CN103122352A

CN103122352A - 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用

Info

Publication number: CN103122352A
Application number: CN201210369096XA
Authority: CN
Inventors: 钱平; 李祥敏; 彭波; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: CN103122352B

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用，参照PCV2b分离株ORF2基因序列，人工合成ORF2基因，以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒为骨架，将合成的ORF2基因基因连入该质粒，得到一种杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2，取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2与DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，筛选阳性菌落，得到重组杆粒rBac-PCV3ORF2，将该杆粒转染sf9细胞，获得重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2。重组杆状病毒高效地表达PCV2ORF2蛋白并形成病毒样颗粒。本发明的重组杆状病毒所表达包装形成的VLP制备灭活疫苗，免疫28日龄仔猪后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能完全保护猪体免受圆环病毒强毒的攻击。

Description

一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和病毒学领域。具体涉及一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒，还涉及一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒的制备方法，还涉及一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒在制备预防猪圆环病毒感染灭活疫苗中的应用。利用本发明的重组病毒表达人工修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因并组装成猪圆环病毒2型样病毒颗粒VLP，可以用于制备圆环病毒安全疫苗。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是90年代初发现的一种无囊膜的单股负链DNA病毒，属于圆环病毒属。PCV2能引起仔猪断奶多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等多种疾病，给养猪业造成巨大的经济损失。同时，PCV2能够导致感染猪获得性免疫抑制（Darwich et al.,2002;Segales et al.,2004），往往导致与猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合症病毒，猪伪狂犬病毒等病原的混合感染。PCV2基因组全长1767/1768bp，同基因型的病毒内部基因组变异不大，同源性在95%以上。PCV的基因组共编码11个开放阅读框架（open reading frames,ORFs）,ORF1~ORF11,其中ORF2编码病毒的唯一结构蛋白——核衣壳蛋白（Cap），该蛋白由234个氨基酸组成，分子量为28kDa,可自我装配成病毒样粒子。Cap是主要的免疫原性蛋白并能诱导特意的PCV2中和抗体(Pogranichnyy et al.,2000)，因此ORF2基因是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。Liu等（2001）通过大肠杆菌表达ORF2基因，证明其具有很强的免疫原性；在杆状病毒表达ORF2基因后可以形成圆环病毒样颗粒（Nawagitgul,2000）。

杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（Autographa califonica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。

PCV2相关性疾病，在2005年给欧洲造成的经济损失高达6亿欧元。同样我国每年因为PCV2感染给我国养猪业带来巨大经济损失，目前对PCV2感染的控制主要通过加强饲养管理和生物安全措施，但是PCV2在猪群中感染率较高以及PCV2对外界环境的抵抗力较强，因而通过安全有效地疫苗免疫预防PCV2感染显得十分重要。PCV2在细胞上的增值滴度非常低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗的前景不大。因而研制安全高效的新型疫苗在PCV2的疫苗开发中占重要地位。近年来发展起来的病毒样颗粒疫苗（Virus like particles,VLP），含有病毒的一个或多个抗原蛋白、具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导机体产生良好的免疫保护。鉴于杆状病毒表达载体的优势和病毒样颗粒疫苗的特性，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达PCV2ORF2基因，并成功组装成病毒样颗粒VLP，以此制备灭活疫苗，为PCV2感染相关疾病(如仔猪断奶多系统衰竭综合症等)的免疫防制提供重要的候选疫苗株。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种人工修饰合成的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2，PCV2)ORF2基因的cDNA序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是提供一种转移载体pFBDPHm3ORF2，该载体含有3个拷贝PCV2免疫原性基因ORF2的cDNA序列和标记基因eGFP。

本发明还有一个目的就是提供一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒，该毒株被命名为重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，属于杆状病毒（Baculovirus），该病毒含有PCV2免疫原性基因ORF2，该病毒于2012年8月16日送交中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为：CCTCC NO：V201238，分类命名：重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2RecominantAutographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus QP-Ac-PCV3ORF2，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是提供了一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒的制备方法，方法简单，易行，适合大规模生产。

本发明还有一个目的是提供了一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒在制备预防猪圆环病毒感染灭活疫苗中的应用，将该病毒免疫仔猪后可诱导机体产生特异性免疫反应。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒，其制备步骤如下：

