CN105749267A - 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别方法 - Google Patents

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其制备方法。本疫苗生产毒种为构建的JXA1?RM株，不仅保持了JXA1?R株安全性和免疫原性，且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高；疫苗免疫猪后，不产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物；针对该毒株的鉴别诊断方法，可以诊断田间毒株和疫苗毒株产生的抗体，结合常规ELISA检测方法，能用于区分免疫该疫苗和自然感染田的动物，有利于高致病性猪蓝耳病的净化。

Description

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别 方法
技术领域
本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法，并可通过血清学鉴别诊断方法实现免疫与自然感染的区分，属于兽用生物制品领域。
背景技术
高致病性猪繁殖与呼吸综合征(俗称高致病性猪蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)变异株引起猪的一种急性、高度致死性接触性传染病。根据OIE制定的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2008版本规定，该病被列为法定上报的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，是威胁我国养猪业的重要传染病之一。
2006年高致病性猪蓝耳病暴发以来，研究人员通过不同方法研制出了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株JXA1-R、HuN4-F112株、TJM-F92株和GDr180株。这些毒株可以抵抗经典蓝耳病与高致病性蓝耳病强毒毒株攻击，在我国高致病性猪蓝耳病的防控中发挥了重要的作用，然而，近年来高致病性猪蓝耳病成散发趋势，依然导致巨大的经济损失，原有疫苗不能区分免疫和自然感染，目前仍在使用疫苗预防高致病性猪蓝耳病的国家或地区，想通过净化手段来达到控制消灭高致病性猪蓝耳病的目的，但是没有相应的方法能够区分免疫和自然感染，使得预防的效果一直不理想，现亟待开发一种能区分免疫和自然感染(DIVA，Discrimination of Infected from Vaccinated Animals)的疫苗。
申请人将临床分离毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1(保藏编号：CGMCCNo.1964)在MARC-145细胞系上进行人工连续培养，制备了对猪致病力显著下降的JXA-R株，并用该毒株研制了活疫苗(专利公开号：CN101307305)。本发明以高致病性猪繁殖与呼吸综合征JXA1-R株为基础，构建其全长感染性克隆，并突变JXA1-R毒株ORF6上的第159，160，164位的三个氨基酸，经拯救获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株JXA1-RM，该毒株不仅同时保持了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗株JXA1-R安全性好，免疫原性优良等特点，而且ORF6上三个氨基酸的突变使JXA1-RM毒株免疫动物后与野毒株产生抗体差异，因此可以作为DIVA疫苗用于高致病性猪蓝耳病的预防与控制。
发明内容
本发明的目的主要是通过构建了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株的全长克隆，并 通过反向遗传操作技术，突变该毒株ORF6上的第159位精氨酸(Arg)为赖氨基(Lys)，160位赖氨基酸(Lys)为精氨酸(Arg)，164位谷氨酰胺(Gln)为精氨酸(Arg)，成功拯救并繁殖了病毒，该病毒毒株命名为Porcine reproductive and respiratory syndromevirus JXA1-RM株。通过实验证实该标记疫苗毒株不仅对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染具有较好的免疫保护效果，而且不能诱导机体产生针对突变前该表位序列(SEQ IDNO.15)的特异性抗体，能通过针对该肽段(SEQ ID NO.15)的抗体来区分免疫与自然感染，从而在血清学上实现对标记疫苗的鉴别诊断。JXA1-RM毒株可作为能区分免疫和自然感染(DIVA)的疫苗毒株。本发明所建立的ELISA鉴别诊断方法，通过优化抗原包被条件和反应条件，能够通过血清学鉴别诊断免疫了JXA1-RM疫苗株的动物和自然感染动物。
本发明技术方案
本发明是通过以下技术方案来实现的：
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是Porcine reproductive and respiratory syndrome virus JXA1-RM株活病毒，该病毒毒株已于2015年12月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.10041。
2.如权利要求1所述一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于用此疫苗免疫猪体后，不产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列(SEQ IDNo.15)的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物。
3.如权利要求1所述一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于其中的猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-RM株是按以下方法构建获得的：
(1)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株(CGMCC No.2467)为模板，分6段扩增出全长；
