JP2017537123A - 即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンのための工程 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための豚用の即時使用型ワクチンを調製するために使用し得る抗原組成物の調製のための工程を記載する。本工程は、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されたＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の予め形成された抗原／アジュバント複合体にＰＣＶ２抗原を混合する段階を含むことを特徴とする。このように、単一または混合感染の何れかのときに、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２による感染および疾患に対して、単回投与後に既に非常に有効であるＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンを調製し得る。また、本ワクチンは、投与時に非常に良好な安全性を有し、即時使用型であり、経済的に採算性がある。

Description

本発明は、獣医学の分野、すなわち、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および豚サーコウイルス２型に対する豚用のワクチンに関する。特に、本発明は、ワクチン抗原を含有する組成物を調製するための新規工程に関する。次に、この組成物は、豚用の有効な即時使用型混合ワクチンの作製を可能にする。さらに、本発明は、新規工程によって得られうる抗原組成物の使用、その抗原組成物から調製されるワクチンならびにこの抗原組成物およびワクチンの様々な方法および使用に関する。

マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） （Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））は、世界中で発生している豚の慢性呼吸器疾患である、（豚）流行性肺炎（ＥＰ）を引き起こす主要な病原体である。以前の文献では、同じ細菌を指す、客観異名：Ｍ．スイニューモニエ（Ｍ．ｓｕｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が使用されていた。この細菌は比較的小さく、細胞壁がなく、モリキュートのクラスに属する。特に、幼若子豚はこの伝染性の強い疾患に対して脆弱であり、伝染は通常、空気感染であるかまたは直接的接触による。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）からの肺疾患は、主に、統合型の肺炎につながる免疫介在性病態である。顕著な毒素を排出しないものの、この細菌は肺繊毛上皮に定着して損傷を引き起こし、繊毛活動の喪失につながる。飼育施設の状態および環境ストレスに依存して、この疾患の最も問題となる結果は、他の細菌およびウイルス性病原体による豚呼吸器系の様々な二次感染に対する素因になることである。これは、いわゆる豚呼吸器病症候群（ＰＲＤＣ）を引き起こし、重度の肺病変を呈する。動物に対する不快感は別にして、ＥＰおよびＰＲＤＣは、成長率および飼料転換率における成績低下によりならびに獣医学的ケアおよび抗生物質使用のためのコストを通じて、養豚業にとって重要な経済的損失を引き起こす（ＴｈａｃｋｅｒおよびＭｉｎｉｏｎ，２０１２，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ，Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｓｗｉｎｅ，１０ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐ．７７９−７９７）。

ＰＲＤＣに関連する他の豚病原体は：ウイルス、例えば豚サーコウイルス２型、豚インフルエンザウイルスおよび豚繁殖呼吸障害症候群ウイルスなど；および細菌、例えばヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）およびアクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などである。

抗生物質は部分的にしか有効ではないので、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）関連疾患および生産性損失に対する主な処置は、好ましくは生後早い時期でのワクチン接種によるものである。総説については、Ｍａｅｓら（２００８，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．２９７−３０９）を参照のこと。一般的に、子豚は、４週齢までに生育用豚舎（ｎｕｒｓｅｒｙ）でワクチン接種を受け、数週間後に免疫促進ワクチン接種を行ってもよい。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）に対するワクチン誘発免疫による疾患制御の正確な機序は完全には理解されていない。ワクチン接種は肺定着または細菌感染を完全に予防することはできないものの、それでも肺定着、肺病変および肺炎などの臨床徴候を実質的に減少させ、脱粒を減少させ、および平均１日体重増加などの経済的成果を回復させることにおいてワクチン接種は有効である。ワクチンの有効性を監視するために、罹患率、肺炎、胸膜炎など、様々な臨床的疾患パラメーターをスコア化し監視し得るが、再分離Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）の検出または定量によっても、例えば血清学、組織学またはＰＣＲなどによっても行い得る。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンの有効性および防御を判定するための一般的な方法は、肺病変の重症度の軽減をスコア化することによる。このような病変は、典型的には、例えばＧｏｏｄｗｉｎスケール（Ｇｏｏｄｗｉｎら、１９６９，Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．４６５−４７６）に基づくような、肺硬化の肉眼的評価によって剖検中にスコア化されるが、このスケールは、ゼロから完全罹患肺に対する最大５５ポイントにまで及ぶ。有効なワクチンを用いると、ワクチン接種動物と非ワクチン接種動物とで攻撃感染の影響を比較した場合、肺病変スコアの５０％を超える低下が観察され得る。このような肺病変スコアの低下は有効な免疫防御に対する指標であり、飼料転換率および平均１日体重増加で測定した場合の豚の健康ならびに豚の生産力を有意に回復させることに相関する（Ｍａｅｓら、２００８，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．２９７−３０９）。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）はインビトロで培養し得るが、必須栄養素そのものを変換する能力を欠く、その小さなゲノムを補うために非常に富栄養性である培地を必要とする。例となるのは、Ｆｒｉｉｓ（１９７５，Ｎｏｒｄ Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２７，ｐ．３３７−３３９）により記載される培地であり、これは、酵母抽出物、動物血清および豚およびウシ起源の様々な抽出物を含有する複雑な培地である。完全に増殖したとき、「バクテリン」型抗原：Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）の死滅全細胞培養抗原を作製するために、通常、化学的または物理学的手段によって、例えばホルマリンを使用して、完全Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）培養物を不活性化する。続いて、不活性化培養物を例えばろ過により濃縮し（例えば１０〜２０倍）、ワクチンの処方に使用し得る。富栄養培地および濃縮物の使用の結果から、このようなＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原は、ワクチンへのさらなる加工に影響を及ぼし得る多くの培地由来タンパク質、脂肪酸などを含有する。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）に対する多くの市販のワクチンが存在し、これらは養豚業の大部分で日常的に使用されている。一般に、これらは、非経口注射によって投与されるアジュバント化（ａｄｊｕｖａｔｅｄ）バクテリンから調製される不活性化ワクチンである。一部の例は、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（商標）Ｍ．ｈｙｏおよびＭｙｃｏＦＬＥＸ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｈｙｏｒｅｓｐ（商標）（Ｍｅｒｉａｌ）、Ｓｔｅｌｌａｍｕｎｅ（商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｅｌａｎｃｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）およびＭ＋Ｐａｃ（商標）（Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）である。

ワクチン作製または開発で使用される周知のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）株は、Ｊ株（ＡＴＣＣ寄託番号２５９３４）、株１１または株２３２である。

これらのワクチンに対して、例えば、使用されるアジュバントのタイプ（鉱油、非鉱油、アルミニウム塩、合成ポリマーなど）、適用しようとする用量（１または２ｍＬ）、ワクチン接種齢（１日齢、７日齢以上、３週齢、６週齢以上など）または投与経路（筋肉内、皮下または皮内）において、いくつかの変更および改良が行われている。

Ｍ＋Ｐａｃワクチンは二重アジュバントであるＥｍｕｎａｄｅ（商標）を含み、これは、水様性担体中に鉱油が分散されている水中油型エマルジョンであり、それにより水様性担体が水酸化アルミニウムアジュバントを含有する。Ｍ＋Ｐａｃワクチンは１９９６年から市販されている。

最近のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンの開発は、免疫促進ワクチン接種を必要としないワクチン、いわゆる「ワンショット」または「シングルショット」ワクチンを提供することによる、投与レジメへの適応である。あるいは、ワンショットまたは２回投与の何れかの投薬に柔軟性があるワクチンが開発され、これはいわゆる可変用量、例えば２回１ｍＬまたは１回２ｍＬである。

油性ベースのエマルジョンアジュバントに次いで、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンに対するアジュバントとしてアルミニウム塩が使用されてきた。アルミニウム塩は周知のアジュバントであり、ヒトのワクチンの場合、これらは主なタイプのアジュバントである。次のような様々な塩が使用されている：結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯ（ＯＨ））である「水酸化アルミニウムアジュバント」；非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェート（Ａｌ（ＯＨ）_ｍ（ＰＯ_４）_ｎである「リン酸アルミニウムアジュバント」；および非晶質アルミニウムヒドロキシサルフェート（ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２）である「硫酸アルミニウムアジュバント」または「ミョウバン」。最後の２つのタイプは、ヒドロキシル基をそれぞれリン酸基−硫酸基で置換することによる、オキシ水酸化アルミニウムの誘導体である。概説については、ＨｅｍおよびＨｏｇｅｎＥｓｃｈ（２００７，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．６，ｐ．６８５−６９８）を参照のこと。

アルミニウム塩アジュバントの作用機序は完全に理解されておらず；基本的には、アルミニウム塩への抗原の吸着およびワクチン接種された標的の体内でのそれらの放出である。抗原のアルミニウム塩への結合は、物理学的捕捉などの異なる種類の会合の結果であるが、反対に荷電した分子間の静電相互作用の結果でもある。さらに、共有結合は陰イオン性リガンド交換を通じて生成され得、それにより、抗原からのリン酸基がアルミニウム塩上のヒドロキシル基と置換する。これらの異なるタイプの会合を通じて、抗原およびアルミニウム塩アジュバントは複合体を形成し、ここで結合抗原は修飾構造を有し得るが、また安定化もなされ得る。

標的の体内で、アジュバント−抗原複合体は間質液中の条件および酵素によって分解され、抗原は解離して免疫系にとって利用可能となる。これにより、アルミニウム塩は、抗原提示細胞による抗原の取り込みを刺激する。また、アルミニウム塩は強力なＴｈ２反応、即ち抗体産生を誘導する（Ｅｘｌｅｙら、２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．３１，ｐ．１０３−１０９）。

水酸化アルミニウムアジュバントにおいて、アルミニウム塩はベーマイト結晶の形態である。これにより、塩が水中で水性コロイド状ゲルを形成する繊維構造になる。これはまた、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ（商標）（Ｒｅｈｅｉｓ）およびＲｅｈｓｏｒｐｔａｒ（商標）（Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）のような製品が市販されている方法でもある。これらの製品は様々な濃度および品質で利用可能であり、結晶のサイズも異なり得；小さい結晶ほど抗原結合能が高い。水酸化アルミニウムアジュバントは約１１のゼロ電荷点を有し、これは１１を下回るｐＨでは正に荷電していることを意味する。結果として、６〜８の間の生理的ｐＨにおいて、アジュバントは負に荷電している抗原タンパク質を吸着し得る（Ａｌ−Ｓｈａｋｓｈｉｒら、１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．４７２−４７４）。

吸着および錯体形成は迅速に開始するが、完全な吸着には数時間かかり得る。吸着レベルはまた、使用されるアルミニウム塩の結合能に依存する。そのタンパク質結合能を定量するために、既知の量の標準タンパク質を用いる結合アッセイを使用し得；水酸化アルミニウムアジュバントの場合、標準的な結合アッセイは、欧州薬局方のモノグラフ１６６４で規定されている。市販の水酸化アルミニウムアジュバントは、一般に生理的ｐＨでアルミニウム１ｍｇあたりアルブミン２．５ｍｇまで結合し得る。

大きな経済的影響を有するもう１つの非常に関連がある豚病原体は、豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）である。概説については、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら（２００９，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．１１５１−１１６３）を参照のこと。ＰＣＶ２は、元来、若い豚で観察された「離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）」の原因病原体として同定された。臨床的徴候および病態には、進行性の衰弱、呼吸困難、頻呼吸および時として黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓおよびｊａｕｎｄｉｃｅ）が含まれる。豚サーコウイルスはサーコウイルス科に属し、約１７６０ヌクレオチドの環状１本鎖ＤＮＡゲノムを含有するキャプシドを有する小型（１７ｎｍ）の正二十面体無エンベロープウイルスを有する。このゲノムは、ごく僅かのオープンリーディングフレームを含有し、そのうちＯＲＦ２は約２８ｋＤａのウイルスキャプシドタンパク質をコードする。これは、主要なウイルス中和エピトープを含有する。

ＰＣＶ２は比較的安定であり、感染力が強い。これは、様々な種類の身体分泌物を介して排出され、豚の群れにおいて水平および垂直方向の両方で広がる。ＰＣＶ２はリンパ球向性であるので、ＰＣＶ２感染によって引き起こされる主な病変はリンパ球欠乏である。これにより免疫抑制が起こり、ＰＣＶ２に感染した動物は二次感染の影響を受け易くなる。その結果、ＰＭＷＳに次いで、ＰＣＶ２は、豚サーコウイルス（関連）疾患（ＰＣＶＤまたはＰＣＶＡＤ）と総称される多くの他の豚疾患症候群にも関与する。最も顕著なＰＣＶＤは、豚呼吸器病症候群、豚皮膚炎およびネフロパシー症候群、生殖障害、肉芽腫性腸炎、先天性振戦および滲出性表皮炎である。

