CN117843737B

CN117843737B - 一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒及其应用

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Publication number: CN117843737B
Application number: CN202410240804.2A
Authority: CN
Inventors: 韦艳娜; 熊祺琰; 刘蓓蓓; 王佳; 倪博; 袁厅; 冯志新; 邵国青; 王丽
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-03-04
Filing date: 2024-03-04
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2044-03-04
Also published as: CN117843737A

Abstract

本发明提供一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒及其应用，属于生物工程技术领域。所述猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒，包括抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5和兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体；所述抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5是由杂交瘤细胞株6D5分泌的，所述杂交瘤细胞株6D5的保藏编号为CCTCC NO：C2022375。本发明试剂盒用于检测猪鼻支原体抗原含量时，费时短、准确性高、能直接反映猪鼻支原体抗原含量,可以用于灭活疫苗及成品疫苗的有效抗原含量检测。

Description

一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪鼻支原体，普遍存在于猪群中，经常在扁桃体和上呼吸道粘膜（包括鼻腔和传导气道）中定植。以前，人们发现大多数有猪鼻支原体定植的猪没有明显的临床症状，因此，猪鼻支原体曾被认为是猪鼻腔细菌群落的一部分。然而，目前的临床和科学研究证实了猪鼻支原体具有一定的致病性。它可诱导严重的全身感染，导致多种疾病，如浆膜炎、关节炎、中耳炎、咽鼓炎、结膜炎和流产等；此外，它也可能参与猪呼吸道疾病综合征。但是，导致疾病发生的确切机制或条件仍然未知。此外，猪鼻支原体也可感染人类，被报道与胃癌、肺癌、结肠癌等多种人类癌症有关，威胁人类健康。

疫苗接种是预防控制猪鼻支原体感染的关键措施，在疫苗研制过程中，抗原含量是重要的质量控制指标，与疫苗的实际效力密切相关。对于猪鼻支原体抗原含量的测定，通常采用颜色改变单位法（color change unite，CCU），但这种方法检测的是培养收获时活的支原体的数量，不能准确反映疫苗中支原体抗原的含量，同时该方法测定周期长达14天，大大增加了生产周期，其结果还会受到检测血清、检测容器、平行数测定、采样时间等因素的影响，在用于灭活疫苗及成品疫苗的有效抗原含量检测时具有较大的局限性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒，用于检测时，费时短、准确性高、能直接反映猪鼻支原体抗原含量,可以用于灭活疫苗及成品疫苗的有效抗原含量检测。

本发明的另一目的是提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测猪鼻支原体抗原含量的方法，该方法耗时短、准确性高、能直接反映猪鼻支原体抗原含量,可以用于检测灭活疫苗及成品疫苗中猪鼻支原体抗原含量。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒，包括抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5和兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体；所述抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5是由杂交瘤细胞株6D5分泌的，所述杂交瘤细胞株6D5的保藏编号为CCTCC NO：C2022375。

在本发明中，所述兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体的制备方法如下：采用重组猪鼻支原体P37蛋白免疫新西兰大白兔，采血，分离血清，得到所述兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体；所述重组猪鼻支原体P37蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，所述试剂盒还包括包被缓冲液、PBST溶液、封闭液、HRP标记的羊抗兔IgG、TMB底物显色液、终止液。

本发明还提供采用所述试剂盒检测疫苗产品中猪鼻支原体抗原含量的方法，包括如下步骤：

（1）用包被缓冲液将抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5按照稀释度为1：5000稀释作为包被液，包被酶标板；

（2）弃去包被液，用PBST溶液洗涤，加入封闭液，进行封闭；

（3）弃去封闭液，用PBST溶液洗涤,加入猪鼻支原体样品，35-40℃孵育，弃去猪鼻支原体样品；

（4）加入兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体，35-40℃孵育，弃去兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体；