1、PCV2ORF2基因的人工修饰合成和杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2的构建

参照PCV2b分离株ORF2基因序列（GenBank No.GU450327），根据密码子的偏爱性人工合成PCV2ORF2基因的序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒（钱平等，一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒，专利公开号CN101624580A,专利号ZL200910063217.6）为骨架，通过NcoI和KpnI酶切pFBDPHmHNM1P10eGFP，回收大片段获得pFBDPHmHNM1。通过XhoI和HindIII分别酶切将PCV2ORF2基因和pFBDPHmHNM1，回收ORF2基因和pFBDPHmHN，然后连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHNORF2。进而通过SpeI和NotI酶切PCV2ORF2基因和pFBDPHmHNORF2,回收ORF2基因和pFBDPHmHORF2，然后连接，提取重组质粒G并酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmH2ORF2。再通过BamHI和EcoRI分别酶切PCV2ORF2基因和pFBDPHmH2ORF2，回收ORF2基因和pFBDPHm2ORF2，然后连接，提取重组质粒，酶切鉴定，最终获得有3个ORF2基因的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2，酶切鉴定结果见图1。

2、重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2的构建与鉴定

（1）重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2的构建

取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF22.0μL与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基（氯化钠浓度为10%），37℃振摇培养4h，按10^-1、10^-2、10^-3稀释后，各取100μL涂布于三抗高盐LB平板（卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书），37℃培养24~48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取杆粒rBac-PCV3ORF2并通过PCR进一步鉴定。设计两对引物扩增鉴定，M13上游引物M13F和PCV2ORF2引物PCV2F3，PCV2ORF2引物上游引物PCV2F4和M13下游引物M13R。

M13F：5’-CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3’

M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

PCV F3:5’-TAAGCGGCCGCTCACTTTGGGTT-3’

PCV F4:5’-TTACTCGAGCCACCATGACTTACCCAAG-3’

按94℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，56℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8%（m/v）的琼脂糖凝胶电泳分析(图2)。

利用脂质体介导转染法（按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书操作），将筛选纯化后的杆粒rBac-PCV3ORF2经

Reagent转染sf9细胞（购自武汉大学中国典型物保藏中心）中，于28℃培养，荧光显微镜下观察报告基因EGFP的表达情况，待大部分病变后获取细胞上清，标注为F0代重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，测定毒价置4℃或-80℃保存，并送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC V201238。

该重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2具有与载体杆状病毒苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（Autographa califonica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）相同的形态学特性，培养特性等功能特性，病毒基因组为DNA，呈杆状，有囊膜包裹；其宿主范围主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。体外培养多使用来源于草地贪夜峨(Spodoptera frugiperda)卵巢的sf9和sf21，以及来源于粉纹夜峨(Trichoplusia ni)的BTI-Tn-5B1-4即Hi5细胞系，培养最适温度是26-28℃，可减少与哺乳动物细胞之间的交叉污染。

（2）重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2的鉴定

（A）Western-blot检测Cap蛋白的表达

收集F2代QP-Ac-PCV3ORF2重组病毒和感染细胞作为检测样品，以Cap蛋白单抗作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot分析，结果显示F2代重组病毒上清和感染细胞样品均能出现一条约28kD的特异条带，而sf9细胞对照组都无此特异条带，证实Cap蛋白获得表达，结果如图3所示。

（B）Cap蛋白的间接免疫荧光检测

QP-Ac-PCV3ORF2感染sf9细胞后36h进行间接免疫荧光检测，一抗为Cap蛋白单抗，二抗为CY3-羊抗鼠IgG（Sigma），最后置共聚焦显微镜下观察。结果表明感染QP-Ac-PCV3ORF2的sf9细胞中有很强红色荧光信号，而正常sf9细胞没有红色荧光信号，表明重组杆状病毒能表达Cap蛋白且具有很好的免疫活性，结果如图4所示。

（C）病毒粒子的电镜观察

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，72小时后收集病变细胞并超声波裂解。在4℃条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓缩到原体积的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27,000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS中，并用1ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60％蔗糖密度梯度进行27,00rpm/min超速离心16小时，收集最上层的蛋白带进行电镜观察，将超速梯度离心的样品送到中国科学院武汉病毒所做电镜观察。结果显示在电子显微镜下观察到大量病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs），直径约为17nm，其形态和大小都与PCV2全病毒粒子相似（图5）。

