CN106999567B - 用于即用型PCV2/M.hyo组合疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于制备抗原组合物的方法，该抗原组合物可用于制备用于猪的即用型疫苗，以用于预防或减少M.hyo或PCV2的感染以及疾病的相关症状。所述方法的特征在于，其包括将PCV2抗原与吸附至氢氧化铝佐剂的M.hyo抗原的预先形成的抗原/佐剂复合物混合的步骤。这样可以制备出PCV2/M.hyo组合疫苗，其单次施用后已经对单一或组合感染时的M.hyo和PCV2的感染和疾病高度有效。此外，所述疫苗在施用时具有非常好的安全性，是即用型，并且在经济上是可行的。
Description
本发明涉及兽医的领域，也即涉及用于猪的抗猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)以及抗2型猪圆环病毒的疫苗。具体而言，本发明涉及用于制备包含疫苗抗原的组合物的新方法。此组合物继而允许生产用于猪的有效的即用型组合疫苗。另外，本发明还涉及可通过所述新方法获得的抗原组合物的用途、从该抗原组合物制备的疫苗、以及所述抗原组合物和所述疫苗的各种方法和用途。
猪肺炎支原体(M.hyo)是引起(猪)地方流行性肺炎(EP)的主要原因，EP是在全世界发生的猪慢性呼吸道疾病。在较早的文献中使用客观同义词：猪肺炎枝原体(M. suipneumoniae)，指代同一细菌。该细菌相对较小，缺少细胞壁，并且属于柔膜菌纲(Mollicute)。尤其是年幼的小猪易受此高度传染性的疾病的侵害，并且传播通常是空气传播的或者是通过直接接触。
源于M.hyo的肺部疾病大部分是免疫介导的病理，导致实变肺炎(consolidatedpneumonia)。虽然并不分泌突出的毒素，但该细菌定殖在并且破坏肺纤毛上皮，导致纤毛活性的丧失。根据居住条件以及环境压力，此疾病的问题最大的后果是，其使得容易受到其它细菌和病毒病原体对猪呼吸系统的不同继发性感染。这引起所谓的：猪呼吸道疾病综合征(PRDC)，展现出严重的肺部病变。在动物的不适之外，由于生长速率和饲料转化率的表现降低、以及通过兽医护理和抗生素使用的成本，EP和PRDC导致猪产业严重的经济损失(Thacker & Minion，2012，Mycoplasmosis，in：Disease of swine, 10th ed., J. Wiley& Sons, p. 779 - 797)。
与PRDC相关的其它猪病原体为：病毒如：2型猪圆环病毒，猪流感病毒，和猪繁殖与呼吸综合征病毒；以及细菌如：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，出血败血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)，猪链球菌(Streptococcus suis)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。
由于抗生素仅部分有效，针对M.hyo相关疾病和生产损失的主要治疗是通过疫苗接种，优选在生命的早期。作为综述，参见：Maes等人(2008，Vet. Microbiol., vol. 126,p. 297-309)。通常在保育期，至4周龄，对小猪进行疫苗接种，任选在几周后进行加强疫苗接种。
通过疫苗诱导的抗M.hyo免疫来对疾病进行控制的确切机制并未完全了解。虽然疫苗接种并不能完全预防肺部定殖或者细菌传播，但是疫苗接种在实质上减少临床症状，如肺部定殖、肺部病变、和肺炎，减少脱落、以及恢复经济表现，如平均每日增重方面是有效的。为了监测疫苗效力，可以对不同的临床疾病参数进行评分和监测，如发病率、肺炎、胸膜炎，以及还通过对重分离的M.hyo进行检测和定量，如通过血清学、组织学、或PCR。
确定M.hyo疫苗的效力和保护作用的通常方式是通过对肺部病变严重性的降低进行评分。通常在尸检期间，通过对肺部实变的宏观评估，对此类病变进行评分，例如基于Goodwin等级表(Goodwin等人, 1969, J. Hyg. Camb., vol. 67, p. 465-476)，此等级表涵盖从0分至完全受影响肺部的最大的55分。当比较经疫苗接种的动物对比未经疫苗接种的动物中攻击感染的影响时，使用有效的疫苗，可以观察到肺部病变评分超过50%的降低。肺部病变评分的此种降低表明有效的免疫保护，并且与猪健康以及猪表现(如在饲料转化率和平均每日增重中所测量的)的显著恢复相关(Maes等人，2008，Vet. Microbiol., vol.126, p. 297-309)。
M.hyo可以在体外培养，但是需要非常富集的培养基，来补偿其缺乏转化自身必要营养的能力的小基因组。实例为Friis (1975，Nord Vet. Med., vol. 27, p. 337-339)所描述的培养基，其是复杂的培养基，包含酵母提取物、动物血清和猪和牛来源的各种提取物。当完全生长时，通常通过化学或物理手段(例如使用福尔马林)，将全部的M.hyo培养物灭活，以产生‘菌苗’型的抗原：M.hyo的灭活全细胞培养物抗原。随后，可以例如通过过滤，将灭活的培养物浓缩(例如10-20倍)，并用于疫苗的配制。由于使用富集培养基以及浓缩，此类M.hyo菌苗抗原包含许多衍生自培养基的蛋白、脂肪酸等，其可影响至疫苗的进一步加工。
存在许多抗M.hyo的商业疫苗，并且这些常规地用于大部分的商业猪养殖运营中。这些通常是从佐剂化的菌苗制备的灭活疫苗，其通过肠胃外注射施用。一些实例为：RespiSure™ (Zoetis)、Ingelvac™ M.hyo、和MycoFLEX™ (Boehringer Ingelheim)、Hyoresp™ (Merial)、Stellamune™ Mycoplasma (Elanco Animal Health)、以及M+Pac™(Merck Animal Health)。
用于疫苗制备或开发的熟知的M.hyo菌株有：J菌株(ATCC保藏号25934)、菌株11、或菌株232。
已经对这些疫苗进行若干改变和优化，例如所使用的佐剂类型(矿物油、非矿物油、铝盐、合成聚合物等)，待应用的剂量(1或2 ml)，疫苗接种的年龄(1天、7天或更大，3周、6周或更大等)，或者施用途径(肌肉内、皮下、或皮内)。
所述M+Pac疫苗包含双佐剂，Emunade™，其是分散在含水载体中的矿物油的水包油乳剂，其中所述含水载体包含氢氧化铝佐剂。所述M+Pac疫苗自1996年起已商业可购。
对M.hyo疫苗最近发展是通过提供不需要加强疫苗接种的疫苗(所谓的：‘一次’或‘单次’疫苗)而对给药方案的调适。或者，开发了弹性给药的疫苗：一次或者双次给药，这是所谓的：‘弹性给药’，例如作为2次1 ml、或者作为一次2 ml。
在基于油的乳剂佐剂之外，已经使用铝盐作为用于M.hyo疫苗的佐剂。铝盐是熟知的佐剂，并且对于人类疫苗，它们是主要的佐剂类型。使用不同的盐：‘氢氧化铝佐剂’，其是结晶体羟基氧化铝(AlO(OH))；‘磷酸铝佐剂’，其是无定形羟基磷酸铝(Al(OH)m(PO4)n；和‘硫酸铝佐剂’，或者：‘Alum’，其是无定形羟基硫酸铝(AlK(SO4)2)。后两种类型是羟基氧化铝的衍生物，其分别用磷酸-、硫酸-基团来替换羟基。对于综述参见：Hem & HogenEsch(2007，Expert Rev. Vaccine, vol. 6, p. 685-698)。
铝盐佐剂的作用机制依然并未完全理解；基础是抗原吸附至铝盐，以及它们在经疫苗接种的靶标体内的释放。抗原与铝盐的结合是不同类型的关联的结果，如物理捕获，以及还有带相反电荷的分子之间的静电相互作用。另外，可以通过阴离子配体互换(由此，以来自抗原的磷酸基团替换铝盐上的羟基)，产生共价键。通过这些不同类型的关联，所述抗原和铝盐佐剂形成复合物，其中结合的抗原可具有经修饰的结构，但也可以被稳定化。
在靶标体内，所述佐剂-抗原复合物通过间质液中的条件和酶降解，并且所述抗原得以解离且可用于免疫系统。铝盐由此刺激抗原呈递细胞对抗原的摄取。此外，铝盐诱导强Th2应答，并因而产生抗体(Exley等人2010，Trends in Immunol., vol. 31, p. 103 -109)。
在氢氧化铝佐剂中，铝盐是勃姆石晶体的形式。这赋予了盐纤维状结构，其在水中形成水胶体凝胶。这也是商业可得的产品的方式，例如：Alhydrogel™ (BrenntagBiosector)、Rehydragel™ (Reheis)、和Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical)。这些产品可以不同的浓度和质量获得，并且还可以在晶体的大尺寸上有不同；较小的晶体具有更多的抗原结合能力。氢氧化铝佐剂具有约11的零电荷点，意味着在低于11的pH，其带正电。因此，在6至8之间的生理pH，该佐剂可吸附带负电的抗原性蛋白(Al-Shakshir等人，1994, Vaccine, vol. 12, p. 472 - 474)。
吸附和复合物形成起始很迅速，但是完全的吸附可需要若干小时。吸附水平还取决于所使用的铝盐的结合能力。为了对其蛋白结合能力进行定量，可以利用使用已知量的标准蛋白的结合测定；对于氢氧化铝佐剂，在European Pharmacopoeia monograph 1664中规定了标准的结合测定。在生理pH，商业氢氧化铝佐剂通常可以结合高达2.5 mg白蛋白/mg铝。
具有巨大经济影响的另一种非常相关的猪病原体是2型猪圆环病毒(PCV2)。关于综述，参见Gillespie等人(2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163)。PCV2最初被鉴定为小猪中观测到的“断奶后多系统衰竭综合征”(PMWS)的致病因子。临床症状和病理包括渐进性消瘦、呼吸困难、呼吸急促、以及偶尔黄疸(icterus和jaundice)。猪圆环病毒属于圆环病毒科(Circoviridae)，而且具有小的(17 nm)二十面体无包膜病毒，以及包含环状、单链DNA基因组(大约1760个核苷酸)的衣壳。该基因组仅包含几个开放阅读框，其中的ORF2编码大约28 kDa的病毒衣壳蛋白。其包含主要的病毒中和表位。
PCV2相对稳定，且感染性高。其经不同种类的机体分泌而脱落，并在猪群中横向和纵向传播。因为PCV2是嗜淋巴细胞的，PCV2感染所引起的主要病变是淋巴衰减。这引起免疫抑制，从而使PCV2感染的动物变得对继发性感染易感。因此，在PMWS之外，PCV2也涉及许多其它猪疾病综合征，其统称为：猪圆环病毒(相关)疾病(PCVD，或PCVAD)。最显著的PCVD是猪呼吸道疾病综合症、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、先天性震颤、和渗出性表皮炎。
然而，没有继发性感染的明显症状，大多数受PCV2感染的猪并不显示出清晰的疾病临床症状。此类PCV2的亚临床感染本身仅仅显现为看上去健康的猪的不佳生长和表现。
由PCV2引起的PCVD的(亚-)临床症状通常可从3或4周龄起在猪中观测到，这是小猪断奶并且保护性的母体来源抗体开始退化的时间。
