CN102925486A

CN102925486A - 一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用

Info

Publication number: CN102925486A
Application number: CN2012102705046A
Authority: CN
Inventors: 朱薇; 熊媛媛; 漆世华; 张萍; 秦红刚; 李伟; 廖园园; 谢红玲; 温文生; 王桢桢; 靖志强; 吴玉石; 韩兴; 刘洁
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: CN102517331A; CN102925486B

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用，所述重组杆状病毒含有双启动子（多角体蛋白启动子和P10启动子），可表达双拷贝的Cap蛋白编码基因，显著提高了蛋白的表达效率。并且，插入的外源基因所表达的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒（VLPs），提高了表达蛋白的免疫原性，且生产的抗原含量高。本发明的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，显著提高了猪圆环病毒2型亚单位疫苗的蛋白产率及质量，所制得的疫苗组合物具有免疫效果稳定、持久、安全性高等优点。

Description

一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用

技术领域

本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特征，病猪主要表现生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。自1991年在加拿大猪群中爆发PMWS以来，PMWS已给全世界养猪业造成极大的经济损失。PCV2不但可以引发断奶仔猪多系统的衰竭，还能够使感染猪的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，引起继发感染，加重病情。此外，PCV2还与母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、猪皮炎肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征等病症相关。近年来，我国猪群也有PMWS流行，所造成的危害十分严重。

疫苗免疫是控制PCV2感染及其相关疾病的重要手段。目前，国内生产的疫苗为全病毒灭活疫苗，如文献CN101240264A公开了一种全病毒灭活疫苗，但PCV2在体外细胞内增殖能力弱，培养难度较大，病毒最终滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制备高质量PCV2疫苗需要浓缩病毒抗原，这将直接导致疫苗生产成本高昂，不能满足动物疫苗质优价廉的实际要求。文献CN101180406A、CN101884787A和CN101358182A均公开了用重组杆状病毒表达PCV2 ORF2基因编码的Cap蛋白，并将其用于制备PCV2疫苗，其中，所描述的重组杆状病毒都只含有一个启动子，且未优化其生产工艺条件，致使生产获得的病毒蛋白产率及质量均较低，且所表达的目的基因有其它多余序列（如6×His标签、分泌性信号肽等）的修饰，不利于表达的外源蛋白形成病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），这些重组杆状病毒构建技术策略存在表达的目的蛋白免疫原性部分丧失的缺陷。此外，由于该亚单位疫苗的佐剂和免疫刺激物等因素影响，其实践中的免疫效果并不佳。因此，急需研制一种产率更高、免疫原性及免疫效果更佳的PCV2亚单位疫苗及其制备方法和其所制备的疫苗组合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pFastBac Dual转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的一个优选技术方案中，所述PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamHI/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dual-2ORF2。

本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得本发明所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2ORF2；

（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；

（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，产生重组杆状病毒DNA。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。

本发明的另一目的在于提供一种重组杆状病毒，由本发明所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法制得。

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。

本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得本发明制备的重组杆状病毒；

（2）培养宿主细胞，接种步骤（1）的重组杆状病毒；

（3）灭活病毒；

（4）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白；

（5）用纯化的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的步骤（2）包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数（MOI）为0.001-10的量接种步骤（1）所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2 Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。

在本发明的一个优选技术方案中，所述生物反应器的培养参数设定为：pH6.0-6.5，温度25-30℃，溶氧30-80%，搅拌速度50-250rpm，优选所述生物反应器的培养参数设定为pH6.2，温度27℃，溶氧50%，搅拌速度100-180rpm。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（2）包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（2）采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（2）采用分批补料培养方法。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（3）包括向细胞培养液中加入二乙烯亚胺（BEI）灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并可选的，在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（4）包括收集步骤（3）灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2 Cap蛋白的细胞培养上清。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（5）包括对步骤（4）纯化的重组PCV2 Cap蛋白进行定量，加入佐剂，制备疫苗。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗包括不低于8μg/ml的重组PCV2Cap蛋白。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗还包括适量的防腐剂。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗还包括免疫刺激复合物或QuilA皂苷的任一种，优选所述免疫刺激复合物由Quil A皂苷、胆固醇和磷脂组成，其中，Quil A皂苷：胆固醇：磷脂的质量比为1:1:1。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗还包括适量的佐剂。

