CN105087605A

CN105087605A - 一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

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Publication number: CN105087605A
Application number: CN201510566448.4A
Authority: CN
Inventors: 姜平; 周雪晨; 白娟; 曹晶晶
Original assignee: Nanjing Kehong Biotechnology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Kehong Biotechnology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CN105087605B

Abstract

本发明提供了一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用，本发明为了获得可溶性重组PCV2？Cap蛋白，采用PCR方法将MPG与NLS部分缺失的Cap蛋白N端基因融合构建成新的基因，然后克隆至大肠杆菌表达载体pET28a，获得重组质粒，转化至大肠杆菌BL21得重组工程菌，重组工程菌用IPTG诱导表达获得可溶性重组PCV2？Cap蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，本发明所得重组蛋白MrCap大部分存在于细菌裂解上清液中，呈可溶性，且该重组蛋白MrCap具有较高的免疫原性和免疫反应性，为PCV2抗体检测试剂盒和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

Description

一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的编码重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的基因及该基因编码的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，还涉及该重组蛋白的制备方法以及应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是与许多猪病相关的重要病原体，最初于1996年在加拿大西部被发现，之后被报道为一种新的综合征，名为仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是最小的动物病毒之一，基因组全长约1.7kb，是单股环状的DNA病毒。有两个比较大的开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码Rep和Cap蛋白，Rep主要参与病毒的复制，Cap是病毒的结构蛋白，可以聚集形成病毒的二十面体衣壳。PCV2Cap蛋白免疫原性高、可与感染PCV2的猪血清反应，因此，Cap蛋白可用作设计新型PCV2疫苗的抗原分子，近年来成为疫苗研究的最主要靶抗原。

近年来，原核和真核表达系统被用于表达Cap蛋白，用于抗PCV2动物免疫。在真核表达系统中，重组蛋白最重要的特性是能通过自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，重组Cap蛋白最先在杆状病毒表达系统中成功表达，并已经开放成功重组杆状病毒亚单位疫苗。然而，任何真核表达系统表达蛋白的成本都很高，在应用上受到限制，而原核表达系统则正好相反，成本低廉。但原核表达也存在难点，例如大肠杆菌表达Cap蛋白最大的困难在于Cap蛋白的N端是一段富含碱性氨基酸的高度保守序列，1-41位氨基酸是Cap蛋白的核定位信号肽序列(NLS)，NLS上的特异性氨基酸使Cap蛋白表达水平很低，即使将Cap基因与GST、MBP等蛋白融合，其表达水平仍然很低。此外，Cap蛋白大肠杆菌系统表达产物多以包涵体形式存在，使应用进一步受到限制。

细胞分泌型多肽(CPPs)，或称为蛋白传输域(PTDs)、细胞穿透肽(cellpenetratingpeptides)、细胞穿膜肽，是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，可有效提高不同生物分子的细胞间转移，包括质粒DNA、寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、多肽核苷酸(PNA)、蛋白和多肽，以及脂质体纳米颗粒在体内体外转移进细胞或组织，可作为将具有生物学活性的分子转运进入细胞的工具。目前没有将CPPs与Cap蛋白进行融合的报道出现。

发明内容

本发明针对重组Cap蛋白的存在形态以及原核表达存在的难点，提供了一种新的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因、含有该基因的重组质粒和重组工程菌，该重组工程菌能表达可溶性重组PCV2Cap蛋白。

本发明还提供了上述基因编码表达的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，该蛋白具有很好的抗原性和免疫原性，且为可溶性蛋白，更便于应用。

本发明还提供了制备上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，该方法操作简便，易于实现。

本发明还提供了以上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为有效成分的亚单位疫苗和PCV2抗体诊断试剂盒。

本发明为了提高Cap蛋白的表达水平以及存在形态，将Cap蛋白N端的前10个氨基酸去除，同时与细胞分泌型多肽进行融合，得到融合蛋白，或者也可以称为重组PCV2Cap蛋白、重组蛋白、重组Cap蛋白。该重组PCV2Cap蛋白是由重组基因表达获得，根据设计的特殊引物序列，扩增出重组基因，重组基因是由缺失的Cap基因与细胞分泌型多肽基因拼接得到的，缺失的Cap基因是缺失编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列的Cap蛋白基因。将该重组基因插入质粒获得重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌得到重组工程菌，重组工程菌表达得到可溶性重组PCV2Cap蛋白。细胞分泌型多肽CPPs包括蛋白型(P)、嵌合型(C)和合成型(S)。本发明使用MPG、ppTG20、TAT三种细胞分泌型多肽进行研究，MPG属于C型，C型CPPs部分源于自然多肽或蛋白，如蛋白的信号序列可被受体蛋白识别，以协助未成熟的蛋白经翻译后转移到细胞间组分的膜上。MPG嵌合了HIVgp41的融合序列和SV40T抗原的NLS，其基因序列为GGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTT，氨基酸序列为：Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。ppTG20属于S型，是一种α螺旋S型CPPs，其基因序列为：GGTCTGTTCCGAGCACTGCTGCGACTGCTGCGATCTCTGTGGCGACTGCTGCTGCGAGCA，氨基酸序列为：Gly-Leu-Phe-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala。TAT属于P型，是涉及HIV复制的氨基酸86-102位点的转录激活因子，基因序列为：TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA，氨基酸序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。以缺失的Cap基因为模板，分别与MPG、ppTG20、TAT基因拼接，得到重组基因，将所得重组基因分别进行原核表达得到三种重组PCV2Cap蛋白。经实验验证，仅有与MPG拼接形成的MPG-Cap(简称MrCap)重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，且可溶性蛋白表达量高，实现了Cap蛋白目的基因可溶性表达。而ppTG20-Cap(简称prCap)和TAT-Cap(简称TrCap)重组蛋白主要以包涵体的形式存在，可溶性蛋白表达量低，应用性不强。

