CN103555746A - 重组猪圆环病毒2型病毒样粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组猪圆环病毒2型病毒样粒子，将来源于HSV-1VP22的蛋白转导域通过SOE-PCR方法与形成PCV2空衣壳蛋白所需的抗原Cap基因连接起来，克隆到杆状病毒转运载体获得同源重组载体，包装产生含有PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白转导域的重组杆状病毒，感染昆虫细胞，表达融合了PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白转导域的重组Cap-VP22蛋白，形成病毒样粒子（VLPs）。研究表明，本发明的VLPs单独或者辅以佐剂接种动物，可有效刺激PCV2特异性抗体产生。因此，应用本发明可研制具有良好免疫效果的新型高效PCV2亚单位疫苗。

Description

重组猪圆环病毒2型病毒样粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于猪圆环病毒2型技术领域，尤其涉及一种重组猪圆环病毒2型病毒样粒子及其制备方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是作为一种猪肾细胞系PK-15培养污染物而被发现的，其基因组为共价闭合的单股环状DNA分子，基因组全长约1.7kb。PCV是迄今为止人们发现的最小动物病毒，病毒粒子表面无囊膜，呈二十面体对称，粒子直径在17-20nm之间。根据PCV的致病性、血清型和基因型特点，将其分为非致病性的PCV1和致病性的PCV2两种类型。其中，PCV2是引起猪圆环病毒病（PCVD）的主要病原。PCV2基因组全长为1767bp或1768bp，由11个开放阅读框（ORF）组成，ORFs之间差异悬殊，并且大部分ORFs都有部分重叠，ORF1和ORF2是PCV2最大的编码基因，ORF1编码与病毒基因组复制相关的Rep蛋白，而ORF2编码病毒的主要结构蛋白Cap。Cap蛋白是组成病毒衣壳的唯一结构蛋白和主要的抗原表位聚集区，其氨基末端有序列高度保守的精氨酸富集区，与病毒DNA的结合密切相关，Cap蛋白是公认的PVC2的主要保护性抗原。

众所周知，疫苗是防控传染病的最有效手段。2006年，法国梅里亚公司率先研制出经欧盟认证的首例PCV2全病毒灭活苗；在国内，刘长明等成功研制出我国首例PCV2灭活苗（LG株），此外姜平等研制的PCV2疫苗（SH株）也已注册上市，这两种疫苗的成功研制和应用一定程度上防控了我国PCV2的流行。但是，由于灭活苗具有免疫持续时间短，免疫注射副作用大，不能刺激机体产生细胞免疫等缺点，使得其免疫效果不尽人意。弱毒苗通常能诱导机体产生坚实的免疫力和持久保护力，但是弱毒苗毒力易反强、致弱毒力评价难，安全性存在隐患，因此国内外对PCV2弱毒苗的研究鲜有报道。DNA疫苗有制备简单、免疫效果好等诸多优点，但由于缺少高效的基因输送系统，外源基因在体内的表达调控及其在体细胞间的转移，可能会产生意外的免疫病理反应等瓶颈问题难以突破使得大部分DNA疫苗的研究仅局限于实验室。其它一些重组病毒疫苗、亚单位疫苗对PCV2有一定的保护效果，但都由于安全性低，免疫效果差等种种原因还处于研发阶段。因此，克服目前PCV2活苗、灭活苗以及基因工程疫苗缺点，寻找新的技术策略，研发一种安全、高效非复制的病毒疫苗是有效免疫防控PCV2的重要科学前提。