（5）加入HRP标记的羊抗兔IgG，35-40℃孵育，弃去HRP标记的羊抗兔IgG；

（6）加入TMB底物显色液，避光反应；

（7）用终止液终止反应，450nm处读取吸光值；

（8）根据标准曲线计算猪鼻支原体抗原含量。

本发明还提供所述试剂盒在检测猪鼻支原体培养菌液或者猪鼻支原体疫苗产品中的应用。

在本发明中，所述猪鼻支原体疫苗产品包括猪鼻支原体单苗或含有猪鼻支原体的联苗。

在本发明中，所述猪鼻支原体疫苗产品包括猪鼻支原体新鲜培养抗原、灭活后的抗原、灭活后的抗原的浓缩物或加入了佐剂后的猪鼻支原体疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒，实现了仅需2-4小时就可以对猪鼻支原体抗原含量进行测定，与常用的CCU计数法相比，大大缩短了生产周期，提高了生产效率。

(2)本发明不仅可检测培养菌液中猪鼻支原体抗原含量，同时可检测灭活后的抗原、浓缩抗原和灭活疫苗中的抗原含量。

(3)本发明试剂盒用于检测猪鼻支原体全菌抗原的最低检出量为4ng/mL，敏感性高。

(3)本发明试剂盒操作简单，特异性高，重复性好，准确性高，结果判定计算简单。

附图说明

图1显示了猪鼻支原体灭活疫苗第二次免疫后2周血清中针对不同蛋白的IgG抗体水平，横坐标是针对的蛋白，纵坐标是检测结果OD值。

图2纯化后的重组猪鼻支原体P37蛋白的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白分子量标准；泳道1：pET-28a(+)空载体转化入BL21所得对照菌诱导后全菌；泳道2：携带pET28a-P37的重组菌未诱导全菌；泳道3：携带pET28a-P37的重组菌诱导后裂解液上清；泳道4-5：纯化的重组猪鼻支原体P37 蛋白。

图3抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5的特异性鉴定结果。

图4是采用本发明试剂盒检测标准品所得标准曲线，横坐标为一系列标准品浓度的对数值（底数为2），纵坐标为吸光值。

图5显示了本发明试剂盒的特异性，横坐标为抗原稀释度的以2为底数的对数。

具体实施方式

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中所用的试剂及来源：大肠杆菌DH5a购自Takara公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂、IPTG、Tween20均购自美国Sigma-Aldrich公司；96孔可拆卸酶标板购自Solarbio公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、TMB显色液（产品编号为P0209）购自碧云天生物科技有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物公司（产品编号为BA1054）、其他所用化学试剂均为分析纯。

实施例1 猪鼻支原体主要抗原蛋白的比较与选择

利用猪鼻支原体灭活疫苗（HEF16株）免疫试验猪两次，两次免疫间隔14d，每次免疫剂量为1.25×10⁹CCU/头，第二次免疫后2周采血，采用常规方法对猪鼻支原体中多种表面蛋白（P37、LDH、EF-Tu、ENO、DnaK、GAPDH、FBA、PFK等）的IgG抗体进行检测。结果（图1）显示，血清中针对表面蛋白P37蛋白的IgG抗体水平最高，与其它蛋白的IgG抗体水平差异极显著，说明P37蛋白是猪鼻支原体关键的抗原蛋白。

实施例2 制备筛选高反应性猪鼻支原体P37蛋白单克隆抗体

1.制备猪鼻支原体P37蛋白单克隆抗体

参考NCBI数据库公布的猪鼻支原体P37蛋白基因（genebank登录号为CAA32357.1），将除信号肽外的猪鼻支原体P37蛋白基因序列(1140 bp)，利用 E.coli偏爱的密码子进行序列优化，优化后的序列如SEQ ID NO:1所示，然后在优化后的序列两端分别添加NheⅠ和BamHⅠ酶切位点，采用基因合成方法获得带有酶切位点的猪鼻支原体P37蛋白基因片段，其编码的P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将合成的基因片段经Nhe Ⅰ和BamHⅠ双酶切后插入经同样双酶切的pET-28a(+)空质粒载体中，构建得到重组表达质粒pET28a-P37。将测序正确的重组表达质粒pET28a-P37转化入BL21感受态细胞，得到重组菌，经IPTG诱导后进行原核表达。将诱导表达后的菌体采用超声裂解后，离心取上清，采用镍柱按照常规方法对重组猪鼻支原体P37蛋白进行纯化（图2），使用BCA法测定浓度，调整终浓度为1mg/mL，分装后-70℃以下保存备用。