已开发了商业疫苗以保护抵御PCV2，并且这些正在全世界使用。不同类型的疫苗有：基于灭活的全PCV2病毒的疫苗(Circovac™，Merial)，或者基于灭活的嵌合PCV1/PCV2病毒的疫苗(Suvaxyn™ PCV/Fostera™ PCV，Zoetis)；基于重组表达的衣壳蛋白的亚单位疫苗(Ingelvac™ CircoFLEX，Boehringer Ingelheim；Porcilis™ PCV/Circumvent™PCV，Merck/MSD AH)。最后这种类型的疫苗是通过PCV2 ORF2在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中重组表达而产生的。所表达的衣壳自装配成类病毒颗粒(VLP)。这类似于天然的PCV2病毒颗粒，除了其缺乏病毒基因组并因此是非复制性的。已经证明，在大约20微克PCV2 VLP/只动物的剂量(经佐剂化为水包油乳剂)，基于此类PCV2 VLP的疫苗是安全且有效的(参见：WO 07/028.823)。
基于所使用的佐剂的类型，PCV2疫苗效力可更多地基于体液或细胞免疫。可以例如使用商业ELISA测量效价：Synbiotics SERELISA™ PCV2 Ab Mono Blocking ELISA。或者，可以使用内部的间接ELISA，如Haake等人(2014，Vet. Microbiol., vol. 168, p.272-280)所述。
PCV2疫苗减少PCV2病毒的复制和传播。这减少肺和淋巴组织中的PCV2病毒负载，并保护免于淋巴衰减、PCVD、和感染的横向传播。因此，这在经疫苗接种的猪群中恢复整体健康和表现，如通过：降低的死亡率、更好的平均每日增重和改善的饲料转化率。
疫苗效力和保护作用可以通过测定PCV2特异性抗体水平，或者通过检测血清或分泌物(口、鼻、粪便、尿)中的PCV2病毒负载、或者通过检测PCVD中涉及的其它病原体，经PCR、(免疫-)组织学、杂交、或血清学方式测量。
用于疫苗开发的PCV2菌株通常是PCV2a基因型；这些也针对PCV2b基因型的菌株产生交叉保护。
已有报道，油佐剂化的针对PCV2的疫苗(如Porcilis PCV)，在注射部位诱导中等至严重的局部反应。参见例如Astrup & Larsen (2010，Poster编号P.049: Proceedings21st IPVS Congress, Canada, 18-21 July)。在接种后的若干天，观测到大小达若干厘米的局部肿胀。然而，这些注射部位的反应是无痛的且短暂的，并且因此在可接受的限度内。另外，它们不与持续的全身性反应相关，而且对疫苗接种效力没有作用。尽管如此，这种类型疫苗的安全性有改善的空间。
源自PCV2感染的疾病症状可以由M.hyo的感染而加重，反之亦然。因此，为了对猪进行有效的保护，需要针对PCV2和M.hyo二者的疫苗接种，以保持良好的猪健康和经济效益。因此，可以使用针对PCV2和针对M.hyo的分离的单抗原疫苗来应用双疫苗接种。然而，为了便于施用，以及节省劳动成本，优选组合疫苗。另外，年幼的猪对于环境应激物非常敏感，因此，减少对其操作的次数直接有益于其健康和表现。当组合疫苗不需要加强疫苗接种，从而在整个肥育期期间，由单一施用保护免于多种疾病时，甚至更为有益。
针对PCV2和M.hyo的商业组合疫苗是可得的，其允许在一次施用中针对两种病原体进行疫苗接种，参见Kim等人(2011, Vaccine, vol. 29, p. 3206-3212)。实例为：Circumvent™ PCV-M (MSD AH)和Fostera™ PCV MH (Zoetis)，二者都是用于弹性剂量施用的即用型组合疫苗，并且是具有油佐剂的水包油乳剂。在Fostera PCV MH的产品活页中，Zoetis描述了他们已经通过在与PCV2抗原组合前，应用Protein A柱层析对M.hyo抗原进行纯化，而克服了M.hyo和PCV抗原之间的干扰。然而，技术人员理解此种复杂的纯化是费力且昂贵的，并降低了疫苗产品的经济可行性。
相关的还有Ingelvac™ CircoFLEX/MycoFLEX™ (Boehringer Ingelheim)，其利用水性聚合物佐剂。然而，最后这种疫苗并不是即用型，并且需要在施用之前不久，现场混合来自不同瓶子的两种疫苗成分，这并不实用。
因此，虽然所有这些疫苗都是有效的，但是对于安全性、效力、或易用性的进一步调适和改善将给兽医领域带来增加的益处。
此前已描述了在Emunade佐剂中的实验性PCV2/M.hyo疫苗(Eggen等人, 2010, 口头报告编号O.072：Proceedings 21st IPVS Congress, Canada, 18-21 July)。此疫苗展示了相当好地减少M.hyo诱导的肺部病变(NB：且n=8，以及对异常值的纠正)，以及认为对于此类型的疫苗是有效的诱导的抗PCV2 抗体水平。所述疫苗是通过将M.hyo和PCV2抗原与空Emunade水包油乳剂混合而制备的。作者们的结论是原则上PCV2和M.hyo抗原可以组合成即用型疫苗，而在靶标中没有免疫干扰。
然而，这种疫苗并不适宜用于大规模商业化，因为所使用的PCV2 VLP抗原已经在CsCl-梯度上通过超离心而经纯化至超过90%的纯度。这样做是试图提高安全性并防止局部位点的反应。因为，这种类型的抗原下游加工是非常劳动密集且极端昂贵的，其对于大规模的应用在经济上不可行，尤其在成本意识高的兽医疫苗领域是不可行的。
近来公开的国际专利申请WO 2014/182872描述了即用型PCV2/M.hyo组合疫苗。此疫苗通过以下制备：首先使M.hyo抗原溶解，继而将其与皂苷混合；接着使PCV2抗原溶解，并将其添加至M.hyo/皂苷混合物。最终，将溶解的抗原与油佐剂或与铝佐剂组合。所述实例都没有描述铝佐剂化疫苗的制备或使用。
近来的出版物进一步证明了即用型PCV2/M.hyo组合疫苗的开发依然非常困难：生产和销售用于现场混合的Ingelvac™ CircoFLEX/MycoFLEX™疫苗的BoehringerIngelheim，近来已经发布了新闻稿声明，表明他们已经终止了开发即用型PCV2/M.hyo组合疫苗的努力。这是因为他们未能实现可接受水平的安全性和效力。Boehringer Ingelheim，2014年9月1日的公司新闻稿(www.boehringer-ingelheim.com/news/news_releases/press_releases/2014/01_ september_2014animal.html)声明：
“Boehringer Ingelheim Animal Health，猪疫苗的市场领先制造商，已经决定持续聚焦于新鲜混合的2型猪圆环病毒(PCV2)/猪肺炎支原体(M.hyo)疫苗，并且不再从事PCV2/M.hyo即用型(RTU)疫苗组合的开发。因而，公司已经中止了其PCV2/M.hyo RTU研究计划。虽然初始的数据是有希望的，但是随着时间显现出来的是，在此事项中，所述RTU设计并未达到高标准的效力和安全性，这是Boehringer Ingelheim的FLEXcombo®平台已知的”。
因此，在该领域中对改善的抗M.hyo和PCV2组合疫苗有着持续的需求，所述组合疫苗是有效且安全的，是用户友好的，以及是经济上可行的。
因此，本发明的目标是通过提供PCV2/M.hyo组合疫苗，克服现有技术中的缺点，并在满足本领域中的这种需求，所述PCV2/M.hyo组合疫苗对于PCV2和M.hyo所引起的感染和疾病高度有效，已经作为单次疫苗，其在施用时具有很好的安全性，并且是即用型。
最初本发明人失望地发现，当使用标准PCV2 VLP抗原时，无法获得Eggen等人(见上文)发表的结果。此种标准抗原是商业PCV2 VLP疫苗如Porcilis PCV/Circumvent PCV疫苗中所使用的。其具有可接受的安全性并且是高度有效的。然而，其是用在经济上更可行水平的下游加工而制备的，而不是经高度纯化的。这样，抗原远不够纯。
依照Eggen等人所应用的程序，本发明人制备了M.hyo菌苗和此种标准PCV2 VLP抗原与空Emunade佐剂的直接组合物。不幸的是，获得的疫苗，其提供的针对M.hyo攻击感染的保护低于正常水平的一半：相较于在使用仅有Emunade中的M.hyo抗原的疫苗(M+Pac™)时66%的减少，肺部病变仅减少了30%。结果呈现在下文的实施例部分。
本发明人因此意外地发现，只有通过在包含疫苗抗原的组合物的制备中应用特别的方法，才能够使用于猪的即用型PCV2/M.hyo组合疫苗的M.hyo疫苗效力可以达到期望的水平：仅在M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂的复合物已经形成之后，添加PCV2抗原。
类似地，本发明人意外地发现，如本文所述的PCV2/M.hyo组合疫苗，已经展示了这种与PCV2单一抗原疫苗相比显著改善的安全性特征。
可以由这种特别制备的抗原组合物制成的PCV2/M.hyo组合疫苗，在单次施用之后已经对M.hyo和PCV2的感染和疾病高度有效、在施用时具有很好的安全性、是即用型、并且是经济上可行的(在于其容纳并非高度纯的PCV2抗原)。实际上，所述疫苗的效力等于针对M.hyo或PCV2的单一抗原疫苗的效力。施用时也是完全安全的，在于其施用于猪时，没有观测到显著的疫苗诱导的局部或全身性反应。
考虑到此种组合疫苗可以在猪生产工业中潜在的大规模使用，这些效果和改善是显著的，并且代表了具有巨大商业意义的预想不到的技术效果。因此，以此方式可以达到本发明的目标，并因而可以克服现有技术中的缺点。
目前尚不知晓，当M.hyo抗原吸附至氢氧化铝佐剂时，PCV2抗原一定不能存在的原因。也并不知晓为何新的PCV2/M.hyo组合疫苗的安全性是如此之好。
虽然本发明人并不想受到可能解释这些观察结果的任何理论和模型的束缚，但是他们推测，当M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂之间形成复合物期间存在PCV2抗原时，这可以某种方式或形式干扰M.hyo抗原向氢氧化铝佐剂的有效吸附。还有，并不像M.hyo抗原那样结合氢氧化铝佐剂的PCV2抗原，可以卷入正在形成的复合物。以一种或其它的方式，这干扰后续针对M.hyo抗原的免疫应答。
类似的推测是新组合疫苗提高的安全性的原因。这可以通过此种抗原与Emunade双佐剂(矿物油和氢氧化铝佐剂)中的成分的某种类型的相互作用，而得以改善，所述相互作用不发生在无铝的油佐剂中。此相互作用可以减少PCV2抗原中物质(的作用)，否则其将会引起注射位点的反应。
因此，第一方面，本发明涉及制备用于猪的即用型组合疫苗的抗原组合物的方法，所述组合物包含猪肺炎支原体(M.hyo)的和2型猪圆环病毒(PCV2)的抗原，其特征在于所述方法包括将PCV2抗原与吸附至氢氧化铝佐剂的M.hyo抗原的预先形成的抗原/佐剂复合物混合的步骤。
对于本发明，“即用型”意味着：不需要组合2个或更多个容器中的(部分的)内含物，以准备好用于施用至靶标动物。例如：不需要溶解或混合的步骤，并且作为单一瓶中的乳剂而可用于终端用户。
对于即用型疫苗，疫苗的制造商已经在受控的环境中进行化合物的必要组合。这相具有超出现场混合的独特优势，主要是便于终端用户使用，特别是当对大量的动物进行疫苗接种时。其它的优势在于，制造商可以在无菌条件下进行组合，并且可以对最终的混合物应用各种质量保证测试，以确保其正确的组成以及其质量。
然而，这并不排除即用型疫苗可以需要一些类型的简单预处理，如用手简单振荡，从而去除乳剂的沉降或者乳状液分层，或者如在疫苗已经冷藏保存时，在施用前加温。
