CN1100871C - 猪肺炎支原体克隆致弱株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株猪肺炎支原体(Mhp)无细胞培养弱毒株，该株毒力较弱、安全，有较强的免疫原性，可在无细胞培养基上培养。该株是由气喘病猪病肺接种于二花脸猪进行人工发病，并进行猪肺炎支原体病原再分离，鉴定后在江苏二号无细胞培养基中致弱培养至322代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是：CGMCCNO.0397。
Description
技术领域：
本发明属微生物新菌株。
背景技术：
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of swine MPS亦称猪地方流行性肺炎、猪气喘病)的主要病原，对养猪业造成重大的经济损失。在猪呼吸道和其它部位还分离到猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis Mpo)、猪絮状支原体(Mycoplasmaflocculare Mf)、猪腹支原体(Mycoplasma sualvi)、脲原体(Ureaplasmas，尿原体)及多种无胆甾原体(Acholeplasmas)，但这些支原体并不普遍，致病意义也较小。Mhp由Mare & Switzer及Goodwin & Whitlestone于1965年分离成功，菌体呈球型到短丝状体，菌落很小，具有不明显的中央隆起，在猪血清琼脂平板上不产生膜，也不溶解马、牛、猪、小鸡红血细胞，营养要求复杂，培养严格好氧。八十年代前，国内外完成Mhp的分离、鉴定、人工发病、诊断技术和药物治疗等系统研究。
但目前国际尚无猪肺炎支原体可无细胞培养的弱毒株，常规的猪肺炎支原体株(Mhp)或者毒力大，或者毒力弱而无免疫原性。
发明内容：
本发明的目的是提供一株猪肺炎支原体(Mhp)无细胞培养弱毒株，该株毒力较弱、安全，有较强的免疫原性，可在无细胞培养基上培养。该株是由气喘病猪病肺接种于二花脸猪进行人工发病，并进行猪肺炎支原体病原再分离，鉴定后在江苏二号无细胞培养基中致弱培养至322代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。该株培养72-144小时，以特定PCR引物可扩增出的特异片段，对该株的探针有特异性杂交反应，扩增产物有特定基因序列。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
支原体(Mycoplasma，M.亦称霉形体)，最早由Nocard和Roux(1898)由牛传染性胸膜肺炎病例中分离到，第一种支原体即丝状支原体牛型亚种(M.mycoidessubsp.bovi/M.mycoides subsp.mycoides)分离后由于其性质难以界定，遂将这一大类微生物命名为类胸膜肺炎微生物(PPLOS)。五十年代中期，始用支原体这一名称。1967年，Edward和Frundt建议将其由裂殖菌纲分出来，单独成立一个新纲：软膜体纲(Mollicutes柔膜菌纲，软皮体纲)，支原体因缺少光合色素(叶绿素)，有别于裂殖藻纲；缺少坚硬的细胞壁和细胞壁成份，有别于裂殖菌纲；可以进行无细胞培养而有别于滤过性病毒。它是最小的能够自我复制的原核生物，基因组大小只有典型细菌的20-40％。国际细菌系统分类委员会软膜体纲分类分会(ICSB-ISTM)将软膜体纲分四个目：目I：支原体目(OrderI，Mycoplasmatales)；目II：昆虫原体目(OrderII，Entomoplasmatales)；目III：无胆甾原体目(OrderIII，Acholoplasmatales)；目IV：厌氧原体目(OrderIV，Anaeroplasmatales)。支原体目下设一个科即支原体科(FamilyI，Mycoplasmataceae)，科内置两属：支原体属(Mycoplasma)，属内有120种；尿原体属(Ureaplasma)，属内有6种，常见的动物支原体属此两属。
猪肺炎支原体克隆致弱株的分类地位为：
原核生物界(Procaryotae)
软壁菌门(Teneribacteria)
软膜体纲(Mollicutes)
支原体目(OrderI，Mycoplasmatales)
支原体科(FamilyI，Mycoplasmataceae)
支原体属(Mycoplasma)
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)
猪肺炎支原体迄今全世界只有一个种，其模式株为：J(ATCC25934，NCTC10110)，YppII(ATCC25617，NCTC10127)。
猪肺炎支原体克隆致弱株经系列生化试验证明为支原体属成员，生长抑制试验检测血清型证明与猪肺炎支原体J株为同一种。