一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒在制备预防圆环病毒感染灭活疫苗中的应用，其步骤如下：

为了评价重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗在预防猪圆环病毒感染中的免疫效果，将获得的重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2以3-5pfu/cell的感染复数接种昆虫细胞HighFive^TM（购自Invitrogen公司），72h后收集病毒液，通过细胞破碎仪处理后离心除去细胞碎片，经7mM的二乙烯亚胺（BEI）灭活36~48小时即为疫苗用抗原。加入等量的硫代硫酸钠中和后与油佐剂乳化制备成灭活疫苗，存储于4℃备用。

抗体阴性28日龄长白仔猪15头，随机分成3组，每组5头。其中sf9细胞对照组5头，商品苗组5头，QP-Ac-PCV3ORF2组5头。sf9细胞对照组和实验组每头免疫1ml，商品苗组按说明书用量进行免疫，均采用颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次，从首免后14d开始前腔静脉采血每隔7d采一次，评价其免疫效果。每组选取两头仔猪于二免后14d进行攻毒。攻毒方案为：攻毒前3d和攻毒后3d注射4mL免疫刺激剂；攻毒当天称重，攻毒用PCV2毒株为WH株(严伟东，硕士学位论文，猪圆环病毒2型(PCV2)的分离鉴定及灭活疫苗的研究与应用)，攻毒剂量为10⁷TCID₅₀/头；攻毒后14天和28天采血检测抗体水平，每天观察猪只的临床反应情况，攻毒28天后称重并处死所有猪，观察剖检病变，并采集淋巴结制作病理切片观察组织病变情况。

各组抗体水平的差异性显著分析和相对平均日增重均采用双样本等方差t检验方法进行，P﹤0.05为差异显著，P﹤0.01为差异极显著。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明根据密码子的偏爱性，人工修饰合成了PCV2的免疫原性基因ORF2，提高了这些基因在杆状病毒中表达水平。

2．本发明是将合成PCV2的免疫原性基因ORF2基因以多个拷贝的形式置于杆状病毒PH启动子下串连表达，大大提高了外源基因的表达量。

3．本发明的重组杆状病毒所表达的衣壳蛋白在昆虫细胞中能成功装配成病毒样颗粒(VLP)，具有与PCV2病毒粒子相似的结构。

4．本发明的重组杆状病毒所表达包装形成的病毒样颗粒(VLP)制备灭活疫苗，免疫仔猪14天后可诱导机体产生特异性免疫反应。

附图说明

图1：为一种杆状病毒载体pFBDPHm3ORF2的酶切鉴定图谱；

M：15000bp DNA Marker；

1、2：pFBDPHm3ORF2BamHI和HindIII双酶切鉴定；

图2：为一种重组杆粒rBac-PCV3ORF2PCR鉴定示意图；

鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2转化DH10Bac，蓝白斑筛选获得阳性菌落，提取杆粒rBac-PCV3ORF2进行PCR鉴定的电泳图片。

1~4为ORF2（F3）/M13（F）引物的PCR结果，片段大小约为1200bp；

5~8为M13（R）/ORF2（F4）引物的PCR结果，片段大小约为5100bp；

9~10：water control。

图3：为一种Western blot分析杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2Cap蛋白的表达示意图；

1：杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2感染sf9细胞后收集上清的Western blotting；

2：sf9细胞后收集细胞的Western blotting；

3：杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2感染sf9细胞后收集细胞的Western blotting；

图4：为一种间接免疫荧光分析杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2Cap蛋白的表达示意图；

a-d：QP-Ac-PCV3ORF2感染sf9细胞，a：观察红火荧光，b：观察绿荧光，c:观察细胞核，d:为a-c合在一起的图片）

e-f：正常sf9cell的间接免疫荧光，e：观察红荧光，f：绿荧光（I：CY3/J：EGFP）；

图5：为一种杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2感染sf9细胞上清形成病毒样颗粒的电镜示意图。

重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2以3~5pfu/cell的感染剂量接种sf9细胞，72小时后收集病变细胞并超声波裂解和超速离心进行电镜观察，可见大量大小约为20nm的无囊膜病毒，形态与典型的PCV2相同，表明组装成病毒样颗粒VLP。

