CN104099269B - 猪肺炎支原体强毒株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供猪肺炎支原体强毒株及其应用，涉及微生物技术领域。本发明猪肺炎支原体强毒株，分类命名为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株，保藏号为CCTCC NO:V201317。本发明还提供所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用。本发明猪肺炎支原体强毒株，具有较高毒力，对猪的肺部具有很强的黏附力。本发明猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用，只需要采用该强毒株的纯培养物就可以进行攻毒，攻毒后的猪肺脏病变典型。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及猪肺炎支原体强毒株及其应用。
背景技术
猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine,MPS) ,又称猪气喘病或猪地方性肺炎(Enzootic pneumonia of swine, EPS) ,是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae, Mhp)引起的一种猪慢性呼吸道传染病。该病主要以气喘为临床特征，在世界范围内广泛流行,我国地方猪种和杂交猪种尤为易感,几乎普遍存在,给养猪业造成了重大损失。由于猪肺炎支原体对营养要求苛刻，使得其体外分离培养的难度很大，从而阻碍了后续病原学、血清学、免疫学、致病机制等研究的顺利推进。
Mhp的分离工作程序复杂，进展缓慢。猪肺炎支原体营养要求高且生长缓慢,分离方法有待改进，因此很难获得大量的菌株。Goodwin采用正常肺血浆块组织培养法和煮沸组织培养后再接种于无细胞培养基的方法分离到Mhp；Pijoan将病猪肺组织的病变部分浸于培养液中过夜后制成悬浮液分离到Mhp；至今国内外分离Mhp大多采用病肺块浸泡法。目前国内外报道的Mhp强毒菌株较少，猪肺炎支原体疫苗效力检验中毒株纯培养物攻毒后猪发病困难，病变程度不高。因此，在猪肺炎支原体疫苗效力检验中，仍以组织毒为攻毒材料，但组织毒成分复杂，不仅含有动物组织，还掺杂其他病原或不明物，会影响疫苗效力检验的准确性和合理性。
发明内容
本发明的目的是提供一株猪肺炎支原体强毒株，具有较高毒力，对猪的肺部具有很强的黏附力。
本发明的另一目的是提供所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用，只需要采用该强毒株的纯培养物就可以进行攻毒，攻毒后的猪肺脏病变典型。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
猪肺炎支原体强毒株，分类命名为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株，保藏号为CCTCC NO: V201317。
在本发明中，所述毒株的P97基因如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用。
在所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用中，采用所述猪肺炎支原体强毒株培养物进行攻毒。
在本发明中，所述猪肺炎支原体强毒株培养物的浓度为108-109CCU/mL。
在本发明中，所述猪肺炎支原体强毒株培养物制备过程中采用的培养基如下：PPLO肉汤4-6g/L，脑心浸液1-3g/L，乳蛋白水解物1-3g/L，示蛋白胨2-4g/L，10×Hank,s液4-6ml/L,酵母抽出液9-11ml/L，健康猪血清180-220ml/L，青霉素100-200万IU/L，质量百分浓度为0.4%的酚红水溶液1-3ml，pH值至7-7.5。
在本发明中，猪肺炎支原体强毒株培养物的培养条件为：在36-38℃培养3-5日。
本发明猪肺炎支原体AV747株分离自猪支原体肺炎特征典型的病料。由于Mhp引起猪支原体肺炎的先决条件是感染时能识别呼吸道黏膜纤毛细胞的特异性受体与其结合，因此本发明尝试用肺泡灌洗液的分离方法分离猪肺炎支原体，利用冲刷原理将Mhp从支气管纤毛上冲洗下来，灌洗液过滤后直接接种于培养基中。相对于传统的分离方法，该方法操作简便，且避免杂菌污染。通过在NA培养基上培养获得了一株猪肺炎支原体毒株，对该毒株进行了一系列鉴定，经生长特性，血清学和分子生物学鉴定结果表明：该毒株为猪肺炎支原体，并将其定名为猪肺炎支原体AV747株。