しかし、二次感染の明白な徴候がなければ、ＰＣＶ２感染豚の大部分は疾患の明確な臨床症状を示さない。ＰＣＶ２によるそのような無症状感染は、見かけは健康な豚において成長不良および生産力不良しか示さない。

ＰＣＶ２によって引き起こされるＰＣＶＤの（亜）臨床症状は、通常、３または４週齢以降の豚において観察され得るが、この時期は、子豚が離乳し、防御的な母親由来抗体が減少し始める時期である。

ＰＣＶ２に対して防御するために、市販のワクチンが開発されており、これらは世界中で使用されている。異なるタイプのワクチンは、不活性化全ＰＣＶ２ウイルス（Ｃｉｒｃｏｖａｃ（商標），Ｍｅｒｉａｌ）または不活性化キメラＰＣＶ１／ＰＣＶ２ウイルス（Ｓｕｖａｘｙｎ（商標）ＰＣＶ／Ｆｏｓｔｅｒａ（商標）ＰＣＶ，Ｚｏｅｔｉｓ）に基づくワクチン；または組み換え発現キャプシドタンパク質に基づくサブユニットワクチン（Ｉｎｇｅｌｖａｃ（商標）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標）ＰＣＶ／Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ（商標）ＰＣＶ，Ｍｅｒｃｋ／ＭＳＤ ＡＨ）である。この最後のタイプのワクチンは、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系におけるＰＣＶ２ ＯＲＦ２の組み換え発現によって作製される。発現されたキャプシドは、自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）になる。これは、ウイルスゲノムを欠くことを除き、ネイティブＰＣＶ２ビリオンに似ており、したがって非複製性である。このようなＰＣＶ２ ＶＬＰに基づくワクチンは、水中油型エマルジョンとしてアジュバント化（ａｄｊｕｖａｔｅｄ）され、動物用量あたり約２０マイクログラムのＰＣＶ２ ＶＬＰで既に安全かつ有効であることが実証されている（国際公開第０７／０２８、８２３号参照）。

使用されるアジュバントのタイプに応じて、ＰＣＶ２ワクチンの有効性は、液性または細胞性免疫に対してより大きく基づき得る。力価は、例えば市販のＥｌｉｓａ：Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ ＳＥＲＥＬＩＳＡ（商標）ＰＣＶ２ Ａｂ Ｍｏｎｏ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡを用いて測定し得る。あるいは、Ｈａａｋｅら（２０１４，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６８，ｐ．２７２−２８０）によって記載されているような、社内の間接的Ｅｌｉｓａを使用し得る。

ＰＣＶ２ワクチンは、ＰＣＶ２ウイルスの複製および広がりを減少させる。これは、肺およびリンパ系組織におけるＰＣＶ２ウイルス量を減少させ、リンパ枯渇、ＰＣＶＤおよび感染の水平拡散を防ぐ。結果的に、これによって、死亡率の低下、より良好な平均１日体重増加および飼料転換の向上など、ワクチン接種豚の群れにおける全般的な健康状態および生産力が回復する。

ワクチン有効性および防御は、ＰＣＶ２特異的抗体レベルを決定することによって、または血清もしくは分泌物（口腔、鼻腔、糞便、尿中）におけるＰＣＶ２ウイルス量の検出によって、または、ＰＣＲ、（免疫）組織学、ハイブリダイゼーションを介するまたは血清学的にＰＣＶＤに関与する他の病原体を検出することによって測定し得る。

ワクチン開発のために使用されるＰＣＶ２株は、一般にＰＣＶ２ａ遺伝子型のものであり；これらはまた、ＰＣＶ２ｂ遺伝子型の株に対しても交差防御する。

Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶなどのＰＣＶ２に対する油性アジュバント添加ワクチンは、注射部位で中等度から重度の局所反応を誘発することが報告されている。例えば、ＡｓｔｒｕｐおよびＬａｒｓｅｎ（２０１０，Ｐｏｓｔｅｒ ｎｏ．Ｐ．０４９：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２１^ｓｔ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｃａｎａｄａ，１８−２１ Ｊｕｌｙ）を参照のこと。接種後数日間、最大で数センチメートルの大きさの局所的な腫脹が観察された。しかし、これらの注射部位反応は無痛で一時的であり、したがって許容限度内である。さらに、一貫した全身反応とは相関せず、ワクチン接種の有効性にも影響がなかった。それにもかかわらず、このタイプのワクチンの安全性を改善する余地がある。

ＰＣＶ２感染からの疾患症状は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）による感染によって悪化し得、逆もまた同様である。したがって、豚の有効な防御のためには、良好な豚の健康および経済的採算性を維持するために、ＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）の両方に対するワクチン接種が必要である。したがって、ＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）に対する個別の単一抗原ワクチンを使用して、二重ワクチン接種を適用し得る。しかし、投与を容易にし労働コストを節約するためには、混合ワクチンが好ましい。さらに、若い豚は環境ストレスに非常に敏感であり、したがってそれらを処置する回数を減少させることは、それらの健康および生産力に対して直接的に利益がある。混合ワクチンは免疫促進ワクチン接種を必要としない場合、より良好であり、単回投与で全肥育期間中に複数の疾患を防ぐようになる。

１回の投与で両方の病原体に対するワクチン接種を可能にする、ＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）に対する市販の混合ワクチンが利用可能であり、Ｋｉｍら（２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２９，ｐ．３２０６−３２１２）を参照のこと。例は、Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ（商標）ＰＣＶ−Ｍ（ＭＳＤ ＡＨ）およびＦｏｓｔｅｒａ（商標）ＰＣＶ ＭＨ（Ｚｏｅｔｉｓ）であり、両方とも可変用量投与用の即時使用型混合ワクチンであり、油性アジュバントを含む水中油型エマルジョンである。Ｆｏｓｔｅｒａ ＰＣＶ ＭＨにおける製品リーフレットにおいて、ＰＣＶ２抗原と合わせる前に、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の精製を適用することにより、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原とＰＣＶ抗原との間の干渉を克服したことがＺｏｅｔｉｓによって記載されている。しかし、当業者は、このような精巧な精製が面倒で高価であり、ワクチン製品の経済的実現可能性を低下させることを理解するであろう。

Ｉｎｇｅｌｖａｃ（商標）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ／ＭｙｃｏＦＬＥＸ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）も関連があり、これは水性ポリマーアジュバントを使用する。しかし、この最後のワクチンは即時使用型ではなく、投与直前に個別の瓶からの２つのワクチン成分を現場で混合する必要があり、実用的ではない。

したがって、全てのこれらのワクチンは有効であるものの、安全性、有効性または使い易さに関してさらに適応および改善が行われれば、獣医学の分野に大きな利益がもたらされるであろう。

Ｅｍｕｎａｄｅアジュバント中の実験的ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンが以前に記載されている（Ｅｇｇｅｎら、２０１０、Ｏｒａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｎｏ．Ｏ．０７２：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２１^ｓｔ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｃａｎａｄａ，１８−２１ Ｊｕｌｙ）。このワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）誘発性肺病変（ＮＢ：ｎ＝８であり、異常値に対して補正）のかなり良好な軽減を示し、抗ＰＣＶ２抗体の誘導レベルが、このタイプのワクチンに関して有効であると考えられた。このワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２抗原を空のＥｍｕｎａｄｅ水中油型エマルジョンと混合することによって調製された。著者らは、原理上、ＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を、標的において免疫学的な干渉を伴わない、即時使用型ワクチンに組み合わせ得ると結論付ける。

しかし、このワクチンは、使用されたＰＣＶ２ ＶＬＰ抗原がＣｓＣｌ勾配での超遠心分離によって９０％超の純度に精製されたものであったため、大規模な商業化には適さなかった。これは、安全性を高め、局所部位反応を防ぐために行われた。このタイプの抗原の下流処理は非常に労働集約的で非常に高価であるため、特に費用対効果の高い獣医学ワクチンの分野では、大規模に適用することは経済的に採算性がない。

最近公開された国際公開第２０１４／１８２８７２号は、即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンを記載している。このワクチンは、最初にＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を可溶化し、次いでこれをサポニンと混合し；次にＰＣＶ２抗原を可溶化し、それをＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）／サポニン混合物に添加することによって調製される。最後に、可溶化抗原の混合物を、油性アジュバントまたはアルミニウムアジュバントの何れかと組み合わせる。アルミニウムアジュバント添加ワクチンの調製または使用を記載する例はない。

最近の刊行物から、即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンの開発が依然として非常に困難であることがさらに明らかになっており、現場混合用のＩｎｇｅｌｖａｃ（商標）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ／ＭｙｃｏＦＬＥＸ（商標）ワクチンを製造販売するＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍは、即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンの開発を終了したことを示すプレス声明を最近発表した。これは、安全性および有効性の許容可能レベルを達成できなかったためである。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍの、２０１４年９月１日の企業プレスリリース（ｗｗｗ．ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｎｅｗｓ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｐｒｅｓｓ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／２０１４／０１＿ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ＿２０１４ａｎｉｍａｌ．ｈｔｍｌ）は、次のように発表している。「豚ワクチン市場をリードする製造者である、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈは、新鮮混合豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）／マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））ワクチンに引き続き焦点を置き、ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）即時使用型（ＲＴＵ）ワクチンの組み合わせの開発は続けないことを決断した。

結果として、同社はＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ＲＴＵ研究プログラムを中止した。最初のデータは有望であったが、この場合では、ＲＴＵ設計が、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＦＬＥＸｃｏｍｂｏ（登録商標）プラットフォームにおいて知られている高い有効性および安全性の基準を満たしていないことが時とともに明らかになった。

結果的に、当分野において、有効で安全であり、使い勝手がよく、経済的に採算性があるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２に対する改善された混合ワクチンが必要とされ続けている。

したがって、本発明の目的は、先行技術における欠点を克服すること、および、単回注射ワクチンとして既にＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）によって引き起こされる感染および疾患に対して非常に有効であり、投与時の安全性が非常に高く、即時使用型である、ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンを提供することにより、現場でのこの要求に応えることである。

当初、発明者らは、標準的なＰＣＶ２ ＶＬＰ抗原を使用する場合、Ｅｇｇｅｎら（前出）によって公表されたような結果を得ることができなかったことを知り失望した。このような標準抗原は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶ／Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ＰＣＶワクチンなどの市販のＰＣＶ２ ＶＬＰワクチンにおいて使用されているものである。これは、安全性が許容可能であり非常に有効である。しかし、高度に精製されているのではなく、下流処理のより経済的に採算性のあるレベルで製造される。このように、この抗原は極めて純度が低い。

Ｅｇｇｅｎらによって適用された手順に従って、発明者らは、空のＥｍｕｎａｄｅアジュバントとともに、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンおよびこのような標準ＰＣＶ２ ＶＬＰ抗原の直接的な配合を行った。残念ながら、得られたワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）攻撃感染に対する防御が正常レベルの半分未満であり：肺病変は、Ｅｍｕｎａｄｅ中でＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原のみを有するワクチン（Ｍ＋Ｐａｃ（商標））を使用した場合の６６％軽減と比較して、僅か３０％の軽減であった。結果は本明細書中の以下の実施例セクションで与える。

国際公開第０７／０２８．８２３号 国際公開第２０１４／１８２８７２号

ＴｈａｃｋｅｒおよびＭｉｎｉｏｎ，２０１２，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ，Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｓｗｉｎｅ，１０ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｐ．７７９−７９７ Ｍａｅｓら、２００８，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．２９７−３０９ Ｇｏｏｄｗｉｎら、１９６９，Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．４６５−４７６ Ｆｒｉｉｓ，１９７５，Ｎｏｒｄ Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２７，ｐ．３３７−３３９ ＨｅｍおよびＨｏｇｅｎＥｓｃｈ，２００７，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．６，ｐ．６８５−６９８ Ｅｘｌｅｙら、２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．３１，ｐ．１０３−１０９ Ａｌ−Ｓｈａｋｓｈｉｒら、１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．４７２−４７４ Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、２００９，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．１１５１−１１６３ Ｈａａｋｅら、２０１４，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６８，ｐ．２７２−２８０ ＡｓｔｒｕｐおよびＬａｒｓｅｎ，２０１０，Ｐｏｓｔｅｒ ｎｏ．Ｐ．０４９：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２１ｓｔ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｃａｎａｄａ，１８−２１ Ｊｕｌｙ Ｋｉｍら、２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２９，ｐ．３２０６−３２１２ Ｅｇｇｅｎら、２０１０，Ｏｒａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｎｏ．Ｏ．０７２：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２１ｓｔ ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｃａｎａｄａ，１８−２１ Ｊｕｌｙ。