将纯化的重组猪鼻支原体P37蛋白作为免疫原，背部皮下多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心），共免疫3次，每次免疫间隔2周。首次免疫，每只BALB/c小鼠使用100μg重组猪鼻支原体P37蛋白（体积100 μL）与等体积弗氏完全佐剂（购自Sigma公司）混合免疫，后两次每只BALB/c小鼠均使用100μg重组猪鼻支原体P37蛋白（体积100 μL）与等体积弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司）混合免疫。小鼠第三次免疫后7d，眼眶采血，分离血清，采用间接ELISA方法测定所得抗血清的抗体效价，选取血清抗体效价﹥10000的小鼠，在细胞融合实验前3 d用不加佐剂的重组猪鼻支原体P37蛋白经腹腔注射加强免疫，50 μg/只。

采用PEG细胞融合方法制备融合细胞。取小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）与加强免疫后的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例，充分混匀，400g离心10min，弃上清，在手掌上轻击或手指轻弹融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置37℃水浴中预热。用1 mL吸管在1 min左右（最佳时间为45 s）缓慢滴加预热至37℃的PEG2000（购自Sigma公司）1 mL，边加边轻轻搅拌1min。加入4mL不完全培养基（购自美谷分子仪器（上海）有限公司），持续搅拌4min。缓缓加入10mL不完全培养基（购自美谷分子仪器（上海）有限公司），放入37℃水浴锅，孵育15min。缓缓加入30mL不含HT的完全培养基（购自美谷分子仪器（上海）有限公司），400g离心7min。吸弃上清，用40mL不含HT的完全培养基洗一遍细胞沉淀以除去PEG。用10mL恢复培养基（购自美谷分子仪器（上海）有限公司）重悬细胞。将细胞悬液转移至T-75细胞培养瓶中，其中预先加入20mL恢复培养基，终体积为30mL，在37℃、5%CO₂条件下培养16-24h。

将培养后的融合细胞悬液转移至50mL圆锥管中，在室温或37℃、400g离心10min，吸弃上清，用10mL恢复培养基重悬浮细胞，对细胞进行计数后，放置一侧待用。将恢复培养基重悬后的细胞悬液加入到半固体培养基（购自美谷分子仪器（上海）有限公司）中，轻轻颠倒试剂瓶约10次以充分混匀，然后转移至6孔板（每孔约2mL）中，稍稍倾斜培养板促进半固体培养基均匀分布，在孔板内部间隔添加4mL无菌水以防止培养基干燥，在37℃、5%CO₂条件下培养10-14天后，进行克隆的挑选。一次细胞融合实验一般可以获得1000个或更多的克隆（10块6孔板）。利用手工挑选的方法将克隆转移至预先加入了生长培养基（含HT，购自美谷分子仪器（上海）有限公司）的96孔板中，在37℃、5% CO₂条件下培养1-7天，吸取杂交瘤细胞培养上清液，用ELISA方法进行效价检测。

