CN117427155A - 猪鼻支原体p37蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用、一种动物疫苗佐剂及其应用 - Google Patents
猪鼻支原体p37蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用、一种动物疫苗佐剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及猪鼻支原体P37蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用、一种动物疫苗佐剂及其应用。本发明以猪鼻支原体P37蛋白为活性成分制备动物疫苗佐剂，实验证明，得到的动物疫苗佐剂具有生物粘性，注射后可以产生缓释效应，使抗原持续有效地释放，延长疫苗作用时间，避免突释效应，维持有效产物浓度，提高疫苗免疫效果，免疫7天即可产生抗体，两周可完全达到免疫保护抗体水平，免疫持续期长；并且容易吸收，无任何毒、副作用，使用安全，免疫后的动物不会出现淋巴细胞缺失现象。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及猪鼻支原体P37蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用、一种动物疫苗佐剂及其应用。
背景技术
目前，我国规模化养殖场的疫病防控压力严峻，使用疫苗强制免疫是控制动物传染病的有效措施之一。实践证明，很多动物疫病(流行性腹泻、伪狂犬病、流感病)的疫苗免疫效果并不理想。
佐剂是非特异性免疫增强剂，在灭活疫苗中被广泛使用，可增强机体对疫苗的免疫应答或改变免疫应答类型。目前我国商品化的灭活疫苗佐剂主要是矿物油(白油、MONTANIDEISA206VG)和铝胶等。矿物油注射困难，不易吸收，会造成免疫部位炎症、坏死并给动物造成痛苦。铝胶佐剂主要诱导Th2型免疫应答，仅适用于以抗体为主要保护性免疫的疫苗，且对许多病毒、寄生虫、细菌抗原无佐剂作用。另外，铝胶在注射部位会形成肉芽肿，并容易诱导机体产生过敏反应。除此之外，矿物油和铝胶佐剂均无法快速激发疫苗诱导的保护性免疫反应。因此，研发安全可靠的动物疫苗佐剂，提高抗体的效价和动物疫苗的安全性，促进动物机体对抗原的免疫应答的产品，显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供猪鼻支原体P37蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用、一种动物疫苗佐剂及其应用，延长疫苗的作用时间，提高动物机体中抗体的效价，提升动物疫苗的安全性，促进动物机体对抗原的免疫应答。
本发明提供了猪鼻支原体P37蛋白在下述a1)至a4)中的一种或多种中的应用；a1)制备动物疫苗佐剂；a2)提高动物机体中抗体的效价；a3)提升动物疫苗的安全性；a4)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品；
所述猪鼻支原体P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述动物包括猪。
优选的，所述疫苗包括灭活疫苗。
优选的，在所述应用过程中，将所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油联合使用；
所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比为45～55μg：0.8～1.2mL。
本发明还提供了一种动物疫苗佐剂，所述动物疫苗佐剂包括猪鼻支原体P37蛋白和矿物油；
所述猪鼻支原体P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比为45～55μg：0.8～1.2mL。
本发明还提供了上述技术方案所述的动物疫苗佐剂在制备动物疫苗中的应用。
本发明还提供了一种动物疫苗，其特征在于，包括上述技术方案所述的动物疫苗佐剂、抗原和水。
优选的，所述抗原和动物疫苗佐剂的质量体积比为45～55μg：0.8～1.2mL。
本发明还提供了上述技术方案所述的动物疫苗的制备方法，包括如下步骤：
将所述抗原和水混合，得到抗原液；
将所述抗原液和动物疫苗佐剂混合，乳化，得到所述动物疫苗。
有益效果：
猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)是一种能够引起猪多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎以及肺炎等病症的致病性支原体，P37蛋白是猪鼻支原体的主要免疫原之一，也是猪鼻支原体中目前唯一已知的与肿瘤直接相关的抗原，本发明以猪鼻支原体P37蛋白为活性成分制备动物疫苗佐剂，实验证明，得到的动物疫苗佐剂具有生物粘性，注射后可以产生缓释效应，使抗原持续有效地释放，延长疫苗作用时间，避免突释效应，维持有效产物浓度，提高疫苗免疫效果，免疫7天即可产生抗体，两周可完全达到免疫保护抗体水平，免疫持续期长；并且容易吸收，无任何毒、副作用，使用安全，免疫后的动物不会出现淋巴细胞缺失现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1动物疫苗佐剂的实物图。
