CN107619822B - 一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用，该猪流行性腹泻病毒JS/PEDV/2/2014G100，保藏编号CCTCC NO.V201728，全长27939bp，其ORF3基因中比PEDV强毒株缺失49个核苷酸，遗传进化分析表明，该毒株归属于G1亚群，在Vero细胞上的增殖不依赖于胰酶，属于细胞适应株，其具有较好的交叉保护性、抗原性和免疫原性，感染猪体临床表征正常，体重增长稳定，不出现排毒现象，体内能产生高水平PEDV抗体，血清IgG抗体的OD450值可达1.2，免疫后60d抗体的OD450水平仍维持在1.0，为后续疫苗研制提供了科研材料。

Description

一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以哺乳仔猪呕吐、腹泻、脱水为典型特征的一种急性、高度接触性传染病。不同年龄、性别和品种的猪均易感染，但其中对哺乳仔猪的危害最严重。

1971年英国首次报道了PED，随后日本、韩国、瑞士、德国、比利时、加拿大等国家陆续报道了该病。中国于1976年首次报道了该病，目前，全国26个省市自治区均有发生，特别是2010年以来，全国大面积流行给养猪业带来了巨大的损失。

秦谷雨等(安徽省仔猪腹泻5种病毒感染情况的调查研究，动物医学进展，2012.33(12)：59-63)对安徽省仔猪腹泻调查情况显示，PEDV阳性病例达59.1％，阳性猪场占75.7％；PEDV与TGEV混合感染占4.3％，PEDV与PCV2混合感染占18.8％，PEDV与PRV混合感染占10.8％。王子龙等(河北省猪病毒性腹泻流行病学调查，黑龙江畜牧兽医，2014，5：59-60)对报道河北省猪腹泻病中PEDV检出率高达86.21％。蔡汝健等(2010-2013年华南地区猪流行性腹泻病流行情况调查及防控效果，广东农业科学，2013，11：105-114)检测我国南方地区PEDV的流行情况，显示PEDV的阳性率高达80％。这些数据证实，PEDV是目前猪病毒性腹泻的主要病原，与国内外当前调查结果高度一致。

目前市场上PEDV疫苗主要有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+CV777株+NX株)，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(HB08株+ZJ08株)等。

尽管疫苗的使用普及率很高，但以PEDV为主要病原引起的腹泻疫情仍然持续存在。PEDV流行株和疫苗株S基因的差异可能是导致基于CV777疫苗株免疫效果不好的原因。因此，PEDV流行株的分离对于猪流行性腹泻病病原学研究和疫苗的研制非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用，该猪流行性腹泻病毒弱毒株属于冠状病毒科(Coronaviridae)α-冠状病毒属(Alphacoronavirus)猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)，名称为猪流行性腹泻病毒JS/PEDV/2/2014 G100(porcine epidemic diarrhea virus)，于2017年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号CCTCCNO.V201728，其对近年来国内流行的PEDV毒株具有较好的交叉保护性，抗原性和免疫原性均较好，感染猪体临床表征正常，体重增长稳定，不出现排毒现象，体内能产生高水平PEDV抗体，血清IgG抗体的OD450值可达1.2，免疫后60d抗体的OD450水平仍维持在1.0。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪流行性腹泻病毒弱毒株，名称为猪流行性腹泻病毒JS/PEDV/2/2014 G100，保藏编号CCTCC NO.V201728。

进一步，所述猪流行性腹泻病毒弱毒株的辅助基因ORF3比PEDV强毒株的ORF3缺失49个核苷酸序列，其核苷酸序列与如SEQ ID NO.1所示序列有至少99.8％的同源性。

又，所述猪流行性腹泻病毒弱毒株的S基因氨基酸序列与如SEQ ID NO.2所示序列有至少98.1％的同源性。

一种猪流行性腹泻病毒弱毒株的培养方法，包括如下步骤：

将0.5-1MOI猪流行性腹泻病毒弱毒株JS/PEDV/2/2014 G100接种于Vero细胞，吸附1-2h后，弃去细胞上清，加入含有1-3％FBS的DMEM培养液，培养60-72h，收集细胞培养液。