本发明具体技术方案如下:

一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因(简称重组PCV2Cap基因)，该基因是在缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合细胞分泌型多肽MPG的基因序列所形成的，所述缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列。

进一步的，本发明编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的序列如SEQIDNO.1所示。在知道了该编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的情况下，可以通过PCR扩增的方式得到该基因。

本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒是将上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因插入pET28a(+)质粒中构建而得。

本发明还提供了一种重组工程菌，该重组工程菌是将上述重组质粒转化入大肠杆菌中而得。所述大肠杆菌可以为大肠杆菌BL21。

本发明还提供了扩增上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的引物，依次以下述a、b、c三对引物进行三次PCR扩增可以得到上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列(共进行三次PCR扩增，每次扩增依次以a、b、c作为引物，上一次扩增得到的基因片段为下一次扩增的DNA模板，最后一次扩增得到编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的全长基因)；

引物a：

上游引物：5'-ATAGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCA-3'(如

SEQIDNO.3所示)

下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'(如SEQIDNO.6所示)

引物b：

上游引物：5'-ATACCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCA-3'(如

SEQIDNO.4所示)

下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'(如SEQIDNO.6所示)

引物c：

上游引物：5'-ATAGGATCCGGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGT-3'(如

SEQIDNO.5所示)

下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'(如SEQIDNO.6所示)。

本发明还提供了一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白(即重组PCV2Cap蛋白、MPG-Cap重组蛋白或MrCap重组蛋白)，其氨基酸序列为：Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Arg-Arg-His-Arg-Pro-Arg-Ser-His-Leu-Gly-Gln-Ile-Leu-Arg-Arg-Arg-Pro-Trp-Leu-Val-His-Pro-Arg-His-Arg-Tyr-Arg-Trp-Arg-Arg-Lys-Asn-Gly-Ile-Phe-Asn-Thr-Arg-Leu-Ser-Arg-Thr-Ile-Gly-Tyr-Thr-Val-Lys-Lys-Thr-Thr-Val-Arg-Thr-Pro-Ser-Trp-Asn-Val-Asp-Met-Met-Arg-Phe-Asn-Ile-Asn-Asp-Phe-Leu-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn-Pro-Leu-Thr-Val-Pro-Phe-Glu-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Lys-Val-Lys-Val-Glu-Phe-Trp-Pro-Cys-Ser-Pro-Ile-Thr-Gln-Gly-Asp-Arg-Gly-Val-Gly-Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Leu-Asp-Asp-Asn-Phe-Val-Thr-Lys-Ala-Asn-Ala-Leu-Thr-Tyr-Asp-Pro-Tyr-Val-Asn-Tyr-Ser-Ser-Arg-Arg-His-Thr-Ile-Thr-Gln-Pro-Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Arg-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Gln-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Gln-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Gln-Thr-Thr-Gly-Asn-Val-Asp-His-Val-Gly-Leu-Gly-Thr-Ala-Phe-Glu-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asp-Gln-Asp-Tyr-Asn-Ile-Arg-Ile-Thr-Met-Tyr-Val-Gln-Phe-Arg-Glu-Phe-Asn-Leu-Lys-Asp-Pro-Pro-Leu-Asn-Pro-Lys，如SEQIDNO.2所示。

本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白可以由上述重组工程菌在IPTG诱导下表达而得。

本发明还提供了上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，步骤包括：将重组工程菌进行培养，待菌液OD600达到0.8-1.0时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，继续培养5h；培养结束后离心收集细菌，用PBS重悬，超声破碎收集上清液，重组猪圆环病毒2型Cap蛋白存在于上清液中。

上述制备方法中，进一步的，将所得上清液用硫酸铵进行纯化，可获得纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

本发明还提供了一种新的亚单位疫苗或PCV2抗体诊断试剂盒，该亚单位疫苗或PCV2抗体诊断试剂盒中含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

上述亚单位疫苗中，含有8ml重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的培养上清液或8ml纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，该培养上清液或纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白按照上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法获得。

本发明还提供了上述亚单位疫苗的制备方法，步骤包括：

(1)将重组工程菌培养至菌液OD600达到0.8-1.0，然后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，继续培养5h；培养结束后离心收集细菌，用PBS重悬，超声破碎收集溶有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的上清液，或者将该上清液进一步用硫酸铵纯化，得纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白；

(2)取8ml上述溶有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的上清液或8ml纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，用PBS稀释至500μg/mL，然后加入2ml佐剂，得亚单位疫苗。

所述佐剂可以为CPH佐剂，其主要成分为卡波姆和生育酚。

为了获得可溶性重组PCV2Cap蛋白，本发明采用PCR方法将MPG、ppTG20、TAT等穿膜肽分别与NLS部分缺失的Cap蛋白N端基因融合构建成新的基因分子，然后克隆至大肠杆菌表达载体pET28a，获得重组质粒，转化至大肠杆菌BL21得重组工程菌，重组工程菌用IPTG诱导表达获得可溶性重组PCV2Cap蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，本发明所得重组蛋白MrCap、prCap、TrCap大小分别为33ku、32ku和31ku，其中，MrCap大部分存在于细菌裂解上清液中，为可溶性的，可溶性蛋白表达量明显高于prCap和TrCap重组蛋白可溶性表达量。将MrCap大肠杆菌诱导表达菌体裂解液离心取出上清液，经硫酸铵沉淀法纯化后，可以获得纯化的MrCap重组蛋白(CMrCap)。经琼脂扩散试验(AGP)和夹心ELISA检测，该重组蛋白MrCap具有较好PCV2抗原性，将MrCap和CMrCap分别与CPH水佐剂混合制成疫苗，选择4-6周龄雌性ICR小白鼠免疫，首免后第3和6周采血，测量PCV2抗体水平，结果为：2种不同疫苗免疫后均可诱导机体产生PCV2抗体，其中，CMrCap-CPH疫苗组中和抗体水平达1：75，证明其具有较高的抗原性和免疫原性，为PCV2抗体检测试剂盒和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