具体实施方式
本发明提供了猪鼻支原体P37蛋白在下述a1)至a4)中的一种或多种中的应用；a1)制备动物疫苗佐剂；a2)提高动物机体中抗体的效价；a3)提升动物疫苗的安全性；a4)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品；
所述猪鼻支原体P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：MLKKFKNFILFSSIFSPIAFAISCSNTGVVKQEDVSVSQGQWDKSITFGVSEAWLNKKKGDKEVNKEVINTFLENFKKEFNKLKNANDKTKNFDDVDFKVTPIQDSTVLLNNLSTDNPELDFGINASGKLVEFLKNNPGIITPALETTTNSFVFDKEKDKFYVDGTDSDPLVKIAKEINKIFVETPYASWTDENHKWNGNVYQSVYDPTVQANFYRGMIWIKGNDETLAKIKKAWNDKDWNTFRNFGILHGKDNSSSKFKLEETILKNHFQNKFTTLNEDRSAHPNAYKQKSADTLGTLDDFHIAFSEEGSFAWTHNKSATKPFETKANEKMEALIVTNPIPYDVGVFRKSVNQLEQNLIVQTFINLAKNKQDTYGPLLGYNGYKKIDNFQKEIVEVYEKAIK。本发明所述猪鼻支原体P37蛋白在NCBI的登录号为AGE45207.1。
在本发明中，所述动物优选包括猪；所述疫苗优选包括灭活疫苗，进一步优选包括用于胃肠炎、流行性腹泻、圆环病毒病、伪狂犬病和流感病中的一种或多种的灭活疫苗。
在本发明所述应用过程中，优选将所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油联合使用；所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比优选为45～55μg：0.8～1.2mL，进一步优选为50μg：1.0mL。本发明将所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油混合使用，可以弥补矿物油为单一成分制备动物疫苗的不足。
本发明还提供了一种动物疫苗佐剂，所述动物疫苗佐剂包括猪鼻支原体P37蛋白和矿物油；
所述猪鼻支原体P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比优选为45～55μg：0.8～1.2mL，进一步优选为50μg：1.0mL。
本发明将猪鼻支原体P37蛋白和矿物油混合得到的动物疫苗佐剂呈白色均一混悬液体，具有生物粘性起到抗原缓释的作用，可在常温阴凉干燥条件下保存。
本发明还提供了上述技术方案所述的动物疫苗佐剂在制备动物疫苗中的应用。
利用本发明得到的动物疫苗佐剂制备动物疫苗，注射后可以产生缓释效应，使抗原持续有效地释放，延长疫苗作用时间，避免突释效应，维持有效产物浓度，提高疫苗免疫效果；并且注射安全，易吸收，无任何毒、副作用，免疫部位不会造成炎症、坏死，动物无不良反应。免疫后7天即可产生抗体，两周可完全达到免疫保护抗体水平，免疫持续期长。实施例结果表明，对诱导细胞产生干扰素的能力优于水佐剂疫苗，在抗体效价上也显著优于水佐剂疫苗。
本发明还提供了一种动物疫苗，包括上述技术方案所述的动物疫苗佐剂、抗原和水。
在本发明中，所述抗原和动物疫苗佐剂的质量体积比优选为45～55μg：0.8～1.2mL，进一步优选为50μg：1.0mL。本发明所述抗原和水的体积与所述动物疫苗佐剂的体积比优选为15：85。
本发明还提供了上述技术方案所述的动物疫苗的制备方法，包括如下步骤：
将所述抗原和水混合，得到抗原液；
将所述抗原液和动物疫苗佐剂混合，乳化，得到所述动物疫苗。
在本发明中，将所述抗原液和动物疫苗佐剂混合的方式优选包括搅拌。本发明优选根据需要制备的动物疫苗的体积确定具体的搅拌条件和乳化条件。当需要制备的动物疫苗的体积为150～200mL时，所述搅拌的转速优选为800rpm。本发明优选边搅拌边向所述抗原液中加入所述动物疫苗佐剂，进一步优选为10min内将所述动物疫苗佐剂全部加入所述抗原液；所述乳化的转速优选为800rpm，时间优选为30min。
当需要制备的动物疫苗的体积＞200mL且≤10L时，所述搅拌的转速优选为300rpm。本发明优选边搅拌边向所述抗原液中加入所述动物疫苗佐剂，进一步优选为按照300mL/min的速度将所述动物疫苗佐剂加入所述抗原液；所述乳化的转速优选为300rpm，时间优选为40min。
当需要制备的动物疫苗的体积＞10L且≤1000L时，所述搅拌的转速优选为100rpm。本发明优选边搅拌边向所述抗原液中加入所述动物疫苗佐剂，进一步优选为20～25min内将所述动物疫苗佐剂全部加入所述抗原液；所述乳化的转速优选为100rpm，时间优选为45min。