图6：为一种仔猪免疫后不同时期抗PCV2的ELISA抗体示意图

重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗、PCV2商品疫苗以及细胞对照免疫仔猪后不同时间点采集血清，检测抗PCV2的ELISA抗体。结果表明QP-Ac-PCV3ORF2组在一免后14d ELISA抗体检测即转为阳性，二免后14d仍能产生高水平的ELISA抗体。

图7：为一种仔猪PCV2攻毒后各组的增重情况示意图

攻毒前和试验结束时分别称重，计算每组平均相对日增重，结果表明疫苗组平均相对日增重都高于细胞对照组，差异性显著分析显示QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗免疫组和细胞对照组差异显著（P﹤0.05）。

具体实施方式

实施例1：一种表达人工修饰合成的PCV2的免疫原性基因ORF2基因重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2的构建

（一）、重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2的构建

1、PCV2主要免疫原性基因ORF2的人工修饰合成

参照PCV2b分离株ORF2基因序列（GenBank No.GU450327），根据密码子的偏爱性人工合成PCV2ORF2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2、杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2的构建

以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒（钱平等，一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒，专利公开号CN101624580A,专利号ZL200910063217.6）为骨架，通过NcoI和KpnI酶切pFBDPHmHNM1P10eGFP，回收大片段获得pFBDPHmHNM1。通过XhoI和HindIII分别酶切PCV2ORF2基因和pFBDPHmHNM1，回收ORF2基因和pFBDPHmHN，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHNORF2。进而通过SpeI和NotI酶切PCV2ORF2基因和pFBDPHmHNORF2,回收ORF2基因和pFBDPHmHORF2，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmH2ORF2。再通过BamHI和EcoRI分别酶切PCV2ORF2基因和pFBDPHmH2ORF2，回收ORF2基因和pFBDPHm2ORF2，然后连接，提取重组质粒，酶切鉴定表明获得有3个ORF2基因的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2。

3、重组病毒杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2的构建

（1）重组杆粒rBac-PCV3ORF2的获得与鉴定

取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF22.0μL与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞（GiBCO BRL公司产品）混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基（氯化钠浓度为10%），37℃振摇培养4h，按10^-1、10^-2、10^-3稀释后，各取100μL涂布于三抗高盐LB平板（卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书），37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-PCV3ORF2，通过两对PCR引物扩增鉴定：M13上游引物（M13F）和PCV2F3(PCV2F3)，PCV2F4上游引物(PCV2F4)和M13下游引物(M13R)。

M13F：5’-CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3’

M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

PCV F3:5’-TAAGCGGCCGCTCACTTTGGGTT-3’

PCV F4:5’-TTACTCGAGCCACCATGACTTACCCAAG-3’

其PCR扩增体系如下：

反应条件如下：

扩增的PCR产物经0.8%（m/v）的琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明能够扩增出5100bp和1200bp的两条特异目的带，大小与预期一致，表明在大肠杆菌中外源基因ORF2已重组入杆状病毒基因组中（图2）。

（2）重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2获得

无菌挑取含重组杆粒rBac-PCV3ORF2的阳性菌落于高盐LB液体培养基中，培养至细菌对数生长期时，收集菌体用0.3mL溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)）重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH,1%SDS,现用现配)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III（3mol/L的乙酸钾，pH5.0）混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70%乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL TE中，可立即使用或-20℃保存，避免反复冻融。

利用脂质体介导转染法（按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书操作），将筛选纯化后的重组杆粒rBac-PCV3ORF2经

Reagent转染sf9细胞（购自武汉大学中国典型物保藏中心）中，于28℃培养，分别在转染后24h、48h、72h利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，在转染72h后收集细胞上清即获得重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，测定毒价后置于-80℃保存。

（二）、重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2外源基因的表达以及空衣壳粒子VLP的形成

1、重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2表达外源蛋白的Western blot分析

将sf9细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长成80-90%单层时，用1个MOI重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2接种sf9细胞，感染72小时后90％以上的sf9细胞发生病变，收集病变细胞并超声波裂解。经SDS-PAGE转膜后以本实验室何启盖教授制备的Cap蛋白单抗为一抗（硕士论文：陈冬焕；表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定。导师：何启盖），HRP标记的羊抗鼠IgG（Sigma）为二抗进行Western-blotting检测ORF2基因的表达。结果显示重组病毒QP-Ac-PCV3ORF2感染上清和感染细胞样品均能出现一条约28kD的特异条带，而sf9细胞对照无此特异条带，证实Cap蛋白获得表达，结果如图3所示。

