CN107304416A - 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

发明公开了一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用，该毒株系冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒，命名为PEDV/CH/NB/2014，保藏编号CGMCC No.12041。该病毒的培养使用无胰酶并添加含有2%胎牛血清的DMEM作为维持液。并稳定在Vero细胞中高效增殖，病毒滴度可达到108.0TCID50/mL，无外源病毒污染，对仔猪具有较强的致病力，病毒滴度达到103TCID50时就能引起仔猪发病，为当前国内流行的变异强毒株，用于制备PEDV诊断试剂和疫苗，具有良好的免疫原性，可弥补现有疫苗种类少的不足。

Description

一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株流行性腹泻病毒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一种急性高度接触性肠道传染病，由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，其临床特征为水样腹泻、呕吐和脱水。各日龄的猪均易感，尤其是哺乳仔猪。PED 在世界范围内广泛分布，英国、比利时、法国、匈牙利、加拿大等国相继报道了本病的发生。据报道，PED 近几年在亚洲国家发生相当严重，日本、韩国、泰国均出现过大流行，并且死亡率高，危害严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。

目前还没有治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此现在仍以疫苗预防为主，虽然目前已有猪流行性腹泻的商业疫苗用于猪群，但是该病毒还是出现在了免疫猪群中，给该病的预防带来了极大的困难，因此寻找一个新的具有较高免疫原性的毒株对于猪流行性腹泻预防措施及诊断方法的研制有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现在猪流行性腹泻疾病防控中的问题，提供一株最新的猪流行性腹泻病毒。

本发明还提供上述猪流行性腹泻病毒株的培养方法。

本发明还提供上述猪流行性腹泻病毒株的应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种猪流行性腹泻病毒，该病毒的分类命名为猪流行性腹泻病毒，拉丁文学名为Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），名称为PEDV/CH/NB/2014，该病毒已于2016年2月18日典藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号CGMCC No.12041。

上述猪流行性腹泻病毒，其病毒纤突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；ORF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；囊膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示；核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

上述猪流行性腹泻病毒的培养方法，步骤如下：

1）用细胞培养液培养Vero细胞使之形成细胞单层；

2）将单层的Vero细胞的生长液弃掉，用PBS洗涤细胞3次，加入1-5%猪流行性腹泻病毒液，37℃和5%浓度CO2条件下感作1.5h，每隔20min摇动一次，吸附完毕后弃掉吸附液，加入含有浓度2%胎牛血清的DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养；

3）连续培养至第7天或者出现70-80%细胞病变时收毒，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物做种毒进行下一轮传代。

上述培养方法中，所述细胞培养液为培养Vero细胞系的常用培养液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的PEDV/CH/NB/2014毒株可在Vero细胞中高效增殖，病毒滴度可以达到108.0TCID50/mL，无外源病毒污染；

2、本发明的PEDV/CH/NB/2014毒株对仔猪具有较强的致病力，病毒滴度100TCID50时即能引起仔猪发病，具有良好的免疫原性；

3、本发明的PEDV/CH/NB/2014毒株与CV777毒株S基因的同源性只有94%，S蛋白在病毒侵入宿主细胞上起着关键性的作用，并且是主要的中和介导抗原决定部位，因此S蛋白作为发展PEDV疫苗的首选目标，PEDV/CH/NB/2014毒株的成功分离及其稳定传代对新疫苗的开发具有重要作用。本发明不仅对我国猪流行性腹泻病毒毒种保存是一种补充，对研究不同同PEDV毒株和流性毒株之间关系，该病引起的疾病诊断，感染检测体系完善和所致疾病流行的控制等有重要的作用。

附图说明

图1：病料的RT-PCR检测结果电泳照片，其中M：DL2000Marker；1-7：阳性病料；8：阴性病料；9：阴性对照；10：阳性对照。

图2：Vero细胞感染PEDV后的病变照片（20×倍数），其中2-1:正常细胞对照；2-2:病料传至第5代时，Vero细胞感染病毒48h后的病变照片，细胞圆缩，聚堆，单个细胞死亡，拉丝，脱落。

图3：RT-PCR检测不同代次的PEDV/CH/NB/2014病毒培养物，1：阳性对照2：阴性对照；3-7：第5、10、15、20、25代细胞培养上清。

图4：PEDV/CH/NB/2014毒株感染Vero细胞的透射电镜照片，箭头指示为病毒颗粒。

图5：间接免疫荧光鉴定照片，其中5-1：阴性对照；5-2：PEDV/CH/NB/2014感染Vero细胞的结果。

图6：PEDV/CH/NB/2014分离株S基因系统进化分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

具体实施方式1：病毒的分离与培养

浙江省宁波市某猪场送检腹泻仔猪小肠，取其肠壁及内容物，用RT-PCR 方法进行检测，结果为猪流行性腹泻抗原阳性，获得了猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/NB/2014（图1）。

