  aaa cct gtc gct ttg  aaa gtg aaa    4914
Pro Tyr  Glu Gly Pro Val Lys  Lys Pro Val Ala Leu  Lys Val Lys
    1625                 1630                 1635
gca aag  aac ttg att gtc act  gag agt ggt gct ccc  ccg act gac    4959
Ala Lys  Asn Leu Ile Val Thr  Glu Ser Gly Ala Pro  Pro Thr Asp
    1640                 1645                 1650
ttg caa  aag atg gtc atg ggt  aac acc aag cct gtt  gag ctc atc    5004
Leu Gln  Lys Met Val Met Gly  Asn Thr Lys Pro Val  Glu Leu Ile
    1655                 1660                 1665
ctc gac  ggg aag acg gtg gcc  atc tgc cgc gcc acc  gga gtg ttt    5049
Leu Asp  Gly Lys Thr Val Ala  Ile Cys Arg Ala Thr  Gly Val Phe
    1670                 1675                 1680
ggt act  gcc tac ctt gtt cct  cgt cat ctc ttc gca  gag aag tat    5094
Gly Thr  Ala Tyr Leu Val Pro  Arg His Leu Phe Ala  Glu Lys Tyr
    1685                 1690                 1695
gac gag  atc atg ctg gac ggc  aga gcc atg aca gac  agt gac tac    5139
Asp Glu  Ile Met Leu Asp Gly  Arg Ala Met Thr Asp  Ser Asp Tyr
    1700                 1705                 1710
aga gtg  ttt gag ttt gag att  aaa gta aaa gga cag  gac atg ctc    5184
Arg Val  Phe Glu Phe Glu Ile  Lys Val Lys Gly Gln  Asp Met Leu
    1715                 1720                 1725
tca gac  gcc gcg ctc atg gtg  ctc cac cgt ggg aat  cgc gtg cgg    5229
Ser Asp  Ala Ala Leu Met Val  Leu His Arg Gly Asn  Arg Val Arg
    1730                 1735                 1740
gac atc  acg aag cac ttc cgt  gat gtg gca aga atg  cag aaa ggc    5274
Asp Ile  Thr Lys His Phe Arg  Asp Val Ala Arg Met  Gln Lys Gly
    1745                 1750                 1755
acc ccc  gtc gtc ggc gta atc  aac aac gct gat gtt  ggg aga ctg    5319
Thr Pro  Val Val Gly Val Ile  Asn Asn Ala Asp Val  Gly Arg Leu
    1760                 1765                 1770
att ttc  tct ggt gag gcc ctt  acc tac aag gac att  gta gtg tgc    5364
Ile Phe  Ser Gly Glu Ala Leu  Thr Tyr Lys Asp Ile  Val Val Cys
    1775                 1780                 1785
atg gac  gga gac acc atg ccc  ggc ctc ttc gcc tac  aaa gct gcc    5409
Met Asp  Gly Asp Thr Met Pro  Gly Leu Phe Ala Tyr  Lys Ala Ala
    1790                 1795                 1800
acc aag  gca ggt tac tgt gga  gga gcc gtt ctt gca  aag gac gga    5454
Thr Lys  Ala Gly Tyr Cys Gly  Gly Ala Val Leu Ala  Lys Asp Gly
    1805                 1810                 1815
gcc gag  act ttc atc gtt ggc  act cac tct gca ggt  ggc aat gga    5499
Ala Glu  Thr Phe Ile Val Gly  Thr His Ser Ala Gly  Gly Asn Gly
    1820                 1825                 1830
gtt gga  tac tgc tca tgc gtt  tcc agg tct atg ctg  ctc aaa atg    5544
Val Gly  Tyr Cys Ser Cys Val  Ser Arg Ser Met Leu  Leu Lys Met
    1835                 1840                 1845
aag gca  cac atc gat ccc gaa  cca cac cac gag gga  ttg ata gtt    5589
Lys Ala  His Ile Asp Pro Glu  Pro His His Glu Gly  Leu Ile Val
    1850                 1855                 1860
gac acc  aga gat gtt gag gag  cgc gtg cat gtc atg  cgc aaa acc    5634
Asp Thr  Arg Asp Val Glu Glu  Arg Val His Val Met  Arg Lys Thr
    1865                 1870                 1875
aag ctc  gca ccc act gtg gca  cac ggt gtg ttt aac  cct gaa ttc    5679
Lys Leu  Ala Pro Thr Val Ala  His Gly Val Phe Asn  Pro Glu Phe
    1880                 1885                 1890
ggg cct  gcc gcc ttg tcc aac  aaa gac ccg cgc ctg  gat gaa gga    5724
Gly Pro  Ala Ala Leu Ser Asn  Lys Asp Pro Arg Leu  Asp Glu Gly
    1895                 1900                 1905
gtt gtc  ctc gat gaa gcc atc  ttc tcc aaa cac aag  gga gac aca    5769
Val Val  Leu Asp Glu Ala Ile  Phe Ser Lys His Lys  Gly Asp Thr
    1910                 1915                 1920
aag atg  tct gag gag gac aaa  gcg ctg ttc cgc cgc  tgc gct gcc    5814
Lys Met  Ser Glu Glu Asp Lys  Ala Leu Phe Arg Arg  Cys Ala Ala
    1925                 1930                 1935
gac tac  gcg tcg cgt ctg cac  agc gtg ctg ggt acg  gca aac gcc    5859
Asp Tyr  Ala Ser Arg Leu His  Ser Val Leu Gly Thr  Ala Asn Ala
    1940                 1945                 1950