2、间接免疫荧光鉴定外源基因的表达

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，36h后固定细胞，以本实验室何启盖教授制备的Cap蛋白单抗为一抗（硕士论文：陈冬焕；表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定。导师：何启盖），二抗为CY3-羊抗鼠IgG（Sigma）进行间接免疫荧光，最后置共聚焦显微镜下观察。感染QP-Ac-PCV3ORF2的sf9细胞中均有很强红色荧光信号，而sf9细胞没有红色荧光信号，表明重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2能表达Cap蛋白且具有很好的免疫活性，结果如图4所示。

3、重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2在昆虫细胞中的形成病毒样颗粒的检测

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，72小时后收集病变细胞并超声波裂解。在4℃条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓缩到原体积的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27,000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS中，并用1ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60％蔗糖密度梯度进行27,00rpm/min超速离心16小时，收集最上层的蛋白带进行电镜观察，结果显示在电子显微镜下观察到大量病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs），直径约为17nm，其形态和大小都与PCV2全病毒粒子相似（图5）。

实施例2：重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗的制备

1、灭活疫苗配置

以实施例1获得的重组杆状病毒以3-5pfu/cell的感染复数接种（悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM,购自Invitrogen公司）sf9细胞，72h后收集细胞及上清，通过细胞破碎仪处理后离心除去细胞碎片，经7mM的二乙烯亚胺（BEI)灭活36~48小时，加入等量的硫代硫酸钠中和后与油佐剂乳化制备成灭活疫苗，存储于4℃备用。

2、重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗技术指标的检验

（1）物理形状

外观本品为乳白色均匀乳剂。

剂型为油乳剂型，取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状，不扩散。

粘度用出口内径为1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右的室温下，令其垂直流出，在8秒钟内应流出0.4mL以上判为合格。

（2）无菌检验

按照《中国兽药典》附录169-171页进行，应该无菌生长。

（3）安全检验

接种16-18克左右的小白鼠5只，每只皮下注射0.3ml，观察14天小鼠应健活。接种1.5-2kg健康家兔2只，每只臀部皮下注射5ml，观察14天应健活且无不良反应。

（4）效力检验

接种体重10-20kg左右的PCV2抗体阴性、健康断奶仔猪5头，各颈部肌肉注射疫苗3ml。于注苗后28天采血，分离血清测定抗PCV2的ELISA抗体水平。

实施例3：重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗的安全性、免疫效力实验

（一）本发明的重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗的安全性试验

1．新生仔猪安全性试验

将实验室制备的灭活疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康1日龄初生仔猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量4mL圆环病毒油乳剂灭活疫苗，另设4头猪为空白对照。所有仔猪在注射疫苗前以及注射疫苗后1周，每天测量2次体温并观察猪的生长状况、精神和食欲，连续观察14天。疫苗接种当天体温上升0.2-0.5℃，第二天恢复正常，精神和食欲正常，无不良反应，表明疫苗对新生仔猪是安全的。

2．断奶仔猪安全性试验

将实验室制备的灭活疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康30日龄断奶仔猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量6mL圆环病毒油乳剂灭活疫苗，另设4头猪为空白对照，同上观察14天。疫苗接种当天体温上升0.1-0.3℃，第二天恢复正常，精神和食欲正常，无不良反应，表明疫苗对断奶仔猪是安全的。

3．妊娠母猪安全性试验

将实验室制备的灭活疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康80日龄妊娠母猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量10mL圆环病毒油乳剂灭活疫苗，另设2头猪为空白对照。相同条件下饲养至产仔，观察疫苗对妊娠母猪繁殖性能产生的影响和新生仔猪发育情况，疫苗接种后体温、精神和食欲正常，无流产、死胎、木乃伊等现象，表明疫苗对妊娠母猪是安全的。

（二）本发明的重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2灭活疫苗的免疫效力试验

1．仔猪的免疫效力试验

抗体阴性28日龄长白仔猪15头，随机分成3组，每组5头。其中sf9细胞对照组5头，商品苗组5头，QP-Ac-PCV3ORF2组5头。sf9细胞对照组和实验组每头免疫1ml，商品苗组按说明书用量进行免疫，均采用颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次，从首免后14d开始前腔静脉采血每隔7d采一次，评价其免疫效果。