ELISA方法检测效价具体步骤如下：采用0.05 mol/L的pH9.6碳酸盐缓冲液将重组猪鼻支原体P37蛋白（本实施例制备）稀释至3μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜，PBST（含有0.05%吐温20的0.01M、pH7.3的PBS缓冲液）洗涤3次，每次5min，拍干；以含5%（质量百分浓度）脱脂乳（购自Sigma公司）的PBS（浓度0.01M、pH7.3）封闭每孔，200μL/孔，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；将杂交瘤细胞培养上清液、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清（记为阳性参考血清）和1:1000稀释的小鼠阴性血清（记为阴性参考血清）分别加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（购自北京全式金生物技术有限公司，产品编号HS201-01），100μL/孔，37℃作用30min，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；加入TMB底物显色液（碧云天生物科技有限公司，产品编号为P0209），100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL浓度为2 mol/L的硫酸水溶液终止反应。经酶标仪测定OD450nm值，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD450nm值，当阴性参考血清的OD450nm值≤0.1，且阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性。

挑选ELISA方法检测的效价较高的3株杂交瘤细胞株9H11、5A6和6D5，以备后续筛选。

2.制备兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体

选择2-2.5kg健康新西兰大白兔5只，将2mg/mL的重组猪鼻支原体P37蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比为1:1混合，乳化后对上述5只新西兰大白兔进行首免，每只免疫1mL（含抗原量1mg），背部皮下多点注射。将2mg/mL的重组猪鼻支原体P37蛋白与弗氏不完全佐剂按照体积比为1:1混合，乳化后用于二免、三免和四免，每次免疫剂量均为每只免疫1mL（含抗原量1mg），免疫方式为背部皮下多点注射。相邻两次免疫之间间隔14天。四免后一周，无菌心脏采血，无菌条件下分离血清，得到兔抗猪鼻支原体P37蛋白高免血清。猪鼻支原体HEF16株（王佳，华利忠，刘蓓蓓，等. 1株猪鼻支原体的分离鉴定及致病性[J]. 畜牧兽医学报. 2021,52(11):3185-3193）菌液按1:10的比例（体积比）接种于KM2液体培养基，37℃静置培养48-72h，收获培养物，离心20分钟，将沉淀用PBS缓冲液洗2次，第2次清洗后，沉淀用少量的PBS缓冲液再次悬浮。超声裂解后离心取上清，即为猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白质的含量测定，-70℃保存。采用本实施例中检测杂交瘤细胞株培养上清的ELSIA方法检测所得兔抗猪鼻支原体P37蛋白高免血清的反应性，另外将本实施例中检测杂交瘤细胞株培养上清的ELSIA方法中的重组猪鼻支原体P37蛋白采用猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白替代，检测兔抗猪鼻支原体P37蛋白高免血清与猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白的反应性。结果：该兔抗猪鼻支原体P37蛋白高免血清与猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白、重组猪鼻支原体P37蛋白发生特异性反应，证明该血清的反应性良好，即为兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体，用于后续试验。

3.筛选高反应性猪鼻支原体P37蛋白单克隆抗体

分别将实施例2中ELISA方法检测的效价较高的3株杂交瘤细胞株的培养上清与兔抗猪鼻支原体全菌蛋白多克隆抗体(制备方法同实施例2兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体的制备，只是将重组猪鼻支原体P37蛋白替换成猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白)或兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体（实施例2制备）配对，建立夹心ELISA方法，筛选检测效果较好的单抗。具体方法如下：将各杂交瘤细胞株培养上清分别作为包被抗体进行包被，加入猪鼻支原体HEF16株培养物作为阳性样品（P），KM2培养基为阴性对照（N），再加入兔抗猪鼻支原体全菌蛋白多克隆抗体或兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体作为检测抗体，检测OD值，比较不同杂交瘤细胞株培养上清的检测结果，选择阴性对照（N）检测值尽量低，而阳性样品和阴性对照的比值（P/N）尽量高的杂交瘤细胞株。结果如表1，兔抗猪鼻支原体全菌蛋白多克隆抗体作为检测抗体，N值偏高，有非特异性反应，兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体作为检测抗体，没有明显非特异性反应。在3株杂交瘤细胞株中，6D5和兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体配对检测P值最高且P/N值最小，检测效果最好，且杂交瘤细胞株6D5培养上清的效价最高，因此最终选择杂交瘤细胞株6D5与兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体配对，研发猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒。