本发明根据需要制备的动物疫苗的体积确定具体的搅拌条件和乳化条件能够制备出均质的合格疫苗。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的猪鼻支原体P37蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用、一种动物疫苗佐剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种动物疫苗佐剂，由猪鼻支原体P37蛋白和矿物油组成，其中猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比为50μg：1mL。
实施例2
一种动物疫苗，由如下步骤组成：
(1)将猪圆环病毒2型抗原和水混合，得到抗原液；
(2)在500rpm转速下，在10s内将实施例1得到的动物疫苗佐剂加入装有步骤(1)得到的抗原液的烧杯中，1000rpm保持搅拌10min，得到动物疫苗；其中，抗原液和动物疫苗佐剂的体积比为15：85；
抗原液中抗原和动物疫苗佐剂的质量体积比为50μg：1.0mL。
实施例3
一种动物疫苗，由如下步骤组成：
(1)将猪圆环病毒2型抗原和水混合，得到抗原液；
(2)在300rpm转速下，按照300mL/min的速度，将实施例1得到的动物疫苗佐剂加入装有步骤(1)得到的抗原液的烧杯中，300rmp保持搅拌40min，得到动物疫苗；其中，抗原液和动物疫苗佐剂的体积比为15：85；
抗原液中抗原和动物疫苗佐剂的质量体积比为50μg：1.0mL。
实施例4
一种动物疫苗，由如下步骤组成：
(1)将猪圆环病毒2型抗原和水混合，得到抗原液；
(2)在100rpm转速下，在20～25min内将实施例1得到的动物疫苗佐剂加入装有步骤(1)得到的抗原液的烧杯中，100rmp保持搅拌45min，得到动物疫苗；其中抗原液和动物疫苗佐剂的体积比为15：85；
抗原液中抗原和动物疫苗佐剂的质量体积比为50μg：1.0mL。
应用例1
1.材料
疫苗：实施例2猪圆环病毒2型新型灭活疫苗，批号202002；
上海海利生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗，批号为20200301，购自上海海利生物技术股份有限公司。
试验动物：30～40日龄试验猪，经猪圆环病毒2型核酸和抗体检测均为阴性，均购自郊区某猪场。
2.方法
2.1分组
取15头试验猪，随机分成3组，每组5头，依次标记为免疫1组、免疫2组和对照组。
2.2免疫试验
免疫1组试验猪使用实施例2得到的动物疫苗进行免疫，免疫剂量为1mL/头，免疫方式为颈部肌肉注射；免疫三周后加强免疫一次，免疫剂量为1mL/头，免疫方式为颈部肌肉注射；
免疫2组试验猪使用上海海利生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗进行免疫，免疫剂量为1mL/头，免疫方式为颈部肌肉注射；免疫三周后加强免疫一次，免疫剂量为1mL/头，免疫方式为颈部肌肉注射；
对照组试验猪颈部肌肉注射生理盐水，注射剂量为1mL/头；免疫三周后加强免疫一次，颈部肌肉注射生理盐水，注射剂量为1mL/头。
测试例1
仔猪免疫安全性试验临床观察
应用例1加强免疫14d后，观察个处理组试验猪的表现，结果如表1所示。
表1各处理组试验猪的临床观察结果
| 组别 | 注射部位炎症 | 疫苗吸收 | 饮食 | 饮水 | 精神状态 |
| 免疫1组 | 5/5无炎症反应 | 5/5吸收良好 | 5/5正常 | 5/5正常 | 5/5正常 |
| 免疫2组 | 5/5无炎症反应 | 5/5吸收良好 | 5/5正常 | 5/5正常 | 5/5正常 |
| 对照组 | 5/5无炎症反应 | 5/5吸收良好 | 5/5正常 | 5/5正常 | 5/5正常 |
根据表1可以看出，各处理组注射部位均未出现炎症反应，并且疫苗吸收良好，试验猪饮食、饮水和精神状态正常，无食欲不振、喜卧，精神萎靡等不良反应。本发明得到的动物疫苗注射安全，容易吸收，无任何毒、副作用。
测试例2
抗体测定
应用例1加强免疫后14d，各组试验猪一并采血并分离血清，测定猪圆环病毒2型的IPMA血清抗体效价，结果如表2所示。
表2各处理组试验猪的IPMA血清抗体效价
根据表2可以看出，利用本发明提供的疫苗进行免疫后，猪圆环病毒2型IPMA血清抗体效价均介于6400～12800倍之间，利用上海海利生物技术股份有限公司生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗进行免疫后，猪圆环病毒2型IPMA血清抗体效价均介于800～3200倍之间。由于上海海利生物技术股份有限公司生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与本发明的区别仅在于该公司生产的疫苗并未添加猪鼻支原体P37蛋白，因而能够说明本发明以猪鼻支原体P37蛋白为佐剂成分，得到的动物疫苗具有更优的免疫效力，能够促进动物机体对抗原的免疫应答，提高抗体效价。
测试例3
攻毒试验