首免后14d开始前腔静脉采血，之后一周采一次至二免后14d结束，分离血清后，ELISA方法检测血清PCV2抗体水平。结果见图6，QP-Ac-PCV3ORF2组在一免后14d ELISA抗体检测即转为阳性，二免后14d都能产生高水平的ELISA抗体，PCV2商品疫苗组在一免后21d抗体水平转为阳性，与之相比两个试验组都能达到相近的抗体水平，而细胞对照组抗体水平也逐渐升高，但其总体变化不明显。差异性显著分析显示，在一免后14d QP-Ac-PCV3ORF2组较商品疫苗组和阴性组差异极显著（P﹤0.01）；而在二免后14d，QP-Ac-PCV3ORF2组和商品疫苗组较阴性组也存在差异极显著（P﹤0.01），QP-Ac-PCV3ORF2组和商品疫苗组之间差异不显著，显示试验组具有很好的免疫效果。

2、仔猪攻毒试验结果

在仔猪的免疫效力试验中，每组选取两头仔猪于二免后14d进行攻毒。攻毒方案为：攻毒前3d和攻毒后3d注射4mL免疫刺激剂；攻毒当天称重，攻毒所用毒株为PCV2WH株(严伟东，硕士学位论文，猪圆环病毒2型(PCV2)的分离鉴定及灭活疫苗的研究与应用)，攻毒剂量为10⁷TCID₅₀/头；攻毒后14天和28天采血检测抗体水平，每天观察猪只的临床反应情况，攻毒28天后称重并处死所有猪，观察剖检病变，并采集淋巴结制作病理切片观察组织病变情况。

2.1临床症状和增重情况

攻毒后，细胞对照组从第8d开始2头仔猪精神较沉郁、被毛出现粗乱，第10d时恢复正常，采食和精神状态良好，无体温升高情况。亚单位疫苗组和商品苗组在攻毒后这段时间内都没有出现异常情况，采食、精神状态以及体温等都正常。攻毒前和试验结束时分别称重，计算每组平均相对日增重，结果表明QP-Ac-PCV3ORF2疫苗组平均相对日增重明显高于细胞对照组，结果见图7。

2.2剖检病理变化

所有猪处死后，剖检观察病变情况。试验组和商品苗组各有一头（1/2）肺有实变，且有部分塌陷，淋巴结、肾脏和脾脏均较正常；而细胞对照组两头肺都发生实变、有出血点，病变严重，细胞对照组中有一头腹股沟淋巴结边缘出血，肺门淋巴结出血严重，肾脏和脾脏较正常。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用

<130> 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒2型病毒

<400> 1

atgacttacc caagacgtag attcagaaga agacgtcacc gtcctcgttc ccacctggga 60

caaattctga gacgtagacc atggttggtt cacccaagac acagataccg ttggcgtaga 120

aagaacggta tcttcaacac aagattgtct cgtacaatcg gttacactgt caagaagacc 180

accgtcagaa ccccatcttg gaacgttgac atgatgagat tcaacatcaa cgacttcctg 240

ccacctggtg gtggtagcaa cccactcacc gtccctttcg agtactacag aatccgtaag 300

gttaaggttg agttctggcc atgctctcct atcacccaag gagacagagg tgtcggtagc 360

actgctgtca tcctggacga caacttcgtt actaaggcca acgctctgac ctacgaccct 420

tacgtcaact acagctctag acacaccatt actcaaccat tcagttacca ctcccgttac 480

ttcaccccaa agcctgtcct ggaccgtact attgactact tccaaccaaa caacaagcgt 540

aaccagctgt ggctgagact gcaaactaca ggaaacgtcg accacgttgg tctgggaacc 600

gccttcgaga actccatcta cgaccaggac tacaacatca gaatcacaat gtacgtccag 660

ttcagagagt tcaacctgaa ggaccctcca ctgaacccaa agtga 705

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒2型病毒

<400> 2

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

Claims

1.一种人工合成的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因的重组杆状病毒，其特征在于：重组杆状病毒 QP-Ac-PCV3ORF2 Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus QP-Ac-PCV3ORF2，CCTCC NO：V201238。

3.一种含有权利要求1所述基因的杆状病毒转移载体pFBDPHm3ORF2。

4.权利要求2所述的重组杆状病毒在制备预防猪圆环病毒感染灭活疫苗中的应用。