进一步，将收集的细胞培养液保存于-40℃以下，备用。

一种猪流行性腹泻弱毒疫苗，其包含所述的猪流行性腹泻病毒弱毒株。

本发明中提供的PEDV流行株JS/PEDV/2/2014 G100，基因组全长27939bp，其ORF3基因比PEDV强毒株缺失49nt，与传代致弱前的病毒株JS/PEDV/2/2014相比，其S基因有氨基酸发生变异，遗传进化分析表明，本发明的JS/PEDV/2/2014 G100弱毒株归属于G1亚群，在Vero细胞上增殖不依赖于胰酶，属于细胞适应株。

仔猪口服免疫本发明的JS/PEDV/2/2014 G100毒株后，临床表征正常，体重增长稳定，不出现排毒现象，血清IgG抗体的OD450值可达1.2，免疫后60d抗体的OD450水平仍维持在1.0左右，证实该毒株的免疫原性较好。此外，利用重组软件分析发现，本发明的JS/PEDV/2/2014 G100与CV777、DR13毒株之间存在重组现象，且以CV777为主，进一步说明本发明的PEDV流行株的交叉保护范围较广，适用于后续疫苗研制。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)仔猪口服免疫本发明病毒后，临床表征正常，体重增长稳定，不出现排毒现象，血清IgG抗体的OD450值可达1.2，免疫后60d抗体的OD450水平仍维持在1.0，说明该毒株的免疫原性较好，且持续期较长。

2)经重组软件分析发现，本发明的猪流行性腹泻病毒JS/PEDV/2/2014G100与CV777、DR13毒株之间存在重组现象，可进行交叉保护，且以CV777为主，进一步说明本发明的PEDV流行株的交叉保护范围较广，适用于后续疫苗研制。

3)本发明的PEDV流行株和DR13、CV777毒株之间的重组区域均为3596-6819nt，位于ORF1a基因，且与CV777重组概率更高，重组系数最高为9.426×10^-03。

附图说明

图1为本发明实施例中RT-PCR检测样品PEDV感染结果，其中，1为疑似感染PEDV样品，2为阴性对照样品。

图2为本发明实施例中PEDV分离株的细胞传代培养检测结果，其中，M：DL 2,000；1-6：JS/PEDV/2/2014 G1-G6。

图3-4为本发明实施例中PEDV分离株的间接免疫荧光检测结果(200×)，其中，图3为Vero细胞，图4为JS/PEDV/2/2014G3感染Vero细胞。

图5为本发明实施例中JS/PEDV/2/2014 G100全基因组进化树分析结果。

图6为本发明实施例中对照组小猪肠道解剖病变图(剖杀)。

图7为本发明实施例中攻毒JS/PEDV/2/2014的病死猪肠道(自然死亡)。

图8为本发明实施例中JS/PEDV/2/2014 G100免疫仔猪的体重和抗体监测，其中，Marker：DL 2000；1、2：攻毒JS/PEDV/2/2014的猪肠内容物；3：对照组猪肠内容物。

图9为本发明实施例中第100代细胞毒JS/PEDV/2/2014 G100免疫仔猪的体重监测结果。

图10本发明实施例中第100代细胞毒JS/PEDV/2/2014 G100免疫仔猪的IgG抗体水平监测结果。

图11为本发明实施例中不同免疫剂量的JS/PEDV/2/2014 G100口服饲喂仔猪后的ELISA检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

DL2000DNA marker、ExTaq DNA聚合酶、Trizol、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、Recominant Rnase Inhibitor、dNTP Mixture(各2.5mM)均购自TaKaRa公司；PEDV单克隆抗体购自山东绿都有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

实施例PEDV流行株JS/PEDV/2/2014 G100的获得及应用

本实施例中，对上海和江苏周边地区采集的腹泻样品进行PEDV检测，成功分离1株PEDV流行株，并传代培养、筛选获得第100代PEDV流行株JS/PEDV/2/2014 G100，其抗原性和免疫原性均较好，为后续疫苗研制提供了科研材料。