术语“猪”是指猪科(Suidae)的动物，并且优选是指猪属(Sus)的动物，其也称作猪。实例为：野生或家养的猪、肉猪(hog)、野猪、东南亚疣猪(babirusa)、或疣猪(warthog)。这也包括任意命名所表示的猪，例如指其性别或年龄如：母猪、母种猪(queen)、公猪、阉猪、肉猪、小母猪、断奶幼猪(weaner)、或小猪。
术语“猪肺炎支原体“(M.hyo)和“2型猪圆环病毒”(PCV2)分别是指细菌、病毒微生物，其展现出其分类学组成员的特征性的性质，如形态学、基因组、和生物化学特征，以及该组的生物学特征，如在其生理学、免疫学、或病理学的行为上。这也分别包括以任何方式进行亚分类的M.hyo细菌、PCV2病毒，例如分为亚种、菌株、分离株、基因型、变体、亚型或亚组等等。
两种微生物都是本领域熟知的，且描述于例如手册中，如：“The Merckveterinary manual”(10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X)，和“Diseases of Swine”(10th ed., 2012, J. Zimmerman等人, edt., ISBN-10:081382267X)。
技术人员明白，尽管用于本发明的M.hyo细菌、或PCV2病毒目前分类为特定的种和属，但这是分类学分类，其会随着时间改变，因为新的理解导致重新分类为新的或不同的分类组。然而，这并不改变微生物本身、或其抗原谱系，而仅仅是改变科学命名或分类，此种重分类的微生物依然在本发明的范围内。
对于本发明，微生物“的抗原”原则上可以是源自M.hyo细菌或源自PCV2病毒的任何类型的抗原性材料，只要其可诱导免疫应答(通过其自身或者与佐剂一起)。优选地，各种抗原性材料是具有大小、结构、形式、或质量，从而其在受疫苗接种的靶标猪中所诱导的免疫应答是保护性的，也即具有足够的强度以能够预防或减少M.hyo或PCV2的感染以及疾病相关症状。
用于本发明的抗原可以是灭活的微生物、或可以是其一部分，如亚单位、提取物、级分、匀浆或超声处理物。所述抗原可以包含一或多种类型的分子，如蛋白、脂蛋白、糖蛋白、和核酸。所述抗原可以是生物来源或(半-)合成来源，并且可以直接或间接源自微生物，如M.hyo细菌、或PCV2病毒。
M.hyo抗原的实例是菌苗。这可以通过将全部或部分的细菌培养物灭活，而根据本领域熟知的方法来生产。灭活可以通过使用任何适宜技术的处理来完成，如使用加热、辐射、或用化学品，如福尔马林、β-丙内酯，二乙烯亚胺(BEI)、或β-乙醇胺。这样，所得的菌苗就是死的细菌细胞(完整的和损坏的)、细胞片段、细胞内含物、和培养期间从细胞分泌的因子，以及来自培养基及其各种成分的因子的复杂混合物。
PCV2抗原是实例是例如基于病毒衣壳蛋白的亚单位疫苗，如本领域中通常应用的那样。这可以通过病毒ORF2基因组序列的重组表达来生产，例如通过杆状病毒/昆虫细胞系统。随后可以，例如使用离心，从昆虫细胞的培养物分离自装配的VLP。
如本文所用的术语“包含”(以及变体，如“comprise”、“comprising”、和“comprised”)，是指在使用该术语的文字章节、段落、权利要求等中涵盖或包括的所有的元素，并且以对于本发明可想到的任何可能的组合，即便此类元素或组合并未明确列举；且并不是指排除任何此类元素或组合。因此，任何此类文字章节、段落、权利要求等也可以涉及一或多个实施方案，其中术语“包含”(或其变体)被术语，如“由……组成”，“组成”、或“基本上由……组成”所替代。
如本文所定义的，“抗原/佐剂复合物”是指M.hyo抗原(的成分)吸附至氢氧化铝佐剂上所形成的大分子结构。因为此吸附通过许多物理和化学的相互作用而发生，因此，所述复合物不能准确地以化学术语来定义。所述复合物的组成和结构还取决于所使用的抗原和佐剂的组成和特征，以及其所形成的条件。这在本领域中是熟知的，并且是领域中公认的。本文中描述了所述抗原和佐剂所需的和优选的特征、以及形成其复合物的条件。
术语“预先形成的”表示(此术语所指的)抗原/佐剂复合物的形成，发生在较早的时间点。对于本发明，这意味着在向组合物添加任何PCV2抗原之前，M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂之间的复合物就已经形成，并且因而所述复合物的形成是在没有PCV2抗原的情况下发生的。
本发明人推测这允许给定的M.hyo抗原在所述情况下变得尽可能完全地吸附至氢氧化铝佐剂，而没有来自PCV2抗原的干扰或共捕获。结果是在从本发明的抗原组合物制备的疫苗中，针对M.hyo抗原的免疫应答是最佳的。
将抗原吸附至氢氧化铝佐剂的一般条件是本领域熟知的，例如来自药物手册、关于(人)疫苗生产的政府指令、以及佐剂制造商的说明。然而，氢氧化铝佐剂和M.hyo菌苗抗原并不具有高度限定的组成。这使得难以很明确地定义工艺条件、以及对于本发明抗原/佐剂复合物的形成所要获得的最终水平。尽管如此，制备药学制品领域的技术人员，如生物化学家或药剂师、或者具有此类技能的团队，将能够容易地改变并优化这些条件，以实现给定M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂可能的最大吸附。随后，可以测定所实现的吸附水平，从而可以比较不同条件和材料的作用。
例如，可以通过生物化学方法方便地测定任何M.hyo抗原实际上是否已吸附至氢氧化铝佐剂，以及如果是这样的话，有多少吸附，因为氢氧化铝晶体可以容易地通过离心而沉淀成团块。这允许测定该团块中M.hyo抗原的量，表明形成抗原/佐剂复合物的程度；或者当复合物形成未发生、或未完全时，这允许测定上清中剩余的M.hyo抗原的量。
团块或上清中M.hyo抗原的检测可以使用基于抗体的方法来完成，例如使用ELISA，如实施例中所述。另一选择是将任何结合的M.hyo抗原从团块中的氢氧化铝佐剂解离，并例如使用电泳分析释放的抗原。此种解离可能以不同的方式，例如通过调整pH、使用磷酸离子、或通过对团块的超声处理。全如现有技术中所述。
可以通过测试在使用M.hyo抗原形成复合物的特定条件下，氢氧化铝佐剂的吸附能力实际上有多少已经被利用，来进一步优化。这可以通过随后使用给定量的已知蛋白形成复合物，并测定另外还可以结合多少该测试蛋白而完成；例如使用Ph. Eur. monograph1664中所描述的结合测定。这将会表明吸附能力是否(以及有多少)已被使用。
对于给定的M.hyo抗原或给定的氢氧化铝佐剂，当抗原/佐剂复合物中M.hyo抗原的量基本上不能进一步提高时(例如通过调整吸附参数如温度、pH、持续时间或成分的相对量)，则复合物的形成是尽可能完全的。另外，当氢氧化铝佐剂的结合能力尽可能多地被M.hyo抗原所使用并且基本上不能再进一步降低时，则复合物的形成是尽可能完全的。
例如，可以根据本发明的方法来生产抗原组合物。这可以经离心，此后可以分别对团块和上清进行测试。通过使用多克隆兔抗M.hyo抗血清，可以例如在ELISA设定中测试上清的系列稀释物，或重悬浮的团块的可检测的M.hyo抗原的相对量。
发现某些条件有助于优化M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂的抗原/佐剂复合物的形成。
因此，在根据本发明的方法的实施方案中，通过以下步骤预先形成所述抗原/佐剂复合物：
a. 在所述氢氧化铝佐剂带正电的pH下，将所述氢氧化铝佐剂和所述M.hyo抗原在含水载体中混合，和
b. 温育步骤a的混合物，以允许所述M.hyo抗原吸附至所述氢氧化铝佐剂并形成抗原/佐剂复合物。
所述“含水载体”原则上可以是任何含水液体，只要其允许所述抗原/佐剂复合物的有效且完全的形成。在优选的实施方案中，所述含水载体是相对简单的，仅包含纯化水中缓冲剂或盐，例如所述含水载体是生理缓冲液(如平衡盐溶液)，或者是生理学盐溶液，也称作是‘生理盐水’；这是熟知的并且具有纯化水中的0.85% w/v的氯化钠。对于本发明，如果液体包含超过其体积的或重量的50%的水，则其是‘含水的’。
‘纯化水’优选是‘注射用水’；通常这是从无菌且基本不含热原的蒸馏水、双蒸水、微过滤水、或渗透纯化水制备的。
如本领域中所知：“带正电”涉及限定条件下，在水溶液中具有净正电荷的化合物。
氢氧化铝佐剂带正电的pH范围是从0至大约11，其中11是零电荷点。因此，在高至大约pH 11的条件下，M.hyo抗原可以有效结合至氢氧化铝佐剂。然而，由于M.hyo抗原在高或低pH水平可发生一些变性，因而优选更符合生理的pH。因此，所述含水载体的pH优选为5至10之间、更优选5.5至9之间、6至8之间、或者甚至是6.2至7.8之间。最优选的是大约6.5至大约7.5之间的含水载体pH。在这些数值，M.hyo抗原保持在生理条件下，同时氢氧化铝佐剂依然带正电，从而所述M.hyo抗原可有效吸附。
用于“温育步骤a的混合物”的条件同样并不是非常关键的，但是需要抗原/佐剂复合物的有效形成。
本发明人已经发现M.hyo抗原至氢氧化铝佐剂的吸附在两种成分混合后迅速开始，但实现完全的吸附，需要充足的时间。因此，温育步骤a中所述混合物的优选时间段，是至少15分钟，更优选：至少0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24小时(按此顺序优选)。在实际情况中，优选进行“过夜”温育，这对应于大约12至大约18小时之间的时间段。
本发明人还发现，M.hyo抗原至氢氧化铝佐剂的吸附对于温育温度具有相对较宽的耐受性；在4℃冷藏以及在室温都观测到了有效的吸附。然而，如本领域所熟知的，不应允许氢氧化铝佐剂冷冻，因为这会损坏晶体结构。还有，在远高于哺乳动物正常体温(对于猪是38至40℃之间)的温度，所述M.hyo抗原会发生一些变性。因此，温育如步骤a中所述混合物的优选温度是大约2至大约45摄氏度之间。更优选是4至40℃、或10至38℃之间。最优选是在‘室温’，也称作是‘环境温度’，其是大约15至大约30℃之间。
为了适应氢氧化铝佐剂的凝胶的粘稠性质，根据本发明的方法中，对步骤a的混合物的温育优选在所述混合物于运动中时进行。然而，如本领域所熟知的，对氢氧化铝佐剂的剧烈混合可损坏晶体结构。因此，优选对混合物进行一些类型的轻柔搅动。实例为用磁棒搅拌，或者用提供轻柔的轨道运动，或者摇摆运动的各种形式的摇荡机或摇床。所有这些都是通常可用的。对于本发明，轻柔搅动(对于搅拌或旋转运动)是250 rpm或更低，优选150 rpm或更低；一次‘旋转’是完整的环状运动，直至返回起始位置。对于摇摆运动：200个循环/分钟或更低，优选100个循环/分钟或更低。一个‘循环’是完整顺序的上-和下-运动，直至返回起始位置。
对于本发明的方法中所使用的抗原：所述M.hyo抗原优选是从全部培养物制备的菌苗；所述菌苗优选是用BEI灭活的；所述菌苗优选使用例如(超)过滤或透析浓缩至大约10-30倍。如所讨论的，并未确切知晓菌苗的组成，但是其可以例如通过指明在灭活时，培养物中M.hyo细胞的数目，并对于浓缩的次数进行纠正，而表征。对于本发明，所述M.hyo抗原(当以菌苗的形式时)，源自在总培养物中每ml包含10^1至10^10之间的M.hyo细胞的M.hyo培养物。优选在总培养物中，10^4至10^10之间；10^6至10^10；10^7至5x10^9；以及5x10^7至5x10^9之间的M.hyo细胞/ml (按此顺序优选)。用于本发明抗原组合物的M.hyo抗原取自此类培养物灭活的悬液。这也可以通过过滤或离心来浓缩。
优选地，将在步骤a中添加的M.hyo抗原的量，是考虑到随后将可通过所述方法获得的抗原组合物掺入至疫苗中而计算的。这意味着当最终的疫苗还包含一定体积的油相时，所述抗原组合物中M.hyo抗原的量对于后来的稀释进行了补偿。
