CN107875378A - 一种猪圆环病毒3型灭活苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪圆环病毒3型灭活苗及其制备方法，涉及兽用生物制药领域。猪圆环病毒3型毒株，命名为PCV3‑BJ23，保藏号为CGMCC No.13855。本发明包括以下技术步骤：（1）猪圆环病毒3型病毒PCV3‑BJ23株的分离鉴定；（2）用PCV3‑BJ23株制备疫苗；（3）猪圆环病毒3型灭活苗的安全试验、抗体水平检测试验、效力试验。目前市场上无猪圆环病毒3型商品苗，本发明提供的猪圆环病毒3型灭活苗具有较好的安全性，可以诱导猪产生免疫保护效果，符合国家兽医生物制品标准。

Description

一种猪圆环病毒3型灭活苗及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制药领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型疫苗及其制备方法。
技术背景
猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3, PCV3）能引起猪的皮炎肾病终合征（PDNS）、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，首先于2015年在美国报道，随后2016年中国华中与华南地区的八九个省份陆续报道该病的流行与病原的分离鉴定，基于目前该病传播流行的快速以及其较高的致病性，畜牧兽医行业各界对其高度重视，尽早开展针对该病的病原生物学研究与疫苗研制迫在眉睫。
目前，国内尚无猪圆环病毒3型疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪圆环病毒3型病毒及其应用，即一种灭活苗，且免疫原性好的猪圆环病毒3型病毒，从而弥补现有技术的不足。
本发明的猪圆环病毒3型病毒PCV3-BJ23株，2013年9月12日于北京康宝利华生物科技有限公司实验室从河北省某发病猪场分离鉴定。
本发明的PCV3-BJ23株用于制备预防猪圆环病毒3型的疫苗。
本发明的PCV3-BJ23株还用于制备抗体。
本发明所筛选的猪圆环病毒3型病毒PCV3-BJ23株，含量为105.5 TCID50/头份，与佐剂ISA206混合后制备的疫苗免疫原性好，抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，免疫剂量小，在产前42天前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。
附图说明
图1为 PCV3进行IFA的实验结果，A：细胞对照，B：实验组。
图2为 PCV3 PCR检测结果，通道1：Takara DNA Maker；通道2：阳性对照；通道3：第3代病毒液；通道4：阴性对照。
图3 为母猪免疫不同疫苗后的抗体水平检测。
本发明所选用的猪圆环病毒3型毒株为PCV-3毒株BJ23株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCCNo.13855。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的病毒进行详细的描述
实施例1：猪圆环病毒3型病毒PCV3-BJ23株的分离鉴定
猪圆环病毒3型病毒PCV3-BJ23株的分离
1）在流行病学调查时，河北某猪场送检仔猪，剖检取淋巴结，按照1:5的比例（重量：体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤。
2）按常规方法接种汇合度约50%的改造后的PK15细胞（接种前用pH7.4的PBS洗三次），按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含2% FBS），37℃温箱培养。如此操作盲传至第3代。同时设置空白细胞作为对照。
3）盲传传至第3代时进行IFA验证。具体方法为将带毒细胞进行铺板，37℃温箱培养3天，将病毒液倒入含有2%NaOH的废弃桶中，每孔加入200μl PBST（0.1mol/L PBS中加入0.05% 吐温20，以下同）洗4次后，每孔加入100μl预冷80%丙酮，室温固定10分钟。弃去固定液，拍干细胞板中余液，放置于开启风机生物安全柜中约5min使细胞板自然干燥。固定完毕后每孔加入200μl PBST洗4次，以1%PBA（PBS+1%BSA）1000倍稀释的猪源PCV3阳性血清，每孔加入50μl，置4℃缓慢振荡感作过夜。隔日弃去一抗，每孔加入200μl PBST洗4次。以1%PBA200倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG二抗（避光），每孔加入50μl，置室温37℃感作1小时，每孔加入200μl PBST洗4次。将PBST倒干后，再加入50μl PBST，并于倒置荧光显微镜200倍视野下观察荧光。细胞对照孔应无特异性荧光出现，而病毒接种细胞孔应有大量荧光出现，见说明书附图图1。
2. 病毒PCR检测
1）按照OMEGA试剂盒的说明进行DNA的提取，产品立即进行PCR或贮存于-20℃备用。并合成检测引物PCV3F：AGAGGCTTTGTCCTGGGTGAG；PCV3R：AGACGACGACGCCACAGRAGG。
2）取DNA 1µL，2×Promega Mix 12.5ul，引物PCV3-F、PCV3- R各1ul，高压灭菌水9.5ul，总体积25ul。反应条件： 94℃ 3min，94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 45s，35个循环，72℃7min。
3）扩增后的产物，进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出目的条带448bp，见说明书附图图2。
3.病毒滴毒测定