附图说明

图1.重组PCV2Cap蛋白基因设计与构建示意图。

图2.重组质粒双酶切鉴定图，其中：1:DL2000DNA标准分子量；2-4:pET28a-MrCap、pET28a-prCap、pET28a-TrCap重组质粒双酶切产物。

图3.重组蛋白诱导产物SDS-PAGE分析(A)及Western-blot(B)检测图，其中：M:蛋白标样；1:BL/pET28a(+)菌体诱导产物；2-3:BL/TrCap菌体诱导产物裂解物,2为上清，3为包涵体；4-5:BL/prCap菌体诱导产物裂解物,4为上清,5为包涵体；6-7:BL/rCap菌体诱导产物裂解物,6为上清，7为包涵体；8-9:BL/MrCap菌体诱导产物裂解物,8为上清,9为包涵体。

图4.不同浓度硫酸铵浓缩纯化的重组蛋白SDS-PAGE分析图，其中M:蛋白标样；1:BL/MrCap菌体诱导产物裂解上清；2:BL/MrCap菌体诱导产物裂解上清最终纯化产物；3,4,5:BL/MrCap菌体诱导产物裂解物上清,纯化过程中经50％、10％、50％硫酸铵分步浓缩纯化后得到的3种产物。

图5.未纯化的MrCap与纯化的MrCapQuantityOne对比分析图。

图6.琼脂扩散试验加样示意图。

图7.免疫小鼠的ELISA抗体水平检测图。

图8.小鼠二次免疫后3周PCV2中和抗体水平检测图。

具体实施方式

下面对本发明进行进一步的说明，以证明本发明的优点。

1.研究方法与结果

1.1主要试剂

PCV2SH株病毒液由本实验室分离鉴定并保存；pET28a(+)质粒、大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α购自上海英骏生物技术有限公司；PCV2单克隆抗体3E5(保藏号CGMCC8169)、兔抗PCV2血清抗体由本实验室制备保存，具体方法见本实验室2013年毕业生翟淑燕硕士学位论文《猪圆环病毒2型单克隆抗体研制与夹心ELISA抗原检测方法的建立》。

CPH佐剂由本实验室制备，配置方法：称取卡波姆50g，加至9800ml蒸馏水中，待充分溶胀后，混匀，115℃高压灭菌30分钟，呈胶冻状，室温放置。使用前缓慢加入灭菌的5％氢氧化钠溶液，使其转化为水溶性状，加蒸馏水至10000ml，加入生育酚，4-8℃保存。

羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-FITC购自武汉博士德生物工程公司；ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；凝胶回收DNA试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司；质粒小量抽提试剂盒购自Biomga公司。ECL化学发光试剂盒购自购自Biouniquer公司；

其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

1.2试验动物

5周龄左右雌性清洁级ICR小鼠，购自上海实验动物中心。

1.3引物设计

根据PCV2SH毒株的基因序列，运用PremierPrimer5.0软件设计各片段PCR引物(见表1)，通过使用不同上游引物MPG-Cap、ppTG20-Cap、TAT-Cap、Cap-F与相同下游引物Cap-R组合可以分别扩增出不同长度的Cap序列，见图1。其中，MPG-Cap与Cap-R能够组成三对引物，基因构建的原理是采用PCR方法将MPG融合至Cap基因N端，即通过PCR的方法，将需要融合的MPG基因序列设计在引物上，PCR时，由于引物上带有MPG基因序列，从而产物上也会产生MPG基因序列，但由于MPG基因全长81bp，而引物通常长20-30bp，因此，一次PCR只能扩增出带有一部分MPG的Cap序列，需要进行多次PCR，才能扩增出具有全部MPG序列的Cap序列。这里设计了三条MPG-Cap引物，分别与Cap-R下游引物共同作用，进行三次PCR，扩增出带有全长MPG的Cap序列。此外，ppTG20-Cap与Cap-R分别组成两对引物可以扩增出ppTG20-Cap重组蛋白的基因，TAT-Cap与Cap-R组成一对引物可以扩增出TAT-Cap重组蛋白的基因，Cap-F与Cap-R组成一对引物可以扩增出NLS部分缺失的rCap蛋白的基因。

表1用于扩增不同Cap蛋白基因片段的引物及其序列

1.4PCV2DNA提取

使用常规酚氯仿提取DNA方法，步骤概述如下：

取500μL增殖的PCV2SH株病毒液(反复冻融过三次)置于1.5mLEP管中，分别加入SDS和蛋白酶K，终浓度分别为1％和50μg/μL；56℃水浴锅，作用2小时，期间晃动2-3次；加入等体积的酚氯仿，涡旋振荡，12000rpm离心10分钟，取上清；加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心10分钟，取上清；加入1/10倍体积3M乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，混匀后-20℃过夜；12000rpm离心15分钟，弃上清，加75％的酒精洗涤一次，12000rpm离心10分钟，弃上清；室温干燥10分钟，使酒精挥发干，用20μL灭菌ddH₂O溶解沉淀。