相对于最终疫苗组合物的体积，来自灭活且浓缩的培养物的M.hyo菌苗的体积可以是1至50% v/v之间。优选地，对于最终疫苗组合物的体积，所述量为2至40%之间、3至30%之间、4至20%之间、或者大约5至大约15% v/v之间(按此顺序优选)。
所述M.hyo抗原优选选自M.hyo J菌株、菌株11、或菌株232。更优选地，所述M.hyo抗原来自J菌株。
因此，在根据本发明的方法的优选实施方案中，所述M.hyo抗原是菌苗，通过以下制备：对细胞密度在大约10^7至大约10^9个细胞/ml之间的来自J菌株的M.hyo培养物进行化学灭活，此后通过过滤将所述灭活的培养物浓缩至10-20倍之间，并且以相对于包含所述M.hyo抗原的最终疫苗组合物的体积，大约5至大约10% v/v之间使用所述灭活的、浓缩的培养物。
所述PCV2抗原优选是ORF2编码的亚基，并且优选是VLP的形式。所述VLP抗原优选未经高度纯化。根据本发明，将在方法的步骤b中混合的PCV2抗原的量优选为大约2至大约200 µg/ml之间的PCV2 ORF2 VLP。更优选为4至100 µg/ml之间的PCV2 ORF2 VLP。
对于所述M.hyo抗原，待添加的PCV2抗原的量，优选是考虑到随后将可通过所述方法获得的抗原组合物掺入至疫苗中而计算的。这意味着当最终的疫苗还包含一定体积的矿物油时，所述抗原组合物中PCV2抗原的量对于后来的稀释进行了补偿。对于待添加至步骤b的PCV2抗原的量，其使得最终疫苗包含至少20 µg的ORF2 VLP/剂量。
由于所述PCV2抗原仅仅是部分纯化的，因此，这可以是来自灭活的昆虫细胞/杆状病毒培养物的样品，在离心后，包含50至1000 µg/ml之间的总蛋白。此外，这实际上意味着相对于最终疫苗组合物的体积，大约3至大约30% v/v之间的PCV2抗原的体积。更优选地，相对于最终疫苗组合物的体积，5至25之间，或者甚至是大约10至大约20% v/v之间。
因此，在根据本发明的方法的优选实施方案中，所述PCV2抗原是ORF2编码的亚基抗原(以VLP的形式)，收获自经化学灭活的且离心的昆虫细胞/杆状病毒表达培养物，并且在包含所述PCV2抗原的最终疫苗组合物中具有至少20 µg的ORF2 VLP/动物剂量。
所述M.hyo抗原和所述PCV2抗原之间没有特定的关系，如在其类型或每剂量的量方面。因此，它们的类型和/或在本发明抗原组合物中的相对量在适宜的时候可以独立地变化；只要它们允许抗原/佐剂复合物的有效形成，并提供有效的疫苗接种作用。
为了测定需要用于制备本发明的抗原组合物和疫苗的来自M.hyo或PCV2抗原批次的抗原的量，通常使用体外效力测定。这也可以用于确定新批次的M.hyo或PCV2抗原具有所需的抗原量(antigenic mass)。此种内部批次释放测试通常是抗原量ELISA。这可以例如使用针对M.hyo或PCV2产生的多克隆抗血清(例如通过兔的免疫获得)、以及使用M.hyo或PCV2抗原的参考标准物而完成。已经在一系列的疫苗接种-攻击实验中测定参考抗原的效力，从而可以将一定数目的任意单位的抗原与期望的疫苗接种效力偶合。实例是登记文件的措辞：本发明的疫苗每2 ml的疫苗剂量需要包含至少2.7‘相对效力单位’的M.hyo菌苗抗原，和至少2800‘抗原性单位’的PCV2抗原。已经确定了包含在本发明疫苗中的这些量的抗原，以确保针对如本文所述的M.hyo和PCV2的严重攻击感染的有效保护。
为了获得每个动物剂量的本发明疫苗所需的效力，通常使用包含这些抗原的最终疫苗组合物体积的5至15%之间的M.hyo菌苗抗原，和10至20%之间的PCV2抗原。
此种批次释放测试的开发，包括适宜抗血清和参考标准物的制备，都在技术人员的常规能力之内。
将与所述M.hyo抗原混合的氢氧化铝佐剂的量，需要足以允许所述M.hyo抗原尽可能完全的吸附。另一方面，所使用的氢氧化铝佐剂的量，需要在每个动物剂量的铝量的可接受限度内，以及需要与使用可通过本发明方法获得的抗原组合物的疫苗的配制相容。在优选的实施方案中，步骤a的混合物包含氢氧化铝佐剂的量，其对应于大约0.1至10 mg/ml之间的铝的量；优选大约0.5至5 mg/ml之间的铝的量。为实现这一点，例如可以使用商业氢氧化铝佐剂产品，如Alhydrogel™，其在一种变体中可以作为“2%”的溶液获得。此命名稍有些令人混淆，但是却衍生自包含大约2% w/w的氧化铝的产品，其对应于大约3% w/w的氢氧化铝，和大约1% w/v的铝。此种产品可以相对于最终疫苗组合物的体积，3至30% v/v之间的体积使用。优选地，以相对于最终疫苗组合物的体积，4至20% v/v之间、优选以大约5至大约15% v/v之间使用氢氧化铝佐剂产品。
因此，在根据本发明的方法的优选实施方案中，所述抗原组合物包含5至15% v/v之间的量的M.hyo抗原，5至15% v/v之间的量的氢氧化铝佐剂产品、以及10至20% v/v的量的PCV2抗原，都是相对于最终疫苗组合物的体积。
在实施方案中，本发明的抗原组合物用作从这种抗原组合物制备的疫苗的全部水相的基础。因此，当要制备的疫苗是包含例如10或20%的油相的乳剂时，水相分别构成最终疫苗组合物的90%或80%。该水相中所包含的是本发明的抗原组合物，具有M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂的复合物、含水载体和PCV2抗原。本发明的抗原组合物中的不同化合物的确切体积量是可以变化的，例如所使用的M.hyo或PCV2抗原的相对体积，可依赖于所使用的特定抗原批次的效力而变，如上文所述。此外，疫苗的水相还可以包含其它成分，如填充剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、另外的抗原、以及从其制备的最终疫苗的制备中所需的任何其它化合物或溶液。对于本发明，通过调整含水载体的体积，来补偿对于从其所制备的疫苗，水相的成分在体积上的差异，以达到期望的水相总体积。
本发明人已发现，以相对较低的体积进行用于本发明的抗原/佐剂复合物的形成是有利的；这允许对于所述M.hyo抗原至氢氧化铝佐剂的吸附的最佳接触。然而，由于氢氧化铝佐剂的凝胶状性质，使用仅M.hyo抗原和一定体积的商业氢氧化铝佐剂产品的混合物可能不会给出最佳结果，并且所述佐剂通常需要某些稀释。因此，抗原/佐剂复合物的形成在还包含含水载体的混合物中进行。
如上所述，此含水载体也用于调节水相的体积，所述水相是用于由其所制备的疫苗的形成。
在优选的实施方案中，用于本发明的抗原/佐剂复合物的形成在具有所述含水载体的混合物中进行，但是其中，在所述复合物形成期间存在的含水载体的体积，少于将用于形成之后疫苗的全部水相的含水载体的总体积。这意味着用于疫苗的全部水相包含一定体积X的所述含水载体的情况下，那么对于所述抗原/佐剂复合物的形成，使用少于该体积X的含水载体；优选使用75%的体积X，更优选50、40、33、30、25、20或甚至10%的体积X (按此顺序优选)。随后，剩余体积的含水载体可以在抗原/抗体复合物形成之后，添加至抗原组合物。
本发明人还发现，对于M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂的复合物的形成，保持步骤a的混合物尽可能简单是有利的，这意味着：在形成抗原/佐剂复合物之前，优选所述混合物尚不包含构成全部水相的任何其它成分。此类其它成分可以是填充剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、另外的抗原等。
因此，在优选的实施方案中，本发明方法的步骤a的混合物，由M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂 (二者可以都已经包含一定量的含水载体)、以及含水载体组成。
在乳化成最终疫苗之前，可需要添加至水相(但优选在所述M.hyo抗原/氢氧化铝佐剂复合物形成之后添加)的化合物的实例为：稳定剂如乙醇或甘油、另外的抗原、或者表面活性剂如Tween™。
因此，在根据本发明的方法的优选实施方案中，应用以下条件中的一种或多种、或者全部：
- 所述M.hyo抗原是M.hyo菌苗，
- 所述PCV2抗原由PCV2 ORF2所编码，
- 由PCV2 ORF2所编码的抗原是类病毒颗粒，
- 步骤a的含水载体是平衡的盐溶液，
- 步骤a的含水载体的pH在6-8之间，
- 步骤a中使用的含水载体的体积，少于用于形成最终疫苗的水相所要使用的含水载体的总体积，
- 步骤a的混合物基本上不含其它成分，
- 步骤b的温育进行10至20小时之间的时间段，
- 步骤b的温育是在室温，和/或
- 步骤b的温育包括将温育的混合物轻柔搅动。
在根据本发明的方法的优选实施方案中，通过以下步骤预先形成所述抗原/佐剂复合物：
a. 在6.5至7.5之间的pH，将氢氧化铝佐剂和M.hyo菌苗在生理盐水中混合，和
b. 温育步骤a的混合物，以允许所述M.hyo菌苗吸附至氢氧化铝佐剂，并形成抗原/佐剂复合物，其中温度为15至30℃之间，且温育在12 - 18小时期间，且轻柔搅动所述混合物。
对于本发明，‘基本上不含’化合物意味着：不包含任何实质量的化合物，如：按重量或体积计，低于10%的化合物，这取决于该化合物是液体还是固体。优选地，基本上不含意味着包含按重量或体积计，低于8、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.05、0.01、或者甚至低于0.001%的化合物(按此顺序优选)。
如本领域技术人员所理解的，本发明的方法可以通过应用本文所述的步骤来进行；按时间顺序为：将M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂在含水载体中混合，将其温育以形成抗原/佐剂复合物，和将PCV2抗原添加至预先形成的复合物；所有这些如本文所定义。
然而，也可以在所述方法的起始、中间或末尾添加或插入一或多个步骤，例如以扩展或优化此方法。例如：在步骤b.后，可将预先形成的抗原/佐剂复合物储存，或者当需要时，可例如通过离心和重悬，而将其纯化。所有这些都保留在本发明的范围内。
通过本发明的方法，可以生产抗原组合物，其可以是可用于制备即用型猪组合疫苗的水相的基础，所述疫苗可以在单一剂量后预防或减少M.hyo或PCV2的感染以及疾病的相关症状。
因此，在另一方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的抗原组合物。所述抗原组合物包含PCV2抗原和吸附至氢氧化铝佐剂的M.hyo抗原的抗原/佐剂复合物，所有都如本文所定义。
本发明的抗原组合物与现有技术组合物的差异在于，其包含M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂的抗原/佐剂复合物，其中对于给定批次的M.hyo抗原和给定的氢氧化铝佐剂，所述M.hyo抗原尽可能完全地吸附至氢氧化铝佐剂。
因此，在优选的实施方案中，本发明的抗原组合物特征在于，存在于所述抗原组合物中的至少50 %的所述M.hyo抗原位于抗原/佐剂复合物中，吸附至氢氧化铝佐剂。
这可以通过测试来确认：在对本发明的抗原组合物于1000-2000 xg离心1-2分钟后，以及通过如本文所述的血清诊断方法检测M.hyo抗原，所述抗原组合物中至少50 %的所述M.hyo抗原位于团块中。
这表明了位于抗原/佐剂复合物(其中M.hyo抗原吸附至氢氧化铝佐剂)中的所述M.hyo抗原的相对量。