目前该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是：CGMCC NO.0397。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、有免疫原性、毒力较弱且对猪安全；
2、能适应于KM2、Friis等无细胞培养基生长；
3、本弱毒株对二花脸和其它中国地方品种猪的免疫原性尚未测试，但安全性好，对二元杂交猪免疫保护率达80％以上。
具体实施方式：
下面对该菌株的培养及鉴定作进一步描述：
一、无细胞培养KM2培养基组成及制法
Eagle’s溶液 1000毫升
1.7％乳蛋白水解物溶于Dubeco-Vot’s磷酸缓冲液(即含10克水解乳蛋白) 600毫升
自制鲜酵母抽出汁 20毫升
健康猪血清 400毫升
青霉素钾盐 40万单位
1％醋酸铊溶液 25毫升
0.4％酚红水溶液 3.5毫升
所有材料低温下用1N NaOH溶液校正其pH到7.4-7.6，Φ0.1μl minipore滤器过滤去除细菌和支原体后，分装贮存于4℃冰箱内备用。
二、猪肺炎支原体克隆致弱株形态鉴定方法
瑞氏染色法镜检：涂片、固定、干燥后，瑞氏染色，置显微镜下油镜1600倍，可见分散的大量具有特定多形态的菌体。
三、猪肺炎支原体克隆致弱株微粒凝集反应试验鉴定方法
1.微粒凝集反应的原理：用一定比例的已知抗体血清与待检培养抗原结合，会发生抗原一抗体凝集反应。由于此种支原体形小、凝集团块肉眼不易察见，经涂片染色，在显微镜下放大观察，可清晰地区别微粒凝集反应与非微粒凝集反应。有凝集反应可判断培养抗原为猪肺炎支原体。
2.材料准备：
(1)抗原：猪肺炎支原体克隆致弱株纯粹培养物接种于江苏2号培养基(KM2pH7.4)，37℃培养48-72小时，待pH降至6.8左右，并有均匀一致的轻微混浊时，涂片染色镜检。可见分布均匀而纯粹的大量具有特定性多形态菌体，以此培养物作为微粒凝集反应抗原。
(2)J株对照抗原、标准阳性血清及标准阴性血清，由江苏省农科院畜牧兽医研究所猪病研究室提供。血清须无菌并在56℃水浴中30分钟灭能。
(3)江苏2号(KM2)培养基。
(4)瑞氏(Wright’s)染色液。
3.操作方法：
(1)用不加阴性猪血清pG7.2的KM2培养基将J株对照抗原、待鉴定培养抗原作10倍稀释。
(2)取稀释抗原0.8毫升，加灭活的标准阳性血清及标准阴性血清0.2毫升混合于灭菌小玻瓶中(可用10毫升链霉素瓶代替)，用灭菌橡皮塞塞紧，于37℃中培养48小时后涂片。置37℃温箱内干燥后，用甲醇固定干燥后用瑞氏染色液染色，染色时间视气温高低而定夏季3-5分钟，冬、秋季15-20分钟；用蒸馏水冲洗干净、干燥后，置显微镜下油镜1000-1600倍以上，观察记录照相。
(3)本试验均应无菌操作。
4.判定结果：在显微镜油镜观察下，如支原体显示均匀一致的分布，定为无凝集反应(-)；呈现小部分菌体凝集反应为(+)；大部分菌体凝集反应(++)；全部菌体凝集反应(+++)。J株对照抗原与阳性血清有++凝集反应，与阴性血清无凝集反应。猪肺炎支原体克隆致弱株待鉴定培养抗原与阳性血清有++以上凝集反应。
5.说明：
(1)本法操作简便，特异性高，可作为实验室诊断鉴定的方法。
(2)应用此法鉴定猪支原体菌株，并证明：猪肺炎支原体克隆致弱株与J株属于同一种。
(3)在实验室与猪鼻支原体、猪滑液支原体、莱氏不需胆甾支原体的高免兔血清作微凝反应，无交叉反应。
四、权利要求书所述之猪肺炎支原体克隆致弱株的P46基因鉴定试验结果
P46基因是编码Mhp细胞表面46KDa蛋白抗原的基因，该抗原可引起Mhp感染猪早期特异性免疫反应。本报告通过对弱毒猪肺炎支原体克隆致弱株P46基因的克隆测序，为猪肺炎支原体克隆致弱株的鉴定作分子标记。
1.材料与方法
1.1Mhp菌株与培养条件
猪肺炎支原体克隆致弱株培养物培养方法：培养基为km2培养基(制备方法略)，种子继代复壮后，1∶10比例接种，37℃培养72小时，培养物pH由7.6降到6.8～6.6，并呈均一混浊状态，无沉淀。培养物涂片瑞氏染色镜检，呈特异多形态菌体，无杂菌。培养物稀释作液体培养变色单位(colour change unit ccu)检测猪肺炎支原体克隆致弱株浓度为10(7)～10(8)ccu/ml。
1.2PCR引物的设计
从Internet下载Futo(1996)在GenBank登载的J株(ATCC 25934)P46基因(命名：MYC46KDSA，1740bp DNA序列)，该序列187～192为-10序列，222～230为RBS序列，235～1494为编码P46抗原蛋白的CDS。用Gold key软件修正各种PCR产物设计指标，最终在320～1680获得一对引物，在此区间内模板序列无HindIII、Bam HI酶切位点，根据克隆质粒pUC19 polylink酶切位点的要求，在引物5′和3′分别添加了HindIII和Bam HI酶切位点及3个保护性碱基，引物G+C％为53～56，无发夹和二聚体，其序列为：(3′为反向互补)5′：GGC AAG CTT CAG GTT GTAGAC AGA CAG，3′：ACC GGA TCC GTC ACA TCA GAA AGA GC。