取送检小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量: 体积）加入生理盐水，研磨，反复冻融3 次，8000r/min离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤，所得病料处理液分装并于-80℃冰箱储存备用。

用细胞培养液培养Vero细胞使之形成细胞单层，将单层的Vero细胞的生长液弃掉，用PBS洗涤细胞3次，加入1-5%猪流行性腹泻病毒液，37℃和5%浓度CO2条件下感作1.5h，每隔20min摇动一次，吸附完毕后弃掉吸附液，加入含有浓度2%胎牛血清的DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养。如此操作盲传至第10 代，观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。

盲传传至第2代时细胞出现轻微的CPE 变化，传至第10代时则出现明显、稳定的CPE 变化，细胞圆缩，聚堆，单个细胞死亡，拉丝，脱落（图2）。

具体实施方式2：细胞培养物的RT-PCR 检测

PEDV/CH/NB/2014 5、10、15、20、25代次细胞培养物分别取250 μL，使用OMEGA公司生产的Total RNA Kit II试剂盒提取RNA。提取后的RNA进行反转录：6 μL的RNA与1μL Oligo(dT)混合均匀，70℃ 10 min，迅速冰浴2min。向该混合液中加入2 μL 5×Buffer，0.5 μL10 mM的dNTP mix，0.25μL MLV反转录酶及0.25 μL RNase Inhibitor。混匀后按如下条件反应：42℃，60 min；70℃，15 min。

反转录后的cDNA用以下引物进行PCR，扩增N基因，上游引物NF：5’CGGTTCTCACAGATAGTGAG 3’，SEQ ID NO：17；下游引物NR：5’ CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT 3’，SEQ ID NO：18。 反应体系为：cDNA 1μL，2×Taq Mix 12.5μL，10 μM/mL的上下游引物各0.5μL，补加去离子水至25μL，混合均匀。同时设水阴性对照和CV777毒株阳性对照。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30 s，56℃退火30s，72℃延伸2min，反应30个循环；72℃延伸10 min。

取10μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图3，可见PEDV/CH/NB/2014不同代次细胞培养物样品均检测到阳性条带。

具体实施方式3：病毒滴度检测

采用微量滴定法测定PEDV/CH/NB/2014病毒毒价，采用方法如下：采用Vero细胞进行病毒滴度的测定。用96孔细胞培养板培养Vero细胞，将病毒用不加血清的DMEM从10-1倍比稀释至10-10，分别将每个稀释度的100μL病毒液接种到铺满Vero细胞的培养孔，每个稀释度接种8孔，同时设置阴性细胞对照孔。置37℃，5%CO2培养箱中培养，4-6天观察细胞感染病毒情况，计算病毒滴度，最高病毒毒价可达108.5TCID50/ml。

具体实施方式4：动物回归实验

取TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的3日龄仔猪5头，每头口服PEDV/CH/NB/2014病毒第5代103个TCID50，观察7日，统计接种猪的发病情况，对试验猪进行剖检，观察病理变化。取发病猪肠粘膜和内容物，提取RNA，按实施例第二步提到的检测N基因设计的引物，进行RT-PCR 检测，并将PCR 产物进行序列测定。结果5头仔猪全部发病，发病率为100%，5头仔猪死亡，死亡率为100%，发病猪表现为腹泻，脱水，个别猪出现呕吐，剖检观察发现胃和小肠出现典型的病理变化。从发病猪的肠粘膜及内容物中可扩增出1326bp的片段，经序列分析为PEDV N基因。

具体实施方式5：电镜鉴定

将PEDV/CH/NB/2014病毒感染Vero细胞单层后，分别于24h、36h和48 h时，用细胞刮收取细胞，800 r/min离心后，收集细胞并用2.5%戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并用醋酸铀和柠檬酸铅染色，电子显微镜观察病毒形态，见图4，结果显示感染PEDV/CH/NB/2014的vero细胞中能检测到典型PEDV病毒粒子，表明PEDV/CH/NB/2014病毒在vero细胞中稳定增殖。