在本发明的一个优选技术方案中，所述佐剂选自水性佐剂、油性佐剂、纳米佐剂或缓释佐剂的任一种或其组合，优选所述的水性佐剂选自氢氧化铝胶佐剂，赛比克Gel 01ST佐剂或Carbopol 971P NF佐剂的任一种或其组合。

在本发明的一个优选技术方案中，每头份所述的亚单位疫苗包括：不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂、0.1%的Carbopol 971P NF佐剂、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂的任一种，组成为50μg/ml Quil A皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物或50μg/ml Quil A皂苷的任一种，按疫苗最终体积计，含量不高于0.01%的硫柳汞。

本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，利用本发明所述重组杆状病毒制备得到。

本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，由本发明所述的制备方法制备得到。

在本发明的一个优选技术方案中，每头份所述的亚单位疫苗包括：不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，50μg/ml Quil A皂苷。

在本发明的一个优选技术方案中，每头份所述疫苗组合物的组成包括：不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂、0.1%的Carbopol 971P NF佐剂、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂的任一种，组成为50μg/ml Quil A皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物或50μg/ml Quil A皂苷的任一种，按疫苗最终体积计，含量不高于0.01%的硫柳汞。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的重组杆状病毒转移载体在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的重组杆状病毒在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗用于预防由猪圆环病毒2型（PCV-2）感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。

为了清楚表述本发明的保护范围，本发明对下述术语进行如下界定：

本发明所述的免疫刺激复合物由Quil A皂苷、胆固醇和磷脂组成，其中，Quil A皂苷：胆固醇：磷脂的质量比为1:1:1，该复合物能形成一种具有较高活性的脂质小泡，又是一种全新的抗原递呈系统，对机体有免疫增强作用，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可产生“全面”免疫应答的效力，并长期增强特异性抗体应答。

本发明所述的“每头份”是指每头猪每次免疫的剂量。

本发明所述的赛比克Gel 01 ST佐剂（购自法国Seppic公司），主要含有高分子的丙烯酸酯聚合物。

本发明所述的Carbopol 971P NF佐剂（购自美国Noveon公司），主要含有丙烯酸键合烯丙基蔗糖。

除非另有说明，本发明所述的百分比为液体与液体之间的百分比时为体积/体积百分比，当百分比为液体与固体之间的百分比时为体积/重量百分比，当百分比为固体与液体之间的百分比时为重量/体积百分比，其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述优点：

1、经试验验证，本发明采用中国流行的PCV2b亚型的编码Cap蛋白的基因序列可针对性地用于预防中国流行的猪圆环病毒病；

2、本发明所述重组杆状病毒含有双启动子（多角体蛋白启动子和P10启动子），可表达双拷贝的Cap蛋白编码基因，显著提高了蛋白的表达效率；并且，插入的外源基因所表达的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒（VLPs），提高了表达蛋白的免疫原性，且生产的抗原含量高；

3、本发明的制备方法利用生物反应器、大规模无血清悬浮培养sf9昆虫细胞，并将其用于制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗，显著提高了猪圆环病毒2型亚单位疫苗的病毒蛋白产率及质量，所制得的疫苗组合物具有免疫效果稳定、持久、安全性高等优点；

4、本发明制备的猪圆环病毒2型亚单位疫苗具有良好的安全性和免疫效力，能够对猪抵抗圆环病毒2型感染提供良好的免疫保护；

5、本发明提供的应用生物反应器猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，具有设备占地面积小、生产规模大、生产效率高，并可实现生产自动化控制和工业化生产等优点。

附图说明

图1本发明的重组杆状病毒转移载体构建流程图。

图2本发明的重组杆状病毒构建流程图。

图3单拷贝、双拷贝重组bacmid PCR鉴定图。

其中图3A：双拷贝重组bacmid鉴定；1、阴性对照；2、3、marker；4、PUC M13F/R引物鉴定结果。

图4本发明的PCV2亚单位疫苗制备工艺流程图。

图5本发明表达的Cap蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）电镜图片。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1重组杆状病毒的构建

使用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒，根据GENBANK公布的基因序列（NCBI登陆号EU340257.1）设计以下引物：