1.样品来源

55份仔猪腹泻粪便样品采自上海某猪场，5份小猪腹泻肠道组织样品采集江苏某猪场。

2.引物设计

参照文献，针对PEDV M基因设计并合成一对PCR检测引物(表1)。

表1

3.实验方法

3.1样品处理及RT-PCR检测

腹泻粪便：用棉拭子采集腹泻粪便，并装于10ml离心管中，加入1ml灭菌PBS，充分溶解后，静置30min，吸取上清至一新的离心管中，-80℃保存。

肠道组织样品：刮取肠道黏膜内容物于离心管中，加入等量PBS，充分混匀后，静置30min，吸取上清至一新的离心管中，-80℃保存。

参照试剂盒说明书，取250μl处理好的样品进行总RNA的提取，最后用20μl H₂O溶解RNA，并用PEDV-R引物进行反转录。然后，取5μl cDNA进行PCR检测。PCR反应体系为：94℃4min，94℃35s、51℃35s、72℃45s(30cycles)，72℃8min。

PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3.2 PCR产物的克隆及序列测定

将大小正确的PCR产物胶回收后，与pMD-18T Vector连接并转化，利用提质粒法和菌液PCR法双重鉴定阳性克隆，并将其送上海生物工程有限公司测序。

利用Lasergene7.1软件对序列进行比对与分析。

3.3病毒的增殖及鉴定

选取生长状态良好的Vero细胞，胰酶消化后铺于6孔板中。第二天，弃去细胞上清，PBS洗2遍，然后分别加入含不同浓度胰酶的DMEM病毒培养液和样品处理液；吸附2h后，弃去上清，然后加入含一定胰酶浓度的DMEM培养液，37℃培养箱培养，观察细胞病变情况，若无病变，则5d后收毒；冻融2次后，再次重复上述过程，进行连续传代培养。

取250μl各代次的细胞培养物，进行RT-PCR检测，验证病毒传代成功与否。

3.4间接免疫荧光检测

将第3代的JS/PEDV/2/2014接种Vero细胞，吸附1h后，换成病毒培养液继续37℃培养。72h后，弃去细胞上清，PBST洗一遍，70％乙醇冰上固定15min；PBST洗3遍并甩干，加入1：1000稀释的PEDV单抗，37℃湿盒中孵育1h；同上洗涤，加入1：3000稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min；洗涤后，置于倒置荧光显微镜(Axio Observer)下观察。

3.5TCID₅₀的测定

提前24h将Vero细胞铺于96孔细胞板中，将不同代次的细胞毒JS/PEDV/2/2014进行10倍倍比稀释，然后加入各细胞孔中，100μl/孔，每个稀释度重复8孔。吸附1h后，弃去上清，加入PEDV病毒培养液，200μl/孔，然后置于37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

然后采用间接免疫荧光试验进行TCID₅₀的测定：培养120h后，弃去上清，PBS洗一遍，每孔加入100μl 75％乙醇，-20℃固定15min；弃去固定液，PBS洗3遍，然后加入1：1500稀释的PEDV单抗，37℃湿盒中孵育1h；弃去上清，洗涤同上，加入1：3000稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃湿盒中孵育30min；弃去上清，洗涤同上，然后每孔加入100μlPBS，置于荧光显微镜下观察。并按照Reed-Muench的方法进行TCID₅₀的计算。

3.6重组病毒分析

参考文献信息，设计了23对引物(见表2)，测定JS/PEDV/2/2014 G100的全基因组序列，并进行遗传进化分析，进一步利用RDP4.1重组软件进行全基因组重组分析，另外，采用5’RACE Kit测定其5’末端序列。

表2

3.7动物实验

3.7.1致弱毒株的代次筛选

在弱毒株的筛选中，筛选出对动物不致病，且无排毒现象，能产生较高水平的抗体，免疫原性较好，对其他强毒有较好的保护效力的弱毒株，具体地：

将22、60、100代次的PEDV细胞毒(10⁶TCID₅₀)分别口服饲喂新生未哺乳仔猪，检测其致病性。同时设置空白对照组。仔猪饲养温度约30℃。攻毒前禁水禁食3h，口服饲喂PEDV细胞毒后4h喂奶粉，30～50ml/只，每间隔3h，饲喂一次。观察仔猪状态，并收集腹泻粪便，粪便样品保存于-80℃。