优选地，存在于抗原/佐剂复合物中，吸附至氢氧化铝佐剂的本发明抗原组合物的M.hyo抗原的相对量超过60%；更优选地，超过70、80、85、90、95、96、97、98、99、或者是100%(按此顺序优选)。
因此，在优选的实施方案中，本发明的抗原组合物特征在于，组合物中100%的所述M.hyo抗原位于抗原/佐剂复合物中，吸附至氢氧化铝佐剂。
如本领域技术人员所理解的，这些百分比的补数(complement)适用于在离心后保留在本发明抗原组合物的上清中的M.hyo抗原的存在：当所述组合物中存在的所述M.hyo抗原超过50%位于团块中时，那么逻辑上所述抗原组合物中的M.hyo抗原少于50%存在于上清中。
因此，在实施方案中，本发明的抗原组合物特征在于，所述组合物中少于50%的所述M.hyo抗原不是位于抗原/佐剂复合物中，吸附至氢氧化铝佐剂，分别地：在离心后位于上清中。
优选地，本发明抗原组合物的不位于抗原/佐剂复合物中，吸附至氢氧化铝佐剂的M.hyo抗原的相对量少于40%；更优选地：少于30、20、15、10、5、4、3、2、1、或者是0% (按此顺序优选)。
对于本发明，表征本发明抗原组合物的优选方式，是通过测定吸附至氢氧化铝佐剂的M.hyo抗原的相对量。
然而，另外，本发明的抗原组合物与现有技术组合物的区别在于，其包含氢氧化铝佐剂，其结合能力尽可能多地被M.hyo抗原所使用。
因此，在实施方案中，本发明的抗原组合物包含氢氧化铝佐剂，其超过50%的蛋白结合能力被M.hyo抗原所使用。
这可以通过(如所述的那样)测试来检测，通过用已知量的已知蛋白进行进一步的吸附，以及通过适宜的血清诊断方法检测待测试的抗原组合物中的氢氧化铝佐剂能够额外地吸附多少已知蛋白。
这表明了本发明抗原组合物中的氢氧化铝佐剂的未经使用的蛋白结合能力。
优选地，本发明抗原组合物中氢氧化铝佐剂的蛋白结合能力超过60%被所述M.hyo抗原所使用；更优选地：超过70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% (以该次序优选)被所述M.hyo抗原所使用。
在其最有利的效用中，本发明的抗原组合物、或者可通过本发明方法获得的抗原组合物，可以用于生产用于猪的疫苗，所述疫苗有效预防或减少M.hyo或PCV2的感染以及有效预防或减少疾病相关症状、使用安全、经济上可行、并且由于其是即用型而对用户友好。
因此，在另一方面，本发明涉及用于猪的即用型疫苗，用于预防或减少M.hyo或PCV2感染及疾病相关症状，所述疫苗包含可通过本发明的方法获得的抗原组合物、或本发明的抗原组合物，以及另外的佐剂。
所述“另外的佐剂”在这样的意义上而言是另外的：其在已经在所述抗原组合物中的氢氧化铝佐剂之外进行使用。这另外的佐剂确保了根据本发明的疫苗至少与针对PCV2或M.hyo的现有技术单一抗原疫苗同样有效。
“佐剂”是熟知的疫苗组分，其以非特异性的方式刺激靶标的免疫应答。许多不同的佐剂是现有技术中已知的。佐剂的实例为：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物和聚胺如硫酸葡聚糖、Carbopol™、吡喃、皂苷，如：Quil A™，或者Q-vac™。皂苷和疫苗成分可以在ISCOM™中组合。
另外，作为佐剂，常使用肽如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、特夫素，以及矿物油例如Bayol™、Drakeol™、Klearol™、或者Marcol™、Montanide™或轻质矿物(石蜡)油；非矿物油如角鲨烯、角鲨烷；植物油或其衍生物，例如油酸乙酯。也可以有利地使用组合产品如来自Seppic的ISA™或DiluvacForte™。
佐剂及其用途和作用的手册有：“Vaccine adjuvants”(Methods in molecularmedicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN-10:0896037355)。
在实施方案中，本发明的疫苗制备为水相和油相的乳剂；优选所述乳剂是这样的类型：油包水(w/o)、水包油(o/w)、水包油包水(w/o/w)、或者双油乳剂DOE)。更优选的是水包油乳剂的本发明疫苗，其中优选所述‘另外的佐剂’是油相。优选所述油是矿物油。
所述油相通过缓慢释放抗原而在经疫苗接种的动物中提供储库效应，由此提供了对靶标的免疫系统延长的刺激。以此方式，水包油乳剂的疫苗，有利地展现出来自水相的直接免疫刺激，和来自油相延迟的免疫刺激的性质。
因此，在根据本发明的疫苗的实施方案中，所述疫苗是水包油乳剂。
在本发明疫苗的另外的实施方案中，所述另外的佐剂是矿物油。
已知此类佐剂对兽医疫苗的免疫原性具有有利的作用。
在根据本发明的疫苗的实施方案中，所述疫苗是水包油乳剂并且所述另外的佐剂是矿物油。
在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，所述矿物油是轻质矿物油或白矿物油或石蜡油，以如下商品名商业可购，如：Marcol™ (ExxonMobil)、Klearol™ (Sonneborn)、或者Drakeol™ (Penreco)。
在实施方案中，相对于最终疫苗的体积，根据本发明的疫苗包含30至80%之间v/v的本发明的抗原组合物。优选相对于最终疫苗的体积，40至75% v/v之间、45至70% v/v之间、50至65%之间、或者甚至55至65% v/v之间(按此顺序优选)。
在实施方案中，相对于最终疫苗的体积，根据本发明的疫苗包含3至50% v/v之间的量的矿物油作为另外的佐剂。优选相对于最终疫苗的体积，4至40% v/v之间、5至30% v/v之间、5至20% v/v之间、或者甚至5至15% v/v之间(按此顺序优选)。
无需赘言，其它方式的佐剂化、添加载剂(vehicle)化合物或稀释剂、将本发明的疫苗乳剂化或稳定化，也在本发明的范围内。
术语“疫苗”表示使用其掺入的免疫学有效量的抗原。什么构成本发明疫苗的‘免疫有效量’取决于期望的效果和取决于所使用疫苗类型的具体特征。有效量的确定在常规从业者的能力范围内，例如通过在疫苗接种后(或在攻击侵袭后)监测靶标的免疫学应答，例如通过监测靶标的临床症状和血清学参数，以及将这些与未经疫苗接种的受攻击动物中观测到的应答进行比较。
猪是否确实患有M.hyo和/或PCV2感染以及有多严重，可以由具有资格的人员(如有经验的家畜饲养者或兽医)使用疾病症状的常规知识，或者使用适宜的诊断工具，而确定。
通常疫苗还包含药物可接受的载体，其有助于疫苗的制造、应用、或保存，而不引起(严重的)副作用。此种载体可以是本发明方法中使用的含水载体。在更复杂的形式中，载体溶液可以例如是缓冲剂，其可包含另外的添加剂，如稳定剂、防腐剂、或佐剂。细节和实例例如描述在熟知的手册中，如：“Remington：the science and practice of pharmacy”(2000, Lippincot, USA, ISBN：683306472)，和：“Veterinary vaccinology” (P.Pastoret等人ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)。
本发明即用型PCV2/M.hyo组合疫苗的实例是将于2015年上市的Porcilis® PCVM Hyo (MSD AH)疫苗。发现此疫苗展现出本发明所有有利的特征，如即使单次施用后针对M.hyo和PCV2的疫苗效力，具有优越的安全性特征，其是即用型，并且是经济上可行的。细节描述于实施例中，以及在对于Porcilis PCV M Hyo的CVMP评估报告中(EMEA/V/C/003796/0000，2014年9月11日)。此报告描述了此新型疫苗符合针对M.hyo和PCV2攻击感染的免疫效力的标准，即使是在2-8℃储存27个月之后。在大量的实验室和现场疫苗接种研究中，发现所述疫苗以2 ml的剂量肌肉内接种至大约3周龄的小猪是安全的，其中除了由于接种体积的肿胀之外，未观测到注射部位反应，以及除了短暂和附带的直肠温度升高大约1℃之外，没有全身性反应。还有该疫苗是有效的，在于其能够减少病毒血症、减少肺部和淋巴组织中的病毒负载，和减少由PCV2感染引起的病毒脱落，以及降低由M.hyo感染所引起的肺部病变的严重性。另外，所述疫苗还在肥育期中降低了每日增重的损失。所诱导的疫苗免疫性在接种后多达22周是可检测的，这覆盖了整个猪肥育期。
因此，本发明的疫苗在猪中的兽医作用是预防或减少M.hyo或PCV2的感染以及任一疾病的相关症状。这是指本发明的疫苗具有这样的治疗和预防作用：通过减少M.hyo或PCV2的复制和扩散，而降低病毒血症和感染的水平；以及减少或者甚至预防临床症状，如肺部病变、肺炎、ADWG和饲料转化率的降低等。
在优选的实施方案中，本发明的疫苗在猪中用于减少M.hyo感染所引起的肺部病变和/或用于减少PCV2的病毒血症。
本发明疫苗的另外的优势作用在于预防或减少M.hyo和/或PCV2在猪群中的扩散(纵向扩散至后代、和横向在猪群或种群中、以及在地理区域内)。因此，使用本发明的疫苗导致M.hyo和/或PCV2流行性的降低。
因此，在优选的实施方案中，根据本发明的疫苗能够降低M.hyo和/或PCV2在地理区域内的流行性。
此外，本发明的另外的方面为：
- 根据本发明的疫苗用于降低M.hyo和/或PCV2在种群中或在地理区域内流行性的用途，和
- 根据本发明的疫苗，其用于降低M.hyo和/或PCV2在种群中或在地理区域内的流行性。
在实施方案中，本发明的疫苗还可以包含稳定剂。这可以用于改善疫苗乳剂的特征，保护易于降解的成分、和/或以增强疫苗的储存期。通常，此类稳定剂是高分子量的大分子，如脂质、碳水化合物、或者蛋白；例如奶粉、明胶、血清白蛋白、山梨醇、蔗糖、海藻糖、亚精胺、NZ胺、右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮，和缓冲剂，如碱金属磷酸盐。
优选地，所述稳定剂没有动物来源的化合物，或者甚至是经化学定义的，如WO2006/094.974中公开的。
本发明的疫苗可包含防腐剂，如水杨乙汞(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物、和/或庆大霉素。优选不使用防腐剂。
本发明的疫苗优选稳定至少12个月、更优选18个月、或者甚至24个月。‘稳定’是指在适宜条件下长期储存后保持化学和物理结构、以及生物学效力；具体而言：保持疫苗效力直至其推荐储存期结束。
无需赘言，与对于本发明疫苗的药物稳定性或有效性所需的或有益的其它添加剂混合，也在本发明的范围内。
根据本发明的疫苗的靶标是猪。要进行疫苗接种的靶标的年龄、体重、性别、免疫学状况、和其它参数并不是关键的，但是明显有利的是对健康的、未感染的靶标进行疫苗接种，以及尽可能早的疫苗接种以预防PCV2或M.hyo的任何野毒感染(field infection)。因为此种感染可以在年幼时就已经确立，所以，根据本发明的疫苗优选从大约3周龄应用。
有利的是，本发明疫苗的效力不受幼猪可能携带的母体衍生的抗体水平的影响。
因此，本发明的疫苗可用作有效的初种疫苗接种(priming vaccination)，其之后可以继之以加强疫苗接种并由此增强。例如，根据本发明的疫苗可以在大约2-10日龄施用，并在大约3周后再次施用，其中，每次疫苗接种1 ml的体积。然而，由于本发明的疫苗在单次施用后就已经有效，因而优选的实施方案是从大约3周龄施用，例如大约2 ml的单一剂量。此种疫苗接种使猪在整个肥育期期间得到保护。