应用例1加强免疫后14d，各组同时注射2型猪圆环病毒(猪圆环病毒2型LG株)，感染方式分为滴鼻和颈部肌肉注射，每种感染途径的注射剂量为1mL/头，病毒滴度为1×105.5TCID50/mL。
(1)临床观察
攻毒后连续观察28日，观察各组试验猪是否出现腹股沟淋巴结肿大症状，结果如表3所示。
表3猪圆环病毒2型攻毒后腹股沟淋巴结临床观察结果
注：“+”表示肿大；“－”表示不肿大。
根据表3可以看出，利用本发明提供的疫苗和上海海利猪圆环病毒2型疫苗免疫攻毒后28日，均未出现腹股沟淋巴结肿大症状，对照组试验猪5头均出现腹股沟淋巴结肿大临床症状。
(2)体重测定
测量攻毒当天和攻毒后第28日体重，计算日增重和相对增重率，结果如表4所示。
表4猪圆环病毒2型攻毒后相对增重率统计结果
根据表4可以看出，利用本发明提供的疫苗免疫后攻毒，试验猪相对增重率为31.48％；利用上海海利猪圆环病毒2型疫苗免疫后攻毒后，试验猪相对增重率为8.52％，本发明提供的疫苗更有利于免疫动物的增重，免疫效果好。
(3)病理观察
攻毒后第28日，剖杀各组试验猪，对各组试验猪的腹股沟淋巴结进行病理切片观察，是否有淋巴细胞缺失现象，结果如表5所示。
表5猪圆环病毒2型攻毒后腹股沟淋巴结病理观察结果
注：“+”表示淋巴细胞缺失，“－”表示淋巴细胞未缺失。
根据表5可以看出，对照组5头试验猪进行腹股沟淋巴结病理切片观察，均呈现淋巴细胞缺失现象，免疫1组的试验猪腹股沟淋巴结均未出现淋巴细胞缺失现象，而免疫2组(上海海利猪圆环病毒2型疫苗)1/5头出现淋巴细胞缺失现象。
(4)核酸检测
攻毒后第28日，采集各组猪腹股沟淋巴结，提取DNA，用PCR方法检测猪圆环病毒2型核酸，结果如表6所示。
表6猪圆环病毒2型攻毒后核酸检测结果
注：“+”表示核酸检测结果阳性，“－”表示核酸检测结果阴性。
根据表6可以看出，免疫1组试验猪的PCR检测均为阴性，免疫2组1/5试验猪的PCR检测均为阳性，对照组试验猪5头PCR检测均为阳性。
(5)发病统计
猪圆环病毒2型攻毒后，根据试验猪临床症状、病理切片结果和核酸检测结果，统计各组试验猪的发病数和保护数，结果如表7所示。
表7猪圆环病毒2型攻毒后发病统计结果
| 组别 | 发病数 | 保护数 |
| 免疫1组 | 0 | 5 |
| 免疫2组 | 1 | 4 |
| 对照组 | 5 | 0 |
根据表7可以看出，利用本发明的动物疫苗免疫后攻毒试验猪的发病数为0，利用上海海利猪圆环病毒2型疫苗免疫后攻毒试验猪的发病数为25％，说明本发明提供的动物疫苗免疫效果更好。
由于上海海利生物技术股份有限公司生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与本发明的区别仅在于该公司生产的疫苗并未添加猪鼻支原体P37蛋白，结合上述内容，可以看出本发明以猪鼻支原体P37蛋白为佐剂成分，得到的动物疫苗具有更优的免疫效力，能够促进动物机体对抗原的免疫应答，提高抗体效价。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.猪鼻支原体P37蛋白在下述a1)至a4)中的一种或多种中的应用；
a1)制备动物疫苗佐剂；
a2)提高动物机体中抗体的效价；
a3)提升动物疫苗的安全性；
a4)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品；
所述猪鼻支原体P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物包括猪。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括灭活疫苗。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，在所述应用过程中，将所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油联合使用；
所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比为45～55μg：0.8～1.2mL。
5.一种动物疫苗佐剂，其特征在于，所述动物疫苗佐剂包括猪鼻支原体P37蛋白和矿物油；
所述猪鼻支原体P37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的动物疫苗佐剂，其特征在于，所述猪鼻支原体P37蛋白和矿物油的质量体积比为45～55μg：0.8～1.2mL。
7.权利要求5或6所述的动物疫苗佐剂在制备动物疫苗中的应用。
8.一种动物疫苗，其特征在于，包括权利要求5或6所述的动物疫苗佐剂、抗原和水。
9.根据权利要求8所述的动物疫苗，其特征在于，所述抗原和动物疫苗佐剂的质量体积比为45～55μg：0.8～1.2mL。
10.权利要求8或9所述的动物疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述抗原和水混合，得到抗原液；
将所述抗原液和动物疫苗佐剂混合，乳化，得到所述动物疫苗。
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