P97蛋白是猪肺炎支原体的主要黏附因子之一。研究人员用单克隆抗体（MAb）F2G5做免疫印迹和亲和吸附试验，发现P97蛋白在猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附中起重要作用，该单抗的F（ab'）2片段能够阻止Mhp对猪气管纤毛的黏附。对P97基因进行结构解析，发现P97蛋白的主要黏附区域在C端，包括R1区和R2区两个重复序列。R1区由连续的5个氨基酸（AAKPV/E）重复单元构成，R2区由连续的10个氨基酸（GTPNQGKKAE）重复单元构成。研究发现Mhp不同菌株间的P97蛋白的重复单元重复次数差异较大，这可用于不同菌株的区分。同时，已有试验证明，重复单元越多黏附能力越强。本发明毒株AV747株的P97蛋白的R1重复序列为17个，显著高于现有猪肺炎支原体菌株，提示该毒株对猪肺部有较好的黏附性，有较高毒力。
通过攻毒试验，发现用猪肺炎支原体AV747株组织毒进行攻毒，猪的临床症状有典型的咳嗽，剖检后猪肺脏病变典型；而猪肺炎支原体AV747株培养物进行攻毒，剖检后猪肺脏病变依然明显，说明猪肺炎支原体AV747株纯培养物就可以作为猪肺炎支原体疫苗效力检验中攻毒材料，不需要采用含有动物组织、掺杂其他病原或不明物的组织毒进行攻毒，将有利于疫苗效力检验的准确性和合理性。
附图说明
图1 P97基因的同源性分析。
图2 不同猪肺炎支原体毒株攻毒后，猪支原体肺炎肺部病变指数。
具体实施方案
PPLO肉汤、脑心浸液、乳蛋白水解物、示蛋白胨均购自美国BD公司。
10×Hank,s液的成分及含量为：含有CaCl2(w/v)0.14%、KCl(w/v)0.4%、KH2PO4(w/v)0.06%、MgCl2·6H2O(w/v)0.1%、MgSO4·7H2O(w/v)0.1%、NaCl(w/v)8%、Na2HPO4·7H2O (w/v)0.09%、葡萄糖(w/v)1%，溶剂为水。
Hank’s液是将10×Hank,s液稀释10倍后得到。
NA液体培养基：取PPLO肉汤5g、脑心浸液2g、乳蛋白水解物2g、示蛋白胨3g、10×Hank,s液 5ml、新鲜酵母抽出液10ml、健康猪血清200ml、青霉素水溶液(20万IU/ml) 5 ml和质量百分浓度为0.4%的酚红水溶液2ml混合，用1N NaOH溶液调节pH值至7.3，用水定容至1000ml。其中，酵母抽出液制备方法：150g酵母膏溶解于1000ml去离子水中,121℃高压蒸汽灭菌10 min，静置过夜，9000rpm离心50 min，吸取上清121℃高压10 min，得到酵母抽出液，分装保存2-8℃。酵母抽出液和健康猪血清要求新鲜。NA培养基以Φ 0.1μm的滤膜过滤除菌，4℃冷藏备用。
NA固体培养基：在NA液体培养基中添加终浓度为1%（质量百分浓度）的琼脂。
猪肺炎支原体232株（为标准强毒株）购自美国模式培养物集存库（ATCC）。
猪肺炎支原体抗血清的制备：用NA液体培养基培养猪肺炎支原体168株（Mhp 168株，强毒，江苏省农科院家畜重大疫病防控研究室）获得培养物，肌肉注射接种健康兔，每头2ml，以后每两个星期加强免疫至效价（采用IDEXX检测试剂盒检测效价）达阳性，采血分离获得的血清即为猪肺炎支原体抗血清。
实施例1：猪肺炎支原体AV747株的获得及培养鉴定
1.菌株分离及克隆纯化
从安徽某猪场有疑似气喘病特征的猪中进行筛选，选取猪支原体肺炎特征典型的病猪，无菌采集其肺脏。在该肺脏的病变组织和健康组织交界处，剪取适当的组织暴露支气管，用无菌注射器抽取5mL NA液体培养基直接打入支气管，并从支气管中倒吸NA液体培养基，获得支气管灌洗液。灌洗液可直接用孔径为0.45μm的滤器进行过滤后，收集滤液接种于NA液体培养基，37℃培养。5天后培养物颜色由橘红色变成黄色，培养物pH下降至6.7-6.9，盲传5代，生长稳定。传代至第8代时，接种至NA固体培养基上进行克隆纯化3次，克隆第3次收获的培养物即为第1代菌种，命名为AV747株。
2. AV747株的特性
（1）形态和生化特性
AV747株为环状、球状、丝状、和点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。
生化特性：（1）需要胆固醇试验：AV747株仅在有血清的培养物中生长，在无血清培养基中不生长，表明AV747株生长需要胆固醇。（2）发酵葡萄糖和水解精氨酸试验：AV747株在含0.5%葡萄糖的培养基中培养，颜色由红色变成黄色，表明其发酵葡萄糖培养基产酸；在含0.2%精氨酸的培养基中培养，培养基未变色，表明其不能水解精氨酸产碱。生化特性说明AV747株符合细菌分类学中支原体的特征。
（2）培养特性
AV747株在NA液体培养基上生长良好，37℃培养3-5天，培养物pH下降至6.6-6.8，呈现轻度浑浊。培养物中活菌浓度可以达到108～109CCU/mL（CCU为颜色变化单位）。 AV747株接种至NA固体培养基，37℃培养7～10日后，可见粗糙不规则菌落（初次分离的菌株在固体培养基上尚未完全适应，未呈现油煎蛋菌落）。
2.鉴定
（1）血清学鉴定
代谢抑制试验鉴定：AV747株在加有猪肺炎支原体抗血清的NA液体培养基中，经37℃恒温培养15日，pH值不下降，培养基颜色未改变，呈现特异的葡萄糖代谢抑制。
生长抑制试验鉴定：将AV747株接种至加有猪肺炎支原体抗血清的NA固体培养基，经37℃恒温培养10-15日，固体培养基表面无菌落出现，呈现特异的猪肺炎支原体生长抑制。
代谢抑制试验和生长抑制试验结果说明AV747株为猪肺炎支原体。