取第3代病毒，用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7 四个稀释度，每个稀释度分别接种汇合度约50%的PK15细胞96孔细胞板6孔，100μl/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO2培养箱培养72～120小时，每孔加入200μl PBST(0.1mol/L PBS中加入0.05% 吐温20，以下同)洗4次后，每孔加入100μl预冷80%丙酮，按照间接免疫荧光方法进行操作，并于倒置荧光显微镜200倍视野下观察荧光。采用Reed-Muench法，计算TCID50。经测定，病毒含量为5×105TCID50/ml。
4. 动物回归试验
1）取PCV3抗原、抗体阴性的母猪所产的3～5日龄仔猪10头，每头口服2ml第10代病毒，观察7天，统计接种猪的发病情况，对试验猪进行剖检，观察病理变化。剖检取淋巴结，提取基因组DNA，按实施例1第2步提到的检测引物，进行PCR 检测，并将PCR 产物进行序列测定。结果仔猪7/10发病，发病猪表现为厌食、消瘦，个别猪出现关节肿胀，剖检观察发现心和肺出现典型的病理变化。从发病猪的淋巴结中可扩增出448bp 的片段，经序列分析为PCV3cap基因。
2）经实验室分离鉴定，已成功的从河北某猪场死胎猪淋巴结中分离到猪圆环病毒3型病毒，命名为PCV3-BJ23株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCC No.13855。
实施例2. 用PCV3-BJ23株制备疫苗
1.疫苗的制备
1）按照常规方法制备改良的PK15细胞（PK15细胞由北京康宝利华生物科技有限公司改良并保存），生长液为含10%新生牛血清的MEM，培养至细胞长成单层时接种PCV3-BJ23病毒；
2）取PCV3-BJ23毒株（5×105TCID50/ml）按1%接种长势良好的PK15单层细胞，置37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有2%新生牛血清的MEM作为维持液继续培养；
3）接毒后，72h收获病毒，将收获的病毒在-80℃，反复冻融三次，8000 rpm离心20 min，收集上清液，即为病毒液；
4）病毒液经20倍浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24h得到疫苗原液；
5）配制佐剂（含5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温60、93% 0.005M柠檬酸钠）：将处方量的吐温80与柠檬酸钠缓冲液搅拌混匀，再加入处方量的油酸、角鲨烷，高压均质机1200bar，进行5个循环，然后收集料液， 0.22 μm PTFE膜过滤除菌；
6）将疫苗原液和佐剂按5:4的体积比，无菌环境中，搅拌混合均匀，即制得猪圆环病毒3型灭活疫苗。
2.疫苗检验方法及结果
按照上述方法制备出3批疫苗，批号分别为20131201、20131202、20131203。
2.1性状检验 3批灭活疫苗外观呈粉红色乳胶状。
2.2无菌检验 3批灭活疫苗按照现《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，T.G、G.P 管和G.A 斜面培养基均未观察到菌落。
2.3支原体检验 3批灭活疫苗按照《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。
2.4外源病毒检验 3批灭活疫苗按照《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部附录进行检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环1型病毒、猪圆环2型病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等污染。证明毒种是纯净的。
2.5安全检验 取猪圆环病毒3型病毒抗体、抗原均为阴性的3日龄猪24头，随机分成4组，每组6头，肌注10头份疫苗，临床观察14日，均6/6健活，未见不良反应发生。
表1：3批猪圆环病毒3型灭活疫苗检验结果
实施例3 猪圆环病毒3型灭活苗的安全试验
材料与方法
1.1对妊娠母猪的单剂量试验
取产前5-6周猪猪圆环病毒3型中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，第一组肌肉注射20131201批猪圆环病毒3型病毒灭活苗1头份/头，第二组不进行注射作为对照组，观察至母猪产仔。
1.2对妊娠母猪的单剂量重复试验
取产前5-6周猪圆环病毒3型抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，第一组肌肉注射20131201批猪圆环病毒3型灭活苗1头份/头，第二组不进行注射免疫。免疫后2周第1组肌肉注射20131201批猪圆环病毒3型灭活苗1头份/头，观察至母猪产仔。
1.3 对妊娠母猪的超剂量试验
取产前5-6周猪圆环病毒3型抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪16头，随机分成4组，第1、2、3组分别肌肉注射20131201、20131202、20131203批猪圆环病毒3型灭活苗各2头份/头，第4组不进行注射作对照组，观察至母猪产仔。
结果
2.1 单剂量试验结果
免疫组5头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。
2.2单剂量重复试验结果
免疫组5头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。
2.3超剂量试验结果
3批疫苗免疫组12头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。
实施例4 母猪注射猪圆环病毒3型灭活疫苗后的抗体水平检测试验
1）材料与方法