1.3PCR模板的制备
猪肺炎支原体克隆致弱株培养物100ml经0.05mol pH7.2 PBS离心、洗涤3次后，沉淀以1ml PBS悬浮。Mhp染色体DNA用Boehringer Manuheim公司的High purePCR Template preparation Kit提纯：吸取200ul Mhp悬液，加200ul结合缓冲液(含6M guanidine-HCL，10mM urea，10mM Tris-HCL，20％Triton X-100(v/v)，pH4.4(25℃))，40ul蛋白酶k溶液(90mg冻干蛋白酶k溶于4.5ml重蒸水，-20℃保存)，立即混匀，72℃温育10min，再加100μl异丙醇，混合后反应液移入带两层玻璃纤维绒(吸附DNA用)的聚丙烯管，8000rpm 1min离心，弃液体。管中再加500μl冲洗液(含20mMNaCl，2mM Tris-HCL，80％乙醇(v/v)，25℃pH7.5)，离心弃冲洗液，再重复冲洗后，加200ul预热到70℃的DNA洗脱缓冲液(10mM Tris，pH8.5，25℃)，8000rpm离心1min，收集Mph染色体DNA洗脱液，Backman毛细管紫外检测仪测得洗脱DNA浓度为6ng/ul，可作PCR模板用。
1.4PCR扩增
引物由中科院上海植生所合成，每管为1个OD值，5′、3′引物分别含0.00370、0.00384μM DNA。分别加123、5ul、128、2ul灭菌重蒸水溶解，引物浓度均成为30pM/ul。Taq DNA聚合酶及缓冲液为Promega公司产，产品号C0010，浓度5u/ul，10X缓冲液含有：500mM kcl，100mM Tris HCL(pH9.0)，1％TritonX100，15mM Mgcl2。dNTP，Promega公司产，含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2.5mM/ul。
PCR扩增仪：Perkin Elmer DNA Thormel cycler。扩增条件设置为：预变性：96℃8min；94℃ 1min，45℃ 1min，72℃ 3min，循环35次；延伸：72℃10min。
PCR扩增：在0.5ml eppendorf管内分别加入：模板2ul，5′引物2ul，3′引物2ul，10×缓冲液5ul，dNTP4ul，灭菌重蒸水35ul，总体积为50ul。加20ul灭菌石腊油后，96℃变性8min，冷却确至室温后，迅速在反应液中加入1ul Taq DNA聚合酶，继续进行循环和延伸反应，扩增产物以1％的琼脂糖电泳测定。
1.5电泳与照相
PCR产物10ul加2ul 6×凝胶加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，4％(w/v)蔗糖水溶液，300mM NaoH，6mM/L EDTA)，在1％琼脂糖凝胶上按《分子克隆》方法电泳。电泳仪为Mupid-2微型DNA电泳仪(Cosmo Bio Co.LTD.生产)，按8～10v/cm电泳45min，凝胶在溴化乙锭(0.5ug/ml，pH8.0，1×TAE)中染色30～45min，紫外灯下检查。凝胶相片拍摄和条带分析用Kodak Digital Science 1D系统，标准分子量参照系用宝灵曼公司的1kb DNA Ladder。
1.6电泳产物回收
PCR产物电泳后，用1％低融点(LMP)琼脂糖回收(参照《分子克隆》)。LMP琼脂糖块加200ul pH8.0 TE于65℃温育5min，琼脂糖溶解后加入等量体积的蒸馏酚，混匀，12000rpm 5min离心，小心吸取上清，再等体积加入1∶1(v/v)混合的酚、氯仿溶液，混匀，12000rpm 5min离心，再等体积加入氯仿抽提一次。最后吸出的水相加0.1体积3M/L乙酸钠和2倍体积4℃的乙醇沉淀DNA，-20℃过夜。12000rpm10min离心，弃上清，4℃ 75％乙醇小心漂洗沉淀，50ul重蒸水溶解，-20℃保存。
1.7P46基因PCR提纯产物和PUC19质粒DNA HindIII、Bam HI双酶切和回收
在0.5ml eppendorf管中进行：
①P46基因双酶切反应
PCR提纯产物 32ul
Bam HI 10u/ul 2ul
HindIII 10u/ul 2ul
BufferE 10× 4ul
反应总体积 40ul
②质粒Puc19双酶切反应
pUC19 0.5ug/ul 10ul
Bam HI 10u./ul 2ul
HindIII 10u./ul 2ul
BufferE 4ul
灭菌重蒸水 22ul
反应总体积 40ul
37.5℃反应45min，产物按1.6方法电泳回收。
1.8连接反应
Puc19回收液 13ul
PCR产物酶切回收液 36u
T4 DNA连接酶1u./ul 5ul
10X连接酶缓冲液 6ul
反应总体积 60ul