若仔猪死亡，则进行剖检，并采集肠道组织。若仔猪未死亡，则7d后将其处死，并剖检、采集肠道组织。

3.7.2最佳口服免疫剂量的筛选

17只小猪，随机分成4组，对照组2只，其余3组各5只；分别为对照组(口服饲喂1mLDMEM培养液)、第一组(口服饲喂1mL JS/PEDV/2/2014 G100，病毒含量10^4.5TCID₅₀)、第二组(口服饲喂1mL JS/PEDV/2/2014 G100，病毒含量10^6.5TCID₅₀)、第三组(口服饲喂1mL JS/PEDV/2/2014 G100，病毒含量10^7.5TCID₅₀)。小猪一免后14d，进行二免，免疫剂量同第一次免疫。

观察仔猪状态，并在免疫0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d分别采集血液，用于血清IgG抗体水平的测定。

具体ELISA检测方法如下：

每孔包被100TCID50PEDV病毒，4℃包被过夜，去掉孔中溶液，每孔加200μl PBST洗涤液，置振荡仪上摇3min倒掉，拍干，重复洗涤5次；每孔加入250μl含5％脱脂乳的PBST封闭液，置于37℃温箱中封闭2h后倒掉，重复洗涤5次；用PBS稀释血清样品，每孔加100μl样品，37℃温箱中孵育1.5h后倒掉，重复洗涤5次；每孔加入100μl PEDV单克隆抗体(1：2000稀释)，37℃温箱中孵育1h后弃去上清，并洗涤5次；每孔加入PBST稀释的酶标二抗100μl，37℃温箱中孵育1h后倒掉，重复洗涤5次；每孔加入将A、B液按1：1的比例配制好的显色液50μl，37℃避光显色10min；每孔加入50μl终止液，10min内测定结果。

4.结果

4.1样品的RT-PCR检测结果

将样品处理后，利用PEDV M基因检测引物进行RT-PCR检测，结果如图1，其中，样品JS/PEDV/2/2014能扩增出552bp的条带，大小正确，与预期相符，初步证实样品中有PEDV存在。

4.2病毒分离

将JS/PEDV/2/2014样品接种于Vero细胞，分别在添加和不添加胰酶的情况下进行病毒分离培养。结果发现，该毒株可以在Vero细胞上增殖，且不需要添加胰酶。连续培养6代后，JS/PEDV/2/2014出现细胞病变。提取不同代次JS/PEDV/2/2014病毒培养液总RNA，利用PEDV引物进行PCR检测。结果如图2所示，JS/PEDV/2/2014第1、2代次的条带都较弱，第3代开始，病毒增殖比较稳定，证实PEDV毒株JS/PEDV/2/2014得到成功分离。

4.3病毒的间接免疫荧光鉴定

将第3代的JS/PEDV/2/2014接种于Vero细胞，72h后进行间接免疫荧光检测，结果参见图3-图4，可以看出，JS/PEDV/2/2014能与商品化PEDV单抗发生阳性反应，胞浆内出现特异性绿色荧光，进一步证实了这个毒株在Vero细胞上增殖成功。

4.4病毒滴度的测定

测定第10、20、50、60、80、90、100代JS/PEDV/2/2014细胞毒的病毒滴度，分别为10^3.1TCID₅₀/0.1mL、10^3.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.3TCID₅₀/0.1mL、10^6.4TCID₅₀/0.1mL、10^6.8TCID₅₀/0.1mL、10^7.5TCID₅₀/0.1mL、10^7.5TCID₅₀/0.1mL。

说明该毒株从第G90开始，病毒滴度较高，且维持在10^7.5TCID₅₀/0.1mL。

4.5全基因组序列信息

测定JS/PEDV/2/2014 G100毒株的全基因组序列，结果表明，JS/PEDV/2/2014G100全长27939bp，ORF3基因中缺失49nt，遗传进化分析表明，该毒株归属于G1亚群(图5)，与1986年分离的黑龙江CH/S毒株亲缘性最近。