したがって、発明者らは、ワクチン抗原を含有する組成物の調製に対して特別な工程を適用することによって：Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバントの複合体が形成された後にのみＰＣＶ２抗原を添加することによってのみ、豚用の即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチン中でのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンの有効性が所望のレベルとなり得ることを見出し、驚愕した。

同様に、発明者らは、本明細書中に記載のＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンが、ＰＣＶ２単一抗原ワクチンと比較して、このように有意に改善された安全性プロファイルを示すことを見出し、驚愕した。

この特別に調製された抗原組成物から作製され得るＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンは、単回投与後に既に、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２による感染および疾患に対して非常に有効であり、投与時に非常に良好な安全性を有し、即時使用型であり、高純度ではないＰＣＶ２抗原に適応し得る点で経済的に実行可能である。実際、ワクチンの有効性は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２に対する単一抗原ワクチンの有効性と同等である。また、投与時の安全性は、豚でのその使用時にワクチン誘発性の顕著な局所的または全身的反応が観察されない点で完全である。

このような混合ワクチンが養豚業で使用され得る大規模なものになる可能性を考慮すると、これらの効果および改善は重要であり、大きな商業的意義を有する驚くべき技術的効果に相当する。したがって、このようにして、本発明の目的を満たし得、その結果、先行技術の欠点を克服し得る。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原が水酸化アルミニウムアジュバントに吸着する間、ＰＣＶ２抗原が存在してはならない理由は現在のところ知られていない。また、なぜ新しいＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンの安全性が優れているのかも分かっていない。

本発明者らは、これらの観察を説明し得る何らかの理論またはモデルに縛られることを望まないが、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原と水酸化アルミニウムアジュバントとの間の複合体の形成中にＰＣＶ２抗原が存在する場合、これが、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の水酸化アルミニウムアジュバントへの効率的な吸着を何らかの方法または形態で妨げ得ると推測する。また、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原のようには水酸化アルミニウムアジュバントには結合しないＰＣＶ２抗原は、形成複合体に絡み合い得る。何れにしろ、これは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原に対する後の免疫反応を妨げる。

同様に推測されることは、新しい混合ワクチンの安全性向上の理由である。これは、Ｅｍｕｎａｄｅ二重アジュバント中の成分：鉱油および水酸化アルミニウムアジュバントとこの抗原のある種の相互作用により向上している可能性があり、この相互作用は、アルミニウムなしの油性アジュバント中では起こらない。この相互作用は、さもなければ注射部位反応を引き起こすであろう、ＰＣＶ２抗原中の物質（の効果）を減少させ得る。

したがって、第１の態様において、本発明は、豚用の即時使用型混合ワクチン用の抗原組成物を調製するための工程に関し、本組成物は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））および豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の抗原を含み、該工程は、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されたＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の予め形成された抗原／アジュバント複合体にＰＣＶ２抗原を混合する段階を含むことを特徴とする。

本発明の場合、「即時使用」とは、標的動物への投与に対して準備を整えるために、２つ以上の容器の内容物（の一部）を組み合わせることを必要としないことを意味する。例えば、溶解または混合段階を必要とせず、エンドユーザにとって単一瓶内でエマルジョンとして利用可能である。

即時使用型ワクチンの場合、化合物の必要な配合は制御環境下でワクチンの製造業者によって実施されている。これは、特に多数の動物にワクチン接種する場合に、エンドユーザにとって主に使い易さの点で現場での混合に対して明確な長所を有する。他の長所は、製造業者が無菌条件下で配合を行い得、その正しい組成および品質を保証するために、最終混合物において様々な品質保証試験を適用し得る。

しかし、これは、即時使用型ワクチンが、エマルジョンの沈降またはクリーミングを除去するための手作業での短時間の振盪など、またはワクチンが冷蔵保存されていた場合には投与前に温めるなど、ある種の単純な前処理を必要とし得ることを排除しない。

「豚」という用語は、イノシシ科の動物、好ましくは豚とも呼ばれるイノシシ属の動物を指す。例は、野生または家畜豚、雄豚、イノシシ、バビルサまたはイボイノシシである。これはまた、例えば、雌豚、クイーン（ｑｕｅｅｎ）、成熟雄豚、去勢豚、雄豚、未経産雌豚、離乳直後の子豚または子豚などのそれらの性別または年齢を指す、任意の名称により示される豚を含む。

「マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）」（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））および「豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）」という用語は、それぞれ、その分類学的な群のメンバーの特徴的な特性、例えば形態学的、ゲノム的および生化学的特徴など、ならびにその群の生物学的特徴、例えばそれらの生理学的、免疫学的または病理学的挙動などを示す、細菌、ウイルス微生物を指す。これはまた、例えば亜種、株、単離株、遺伝子型、変異体、サブタイプまたはサブグループなどとして何れかの方法でサブ分類され、それぞれ、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細菌、ＰＣＶ２ウイルスも含む。

両微生物は当技術分野で周知であり、例えば「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍａｎｕａｌ」（１０ｔｈ ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）および「Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ」（１０ｔｈ ｅｄ．，２０１２，Ｊ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら編、ＩＳＢＮ−１０：０８１３８２２６７Ｘ）のようなハンドブックに記載されている。

当業者にとって当然のことながら、本発明に対するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細菌またはＰＣＶ２ウイルスは、現在特定の種および属に分類されているが、これは新しい洞察が新しいかまたは異なる分類群への再分類につながるので、時間が経つにつれて変化し得る分類学的分類である。しかし、これは、微生物そのものまたはその抗原レパートリーを変化させず、変化するのはその科学名または分類だけなので、このような再分類微生物は、本発明の範囲内に留まる。

本発明の場合、微生物の「抗原」は原則としてＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細菌またはＰＣＶ２ウイルス由来の任意のタイプの抗原性物質であり得るが、ただし、それは（単独またはアジュバントを伴うかの何れかで）免疫反応を誘導し得るものとする。好ましくは、個々の抗原性物質は、ワクチン接種された標的豚においてそれが誘導する免疫反応が防御的であるようなサイズ、構造、形態または品質のものであり、すなわちＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減可能であるのに十分な強度のものである。

本発明での使用のための抗原は、不活性化微生物であり得るか、またはサブユニット、抽出物、分画、ホモジネートまたは超音波分解物など、その一部であり得る。抗原は、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質および核酸などの１つ以上のタイプの分子を含有し得る。抗原は、生物学的または（半）合成起源のものであり得、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細菌またはＰＣＶ２ウイルスなど、微生物から直接または間接的に誘導され得る。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の例はバクテリンである。これは、当技術分野で周知の方法に従って、細菌培養物の全体または一部の不活性化によって作製され得る。不活性化は、熱、放射線またはホルマリン、ベータ−プロピオラクトン、バイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）またはベータ−エタノールアミンなどの化学薬品によるなど、任意の適切な技術での処理によって行い得る。次いで、得られるバクテリンは、無傷および損傷の両方の死細菌、細胞断片、細胞内容物および培養中に細胞から分泌される因子、ならびに培地およびその様々な成分からの因子の複雑な混合物である。

ＰＣＶ２抗原の一例は、当技術分野で一般的に適用されるような、例えばウイルスキャプシドタンパク質に基づくサブユニットワクチンである。これは、ウイルスＯＲＦ２ゲノム配列の組み換え発現によって、例えばバキュロウイルス／昆虫細胞系によって産生され得る。次いで、例えば遠心分離を用いて、自己集合ＶＬＰを昆虫細胞培養物から単離し得る。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの変形物）は、本明細書中で使用される場合、全ての要素を、このような要素または組み合わせが明らかに示されない場合でも、その用語が使用される、文章セクション、段落、請求項などによりカバーされるかまたはこれに含まれる、本発明に対して想定できるあらゆる可能な組み合わせを指し；何らかのこのような（１つまたは複数の）要素または組み合わせの排除を指すものではない。結果的に、何らかのこのような文章セクション、段落、請求項なども、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語（またはその変形物）が、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「を主成分とする（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語により置き換えられる１つ以上の（１つまたは複数の）実施形態に関し得る。

「抗原／アジュバント複合体」は、本明細書で定義されるように、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原（の成分）の水酸化アルミニウムアジュバントへの吸着の際に形成される巨大分子構造を指す。この吸着は多くの物理学的および化学的相互作用によって起こるため、したがって、複合体は、化学用語で正確には定義し得ない。複合体の組成および構造はまた、使用された抗原およびアジュバントの組成および特徴にも依存し、ならびにそれが形成された条件からのものである。これは当技術分野で周知であり、現場で受容されている。抗原およびアジュバント、およびそれらの複合体の形成のための条件の必要かつ好ましい特徴は、本明細書中に記載されている。

「予め形成される」という用語は、この用語が指す抗原／アジュバント複合体の形成がより早い時点で起こったことを示す。本発明の場合、これは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原と水酸化アルミニウムアジュバントとの間の複合体が、ＰＣＶ２抗原が組成物に添加される前に形成され、したがって複合体の形成がＰＣＶ２抗原の非存在下で起こることを意味する。

発明者らは、これにより、所与のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原が、ＰＣＶ２抗原の妨害または同時捕捉なくその状況下で可能な限り完全に水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されるようになることを可能にすると推測する。その結果、本発明による抗原組成物から調製されたワクチンにおいて、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原に対する免疫反応が最適となる。

水酸化アルミニウムアジュバントに抗原を吸着させるための一般的な条件は、例えば医薬ハンドブック、（ヒト）ワクチンの製造における行政指令、およびアジュバント製造業者の指示書から当技術分野で周知である。しかし、水酸化アルミニウムアジュバントおよびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原は、高度に定義された組成を有さない。これによって、プロセス条件および本発明の抗原／アジュバント複合体の形成のために得ようとする最終レベルを、非常に具体的に定義することが困難になる。それにもかかわらず、所与のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバントに対して可能な最大吸着を達成するために、生化学者または薬剤師またはそのような技能を有するチームなど薬学的製剤を製造する技術分野の熟練者は、これらの条件を容易に変更し、最適化し得る。次いで、達成された吸着レベルを決定し得、様々な条件および材料の効果を比較し得る。

例えば、水酸化アルミニウム結晶は遠心分離によって容易にペレット化させ得るので、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原が実際に水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されているか否か、および、そうである場合どの程度であるかは、生化学的方法によって好都合に決定し得る。これによって、抗原／アジュバント複合体の形成の程度を示す、そのペレット中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量の決定が可能になり；あるいは、これによって、複合体形成が起こらなかった場合または完全ではなかった場合に、上清中に残存するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量の決定が可能になる。

ペレットまたは上清中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の検出は、実施例で概説するように、抗体に基づく方法を使用して、例えばＥｌｉｓａを使用して行い得る。代替法は、結合Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を全てペレット中の水酸化アルミニウムアジュバントから解離させ、例えば電気泳動を用いて、放出された抗原を分析することである。このような解離は、様々な方法で、例えばｐＨを適合させること、リン酸イオンを使用すること、またはペレットの超音波処理によって可能である。全ては当技術分野で記載されているとおりである。

複合体形成のある一定の条件下で水酸化アルミニウムアジュバントの吸着能が実際にＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によりどの程度使用されたかを試験することにより、さらなる最適化が可能である。これは、定められた量の既知のタンパク質を用いたその後の複合体形成によって、およびどの程度のその試験タンパク質がさらに結合し得るかを決定することによって；例えばＰｈ．Ｅｕｒ．モノグラフ１６６４に記載のような結合アッセイを使用して行い得る。これは、吸着能が使用されていないか、およびどの程度の量が使用されていないかを示す。

所与のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原または所与の水酸化アルミニウムアジュバントについて、抗原／アジュバント複合体中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量が実質的にさらに増加させ得ない場合、例えば吸着のパラメーター、例えば温度、ｐＨ、持続時間または成分の相対量などを適合させることによって、複合体形成は可能な限り完全である。さらに、水酸化アルミニウムアジュバントの結合能がＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によって可能な限り多く使用され、実質的にさらに減少させ得ない場合、複合体形成は可能な限り完全である。

例えば、抗原組成物は、本発明の工程に従って作製し得る。これを遠心分離し得、その後、ペレットおよび上清を個別に試験し得る。ポリクローナルウサギ抗Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗血清を用いることにより、検出可能なＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量に対して、例えばＥｌｉｓａ設定において、上清または再懸濁ペレットの希釈範囲を試験し得る。