(2)依次将片段连入pBluscript SK+载体中，构建成JXA1-R株的全长cDNA克隆；
(3)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株全长感染性克隆为载体pJXA1-R，利用引物引入突变序列，构建成高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株JXA1-RM的全长cDNA克隆；经拯救后获得一株病毒，命名为Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus JXA1-RM株，该病毒毒株保藏编号为：CGMCC No.10041；
(4)测定病毒的繁殖及遗传稳定性。
4.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的制备方法，其特征在于：该方法是以Porcine reproductive and respiratory syndrome virus JXA1-RM作为疫苗生产毒种，接入生长良好的MARC-145细胞，按常规细胞活疫苗的制造方法制成高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗。
5.如权利要求2所述的一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于其中所述疫苗免疫后能区分疫苗免疫和自然感染的方法是以美洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白线性表位肽序列(SEQ ID NO.15)为抗原，包被ELISA反应板，优化血清作用条件及二抗显色条件，建立的合成肽抗体的ELISA检测试剂盒。
具体实施方式
高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株是通过以下技术方案实现的：
一、高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株的构建
1.高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株JXA1-R株全长克隆的构建：
(1)RNA提取，反转录，PCR扩增：取猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R(该毒株于2008年4月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.2467)生产毒种，提取总RNA，反转录，根据发表于Genebank(登录号：FJ548853.1)的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列设计6对引物(SEQ ID No.1-12)，将其基因组分6段扩增，分别命名为A、B、C、D、E、F，全部克隆至pEASY-Blunt载体(全式金公司)，选取阳性克隆，提取质粒，分别命名为pA，pB，pC，pD，pE，pF。
上游引物AF：5’-CCCCCCTCGA GATTTAGGTG ACACTATAGG ATGACGTATA GGTGTTGGC-3’49(SEQ ID No.1)
下游引物AR：5’-GACAACCTCTTCCAACTTAGAGAG-3’24(SEQ ID No.2)；
上游引物BF：5’-CAACCTCACG TCAACTCATG CTGC-3’24(SEQ ID No.3)
下游引物BR：5’-CCAACAAGGA CATTGTGAAG GCAG-3’24(SEQ ID No.4)；
上游引物CF：5’-GCAGCCCTTA ACAGAAACAG ATGG-3’24(SEQ ID No.5)
下游引物CR：5’-CGGTAGATGC CCCTCAGCAC AGGC-3’24(SEQ ID No.6)；
上游引物DF：5’-GCGTTCAACT CGCCCATCGC CCTC-3’24(SEQ ID No.7)
下游引物DR：5’-GTTGGTTCA ATGACAGGGC CCGG-3’24(SEQ ID No.8)；
上游引物EF：5’-CTGGGGATTT GAATCGGATA CAGC-3’24(SEQ ID No.9)
下游引物ER：5’-GATAACCACG CGTTTGTCGT-3’20(SEQ ID No.10)；
上游引物EF：5’-TTGGCGTTTT CCATTACCTA CAC-3’23(SEQ ID No.11)
下游引物FR：5’-CCACCGCGGT GGCGGCCGCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTAATTACGG-3’57(SEQ ID No.12)。
1)用上游引物AF(SEQ ID No.1)和下游引物AR(SEQ ID No.2)扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R株基因组份A(1-2382)。
2)用上游引物BF(SEQ ID No.3)和下游引物BR(SEQ ID No.4)扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R株基因组份B(2272-6522)。
3)用上游引物CF(SEQ ID No.5)和下游引物CR(SEQ ID No.6)扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R株基因组份C(6400-8843)。
4)用上游引物DF(SEQ ID No.7)和下游引物DR(SEQ ID No.8)扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R株基因组份D(8764-11930)。
5)用上游引物EF(SEQ ID No.9)和下游引物ER(SEQ ID No.10)扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R株基因组份E(11851-14703)。
6)用上游引物FF(SEQ ID No.11)和下游引物FR(SEQ ID No.12)扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R株基因组份F(14680-15359)。
(2)猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株全长克隆的构建