P1：TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG

P2：GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC

P3：TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG

P4：GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC

以PCV2b株病毒ORF2序列为模板（该模板根据已公布的PCV2b ORF2序列：登陆号EU340257.1合成获得），P1，P2扩增PCV2 ORF2基因，并将该基因克隆入pMD-19T载体中，获得重组载体pMD-19T-ORF2-1，以PCV2b株病毒ORF2序列为模板，P3，P4扩增PCV2ORF2基因，并将该基因克隆入pMD-19T载体中，获得重组载体pMD-19T-ORF2-2。

通过BamH I和Hind III双酶切pMD-19T-ORF2-1，将ORF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual中，构建载体pFastBac Dual-ORF2；通过Kpn I和Xho I双酶切pMD-19T-ORF2-2，将ORF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual-ORF2中，构建包含双拷贝ORF2基因的重组转移载体pFastBac Dual-2ORF2，将该重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac，获得插入双拷贝ORF2基因的重组质粒bacmid-2ORF2（PUC M13 F/R引物鉴定bacmid结果见图3A），将该重组质粒bacmid-2ORF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状病毒rBac-2ORF2（ORF2序列如SEQ ID NO：1所述），扩增重组杆状病毒rBac-2ORF2作为种毒备用。将重组转移载体pFastBac Dual-ORF2转化大肠杆菌DH10Bac，获得插入单拷贝ORF2基因的重组质粒bacmid-ORF2，将该重组质粒bacmid-ORF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状病毒rBac-ORF2（ORF2序列如SEQ ID NO：1所述），扩增重组杆状病毒rBac-ORF2备用（PUC M13 F/R引物鉴定bacmid结果见图3B）。

实施例2昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及Cap蛋白的表达定量

在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cells/ml，活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cells/ml。当细胞浓度达到3-5×10⁶cells/ml时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-5×10⁶cells/ml，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-8×10⁶cells/ml时，接种重组病毒rBac-2ORF2或rBac-ORF2，感染复数（MOI）为0.001-10，反应器培养条件为pH6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50%、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入终浓度为5mmol/L的BEI，37℃作用24h后，加1mol/L Na₂S₂O₃至终浓度5mmol/L终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。

制备的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通过ELISA定量检测。用包被缓冲液稀释纯化的捕获抗体兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1%BSA封闭1小时。加入不同浓度的抗原标准品（通过CsCl密度梯度离心纯化的形成病毒样颗粒VLPs的Cap蛋白）和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体-抗PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2MH₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Cap蛋白的量。

使用三种不同MOI（0.01、0.1、1）接种两种不同的病毒，分别于接种后7-11天取样定量分析培养上清中的目的蛋白含量，结果见表1。

表1不同感染复数接种两种病毒蛋白表达量（μg/ml）分析

由Cap蛋白定量结果表明，使用生物反应器无血清悬浮培养表达Cap蛋白，在最适MOI（MOI=0.1）下，其表达量可达180μg/ml，相同条件下使用单拷贝目的基因的重组杆状病毒表达Cap蛋白（仅含多角体蛋白启动子），其表达量仅为70μg/ml。由此可见，本发明所述构建策略可以大幅提高Cap蛋白的表达水平。

实施例3VLP颗粒的纯化及电镜观察

收获表达细胞培养物，将细胞培养物10000g，4℃离心30min，去细胞碎片，取上清，将上清31000rpm离心3h（Beckman SW70转子），将沉淀用少量PBS重悬，待沉淀完全溶解后，按2.1g/4.5ml溶液加入CsCl，混合均匀后，分装到5ml超速离心管中，补加PBS，到距管口2-3mm处，精确配平后，149000g，10℃离心24h。离心后，可见两条淡黄色透明带。将目的带（下层带）吸出收集，即为纯化的病毒样颗粒。

取同等条件下，培养等量的rBac-ORF2和rBac-2ORF2表达的细胞培养物，按上述方法处理，将吸出的目的带稀释到相同体积，取样进行磷钨酸负染，电镜观察。结果如图5所示，其中，图5A为rBac-ORF2单拷贝表达样品纯化后电镜观察图片，图5B为rBac-2ORF2双拷贝表达样品纯化后电镜观察图片。可见，rBac-2ORF2能表达出更多的病毒样颗粒，具有良好的免疫原性。