ある一定の条件が、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバントの抗原／アジュバント複合体の形成を最適化するのに役立つことが分かった。

したがって、本発明による工程の一実施形態において、抗原／アジュバント複合体は、以下の：
ａ．水様性担体中で、水酸化アルミニウムアジュバントが正に荷電するｐＨにて、水酸化アルミニウムアジュバントおよびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を混合し、そして
ｂ．Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させ、抗原／アジュバント複合体を形成させるために、段階ａの混合物をインキュベートする
段階により予め形成される。

「水様性担体」は、原理上は、任意の水様性の液体であり得るが、ただしそれは、抗原／アジュバント複合体の有効かつ完全な形成を可能にするものとする。好ましい実施形態において、水様性担体は精製水中に緩衝剤または塩のみを含有する比較的単純なものであり、例えば、水様性担体は、平衡塩類溶液などの生理的緩衝液であるか、または生理的塩溶液、別名「生理食塩水」であり；これは周知であり、精製水中０．８５％ｗ／ｖ塩化ナトリウムを有する。本発明の場合、液体がその水の容量または重量の５０％超を構成する場合、液体は「水様性」である。

「精製水」は、好ましくは「注射用水」であり；典型的には、蒸留水、二重蒸留水、精密ろ過水または浸透精製水から調製され、これは滅菌されており、基本的に発熱物質不含である。

当技術分野で知られているように、「正に荷電した」とは、定められる条件下で水溶液中で正味の正電荷を有する化合物に関する。

水酸化アルミニウムアジュバントが正に荷電するｐＨ範囲は０〜約１１であり、１１はゼロ電荷点である。その結果、約１１のｐＨまでの条件において、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は水酸化アルミニウムアジュバントに効果的に結合し得る。しかし、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の幾分かの変性が高ｐＨレベルまたは低ｐＨレベルで起こり得るので、より生理的なものに近いｐＨが好ましい。したがって、水様性担体のｐＨは、好ましくは５〜１０、より好ましくは５．５〜９、６〜８またさらには６．２〜７．８である。最も好ましいのは、約６．５〜約７．５の水様性担体のｐＨである。これらの値でＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は生理的条件で維持されるが、一方で水酸化アルミニウムアジュバントはＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原が効果的に吸着し得るように依然として正に荷電している。

抗原／アジュバント複合体の有効な形成が必要であるものの、「段階ａの混合物をインキュベートする」ための条件もそれほど重要ではない。

発明者らは、水酸化アルミニウムアジュバントへのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の吸着が、両成分が混合された後に迅速に開始するが、完全な吸着を達成するためには十分な時間が必要であることを見出した。したがって、段階ａに記載のように混合物をインキュベートするための好ましい期間は、少なくとも１５分、より好ましくは：好ましい順に、少なくとも０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２４時間である。実際の状況下では、インキュベートは、好ましくは、約１２〜約１８時間の期間に対応する「一晩」行われる。

発明者らはまた、水酸化アルミニウムアジュバントへのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の吸着が、インキュベート温度に対して比較的広い耐容性を有することを見出し；４℃で冷蔵した場合ならびに室温の両方で有効な吸着が観察された。しかし、当技術分野で周知のように、水酸化アルミニウムアジュバントは、結晶構造を損ねるため凍結させることはできない。また、豚の場合は３８〜４０℃の間である、正常な哺乳類の体温よりもはるかに高い温度では、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の変性が幾分起こり得る。したがって、段階ａに記載のように混合物をインキュベートするのに好ましい温度は、約２〜約４５℃の間である。より好ましくは４〜４０℃の間、さらには１０〜３８℃の間である。最も好ましいのは「室温」であり、これは「周囲温度」と呼ぶこともあり、約１５℃〜約３０℃の間である。

水酸化アルミニウムアジュバントであるゲルの粘性特性に対応するために、本発明による工程中の段階ａの混合物のインキュベートは、好ましくは、混合物が運動している間に行われる。しかし、当技術分野で周知のように、水酸化アルミニウムアジュバントの激しい混合は、結晶構造を損傷させ得る。したがって、混合物のある種の穏やかな撹拌が好ましい。一例は、磁気棒を使用して、または穏やかな軌道もしくは振動運動を与える様々な形態の振盪機またはテーブルを用いて撹拌することである。これらは全て一般に利用可能である。本発明の場合、穏やかな撹拌は、２５０ｒｐｍ以下、好ましくは１５０ｒｐｍ以下の撹拌またはスピン運動に対するものであり；１つの「回転」は、開始位置に戻るまで完全な円運動である。振動運動の場合：２００サイクル／分以下、好ましくは１００サイクル／分以下である。１つの「サイクル」は、開始位置に戻るまでの完全な連続上下運動である。

本発明による工程で使用される抗原に関して：
Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は、好ましくは、全培養物から調製されたバクテリンであり；バクテリンは好ましくはＢＥＩで不活性化され；バクテリンは、好ましくは、例えば（限外）ろ過または透析を用いて約１０〜３０倍に濃縮される。論じられるように、バクテリンの組成は正確には分かっていないが、例えば、不活性化時の培養物中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細胞の数を示すことによって特徴評価でき、濃縮時間について補正し得る。本発明の場合、バクテリンの形態であるとき、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は、全培養物中１ｍＬあたり１０＾１〜１０＾１０個のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細胞を含有するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）の培養物に由来する。好ましくは、好ましい順に、全培養物中、１０＾４〜１０＾１０；１０＾６〜１０＾１０；１０＾７〜５ｘ１０＾９の間；および５ｘ１０＾７〜５ｘ１０＾９個のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）細胞／ｍＬの間である。本発明による抗原組成物に対して使用されるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は、このような培養物の不活性化懸濁液から採取される。これは、ろ過または遠心分離によっても濃縮し得る。

好ましくは、段階ａで添加すべきＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量は、本工程によって得られうる抗原組成物の、後のワクチンへの組み込みを考慮して計算される。これは、最終ワクチンがある容量の油性相も含有する場合、抗原組成物中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量について、その後の希釈の分を補うことを意味する。

不活性化および濃縮培養物からのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンの容量は、最終ワクチン組成物の量に対して、１〜５０％ｖ／ｖの間であり得る。好ましくは、この量は、最終ワクチン組成物の容量に対して、好ましい順に、２〜４０％、３〜３０％、４〜２０％または約５〜約１５％ｖ／ｖの間である。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は、好ましくは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）Ｊ株、株１１または株２３２から選択される。より好ましくは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原はＪ株由来である。

したがって、本発明による工程の好ましい実施形態において、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原はバクテリンであり、細胞約１０＾７〜約１０＾９個／ｍＬの細胞密度のＪ株からのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）培養物の化学的不活性化によって調製され、その後、不活性化培養物をろ過により１０〜２０倍に濃縮し、不活性化濃縮培養物は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を含む最終ワクチン組成物の容量に対して約５〜約１０％ｖ／ｖの間で使用する。

ＰＣＶ２抗原は、好ましくはＯＲＦ２でコードされるサブユニットであり、好ましくはＶＬＰの形態である。ＶＬＰ抗原は、好ましくは高度に精製されていない。本発明による工程の段階ｂで混合しようとするＰＣＶ２抗原の量は、好ましくは約２〜約２００μｇ／ｍＬのＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＶＬＰである。より好ましくは、４〜１００μｇ／ｍＬのＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＶＬＰである。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原に関して、添加すべきＰＣＶ２抗原の量は、好ましくは本工程によって得られうる抗原組成物の、後のワクチンへの組み込みを考慮して計算される。これは、最終ワクチンがある容量の鉱油も含有する場合、抗原組成物中のＰＣＶ２抗原の量についてその後の希釈の分を補うことを意味する。段階ｂに添加されるべきＰＣＶ２抗原の量について、これは最終ワクチンが少なくとも２０μｇのＯＲＦ２ ＶＬＰ／用量を含有するようなものである。

ＰＣＶ２抗原は部分的にしか精製されていないので、したがって、これは、遠心分離後の５０〜１０００μｇ／ｍＬの総タンパク質を含有する不活性化昆虫細胞／バキュロウイルス培養物からの試料であり得る。また、実際には、これは、最終ワクチン組成物の容量に対して約３〜約３０％ｖ／ｖの間であるＰＣＶ２抗原の容量を意味する。より好ましくは、最終ワクチン組成物の容量に対して、５〜２５％、さらには約１０〜約２０％ｖ／ｖの間である。

したがって、本発明による工程の好ましい実施形態において、ＰＣＶ２抗原は、ＶＬＰの形態のＯＲＦ２でコードされたサブユニット抗原であり、化学的に不活性化され、遠心分離された昆虫細胞／バキュロウイルス発現培養物から回収され、ＰＣＶ２抗原を含む最終ワクチン組成物中で動物用量あたり少なくとも２０μｇのＯＲＦ２ ＶＬＰを有する。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原とＰＣＶ２抗原との間には、それらのタイプおよび用量あたりの量などにおいて特定の関係はない。結果として、本発明による抗原組成物中のそれらのタイプおよび／または相対量は、必要に応じて独立に変動させ得るが；ただし、それらが抗原／アジュバント複合体の有効な形成を可能にし、有効なワクチン接種効果をもたらすものとする。

本発明による抗原組成物およびワクチンの調製のために使用する必要のあるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２抗原のバッチからの抗原の量を決定するために、典型的にはインビトロ効力アッセイを使用する。これはまた、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２抗原の新しいバッチが必要な抗原質量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｓｓ）を有することを確認するのに役立ち得る。このような内部バッチ放出試験は、通常、抗原質量Ｅｌｉｓａ（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｓｓ Ｅｌｉｓａ）である。これは、例えばウサギの免疫付与により得られる、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２に対して生じたポリクローナル抗血清を用いて、およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２抗原の参照標準を使用して行い得る。参照抗原の効力は、一連のワクチン攻撃実験において決定され、抗原の任意単位のある一定数を所望のワクチン接種の有効性に結びつけ得るようになる。一例は、登録ファイルの文言であり：本発明によるワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原の少なくとも２．７の相対効力単位、および、２ｍＬのワクチン用量あたりのＰＣＶ２抗原の少なくとも２８００の「抗原性単位」を含有する必要がある。本発明によるワクチンに含まれるこれらの抗原量は、本明細書中に記載のようなＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２による激しい攻撃感染に対する有効な防御を確実にするために決定した。

本発明によるワクチンの動物用量あたりの必要効力を得るために、典型的には、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原は５〜１５％の間で使用し、ＰＣＶ２抗原は、これらの抗原を含む最終ワクチン組成物の容量の１０〜２０％の間で使用する。

適切な抗血清および参照標準の調製を含め、このようなバッチ放出試験の開発は、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。

Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原と混合しようとする水酸化アルミニウムアジュバントの量は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の吸着を可能な限り完全にするのに十分である必要がある。一方で、使用される水酸化アルミニウムアジュバントの量は、動物用量あたりのアルミニウム量の許容限度内である必要があり、本発明による工程によって得られうる抗原組成物を用いたワクチンの処方に適合する必要がある。好ましい実施形態において、段階ａの混合物は、約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬのアルミニウム量；好ましくは約０．５〜５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム量に対応する水酸化アルミニウムアジュバント量を含有する。これを達成するために、例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）などの市販の水酸化アルミニウムアジュバント製品を使用し得、これは、ある変形型では「２％」溶液として入手可能である。この名称はやや紛らわしいが、約３％ｗ／ｗ水酸化アルミニウムに対応する約２％ｗ／ｗの酸化アルミニウムおよび約１％ｗ／ｖアルミニウムを含有する製品に由来する。このような製品は、最終ワクチン組成物の容量に対して３〜３０％ｖ／ｖの容量で使用され得る。好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバント製品は、最終ワクチン組成物の容量に対して４〜２０％ｖ／ｖ、好ましくは約５〜約１５％ｖ／ｖで使用される。

したがって、本発明による工程の好ましい実施形態において、抗原組成物は、全て最終ワクチン組成物の容量に対して、５〜１５％ｖ／ｖのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原、５〜１５％ｖ／ｖの水酸化アルミニウムアジュバント製品および１０〜２０％ｖ／ｖのＰＣＶ２抗原の量を含む。