杂交瘤细胞株6D5的保藏信息如下：

分类命名为杂交瘤细胞株6D5，Hybridoma cell line 6D5;

保藏日期为2023年3月8日；

保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；

保藏单位地址为武汉大学；

保藏编号为CCTCC NO：C2022375。

表1.抗体配对结果

将杂交瘤细胞株6D5分泌的单克隆抗体命名为抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5。将杂交瘤细胞株6D5扩大培养，冻存，并采用常规方法进行腹水制备。将灭菌的液体石蜡腹腔注射10-12周龄的BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心），0.5mL/只，7d后将杂交瘤细胞株6D5注射至小鼠腹腔，每只注射2.5×10⁶个杂交瘤细胞，8d后采集腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000rpm离心10min，收集上清液，在56℃处理30min，过滤除菌并采用饱和硫酸铵沉淀法进行纯化，得到抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5。抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5纯化的具体方法如下：（1）取5mL单抗腹水，加入5mL的PBS缓冲液（0.01M，pH7.2），再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5ml使其成为20%的硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静置30min。（2）8000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。（3）在上清液中逐滴加入12.5mL饱和硫酸铵溶液，充分混匀，静置30min。（4）8000r/min条件下离心20min，弃去上清。（5）于沉淀中加入10mL的PBS缓冲液（0.01M，pH7.2），使之溶解，再逐滴加入5mL饱和硫酸铵溶液，使之成为33%的硫酸铵溶液，充分混匀后，静置30min。（6）8000r/min条件下离心20min，弃去上清，以除去白蛋白。（7）依次重复步骤（5）和（6）两次，最后所得沉淀采用5mL的PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）溶解，装入透析袋（截留分子量是12KD），4℃下用PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）透析，换液4次。（9）8000r/min条件下离心20min，弃沉淀，上清即为纯化抗体，测抗体效价（实施例2中ELISA方法），分装后，-70℃保存。

经鉴定，杂交瘤细胞株6D5分泌的抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5的亚类为IgG1 κ。采用实施例2中ELISA方法检测杂交瘤细胞株6D5培养上清的效价为16000，纯化后的抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5的效价（对应的蛋白浓度是7.5mg/mL）为5120000。

将检测杂交瘤细胞株上清效价的ELISA方法中包被在酶标板上的重组猪鼻支原体P37蛋白分别替换为猪肺炎支原体、絮状支原体、猪滑液支原体、猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白，以检测杂交瘤细胞株6D5分泌的抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5的特异性。结果如图3，该单克隆抗体能与猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白、重组猪鼻支原体P37蛋白有特异性反应，而与猪肺炎支原体、絮状支原体、猪滑液支原体无反应，证明该单克隆抗体能有效检测出猪鼻支原体抗原，具有较好的特异性。

实施例3 夹心ELISA定量检测试剂盒的组成及检测方法

1.夹心ELISA定量检测试剂盒的组成

夹心ELSIA定量检测试剂盒（记为本发明试剂盒）包括：包被缓冲液、抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5、PBST溶液、封闭液、兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、TMB底物显色液、终止液。

包被缓冲液（pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液）：是含有1.59g/L的Na₂CO₃和2.93g/L的NaHCO₃的水溶液。

抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5：按照实施例2中方法制备，效价为5120000。

PBST溶液：是含有0.05％（体积百分浓度）Tween-20的PBS缓冲液；此处的PBS缓冲液浓度为0.01M、pH7.2，是含有8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na₂HPO₄和0.24g/L KH₂PO₄的水溶液。