将猪繁殖与呼吸综合征cDNA阳性质粒pA，pB，pC，pD，pE，pF中的A、B、C、D、E、F片段通过酶切位点Xho Ⅰ，Mfe Ⅰ，Afl Ⅱ，Cal Ⅰ，Asc Ⅰ，Mlu Ⅰ，Not Ⅰ依次连入多克隆位点改造好的pBluscript-SK载体，筛选获得阳性克隆pJXA1-R。JXA1-R全长克隆技术路线见图1。
2.标记基因的引入方法：
(1)标记基因穿梭质粒的构建：取猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R的疫苗生产毒种，提取总RNA，反转录，设计2对引物，使用上游引物EF(SEQ ID No.11)和下游引物MR(SEQID No.13)扩增，回收扩增产物；使用上游引物MF和下游引物FR(SEQ ID No.12)扩增，回收扩增产物；最后使用上游引物EF(SEQ ID No.11)和下游引物FR(SEQ ID No.12)以上述两次回收产物为模板扩增，回收扩增产物并克隆至pEASY-Blunt载体(全式金公司)，选取阳性克隆，提取质粒，命名为pM；
上游引物EF：5’-TTGGCGTTTT CCATTACCTA CAC-3’23(SEQ ID No.11)
下游引物MR：5’-GTTTACCACT CCTCTTTTAA CAGCGCGCTT GCCACCCAAC AC-3’42(SEQID No.13)；
上游引物MF：5’-GTGTTGGGTG GCAAGCGCGC TGTTAAAAGA GGAGTGGTAA AC-3’42(SEQID No.14)，
下游引物ER：5’-CCACCGCGGT GGCGGCCGCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTAATTACGG-3’57(SEQ ID No.12)；
上游引物EF：5’-TTGGCGTTTT CCATTACCTA CAC-3’23bp(SEQ ID No.11)，
下游引物FR：5’-CCACCGCGGT GGCGGCCGCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTAATTACGG-3’57bp(SEQ ID No.12)；
(2)标记基因的引入：将pM、pJXA1-R用MluⅠ，NotⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，连接转化，筛选获得基因突变的pJXA1-RM(如图2所示)。引入的标记基因，其核苷酸序列为SEQID No.16，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.17，处于PRRSV的ORF6上。JXA1-RM全长克隆毒株技术路线见图2。
SEQ ID No.16：
TTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAAGCGCGCTGTTAAGAGAGGAGTGGT 60
AAACCTTGTTAAATATGCCAAA 72
SEQ ID No.17：
Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Lys Arg Ala Val Lys Arg Gly Val
5 10 15 20
Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 24
(3)病毒拯救：将高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株pJXA1-RM质粒用限制性内切酶NotⅠ处理，通过体外转录试剂盒(Ambion公司)转录成RNA。通过电转染或脂质体转染将含标记的pJXA1-RM的RNA转录产物转染到猪繁殖与呼吸综合征病毒易感细胞MARC-145中，成功拯救出病毒，该病毒毒株已于2015年12月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.10041。
具体步骤如下：取处于对数期生长的MARC-145细胞，弃去培养基，加入0.25％胰酶消化液，待作用充分后，加入含8％胎牛血清的培养基终止消化，1000r/min，4℃离心5min；弃上清，加入PBS充分吹打细胞团块，1000r/min，4℃离心5min，重复3遍，加入PBS重悬细胞，使每毫升细胞浓度达到1×107cell/mL；取1mL细胞加入电转杯中，再加入20μL RNA混匀，以300V，88μF电击，室温放置5min左右；加入10mL含10％胎牛血清的培养基，加入75cm2细胞培养瓶培养至细胞病变后收毒。细胞病变结果见图3，A为拯救病毒JXA1-RM在MARC-145细胞上的病变结果，B为 JXA1-R在MARC-145细胞上的病变结果，C为MARC-145正常细胞对照。
(4)病毒的繁殖及遗传稳定性测定：将拯救病毒按1％(V/V)接种单层MARC-145细胞，37℃培养约72h，至细胞病变约80％左右，反复冻融3次收毒，连续传代至第45代，通过对第45代的病毒液进行RT-PCR扩增，产物送测序，发现标记基因未发生恢复性突变。
二、高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗的制备
1.毒种的繁殖：
制苗用毒株为猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株JXA1-RM，(保藏编号为CGMCCNo.10041)
细胞：MARC-145细胞株，由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存，传代批次为第11代、15代、20代。
将生长良好的MARC-145细胞用消化液消化，接种于细胞瓶内，同时按1％接种量接种病毒，37℃培养，每日观察细胞病变(CPE)，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约72h)，冻融3次，分装。
2.细胞种子繁殖
从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10mL无血清培养基的离心管中，1000r/min离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO2培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1:3传代增殖培养。
3.制备病毒液
细胞单层培养：将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时。