当本发明疫苗的猪靶标要饲养超过6个月时，如用于繁育的母猪，或者用于产生精子的公猪，这些可以每年施用1次、2次、或3次规律的加强疫苗接种，例如对于母猪：每次产小猪前进行一次加强疫苗接种，平均大约2.2次/年。
因此，本发明的疫苗可以用作预防性或治疗性的处理(或者二者)，因为其干扰M.hyo和/或PCV2感染的确立和进展二者。
本发明疫苗的施用方案优选整合至靶标猪可需要的其它疫苗的现有疫苗接种日程中，以减少对动物的压力和减少劳动力成本。这些其它疫苗可以同步的、同时的、或顺次的方式，以与其登记的用途相容的方式进行施用。
本发明的疫苗，可以靶标动物可接受的体积进行施用，并且可以例如是大约0.1至大约10 ml之间的体积。优选地，一个剂量是大约0.1至大约5 ml之间的体积，更优选一个动物剂量是0.2至3 ml之间。优选地，肌肉内剂量是大约1至大约3 ml之间，优选大约2 ml；以及皮内剂量是大约0.1至大约0.5 ml之间，优选大约0.2 ml。
根据本发明的疫苗可以根据现有技术已知的方法施用至靶标猪。优选的应用是通过肠胃外途径，例如通过注射至或经由皮肤，例如：肌肉内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜下、或者皮下。本发明疫苗的更优选的施用途径是通过肌肉内或通过皮下注射。甚至更优选的是在后腿中、或在颈部中的肌肉内施用。
无需赘言，应用的最佳途径将取决于所使用的疫苗的细节，以及取决于靶标的特定特征。
在实施方案中，根据本发明的疫苗，作为大约2 ml的单一剂量，从大约3周龄肌肉内施用至猪。
优选的肌肉内施用部位是颈部。
进一步优化本发明的疫苗在本领域技术人员的能力范围内。这一般涉及对疫苗效力的微调，从而使其提供充分的免疫保护。这可以通过调整疫苗的剂量、体积、或抗原含量来实现；通过使用另一种形式或剂型的疫苗；通过调整疫苗的其它组分(例如所述稳定剂或所述另外的佐剂)；或者通过经不同的途径、方法、或方案来应用。
本发明的疫苗可另外包含其它化合物，如另外的抗原、细胞因子、或者包含未甲基化的CpG的免疫刺激性核酸等。或者，本发明的疫苗可有利地与药物成分如抗生素、激素、抗炎-或抗寄生虫药物进行组合。或者，本发明的疫苗，本身可以添加至疫苗。
根据本发明的疫苗可有利地与(例如源自另一病原体的)另一抗原组合。此种组合疫苗的优势在于其不仅诱导针对M.hyo和PCV2的免疫应答，还诱导针对其它病原体的免疫应答，而仅需要对靶标动物进行单次疫苗接种操作，由此减少了对靶标的疫苗接种压力，以及减少了时间和劳动成本。
因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗包含另外的抗原性材料，所述抗原性材料源自对猪有致病性的微生物。
所述“另外的抗原性材料”本身可以是可复制的或灭活的形式，或者是亚基，以及可以是具有或没有佐剂。所述另外的抗原性材料可以是抗原，并且可以由生物的或合成的分子组成，如蛋白、碳水化合物、脂多糖、或者核酸分子。或者，其可以是来自所述其它微生物的一段核酸的表达产物，或者是包含此段核酸的载体；所述载体本身可以是微生物或真核宿主细胞。
所述另外的抗原性材料可以是以任何方式“源自”对猪有致病性的其它微生物，例如作为提取物、级分、匀浆或超声处理物。
用于本发明的“对猪有致病性的微生物”，是本领域熟知的。因此，所述另外的抗原性材料原则上可以源自对猪有致病性的任何病毒、细菌、寄生虫、真菌、立克次氏体、原生动物和/或寄生虫。
此类对猪有致病性的微生物的实例为：猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、古典猪瘟病毒、猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、水疱性口炎病毒、胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)、胸膜肺炎放线杆菌、短螺旋体(Brachyspira)、大肠杆菌(E. coli)、嗜血杆菌(Haemophilus)、链球菌(Streptococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、梭菌(Clostridia)、巴斯德菌(Pasteurella)、丹毒丝菌(Erysipelothrix)、博德特氏菌(Bordetella)、弓形虫(Toxoplasma)、等孢子球虫(Isospora)、和旋毛虫(Trichinella)。
在优选的实施方案中，将所述另外的抗原性材料(作为非活的冻干抗原)添加至本发明的疫苗，其可以通过混合本发明的疫苗乳剂而重构。这描述于例如WO 2010/106.095中。
在根据本发明的疫苗的优选实施方案中，所述疫苗包含来自M.hyo、PCV2、胞内劳森菌、和PRRSV的抗原。
由于这些是重要的猪疾病，因此它们组合成即用型的单次疫苗是非常有利的。
本发明的疫苗是通过本领域技术人员熟知的方式制备的。
因此，在另一方面，本发明涉及制备本发明疫苗的方法，包括将可通过本发明的方法获得的抗原组合物，或本发明的抗原组合物，与另外的佐剂混合的步骤。
在另一方面，本发明涉及制备本发明疫苗的方法，包括将可通过本发明的方法获得的抗原组合物，或本发明的抗原组合物，和矿物油，乳化成水包油乳剂的步骤。
此类方法产生本发明疫苗的可用性，所述疫苗具有在猪中预防或减少M.hyo和/或PCV2的感染以及疾病相关症状的有利作用，如上文所述。
本文中描述了“用于制备疫苗的方法”的细节和实例，其是本领域技术人员易于应用的。例如，本发明的抗原组合物可以较小的或较大的体积进行工业化生产，继而与药物可接受的赋形剂组合，配制成疫苗，并填充至适宜大小的容器中。制造方法的各个阶段将通过充分的测试进行监测，例如通过免疫学测试抗原的质量和量；通过微生物学测试灭活、无菌性、和外来物质的缺乏；以及最终通过在动物中研究疫苗效力和安全性的确认。在完成对质量、量和无菌性的测试后，疫苗产品可以发布出售。
所有这些都是本领域技术人员熟知的，并且应用于疫苗制备的一般技术和考虑因素描述于例如政府指令和法规(药典)和在熟知的手册中。
本发明的疫苗可以制备成适宜用于施用至猪靶标的形式，并且其与期望的应用途径相匹配，以及与期望的作用相匹配。
优选本发明的疫苗配制为适宜用于肠胃外注射的形式，也即可注射的液体如：悬液、溶液、扩散液、或者乳剂。通常此类疫苗是无菌制备的，并且是在生理pH。
因此，在另外的方面本发明涉及：
- 可通过本发明的方法获得的抗原组合物、或本发明的抗原组合物，其用于猪的疫苗，所述疫苗用于预防或减少M.hyo或PCV2感染及疾病的相关症状.
- 可通过本发明的方法获得的抗原组合物、或本发明的抗原组合物，在制备用于预防或减少 M.hyo或PCV2感染及疾病的相关症状的疫苗中的用途.
- 本发明的疫苗、或者可通过本发明的方法获得的疫苗，用于预防或减少M.hyo或PCV2感染及疾病的相关症状的用途。
- 用于预防或减少猪中的M.hyo或PCV2感染及疾病的相关症状的方法，所述方法包括向猪施用本发明的疫苗、或者施用可通过本发明的方法获得的疫苗。
本发明将通过以下的非限制性的实施例进一步描述。
实施例
1. M.hyo抗原的制备
以类似用于商业M+Pac疫苗的方式制备M.hyo菌苗抗原；这基本上如(WO 1993/016.726)中所述。简言之：基于最初由Friis (1975，见上文)所描述的培养基，将M.hyo菌株J悬液培养在富集培养基中。这是复合的培养基，其包含酵母提取物、血清和猪和牛来源的各种提取物。在若干次预培养之后，在37℃，以及搅动和pH控制下，在大发酵罐中来完成主培养，并且通常需要进行20至60小时来达到稳定期。为了将培养物灭活，将BEI添加至发酵罐，将其搅拌1小时，之后将全部内含物转移至第二容器中，并在搅拌下于37℃温育达24小时。随后，用硫代硫酸钠，通过在37℃搅拌达24小时，将过量的BEI中和。随后，通过超滤，将所述经灭活且中和的培养物浓缩达15倍。将所述M.hyo菌苗抗原批量储存在4℃备用。由内部ELISA测定所述抗原量和相对效力，其中使用M.hyo-特异性的多克隆兔抗血清，并通过与效力已知的参考标准M.hyo菌苗制剂进行比较。
2. PCV2抗原的制备
以类似用于Porcilis PCV的方式，生产PCV2抗原，其为ORF2编码的VLP的亚基的形式；这基本上如此前所描述(例如WO 2007/028.823)。简言之：用重组杆状病毒感染Sf21昆虫细胞的悬液培养物，所述重组杆状病毒包含在杆状病毒p10基因启动子控制下的插入的PCV2 ORF2基因；感染时的细胞密度为大约1.4 x 106个细胞/ml，感染复数(MOI)为0.01。在于约27℃培养4-8天后，通过使全部培养物穿过工业级超声波仪，对其进行超声处理。随后，在搅拌和pH控制下，用BEI灭活重组杆状病毒，在37℃进行72小时。灭活之后，用硫代硫酸钠中和BEI。中和之后，通过离心去除细胞碎片。随后，将上清用于测定PCV2衣壳VLP的抗原量，其中使用SDS凝胶电泳通过与已知量的标志物蛋白的系列稀释物进行比较，或者是通过内部的ELISA。
3. M.hyo和PCV2抗原的抗原组合物的制备，和即用型疫苗的配制
制备本发明的抗原组合物、以及随后制备本发明疫苗的示例性方案，是制备100ml批次的本发明的疫苗(具有18%的油相)，如下：在玻璃烧杯中无菌组合：5 ml的M.hyo菌苗抗原批次(大约60 RPU/ml)，10 ml的Alhydrogel 2%，和12 ml的生理盐水。这些量代表最终疫苗中3 RPU的M.hyo抗原/ml和大约1 mg/ml的铝。这些与含水载体组合，此处为：盐水。因为对于此疫苗，将会添加37 ml的盐水以配齐水相，此处使用33%的该体积，即12 ml用于抗原/佐剂复合物的形成。
使用4 N盐酸将混合物调节至pH 6.5，并在使用磁力混合盘和无菌的磁力混合棒的轻柔搅拌下，将混合物在室温(大约20℃)温育过夜(16小时)。次日上午，将所述混合物与剩余体积的盐水、17 ml的大约14000 AU/ml的PCV2抗原批次(在最终疫苗中提供约2300AU/ml)、以及乙醇96%和甘油(无菌的)组合。混合持续10分钟，此后，用于疫苗的水相就准备好了。随后，添加18 ml的油相，其由Tween、Span、和Drakeol的混合物组成。随后，用Ultra-Turrax混合器，以10.000 rpm将所述两相均质化2分钟。
以基本相同的方式制备了较大体积(达100升)的疫苗批次，并且这些用在各种实验室和实地的疫苗接种实验中(如本文所述)。在此种规模，使用大尺寸的混合容器来容纳较大的体积，并对预先形成的抗原/佐剂复合物与所述PCV2抗原以及水相的其它成分的混合时间进行了调整：这增加至60分钟；pH保持在6.2至7.5之间，并且温育是在室温。还有水相的体积和抗原批次的体积不同，以匹配所使用的抗原批次的效力。显然，这些体积的乳化也使用大规模的匀化器(Dispax Reactor，IKA)来进行。
继续实验以优化本发明方法的用于预形成抗原/佐剂复合物的条件。例如，通过改变温育的温度和持续时间、混合物的pH、以及氢氧化铝佐剂对M.hyo抗原的比例。
用于测试M.hyo抗原是否以及有多少已经吸附至氢氧化铝佐剂的样品，取自乳化之前的水相，并进行离心以及测试上清和团块。当疫苗制备为水包油乳剂时，这也可以使用最终疫苗的样品来完成。