封闭液：含2％（质量百分浓度）脱脂乳的PBS缓冲液（浓度0.01M、pH7.2）。

兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体：实施例2制备。

HRP标记的羊抗兔IgG：购自武汉博士德生物公司，产品编号为BA1054。

TMB底物显色液：购自碧云天生物科技有限公司，产品编号为P0209。

终止液：浓度为2M的硫酸水溶液。

2.本发明试剂盒的使用方法

采用本发明试剂盒定量检测猪鼻支原体抗原含量的方法，包括如下步骤：

a.包被：用包被缓冲液将抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5按稀释度为1：5000稀释作为包被液，然后按照100μl/孔，加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜（12-14h）。

b.封闭：弃去包被液，用PBST溶液洗涤3次，得到ELISA反应板。在ELISA反应板中加入封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h。

c.加样：弃去封闭液，用PBST溶液洗涤3次后，在阴性对照样品孔中加入KM2液体培养基，在待测样品孔中加入猪鼻支原体样品，100μl/孔，各样品做2个重复，37℃孵育30min。猪鼻支原体样品包括猪鼻支原体新鲜培养抗原、灭活后的抗原、灭活后的抗原的浓缩物或加入了佐剂后的猪鼻支原体疫苗。其中猪鼻支原体新鲜培养抗原可以是菌液，也可以是全菌蛋白。

d.加入兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体：弃去加样，用PBST溶液洗涤3次后，加入采用PBST溶液按照稀释度为1:5000稀释的兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；

e.加酶标抗体：弃去兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体，用PBST溶液洗涤3次后，加入采用PBST溶液按照稀释度为1:10000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃孵育30min；

f.显色：弃去酶标抗体，用PBST溶液洗涤3次后加入TMB底物显色液，100μl/孔，室温避光反应10min；

g.终止：用终止液终止反应，50μl/孔，450nm处读取吸光值；

h.结果判定：阴性对照的吸光值应≤0.3，y为待测样品孔的吸光值，根据标准曲线图y＝0.2352x+0.7795（制作方法见实施例3本发明试剂盒的标准曲线制作）计算出x，最后计算2^x即为待检样品中的P37蛋白（抗原）含量。待检样品的抗原含量既可以用待检样品中P37蛋白含量表示，单位是ng/mL；亦可用相对效力值（RP）表示，RP=待检样品中P37蛋白含量/参考样品中P37蛋白含量，其中参考样品是已经过动物攻毒效力试验检验为合格疫苗产品、或已知全菌蛋白含量、或已知CCU等样品。如RP≥1.0，则表明待检样品的P37蛋白含量高于参考样品。

3.本发明试剂盒的标准曲线制作

制作标准曲线：将实施例2中制备的1mg/mL的重组猪鼻支原体P37蛋白，先采用PBS缓冲液（0.01M、pH7.2）稀释至100ng/mL后，再按照稀释倍数为2、4、8、16、32、64、128、256进行稀释，得到一系列标准品，将该标准品作为待检样品，按照实施例3本发明试剂盒的使用方法中步骤a-g进行检测，得到450nm处的吸光值。以一系列重组猪鼻支原体P37蛋白标准品浓度的对数值（底数为2）为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线图。结果见图4，标准曲线为y＝0.2352x+0.7795，其中x为标准品浓度的对数值（底数为2），y为吸光值，相关系数R²＝0.9918。

实施例4 夹心ELSIA定量检测方法的特异性评价

采用本发明试剂盒检测不同支原体，将猪鼻支原体作为阳性对照，KM2培养基及PBS缓冲液作为阴性对照，检测猪肺炎支原体、絮状支原体、猪滑液支原体培养菌液、PCV、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV，以评价本发明试剂盒的特异性。结果如图5，在阴阳性对照均成立的情况下，采用本发明试剂盒对猪肺炎支原体、絮状支原体、猪滑液支原体培养菌液、PCV、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV的检测结果均为阴性，表明本发明试剂盒具有良好的特异性。

实施例5 本发明试剂盒的重复性评价

采用本发明试剂盒，使用同一批次的ELISA反应板（实施例3中本发明试剂盒的使用方法）对5批次猪鼻支原体HEF16株抗原样品（猪鼻支原体HEF16株采用KM2培养基培养所得菌液）进行检测，每批次抗原样品同时采用同一批次中3块不同ELISA反应板分别检测一次，计算抗原含量，计算板内变异系数。