一実施形態において、本発明による抗原組成物は、この抗原組成物から調製されるワクチンの完全な水相に対する基礎として使用される。結果として、調製しようとするワクチンが、例えば１０または２０％の油性相を含むエマルジョンである場合、その水相は最終ワクチン組成物のそれぞれ９０または８０％を形成する。その水相中には、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原と水酸化アルミニウムアジュバントとの複合体、水様性担体およびＰＣＶ２抗原とともに、本発明による抗原組成物が含まれる。本発明による抗原組成物中の様々な化合物の正確な容量は変動し得、例えば、使用されるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２抗原の相対容量は、上記のように使用されている特定の抗原バッチの効力に依存して変動し得る。さらに、ワクチンに対する水相は、充填剤、安定化剤、保存剤、界面活性剤、追加の抗原、およびそこから調製される最終ワクチンの調製に必要な何らかの他の化合物または溶液などの他の成分も含み得る。本発明の場合、そこから調製されたワクチンについての水相の成分の容量の差は、所望の総容量の水相を得るために、水様性担体の容量を適合させることによって補われる。

発明者らは、比較的小さい容量で本発明に対する抗原／アジュバント複合体の形成を行うことが好ましく；これによって、水酸化アルミニウムアジュバントへのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の吸着のために最適な接触が可能となることを見出した。しかし、水酸化アルミニウムアジュバントのゼラチン性のために、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原とある容量の市販の水酸化アルミニウムアジュバント製品のみとの混合物の使用によっては、最良の結果が得られなくなる可能性があり、アジュバントは、通常、ある程度希釈する必要がある。したがって、抗原／アジュバント複合体の形成は、水様性担体も含む混合物中で行われる。

記載のように、この水様性担体は、そこから調製されるワクチンの形成のための水相の容量を調整するためにも使用される。

好ましい実施形態において、本発明に対する抗原／アジュバント複合体の形成は、水様性担体との混合物中で行われるが、複合体の形成中に存在する水様性担体の容量は、後のワクチンに対する完全な水相を形成するために使用されるであろう水様性担体の総容量よりも少ない。これは、ワクチンに対する完全な水相が、ある一定容量Ｘの水様担体を含む場合、抗原／アジュバント複合体の形成のために、水様性担体のその容量Ｘ未満が使用されることを意味し；好ましくは容量Ｘの７５％、より好ましくは、好ましい順に、容量Ｘの５０、４０、３３、３０、２５、２０またはさらに１０％が使用される。次いで、抗原／抗体複合体の形成後、水様性担体の残りの容量を抗原組成物に添加し得る。

本発明者らはまた、段階ａの混合物を可能な限り単純に保つことが、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバントの複合体の形成に有利であることも見出したが、これはつまり、抗原／アジュバント複合体の形成前に、完全な水相を構成する他の成分の何れも混合物中にまだ含まれていないことが好ましいということである。このような他の成分は、充填剤、安定化剤、保存剤、界面活性剤、追加の抗原などであり得る。

結果として、好ましい実施形態において、本発明による工程の段階ａの混合物は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバント（両者は既にある量の水様性担体を含有し得る。）および水様性担体からなる。

最終ワクチンへの乳化前に水相に添加する必要があり得、しかし、好ましくはＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原／水酸化アルミニウムアジュバント複合体の形成後にのみ添加される化合物の例は、エタノールまたはグリセロールなどの安定化剤、追加の抗原またはＴｗｅｅｎ（商標）などの界面活性剤である。

したがって、本発明による工程の好ましい実施形態において、以下の条件のうちの１つ以上または全てが適用される：
−Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原はＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンである、
−ＰＣＶ２抗原はＰＣＶ２ ＯＲＦ２によってコードされる、
−ＰＣＶ２ ＯＲＦ２にコードされる抗原はウイルス様粒子である、
−段階ａの水様性担体は平衡塩類溶液である、
−段階ａの水様性担体のｐＨは６〜８の間である、
−段階ａで使用される水様性担体の容量は、最終ワクチンに対する水相の形成に使用しようとする水様性担体の総容量未満である、
−段階ａの混合物は、他の成分を本質的に含まない、
−段階ｂのインキュベートは１０〜２０時間の間である、
−段階ｂのインキュベートは室温である、および／または
−段階ｂのインキュベートは、インキュベートされた混合物の穏やかな撹拌を含む。

本発明による工程の好ましい実施形態において、抗原／アジュバント複合体は、次の段階により予め形成される：
ａ．生理食塩水中、ｐＨ６．５〜７．５の間で水酸化アルミニウムアジュバントおよびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンを混合し、および
ｂ．Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンの水酸化アルミニウムアジュバントへの吸着を可能にし、抗原／アジュバント複合体を形成させるために段階ａの混合物をインキュベートし、ここで、温度が１５〜３０℃であり、インキュベートが混合物を穏やかに撹拌しながら１２〜１８時間行われる。

本発明の場合、化合物を「本質的に含まない」とは、化合物の何らかの実質的な量を含まないことを意味し、化合物が液体であるか固体であるかに依存して、例えば化合物の１０重量または容量％未満などである。好ましくは、本質的に含まない、とは、含まれるのが、好ましい順に、化合物の、８、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０５、０．０１％未満またはさらに０．００１重量または容量％未満であることを意味する。

当業者にとって当然のことながら、本発明による工程は、本明細書中で特定されるような段階を適用することによって行われ得；これは、時間の順に、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバントを水様性担体中で混合し、抗原／アジュバント複合体を形成させるためにそれらをインキュベートし、予め形成された複合体にＰＣＶ２抗原を添加することであり；これらは全て本明細書で定められるとおりである。

しかし、本工程の開始、工程中または終了時に、例えばこの工程を拡大または最適化するために、１つ以上の段階を追加または挿入することもできる。例えば、段階ｂの後、予め形成された抗原／アジュバント複合体を保存し得るか、または、必要に応じて、例えば遠心分離および再懸濁によって精製し得る。この全てが本発明の範囲内にある。

本発明による工程によって、豚用の即時使用型混合ワクチンの調製のために使用し得る水相の基礎となり得る抗原組成物を作製し得、このワクチンは、単回投与後既に、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および疾患の関連徴候を予防または軽減し得る。

したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による工程によって得ることができる抗原組成物に関する。抗原組成物は、全て本明細書で定められるとおりの、ＰＣＶ２抗原および水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されたＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の抗原／アジュバント複合体を含む。

本発明による抗原組成物は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原および水酸化アルミニウムアジュバントの抗原／アジュバント複合体を含むことにおいて先行技術組成物とは異なり、ここで、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の所与のバッチおよび所与の水酸化アルミニウムアジュバントに対して、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）は、水酸化アルミニウムアジュバントにできる限り完全に吸着される。

したがって、好ましい実施形態において、本発明による抗原組成物は、抗原組成物中に存在するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の少なくとも５０％が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された抗原／アジュバント複合体にあることを特徴とする。

これは試験することによって確認し得：本発明による抗原組成物を１０００〜２０００ｘｇで１〜２分間遠心分離したのち、本明細書に記載のような適切な血清診断法によりＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を検出すると、抗原組成物中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の少なくとも５０％がペレット中にある。

これは、抗原／アジュバント複合体中にあるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量を示すが、ここで、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されている。

好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された抗原／アジュバント複合体中に存在する本発明による抗原組成物のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量は６０％を超え；より好ましくは、好ましい順に、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９を超えるかまたは１００％である。

したがって、好ましい実施形態において、本発明による抗原組成物は、組成物中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の１００％が水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された抗原／アジュバント複合体にあることを特徴とする。

当業者は理解するであろうが、これらのパーセンテージの余数は、遠心分離後の本発明による抗原組成物の上清中に残存するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の存在に適用され：組成物中に存在するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の５０％超がペレット中にある場合、理論上、抗原組成物中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の５０％未満が上清中に存在する。

したがって、一実施形態において、本発明による抗原組成物は、それぞれ、組成物中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の５０％未満が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された、抗原／アジュバント複合体中にはなく：遠心分離後に上清にあることを特徴とする。

好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された抗原／アジュバント複合体にない本発明による抗原組成物のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量は４０％未満；より好ましくは：好ましい順に、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２、１％未満であるかまたは０％である。

本発明の場合、本発明による抗原組成物を特徴付けるための好ましい方法は、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量を決定することによる。

しかし、さらに、本発明による抗原組成物は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によって可能な限り結合能力が使用される水酸化アルミニウムアジュバントを含むという点で、先行技術の組成物とは異なる。

したがって、一実施形態において、本発明による抗原組成物は、タンパク質結合能が、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によって５０％を超えて使用される水酸化アルミニウムアジュバントを含む。

これは、既知のタンパク質の既知の量のさらなる吸着を適用することにより（記載のように）試験し、試験しようとする抗原組成物中でどの程度の既知のタンパク質が追加的に水酸化アルミニウムアジュバントに吸着され得るかを適切な血清診断法によって検出することによって検出し得る。

これは、本発明による抗原組成物中の水酸化アルミニウムアジュバントの未使用タンパク質結合能を示す。

好ましくは、本発明の抗原組成物中の水酸化アルミニウムアジュバントのタンパク質結合能は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によって６０％超；より好ましくは：好ましい順に、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によって７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％超、または１００％に対して使用される。

その最も有利な有用性において、本発明による抗原組成物または本発明による工程により得ることができる抗原組成物は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染の予防または軽減において、および関連する疾患徴候の予防または軽減において有効な豚用ワクチンを作製するために使用され得、安全に使用され、経済的に採算性があり、即時使用型という点で使い勝手がよい。

したがってさらなる態様において、本発明は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための、豚用の即時使用型ワクチンに関し、本ワクチンは、本発明による工程によって得られうる抗原組成物または本発明による抗原組成物および追加のアジュバントを含む。

「追加のアジュバント」は、既に抗原組成物中にある水酸化アルミニウムアジュバントに加えて使用されるという意味で追加的である。この追加のアジュバントは、本発明によるワクチンがＰＣＶ２またはＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）に対する先行技術の単一抗原ワクチンと少なくとも同程度に効果的であることを保証する。

「アジュバント」は、標的の免疫反応を非特異的に刺激する周知のワクチン成分である。多くの様々なアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例は、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマーおよびポリアミン、例えば硫酸デキストラン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）、ピラン、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ（商標）またはＱ−ｖａｃ（商標）である。サポニンおよびワクチン成分は、ＩＳＣＯＭ（商標）中で組み合わせられ得る。

さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどのペプチドは、アジュバントとして使用されることが多く、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（商標）、Ｄｒａｋｅｏｌ（商標）、Ｋｌｅａｒｏｌ（商標）またはＭａｒｃｏｌ（商標）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）など、または軽（パラフィン）油；非鉱油、例えばスクアレン、スクアランなど；植物油またはその誘導体、例えばオレイン酸エチルなどである。また、ＳｅｐｐｉｃからのＩＳＡ（商標）またはＤｉｌｕｖａｃＦｏｒｔｅ（商標）などの併用製品も有利に使用し得る。

アジュバントおよびその使用および効果に関するハンドブックは、「Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．４２，Ｄ．Ｏ’Ｈａｇａｎ ｅｄ．，２０００，Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，ＮＪ， ＩＳＢＮ−１０：０８９６０３７３５５）である。

一実施形態において、本発明によるワクチンは、水性相および油性相のエマルジョンとして調製され；好ましくは、油中水型（ｗ／ｏ）、水中油型（ｏ／ｗ）、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）または二重型オイルエマルジョン（ＤＯＥ）のタイプのエマルジョンである。より好ましいのは、水中油型エマルジョンである本発明によるワクチンであり、それにより好ましくは「追加のアジュバント」は油性相である。好ましくは、油は鉱油である。

油性相は、抗原をゆっくりと放出することによってワクチン接種動物においてデポー効果をもたらし、それにより標的の免疫系の長期刺激をもたらす。このようにして、水中油型エマルジョンであるワクチンは、有利に、水性相からの直接免疫刺激の特性を示し、油性相からの免疫刺激を遅延させる。

したがって、本発明によるワクチンの一実施形態において、ワクチンは水中油型エマルジョンである。

本発明によるワクチンのさらなる実施形態において、追加のアジュバントは鉱油である。

このようなアジュバントは、獣医学用ワクチンの免疫原性に好ましい効果を有することが知られている。

本発明によるワクチンの実施形態において、ワクチンは水中油型エマルジョンであり、追加のアジュバントは鉱油である。

本発明によるワクチンの好ましい実施形態において、鉱油は、Ｍａｒｃｏｌ（商標）（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ）、Ｋｌｅａｒｏｌ（商標）（Ｓｏｎｎｅｂｏｒｎ）またはＤｒａｋｅｏｌ（商標）（Ｐｅｎｒｅｃｏ）などの商品名で市販されている軽油または白色鉱油またはパラフィン油である。

一実施形態において、本発明によるワクチンは、最終ワクチンの容量に対して３０〜８０％ｖ／ｖの間で本発明による抗原組成物を含む。好ましくは、最終ワクチンの容量に対して、好ましい順に、４０〜７５％ｖ／ｖ、４５〜７０％ｖ／ｖ、５０〜６５％またはさらには５５〜６５％ｖ／ｖである。