（2）分子生物学鉴定（P97基因序列的测定）
根据GenBank登载的猪肺炎支原体232株P97基因设计一对引物，上游引物序列（SEQ ID NO:2）为：5‘-AAAAATTAGATATCTAAATTAT-3’，下游引物序列（SEQ ID NO:3）为： 5‘-CCTCCGGGTTTTATTTAGATTC-3’。采用上述引物对，以AV747株的总DNA为模板，PCR扩增该菌株的P97基因并进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示。
AV747株与猪肺炎支原体168株（Mhp 168，GenBank登录号: CP002274.1）P97基因的同源性为92.2%，与国际菌株Mhp 232株、J株、7448株的同源性为91.3-97.9%，（图1），说明AV747株是猪肺炎支原体。
分析AV747株和已经公开的猪肺炎支原体毒株的P97蛋白（表1），发现AV747株P97蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO:4）中R1(AAKPV/E)重复序列个数为17，显著多于现有猪肺炎支原体猪肺炎支原体P97基因，由于多项研究表明重复单元越多，黏附能力越强，所以提示AV747株对猪肺部有较好的黏附性，毒力强。
表1、各毒株P97蛋白的R1(AAKPV/E)重复序列比较
| 毒株 | P97蛋白的R1(AAKPV/E)重复序列个数 |
| Mhp AV747 | 17 |
| Mhp J | 9 |
| Mhp 232 | 15 |
| Mhp 7448 | 10 |
| Mhp 168 | 11 |
将AV747株命名为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息如下：
分类命名：猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株；
地址：中国.武汉.武汉大学；
保藏日期：2013年6月5日；
保藏编号为CCTCC NO: V201317。
实施例2组织毒制备及攻毒
1.组织毒制备
采用NA液体培养基分别培养猪肺炎支原体AV747株和232株，得到培养物。将各毒株培养物调整浓度至108CCU/ml，以备攻毒用。
将健康试验猪随机分为3组，每组3头，随机选取一组用AV747株培养物（108CCU/ml）进行攻毒，另选一组用232株培养物（108CCU/ml）进行攻毒，攻毒方式均为肺内注射，攻毒剂量为每头猪气管内注射5ml。最后一组气管内注射5ml NA培养基作健康对照。
从攻毒的试验猪中采集肺部有明显气喘病特征的肺脏组织样品，对通过呼吸道感染的病毒进行检测（如猪瘟、蓝耳、圆环病毒Ⅱ型、伪狂犬）。试验猪肺脏组织样品的猪瘟、蓝耳、圆环病毒Ⅱ型、伪狂犬均为阴性，猪肺炎支原体PCR（方法同实施例1中分子生物学鉴定）阳性者可以用于制备猪肺炎支原体疫苗效力检验中用于攻毒的组织强毒。
将符合组织强毒制备要求的肺脏组织用3%双氧水冲淋肺脏的表面，按质量比为1:4将肺脏组织与Hank’s液混合，用灭菌剪刀将肺脏组织剪碎成小块，放入消毒好的匀浆机中匀浆，过滤收集滤液，测量滤液的体积。将滤液与冻干保护剂（含有1.5%（w/v）明胶和12.5%（w/v）蔗糖的水溶液）按体积比1.5:1进行充分混匀，加入终浓度均为1000单位/ml的青霉素及链霉素，充分混匀，获得AV747株和232株的攻毒用组织强毒。将攻毒用组织强毒按照每瓶2ml的体积无菌加入到灭菌的7ml西林瓶中，冷冻干燥，获得各毒株组织强毒冻干粉，检验冻干物理性状合格，做好标记，-20℃保存备用。
2.组织毒攻毒
将健康试验猪随机分为3组，每组3头，其中一组采用本实施例标题1制备的AV747株攻毒用组织强毒进行攻毒；另选一组采用本实施例标题1制备的232株攻毒用组织强毒进行攻毒；攻毒方式为采用肺内注射的方式；余下的一组气管内注射5ml NA培养基作健康对照。具体攻毒方法如下：将各毒株攻毒用组织强毒冻干粉用生理盐水按照稀释度为1：100进行稀释，得到攻毒液。每头待攻毒试验猪取攻毒液5ml直接注入猪气管中。固定猪头部2～5min以免注射物咳嗽出来。
攻毒28日后，剖检所有试验猪，观察肺病变，按猪支原体肺炎肺病变指数记分标准判定。猪支原体肺炎肺病变指数记分标准为：试验猪剖检后，分别观察肺组织左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶和副叶的背面和腹面发生胰样肉变的实变的平均肺面积占该肺叶面积的百分比；将面积比在1%到25%之间的记为1分，在26%到50%之间的记为2分，在51%到75%之间的记为3分，在76%到100%之间的记为4分；各肺叶评定的记分相加即为该猪的肺病变指数记分，最高为28分。结果如表2，AV747株组织强毒接种猪肺部出现典型的猪支原体肺炎病变，且肺病变指数明显高于其他组，与对照组相比差异极显著（P<0.01），说明AV747株组织毒具有较强的毒力，且致病性强。
表2 不同毒株组织毒攻毒后，猪支原体肺炎肺部病变指数
| 不同组织毒 | 稀释倍数 | 攻毒剂量 | 猪支原体肺炎肺病变指数 |