1.5PCR扩增不同长度的基因片段

分别以MPG-Cap、ppTG20-Cap、TAT-Cap、Cap-F与相同下游引物Cap-R为引物，以PCV2DNA为模板，分别扩增出删除NLS中N端前10个氨基酸后的rCap蛋白基因和在rCap蛋白基因N端添加融合蛋白MPG、ppTG20和TAT的基因的重组PCV2Cap基因(MrCap、prCap和TrCap)基因片段。PCR反应体系25μL，含2×PCRMix(含酶)12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板1μL、双蒸水9.5μL。PCR的循环参数为：预变性95℃8min；变性95℃40s,退火57℃40s，延伸72℃50s，35个循环；最后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察。

1.6重组质粒的构建与鉴定

分别构建pET28a-rCap、pET28a-MrCap、pET28a-prCap、pET28a-TrCap重组质粒，方法如下：

1.6.1PCR产物的回收

用市售DNA胶回收试剂盒回收各PCR扩增的基因片段，具体操作为：

(1)PCR扩增的基因加入10╳LoadingBuffer经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含有目的基因DNA的凝胶块，并保证切下的胶块尽量的小。减少紫外灯下照射的时间，以防紫外线对DNA造成损伤；

(2)用1.5mLEP管称量胶块重量，按每100mg胶块加入300μLA液的比例加入，置50-60℃水浴10min左右，其间需颠倒2-3次以使琼脂糖块完全融化；

(3)加入50μLB液，颠倒混匀后将混合液转移入吸附柱，静置2min，12000rpm离心30s，弃滤液(为提高回收效率，可将滤液重复过柱一次)；

(4)向吸附柱中加入500μLC液，12000rpm离心30s弃滤液；重复洗涤一次；

(5)弃去滤液后，再将吸附柱12000rpm离心2min；

(6)将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管上，室温静置5min以充分挥发残留乙醇；

(7)在吸附膜的中央加入已预热的20μLD液，静置2min，12000rpm离心2min洗脱DNA，将回收产物保存于-20℃。

1.6.2DNA片段与载体的酶切和连接

将纯化后得到的10μL各基因片段(rCap、MrCap、prCap和TrCap)及10μLpET-32a(+)载体分别用SalⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行双酶切处理，酶切反应可在0.5mL的EP管中进行，37℃水浴4-5h。

酶切后回收、纯化各基因片段和载体。将酶切回收后的7μL各基因片段分别与1μL酶切后载体利用1μLT4连接酶进行连接，连接体系置16℃6-8h或过夜，得连接产物。

1.6.3DH5α感受态细胞制备与连接产物转化

感受态大肠杆菌DH5α的制备：以无菌接种环取冻存的DH5α菌种划线接种于不含抗生素的LB平板上，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落接种于3mLLB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜；取10μL生长好的菌液接种于新的3mLLB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达0.3-0.4(肉眼观察成云雾状)；无菌条件下将培养物倒入冰预冷的无菌EP管中，4℃12000rpm离心1min，尽弃上清；用1mL冰预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴放置30min，4℃12000rpm离心1min，弃上清，倒置控干；以100μL冰预冷的0.1MCaCl₂溶液轻轻地重悬细菌沉淀，4℃保存备用。

连接产物的转化：取不同的连接产物各10μL分别加入到100μL制备好的DH5α感受态中，轻弹管壁混匀后冰浴30min；将EP管置42℃水浴中热激90s，然后迅速冰浴5min；加入890μLLB液体培养基，37℃200rpm/min振荡培养45min；12000rpm离心1min后弃去大部分上清，保留100μL左右上清重悬细菌沉淀，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的抗性平板上，37℃温箱中培养16h左右。

1.6.4阳性重组质粒菌液PCR和双酶切验证

根据上述平板上菌落的生长情况挑取分散的单菌落若干，接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜。在无菌条件下吸取相应的菌液1μL作为模板进行PCR扩增，PCR结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。选取PCR结果正确且特异的样品所对应的菌液，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒。

将1μg各重组质粒分别用0.5μLXhoI和0.5μLBamHI限制性内切酶进行双酶切处理，将双酶切鉴定正确的重组质粒送上海Invitrogen公司测序。酶切反应可在0.5mL的EP管中进行，酶切过程为37℃水浴，4小时。酶切完成后，取10μL酶切后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，从图中可以看出，酶切所得MrCap、prCap和TrCap片段与预期大小相符，分别为753bp、732bp、702bp，且测序完全正确。

1.7重组质粒转化入大肠杆菌BL21及诱导表达

参照1.6.3，制备大肠杆菌BL21感受态细菌，并将测序正确的重组质粒pET28a-rCap、pET28a-MrCap、pET28a-prCap、pET28a-TrCap转化至BL21感受态细菌中，获得的细菌分别命名为BL/rCap、BL/MrCap、BL/prCap、BL/TrCap，同时将空载体质粒(pET28a(+))也进行转化，命名为BL/pET28a(+)，以便作为对照。

分别挑取不同重组细菌的单菌落到3mL含有卡那抗生素(含量为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床，振摇2-3小时，待菌液OD600达到0.8-1.0左右时，加入终浓度为1.0mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，继续进行振摇培养5小时。

培养结束后，8000rpm离心3min，收集细菌，并用PBS溶液洗涤2次，最终用500μL的PBS重悬菌体后，进行超声波破碎，参数为功率200W，时间10min(工作3s，间隔7s)，然后8000rpm离心5min，收集上清液，同时用500μL的PBS将沉淀重悬。

1.8诱导蛋白SDS-PAGE鉴定

各取100μL1.7中诱导表达所得的上清液和沉淀，加入25μL5×LoadingBuffer，100℃水浴煮样8min，然后加到已配好的聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，每孔20μL。电泳时，以80V电压跑过浓缩胶，以120V电压跑完分离胶。然后将凝胶用考马斯亮蓝染色液染色3小时，换脱色液3-5次，每次1小时，至背景颜色洗脱干净，进行拍照记录。