4. 用于形成抗原/佐剂复合物的不同条件的作用
如上文所述制备M.hyo/PCV2组合疫苗，其中使用由不同的方法制备的抗原组合物：使PCV2抗原，在M.hyo抗原和氢氧化铝佐剂之间复合物的形成期间，存在或不存在。通过在实验动物中测试这些疫苗，这允许比较不同的方法对所述M.hyo抗原效力的作用。
4.1. 材料和方法
使用(最终疫苗体积的) 5%的10x浓缩批次的M.hyo菌苗、和(相当于商业PCV2疫苗中的)标准量的PCV2抗原，制备了抗原组合物。根据以下方案制备疫苗：
| 疫苗 | M.hyo抗原输入(v/v) | PCV2抗原量(AU)/剂量 | 氢氧化铝复合物形成： |
| A | 5% | - | M.hyo |
| B | 5% | > 2800 | M.hyo + PCV2 |
| C | 5% | > 2800 | M.hyo |
在吸附步骤之后，添加了水相的其余成份，随后添加油相并乳化，以获得最终疫苗产品。所述疫苗储存在2-8℃备用。
随后，将4组的8只小猪用于疫苗接种-攻击实验：三组各接受特定疫苗之一，一组用作未经疫苗接种的对照组。这三种疫苗作为2 ml的剂量在三周龄经肌肉内施用。
4周后，在7周龄，所有的猪在连续的两天通过气管内滴注5 ml的Friis培养基中的毒性M.hyo分离物的培养物进行攻击。又3周后(在10周龄)，对猪进行尸检并根据Goodwin等级表对实变的M.hyo肺部病变进行评分。
在实验期间，在疫苗接种时、在攻击时、以及在尸检时，获取用于血清学的血液样品。使用ELISA，确定了抗PCV2抗体水平(以任意单位计)。
4.2. 结果
表1：M.hyo 肺部病变评分的结果和PCV2血清学结果
* ：病变评分显著不同于对照(p<0.05，Mann-Whitney U检验)。
如表1中所示，用M.hyo单一抗原疫苗A的疫苗接种导致了M.hyo-诱导的肺部病变的严重性(与未经疫苗接种的对照猪中病变的严重性相比)显著降低66%。此疫苗与M+Pac商业产品相当。然而，对于从抗原组合物制备(其中，在复合物形成期间存在M.hyo抗原和PCV2抗原二者)的疫苗B，这是在根本上不同的：此疫苗仅诱导了30%的肺部病变减少。对于疫苗C，M.hyo的疫苗效力恢复至58%的肺部病变减少，这基本上是单一抗原疫苗的水平；此疫苗是由根据本发明方法制备的抗原组合物制备的。
对于PCV2抗体水平：在疫苗接种时，所有组中的猪都具有针对PCV2抗原的母体衍生的抗体。这些母体抗体在接受疫苗A的组和在对照组中衰退。接受包含PCV2抗原的疫苗B或C的组，显示了保护性水平的血清应答。在它们之间没有显著差异，表明PCV2疫苗效力与抗原吸附至氢氧化铝佐剂的方式不相关。
4.3. 结论
取决于抗原组合物所制备的方式，针对M.hyo感染的疫苗效力存在清楚且显著的差异：与预先形成M.hyo抗原/氢氧化铝佐剂复合物，之后再添加PCV2抗原时相比，当M.hyo抗原吸附至氢氧化铝期间存在PCV2抗原时的功效仅为一半。
5. 对即用型PCV2/M.hyo疫苗的安全性和效力的延伸测试
下文描述的研究的目标是评估新的Porcilis PCV M Hyo疫苗，在实验室和实地条件下的效力和安全性。
5.1. 材料和方法
5.1.1. 疫苗
所测试的疫苗包含M.hyo菌苗抗原，杆状病毒-表达的PCV2 ORF2 VLP抗原，和Emunade 佐剂，如上所述。所述疫苗作为单一的2 ml剂量经肌肉内施用至3周龄小猪的颈部。
5.1.2. GLP安全性试验
2组的12只健康SPF猪用Porcilis PCV M Hyo在19-21日龄进行疫苗接种(疫苗接种组)或者用磷酸盐缓冲盐水注射(对照组)。直至疫苗接种后14天，每天观测小猪的异常全身或局部反应。在疫苗接种前一天、就在疫苗接种之前、疫苗接种后4小时、以及疫苗接种后4天每天记录直肠温度。在疫苗接种后14天，处死所有动物用于检验注射部位。
5.1.3. 免疫和攻击实验
在实验攻击研究中，对两种疫苗抗原的每一种测定免疫性的出现(OOI)和免疫性的持续时间(DOI)。在每个实验中，将来自猪群的在疫苗接种时没有M.hyo且PCV2血清阳性的3周龄的猪随机分成两组(疫苗和对照) (PCV2 OOI/DOI：每组15只猪，M.hyo OOI：每组19只动物，DOI：每组40只猪)。就在疫苗接种前、在攻击时、以及在攻击后2周(仅PCV攻击研究)和3周，获取血液样品。为了测定DOI，还在疫苗接种和攻击之间，以规律的间隔获取血液样品。
通过在5周龄或25周龄鼻内滴注(每个鼻孔3 ml，具有大约10^6 TCID50)近期的荷兰的PCV2流行分离物(field isolate)来完成PCV2攻击。PCV2攻击之后3周，对所有的猪进行尸检，并收集肠系膜和腹股沟淋巴结、扁桃体和肺以用于PCV2病毒负载的定量。
使用10 ml的丹麦流行分离物(由哥本哈根国家兽医实验室N. Friis博士提供，包含大约10^7颜色变化单位/ml (CCU/ml))的培养物，在7周龄或24周龄连续两天于气管内进行M.hyo攻击。攻击后3周，对猪进行尸检以评估肺部病变，其如Goodwin等人(上文)所述进行评分。
在所有研究期间，每天观测所述猪的临床异常。
5.1.4. 现场试验
现场安全性试验在两个荷兰的猪农场和一个德国的农场依照随机的和盲选的设计在年幼小猪中完成。在每个农场，将至少56只健康3周龄哺乳小猪(17-24天大)随机分配至两个组之一。一个组中的小猪(疫苗)用Porcilis® PCV M Hyo进行疫苗接种，而另一组中的小猪(对照)用无菌缓冲盐水注射。在登记时(疫苗接种之前一天)、就在疫苗接种之前，疫苗接种后1和4小时、以及每天检查进行14天，对小猪的整体健康进行了检查。在疫苗接种之前一天、就在疫苗接种之前、疫苗接种后4小时、以及疫苗接种后每天测量进行4天，对所有小猪的直肠温度进行了测量。在疫苗接种后1小时和4小时、以及接着每天检查进行14天，通过触诊对注射部位检查局部反应。所有的研究，在登记时(-1日)、以及在研究的结束时(疫苗接种后21天)对小猪进行个别称重。
还在患有M.hyo和PCV2现场感染的法国猪群，根据对照的、随机的、和盲选的设计，进行了组合的现场安全性和效力研究。将健康的3周龄哺乳小猪在窝内随机分配至两个组的每组300只小猪中的一组。一个组中的猪(疫苗)用Porcilis® PCV M Hyo进行疫苗接种，而在另一组中的猪(对照)用无菌缓冲盐水注射。主要效力参数是在屠宰时的肺部病变、PCV2 病毒血症 和增肥期间的平均每日增重(ADWG)，(也即疫苗接种后7-19周(wpv)之间)。次级参数是整体ADWG (也即疫苗接种和19 wpv之间)、死亡率、发病率、胸膜炎病变和PCV2脱落。还确定了对疫苗接种或现场感染的血清学应答。在疫苗接种时、在转移至肥育单元(finishing unit)时、以及在屠宰之前对猪进行个别称重。对用药进行记录并且研究期间死亡的猪经事后检验以确定死因。在屠宰时对肺部进行个别地检验，以对典型的M.hyo病变和胸膜炎的严重性进行评分。每个处理组25只小猪取血用作血清样品，并且每4周取肛门和鼻拭子。虽然安全性并不是此研究的主要目标，研究者在疫苗接种时，以及作为一组，在疫苗接种后4小时、和1、4、7、和14天后，常规地观测动物。
5.1.5. 血清学
对于M.hyo 血清学，根据制造商的说明使用商业ELISA (M.hyo Ab测试，IDEXX)。结果表示为负的、整的、或无结论的。
对于PCV2血清学，如此前所述那样进行内部的ELISA (Haake等人，如上文)。
5.1.6. PCV2 DNA的定量
通过此前所描述的qPCR(Haake等人，如上文)，对血清中、淋巴器官中、肺部、和分泌物中PCV2病毒的负载进行了定量。
5.1.7. 统计学分析
在PCV2攻击后收集的血清样品qPCR数据的曲线下面积(AUC)通过线性梯形公式进行了计算，并通过Wilcoxon Rank Sum检验进行了分析。攻击实验中的肺部病变得分和腹股沟和肠系膜淋巴结、肺部和鼻孔的qPCR数据也通过Wilcoxon Rank Sum检验进行了分析。
在现场研究中，在用ANOVA分析前将AUC数据排序(将疫苗接种组、生产批次以及其相互作用作为固定的效应)。使用混合模型ANOVA在组之间对现场研究中的肺部病变得分进行了比较。将疫苗接种组、生产批次以及其相互作用包括在内作为固定的效应，而母猪作为随机的效应。通过Cochran Mantel Haenszel方法在疫苗接种组之间比较了具有胸膜炎(缺乏或存在)的猪的比例、死亡率和发病率(以生产批次作为分类变量)。使用混合模型ANOVA在组之间比较了平均日增重。将具有适当相互作用的疫苗接种组、生产批次以及性别包括在内作为固定效应，而母猪作为随机效应。将登记时的体重包括在模型中作为协变量。将具有局部或全身性反应的猪的数目与Fischer精确检验进行比较。
5.2. 结果
5.2.1. 安全性试验
所有安全性研究的组合结果在表1中进行了总结。
在GLP安全性研究中，没有动物发展出局部或全身性的反应，并且在尸检时并未在注射部位观测到宏观的异常。在疫苗接种后4小时，经疫苗接种动物的直肠温度平均比对照动物中高1.1℃ (p<0.001)，但是在疫苗接种次日恢复正常。
在现场安全性研究中，处理导致了局部注射部位反应，其中在13%的疫苗接种组中1 cm的最大直径和在4%的对照中0.3 cm的最大直径。这些局部反应仅在疫苗接种后4小时观测到，并且在次日消失。在处理后偏离正常整体健康的小猪数目在两组中都是相似的(对于疫苗接种组和对照分别是6%和5%)。疫苗接种后4小时在疫苗接种组中测得了平均直肠温度高1.1℃ (p<0.0001，40.6℃对比39.5℃)，其在疫苗接种后的那天就恢复到正常。在处理后的三周观察期期间，组之间的增重没有差异。
在现场的安全性和效力研究中，在两组中都有大约1%的猪观测到了局部的反应。在疫苗接种组中局部反应的最大尺寸为2 cm而最大持续时间为一天。在3%的疫苗接种组和1%的对照中观测到从正常的整体健康偏离。一些动物在疫苗接种后4小时显示出了不适的轻微症状。
5.2.2. 攻击实验
在疫苗接种和攻击之间的期间并未出现可与处理相关联的临床异常。然而，一些经疫苗接种的和对照的猪在所述研究期间有跛足，最可能的是由于猪链球菌的感染。所述PCV2攻击感染并未导致任何临床症状，但是qPCR数据清楚地显示出各种淋巴组织和肺部的感染(图1)。平均病毒负载一般而言比经疫苗接种的猪中低2至3 log10的数量级，并且组之间的差异是统计学显著的(p<0.05)。
对于Porcilis® PCV M hyo a PCV2，大约3 Log2和更高的特异性抗体效价与病毒负载的显著减少相关联。在这些实验中，疫苗接种还在疫苗接种后导致针对PCV2的清楚的抗体应答，而对照组在母体抗体效价退化后脂质攻击时保持血清学阴性。在攻击之后，疫苗接种组发展出了回忆应答而对照组中的动物开始血清转化。
在M.hyo攻击实验中还发现了疫苗接种之后的血清应答，其中84%的动物在4 wpv为血清阳性以及97%的动物在21 wpv为血清阳性(图2)。几乎所有的对照动物对攻击感染有血清学应答。在攻击后三周的尸检时，中位M.hyo-诱导的肺部病变比疫苗接种组低77%(OOI研究)和50% (DOI研究) (p<0.05)。
5.2.3. 现场效力研究
在现场研究中的PCV2血清学特征(图3)表明了在8至12 wpv之间的PCV2现场感染。实际上，在疫苗接种后8周，在对照动物中可以低量检测到PCV2的存在，在12 wpv于鼻和粪便排泄物中以及在16 wpv于血清中达到峰值。然而，相较于对照动物，经疫苗接种动物的病毒负载(计算为AUC)在血清中、鼻中、和粪便排泄物中分别显著降低了79% (p<0.0001)、70%(p<0.0001)、和55% (p=0.0159)。