实施例4昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养条件优化

本实施例采用批式培养方法和分批补料培养方法对悬浮培养条件进行优化，其中，Cap蛋白表达定量方法同实施例2。

批式培养中，于10L生物反应器中，按照5×10⁵cells/ml接种sf9细胞，当细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，接种重组病毒rBac-2ORF2，培养7天，收获细胞培养物，测定Cap蛋白的表达量。

分批补料培养中，于10L生物反应器中，按照5×10⁵cells/ml接种sf9细胞，当细胞密度达到8×10⁶cells/ml时，接种重组病毒rBac-2ORF2，同时按照每天1/1000培养体积的量进行补料，培养7天，收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。测定Cap蛋白的表达量。

Cap蛋白定量结果表明：批式培养表达量为150μg/ml，而分批补料培养表达量达221μg/ml。可见，使用分批补料培养方法能大幅提高细胞培养密度及Cap蛋白的表达水平。

实施例5疫苗佐剂比较研究

按照以下不同佐剂配制疫苗组合物：

佐剂1疫苗：按疫苗抗原总体积的1%加入乙基苯基聚乙二醇（NP-40），室温搅拌2h；按疫苗抗原中蛋白浓度计算抗原头份数（每头份8μg抗原），加主要成分为Quil A皂苷、胆固醇和磷脂免疫刺激复合物（其中，Quil A皂苷：胆固醇：磷脂的质量比为1:1:1，每头份50μg，即每头份中含有50μg Quil A皂苷+50μg胆固醇+50μg磷脂），室温搅拌2h；加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算）；用PBS稀释疫苗至1ml每头份，按每头份1mg加入氢氧化铝胶佐剂，混合均匀；定量分装，加盖密封。

佐剂1疫苗的每头份包括：8μg/ml的PCV2 Cap蛋白、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂、组成为50μg/ml Quil A皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物、一定浓度的NP-40，以及按疫苗最终体积计算不高于0.01%的防腐剂硫柳汞。

佐剂2疫苗：按疫苗抗原总体积的1%加入乙基苯基聚乙二醇（NP-40），室温搅拌2h；按疫苗抗原中蛋白浓度计算抗原头份数（每头份8μg抗原），加Quil A皂苷（每头份50μg），室温搅拌2h；加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算）；按每头份1mg加入氢氧化铝胶佐剂，用PBS稀释疫苗至1ml每头份，混合均匀；定量分装，加盖密封。

佐剂2疫苗的每头份包括：8μg/ml的PCV2 Cap蛋白、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂、50μg/ml Quil A皂苷、一定浓度的NP-40，以及按疫苗最终体积计算不高于0.01%的防腐剂硫柳汞。

佐剂3疫苗：按疫苗抗原总体积的1%加入乙基苯基聚乙二醇（NP-40），室温搅拌2h；按疫苗抗原中蛋白浓度计算抗原头份数（每头份8μg抗原），加Quil A皂苷（每头份50μg），室温搅拌2h；加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算）；用PBS稀释疫苗至0.9ml每头份，按每头份0.1ml加入赛比克Gel 01 ST佐剂（购自法国Seppic公司），混合均匀；定量分装，加盖密封。

佐剂3疫苗的每头份包括：8μg/ml的PCV2 Cap蛋白、50μg/ml Quil A皂苷、一定浓度的NP-40，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂，以及按疫苗最终体积计算不高于0.01%的防腐剂硫柳汞。

佐剂4疫苗：佐剂2疫苗：按疫苗抗原总体积的1%加入乙基苯基聚乙二醇（NP-40），室温搅拌2h；按疫苗抗原中蛋白浓度计算抗原头份数（每头份8μg抗原），加Quil A皂苷（每头份50μg），室温搅拌2h；加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算）；用PBS稀释疫苗至0.8ml每头份，按每头份0.2ml加入0.5%的Carbopol 971P NF佐剂（购自美国Noveon公司），混合均匀；定量分装，加盖密封。

佐剂4疫苗的每头份包括：8μg/ml的PCV2 Cap蛋白、50μg/ml Quil A皂苷、一定浓度的NP-40，终浓度为0.1%的Carbopol 971P NF佐剂，以及按疫苗最终体积计算不高于0.01%的防腐剂硫柳汞。