SDS-PAGE结果见图3A，从图中可以看出，重组质粒表达的MrCap重组蛋白主要以可溶性形式存在，大小为33ku；而rCap重组蛋白主要以包涵体形式存在，大小为30ku；prCap重组蛋白表达量较少，大小为32ku；TrCap重组蛋白表达于上清和包涵体中，大小为31ku。

1.9诱导蛋白Western-blot鉴定

首先按1.8步骤将样品进行SDS-PAGE电泳，然后根据胶的大小，剪取海绵和硝酸纤维素膜(NC膜)，并与胶一起浸泡于转印缓冲液中；按如下顺序安装转印装置：阳极-较大的海绵-NC膜-聚丙烯酰胺凝胶胶-较小的海绵-阴极，并将层与层之间气泡赶出，转印条件为23V，35分钟；转印结束后，将NC膜用5％丽春红染色液室温染色1min，用铅笔标出蛋白Marker条带，观察转印情况；去离子水洗去NC膜上丽春红染色液，用含10％脱脂乳的PBST溶液封闭，室温作用3小时；封闭结束后，PBST洗涤NC膜2次，每次10分钟，然后加入1000倍稀释的PCV2单克隆抗体3E5(稀释液PBST)，室温作用1小时；孵育一抗结束后用PBST洗涤NC膜5次，每次10分钟，再加入10000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP(稀释液PBST)，室温作用30分钟；孵育二抗结束后用PBST洗涤NC膜5次，每次10分钟；用ECL增强型化学发光试剂盒显色：将A、B溶液等体积混合后，均匀铺于NC膜上有蛋白一面，避光作用2min，用保鲜膜将NC膜包好，赶走膜之间气泡，在暗室内将NC膜有发光液面紧贴X光片，于暗盒内曝光1-3分钟，取出X光片，在显影液中作用1-5min(至看到条带)；取出胶片用清水漂洗，再于定影液中定影2分钟，最后用清水洗涤干净后，干燥保存。

Western-blot检测结果见图3B，从图中可以看出，重组质粒表达的MrCap重组蛋白主要以可溶性形式存在，大小为33ku；而prCap、TrCap、rCap重组蛋白主要以包涵体形式存在，大小为32ku、31ku、30ku。

从以上结果可以看出，MrCap、prCap、TrCap三种重组蛋白中仅MrCap重组蛋白主要以可溶性形式存在，且表达量高，满足要求，而prCap、TrCap重组蛋白主要以包涵体形式存在，因此对MrCap重组蛋白进行进一步的研究。

1.10硫酸铵法浓缩纯化MrCap重组蛋白

向上述得到的BL/MrCap诱导表达的上清液中加入硫酸铵至50wt％饱和度，充分混匀后，置2～8℃静置12～16小时，离心，收集沉淀。称重后按1:20(W:V)加入灭菌生理盐水重悬沉淀，向重悬液中加入硫酸铵至10wt％饱和度，充分混匀后，2～8℃静置4小时，离心，去除沉淀。再向上清液中加入硫酸铵至50wt％饱和度，充分混匀后，2～8℃静置12～16小时，离心，去上清，收集沉淀，称重后按1:20(W:V)加入灭菌生理盐水复溶，得纯化的MrCap蛋白(CMrCap)。置2～8℃保存，应不超过7日。

将纯化过程中和分离纯化后得到的MrCap蛋白进行SDS-PAGE检测，结果见图4，从图中可以看出，MrCap蛋白得以较好纯化。将图4的泳道1和2进行薄层扫描，并进行QuantityOne分析，纯化前和纯化后的MrCap蛋白的QuantityOne分析图见图5，从图中可以看出，纯化前和纯化后的MrCap重组蛋白含量占总蛋白量的19.3％和40.2％。

1.11琼脂扩散试验鉴定纯化的MrCap重组蛋白抗原性

1.11.1pH值7.2,0.01mol/LPBS溶液的配制

精密称取NaH₂PO₄.2H₂O1.56g，Na₂HPO₄.12H₂O3.58g，NaCl9.0g，加蒸馏水400ml充分溶解后，调pH值至7.2，然后加蒸馏水至1000ml。

1.11.2琼脂平板的制备

pH值7.2，0.01mol/LPBS100ml，加1.0g琼脂糖，用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。取无菌直径90mm平皿，加入溶解后的琼脂20ml，制成2.5-3mm厚的琼脂板，待琼脂完全凝固后，平皿加盖并倒置，存放于湿盒中，2-8℃冷藏备用。

1.11.3打孔

用直径4mm，中心孔与外周孔距为4mm的梅花形打孔器。打孔时，将打孔器垂直、快速打至琼脂板底部。用针头挑出孔内琼脂，将针头插入孔内琼脂的中下部，轻轻向上挑出。

1.11.4封底

孔中琼脂挑出后，将琼脂板底部置酒精灯火焰加热并轻摇2次进行封底。琼脂板封底温度以手背试板底部微热即可。

1.11.5加样

如图6所示，中心孔加入猪抗PCV2阳性血清(购自青岛瑞尔生物技术有限公司)，外围第1、3、5孔加入PCV2SH株病毒液作对照孔，第2、4、6孔分别加入0、10倍和100倍稀释的CMrCap重组蛋白。每个加样孔均应加满液体，加液量以不溢出加样孔为宜，并做好标记。

1.11.6孵育

加样后静置5-10分钟，加样后的琼脂板置湿盒内用湿润的脱脂纱布覆盖保湿，37℃恒温恒湿培养箱中孵育24-48小时，观察并记录结果。结果显示，没有稀释的CMrCap重组蛋白孔和中间的PCV2血清抗体孔之间可形成沉淀线，而10和100倍稀释的CMrCap重组蛋白孔与PCV2血清抗体孔之间无沉淀线，说明纯化的MrCap重组蛋白具有PCV2抗原性。