| AV747株组织毒 | 100 | 5ml/头 | 22.00±2.65﹡﹡ |
| 232株组织毒 | 100 | 5ml/头 | 14.00±3.00﹡﹡ |
| 健康对照组 | —— | 5ml/头 | 2.00±1.00 |
注：表2中“﹡﹡”表示差异极其显著，P<0.01。
实施例3 猪肺炎支原体AV747株培养物攻毒试验及毒株再分离
采用NA液体培养基分别培养猪肺炎支原体AV747株和232株，得到培养物。将各毒株培养物调整浓度至108CCU/ml，以备攻毒用。
1. 攻毒试验
将健康试验猪随机分为3组，每组3头，随机选一组（AV747株攻毒组）用AV747株培养物（108CCU/ml）进行攻毒，另选一组（232株攻毒组）用232株培养物（108CCU/ml）进行攻毒，攻毒方式均为肺内注射的方式，攻毒剂量均为每头猪气管内注射5ml。最后一组（健康对照组）气管内注射5ml NA培养基作。
攻毒28日后，剖检所有试验猪，观察肺病变，按猪支原体肺炎肺病变指数记分标准判定。猪支原体肺炎肺病变指数记分标准为：试验猪剖检后，分别观察肺组织左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶和副叶的背面和腹面发生胰样肉变的实变的平均肺面积占该肺叶面积的百分比；将面积比在1%到25%之间的记为1分，在26%到50%之间的记为2分，在51%到75%之间的记为3分，在76%到100%之间的记为4分；各肺叶评定的记分相加即为该猪的肺病变指数记分，最高为28分。结果如表3和图2，AV747株培养物接种猪肺部出现典型的猪支原体肺炎病变，且肺病变指数与对照组相比差异显著（P<0.05），其发病程度显著高于232株培养物攻毒，同时也高于232株组织毒攻毒（实施例2表2），说明AV747株具有较强的毒力、且毒力高于232株，AV747株培养物可以在猪肺炎支原体疫苗效力检验中用于攻毒。
另外，统计各组试验猪攻毒后病变肺数量，结果如表4所示。从表4可以看出，本发明AV747株攻毒后，3头猪中有3个肺均发生病变，肺病变个数显著高于232株攻毒组和健康对照组，说明AV747株具有较强的毒力、且毒力高于232株，AV747株培养物可以在猪肺炎支原体疫苗效力检验中用于攻毒。
表3 不同毒株培养物攻毒后猪支原体肺炎肺部病变指数
| 攻毒毒株 | 攻毒剂量 | 猪支原体肺炎肺病变指数 |
| AV747株 | 5×108CCU | 16.33±2.08﹡﹡ |
| 232株 | 5×108CCU | 10.67±2.52﹡﹡ |
| 健康对照组 | —— | 1.33±1.53 |
注：表3中“﹡﹡”表示差异极其显著，P<0.01。
2.攻毒猪病变肺中猪肺炎支原体的再分离
用研磨法从攻毒猪病变肺中进行猪肺炎支原体的再分离和鉴定。经过NA培养基盲传培养，观察培养物颜色变化、涂片镜检及PCR鉴定，考察各毒株是否能够再次分离。结果如表4所示，AV747株攻毒的3头猪病变肺均再次分离到猪肺炎支原体AV747株，而232株攻毒的3头猪中仅1头分离到猪肺炎支原体。试验结果表明，猪肺炎支原体AV747株的毒力强、致病性高，因而肺部病变明显，再次分离率也较高。
表4 攻毒后猪肺炎支原体再分离结果
| 不同菌株攻毒组 | 病变肺个数 | PCR鉴定为阳性的肺个数 | 猪肺炎支原体分离率（分离率为再次分离获得该毒株的概率） |
| AV747株 | 3 | 3 | 2/3 |
| 232株 | 2 | 2 | 1/3 |
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 猪肺炎支原体强毒株及其应用
<130> 20140623
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 3375
<212> DNA
<213> 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株
<400> 1
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caacaaagcc caactaccga attaactaat taccttcctg acttaggtaa aaaaattgac 3180
gaaatcatta aaaaacaggg taaaaattga aaaacagagg ttgaactaat cgaggataat 3240
atcgctggag atgctaaatt gctatacttt atcctaaggg atgattcaaa atccggtgat 3300
cctaaaaaat caagtctaaa agttaaaata acagtaaaac aaagtaataa taatcaggaa 3360
ccagaatcta aataa 3375
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 上游引物
<400> 2
aaaaattaga tatctaaatt at 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 下游引物