一実施形態において、本発明によるワクチンは、最終ワクチンの容量に対して、３〜５０％ｖ／ｖの間の量の追加のアジュバントとしての鉱油を含む。好ましくは、最終ワクチンの容量に対して、好ましい順に、４〜４０％ｖ／ｖ、５〜３０％ｖ／ｖ、５〜２０％ｖ／ｖまたはさらには５〜１５％ｖ／ｖの間である。

言うまでもないが、アジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）し、ビヒクル化合物または希釈剤を添加し、本発明によるワクチンを乳化するかまたは安定化する他の方法もまた本発明の範囲内である。

「ワクチン」という用語は、それが組み込む抗原の免疫学的有効量の使用という意味を含む。本発明によるワクチンについての「免疫学的有効量」を構成するものは、所望の効果および使用されているワクチンのタイプの具体的な特徴に依存する。有効量の決定は、例えばワクチン接種後の標的の免疫学的反応を監視することにより、または攻撃的侵入後に例えば標的の臨床徴候および血清学的パラメーターを監視し、これらをワクチン接種せずに攻撃を行った動物で見られる反応と比較することにより、十分に通常の技術者の技術の範囲内に入る。

豚が実際にＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２に感染しているか否かおよびどの程度重症であるかは、疾患の症状に関する常識を使用するかまたは適切な診断ツールを使用して、適格者例えば経験のある家畜飼育者または獣医師などによって確立され得る。

一般に、ワクチンはまた、（重篤な）有害作用を引き起こすことなく、ワクチンの製造、適用または保存に役立つ医薬的に許容可能な担体も含む。このような担体は、本発明による工程において使用されるような水様性担体であり得る。より複雑な形態において、担体溶液は、例えば緩衝液であり得、安定化剤、保存剤またはアジュバントなどの追加の添加剤を含み得る。詳細および例は、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）などの周知のハンドブックに記載されている。

本発明による即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンの例は、２０１５年に上市されるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏ（ＭＳＤ ＡＨ）ワクチンである。このワクチンは、単回投与後でさえも、優れた安全性プロファイルとともに、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２に対するワクチンの有効性など、本発明の好ましい特徴全てを示すことが分かり、これは即時使用型であり、かつ経済的に採算性がある。詳細は、実施例およびＰｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏに対するＣＶＭＰ評価報告書に記載されている（ＥＭＥＡ／Ｖ／Ｃ／００３７９６／００００，１１ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４）。この報告書は、この新規ワクチンが、２〜８℃で２７ヶ月間保存した後でさえ、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２による攻撃感染に対するワクチンの有効性についての基準を満たすことを記載している。多数の実験室および野外ワクチン接種試験において、接種容量に起因する腫脹以外に注射部位反応が観察されず、直腸温の約１℃の一時的および偶発的な上昇以外の全身反応が観察されなかったという点で、約３週齢からの子豚への２ｍＬ用量の筋肉内接種の際に本ワクチンが安全であることが分かった。また、本ワクチンは、ビレアミア（ｖｉｒｅａｍｉａ）、肺およびリンパ組織におけるウイルス量およびＰＣＶ２感染により引き起こされるウイルス脱粒の減少、ならびにＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）感染により引き起こされる肺病変の重症度の軽減が可能であった点で有効であった。さらに、本ワクチンは、仕上げ期間における１日体重増加の喪失を軽減した。誘導されたワクチン免疫は接種後２２週間まで検出可能であり、これは豚の仕上げ期間全体に及ぶ。

したがって、豚における本発明によるワクチンの獣医学的効果は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および何れかの疾患の関連する徴候を予防または軽減することである。これは、本発明によるワクチンが、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２の複製および蔓延を緩和することによってビレアミア（ｖｉｒｅａｍｉａ）および感染のレベルを低下させること；および肺病変、肺炎などの臨床的徴候を軽減またはさらに予防し、ＡＤＷＧおよび飼料転換率の低下を軽減またはさらに阻止することを有するという、治療的および予防的効果を指す。

好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）感染によって引き起こされる肺病変を軽減するため、および／または豚におけるＰＣＶ２によるビレアミア（ｖｉｒｅａｍｉａ）を軽減させるためのものである。

本発明によるワクチンのさらなる有利な効果は、豚の群れにおける、縦方向に子孫への、および水平方向に群れまたは集団内および地理的領域内での、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２の蔓延の予防または軽減である。結果として、本発明によるワクチンの使用によって、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２の有病率の低下に導く。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、地理的領域におけるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２の有病率を低下させ得る。

また、本発明のさらなる態様は、
−集団中または地理的領域におけるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２の有病率を低下させるための本発明によるワクチンの使用、および
−集団中または地理的領域におけるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２の有病率を低下させるための本発明によるワクチン
である。

一実施形態において、本発明によるワクチンは安定化剤も含み得る。これは、ワクチンエマルジョンの特徴を改善するため、分解し易い成分を保護するため、および／またはワクチンの貯蔵寿命を延長させるために役立ち得る。一般に、このような安定化剤は、高分子量の大きな分子、例えば脂質、炭水化物またはタンパク質など；例えば粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、スクロース、トレハロース、スペルミジン、ＮＺアミン、デキストランまたはポリビニルピロリドン、および緩衝剤、例えばリン酸アルカリ金属など、である。

好ましくは、安定化剤は、動物起源の化合物を含まず、またはさらに国際公開第２００６／０９４．９７４号で開示されるように化学的に定義されている。

本発明によるワクチンは、チメロサール、メルチオレート、フェノール化合物および／またはゲンタマイシンなどの保存剤を含み得る。好ましくは、保存剤が使用されない。

本発明によるワクチンは、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは１８ヶ月間またはさらに２４ヶ月間安定である。「安定」しているとは、化学的および物理学的構造の維持、および適切な条件下での長期保存後の生物学的有効性；特にその推奨される貯蔵寿命の終了までのワクチン有効性の維持を指す。

言うまでもなく、本発明によるワクチンの医薬的安定性または有効性に必要とされるかまたは有益な他の添加剤を混合することも、本発明の範囲内である。

本発明によるワクチンに対する標的は豚である。ワクチン接種しようとする標的の年齢、体重、性別、免疫学的状態および他のパラメーターはあまり重要ではないが、ＰＣＶ２またはＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）での何らかの野外感染を防ぐために、健康な非感染標的にワクチン接種することおよび可能な限り早期にワクチン接種することは明らかに有利である。このような感染は若齢で既に確立され得るので、したがって、本発明によるワクチンは好ましくは約３週齢から適用される。

有利に、本発明によるワクチンの有効性は、幼若豚が保有し得る母親由来抗体のレベルに影響されない。

したがって、本発明によるワクチンは、有効なプライミングワクチン接種として役立ち得、これは、後に免疫促進ワクチン接種が続き、それにより増幅され得る。例えば、本発明によるワクチンは、約２〜１０日齢で投与され、約３週間後に再び投与され得、各ワクチン接種は１ｍＬ容量で行われる。しかし、本発明によるワクチンは、単回投与後に既に有効であるので、好ましい実施形態は、約３週齢からの、例えば約２ｍＬの単回用量の投与である。このワクチン接種は、肥育期間全体にわたって豚を防御する。

本発明によるワクチンの豚標的が、繁殖用の雌豚または精子産生ための成熟雄豚など、６ヶ月を超えて維持しようとするものである場合、これらに対して定期的な免疫促進ワクチン接種を年に１回、２回または３回投与し得、例えば雌豚に対しては：各分娩の前に免疫促進ワクチン接種を１回行うが、これは平均して約２．２回／年である。

したがって、本発明によるワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）による、および／またはＰＣＶ２による感染の確立および進行の両方を妨げるので、予防的または治療的処置としてまたはその両方として使用し得る。

本発明によるワクチンの投与用のレジメは、好ましくは、動物へのストレスを軽減し、労働コストを軽減するために、標的豚が必要とし得る他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに統合される。これらの他のワクチンは、それらの登録された使用と適合する方式で、同時、同時的または逐次的な方式で投与し得る。

本発明によるワクチンは、標的動物にとって許容可能である容量で投与し得、例えば約０．１〜約１０ｍＬの容量であり得る。好ましくは、１回の用量は約０．１〜約５ｍＬ、より好ましくは１回の動物用量は０．２〜３ｍＬの間の容量である。好ましくは、筋肉内用量は約１〜約３ｍＬ、好ましくは約２ｍＬであり；皮内用量は約０．１〜約０．５ｍＬ、好ましくは約０．２ｍＬである。

本発明によるワクチンは、当技術分野で公知の方法に従って標的豚に投与され得る。好ましい適用は非経口経路によるものであり、例えば、皮膚への、または皮膚を通じた注射：例えば筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下または皮下などによる。本発明によるワクチンのより好ましい投与経路は、筋肉内投与によるかまたは皮下注射による。さらにより好ましくは、後肢または頸部における筋肉内投与である。

言うまでもなく、適用の最適経路は、使用されるワクチンの仕様および標的の特定の特徴に依存する。

一実施形態において、本発明によるワクチンは、約３週齢からの豚に約２ｍＬの単回用量として筋肉内に投与される。

筋肉内投与に好ましい部位は頸部である。

本発明によるワクチンをさらに最適化することは、十分に当業者の範囲内である。一般に、これはワクチンの有効性の微調整を含み、十分な免疫防御を提供するようになる。これは、ワクチンの、用量、容量または抗原含量を適応させることによって；別の形態または処方でワクチンを使用することによって；ワクチンの他の構成要素（例えば安定化剤または追加のアジュバント）を適応させることによって；または異なる経路、方法またはレジメを介した適用によって、行われ得る。

本発明によるワクチンは、追加の抗原、サイトカインまたは非メチル化ＣｐＧなどを含む免疫賦活性核酸などの他の化合物をさらに含み得る。あるいは、本発明によるワクチンは、有利に、医薬成分、例えば抗生物質、ホルモン、抗炎症薬または抗寄生虫薬と組み合わせられ得る。または、本発明によるワクチンは、それ自体、ワクチンに添加され得る。

本発明によるワクチンは、別の抗原、例えば別の病原体由来の抗原と有利に組み合わせられ得る。このような混合ワクチンの長所は、ワクチン接種のための動物標的の操作が１回しか必要でなく、それによって標的動物に対するワクチン接種ストレスならびに時間および労働コストが低下する一方で、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２に対する免疫反応を誘導するだけでなく、他の病原体に対しても免疫反応を誘導するという点である。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、豚に対して病原性である微生物に由来する追加の抗原性物質を含む。

「追加の抗原性物質」は、それ自体、複製型もしくは不活性化形態、またはサブユニットであり得、アジュバントを伴ってもよいし、または伴わなくてもよい。追加の抗原性物質は、抗原であり得、そして、タンパク質、炭水化物、リポ多糖または核酸分子などの生物学的または合成分子からなり得る。あるいは、それは、他の微生物からの核酸片からの発現産物またはこのような核酸片を含むベクターであり得；このベクターはそれ自体、微生物または真核宿主細胞であり得る。

追加の抗原性物質は、例えば抽出物、分画、ホモジネートまたは超音波処理物として、何らかの形で豚に対して病原性である他の微生物「由来」であり得る。

本発明のための「豚に対して病原性である微生物」は、当技術分野で周知である。したがって、追加の抗原性物質は、原則として、豚に対して病原性である任意のウイルス、細菌、寄生虫、真菌、リケッチア、原生動物および／または寄生生物由来であり得る。

豚に対して病原性であるこのような微生物の例は、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、豚パルボウイルス、豚コレラウイルス、豚インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、豚伝染性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）属、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、クロストリジウム、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）属、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）属およびトリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）属である。

好ましい実施形態において、追加の抗原性物質は、非生凍結乾燥抗原として本発明によるワクチンに添加し、これは、本発明のワクチンエマルジョンを混合することによって再構成し得る。これは、例えば国際公開第２０１０／１０６．０９５号に記載されている。

本発明によるワクチンの好ましい実施形態において、ワクチンは、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）、ＰＣＶ２、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）およびＰＲＲＳＶからの抗原を含む。

これらは重要な豚の疾患であるため、したがって、シングルショットの即時使用型ワクチンへのそれらの配合は非常に有利である。

本発明によるワクチンは、当業者に周知の手段によって調製される。

したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明によるワクチンを調製するための工程であって、本発明の工程によって得られうる抗原組成物または本発明の抗原組成物と、追加のアジュバントとを混合する段階を含む工程に関する。