病毒样粒子（Virus-like particles，VLPs），是由病毒主要衣壳蛋白或包膜蛋白自主包装形成的衣壳结构，不含有遗传物质，其形态、大小、结构及表面抗原和多肽表位与天然病毒粒子非常相似，因而能够被宿主抗原提呈细胞所识别，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，具有良好的免疫原性，并且无潜在的毒副作用。目前，国外已有部分VLPs疫苗上市，如乙肝VLPs疫苗、乳头瘤VLPs疫苗、流感VLPs疫苗等，此外还有戊型肝炎VLPs疫苗等多个品种在临床研究中，显示出该类疫苗的巨大潜力。研究证实，PCV2的Cap蛋白在体外表达过程中具有自我组装成病毒样粒子的特点，近年来，先后有利用大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和昆虫/杆状病毒表达系统在体外制备出Cap蛋白的VLPs，在小鼠和猪体内免疫实验中，这些病毒样粒子都表现出良好的免疫原性。来源于HSV-1VP22转录因子的转导域具有强大的蛋白转导功能，能将与其偶联的外源蛋白带入细胞并通过MHC-I类分子介导的抗原提呈，激发抗原特异性CTL效应。VP22转导域的功能已广泛应用于DNA疫苗及肿瘤疫苗的研究中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组猪圆环病毒2型病毒样粒子及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：Cap-VP22融合基因，该基因由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白转导域核苷酸序列形成。

上述Cap-VP22融合基因，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

上述Cap-VP22融合基因在制备预防猪圆环病毒病（PCVD）的疫苗（PCV2疫苗）中的应用。

重组猪圆环病毒2型病毒样粒子，该病毒样粒子由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白转导域核苷酸序列形成的Cap-VP22融合基因所编码。

上述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子，具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

上述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子的制备方法，将来源于HSV-1VP22的蛋白转导域通过SOE-PCR方法与形成PCV2空衣壳蛋白所需的抗原Cap基因连接起来，克隆到杆状病毒转运载体获得同源重组载体，包装产生含有PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白转导域的重组杆状病毒，感染昆虫细胞，表达融合了PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白转导域的重组Cap-VP22蛋白，形成病毒样粒子（VLPs）。

上述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子的制备方法，包括以下步骤：

（1）克隆目的基因Cap-VP22，并通过BamHI/NotI和NheI/KpnI双酶切位点分别在

pFastBac Dual转移载体P10和Ph启动子之后各插入一个拷贝的目的基因Cap-VP22，获得含双拷贝目的基因的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2Cap-VP22；

（2）用步骤（1）获得的pFastB Dual-2Cap-VP22转移载体转化DH10Bac感受态细胞，进行同源重组；

（3）筛选鉴定获得携带有目的基因Cap-VP22的重组杆状病毒DNA；

（4）用步骤（3）获得的重组杆状病毒DNA以脂质体法转染对数生长期的Sf9细胞，产生表达融合基因Cap-VP22的重组杆状病毒；

（5）用步骤（4）获得的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，使感染细胞表达Cap-VP22基因；

（6）收集步骤（5）获得的感染细胞培养液并裂解感染有Cap-VP22基因重组杆状病毒的宿主细胞，纯化获得重组猪圆环病毒2型病毒样粒子(Cap-VP22VLPs)。

上述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子在制备预防猪圆环病毒病（PCVD）的疫苗（PCV2疫苗）中的应用。

针对目前缺乏安全高效防控猪圆环病毒病的疫苗（PCV2疫苗）的问题，发明人首次提出了用杆状病毒表达系统表达融合PCV2Cap与VP22融合基因，设计并制备了一种重组猪圆环病毒2型病毒样粒子，包括利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中大量表达C端融合具有细胞穿膜功能的VP22蛋白转导域的PCV2重组Cap蛋白，体外组装形成嵌合病毒样粒子。具体操作是首先对PCV2Cap全基因序列进行扩增，再用SOE-PCR的方法在Cap的C端引入VP22蛋白转导域，构建包含目的基因Cap、VP22的重组杆状病毒，重组杆状病毒感染Sf9细胞获得相应的PCV2病毒样粒子。研究表明，该重组融合蛋白基因具有高度组装成病毒样粒子的能力；融合表达PCV2Cap蛋白和VP22蛋白转导域的重组杆状病毒能够对目的蛋白Cap-VP22进行有效表达，并且表达的目的蛋白免疫原性好，并形成病毒样粒子；表达的重组蛋白（即病毒样粒子，VLPs）能诱导针对PCV2的特异抗体，与单纯的Cap蛋白相比，具有增强免疫的效果；形成的VLPs可以单独或者辅以佐剂接种动物，可有效刺激PCV2特异性抗体产生。因此，应用本发明可研制具有良好免疫效果的新型高效PCV2亚单位疫苗。