如图4中所示，46%的经疫苗接种的动物在4 wpv变成M.hyo血清阳性。在16 wpv观测到M.hyo血清阳性对照动物。在屠宰时，疫苗接种组中的肺部病变得分比对照组动物中低46% (p<0.0001)。具体而言，具有严重肺部病变(得分>10)的动物的百分比降低了56%。具有胸膜炎的动物数目在疫苗接种组中较低(32%对比39%)，但是此降低在统计学上并不显著(p=0.121)。
另外，用Porcilis® PCV M Hyo疫苗接种在增肥期间诱导了比对照动物高34 g的ADWG (p<0.0001)以及在整个研究期间诱导了比对照动物高19 g的ADWG (p=0.0019) (表3)。虽然在疫苗接种组中发病率和死亡率都更低，但是与对照的差异在统计学上并不显著。
5.3. 讨论
本研究支持了新Porcilis® PCV M Hyo疫苗可以安全地施用至3周龄的小猪。全身性反应的频率很低并且因为这些反应在注射盐水的对照组中也有观测到，它们看起来更加与处理(2 ml体积的注射)相关，而不是疫苗接种的结果。疫苗接种在幼猪期对于猪的生长并不具有负面的作用，并且局部反应是小且暂时的。在疫苗接种后4小时观测到大约1℃得直肠温度平均提升。然而，由于温度在第二天就恢复了正常，以及由于另外动物的整体行为和饲料摄取(在现场研究中疫苗接种后的3周或7周通过体重来测量)都未受影响，因而此直肠温度的短暂提升是可接受的疫苗相关发现。还有，此种1℃的平均提升在根据EuropeanPharmacopoeia monograph 2448 (猪地方性肺炎疫苗(灭活的))允许的1.5℃的限度之内。
实验攻击研究表明免疫性的发作早在疫苗接种后2周(PCV2)至4周(M.hyo)就发生了，并且持续至少21 (M.hyo)至22 (PCV2)周。这是通过淋巴器官和肺部中PCV2病毒负载的显著减少以及M.hyo特异性肺部病变的显著减少而得以证实。因此，3周龄动物的单一疫苗接种可以在肥育期针对PCV2和M.hyo感染而对增肥中的猪进行保护。
在现场效力试验中确认了在攻击实验期间进行的观测：测量到了PCV2病毒负载和M.hyo-诱导的肺部病变的巨幅减少。所述现场效力研究显示出，用Porcilis® PCV M Hyo疫苗接种不仅降低了血清中猪病毒负载的水平，还缩短了感染后病毒经鼻和粪便途径排出病毒的时间。在现场研究中遭遇的PCV2感染主要是亚临床的，但是在猪群中观测到了作为M.hyo感染症状的咳嗽。
在现场效力研究中动物的血清学和病毒学特征表明，PCV2感染在大约8 wpv开始，并且在12-16 wpv之间观测到M.hyo血清应答动物数目的增加。考虑到针对M.hyo的血清转化一般在感染后约3-4周发生，血清学特征表明了M.hyo感染与PCV2感染的峰值是在大致相同的时间(12-16 wpv，对应于15至19周龄)。在PCV2和M.hyo双重感染的情形中，PCV2已经显示出加强了M.hyo病变的严重性，以及M.hyo已经显示出加强了PCV2病毒血症的严重性。而针对两种病原体之一单独的疫苗接种不足以就两种病原体的双重感染而对动物提供保护。因此共感染对动物状况的作用，通常比两种病原体任何单独的都更加剧烈。在现场研究中通过在肥育期期间(10至22周龄之间的时间段)高34 g的ADWG，而反映出组合PCV2-M.hyo疫苗针对这些协同疾病效应的优势。
5.4. 结论：
安全性：
- 疫苗接种在疫苗接种那天导致了中等的温度提升以及在低百分比的经疫苗接种的猪中轻微的全身性和局部反应。
- 所观测到的局部反应是小的(最大2 cm)且短暂的(最多1天)。
效力：
- 在用个体病原体进行的短期(免疫性的发作)和长期(免疫性的持续时间)攻击研究中，PCV2/M.hyo组合疫苗显著降低了血清、淋巴组织和肺部中的PCV2负载，以及M.hyo诱导的肺部病变。
- 在对PCV2和M.hyo都出现的农场进行的安慰剂对照现场试验中，小猪在3周龄的疫苗接种导致了PCV2病毒血症和脱落的减少，并降低了屠宰时的肺部病变得分。
- 还有，观测到了在育肥期，来自疫苗接种对平均每日增重的正面作用(+ 34 g/天)。
5.5. 表格：
表2：PCV2/M.hyo组合疫苗的安全性分析
表3：在用PCV2/M.hyo组合疫苗进行的现场效力试验 中实验动物及其状况的描述性数据
1. 疫苗组减对照组。
6. 用于M.hyo抗原结合至氢氧化铝佐剂的条件的作用
6.1. 介绍
在进一步的研究中，改变M.hyo抗原结合至氢氧化铝佐剂的条件，以测试其对于抗原/佐剂复合物形成效率的作用。
具体而言，通过小规模制备许多完整的o/w疫苗制剂，研究了温度、pH、和氢氧化铝的量对于M.hyo抗原的结合的影响。接着，在完整疫苗乳剂中、以及在疫苗乳剂离心后团块或上清的样品中，确定了结合至抗原/佐剂复合物的M.hyo抗原的相对量。
6.2. 材料和方法
6.2.1. 疫苗乳剂制备
不同疫苗制剂的制备基本上如实施例3中所描述的。从M.hyo或PCV2抗原的标准批次，将M.hyo抗原添加至6 % (w/v)的浓度以及将PCV2抗原添加至2500 U/ml的终浓度。在不同条件下制备了20 ml的疫苗乳剂，参见表4。制备之后，将所有的疫苗储存在2-8 ℃直至测试。
表4：不同疫苗参数的变化
6.2.2. 样品制备
以低g值将10 ml的疫苗离心(以600 xg，20分钟)，并去除上清(8.5 ml)。从样品编号7仅能去除7.5 ml的上清，因为团块由于较高的氢氧化铝的量而具有较大的体积。用一定体积(等于已经去除的上清体积)的0.9%生理盐水将团块重悬并均质化，以便能够比较相同体积的‘团块’和上清。
6.2.3. M.hyo抗原定量
测试样品中M.hyo抗原的量可以用标准Elisa进行测量(对于上清和对于团块样品都是如此)。用计算机程序来完成从所测量的OD计算抗原量。每种样品测试两次，并且个体混合物的疫苗、团块和上清在一个微滴定平板上同时进行测试。表5中给出的结果是每个双份的平均值。团块和上清的相对效力单位(RPU)值，是相对于M.hyo抗原在其各自的完整疫苗乳剂中的量(设定为100%)来进行计算的。
6.3. 结果
以低g值进行样品的离心；这足以使氢氧化铝沉淀成丸，而不会使所述M.hyo抗原(不依赖于其结合至佐剂)沉淀成丸。还有在这些低g值，上清依然由水包油乳剂组成。
为了验证所述离心不是太过强劲，通过直接将M.hyo和PCV2抗原与空Emunade o/w乳剂混合来制备了对照样品，随后立即以同样的低g值进行离心。这些对照样品的结果证明了在这些条件下，M.hyo抗原本身并未有显著水平的沉淀：在此团块中检测到的13%的M.hyo抗原，仅仅代表了所测试疫苗总体积中团块的体积(10 ml中的1.5 ml)。
除了在pH值或温育温度有偏差的样品，其它样品具有6.8至7.3之间的pH，并且实验时的环境温度为22℃。
标准条件为：在环境温度、在6.5至7.5之间的pH、以及用9.8 w/w %的氢氧化铝佐剂，O/N温育。
在各种样品的团块和上清中测量的M.hyo抗原的百分比RPU在表5中示出。对于温度和pH，未观测到其对M.hyo抗原结合至氢氧化铝佐剂有显著的影响。对于这些条件，在氢氧化铝相中检测到的M.hyo抗原的相对量为74 - 82 %。
然而，乳剂中氢氧化铝的量的确有显著的影响：从9.8降低至5% w/w，几乎将团块中M.hyo抗原的相对量减半(48%)，而将氢氧化铝的量提升至25%显示出所述M.hyo抗原几乎完全的结合(96%)。
表5：存在于团块和上清中的M.hyo抗原的相对百分比
6.4. 结论
随着结合的温度或pH条件的改变，没有发现M.hyo抗原至氢氧化铝的结合的显著差异。发现了在结合时的氢氧化铝量变化的作用。
附图说明
图1：PCV2攻击研究的结果：免疫性的出现和的持续时间，表示为抗-PCV2抗体效价、以及PCV2病毒负载，如通过qPCR检测的。
图2：M.hyo攻击研究的结果：免疫性的出现和的持续时间，表示为抗-M.hyo抗体效价、以及肺部病变得分。
图3：来自现场效力研究的PCV2数据：来自现场效力研究的结果，其中在实验的8至12周之间遇到PCV2现场感染。结果由血清学和病毒DNA检测给出。
图4：来自现场效力研究的M.hyo数据：来自现场效力研究的结果，其中在实验的12周左右之间遇到M.hyo现场感染。结果由血清学和肺部病变得分给出。
Claims (13)
1.制备用于猪的即用型组合疫苗的抗原组合物的方法，所述组合物包含猪肺炎支原体(M.hyo)和2型猪圆环病毒(PCV2)的抗原，其特征在于，所述方法包括将PCV2抗原与吸附至氢氧化铝佐剂的M.hyo抗原的预先形成的抗原/佐剂复合物混合的步骤，其中通过以下步骤预先形成所述抗原/佐剂复合物：
a. 在所述氢氧化铝佐剂带正电的pH下，将所述氢氧化铝佐剂和所述M.hyo抗原在含水载体中混合，
b. 温育步骤a的混合物，以允许所述M.hyo抗原吸附至所述氢氧化铝佐剂并形成抗原/佐剂复合物。
2.权利要求1的方法，其特征在于，应用选自以下的一种或多种或全部条件：所述M.hyo抗原是M.hyo菌苗；所述PCV2抗原由PCV2 ORF2所编码；由PCV2 ORF2所编码的抗原是类病毒颗粒；步骤a的含水载体是平衡的盐溶液；步骤a的含水载体的pH在6-8之间；步骤a的混合物基本上不含其它成分；步骤b的温育进行10-20小时，步骤b的温育是在室温；以及：步骤b的温育包括将温育的混合物轻柔搅动。
3.可通过权利要求1或2的方法获得的抗原组合物。
4.权利要求3的抗原组合物，其特征在于，至少50%的所述M.hyo抗原位于所述抗原/佐剂复合物中。
5.权利要求4的抗原组合物，其特征在于，所述氢氧化铝佐剂的至少50%的蛋白结合能力被所述M.hyo抗原使用。
6.用于猪的即用型疫苗，其用于预防或减少M.hyo或PCV2的感染及疾病的相关症状，所述疫苗包含可通过权利要求1或2的方法获得的抗原组合物，或权利要求3-5中任一项的抗原组合物，以及另外的佐剂。
7.权利要求6的疫苗，其特征在于，所述疫苗是水包油乳剂并且所述另外的佐剂是矿物油。
8.权利要求6或7中任一项的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含另外的抗原性材料，所述抗原性材料源自对猪有致病性的微生物。
9.用于制备权利要求6的疫苗的方法，其包括将可通过权利要求1或2的方法获得的抗原组合物，或权利要求3-5中任一项的抗原组合物，与另外的佐剂混合的步骤。
10.用于制备权利要求8的疫苗的方法，其包括将可通过权利要求1或2的方法获得的抗原组合物，或权利要求3-5中任一项的抗原组合物，和矿物油，乳化成水包油乳剂的步骤。
11.可通过权利要求1或2的方法获得的抗原组合物，或权利要求3-5中任一项的抗原组合物，其用于猪的疫苗，所述疫苗用于预防或减少M.hyo或PCV2的感染及疾病的相关症状。
12.可通过权利要求1或2的方法获得的抗原组合物，或权利要求3-5中任一项的抗原组合物，在制备用于预防或减少M.hyo或PCV2的感染及疾病的相关症状的疫苗中的用途。
13.权利要求中6-8任一项的疫苗，或可通过权利要求9或10中任一项的方法获得的疫苗在制备用于预防或减少猪中的M.hyo或PCV2感染及疾病的相关症状的药物中的用途。
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