4.6重组病毒分析

利用RDP4软件对JS/PEDV/2/2014 G100全基因组序列进行病毒重组分析，发现本发明的JS/PEDV/2/2014 G100毒株和DR13、CV777毒株之间均有重组现象，重组区域均为3596-6819nt，位于ORF1a基因，且与CV777重组概率更高些，重组系数最高为9.426×10^-03。

4.7不同代次PEDV毒株的仔猪攻毒试验

将第22代细胞毒JS/PEDV/2/2014 G22口服饲喂未哺乳仔猪，结果发现仔猪72h出水样腹泻症状，其中一只猪在156h死亡，另一只于第7d将其处死。剖解小猪，参见图6-图7，发现攻毒JS/PEDV/2/2014的病死猪肠道有PEDV感染症状。采集肠内容物进行RT-PCR检测，结果两只小猪肠内容物中均能检出约500bp的PEDV阳性条带，而对照组未检出(图8)。

将第60代细胞毒JS/PEDV/2/2014 G60口服饲喂未哺乳仔猪，结果发现仔猪72h出现腹泻症状，但不呈水样腹泻，5d后腹泻症状消失，临床表现正常；排毒较持久，JS/PEDV/2/2014 G60免疫仔猪排毒检测结果参见表3。

表3

由表3可见，从攻毒后第3d直至11d，仍能从粪便中检测PEDV阳性。

将第100代细胞毒JS/PEDV/2/2014 G100口服饲喂未哺乳仔猪，参见图9-10，结果发现，仔猪临床表现正常，无腹泻，鼻腔和粪便均无排毒现象，体重增长正常(图9)，一免14d，ELISA检测血清IgG抗体水平达0.75左右(图10)，证实该病毒的免疫原性良好。

4.8最佳免疫剂量的确定及抗体持续期监测

将不同免疫剂量的JS/PEDV/2/2014 G100分别口服饲喂仔猪，免疫后，各猪体均表现正常，无排毒现象，ELISA检测结果参见图11。

由图11可以看出，口服免疫10^4.5TCID₅₀病毒诱导产生的IgG水平不高，口服免疫10^7.5TCID₅₀病毒可诱导高水平IgG抗体，而口服免疫10^6.5TCID₅₀病毒诱血清IgG抗体水平最高；因此，确定10^6.5TCID₅₀是最佳免疫剂量。

监测IgG抗体水平，发现免疫60d后，IgG抗体水平仍维持在1.0左右，说明该毒株的免疫原性较好，且持续期较长。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用

<130> 1711344

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 276

<212> DNA

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 1

atgtttcttg gacttcttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcgaagtct 60

gccaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttctta tttacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattttt 240

ctttctgttg cacacttatt ggcagacttt gcttag 276

<210> 2

<211> 1382

<212> PRT

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 2

Met Thr Pro Leu Ile Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Gln Ser Thr Ile Asn Phe

20 25 30

Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val

35 40 45

Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly

50 55 60

Thr Gly Ile Glu Thr Asp Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu Ser Tyr

65 70 75 80

Ile Asp Ser Gly Gln Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe

85 90 95

Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Ile Asn Gly Asn

100 105 110

Thr Ser Ala Ile Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Asp Asn Lys

115 120 125

Thr Leu Gly Pro Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala Leu Gln Asp Gly Lys Asn Ile Val Val

145 150 155 160

Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ala Asp Lys Ile

165 170 175

Tyr His Phe Tyr Ile Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Arg Cys

180 185 190

Tyr Asn Lys Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Pro Thr Tyr

195 200 205

Tyr Met Leu Asn Val Ala Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Tyr Tyr Glu

210 215 220

Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ser Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr

225 230 235 240

Asp Ser Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe

245 250 255

Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val Val Ser Asn

260 265 270

Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Trp Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly

275 280 285

Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Met Asp Gly Val Cys Asn

290 295 300

Gly Ala Ala Ala Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn

305 310 315 320

Asp Thr Phe Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala

325 330 335

Leu Gly Thr Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp Pro His

340 345 350

Lys Ala Ile Phe Thr Ile Pro Leu Gly Val Thr Glu Val Pro Tyr Tyr

355 360 365

Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Lys Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu

370 375 380

Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Lys Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly

385 390 395 400

Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp

405 410 415

Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser

420 425 430

Gly Phe Trp Thr Val Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu

435 440 445

Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val

450 455 460

Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ser Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe

465 470 475 480

Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser

485 490 495

Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr

500 505 510

Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser

515 520 525

Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln

530 535 540

Phe Thr Ile Thr Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val

545 550 555 560

Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn

565 570 575

Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala

580 585 590

Gly Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly

595 600 605

Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile

610 615 620

Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Gln Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met

625 630 635 640

Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu

645 650 655

Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr

660 665 670

Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly

675 680 685

Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr

690 695 700

Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Asn Ser Thr

705 710 715 720

Phe Asn Asn Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn Asp

725 730 735

Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val

740 745 750

Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Leu Gln Asp Gly Gln Val

755 760 765

Lys Ile Ala Pro Met Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn Phe

770 775 780

Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr Asn Thr Pro Val

785 790 795 800

Ser Val Asp Cys Val Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn Ser Arg Cys Lys

805 810 815

Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr Ile Glu Ser Ala

820 825 830

Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Ser Met Leu

835 840 845

Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser Ser Phe Asn

850 855 860

Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Asp

865 870 875 880

Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Gly Ser Phe Ile Glu Asp Leu

885 890 895

Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr Val Asp Glu Asp

900 905 910

Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp Leu Val Cys Ala

915 920 925

Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val Val Asp Ala Glu

930 935 940

Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Met Ala Leu Gly

945 950 955 960

Gly Val Ser Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser His Ala Val Gln Ala

965 970 975

Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu Gln Arg Asn Gln

980 985 990

Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly Asn Ile Thr Ser

995 1000 1005

Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr Ser Asn Gly Leu

1010 1015 1020

Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu Val Val Asn Ser

1025 1030 1035 1040

Gln Gly Ser Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Leu Gln His Asn Phe

1045 1050 1055

Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile

1060 1065 1070

Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser

1075 1080 1085

Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val

1090 1095 1100

Gln Ala Ser Arg Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys

1105 1110 1115 1120

Ser Gln Ser Gln Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile

1125 1130 1135

Phe Ser Leu Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr

1140 1145 1150

Val Leu Val Pro Gly Asp Phe Val Asn Val Ile Ala Ile Asp Gly Leu

1155 1160 1165

Cys Val Asn Gly Asp Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val

1170 1175 1180

Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Tyr Phe Val

1185 1190 1195 1200

Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser Asp Phe

1205 1210 1215

Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Gly Thr Tyr Val Asn Leu Thr Ser Asp

1220 1225 1230

Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn Lys Thr Leu

1235 1240 1245

Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Ile Gly Pro Ser Leu Pro

1250 1255 1260

Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu Ile Ala

1265 1270 1275 1280

Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu

1285 1290 1295

Arg Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp

1300 1305 1310

Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu

1315 1320 1325

Ile Ile Phe Ile Val Leu Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys

1330 1335 1340

Cys Ile Ser Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys

1345 1350 1355 1360

Phe Ser Gly Cys Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Ala Phe

1365 1370 1375

Glu Lys Val His Val Gln

1380

Claims (5)

1.一种猪流行性腹泻病毒弱毒株，名称为猪流行性腹泻病毒JS/PEDV/2/2014G100，保藏编号CCTCC NO.V201728，该弱毒株的辅助基因ORF3比PEDV强毒株的ORF3缺失49个核苷酸，其核苷酸序列与如SEQ ID NO.1所示序列有至少99.8％的同源性，且其在Vero细胞上的增殖不依赖于胰酶。

2.根据权利要求1所述猪流行性腹泻病毒弱毒株，其特征在于，其S基因氨基酸序列与如SEQ ID NO.2所示序列有至少98.1％的同源性。

3.一种猪流行性腹泻病毒弱毒株的培养方法，包括如下步骤：

将0.5-1MOI如权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒株JS/PEDV/2/2014G100接种于Vero细胞，吸附1-2h后，弃去细胞上清，加入含有1-3％FBS的DMEM培养液，培养60-72h，收集细胞培养液，获得所述猪流行性腹泻病毒弱毒株。

4.根据权利要求3所述猪流行性腹泻病毒弱毒株的培养方法，其特征在于，将收集的细胞培养液保存于-40℃以下，备用。

5.一种猪流行性腹泻弱毒候选疫苗，其包含权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒株。

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