附图说明

图1是Cap、VP22、Cap-VP22基因克隆电泳图。

图2是pEASY-Cap-VP22克隆载体鉴定电泳图，图中M1：DNA MarkerⅢ，1和2：pEASY-Cap PCR鉴定，3和4：pEASY-Cap酶切鉴定，5和6：pEASY-Cap-VP22PCR鉴定，7和8：pEASY-Cap-VP22酶切鉴定，M2：1kb DNA Ladder。

图3是pFastBac Dual-2Cap-VP22重组载体鉴定电泳图，图中M1：DNA MarkerⅢ，1：pFastBac Dual-Cap酶切鉴定，2和3：pFastBac Dual-2Cap酶切鉴定，4：pFastBac-2Cap PCR鉴定，5：pFastBac-Cap-VP22酶切鉴定，6和7：pFastBac-2Cap-VP22酶切鉴定，8：pFastBac-2Cap-VP22PCR鉴定。

图4是Bacmid重组子鉴定电泳图，图中M：1kb DNA Ladder，1：Bac-2Cap重组子PCR鉴定，2：Bac-2Cap-VP22重组子PCR鉴定。

图5是Sf9细胞观察图，图中A：正常培养Sf9细胞，B：转染Bac-2Cap细胞，C：转染Bac-2Cap-VP22细胞。

图6是间接免疫荧光检测图，图中A：正常Sf9，B：Bac-2Cap接种细胞，C：Bac-2Cap-VP22接种细胞。

图7是病毒样粒子电镜观察图，图中A：Cap蛋白形成病毒样粒子，B：Cap-VP22蛋白形成病毒样粒子。

图8是PCV2抗体检测图，图中1Cap为注射Cap VLPs亚单位疫苗组，2Cap-VP22为注射Cap-VP22VLPs亚单位疫苗组，3NC为阴性对照组。

具体实施方式

本发明的重组猪圆环病毒2型病毒样粒子及其亚单位疫苗按以下构建：

一、研究方法

1、Cap-VP22基因的扩增、克隆，根据GenBank公布的PCV2（GenBank登录号：GU450328）ORF2序列设计合成扩增Cap蛋白基因的特异性引物，并合成VP22蛋白转导域序列，以及将Cap蛋白基因序列与VP22蛋白转导域序列融合的引物。以常规方法提取PCV2病毒DNA，采用SOE-PCR方法扩增得到Cap-VP22融合基因，将融合基因测序后，通过BamHI/NotI和NheI/KpnI酶切，将两个Cap-VP22基因先后插入杆状病毒转移载体pFastBac Dual的多克隆位点中，经PCR、酶切及测序鉴定，获得阳性重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2Cap-VP22。

2、重组质粒pFastBac Dual-2Cap-VP22转化E.coli DH10Bac感受态细胞，在辅助质粒作用下，重组质粒与杆状病毒骨架载体Bacmid发生同源重组，外源基因插入杆状病毒载体骨架，经两次蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid质粒，经PCR鉴定后获得包含目的基因2Cap-VP22的重组Bacmid质粒。

3、提取重组Bacmid质粒Bac-2Cap-VP22，通过Lipofectamine2000转染Sf9细胞，收取上清，提取病毒DNA，以目的基因Cap-VP22基因引物鉴定重组病毒，确定重组质粒在Sf9细胞内包装产生表达融合基因Cap-VP22的重组杆状病毒。重组杆状病毒命名为cBac-2Cap-VP22。

4、重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，并表达导入的Cap-VP22基因；收集感染细胞培养液并裂解，纯化获得Cap-VP22VLPs。

5、Cap-VP22VLPs单独或与佐剂配制制备成重组猪圆环病毒颗粒疫苗，免疫小鼠，评价其免疫效果。

二、研究实验

1、PCV2Cap-VP22融合基因扩增、克隆和鉴定

1.1引物设计合成

根据GenBank公布的PCV2（GenBank登录号：GU450328）ORF2序列设计合成扩增Cap蛋白基因特异性引物，人工合成VP22蛋白转导域序列，同时设计将PCV2Cap与VP22融合的引物。