佐剂5疫苗：按每头份1mg/ml加入氢氧化铝胶佐剂，用PBS稀释疫苗至1ml每头份（每头份8μg/ml抗原），加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算），混合均匀，定量分装，加盖密封。

将购回的仔猪55头，分为5组，第一组到第四组分别为10头，经肌肉接种佐剂1疫苗、佐剂2、佐剂3、佐剂4、佐剂5疫苗。第6组（5头仔猪）作为空白对照（即非免疫组）。免疫前和免疫后第7天、第14天、第21天、第28天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天对每组仔猪采血，分离血清用于抗体检测，结果见表2。

表2不同佐剂免疫后抗体检测结果

注：“-”表示抗体检测结果为阴性。以OD值为阳性的血清的最大稀释度为抗体效价。

根据抗体检测结果可以看出，与未添加Quil A皂苷的佐剂5疫苗相比，添加了免疫刺激复合物的佐剂1疫苗、添加了Quil A皂苷的水性佐剂疫苗佐剂2疫苗、佐剂3疫苗和佐剂4疫苗的抗体产生快，抗体持续期长，在免疫后28天，抗体效价能达到较高水平，且抗体持续期较长，能显著刺激机体产生较强的免疫反应，显著提高了免疫效果。

实施例6猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备

使用新型的免疫刺激复合物佐剂及氢氧化铝胶佐剂配制疫苗，具体制备方法如下：

按疫苗抗原总体积的1%加入NP-40（乙基苯基聚乙二醇），室温搅拌2h；按疫苗抗原中蛋白浓度计算抗原头份数（每头份8μg抗原），加免疫刺激复合物（其主要成分为Quil A皂苷、胆固醇和磷脂的复合物），室温搅拌2h；加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算）；用PBS稀释疫苗至1ml每头份，按每头份1mg加入氢氧化铝胶佐剂，混合均匀；定量分装，加盖密封。

以上方法配置的疫苗每头份包括：8μg/ml的PCV2 Cap蛋白、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂、组成为50μg/ml Quil A皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物、疫苗抗原原液总体积1%的NP-40，以及按疫苗最终体积计算不高于0.01%的防腐剂硫柳汞。

实施例7猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备

使用QuilA皂苷和水性佐剂配制疫苗，具体制备方法如下：

按疫苗抗原总体积的1%加入乙基苯基聚乙二醇（NP-40），室温搅拌2h；按疫苗抗原中蛋白浓度计算抗原头份数（每头份8μg抗原），加Quil A皂苷（每头份50μg），室温搅拌2h；加入硫柳汞至终浓度0.01%（按疫苗的最终体积计算）；用PBS稀释疫苗至0.9ml每头份，按每头份0.1ml加入赛比克Gel 01 ST佐剂，混合均匀；定量分装，加盖密封。

每头份疫苗包括：8μg/ml的PCV2 Cap蛋白、50μg/ml Quil A皂苷、一定浓度的NP-40，体积比为10v/v%的赛比克Gel 01 ST佐剂，以及按疫苗最终体积计算不高于0.01%的防腐剂硫柳汞。

实施例8猪圆环病毒2型亚单位疫苗效力实验

对武汉某猪场进行主要病原和相关抗体检测，选用21-25日龄的猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒等病原阴性、猪圆环病毒2型抗体阴性猪20头。

将符合条件的仔猪随机分为4组，第1组（5头猪）为免疫组，给予按实施例6中配制的猪圆环病毒2型亚单位疫苗（8μg/头份）；第2组（5头猪）为免疫组，给予按实施例7中配制的猪圆环病毒2型亚单位疫苗（8μg/头份）；第3组（5头猪）为攻毒对照组；第4组（5头猪）为空白对照组。免疫后28天对第1-3组同时进行PCV2病毒（7.0lgTCID₅₀/ml）攻击，每只猪颈部肌肉注射3ml，滴鼻2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天分别在两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（1mg/ml，每部位0.5ml），攻毒后28天剖杀。第4组作为阴性对照组，单独隔离饲养，在第1-3组攻毒后28天进行剖杀。所有猪在免疫前、免疫后7天、14天、21天、28天和剖杀前采集血样，通过ELISA法进行PCV2血清抗体分析(见表3)。攻毒后28天剖检全部猪仔，符合以下三项中的两项，即可判定发病（见表4）。