<400> 3
cctccgggtt ttatttagat tc 22
<210> 4
<211> 1124
<212> PRT
<213> 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株
<400> 4
Met Ser Lys Lys Ser Lys Thr Phe Lys Ile Gly Leu Thr Ala Gly Ile
1 5 10 15
Val Gly Leu Gly Val Phe Gly Leu Thr Val Gly Leu Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Pro Arg Lys Ile Ala Asn Asp Phe Ala Ala
35 40 45
Lys Val Ser Thr Leu Ala Phe Ser Pro Tyr Ala Phe Glu Thr Asp Ser
50 55 60
Asp Tyr Lys Ile Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser Asn Asn Asn Ile
65 70 75 80
Arg Asn Lys Glu Lys Val Ile Asp Ser Phe Ser Phe Phe Thr Lys Asn
85 90 95
Gly Asp Gln Leu Glu Lys Ile Asn Phe Gln Asp Pro Glu Tyr Thr Lys
100 105 110
Ala Lys Ile Thr Phe Glu Ile Leu Glu Ile Ile Pro Asp Asp Val Asn
115 120 125
Gln Asn Phe Lys Val Lys Phe Gln Ala Leu Gln Lys Leu His Asn Gly
130 135 140
Asp Ile Ala Lys Ser Asp Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Gln Ser Asn Leu Leu Val Ala Glu Phe Asn Phe Ser Leu Lys Lys Ile
165 170 175
Thr Glu Lys Leu Asn Gln Gln Ile Glu Asn Leu Ser Thr Lys Ile Thr
180 185 190
Asn Phe Ala Asp Glu Lys Thr Ser Ser Gln Lys Asp Pro Ser Thr Leu
195 200 205
Arg Ala Ile Asp Phe Gln Tyr Asp Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Asp Ile Lys Leu Ala Asn Tyr Phe Pro Val Leu Lys Asn Leu
225 230 235 240
Ile Asn Arg Leu Asn Asn Ala Pro Glu Asn Lys Leu Pro Asn Asn Leu
245 250 255
Gly Asn Ile Phe Glu Phe Ser Phe Ala Lys Asp Ser Ser Thr Asn Gln
260 265 270
Tyr Val Ser Ile Gln Asn Gln Ile Pro Ser Leu Phe Leu Lys Ala Asp
275 280 285
Leu Ser Gln Ser Ala Arg Glu Ile Leu Ala Ser Pro Asp Glu Val Gln
290 295 300
Pro Val Ile Asn Ile Leu Arg Leu Met Lys Lys Asp Asn Ser Ser Tyr
305 310 315 320
Phe Leu Asn Phe Glu Asp Phe Val Asn Asn Leu Thr Leu Lys Asn Met
325 330 335
Gln Lys Glu Asp Leu Asn Ala Lys Gly Gln Asn Leu Ser Ala Tyr Glu
340 345 350
Phe Leu Ala Asp Ile Lys Ser Gly Phe Phe Pro Gly Asp Lys Arg Ser
355 360 365
Ser His Thr Lys Ser Glu Ile Ser Asn Leu Leu Asn Lys Lys Glu Asn
370 375 380
Ile Tyr Asp Phe Gly Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Asn Asp Arg Leu Asn
385 390 395 400
Ser Pro Asn Leu Glu Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Ser Ala Ser Leu Asp
405 410 415