接种：取所需的数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养。
收获：在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，直到CPE达到80％～90％时收获细胞培养物，反复冻融3次，经3000r/min离心20min，收获的病毒液冻存于-20℃以下。测定TCID50为1×107TCID50/mL，
4.冻干
将收获病毒液按体积比加入10％灭菌脱脂乳，混匀后经冷冻干燥而成。
三.疫苗检验
1无菌检验按现行《中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典三部2010年版》中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录方法进行检验，均无细菌、霉菌生长。
2支原体检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无支原体生长。
3剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，均符合规定。
4真空度测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，均符合规定。
5.安全性检验：用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗2mL，连续观察21天，免疫猪只体温升高不超过1℃，稽留时间不超过24h，符合现行《中华人民共和国兽药典》的安全检验规定，接种疫苗毒株JXA1-RM 21天后，5头实验3～4周龄猪均无不良反应，剖检未见病理性变化。
6.效力检验：免疫后28天，用PRRSV变异株NVDC-JXA1(含量为105 . 5TCID50/mL的病毒液)，1:10稀释后每头猪经肌肉接种3mL，继续饲养观察21天，扑杀剖检。对照组应有4头以上的猪发病；免疫组应有4头以上的猪不发病。
四、鉴别诊断方法
1.标准阳性血清的制备
将制备获得的合成肽抗原分三次免疫试验猪(商品猪)1头，试验猪的PRRS抗原和抗体检测均为阴性。免疫方法及剂量如下：第一次免疫，弗氏完全佐剂和纯化蛋白按1∶1混合并充分乳化，500μg的合成肽，皮下多点免疫。二周后进行二免，弗氏不完全佐剂和合成肽按1:1混合并充分乳化，500μg的合成肽，皮下多点免疫。相同剂量和方法，在两周后进行三免。第三次免疫一周后，对试验猪采用颈前腔静脉采血，分离血清待用，该血清即为合成肽标准阳性血清。
2.抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
(1)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释10倍梯度，将合成肽抗原(10μg/mL至0.125μg/mL)包被在96孔板，每孔50μL；
(2)包被条件为4℃包被过夜，封闭是采用5％脱脂乳，在37℃条件下，封闭2h。
(3)合成肽标准阳性血清、阴性血清分别采用1:20、1:40、1:80、1:160梯度稀释，每孔100μL稀释液，37℃条件下孵育1h进行ELISA方阵试验。
(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG抗体1:20000倍稀释，每孔100μL，37℃孵育1h。
(5)加入50μL TMD显色底物，室温避光显色10min。
(6)50μL 1M HCL终止反应。测定各孔OD450nm值，确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。
结果：
抗原的初始浓度为1mg/mL，通过棋盘法确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。
由表1可知，抗原和抗体稀释倍数的增加，阳性血清的OD值存在下降趋势，阴性血清的OD值 变化不显著。选择阴性血清的OD450nm值≤0.100，阳性血清的OD450nm值≥0.200，阳性血清和阴性血清OD450nm比值P/N≥2的最大稀释度，即血清的稀释度为1:40，抗原的稀释浓度为1:200，每孔包被量为0.5mg抗原为最佳包被量。
表1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度结果
4.抗原最佳包被条件的确定
用选定的抗原包被浓度50μL包被，于37℃分别作用1h，2h，4h，以及4℃作用过夜，确定最佳的抗原包被时间。结果发现2h包被阳性和阴性OD450nm的P/N值最高(见图4)，选择最佳抗原包被条件为37℃作用2h。
5.血清最佳反应时间的确定
用选定的血清稀释液，将已知阴、阳性血清做1∶40稀释，于37℃下分别作用30min、60min、90min、120min，进行ELISA检测，确定血清最佳反应时间。结果发现阳性和阴性的OD450nm值60min时P/N值最高(见图5)，选择最短反应时间60min为最佳时间。
6.酶标二抗的稀释度确定
将HRP标记的兔抗猪抗体分别按照1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000稀释，37℃下反应1h，洗涤后，加入新配的底物溶液50μL/孔，室温显色10min，用酶联仪测定OD450nm值，比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，以确定酶标二抗的稀释度。结果：其他条件不变，酶标二抗在不同稀释度下，测定OD450nm值有显著差异，阳性血清OD450nm值范围为1.431到0.432，阴性血清OD450nm值范围为0.39到0.043，选择阴性血清OD450nm值小于0.100，且P/N值较大者，即 1∶10000为二抗最佳稀释度(见图6)。
7.酶标二抗的作用时间
将HRP标记的兔抗猪抗体稀释到工作浓度，100μL/孔，分别于室温下作用30min、45min、60min、90min，比较阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，以确定酶标二抗的工作时间。结果：其他条件不变，仅改变酶标二抗的作用时间，测定OD450nm值，作用时间为45min时，其P/N最高，选择45min为作用时间(见图7)。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明所涉及的原始毒株NVDC-JXA1，是一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株，该株于2007年3月9日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.1964。