VP22蛋白转导域序列及引物序列如下：

VP22蛋白转导域序列（序列表SEQ.ID.No.3）：

GACGCGGCCACGGCGACTCGAGGGCGTTCTGCGGCGTCGCGCCCCACCGAGCGACCTCGAGCCCCAGCCCGCTCCGCTTCTCGCCCCAGACCCAGACGGCCCGTCGAGTGA

引物序列：

P1（序列表SEQ.ID.No.4）：

5’-GGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGA-3’(BamHI)

P2（序列表SEQ.ID.No.5）：

5’-CCCTCGAGTCGCCGTGGCCGCGTCAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGA-3’

P3（序列表SEQ.ID.No.6）：

5’-TTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTGACGCGGCCACGGCGAC-3’

P4（序列表SEQ.ID.No.7）：

5’-GCGGCCGCTCACTCGACGGGCCGTCTGGGTCT-3’（NotI）

P5（序列表SEQ.ID.No.8）：

5’-GCTAGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGA-3’(NheI)

P6（序列表SEQ.ID.No.9）：

5’-GGTACCTCACTCGACGGGCCGTCTGGGTCT-3’(KpnI)

1.2PCR扩增目的基因

采用常规方法提取PCV2病毒DNA，应用SOE-PCR技术分两次扩增得到C端引入VP22蛋白转导域序列的Cap-VP22融合基因。第一次PCR以PCV2基因组为模板，以P1\P2、P5\P2为引物，扩增出两条Cap基因片段，同时以PUCK-VP22质粒为模板，以P3\P4、P3\P6为引物，扩增VP22序列；第二次PCR以第一次PCR产物为模板，PCR反应10个循环后，再分别以P1\P4、P5\P6为引物扩增出两端分别含BamHI/NotI和NheI/KpnI酶切位点的Cap-VP22融合基因，结果见图1。

PCR体系（参照北京全式金公司Fast pfu DNAPolymerase试剂盒说明书）：DNA(或质粒)模板20ng，上游引物（20μM）1μL，下游引物（20μM）1μL，dNTPs(2.5mM)3μL，5xFastBuffer5μL，DNA polymerase1μL，去离子水补足25μL。

PCR反应程序（参照北京全式金公司Fast pfu DNAPolymerase试剂盒说明书）：95℃2min；95℃20s，68℃35s，30个循环；72℃7min。

1.3PCR产物的克隆

1.3.1PCR产物回收与纯化

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下含目的条带的琼脂胶块，参照DNA快速回收纯化试剂盒（北京天根）说明书回收目的片段。

1.3.2PCR产物克隆与测序

PCR回收产物分别连接到PEASY克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落培养，提取质粒，通过PCR、酶切及测序鉴定，结果见图2，获得PEASY-Cap质粒及含目的基因序列（序列表SEQ.ID.No.1）的PEASY-Cap-VP22质粒。

2、重组质粒pFastBac Dual-2Cap-VP22的构建

2.1酶切产物回收与纯化

将PEASY-Cap-VP22质粒及pFastBac Dual载体进行酶切，纯化回收目的片段Cap-VP22及线性化载体骨架。

2.2目的基因克隆进入pFastBac Dual载体

首先通过BamHI/NotI酶切位点，将2.1纯化的Cap-VP22基因插入供体质粒pFastBacDual中，获得重组质粒pFastBac Dual-Cap-VP22，再通过NheI/KpnI双酶切pFastBac Dual-2Cap-VP22载体，回收线性骨架，与2.1回收的Cap-VP22基因片段再连接，进而将另一个Cap-VP22基因插入pFastBac Dual载体中，最终获得含两个拷贝目的基因的重组质粒pFastBac Dual-2Cap-VP22。

2.3重组质粒的提取和鉴定

重组质粒pFastBac Dual-2Cap-VP22采用双酶切鉴定，结果如图3。

3、重组Bacmid质粒Bac-2Cap-VP22的构建与鉴定

3.1重组Bacmid质粒Bac-2Cap-VP22构建

按照Bac-to-Bac表达系统说明书，将重组质粒pFastBac Dual-2Cap-VP22转化DH10Bac感受态细胞，在辅助质粒的作用下与杆状病毒骨架载体发生同源重组，获得包含两个Cap-VP22基因的重组Bacmid质粒Bac-2Cap-VP22，最终将外源基因插入到杆状病毒骨架载体中。