16～20℃连接12hr，取出其中的10ul转化感受态细胞。
1.9转化、筛选重组子
按常规方法制备大肠杆菌JM105株的感受态细胞，将含60ul新鲜感受态细胞的eppendorf管置冰水中，加入1.8连接反应产物10ul，冰水中放置30min，再于42℃水浴2min，加入1ml LB，37℃振荡培养1hr，稍加离心，去上清，约余500ul。吸200ul涂布接种含有氨苄青霉素和已涂布40ul X-gal贮存液(20mg/ml二甲基甲酰胺、4ul异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)溶液(200mg/ml))作选择性标记的琼脂培养皿上，静置10min后，倒置平板37℃培养18小时，挑选白色单菌落，再接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养管，37℃振荡培养8hr，提取质粒。
1.10重组子质粒的鉴定
提取的重组子质粒10ul按1.7中pUC19质粒双酶切反应的方法以BamHI、HindIII双酶切，酶切后电泳检查。
1.11克隆基因的测序
中科院上海植生所进行，用酶法荧光分析系统测序，以P46基因5′PCR引物为寡核苷酸引物。
2.结果
2.1猪肺炎支原体克隆致弱株模板DNA的提取
用石英毛细管吸取5～8ul模板DNA提取液，在Backman DU-600spctrophotometer上测得OD260为0.12，OD280为0.06，OD260/OD280＝2.0，证明核酸纯度较高，模板DNA浓度为：0.12×50＝6ng/ul。
2.2P46基因的PCR扩增
PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果经Kodak Digital Science 1D照相分析，目的基因为1.37kb，与设计期待长度1377bp相一致，PCR产物浓度为0.025g/ml。
2.3重组质粒的酶切鉴定
重组质粒经BamHI、HindIII双酶切后产生2.6kb、1.4kb两条带，酶切结果表明约1.37kb的P46基因已插入pUC19。
2.4克隆基因的部分测序及序列分析
测序结果与J株P46基因序列及碱基组成比较结果如下：
1.猪肺炎支原体克隆致弱株P46基因(1-501)与J株基因的部分序列(366-866)比较
10 20 30 40 50 60
GNGGGCCGAGACTCTAAAACATAAAGTAAGTAATGATTCTATTCGAATAGCACTAACCGA
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
ACAAGCCGAGACTCTAAAACATAAAGTAAGTAATGATTCTATTCGAATAGCACTAACCGA
375 385 395 405 415 425
70 80 90 100 110 120
TCCGGATAATCCTCGATGAATTAGTGCCCAAAAAGATATTATTTCTTATGTTGATGAAAC
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
TCCGGATAATCCTCGATGAATTAGTGCCCAAAAAGATATTATTTCTTATGTTGATGAAAC
435 445 455 465 475 485
130 140 150 160 170 180
AGAGGCAGCAACTTCAACAATTACAAAAAACCAGGATGCACAAAATAACTGACTCACTCA
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
AGAGGCAGCAACTTCAACAATTACAAAAAACCAGGATGCACAAAATAACTGACTCACTCA
495 505 515 525 535 545
190 200 210 220 230 240
GCAAGCTAATTTAAGTCCAGCACCAAAAGGATTTATTATTGCCCCTGAAAATGGAAGTGG
::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
GCAAGCTAATTTAAGTCCAGCGCCAAAAGGATTTATTATTGCCCCTGAAAATGGAAGTGG
555 565 575 585 595 605
250 260 270 280 290 300
AGTTGGAACTGCTGTTAATACAATTGCTGATAAAGGAATTCCGATTGTTGCCTATGATCG
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
AGTTGGAACTGCTGTTAATACAATTGCTGATAAAGGAATTCCGATTGTTGCCTATGATCG
615 625 635 645 655 665