さらなる態様において、本発明は、本発明によるワクチンを調製するための工程であって、本発明の工程によって得られうる抗原組成物または本発明による抗原組成物、および鉱油、を乳化して水中油型エマルジョンにする段階を含む工程に関する。

このような工程の結果、上記のように、豚におけるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）および／またはＰＣＶ２による感染症および関連する疾患の徴候を予防または軽減する有利な効果を有する本発明のワクチンが利用可能になる。

当業者によって容易に適用可能な「ワクチンを調製するための工程」の詳細および例を本明細書中に記載する。例えば、本発明による抗原組成物は、より小さいかまたはより大きい容量で工業的に製造され得、次いで医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせられて、ワクチンへと処方され、適切なサイズの容器に充填される。適正な試験によって、例えば抗原の品質および量に対する免疫学的試験によって；不活性状態、無菌性および外来性物質非存在についての微生物試験によって；および最終的にはワクチンの有効性および安全性を確認するための動物における試験によって、製造工程の様々な段階が監視される。品質、量および無菌性についての試験の完了後、ワクチン製品を発売し得る。

これらは全て当業者に周知であり、ワクチンの調製に適用される一般的な技術および留意事項は、例えば政府からの指示および規制（薬局方）および周知のハンドブックに記載されている。

本発明によるワクチンは、豚標的への投与に適しており、所望の適用経路および所望の効果と合致する形態に調製し得る。

好ましくは、本発明によるワクチンは、非経口注射に適した形態、すなわち注射液、例えば懸濁液、溶液、分散液またはエマルジョンなどに処方される。一般に、このようなワクチンは、無菌で、生理的ｐＨで調製される。

したがって、さらなる態様において、本発明は、次のことに関する：
−Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための豚用のワクチンにおける使用のための、本発明による工程によって得られうる抗原組成物または本発明による抗原組成物。

−Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するためのワクチンの作製のための、本発明の工程によって得られうる抗原組成物または本発明による抗原組成物の使用。

−Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための、本発明のワクチンまたは本発明の工程によって得られうるワクチンの使用。

−本発明のワクチンまたは本発明の工程によって得られうるワクチンの豚への投与を含む、豚におけるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための方法。

ここで、次の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。

［実施例］
１．Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の調製
Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原は、市販のＭ＋Ｐａｃワクチンに対するものと同様の方法で調製したが；これは本質的に記載のとおりである（国際公開第１９９３／０１６．７２６号）。手短に述べると、Ｆｒｉｉｓ（１９７５、前出）によって最初に記載された培地に基づいて、富栄養培地中、懸濁状態でＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）Ｊ株を培養した。これは、酵母抽出物、血清および豚およびウシ起源の様々な抽出物を含有する複合培地である。数回の前培養の後、撹拌しながらｐＨを制御して、３７℃にて大型の発酵槽中で主培養を行ったが、一般的には定常期に達するために２０〜６０時間かかった。培養物を不活性化するためにＢＥＩを発酵槽に添加し、これを１時間撹拌し、その後、全内容物を第２の容器に移し、３７℃で撹拌しながら最長２４時間インキュベートした。次に、３７℃で最長２４時間撹拌することによって、チオ硫酸ナトリウムを用いて過剰なＢＥＩを中和した。次いで、不活性化および中和培養物を、限外ろ過によって最大１５倍濃縮した。Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原バルクは使用するまで４℃で保存した。抗原質量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｓｓ）および相対効力は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）特異的ポリクローナルウサギ抗血清を用いて、既知の効力の参照標準Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン調製物との比較により、社内Ｅｌｉｓａを用いて決定した。

２．ＰＣＶ２抗原の調製
ＯＲＦ２でコードされたＶＬＰであるサブユニットの形態のＰＣＶ２抗原は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶに対するものと同様の方法で作製したが；これは本質的に以前に記載のとおりである（例えば、国際公開第２００７／０２８．８２３号）。手短に述べると、Ｓｆ２１昆虫細胞の懸濁培養物に、バキュロウイルスｐ１０遺伝子プロモーターの制御下に挿入されたＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスを感染させ；感染時の細胞密度は細胞約１．４ｘ１０^６個／ｍＬであり、感染多重度（ＭＯＩ）は０．０１であった。約２７℃で４〜８日間培養した後、培養物全体を工業規模の超音波処理装置に通すことにより超音波処理した。次に、撹拌およびｐＨ制御を行いながら、組み換えバキュロウイルスを、３７℃で７２時間、ＢＥＩで不活性化した。不活性化後、ＢＥＩをチオ硫酸ナトリウムで中和した。中和後、遠心分離により細胞片を除去した。次に、上清を使用して、既知の量のマーカータンパク質の希釈範囲との比較によるＳＤＳゲル電気泳動または社内Ｅｌｉｓａを用いて、ＰＣＶ２キャプシドＶＬＰの抗原質量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｓｓ）を決定した。

３．Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２抗原の抗原組成物の調製および即時使用型ワクチンの処方
本発明による抗原組成物およびその後の本発明によるワクチンを調製するための例示的なプロトコールは、以下のように、１８％の油相を有する本発明によるワクチンの１００ｍＬバッチの調製である：ビーカーグラス中で、約６０ＲＰＵ／ｍＬのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原のバッチからの５ｍＬ、１０ｍＬのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ ２％および１２ｍＬの生理食塩水を無菌的に合わせた。これらの量は、最終ワクチン中に３ＲＰＵのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原／ｍＬおよび約１ｍｇ／ｍＬのアルミニウムに相当する。これらを水様性担体、ここでは食塩水と合わせた。このワクチンに関して、３７ｍＬの食塩水を添加して水相を完成させ、ここでその容量の３３％、１２ｍＬを抗原／アジュバント複合体の形成のために使用した。

４Ｎ塩酸を用いて混合物をｐＨ６．５に調整し、この混合物を室温（約２０℃）で一晩（１６時間）、磁気混合プレートおよび滅菌磁気混合バーを用いて穏やかに撹拌しながらインキュベートした。翌朝、この混合物を、食塩水の残りの容量と、１７ｍＬの約１４０００ＡＵ／ｍＬのＰＣＶ２抗原バッチ（最終ワクチン中で約２３００ＡＵ／ｍＬを提供）およびエタノール９６％およびグリセロール（滅菌済み）と合わせた。１０分間混合を続け、その後、ワクチンに対する水相が準備できた。次に、Ｔｗｅｅｎ、ＳｐａｎおよびＤｒａｋｅｏｌの混合物からなる１８ｍＬの油相を添加した。次に、２相を、ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘミキサーを用いて１０．０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズした。

本質的に同じ方法で、最大１００リットルのより大きな容量のワクチンバッチを調製し、これらを本明細書中に記載のような様々な実験室および野外ワクチン接種実験において使用した。この規模で、より大きな容量を収容するために大型の混合容器を使用し、予め形成された抗原／アジュバント複合体とＰＣＶ２抗原および水相の他の成分との混合の時間について変化させ：これを６０分に延長し；ｐＨを６．２〜７．５に維持し、室温でインキュベートを行った。また、使用した抗原バッチの効力を一致させるために、水性相および抗原バッチの容量も異なった。明らかに、これらの容量の乳化も、大型ホモジナイザー（Ｄｉｓｐａｘ ｒｅａｃｔｏｒ，ＩＫＡ）を用いて行った。

抗原／アジュバント複合体を予め形成させるために、本発明による工程の条件を最適化するよう実験を続ける。例えば、インキュベートの温度および持続時間、混合物のｐＨおよびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原に対する水酸化アルミニウムアジュバントの比率を変動させることによる。

次いで、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原が水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されているか否かおよびどの程度吸着されているかを試験するための試料を乳化前に水相から採取し、遠心分離し、上清およびペレットを試験する。ワクチンが水中油型エマルジョンとして調製された場合、これは最終ワクチンの試料を用いて行うこともできる。

４．抗原／アジュバント複合体を形成させるための様々な条件の影響
Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原と水酸化アルミニウムアジュバントとの複合体の形成中にＰＣＶ２抗原が存在するかまたは存在しない、といった異なる工程を用いて調製した抗原組成物を用いて、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）／ＰＣＶ２混合ワクチンを上記のように調製した。これらのワクチンを実験動物で試験することによって、これにより、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の有効性に対する異なる工程による影響を比較することが可能になった。

４．１．材料および方法：
Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンの１０ｘ濃縮バッチの（最終ワクチン容量の）５％、および市販のＰＣＶ２ワクチンと同等の標準的な量のＰＣＶ２抗原を用いて抗原組成物を調製した。以下のスケジュールに従ってワクチンを調製した：

吸着段階後、水相の残りの成分を添加し、続いて油相を添加し、乳化して、最終ワクチン生成物を得た。ワクチンは、使用するまで２〜８℃で保存した。

次に、８匹の子豚の４群をワクチン接種攻撃実験に使用し：３群にはそれぞれ特定のワクチンの１つを投与し、１群は非ワクチン接種対照群とした。３種類のワクチンは、３週齢で２ｍＬの用量として筋肉内投与した。

４週間後、７週齢で、Ｆｒｉｉｓ培地中の毒性Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）単離株の培養物５ｍＬを２日間連続で気管内滴下注入することにより、全ての豚に対して攻撃を行った。３週間後（１０週齢で）、豚を剖検し、統合Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）肺病変をＧｏｏｄｗｉｎの評価尺度に従ってスコア化した。

実験中、ワクチン接種時、攻撃接種時および剖検時に、血清学用の血液試料を採取した。抗ＰＣＶ２抗体レベルは、Ｅｌｉｓａを用いて任意単位で測定した。

４．２．結果

表１で示されるように、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）単一抗原ワクチンＡによるワクチン接種は、非ワクチン接種対照豚における病変の重症度と比較した場合、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）誘発性肺病変の重症度が６６％有意に低下した。このワクチンはＭ＋Ｐａｃ市販品に匹敵する。しかし、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原およびＰＣＶ２抗原が複合体形成中に両方とも存在する抗原組成物から調製されたワクチンＢの場合、これは本質的に異なっており：このワクチンは肺病変の３０％の減少しか誘導しなかった。Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンの有効性は、ワクチンＣの場合、５８％の肺病変縮小まで回復し、これは本質的に単一抗原ワクチンのレベルであり；このワクチンは、本発明による工程に従って調製された抗原組成物から調製された。

ＰＣＶ２抗体レベルに関して：全群の豚が、ワクチン接種時にＰＣＶ２抗原に対する母親由来の抗体を有していた。これらの母親由来抗体は、ワクチンＡを投与された群および対照群において減少した。ＰＣＶ２抗原を含有するワクチンＢまたはＣを投与された群は、防御レベルに対する血清反応を示した。それらの中で有意差はなく、これは、抗原を水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させる方法とＰＣＶ２ワクチンの有効性が関連していないことを示す。

４．３．結論
抗原組成物が調製される方法に依存して、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）感染に対するワクチンの有効性には明らかで有意な差があり：ＰＣＶ２抗原が水酸化アルミニウムへのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の吸着中に存在した場合、得られたワクチンは、予め形成されたＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原／水酸化アルミニウムアジュバント複合体に後にＰＣＶ２抗原を添加した場合と比較して、半分程度しか効果がなかった。

５．即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンの安全性および有効性の拡張試験
以下に記載する研究の目的は、実験室および野外条件下での新型Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏワクチンの有効性および安全性を評価することであった。

５．１．材料および方法：
５．１．１．ワクチン
試験したワクチンは、記載のように、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリン抗原、バキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＶＬＰ抗原およびＥｍｕｎａｄｅアジュバントを含有した。ワクチンは、３週齢の子豚に対して、単回２ｍＬ用量として、頸部に筋肉内投与した。

５．１．２．ＧＬＰ安全性試験
１２匹の健康なＳＰＦ豚の２つの群に対して、１９〜２１日齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏでワクチン接種するか（ワクチン接種群）またはリン酸緩衝食塩水を注射する（対照群）かの何れかを行った。ワクチン接種から１４日後まで、異常な全身または局所反応について子豚を毎日観察した。直腸温をワクチン接種の１日前、ワクチン接種の直前、ワクチン接種の４時間後および４日間にわたり毎日記録した。ワクチン接種１４日後に、注射部位の検査のために全動物を屠殺した。