3.2重组细菌的挑选和质粒提取

将转入重组质粒的DH10Bac感受态细胞以100倍稀释，取50μL涂布于新鲜的含四环素（10μg/ml）、卡那霉素（50μg/ml）、庆大霉素（7μg/ml）、β-半乳糖苷（100μg/ml）和IPTG（40μg/ml）的SOB平板中，培养48-72小时后，再挑取大的白色菌落重新接种于新的SOB平板中，37℃培养过夜，挑取白色单克隆接种于含（50μg/ml）卡那霉素，（7μg/ml）庆大霉素，（10μg/ml）四环素的LB培养液中，37℃培养8-12h。提取重组Bacmid质粒Bac-2Cap-VP22。

3.3重组Bacmid质粒Bac-2Cap-VP22的鉴定

以提取的重组Bac-2Cap-VP22质粒为模板，以M13F（序列表SEQ.ID.No.10）：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’、M13R（序列表SEQ.ID.No.11）：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’为引物，按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行PCR鉴定，结果见图4。

4、VLPs的获得与鉴定

4.1重组质粒转染Sf9细胞

将Sf9细胞于6孔板中培养，待细胞汇合度至60-70%时，按照Lipofectamine2000（invitrogen）说明书进行质粒转染。具体步骤如下：

(1)待转染的细胞转染前换上双无TNM-FH培养基(无双抗，无FBS)；

(2)将2μg Bacmid重组质粒Bac-2Cap-VP22加入到200μL双无TNM-FH培养基中，轻轻混匀；

(3)将8μL Lipofectamine2000脂质体加入到200μL双无TNM-FH培养基中，轻轻混匀；

(4)将步骤(2)和步骤(3)液体混合均匀，室温放置15min；

(5)将步骤(4)混合液逐滴滴入细胞中，补加双无TNM-FH培养基至1.5mL，27℃培养4～6h后换成含2.5%胎牛血清培养基正常培养。

4.2重组杆状病毒的获得与增殖

转染后每天观察细胞病变情况，第三天开始细胞出现明显的病变，细胞变大，变圆或不规则，开始出现上漂，结果如图5所示；收集细胞及上清，提取细胞RNA及培养上清中的重组杆状病毒，进行PCR鉴定，检测到目的条带存在；继续培养5天后，反复冻融收集细胞及培养物上清，4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，此为P1代重组细胞毒。将P1按照1:10接种Sf9细胞，27℃培养4-5天，细胞出现病变时收获P2代毒，按同样方法培养P3代毒。重组病毒4℃保存。

4.3重组杆状病毒滴度测定

按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行重组病毒滴度计算。将收获的重组病毒进行10倍稀释，于24孔板中分别接种长满单层的Sf9细胞，每个稀释度进行两个重复，每孔接种100μL，27℃培养1h后，弃掉病毒液，每孔加入0.5mL琼脂，27℃培养7-10天，染色后计算孔中空斑数，计算出病毒滴度为2×10⁷pfu/mL。

4.4重组Cap-VP22蛋白IFA鉴定

将重组杆状病毒感染96孔板培养的Sf9细胞，设置非感染组对照。27℃培养48-72h，细胞出现病变后以80%预冷丙酮固定2h。PBST洗涤3次，5%脱脂奶粉（TBST）封闭1h。加入150μL100倍稀释的针对PCV2的多克隆抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入150μL含有0.02%的伊文斯蓝的FITC荧光标记的IgG（1:100倍稀释），37℃孵育1h，PBST洗涤3次，荧光显微镜观察并记录结果，重组杆状病毒感染的细胞有绿色荧光出现，而对照组观测不到荧光。结果如图6所示。

4.5重组病毒样粒子形成

将重组杆状病毒接种Sf9细胞，27℃培养，表达重组蛋白，反复冻融收集细胞及培养物上清，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，进行电镜观察，检测病毒样粒子的形成，结果如图8所示。表明融合VP22蛋白转导域的Cap蛋白能在体外有效形成病毒样粒子。5、PCV2重组病毒样粒子疫苗制备及小鼠免疫试验