cca ctg  agc atc tac gag gca  att aag ggc gtc gac  gga ctt gac    5904
Pro Leu  Ser Ile Tyr Glu Ala  Ile Lys Gly Val Asp  Gly Leu Asp
    1955                 1960                 1965
gcc atg  gaa cca gac acc gcg  cct ggt ctt ccc tgg  gct ctc cag    5949
Ala Met  Glu Pro Asp Thr Ala  Pro Gly Leu Pro Trp  Ala Leu Gln
    1970                 1975                 1980
ggg aaa  cgc cgt ggt gcg ctc  att gac ttc gag aac  ggc act gtc    5994
Gly Lys  Arg Arg Gly Ala Leu  Ile Asp Phe Glu Asn  Gly Thr Val
    1985                 1990                 1995
gga ccc  gag gtt aaa gct gcc  tta gag ctc atg gag  aaa aga gag    6039
Gly Pro  Glu Val Lys Ala Ala  Leu Glu Leu Met Glu  Lys Arg Glu
    2000                 2005                 2010
tac aag  ttt gca tgc caa acc  ttc ctg aag gac gag  att cgc ccg    6084
Tyr Lys  Phe Ala Cys Gln Thr  Phe Leu Lys Asp Glu  Ile Arg Pro
    2015                 2020                 2025
atg gaa  aag gta cgt gcc ggc  agg act cgc att gtc  gac gtc ttg    6129
Met Glu  Lys Val Arg Ala Gly  Arg Thr Arg Ile Val  Asp Val Leu
    2030                 2035                 2040
cct gtt  gaa cac att ctt tac  acc agg atg atg att  ggc aga ttc    6174
Pro Val  Glu His Ile Leu Tyr  Thr Arg Met Met Ile  Gly Arg Phe
    2045                 2050                 2055
tgt gct  caa atg cac tca aac  aac gga ccg caa att  ggc tcg gcg    6219
Cys Ala  Gln Met His Ser Asn  Asn Gly Pro Gln Ile  Gly Ser Ala
    2060                 2065                 2070
gtt ggt  tgc aat cct gat gtt  gat tgg caa aga ttt  ggc aca cac    6264
Val Gly  Cys Asn Pro Asp Val  Asp Trp Gln Arg Phe  Gly Thr His
    2075                 2080                 2085
ttt gct  cag tac aga aac gtg  tgg gat gtg gac tat  tcg gcc ttt    6309
Phe Ala  Gln Tyr Arg Asn Val  Trp Asp Val Asp Tyr  Ser Ala Phe
    2090                 2095                 2100
gat gcc  aac cac tgc agt gac  gca atg aac atc atg  ttt gag gag    6354
Asp Ala  Asn His Cys Ser Asp  Ala Met Asn Ile Met  Phe Glu Glu
    2105                 2110                 2115
gtg ttc  aac acg gac ttc ggt  ttc cac cca aac gct  gag tgg atc    6399
Val Phe  Asn Thr Asp Phe Gly  Phe His Pro Asn Ala  Glu Trp Ile
    2120                 2125                 2130
ctg aaa  act ctc gtg aac act  gaa cac gcc tat gag  aac aaa cgc    6444
Leu Lys  Thr Leu Val Asn Thr  Glu His Ala Tyr Glu  Asn Lys Arg
    2135                 2140                 2145
atc act  gtt gag ggc ggg atg  cca tct ggt tgt tcc  gca aca agc    6489
Ile Thr  Val Glu Gly Gly Met  Pro Ser Gly Cys Ser  Ala Thr Ser
    2150                 2155                 2160
atc atc  aac aca att ttg aac  aat atc tac gtg ctc  tac gcc ttg    6534
Ile Ile  Asn Thr Ile Leu Asn  Asn Ile Tyr Val Leu  Tyr Ala Leu
    2165                 2170                 2175
cgt aga  cac tat gag gga gtt  gag ctg gac act tac  acc atg atc    6579
Arg Arg  His Tyr Glu Gly Val  Glu Leu Asp Thr Tyr  Thr Met Ile
    2180                 2185                 2190
tct tac  gga gac gac atc gtg  gtt gca agt gat cac  gat ctg gac    6624
Ser Tyr  Gly Asp Asp Ile Val  Val Ala Ser Asp His  Asp Leu Asp
    2195                 2200                 2205
ttt gag  gcc ctc aag cct cac  ttc aaa tcc ctt ggt  caa acc atc    6669
Phe Glu  Ala Leu Lys Pro His  Phe Lys Ser Leu Gly  Gln Thr Ile
2210                 2215                 2220
act cca  gct gac aaa agc gac  aaa ggt ttt gtt ctt  ggt cac tcc    6714
Thr Pro  Ala Asp Lys Ser Asp  Lys Gly Phe Val Leu  Gly His Ser
    2225                 2230                 2235
atc acc  gat gtc act ttc ctc  aaa aga cac ttt cac  atg gat tat    6759
Ile Thr  Asp Val Thr Phe Leu  Lys Arg His Phe His  Met Asp Tyr
    2240                 2245                 2250
gga act  ggg ttt tac aaa cct  gtg atg gct tcg aag  acc ctc gag    6804
Gly Thr  Gly Phe Tyr Lys Pro  Val Met Ala Ser Lys  Thr Leu Glu
2255                 2260                 2265
gct atc  ctc tcc ttt gca cgc  cgt ggg acc ata cag  gag aag ttg    6849
Ala Ile  Leu Ser Phe Ala Arg  Arg Gly Thr Ile Gln  Glu Lys Leu
    2270                 2275                 2280