310 320 330 340 350 360
ACTAATTACTGGATCTGATAAATATGATTGGTATGTTTCTTTTGATAATGAAAAAGTTGG
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
ACTAATTACTGGATCTGATAAATATGATTGGTATGTTTCTTTTGATAATGAAAAAGTTGG
675 685 695 705 715 725
370 380 390 400 410 420CGAATTACAAGGTCTTTCACTTGCTGCGGGTCTATTAGGAAAAGAPGATGGTGCTTTTGAT:::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::: :::::::::::::::CGAATTACAAGGTCTTTCACTTGCGGCGGGTCTATTAGGAAAAGAAGATGGTGCTTTTGAT
735 745 755 765 775 785
430 440 450 460 470 480TCCCTTGATCCACTGAATGAATATCTAAAPTCCCPTATGCCCCAPGAGACAPTTTCTTT:: ::::::::::::::::::::::::: :: : ::::::::: :::::: :::::::TCAATTGATCAAATGAATGAATATCTAAAATCACATATGCCCCAAGAGACAATTTCTTT
795 805 815 825 835 845
490 500 510TPATACAPTCGCGGGTTCCPAGATGAGC@: ::::: ::::::::::: :::::::TTATACAATCGCGGGTTCCCA
855 865 875
P：碱基缺失。
2.猪肺炎支原体克隆致弱株P46基因碱基组成与J株的比较
| Mhp碱基 J株P46基因366-867 克隆致弱株P46部分结构基因1-501猪肺炎支原体成分Base strain J P46 gene 克隆致弱株 P46 gene数目 百分数 数目 百分数Number percent number percent |
| A 176 35.13 165 32.93C 87 17.37 91 18.16T 144 28.74 145 28.94G 94 18.76 98 19.56未知unknown 0 0.00 2 0.40 |
比较J株和猪肺炎支原体克隆致弱株P46基因的部分结构基因的10～490碱基，(J株位于376～857)，在10～385位碱基均相同，仅在202位J株基因由G变为A，在385～490之间有14处变异，分别为5个A缺失，5个A变为C，1个A变为T，1个G变为T，2个T缺失。总体上A、T的缺失或变异占87％。比较J株(366-867)和猪肺炎支原体克隆致弱株P46基因(1-501)的碱基成分，J株G+C％为36.13，猪肺炎支原体克隆致弱株为37.72，后者略多。
猪肺炎支原体克隆致弱株P46基因的测序，可为猪肺炎支原体克隆致弱株的鉴定作分子标记。
Claims (1)
1.猪肺炎支原体克隆致弱株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是：CGMCC NO.0397。
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| CN86102858A (zh) * | 1985-03-27 | 1987-10-28 | 拜奥根公司 | 制备猪支原体的重组表面抗原及其疫苗的方法 |
| CN88101554A (zh) * | 1987-03-26 | 1988-11-02 | Ml技术投资有限公司 | 猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)抗原及其应用 |
-
1999
- 1999-06-25 CN CN99114276A patent/CN1100871C/zh not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN86102858A (zh) * | 1985-03-27 | 1987-10-28 | 拜奥根公司 | 制备猪支原体的重组表面抗原及其疫苗的方法 |
| CN88101554A (zh) * | 1987-03-26 | 1988-11-02 | Ml技术投资有限公司 | 猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)抗原及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1244580A (zh) | 2000-02-16 |
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