另外，采用本发明试剂盒，以3批次ELISA反应板（实施例3中本发明试剂盒的使用方法），检测5批次猪鼻支原体HEF16株抗原样品（猪鼻支原体HEF16株采用KM2培养基培养所得菌液），每批次抗原样品同时采用3块不同批次的ELISA反应板检测，计算5批次抗原每组变异系数，即板间的重复变异系数。

结果如表2，本发明试剂盒的板内和板间的重复变异系数平均值分别为3.74%和4.87%，重复性好。

表2夹心ELSIA定量检测方法的重复性分析

实施例6采用本发明试剂盒检测猪鼻支原体疫苗产品中的抗原含量

将复苏的猪鼻支原体HEF16株菌液按体积比为1:9接种至600mL的KM2培养基中，进行扩大培养，待菌液生长至对数期时，得到新鲜菌液（即灭活前抗原），留50mL用于检测；在剩余新鲜菌液中加入终浓度（质量百分浓度）为0.01%的甲醛，37℃灭活24h，得到灭活后的抗原，留50mL用于检测。将剩余的灭活后的抗原取500mL在12000r/min、4℃离心30min，收集菌体沉淀，向沉淀内加入50mL的PBS缓冲液混匀，得到的悬浮液即为灭活后的浓缩抗原。

按照上述方法制备3批次猪鼻支原体新鲜菌液（即灭活前抗原）、灭活后的抗原和灭活后的浓缩抗原。将3批次猪鼻支原体灭活后的浓缩抗原分别按照以下两种方法制备猪鼻支原体灭活疫苗。第一种方法制备油佐剂疫苗：(1)油相：将白油（埃索白矿油52，即MARCOL52）和司本80按照体积比为94：6混合均匀，高压灭菌，得到油相。(2)吐温-80：高压灭菌。(3)水相：将96体积份的猪鼻支原体灭活后的浓缩抗原，置37℃放置约20min，使抗原温度达到37℃左右，加入4体积份的吐温80，充分振荡（10000r/min 搅拌）使吐温溶解，得到水相。(4)乳化：将油相倒入乳化容器中，10000r/min 搅拌，边搅拌边将水相以水相：油相（体积比）=1：2.5 比例缓慢加入，加完水相后在20000r/min条件下乳化1.5-2min，得到猪鼻支原体油佐剂灭活疫苗。第二种方法制备水佐剂灭活疫苗：将水佐剂Gel和猪鼻支原体灭活后的浓缩抗原以1：9的体积比充分混匀，即得到猪鼻支原体水佐剂灭活疫苗。

对3批次的油佐剂灭活疫苗进行滴水试验，结果：均不破乳。具体方法如下：取10mL猪鼻支原体油佐剂灭活疫苗于3000r/min离心10min，析出水相低于0.5mL，说明制备的猪鼻支原体油佐剂灭活疫苗质量合格。

采用本发明试剂盒检测本实施例制备的疫苗生产过程中的半成品（新鲜菌液、灭活后抗原及灭活后的浓缩抗原）、3批次猪鼻支原体油佐剂灭活疫苗及水佐剂灭活疫苗。将猪鼻支原体油佐剂灭活疫苗及水佐剂灭活疫苗放置于-20℃，反复冻融3次后，5000rpm离心10min，取沉淀，获得疫苗抗原，然后采用本发明试剂盒检测抗原含量，如待检样品抗原浓度过高可适当稀释后测定。

结果显示：疫苗生产过程中抗原灭活和浓缩后几乎没有损失（表3），3批次疫苗抗原在制备疫苗前和制备疫苗后测得的抗原总量基本一致（表4），说明含量测定不受制剂的影响，可用于成品疫苗含量检测。因此，本发明试剂盒实现了对猪鼻支原体肺炎灭活疫苗半成品和成品抗原含量的快速定量测定，填补了现有CCU计数法无法定量检测灭活疫苗中抗原的缺陷，使疫苗质量得以保证。