atc tcc  gtg gca gga ctc gcc  gtc cac tct gga cct  gac gag tac    6894
Ile Ser  Val Ala Gly Leu Ala  Val His Ser Gly Pro  Asp Glu Tyr
    2285                 2290                 2295
cgg cgt  ctc ttt gag cct ttc  cag ggc ctc ttt gag  att cca agc    6939
Arg Arg  Leu Phe Glu Pro Phe  Gln Gly Leu Phe Glu  Ile Pro Ser
    2300                 2305                 2310
tac aga  tca ctt tac ctg cgt  tgg gtg aac gcc gtg  tgc ggt gac    6984
Tyr Arg  Ser Leu Tyr Leu Arg  Trp Val Asn Ala Val  Cys Gly Asp
    2315                 2320                 2325
gca taa                                                           6990
Ala
<210>4
<211>2329
<212>PRT
<213>Foot-and-mouth disease virus
<400>4
Met Ser Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Leu Tyr Ala Phe Arg Glu
1               5                   10                  15
Ile Lys Thr Leu Phe Leu Ser Arg Ala Gln Gly Lys Met Glu Phe Thr
            20                  25                  30
Leu His Asn Gly Glu Lys Lys Thr Phe Tyr Ser Arg Pro Asn Asn His
        35                  40                  45
Asp Asn Cys Trp Leu Asn Thr Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Asn Ser Pro Glu Asn Leu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ile Lys Gln Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu Glu Leu His Glu
                85                  90                  95
Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His Leu Leu Ser
            100                 105                 110
Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Met Val Asp
        115                 120                 125
Gly Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys
    130                 135                 140
Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asn Gly Trp Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp Pro Ser Asp
                165                 170                 175
Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn Gly Glu Trp
            180                 185                 190
Lys Ala Lys Val Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro
        195                 200                 205
Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn
    210                 215                 220
Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly
225                 230                 235                 240
Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr
                245                 250                 255
Ser Thr His Thr Asn Thr Thr Gln Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu
            260                 265                 270
Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys
        275                 280                 285
Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg
    290                 295                 300
Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly
                325                 330                 335
Leu Glu Thr Arg Val Gln Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu
            340                 345                 350
Phe Asp Trp Thr Pro Asn Leu Ala Phe Gly Tyr Cys His Tyr Leu Glu
        355                 360                 365
Leu Pro Thr Glu His Lys Gly Val Tyr Gly Ser Leu Met Asp Ser Tyr
    370                 375                 380
Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Ile Glu Val Thr Ala Val Gly Asn
385                 390                 395                 400
Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Leu Val Pro Glu Leu Lys
                405                 410                 415
Ser Leu Asp Thr Arg Gln Lys Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln
            420                 425                 430
Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Asn Val Pro Phe
        435                 440                 445
Ile Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Met Leu His Lys Pro Trp Thr
    450                 455                 460
Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser
465                 470                 475                 480
Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met Asn Ala Ala Pro Thr Tyr Val His Val
                485                 490                 495
Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Ala
            500                 505                 510
Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro
        515                 520                 525
Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro Arg Thr Asn Leu Pro Gly Arg
    530                 535                 540
Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg
545                 550                 555                 560
Phe Gly Glu Val Pro Phe Val Lys Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu
                565                 570                 575
Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu Ala Ala Gly His Met Ser Asn Thr
                580             585                 590
Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met
        595                 600                 605
Asn Val His Phe Met Phe Thr Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr
    610                 615                 620
Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly Met Thr Pro Pro Thr Asp Pro Glu
625                 630                 635                 640
Arg Ala Ala His Cys Ile His Ser Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser
                645                 650                 655
Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr
            660                 665                 670
Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Thr Ser Val Gln Gly Trp Val Cys
        675                 680                 685
Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly Lys Ala Glu Gly Asp Ala Leu Val Val
    690                 695                 700
Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala
705                 710                 715                 720
Arg Arg Gln Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr
                725                 730                 735
Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His
            740                 745                 750
Thr Asp Val Ala Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro
        755                 760                 765
Lys Asn Ile Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu
    770                 775                 780
Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu
785                 790                 795                 800
Val Ala Ile Val His Thr Gly Pro Ile Thr Trp Val Pro Asn Gly Ser
                805                 810                 815
Pro Lys Asp Ala Leu Asp Asn Gln Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys
            820                 825                 830
Gln Pro Val Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val
        835                 840                 845
Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala
    850                 855                 860
Arg Arg Gly Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Gly Arg Leu
865                 870                 875                 880
Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu
                885                 890                 895
Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu
            900                 905                 910
Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Lys Ile Ile Ala
        915                 920                 925
Pro Gly Lys Gln Met Val Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
    930                 935                 940
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn
945                 950                 955                 960
Phe Ser Lys Leu Val Glu Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser
                965                 970                 975
Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu
            980                 985                 990
Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile  Arg Thr Gly Leu Asp  Glu Ala Lys
         995                1000                 1005
Pro Trp  Tyr Lys Leu Ile Lys  Leu Leu Ser Arg Leu  Ser Cys Met
    1010                 1015                 1020
Ala Ala  Val Ala Ala Arg Ser  Lys Asp Pro Val Leu  Val Ala Ile
    1025                 1030                 1035
Met Leu  Ala Asp Thr Gly Leu  Glu Ile Leu Asp Ser  Thr Phe Val
    1040                 1045                 1050
Val Lys  Lys Ile Ser Asp Ser  Leu Ser Ser Leu Phe  His Val Pro
    1055                 1060                 1065
Ala Pro  Val Phe Ser Phe Gly  Ala Pro Ile Leu Leu  Ala Gly Leu
    1070                 1075                 1080
Val Lys  Val Ala Ser Ser Phe  Phe Arg Ser Thr Pro  Glu Asp Leu
    1085                 1090                 1095
Glu Arg  Ala Glu Lys Gln Leu  Lys Ala Arg Asp Ile  Asn Asp Ile
    1100                 1105                 1110
Phe Ala  Ile Leu Lys Asn Gly  Glu Trp Leu Val Lys  Leu Ile Leu
    1115                 1120                 1125
Ala Ile  Arg Asp Trp Ile Lys  Ala Trp Ile Ala Ser  Glu Glu Lys
    1130                 1135                 1140
Phe Val  Thr Met Thr Asp Leu  Val Pro Gly Ile Leu  Glu Lys Gln
    1145                 1150                 1155
Arg Asp  Leu Asn Asp Pro Ser  Lys Tyr Lys Glu Ala  Lys Glu Trp
    1160                 1165                 1170
Leu Asp  Asn Ala Arg Gln Ala  Cys Leu Lys Ser Gly  Asn Thr His
    1175                 1180                 1185
Ile Ala  Asn Leu Cys Lys Val  Val Ala Pro Ala Pro  Ser Arg Ser
    1190                 1195                 1200
Arg Pro  Glu Pro Val Val Val  Cys Leu Arg Gly Lys  Ser Gly Gln
    1205                 1210                 1215
Gly Lys  Ser Phe Leu Ala Asn  Val Leu Ala Gln Ala  Ile Ser Thr
    1220                 1225                 1230
His Phe  Thr Gly Arg Thr Asp  Ser Val Trp Tyr Cys  Pro Pro Asp
    1235                 1240                 1245
Pro Asp  His Phe Asp Gly Tyr  Asn Gln Gln Thr Val  Val Val Met
    1250                 1255                 1260
Asp Asp  Leu Gly Gln Asn Pro  Asp Gly Lys Asp Phe  Lys Tyr Phe
    1265                 1270                 1275
Ala Gln  Met Val Ser Thr Thr  Gly Phe Ile Pro Pro  Met Ala Ser
    1280                 1285                 1290
Leu Glu  Asp Lys Gly Lys Pro  Phe Asn Ser Lys Val  Ile Ile Ala
    1295                 1300                 1305
Thr Thr  Asn Leu Tyr Ser Gly  Phe Thr Pro Arg Thr  Met Val Cys
    1310                 1315                 1320
Pro Asp  Ala Leu Asn Arg Arg  Phe His Phe Asp Ile  Asp Val Ser
    1325                 1330                 1335
Ala Lys  Asp Gly Tyr Lys Ile  Asn Asn Lys Leu Asp  Ile Thr Lys
    1340                 1345                 1350
Ala Leu  Glu Asp Thr His Thr  Asn Pro Val Ala Met  Phe Lys Tyr
    1355                 1360                 1365
Asp Cys  Ala Leu Leu Asn Gly  Met Ala Val Glu Met  Lys Arg Met
    1370                 1375                 1380
Gln Gln  Asp Met Phe Lys Pro  Gln Pro Pro Leu Gln  Asn Val Tyr
    1385                 1390                 1395
Gln Leu  Val Gln Glu Val Ile  Asp Arg Val Glu Leu  His Glu Lys
    1400                 1405                 1410
Val Ser  Ser His Pro Ile Phe  Lys Gln Ile Ser Ile  Pro Ser Gln
    1415                 1420                 1425
Lys Ser  Val Leu Tyr Phe Leu  Ile Glu Lys Gly Gln  His Glu Ala
    1430                 1435                 1440
Ala Ile  Glu Phe Phe Glu Gly  Met Val His Asp Ser  Ile Lys Glu
    1445                 1450                 1455
Glu Leu  Arg Pro Leu Ile Gln  Gln Thr Ser Phe Val  Lys Arg Ala
    1460                 1465                 1470
Phe Lys  Arg Leu Lys Glu Asn  Phe Glu Ile Val Ala  Leu Cys Leu
    1475                 1480                 1485
Thr Leu  Leu Ala Asn Ile Val  Ile Met Ile Arg Glu  Thr Arg Lys
    1490                 1495                 1500
Arg Gln  Gln Met Val Asp Asp  Ala Val Asn Glu Tyr  Ile Glu Lys
    1505                 1510                 1515
Ala Asn  Ile Thr Thr Asp Asp  Lys Thr Leu Asp Glu  Ala Glu Lys