1.12夹心ELISA检测MrCap重组蛋白抗原性

方法概述如下：

(1)PCV2单克隆抗体3E5包被酶标板，用抗原包被液将纯化的PCV2单克隆抗体3E5稀释至2μg/mL，每孔100μL加到酶标板条中，37℃温箱，静置2小时；

(2)洗涤，用PBST进行洗涤，每次5min，洗涤3次；

(3)封闭，用PBST配制的5％脱脂乳，每孔200μL，37℃温箱，静置3小时；

(4)洗涤，同步骤(2)；

(5)待测PCV2、MrCap和CMrCap抗原的原液、10倍和20倍稀释样品，每孔加100μL，37℃温箱，静置1小时；

(6)洗涤，同步骤(2)；

(7)孵育兔抗PCV2血清抗体，用PBST将兔抗PCV2血清抗体进行8000倍稀释，每孔100μL，37℃温箱，静置2小时；

(8)洗涤，同步骤(2)；

(9)孵育羊抗兔IgG-HRP抗体，用PBST将羊抗兔IgG-HRP抗体进行10000倍稀释，每孔100μL，37℃温箱，静置45min；

(10)洗涤，同步骤(2)；

(11)显色，TMB显色液，每孔100μL，37℃温箱，静置10min；

(12)终止，2MH₂SO4，每孔50μL；

(13)读数，酶标仪读取各孔OD450值。

未纯化的MrCap蛋白、纯化的MrCap蛋白(CMrCap)和PCV2病毒液夹心ELISA抗原性检测结果见表2。与PBS空白对照组相比，BL21/pET28a-MrCap重组大肠杆菌诱导表达的蛋白可被PCV2夹心ELISA方法检测到，说明重组大肠杆菌表达的MrCap重组蛋白具有PCV2抗原性，且纯化的CMrCap蛋白夹心ELISAOD值高于未纯化的MrCap蛋白，说明硫酸铵沉淀法可用于该重组蛋白的纯化。

表2夹心ELISA对MrCap重组蛋白的检测结果

1.13MrCap蛋白含量测定

1.13.1试剂盒：BCA蛋白含量检测试剂盒。

1.13.2操作步骤

1.13.2.1稀释BSA标准品：按照下表3用PBS稀释BSA标准品。

表3标准品的配置

管号	PBS用量(μl)	BSA标准品用量(μl)	BSA最终浓度(μg/ml)
				A	0	300μl原液	2000
B	125	375μl原液	1500
				C	325	325μl原液	1000
D	175	175μlB瓶稀释液	750
				E	325	325μlC瓶稀释液	500
F	325	325μlE瓶稀释液	250
				G	325	325μlF瓶稀释液	125
H	400	100μlG瓶稀释液	25
				I	400	0	0＝空白

1.13.2.2制备BCA工作液

1.13.2.2.1使用下列公式来确定所需的工作液的总体积：

(标准品的个数+待测重组蛋白样品的个数)╳(实验重复次数)╳(用于每个样品的工作液的体积)＝所需的工作液总体积

以12个待测样品为例说明：(9个标准品+12个待测样品)╳(2次实验重复)╳(2ml)＝84ml工作液

1.13.2.2.2制备工作液

将90mlBCA试剂A与1.8mlBCA试剂B混合(试剂A与试剂B的比例＝50:1)，制备工作液。

1.13.2.3检测

取各个稀释浓度的标准品和待测重组蛋白样品各0.1ml，加入到已做好标记的试管中。在每个试管中加入2.0ml工作液，充分混合。将试管密封，37℃孵育30分钟。将所有试管冷却至室温。将分光光度计设定检测波长为562nm，使用一只仅装有水的比色皿将仪器调零。然后，在10分钟内依次检测所有样品的吸光值。将各个标准品和待测样品在562nm波长下的吸光值减去空白标准品在562nm波长下的平均吸光值。将标准品在562nm波长下经过空白校正的吸光值对其浓度(μg/ml)作图，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线(R²值应不低于0.9900)，得出一元二次方程。将每个待测样品的吸光值代入方程，计算总蛋白质含量。

1.13.3SDS-PAGE蛋白电泳

将待测重组蛋白样品摇匀，取25μl加入到装有25μl2╳LoadingBuffer的离心管中，沸水中煮10分钟，瞬离，取20μl进行SDS-PAGE蛋白电泳。电泳结束后，进行染色，脱色。

1.13.4蛋白浓度的分析

用带有蛋白浓度分析功能的凝胶成像仪(QuantityOne)对样品的各条带浓度进行分析，得出目的条带在总蛋白中的浓度。

1.13.5MrCap蛋白的含量的计算

检测得到的总蛋白浓度、体积以及目的条带在总蛋白中的浓度结果见下表4。

表4MrCap重组蛋白含量测定结果

名称	总蛋白浓度	总蛋白体积	目的条带浓度
				纯化前的MrCap	1.1mg/mL	60mL	19.3％
纯化后的CMrCap	1.8mg/mL	14mL	40.2％

根据上述数据，计算样品中的MrCap蛋白的含量(计算公式：MrCap蛋白的含量＝BCA法检测总蛋白的含量╳目的条带在总蛋白中的浓度)。

纯化前的MrCap蛋白总含量：1.1mg/mL╳60mL╳19.3％＝12.7mg

纯化后的CMrCap蛋白总含量：1.8mg/mL╳14mL╳40.2％＝10.1mg

蛋白纯化效率：10.1mg/12.7mg＝79.5％。

1.14疫苗配制

A.挑取BL21/pET28a-MrCap重组大肠杆菌单菌落到3mL含有卡那抗生素(含量为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床，振摇2-3小时，待菌液OD600达到0.8-1.0左右时，加入终浓度为1.0mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，继续进行振摇培养5小时。培养结束后，8000rpm离心3min，收集细菌，并用PBS溶液洗涤2次，最终用500μL的PBS重悬菌体后，进行超声波破碎，参数为功率200W，时间10min(工作3s，间隔7s)，然后8000rpm离心5min，收集上清液，得未纯化的MrCap蛋白，待用。