具体实施方式6：间接免疫荧光检测

于12孔板培养Vero细胞，长至单层后接种PEDV/CH/NB/2014 第5代病毒培养物，同时设立不接毒的Vero细胞作阴性对照，以及接种CV777毒株的阳性对照。培养36h后在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次。每孔加入500μL -20℃预冷的丙酮，将培养板置4℃冰箱固定15min。PBS洗涤3次，每次5min。每孔加入500μL 5%的脱脂奶粉封闭30min。弃掉脱脂奶粉，用PBS轻轻洗涤2次，每次3min。向孔内滴加适当稀释后的一抗（鼠抗PEDV 6C8单克隆抗体（BioNote，Seoul，Korea））各200μL，于37℃作用1h。PBS洗涤3次，每次5min；滴加FITC（异硫氰酸荧光素）标记的山羊抗鼠IgG二抗（1：20000），37℃作用30min，PBS洗涤3次，每次5min。每孔加入500μLPBS，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。实验过程中需设置只加一抗不加二抗和只加二抗不加一抗的阴性对照。结果显示，阴性对照孔均无荧光；阳性对照孔及接种PEDV/CH/NB/2014的孔均在细胞浆中呈现绿色荧光；只加一抗和只加二抗的阴性对照孔没有绿色荧光背景。说明所分离到的病毒是猪流行性腹泻病毒，结果见图5，表明分离株PEDV/CH/NB/2014具有良好的抗原性。

具体实施方式7：S、ORF3、M、N基因序列测定

取250 μL PEDV/CH/NB/2014第5代Vero细胞培养物提取RNA，并进行反转录及PCR扩增（RNA提取和反转录体系及反应条件同上述步骤2）。反转录后的cDNA用下述引物进行PCR：分段扩增S基因，引物S1F 5’ TAGTGATGTTGTGTTAG 3’，见SEQ ID No:2；S1R 5’CGCTGCACAGCAGCTC 3’，SEQ ID No:3；S2F 5’ CATACCAGAAGGTTTTAG 3’ ，见SEQ ID No:4；S2R 5’ GTAATCAACTCACCCTT 3’，见SEQ ID No:5； S3F 5’TTACCCTGAGTTTGGTAGTG 3’，见SEQ ID No:6； S3R 5’ TCCGTCTGTAGAGCAAGAT 3’，见SEQ ID No:7；S4F 5’CTTCACATGTATAGTGCGTCT 3’，见SEQ ID No:8；S4R 5’ CAGACTTTGAGACATCTTTGAC 3’，见SEQID No:9。扩增ORF3基因，引物ORF3F 5’CTAGACTTCAACCTTACGAA 3’，见SEQ ID No:11；ORF3R5’TACTAGACCATTATCATTCACT 3’，见SEQ ID No:12。扩增M基因，引物 MF 5’ACTGTTATTGACGTATAAACG 3’,见SEQ ID No:14；MR 5’ ATGAAGCACTTTCTCACTATC 3’，见SEQID No:15。扩增N基因，引物NF 5’ CGGTTCTCACAGATAGTGAGA 3’，见SEQ ID No:17；NR 5’CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT 3’，见SEQ ID No:18。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min。将PCR产物送诺塞基因公司进行测序。测序结果：S基因拼接后全长为4161bp，见SEQ ID No:1；ORF3基因全长675bp，见SEQ ID No:10；M基因661bp（非全长），见SEQ ID No:13 ；N基因全长1326bp，见SEQ ID No:16。

具体实施方式8：S基因进化分析

利用DNAStar软件对测序结果进行分析，结果表明，PEDV/CH/NB/2014与美国分离株USA/Colorado/2013构成一新的分支，与我国报道株PEDV/CH/BJ/2014、FJ-ZP-2014、BJ-2012及ZJ-2011-2同源性较高；与经典参考株如比利时CV777毒株、韩国DR13毒株、日本KPEDV-9毒株等相比，不在同一进化分支上，已经发生了明显的变异，表明我国及美国最新流行的PEDV野毒株发生了明显的变异，结果见图6。

所述毒株可以应用于制备猪流行性腹泻病毒治疗感染药物中，制备猪流行性腹泻病毒诊断试剂中或者制备猪流行性腹泻病毒疫苗中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京伟嘉人生物技术有限公司

<120> 一株猪流行性腹泻病毒的分离培养与应用

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Claims (6)

1.一株猪流行性腹泻病毒，名称为PEDV/CH/NB/2014，保藏于中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12041。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒，其特征在于，其病毒纤突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；ORF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；囊膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

3.一种权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，步骤为：

1）用细胞培养液培养Vero细胞使之形成细胞单层；

2）将单层的Vero细胞的生长液弃掉，用PBS洗涤细胞3次，加入1-5%猪流行性腹泻病毒液，37℃和5%浓度CO2条件下感作1.5h，每隔20min摇动一次，吸附完毕后弃掉吸附液，加入含有浓度2%胎牛血清的DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养；

3）连续培养至第7天或者出现70-80%细胞病变时收毒，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物做种毒进行下一轮传代。

4.权利要求1或2 所述毒株在制备猪流行性腹泻病毒治疗感染药物中的应用。

5.权利要求1或2 所述毒株在制备猪流行性腹泻病毒诊断试剂中的应用。

6.权利要求1或2 所述毒株在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用。