本发明所使用的原始毒株JXA1-R，是一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，该毒株于2008年4月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.2467。
本发明构建并拯救的高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株命名为Porcinereproductive and respiratory syndrome virus JXA1-RM，该株于2015年12月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.10041。
附图说明
图1高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗JXA1-R株全长克隆构建示意图；
图2高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus JXA1-RM株全长感染性克隆示意图；
图3高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株的细胞病变；
图4是本发明确定抗原最佳包被时间结果图；
图5是本发明确定血清作用时间的结果图；
图6是本发明确定酶标二抗稀释度的结果图；
图7是本发明确定的酶标二抗作用时间结果图；
图8是本发明实施例3免疫猪的抗体消长结果图。
本发明的有益效果：
本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其制备方法。本发明疫苗的生产毒种为构建的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus JXA1-RM株，不仅保持了JXA1-R株安全性好，免疫原性优良等特点，而且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高；疫苗免疫猪体后，不能产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列为：Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys Ala Val Lys Gln Gly Val Val AsnLeu Val Lys Tyr Ala Lys(SEQ ID No.15)的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物，在高致病性猪蓝耳病净化过程中或暴发疫情时免疫，根据感染抗体和免疫抗体的不同区分出感染动物；针对该毒株的鉴别诊断方法，可以诊断田间毒株和疫苗毒株产生的抗体，结合常规ELISA检测方法，能用于区分免疫该疫苗和感染田间毒株的动物，进而有利于高致病性猪蓝耳病的净化。
实施例
以下实施例是对本发明进一步阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
——高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗的制备
(1)毒种的繁殖：
制苗用毒株为Porcine reproductive and respiratory syndrome virus JXA1-RM株，(保藏编号为CGMCC No.10041)
细胞：MARC-145细胞株，由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存，传代批次为第11代、第15代、第20代。
取生长良好的MARC-145细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，同时按1％接种量接种病毒，37℃培养，每日观察细胞病变(CPE)，当70％以上细胞出现CPE时收毒(大约72h)，冻融3次，分装。
(2)细胞种子繁殖
从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10mL无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用10％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，37℃、5％CO2培养，当覆盖率达到100％时用胰酶消化细胞，按1:3传代增殖培养。
(3)制备病毒液
细胞单层培养：将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速8-9转/小时。
接种：取所需的数量的、细胞覆盖率达到80％以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，按1％(V/V)接种病毒，加入含2％胎牛血清的细胞培养液，在37℃下旋转培养。
收获：在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，直到CPE达到80-90％时收获细胞培养物，反复冻融3次，经3000rpm离心20min，收获的病毒液冻存于-20℃以下。测定TCID50为1×107TCID50/mL，将收获病毒液2mL加10％脱脂乳冻干。
实施例2
——疫苗的安全性与保护性检验
(1)安全性检验：用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗2mL，连续观察21日，免疫猪只体温升高不超过1℃，稽留时间不超过24h，符合现行《中华人民共和国兽药典》的安全检验规定。
(2)安全性检验结果
接种疫苗毒株JXA1-RM 21天后，5头实验3～4周龄猪均无不良反应，剖检未见病理性变化，见表2
表2安全性检验结果
动物编号 不良反应 剖检变化
S1 无不良反应 未见病变，疫苗吸收完全
S2 无不良反应 未见病变，疫苗吸收完全
S3 无不良反应 未见病变，疫苗吸收完全
S4 无不良反应 未见病变，疫苗吸收完全
S5 无不良反应 未见病变，疫苗吸收完全
(3)效力检验：免疫后28天，用PRRSV变异株NVDC-JXA1(含量为105 . 5TCID50/mL的病毒液)，1:10稀释后每头猪经肌肉接种3mL，继续饲养观察21天，扑杀剖检。对照组应有4头以上的猪发病；免疫组应有4头以上的猪不发病。