取产前42天猪圆环病毒3型抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪20头，随机分成4组，每组5头，第1组肌肉注射20131201批猪圆环病毒3型病毒灭活苗1头份/头，第2组不进行注射作为对照组。各组于免疫后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周采血，分离血清进行Elisa抗体检测和病毒中和试验。
2）Elisa抗体检测
用大肠杆菌表达的PCV3-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验建立间接Elisa方法。首先确定最佳包被浓度，然后以该浓度100ul/孔，4℃孵育过夜；洗涤4次，每次1min；每孔加100ul的1%BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；将待检血清用含0.1%的BSA的PBS进行倍比稀释，每个样品一行，每孔加100ul，37℃作用1h；洗涤；然后加入HRP标记的抗猪二抗（稀释度1：1W），每孔加100ul，37℃作用1h；洗涤；每孔加100ul底物TMB显色，37℃作用10min；最后用2N H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450/阳性血清OD450≥0.5为阳性。
3）血清中和实验
采用固定病毒稀释血清法。将待检血清56℃灭活30min，12000rpm离心5min，取上清，进行倍比稀释；分别与等体积的200TCID50 PCV3病毒液混合，37℃作用1h，接种于含单层PK15细胞的96孔板内，每孔100ul，每一稀释度接种6孔，同时设置细胞对照和病毒对照，培养72h，用预冷80%丙酮进行固定，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。
4）结果
本发明所制备的疫苗，仔猪免疫后14天产生中和抗体，且首免后35d， 免疫组ELISA抗体效价达到1 : 3840；中和抗体效价达到1 : 32以上，抗体滴度高，维持时间长，见说明书附图图3。
实施例5 猪圆环病毒3型灭活疫苗的效力试验
1）材料与方法
取产前5-6周猪圆环病毒3型抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，第1组肌肉注射20131201批猪圆环病毒3型病毒灭活苗1头份/头，第2组不进行注射作为对照组，母猪产仔后，3日龄、7日龄、14日龄仔猪各取16头，随机分成2组，每组8头，均口服猪圆环病毒3型强毒5ml，观察攻毒后仔猪的临床表现。
2）结果
免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，8头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；8头对照仔猪攻毒后，8/8出现体温升高（>40℃），持续3~6天，第10天出现食欲减退现象，有2头死亡；7日龄攻毒后，8头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；8头对照组仔猪攻毒后，8/8出现体温升高（>40℃）、食欲减退现象，1/8死亡；14日龄攻毒后，8头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；8头对照组仔猪攻毒后，8/8出现体温升高（>40℃）、食欲减退现象，无死亡。 死亡仔猪病理剖检表现为肺脏出血，淋巴结肿胀、出血，脾脏边缘轻微出血等。
表2 免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率
攻毒日龄 免疫组攻毒保护率 对照组攻毒保护率
3日龄 8/8 6/8
7日龄 8/8 7/8
14日龄 8/8 8/8
本发明所筛选的猪圆环病毒3型病毒PCV3-BJ23株与佐剂（5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温60、93% 0.005M柠檬酸钠配制而成）混合后制备的疫苗安全性很好，免疫原性好，抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，免疫剂量小，在产前42天前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。

Claims (6)

1.一种猪圆环病毒3型灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的猪圆环病毒3型和疫苗佐剂；其中猪圆环病毒3型含量≥105.5 TCID50/头份。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型灭活疫苗，其特征在于，所述猪圆环病毒3型命名为PCV3-BJ23，保藏号为CGMCC No.13855。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型灭活疫苗的制备方法，其特征在于，其制备方法包括：
1）猪圆环病毒3型病毒PCV3-BJ23株的分离鉴定；
2）以PCV3-BJ23株为毒种制备病毒液，病毒液经灭活、浓缩后与佐剂混合，制得疫苗。
4.根据权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为ISA206。
5.根据权利要求4所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒3型浓缩至含量至少为105.5 TCID50/头份。
6.根据权利要求4所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的疫苗佐剂为ISA206，含量为疫苗总量的4:9（V/V）。
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