A体温症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3天；

B体重标准：相对增重率下降应不低于5.0%，攻毒仔猪的平均日增重应小于非攻毒对照组仔猪的平均日增重。于攻毒当日分别逐头称量所有试验仔猪体重，攻毒后28日再次称量所有试验仔猪体重；其中，“B体重标准”中相对增重率的计算按如下公式进行：

C病毒抗原检测：用免疫组化技术检测淋巴结组织，检测到PCV2病毒。

表3抗体检测结果

表4各组试验动物发病判定结果

结果表明，免疫后28天，仔猪抗体全部转阳，攻毒后，免疫组保护率可达100%，所有试验动物均未发病。

由此可见，本发明中所述方法生产的亚单位疫苗可以给动物提供保护，能有效保护猪只抵抗PCV2感染，并且，采用新型佐剂的本发明PCV2疫苗可以显著提高疫苗的免疫效果。

Claims

1.一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pFastBac Dua1转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2，优选所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2，更优选所述PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamH I/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求1-2任一项所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dua1-2ORF2。

4.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得如权利要求1-5任一项所述的重组杆状病毒转移载体；

（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；

（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，产生重组杆状病毒DNA。

6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA转染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。

7.一种重组杆状病毒，由权利要求4-6任一项所述的方法制备得到，优选所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。

8.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得权利要求9所述的重组杆状病毒；

（2）培养宿主细胞，接种步骤（1）的重组杆状病毒；

（3）灭活病毒；

（4）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白；

（5）用纯化的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数（MOI）为0.001-10的量接种步骤（1）所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2 Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，生物反应器的培养参数设定为：pH6.0-6.5、温度25-30℃、溶氧30-80%、搅拌速度50-250rpm，优选生物反应器的培养参数设定为pH6.2，温度27℃，溶氧50%，搅拌速度100-180rpm。

11.如权利要求8-10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大的培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。

12.如权利要求8-11任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合进行培养，优选为分批补料培养方法进行培养。

13.如权利要求8-12任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）包括向细胞培养液中加入BEI灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。

14.如权利要求8-13任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）包括收集步骤（3）灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清。

15.如权利要求8-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）包括对步骤（4）纯化的重组PCV2 Cap蛋白进行定量，加入佐剂，制备疫苗。

16.如权利要求8-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的亚单位疫苗包括不低于8μg/ml的重组PCV2 Cap蛋白，优选所述的亚单位疫苗还包括适量的防腐剂。

17.如权利要求8-16任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的亚单位疫苗还包括免疫刺激复合物或Quil A皂苷的任一种，其中，所述免疫刺激复合物由Quil A皂苷、胆固醇和磷脂组成，其中，Quil A皂苷：胆固醇：磷脂的质量比为1:1:1；优选所述的亚单位疫苗还包括适量的佐剂，更优选所述佐剂选自水性佐剂、油性佐剂、纳米佐剂或缓释佐剂的任一种或其组合，还优选所述的水性佐剂选自氢氧化铝胶佐剂、赛比克Gel 01ST佐剂或Carbopol 971P NF佐剂的任一种或其组合。

18.如权利要求8-17任一项所述的制备方法，其特征在于，每头份所述的亚单位疫苗包括：不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂、0.1%的Carbopol 971P NF佐剂、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂的任一种，组成为50μg/ml QuilA皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物或50μg/ml Quil A皂苷的任一种，按疫苗最终体积计，含量不高于0.01%的硫柳汞。

19.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，利用权利要求7所述重组杆状病毒制得，或者如权利要求8-18任一项所述的方法制备得到。

20.如权利要求19所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，其特征在于，每头份所述疫苗组合物的组成包括，不低于8μg/ml的PCV2 Cap蛋白，10%（v/v）的赛比克Gel 01 ST佐剂、0.1%的Carbopol 971P NF佐剂、1mg/ml的氢氧化铝胶佐剂的任一种，组成为50μg/ml Quil A皂苷、50μg/ml胆固醇和50μg/ml磷脂的免疫刺激复合物或50μg/mlQuil A皂苷的任一种，按疫苗最终体积计，含量不高于0.01%的硫柳汞。

21.权利要求1-3任一项所述的重组杆状病毒转移载体或者权利要求7所述重组杆状病毒在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用，优选所述的PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗用于预防由猪圆环病毒2型感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。