Lys Lys Asp Lys Ser Ile Ile Leu Ile Pro Tyr Arg Leu Glu Ile Lys
420 425 430
Asp Lys Phe Phe Ala Asp Asp Leu Tyr Pro Asp Thr Lys Asp Asn Ile
435 440 445
Leu Val Lys Glu Gly Ile Leu Lys Leu Thr Gly Phe Lys Lys Gly Pro
450 455 460
Lys Ile Asp Leu Pro Asn Ile Asn Gln Gln Ile Phe Lys Thr Glu Tyr
465 470 475 480
Leu Pro Phe Phe Glu Lys Gly Lys Glu Glu Gln Ala Lys Leu Asp Tyr
485 490 495
Gly Asn Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln Leu Ala Lys Val Glu Val
500 505 510
Glu Ala Leu Phe Lys Gly Asn Lys Asn Gln Glu Ile Tyr Gln Ala Leu
515 520 525
Asp Gly Asn Tyr Ala Tyr Glu Phe Gly Ala Phe Lys Ser Val Leu Asn
530 535 540
Ser Trp Thr Gly Lys Ile Gln His Pro Glu Lys Ala Asp Ile Gln Arg
545 550 555 560
Phe Thr Arg His Leu Glu Gln Val Lys Ile Gly Ser Asn Ser Val Leu
565 570 575
Asn Gln Pro Gln Thr Thr Lys Glu Gln Val Ile Ser Ser Leu Lys Ser
580 585 590
Asn Asn Phe Phe Lys Asn Gly His Gln Val Ala Ser Tyr Phe Gln Asp
595 600 605
Leu Leu Thr Lys Asp Lys Leu Thr Val Leu Glu Thr Leu Tyr Asp Leu
610 615 620
Ala Lys Lys Trp Gly Leu Glu Thr Asn Trp Ala Gln Phe Pro Lys Gly
625 630 635 640
Ala Phe Gln Tyr Thr Lys Asp Ile Phe Ala Glu Ala Asp Lys Leu Lys
645 650 655
Phe Leu Glu Ser Lys Lys Lys Asp Pro Phe Asn Gln Ile Lys Glu Ile
660 665 670
His Gln Leu Ser Phe Asn Ile Leu Ala Arg Asn Asp Val Ile Lys Ser
675 680 685
Asp Gly Phe Tyr Gly Val Leu Leu Leu Pro Gln Ser Val Lys Thr Glu
690 695 700
Leu Glu Gly Lys Asn Glu Ala Gln Ile Phe Glu Ala Leu Lys Lys Tyr
705 710 715 720
Ser Leu Ile Glu Asn Ser Ala Phe Lys Thr Thr Ile Leu Asp Lys Asn
725 730 735
Leu Leu Glu Gly Thr Asp Phe Lys Thr Phe Gly Asp Phe Leu Lys Ala
740 745 750
Phe Phe Leu Lys Ala Ala Gln Phe Asn Asn Phe Ala Pro Trp Ala Lys
755 760 765
Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys Gly Glu
770 775 780
Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu
785 790 795 800
Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys
805 810 815
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro
820 825 830
Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
835 840 845
Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala
850 855 860
Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala
865 870 875 880
Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys
885 890 895
Pro Val Ala Thr Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Thr Gly Phe Ser Leu
900 905 910
Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser His Lys
915 920 925
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Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser Glu Tyr Glu Asp Gln Lys
945 950 955 960
Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu Asn Leu Gln Tyr Gln Phe
965 970 975
Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Ala Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His Pro
980 985 990
Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ser Glu Gly Thr
995 1000 1005
Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys
1010 1015 1020
Lys Ala Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala
1025 1030 1035
Pro Ser Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Pro
1040 1045 1050
Asp Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln Gly Lys
1055 1060 1065
Asn Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala Gly
1070 1075 1080
Asp Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Ile Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser
1085 1090 1095
Gly Asp Pro Lys Lys Ser Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys
1100 1105 1110
Gln Ser Asn Asn Asn Gln Glu Pro Glu Ser Lys
1115 1120
Claims (7)
1.猪肺炎支原体强毒株，分类命名为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）AV747株，保藏号为CCTCC NO: V201317。
2.根据权利要求1所述猪肺炎支原体强毒株，其特征在于所述毒株的P97基因如SEQ IDNO：1所示。
3.权利要求1或2所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用。
4.根据权利要求3所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用，其特征在于：采用权利要求1或2所述猪肺炎支原体强毒株培养物进行攻毒。
5.根据权利要求4所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用，其特征在于：所述猪肺炎支原体强毒株培养物的浓度为108-109CCU/mL。
6.根据权利要求5所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用，其特征在于：所述猪肺炎支原体强毒株培养物制备过程中采用的培养基如下： PPLO肉汤4-6g/L，脑心浸液1-3g/L，乳蛋白水解物1-3g/L，示蛋白胨2-4g/L，10×Hank,s液4-6ml/L,酵母抽出液9-11ml/L，健康猪血清180-220ml/L，青霉素100-200万 IU/L，质量百分浓度为0.4%的酚红水溶液1-3ml，pH值至7-7.5。
7.根据权利要求6所述猪肺炎支原体强毒株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用，其特征在于猪肺炎支原体强毒株培养物的培养条件为：在36-38℃培养3-5日。
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