表3.本发明试剂盒用于疫苗生产过程中的半成品的抗原含量检测

表4.本发明试剂盒用于疫苗成品的抗原含量检测

实施例7 本发明试剂盒敏感性及与其他ELISA测定方法的比较

目前报道的用于检测猪鼻支原体抗原含量的ELISA检测方法有三种。对照方法1：朱红振，危艳武，黄立平，等. 检测猪鼻支原体抗原的ELISA方法的建立及其应用[J]. 中国兽医科学，2019，49(07)：828-833；对照方法2：刘星，张丽芳，杨玉萍，等. 抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立[J]. 中国比较医学杂志，2008，18（3）：55-58；以及对照方法3：一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用，申请号为202011277555.2的发明专利。

由于上述已经报道的三种方法对敏感度的监测指标不同，为了比较本发明试剂盒与各方法敏感度，因此选用BCA试剂盒检测所得猪鼻支原体全菌蛋白浓度（收集猪鼻支原体菌体超声裂解后用市售BCA试剂盒检测蛋白浓度，ng/mL）作为统一标准进行敏感度对比分析。首先对本发明试剂盒敏感度进行检测，将猪鼻支原体HEF16株全菌蛋白（批次221016）2倍比稀释后应用本发明试剂盒进行抗原定量检测，结果显示本发明试剂盒检测猪鼻支原体时，全菌蛋白抗原的最低检出量为4ng/mL（表5）。

表5 本申请试剂盒检测方法对猪鼻支原体全菌蛋白抗原标准曲线的测定结果

对照方法3为基于竞争法建立的通用型支原体抗原定量检测方法，对对照方法3的敏感度进行检测，如表6显示，对照方法3检测猪鼻支原体全菌蛋白抗原的最低检出量为0.41μg/ml。

表6 对照方法3对猪鼻支原体全菌蛋白抗原标准曲线的测定结果

注：表6中B是猪鼻支原体全菌蛋白2倍比稀释后各孔的吸光度； B0是空白对照样品孔的吸光度。

将本发明试剂盒检测结果与现有报道的结果进行比对，对照方法1检测猪鼻支原体全菌蛋白抗原的最低检出量为25ng/100μL（250ng/ml），为本发明试剂盒的62.5倍。对照方法2的最低抗原检出量为30ng/ml，为本发明方法的7.5倍。对照方法3的最低抗原检出量为0.41μg/ml，为本发明方法的102.5倍。因此本发明方法具有更高的敏感性。

Claims

1.一种猪鼻支原体抗原含量检测试剂盒，其特征在于包括抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5和兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体；所述抗猪鼻支原体单克隆抗体6D5是由杂交瘤细胞株6D5分泌的，所述杂交瘤细胞株6D5的保藏编号为CCTCC NO：C2022375；所述兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体的制备方法如下：采用重组猪鼻支原体P37蛋白免疫新西兰大白兔，采血，分离血清，得到所述兔抗猪鼻支原体P37蛋白多克隆抗体；所述重组猪鼻支原体P37蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括包被缓冲液、PBST溶液、封闭液、HRP标记的羊抗兔IgG、TMB底物显色液、终止液。

3.采用权利要求1所述试剂盒检测疫苗产品中猪鼻支原体抗原含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

（6）加入TMB底物显色液，避光反应；

（7）用终止液终止反应，450nm处读取吸光值；

（8）根据标准曲线计算猪鼻支原体抗原含量。

4.权利要求1所述试剂盒在检测疫苗生产中的猪鼻支原体培养菌液或者猪鼻支原体疫苗产品中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于所述猪鼻支原体疫苗产品包括猪鼻支原体单苗或含有猪鼻支原体的联苗。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述猪鼻支原体疫苗产品包括猪鼻支原体新鲜培养抗原、灭活后的抗原、灭活后的抗原的浓缩物或加入了佐剂后的猪鼻支原体疫苗。