(4)效力检验实验结果：疫苗接种组5头猪仔在第28天检测，中和抗体效价均达到16以上，攻毒后21天未见发病。
攻毒对照组5头猪只在接种病毒后3～5天发病，3头猪死亡。经RT-PCR检测PRRSV变异株均为阳性。结果见表3
表3效力检验结果
实施例3
——ELISA鉴别诊断试剂盒的制备
(1)ELISA反应板的包被
用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将人工合成的氨基酸序列合成肽(SEQID NO.15)包被ELISA反应板，稀释至浓度1μg/mL，加入到酶标板中，每孔50μL，4℃包被16h过夜；用PBS-Tween缓冲液洗涤ELISA反应板3次，每孔加入5％脱脂牛奶37℃封闭1h；用PBS-Tween缓冲液洗涤1次，风干后真空干燥保存。
(2)洗涤液的配制
称取Na2HPO4·H2O 2.5g，NaH2PO4·H2O 35g，NaCl8.5g，Tween-20 5mL，加去离子水至800mL，调pH值至7.2～7.6，定容至1000mL。分装备用。
(3)样品稀释液的配制
称取Na2HPO4·H2O 2.5g。，NaH2PO4·H2O 3.5g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，蔗糖:5g，加去离子水至800mL，调pH值7.2～7.6，定容至1000mL。加入proclin300溶液使其终浓度为0.05％，过滤除菌后，无菌分装。
(4)HRP标记兔抗猪IgG的配制
将购自Sigma-aldrich公司的HRP标记兔抗猪IgG(Sigma)，用稀释液作1:100稀释，加入proclin300溶液使其终浓度为0.05％，无菌分装。
(5)底物显色液的来源用于本试剂盒的底物溶液购自美国KPL公司，分为底物溶液A(TMB Peroxidase Substrate)和底物溶液B(Peroxidase Substrate B)。
(6)终止液的配制配制1M HCL，定量分装。
实施例4
——高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗的免疫检测
选取经中和试验方法检测的无猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体的健康易感断奶猪10头，分为2组，其中1组每头肌肉注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株液1mL(5.0TCID50/mL)，另外一组接种同样剂量的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1(美洲株)，每7天采血分离血清，分别用IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒和实例3制备的鉴别诊断试剂盒进行检测。
检测结果表明，在接种7天后两组动物均诱导产生PRRSV抗体(IDEXX试剂盒检测)，28天时抗体达到较高水平。且通过实例3制备的合成肽诊断试剂盒检测接种JXA1-RM毒株为阴性，接种NVDC-JXA1毒株的血清抗体为阳性(见图8)。

Claims (5)

1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(猪繁殖与呼吸综合征病毒)JXA1-RM株活病毒，该病毒毒株已于2015年12月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.10041。
2.如权利要求1所述一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗，其特征在于用此疫苗免疫猪体后，不产生针对美洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列(SEQ ID No.15)的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物。
3.如权利要求1所述一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗，其特征在于其中的猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-RM株是按以下方法构建获得的：
(1)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株为模板，分6段扩增出全长；
(2)依次将片段连入pBluscript SK+载体中，构建成JXA1-R株的全长cDNA克隆；
(3)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株全长感染性克隆为载体pJXA1-R，利用引物引入突变序列，构建成高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-RM株的全长cDNA克隆；经拯救后获得一株病毒，命名为Porcine reproductive and respiratory syndromevirus JXA1-RM株，该病毒毒株保藏编号为：CGMCC No.10041；
(4)病毒的繁殖及遗传稳定性测定。
4.权利要求1所述的一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗的制备方法，其特征在于：该方法是以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-RM株作为疫苗生产毒种，接入生长良好的MARC-145细胞，按常规细胞活疫苗的制造方法制成高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗。
5.如权利要求1、2所述的一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗，其特征在于其中所述疫苗免疫后能区分疫苗免疫和自然感染的方法是以美洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白线性表位肽序列(SEQ ID NO.15)为抗原，包被ELISA反应板，优化血清作用条件及二抗显色条件，建立的合成肽抗体的ELISA检测试剂盒的检测方法。
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