    1520                 1525                 1530
Asn Pro  Leu Glu Thr Ser Gly  Ala Thr Thr Val Gly  Phe Arg Glu
    1535                 1540                 1545
Lys Thr  Leu Pro Gly His Lys  Ala Ser Asp Asp Val  Asn Ser Glu
    1550                 1555                 1560
Pro Ala  Lys Ser Val Glu Glu  Gln Pro Gln Ala Glu  Gly Pro Tyr
    1565                 1570                 1575
Ala Gly  Pro Leu Glu Arg Gln  Lys Pro Leu Lys Val  Arg Ala Lys
    1580                 1585                 1590
Leu Pro  Gln Gln Glu Gly Pro  Tyr Ala Gly Pro Met  Glu Arg Gln
    1595                 1600                 1605
Lys Pro  Leu Lys Val Lys Ala  Lys Ala Pro Val Val  Lys Glu Gly
    1610                 1615                 1620
Pro Tyr  Glu Gly Pro Val Lys  Lys Pro Val Ala Leu  Lys Val Lys
    1625                 1630                 1635
Ala Lys  Asn Leu Ile Val Thr  Glu Ser Gly Ala Pro  Pro Thr Asp
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Leu Gln  Lys Met Val Met Gly  Asn Thr Lys Pro Val  Glu Leu Ile
    1655                 1660                 1665
Leu Asp  Gly Lys Thr Val Ala  Ile Cys Arg Ala Thr  Gly Val Phe
    1670                 1675                 1680
Gly Thr  Ala Tyr Leu Val Pro  Arg His Leu Phe Ala  Glu Lys Tyr
    1685                 1690                 1695
Asp Glu  Ile Met Leu Asp Gly  Arg Ala Met Thr Asp  Ser Asp Tyr
    1700                 1705                 1710
Arg Val  Phe Glu Phe Glu Ile  Lys Val Lys Gly Gln  Asp Met Leu
    1715                 1720                 1725
Ser Asp  Ala Ala Leu Met Val  Leu His Arg Gly Asn  Arg Val Arg
    1730                 1735                 1740
Asp Ile  Thr Lys His Phe Arg  Asp Val Ala Arg Met  Gln Lys Gly
    1745                 1750                 1755
Thr Pro  Val Val Gly Val Ile  Asn Asn Ala Asp Val  Gly Arg Leu
    1760                 1765                 1770
Ile Phe  Ser Gly Glu Ala Leu  Thr Tyr Lys Asp Ile  Val Val Cys
    1775                 1780                 1785
Met Asp  Gly Asp Thr Met Pro  Gly Leu Phe Ala Tyr  Lys Ala Ala
    1790                 1795                 1800
Thr Lys  Ala Gly Tyr Cys Gly  Gly Ala Val Leu Ala  Lys Asp Gly
    1805                 1810                 1815
Ala Glu  Thr Phe Ile Val Gly  Thr His Ser Ala Gly  Gly Asn Gly
    1820                 1825                 1830
Val Gly  Tyr Cys Ser Cys Val  Ser Arg Ser Met Leu  Leu Lys Met
    1835                 1840                 1845
Lys Ala  His Ile Asp Pro Glu  Pro His His Glu Gly  Leu Ile Val
    1850                 1855                 1860
Asp Thr  Arg Asp Val Glu Glu  Arg Val His Val Met  Arg Lys Thr
    1865                 1870                 1875
Lys Leu  Ala Pro Thr Val Ala  His Gly Val Phe Asn  Pro Glu Phe
    1880                 1885                 1890
Gly Pro  Ala Ala Leu Ser Asn  Lys Asp Pro Arg Leu  Asp Glu Gly
    1895                 1900                 1905
Val Val  Leu Asp Glu Ala Ile  Phe Ser Lys His Lys  Gly Asp Thr
    1910                 1915                 1920
Lys Met  Ser Glu Glu Asp Lys  Ala Leu Phe Arg Arg  Cys Ala Ala
    1925                 1930                 1935
Asp Tyr  Ala Ser Arg Leu His  Ser Val Leu Gly Thr  Ala Asn Ala
    1940                 1945                 1950
Pro Leu  Ser Ile Tyr Glu Ala  Ile Lys Gly Val Asp  Gly Leu Asp
    1955                 1960                 1965
Ala Met  Glu Pro Asp Thr Ala  Pro Gly Leu Pro Trp  Ala Leu Gln
   1970                 1975                 1980
Gly Lys  Arg Arg Gly Ala Leu  Ile Asp Phe Glu Asn  Gly Thr Val
   1985                 1990                 1995
Gly Pro  Glu Val Lys Ala Ala  Leu Glu Leu Met Glu  Lys Arg Glu
   2000                 2005                 2010
Tyr Lys  Phe Ala Cys Gln Thr  Phe Leu Lys Asp Glu  Ile Arg Pro
    2015                 2020                 2025
Met Glu  Lys Val Arg Ala Gly  Arg Thr Arg Ile Val  Asp Val Leu
    2030                 2035                 2040
Pro Val  Glu His Ile Leu Tyr  Thr Arg Met Met Ile  Gly Arg Phe
    2045                 2050                 2055