5.1重组病毒样粒子疫苗制备

将收获的第二代培养物上清接种Sf9细胞，27℃培养，3天后收取细胞上清及培养物，经反复冻融后，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，测定蛋白浓度。将获得的重组蛋白浓度调整为400ng/mL，按照抗原/佐剂体积比例1:1加入弗氏不完全佐剂乳化，制备成亚单位疫苗。

5.2小鼠免疫试验

选取24只8周龄的BALB/c小鼠随机分3组，每组8只，其中1、2组分别注射Cap VLPs、Cap-VP22VLPs亚单位疫苗，3组作为阴性对照。经肌肉注射（150μL/只）和皮下注射（150μL/只）免疫小鼠，间隔2周以相同途径和剂量加强免疫一次。在首免后每间隔7天进行小鼠尾尖静脉采血，收集小鼠血清测定血清PCV2抗体水平。

5.3PCV2特异性抗体检测

将重组Cap蛋白100μL/孔包被酶标板，37℃作用2h或4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干，加封闭液(10%小牛血清)200μL/孔，37℃水浴作用2h或4℃封闭过夜，同上洗涤3次，加入血清样品，进行2倍倍比稀释，37℃孵育1.5h，同上洗涤3次，加入工作浓度(l:8000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG，50μL/孔，37℃孵育lh，同上洗涤3次，加入新鲜配制的OPD底物显色液50μL/孔，37℃反应5-10min，加入2M硫酸50μL/孔终止反应，在酶标仪上读取OD₄₅₀数值，分析抗体产生情况。结果如图8所示，两种亚单位疫苗均能刺激小鼠产生特异性抗体，并且Cap-VP22VLPs组要优于Cap VLPs组。

本发明制备了含VP22蛋白转导域的PCV2重组VLPs，并将其与佐剂配制亚单位疫苗，通过免疫小鼠具有较好的免疫原性，若进一步优化接种条件、佐剂类型等，可以进一步进行猪体的免疫试验，具有更好的免疫保护效力，可用于PCV2的预防。

Claims (8)

1.Cap-VP22融合基因，其特征在于：该基因由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白转导域核苷酸序列形成。

2.根据权利要求1所述的Cap-VP22融合基因，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

3.权利要求1所述Cap-VP22融合基因在制备预防猪圆环病毒病的疫苗中的应用。

4.一种重组猪圆环病毒2型病毒样粒子，其特征在于：该病毒样粒子由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白转导域核苷酸序列形成的Cap-VP22融合基因所编码。

5.根据权利要求4所述的重组猪圆环病毒2型病毒样粒子，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子的制备方法，其特征在于：将来源于HSV-1VP22的蛋白转导域通过SOE-PCR方法与形成PCV2空衣壳蛋白所需的抗原Cap基因连接起来，克隆到杆状病毒转运载体获得同源重组载体，包装产生含有PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白转导域的重组杆状病毒，感染昆虫细胞，表达融合了PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白转导域的重组Cap-VP22蛋白，形成病毒样粒子。

7.根据权利要求6所述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）克隆目的基因Cap-VP22，并通过BamHI/NotI和NheI/KpnI双酶切位点分别在pFastBac Dual转移载体P10和Ph启动子之后各插入一个拷贝的目的基因Cap-VP22，获得含双拷贝目的基因的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2Cap-VP22；

（2）用步骤（1）获得的pFastB Dual-2Cap-VP22转移载体转化DH10Bac感受态细胞，进行同源重组；

（3）筛选鉴定获得携带有目的基因Cap-VP22的重组杆状病毒DNA；

（4）用步骤（3）获得的重组杆状病毒DNA以脂质体法转染对数生长期的Sf9细胞，产生表达融合基因Cap-VP22的重组杆状病毒；

（5）用步骤（4）获得的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，使感染细胞表达Cap-VP22基因；

（6）收集步骤（5）获得的感染细胞培养液并裂解感染有Cap-VP22基因重组杆状病毒的宿主细胞，纯化获得重组猪圆环病毒2型病毒样粒子。

8.权利要求3所述重组猪圆环病毒2型病毒样粒子在制备预防猪圆环病毒病的疫苗中的应用。

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