B.向上述上清液中加入硫酸铵至50wt％饱和度，充分混匀后，置2～8℃静置12～16小时，离心，收集沉淀。称重后按1:20(W:V)加入灭菌生理盐水重悬沉淀，向重悬液中加入硫酸铵至10wt％饱和度，充分混匀后，2～8℃静置4小时，离心，去除沉淀。再向上清液中加入硫酸铵至50wt％饱和度，充分混匀后，2～8℃静置12～16小时，离心，去上清，收集沉淀，称重后按1:20(W:V)加入灭菌生理盐水复溶，得纯化的MrCap蛋白(CMrCap)。置2～8℃保存，待用。

分别配制两种疫苗：

①步骤A中的上清液8ml，用PBS稀释至500μg/mL，然后与2mLCPH佐剂混合，得疫苗，简称MrCap+CPH；

②步骤B中的纯化的MrCap蛋白8ml，用PBS稀释至500μg/mL，然后与2mLCPH佐剂混合，得疫苗，简称CMrCap+CPH。疫苗置4-8℃保存备用。

1.15小鼠免疫试验

取30只4-6周龄雌性ICR小白鼠随机分为3组，每组10只。第1、2组分别免疫上述2种疫苗(即MrCap+CPH，CMrCap+CPH组)每只皮下注射0.2mL，第3组为空白对照组(NC)，注射等量PBS溶液。免疫前尾尖采血检测血清抗体水平；首免后第3周每组取5只小鼠尾尖采血，测量抗体水平；其余小鼠进行二次免疫，每只皮下注射各疫苗0.2mL，空白对照组注射等量PBS溶液，二免后第3周小鼠眼球采血，测量PCV2ELISA和中和抗体水平。

1.16免疫小鼠PCV2ELISA抗体的检测

1.16.1ELISA抗原制备

1.16.1.1PCV2增殖

10％DMEM培养PK-15细胞，待其刚铺满单层后弃掉培养液，接种适量的PCV2SH株病毒液，37℃吸附1h，然后加入2％DMEM继续培养72h，-20℃反复冻融三次后收获病毒液。

1.16.1.2PCV2纯化

病毒液经8000rpm离心30min取上清；用终浓度8％PEG6000和4％NaCl，4℃搅拌2h后，静置过夜；12000rpm离心1h，收集沉淀，并用适量PBS溶解；10000rpm，离心0.5h，收集上清；最后用100000g/min离心4.5h收集沉淀，沉淀即为纯化的PCV2抗原。用原体积的1/100的PBS溶解沉淀，利用核酸定量仪测定其浓度为5mg/mL，-20℃保存备用。

1.16.2PCV2ELISA抗体的检测

PCV2特异性抗体是通过间接ELISA方法检测的，方法概述如下：

(1)抗原包被，将超离纯化的PCV2病毒用抗原包被液稀释至2μg/mL，每孔100μL加到酶标板条中，37℃温箱，静置2小时；

(2)洗涤，用PBST进行洗涤，每次5min，洗涤3次；

(3)封闭，用PBST配置的5％脱脂乳，每孔200μL，37℃温箱，静置3小时；

(4)洗涤，同步骤(2)；

(5)待检血清，用PBST将待检血清进行100倍稀释，每孔100μL，37℃温箱，静置1小时；

(6)洗涤，同步骤(2)；

(7)孵育二抗，用PBST将羊抗小鼠IgG-HRP抗体进行10000倍稀释，每孔100μL，37℃温箱，静置45min；

(8)洗涤，同步骤(2)；

(9)显色，TMB显色液，每孔100μL，37℃温箱，静置10min；

(10)终止，2MH₂SO₄，每孔50μL；

(11)读数，酶标仪读取各孔OD₄₅₀值。

小鼠免疫后的3周和6周，PCV2ELISA抗体水平测定结果见图7，从图中可以看出，纯化和未纯化的MrCap蛋白首次免疫后3周即可诱导产生抗体，二次免疫后抗体持续升高，纯化的MrCap组诱导产生的抗体高于未纯化的MrCap免疫组，说明大肠杆菌表达的MrCap蛋白具有较好的抗原特性，且纯化的MrCap抗原性更高。

1.17免疫小鼠血清PCV2中和抗体检测

(1)将PK-15细胞铺于96孔板内，等到细胞长到单层细胞的70％左右时，便可用于接毒；

(2)将分离的血清首先在56℃条件下灭活30分钟，然后12000rpm离心10分钟除菌，无菌操作将血清用纯DMEM进行2倍比稀释，依次是1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；

(3)将PCV2用纯DMEM营养液稀释到2000TCID₅₀/mL，然后与不同稀释度的血清等体积混合，置于37℃温箱，作用1小时；

(4)将细胞上营养液弃掉，用纯DMEM将细胞洗涤一次，然后将血清与病毒混合作用后液体接到细胞孔中，每孔100μL，同时设立空白对照、阳性对照、阴性血清对照，37℃温箱，培养72-96小时；