Cys Ala  Gln Met His Ser Asn  Asn Gly Pro Gln Ile  Gly Ser Ala
    2060                 2065                 2070
Val Gly  Cys Asn Pro Asp Val  Asp Trp Gln Arg Phe  Gly Thr His
    2075                 2080                 2085
Phe Ala  Gln Tyr Arg Asn Val  Trp Asp Val Asp Tyr  Ser Ala Phe
    2090                 2095                 2100
Asp Ala  Asn His Cys Ser Asp  Ala Met Asn Ile Met  Phe Glu Glu
    2105                 2110                 2115
Val Phe  Asn Thr Asp Phe Gly  Phe His Pro Asn Ala  Glu Trp Ile
    2120                 2125                 2130
Leu Lys  Thr Leu Val Asn Thr  Glu His Ala Tyr Glu  Asn Lys Arg
    2135                 2140                 2145
Ile Thr  Val Glu Gly Gly Met  Pro Ser Gly Cys Ser  Ala Thr Ser
    2150                 2155                 2160
Ile Ile  Asn Thr Ile Leu Asn  Asn Ile Tyr Val Leu  Tyr Ala Leu
    2165                 2170                 2175
Arg Arg  His Tyr Glu Gly Val  Glu Leu Asp Thr Tyr  Thr Met Ile
    2180                 2185                 2190
Ser Tyr  Gly Asp Asp Ile Val  Val Ala Ser Asp His  Asp Leu Asp
    2195                 2200                 2205
Phe Glu  Ala Leu Lys Pro His  Phe Lys Ser Leu Gly  Gln Thr Ile
    2210                 2215                 2220
Thr Pro  Ala Asp Lys Ser Asp  Lys Gly Phe Val Leu  Gly His Ser
    2225                 2230                 2235
Ile Thr  Asp Val Thr Phe Leu  Lys Arg His Phe His  Met Asp Tyr
    2240                 2245                 2250
Gly Thr  Gly Phe Tyr Lys Pro  Val Met Ala Ser Lys  Thr Leu Glu
    2255                 2260                 2265
Ala Ile  Leu Ser Phe Ala Arg  Arg Gly Thr Ile Gln  Glu Lys Leu
    2270                 2275                 2280
Ile Ser  Val Ala Gly Leu Ala  Val His Ser Gly Pro  Asp Glu Tyr
    2285                 2290                 2295
Arg Arg  Leu Phe Glu Pro Phe  Gln Gly Leu Phe Glu  Ile Pro Ser
    2300                 2305                 2310
Tyr Arg  Ser Leu Tyr Leu Arg  Trp Val Asn Ala Val  Cys Gly Asp
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Ala
<210>5
<211>636
<212>DNA
<213>Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(633)
<223>
<400>5
acc acc act acc ggc gag tca gca gac ccg gta aca acc acg gtc gag    48
Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu
1               5                   10                  15
aac tac gga gga gaa act cag aca gcc agg cgg ctt cac act gat gtt    96
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val
            20                  25                  30
gcc ttc gtt ctt gac agg ttt gtg aaa ctc act gca ccc aag aac att    144
Ala Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ile
        35                  40                  45
cag acc ctt gac ctc atg caa att ccc tca cac acg ctg gtt gga gca    192
Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala
    50                  55                  60
ctg ctg cgg tct gcg acg tac tac ttc tca gac ctg gag gtt gcg att    240
Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Ile
65                  70                  75                  80
gtc cac aca ggc ccg atc acc tgg gtg ccc aac ggc tcg ccc aag gat    288
Val His Thr Gly Pro Ile Thr Trp Val Pro Asn Gly Ser Pro Lys Asp
                85                  90                  95
gct cta gac aac cag acc aac cca act gcc tac cag aag caa cct gtc    336
Ala Leu Asp Asn Gln Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Val
            100                 105                 110
acc cgc ttg gcg ctc ccc tac acc gcc ccc cat cgt gtg ctg gcg aca    384
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
        115                 120                 125
gtg tac aac ggg aag acg acg tac ggg gaa aca acc gcg cgg cgt ggc    432
Val Tyr Asn Gly Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala Arg Arg Gly
    130                 135                 140
gat acg gcg gcc ctt gca caa aga ctg agt ggg cgg ctg ccc acc tca    480
Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Gly Arg Leu Pro Thr Ser
145                 150                 155                 160