(5)将细胞上清弃掉，用PBST洗涤细胞3次，每次静置5分钟；

(6)用80％丙酮，每孔100μL，4℃固定10分钟，同(5)洗涤；

(7)将PCV2单克隆抗体3E5用PBST进行500倍稀释，每孔100μL，37℃温箱作用1h，同(5)洗涤；

(8)将羊抗小鼠IgG-FITC稀释200倍，每孔加50μL，37℃温箱作用45min，同(5)洗涤；

(9)荧光倒置显微镜进行观察统计，以荧光数量减少50％以上的孔作为阳性孔，将血清最高稀释度的倒数作为中和抗体效价。

小鼠二免后3周，眼球采血分离血清后按照上述方法进行中和抗体检测，结果如图8所示，从图中可以看出，纯化的MrCap重组蛋白疫苗免疫组PCV2中和抗体效价达1:75，明显高于未纯化重组蛋白疫苗免疫组，证明MrCap重组蛋白具有较好免疫原性。

2、结论

1、本发明成功设计出MPG-Cap重组蛋白的融合基因，利用pET28a载体成功表达了MPG-Cap重组蛋白，该融合蛋白能够以可溶性方式表达，更便于应用。

2、本发明采用硫酸铵沉淀法纯化MPG-Cap融合蛋白，得到明显富集的CMrCap蛋白。CMrCap经AGP和夹心ELISA检测，证明其具有较高的免疫原性，可用于PCV2抗体检测试剂盒的研制。

3、本发明将MPG-Cap融合蛋白与纯化的MPG-Cap融合蛋白作为抗原，免疫小鼠，经血清间接ELISA和中和抗体效价检测，证明MPG-Cap融合蛋白与纯化的MPG-Cap融合蛋白均具有免疫反应性，且纯化的MPG-Cap融合蛋白具有更高的免疫反应性，为PCV2Cap蛋白亚单位疫苗研究奠定了基础。

<110>南京农业大学，南京科宏生物科技有限公司

<120>一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

<160>6

<210>1

<211>753

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

GGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAG60

CCGAAAAAGAAACGCAAAGTTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTC120

CGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGC180

ATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACTGTCAAGAAAACCACAGTCAGA240

ACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTTCCCCCAGGA300

GGGGGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGGTTAAGGTT360

GAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTT420

ATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAAC480

TACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCG540

AAACCTGTCCTTGATAGGACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGAAATCAACTC600

TGGCTGAGACTACAAACTACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAA660

AACAGTATATACGACCAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAATTCAGAGAA720

TTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTAAG753

<210>2

<211>251

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

GlyAlaLeuPheLeuGlyPheLeuGlyAlaAlaGlySerThrMetGly

151015

AlaTrpSerGlnProLysLysLysArgLysValArgArgHisArgPro

202530

ArgSerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuValHis

354045

ProArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePheAsnThr

505560

ArgLeuSerArgThrIleGlyTyrThrValLysLysThrThrValArg

65707580

ThrProSerTrpAsnValAspMetMetArgPheAsnIleAsnAspPhe

859095

LeuProProGlyGlyGlySerAsnProLeuThrValProPheGluTyr

100105110

TyrArgIleLysValLysValGluPheTrpProCysSerProIleThr

115120125

GlnGlyAspArgGlyValGlySerThrAlaValIleLeuAspAspAsn

130135140

PheValThrLysAlaAsnAlaLeuThrTyrAspProTyrValAsnTyr

145150155160

SerSerArgArgHisThrIleThrGlnProPheSerTyrHisSerArg

165170175

TyrPheThrProLysProValLeuAspArgThrIleAspTyrPheGln

180185190

ProAsnAsnLysArgAsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrThrGly

195200205

AsnValAspHisValGlyLeuGlyThrAlaPheGluAsnSerIleTyr

210215220

AspGlnAspTyrAsnIleArgIleThrMetTyrValGlnPheArgGlu

225230235240

PheAsnLeuLysAspProProLeuAsnProLys

245250

<210>3

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ATAGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCA59

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ATACCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCA59

<210>5

<211>57

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

ATAGGATCCGGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGT57

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG29

Claims

1.一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，其特征是：该基因是在缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合细胞分泌型多肽MPG的基因序列所形成的，所述缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征是：该基因的序列如SEQIDNO.1所示。

3.一种扩增编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的引物，其特征是：依次以下述a、b、c三对引物进行三次PCR扩增最终得到权利要求1或2所述的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因；

引物a：

上游引物：5'-ATAGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCA-3'

下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'

引物b：

上游引物：5'-ATACCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCA-3'

下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'

引物c：

上游引物：5'-ATAGGATCCGGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGT-3'

下游引物：5'-ATCCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGGG-3'。

4.一种重组质粒，其特征是：将权利要求1或2所述的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因插入pET28a（+）质粒中构建而得。

5.一种重组工程菌，其特征是：是将权利要求4所述的重组质粒转化入大肠杆菌中而得。

6.一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征是：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

7.根据权利要求6所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征是：由权利要求5所述的重组工程菌在IPTG诱导下表达而得。

8.一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，其特征是：将权利要求5所述的重组工程菌进行培养，待菌液OD600达到0.8-1.0时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，继续培养5h；培养结束后离心收集细菌，用PBS重悬，超声破碎收集上清液，重组猪圆环病毒2型Cap蛋白存在于上清液中；或者，进一步将所得上清液用硫酸铵进行纯化，获得纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

9.一种亚单位疫苗或PCV2抗体诊断试剂盒，其特征是：含有权利要求6或7所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

10.一种权利要求9所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征是：

（1）将权利要求5所述的重组工程菌培养至菌液OD600达到0.8-1.0，然后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，继续培养5h；培养结束后离心收集细菌，用PBS重悬，超声破碎收集溶有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的上清液，或者将该上清液进一步用硫酸铵纯化，得纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白；

（2）取8ml上述溶有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的上清液或8ml纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，用PBS稀释至500μg/mL，然后加入2ml佐剂，制得亚单位疫苗。