ttt aac tac ggc gct gta aag gct gaa acc atc act gag ctt ttg att    528
Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile
                165                 170                 175
cgc atg aaa cgt gcg gag aca tac tgc cct agg cct ttg cta gct ctt    576
Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu
            180                 185                 190
gac acc act cag gac cgc cgt aaa cag aag atc att gca cct gga aag    624
Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Gly Lys
        195                 200                 205
cag atg gtg tag    636
Gln Met Val
    210
<210>6
<211>211
<212>PRT
<213>Foot-and-mouth disease virus
<400>6
Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val
            20                  25                  30
Ala Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ile
        35                  40                  45
Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala
    50                  55                  60
Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Ile
65                  70                  75                  80
Val His Thr Gly Pro Ile Thr Trp Val Pro Asn Gly Ser Pro Lys Asp
                85                  90                  95
Ala Leu Asp Asn Gln Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Val
            100                 105                 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
        115                 120                 125
Val Tyr Asn Gly Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Thr Thr Ala Arg Arg Gly
    130                 135                 140
Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Gly Arg Leu Pro Thr Ser
145                 150                 155                 160
Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile
                165                 170                 175
Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu
            180                 185                 190
Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Gly Lys
        195                 200                 205
Gln Met Val
    210

Claims (8)

1.一种制备口蹄疫抗原的方法，包括：将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5所示的碱基序列分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移载体；用所构建的转移载体转染杆状病毒进行DNA重组，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行口蹄疫抗原表达；收集并纯化所表达的口蹄疫抗原。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体选自AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bacmid，BlucBacII-pETL，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc373，pAcAB3，pAcAB 4，PAcAS3，pAcC129，pAcC4，DZI，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2，pAcMLF 7，pAcMLF8，pAcMP1，pAcMP2，pAcRP23，pAcRP25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1，pAcUW21，pAcUW2A，pAcUW2B，pAcUW3，pAcUW31，pAcUW41，pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51，pAcVC2，pAcVC3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1，pBac2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55，mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYNXIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391，pVL1392，pVL 1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVTBac，pBM030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体。
3.按照权利要求2的方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体是pVL1393。
4.按照权利要求1的方法，其特征在于：所构建的转移载体是pVL1393-P1-2A3C，pVL1393-ORF或pVL1393-VP1。
5.按照权利要求1的方法，其特征在于：所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或TeNPV。
6.按照权利要求1的方法，其特征在于：所述的重组杆状病毒选自以下任意一种重组病毒：(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-ORF，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1980；(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-P1-2A3C，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1979；(3)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-VP1，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1975。
7.按照权利要求1的方法，其特征在于：所述的昆虫宿主包括家蚕(Bombyxmori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothisvirescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)。
8.按照权利要求7的方法，其特征在于：所述的昆虫宿主是家蚕幼虫或蛹。
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