５．１．３．免疫および攻撃実験
２種類のワクチン抗原のそれぞれについての免疫開始（ＯＯＩ）および免疫持続時間（ＤＯＩ）を実験的攻撃試験において決定した。各実験において、ワクチン接種時に、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）を含まず、ＰＣＶ２について血清陽性である群からの３週齢の豚を、無作為に２群（ワクチンおよび対照）に分けた（ＰＣＶ２ ＯＯＩ／ＤＯＩ：１群あたり豚１５匹、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ＯＯＩ：１群あたり１９匹、ＤＯＩ：１群あたり豚４０匹）。ワクチン接種直前、攻撃時および攻撃後２週間（ＰＣＶ攻撃試験のみ）および３週間で、血液試料を採取した。ＤＯＩの測定のために、ワクチン接種と攻撃との間の一定間隔でも血液試料を採取した。

ＰＣＶ２攻撃は、５〜２５週齢の最近のオランダＰＣＶ２野生分離株の鼻腔内滴下注入（鼻孔あたり３ｍＬ、約１０＾６ ＴＣＩＤ５０）によって行った。ＰＣＶ２攻撃後３週間、全ての豚を剖検し、腸間膜および鼠径リンパ節、扁桃および肺をＰＣＶ２ウイルス量の定量のために回収した。

約１０＾７色変化単位（ｃｏｌｏｕｒ ｃｈａｎｇｅ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬ（ＣＣＵ／ｍＬ）を含有するデンマーク野生分離株（Ｄｒ．Ｎ．Ｆｒｉｉｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎより提供）の培養物１０ｍＬを用いて、７または２４週齢でＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）攻撃を２日間連続して気管内投与により行った。攻撃から３週間後に、豚を剖検して、Ｇｏｏｄｗｉｎら（前出）により記載されるようにスコア化された肺病変を評価した。

全研究の間、臨床的異常について豚を毎日観察した。

５．１．４．野外試験
野外安全性試験は、オランダの２つの養豚場およびドイツの１つの養豚場で、無作為化および盲検デザインに従って、幼若子豚において行った。各養豚場において、少なくとも５６匹の健康な１７〜２４日齢の３週齢乳獣を無作為に２群のうちの１つに割り当てた。１群（ワクチン）の子豚にＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏを接種し、他の群（対照）の子豚に滅菌緩衝食塩水を注射した。試験に入る日（ワクチン接種の前日）、ワクチン接種直前、ワクチン接種の１〜４時間後、および１４日間にわたり毎日、子豚の一般的な健康状態を確認した。ワクチン接種１日前、ワクチン接種直前、ワクチン接種４時間後およびワクチン接種後４日間にわたり毎日、全ての子豚の直腸温を測定した。注射部位は、ワクチン接種の１時間後および４時間後、次いで１４日間にわたり毎日、触診によって局所反応について検査した。全試験子豚について、試験に入るとき（第−１日）および試験終了時（ワクチン接種後２１日）に個々に体重を測定した。

また、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２野外感染が起こっているフランスの豚群において、対照無作為化および盲検の計画に従って、組み合わせ野外安全性および有効性試験を行った。健康な３週齢乳獣を、それぞれおよそ３００匹の２つの子豚群のうち１つに同腹仔内で無作為に割り当てた。１群（ワクチン）の豚にＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏをワクチン接種し、他の群（対照）の豚に滅菌緩衝食塩水を注射した。主要有効性パラメーターは、屠殺時の肺病変、ＰＣＶ２ビレアミア（ｖｉｒｅａｍｉａ）および肥育中の（すなわちワクチン接種後７〜１９週（ｗｐｖ））の平均１日体重増加（ＡＤＷＧ）であった。副次的パラメーターは、全体的ＡＤＷＧ（すなわち、ワクチン接種から１９ｗｐｖの間）、死亡率、罹患率、胸膜炎病変およびＰＣＶ２脱粒であった。また、ワクチン接種または野外感染に対する血清学的反応を調べた。豚に対して、ワクチン接種時、仕上げユニットへの移送時および屠殺前に個々に体重測定を行った。投薬を記録し、試験中に死亡した豚を死後検査して死因を確定した。典型的なＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）病変および胸膜炎の重症度をスコア化するために、屠殺時に個別に肺を検査した。処置群あたり２５匹の子豚から、血清試料を得るために採血し、直腸および鼻腔スワブをおよそ４週間ごとに採取した。安全性はこの研究の主要な目的ではなかったが、研究者は、ワクチン接種時に日常的に動物を観察し、ワクチン接種の４時間後および１、４、７および１４日後に、１つの群として観察した。

５．１．５．血清学
Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）血清学については、市販のＥｌｉｓａ（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）Ａｂテスト、ＩＤＥＸＸ）を製造業者の指示に従って使用した。結果は、陰性、陽性または不確定として表す。

ＰＣＶ２血清学については、以前に記載のように（Ｈａａｋｅら、前出）、社内ＥＬＩＳＡを行った。

５．１．６．ＰＣＶ２ ＤＮＡの定量
血清、リンパ系器官、肺および排泄物中のＰＣＶ２ウイルス量の定量は、以前に記載のように（Ｈａａｋｅら、前出）ｑＰＣＲによって行った。

５．１．７．統計分析
ＰＣＶ２攻撃後に回収した血清試料に対するｑＰＣＲデータの曲線下面積（ＡＵＣ）を線形台形則により計算し、ウィルコクソン順位和検定により分析した。攻撃実験における肺病変スコアおよび鼠径部および腸間膜リンパ節、肺および扁桃腺のｑＰＣＲデータもウィルコクソン順位和検定により分析した。

野外試験において、ワクチン接種群、生産バッチおよびそれらの相互作用を固定効果として用いるＡＮＯＶＡを使用して、分析前にＡＵＣデータをランク付けした。混合モデルＡＮＯＶＡを用いて、野外試験における肺病変スコアを群間で比較した。ワクチン接種群、生産バッチおよびそれらの相互作用は固定効果として、及び雌豚は変量効果として含めた。分類変数として生産バッチを用いて、コクラン・マンテル・ヘンツェル法により、ワクチン接種群間で、胸膜炎がある豚（無または有）の割合、死亡率および罹患率を比較した。混合モデルＡＮＯＶＡを用いて、群間で平均１日体重増加を比較した。適切な相互作用がある、ワクチン接種群、生産バッチおよび性別を固定効果として、及び雌豚は変量効果として含めた。試験に入ったときの体重は、共変数としてモデルに含めた。局所または全身反応のある豚の数をフィッシャーの直接検定により比較した。

５．２．結果
５．２．１．安全性試験
全ての安全性試験の統合結果を表１で要約する。

ＧＬＰ安全性試験において、局所的または全身的な反応を発現した動物はなく、剖検時に注射部位で肉眼的な異常は観察されなかった。ワクチン接種後４時間で、ワクチン接種動物の直腸温は、対照動物よりも平均１．１℃高かった（ｐ＜０．００１）が、ワクチン接種の翌日には正常に戻った。

野外安全性試験において、処置の結果、ワクチン接種の１３％で最大直径１ｃｍ、対照の４％で０．３ｃｍの局所注入部位反応が生じた。これらの局所反応は、ワクチン接種後４時間にのみ観察され、翌日までに消失した。処置後の正常な全般的健康状態からの逸脱がある子豚の数は、両群で同様であった（ワクチン接種および対照についてそれぞれ６％および５％）。ワクチン接種動物において測定したところ、ワクチン接種４時間後での平均直腸温度は１．１℃高く（４０．６℃と３９．５℃）（ｐ＜０．０００１）、ワクチン接種翌日に正常に戻った。体重増加は、処置後３週間の観察期間中、群間で差はなかった。

野外安全性および有効性試験において、両群の豚のおよそ１％で局所反応が観察された。ワクチン接種動物における局所反応の最大サイズは２ｃｍであり、最大持続時間は１日であった。ワクチン接種動物の３％および対照の１％において、正常な全般的健康状態からの逸脱が観察された。一部の動物は、ワクチン接種４時間後に軽度の不快感の徴候を示した。

５．２．２．攻撃実験
ワクチン接種と攻撃との間の期間に、処置と関連し得る臨床的異常はなかった。しかし、一部のワクチン接種豚および対照豚では、試験中に跛行があり、これはおそらくストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）感染によるものと思われた。ＰＣＶ２攻撃感染は臨床的徴候を何ら引き起こさなかったが、ｑＰＣＲデータから、様々なリンパ系組織および肺の感染が明らかに示された（図１）。平均ウイルス量は、ワクチン接種豚では全般的に２〜３ｌｏｇ１０桁低く、群間の差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ ｈｙｏの場合、ＰＣＶ２、約３Ｌｏｇ２以上の特異的抗体力価は、ウイルス量の有意な減少と相関する。これらの実験において、ワクチン接種の結果、ワクチン接種後にＰＣＶ２に対する明確な抗体反応が生じたが、一方で対照群は、攻撃時までは、母親由来抗体力価の低下後、血清学的に陰性のままであった。攻撃後、ワクチン接種動物は既往性反応を発現し、対照群の動物では抗体陽転が起こり始めた。

ワクチン接種後の血清反応は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）攻撃実験において、４ｗｐｖで血清陽性動物のうち８４％および２１ｗｐｖで血清陽性動物のうち９７％でも見られた（図２）。殆ど全ての対照動物が、攻撃感染に対して血清学的に反応した。攻撃から３週間後の剖検で、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）誘発性肺病変の中央値は、ワクチン接種群の場合よりも７７％（ＯＯＩ試験）および５０％（ＤＯＩ試験）低かった（ｐ＜０．０５）。

５．２．３．野外有効性試験
野外試験における豚のＰＣＶ２血清学的プロファイル（図３）は、８〜１２ｗｐｖのＰＣＶ２野外感染を示す。実際に、ワクチン接種後８週間では、ＰＣＶ２の存在が対照動物において少量検出され得、１２ｗｐｖに鼻腔および糞便排泄中で、１６ｗｐｖに血清中でピークに達する。しかし、対照動物と比較して、ワクチン接種動物のウイルス量（ＡＵＣとして計算）は、血清、鼻腔および糞便排泄中でそれぞれ、７９％（ｐ＜０．０００１）、７０％（ｐ＜０．０００１）および５５％（ｐ＝０．０１５９）、有意に減少した。

図４で示されるように、ワクチン接種動物の４６％が、４ｗｐｖでＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）血清陽性となった。Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）血清陽性対照動物は１６ｗｐｖで観察された。屠殺時、ワクチン接種群の肺病変スコアは対照動物の場合よりも４６％低かった（ｐ＜０．０００１）。特に、重度の肺病変を有する動物（スコア＞１０）のパーセンテージは５６％低下した。胸膜炎の動物数は、ワクチン接種群ではより少なかった（３２％と３９％）が、この減少は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１２１）。

さらに、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏによるワクチン接種は、対照動物の場合よりも、肥育中に３４ｇ多いＡＤＷＧを誘導し（ｐ＜０．０００１）、研究期間全体の間に１９ｇ多いＡＤＷＧを誘導した（ｐ＝０．００１９）（表３）。罹患率および死亡率は両者ともワクチン接種群でより低かったが、対照との差は統計学的に有意ではなかった。

５．３．考察
本研究は、新しいＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏワクチンが３週齢の子豚に安全に投与され得ることを裏付ける。全身反応の頻度は非常に低く、これらの反応は、食塩水を注射した対照群でも観察されたので、ワクチン接種の結果よりもそのような処置（２ｍＬ容量の注射）とより関連が大きいと思われる。ワクチン接種はまた、生育期（ｎｕｒｓｅｒｙ ｐｈａｓｅ）中に豚の成長に負の影響を及ぼさず、局所反応は小さく、一時的であった。ワクチン接種後４時間で、平均およそ１℃の直腸温の上昇が観察された。しかし、翌日、体温が正常に戻り、動物の全般的な行動にも飼料摂取（野外試験でワクチン接種後３または７週間の体重により測定した場合）にも影響がなかったため、この一時的な直腸温上昇は、許容可能なワクチン関連知見である。また、このような平均１℃の上昇は、十分に、欧州薬局方のモノグラフ２４４８（豚流行性肺炎ワクチン（不活性化））に従って許容される１．５℃の限界内である。

実験的攻撃試験から、免疫発現がワクチン接種後２週間（ＰＣＶ２）〜４週間（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））という早い時期に起こり、少なくとも２１週間（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））〜２２週間（ＰＣＶ２）持続することが示される。これは、リンパ器官および肺におけるＰＣＶ２ウイルス量の有意な減少およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）特異的肺病変の有意な減少によって明らかになった。したがって、３週齢での動物の単回ワクチン接種は、肥育期間中の肥育豚のＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）感染を防御し得る。

攻撃実験中に行われた観察は、野外有効性試験で確認され：ＰＣＶ２ウイルス量およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）誘発性肺病変の大幅な減少が測定された。野外有効性試験から、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ Ｍ Ｈｙｏによるワクチン接種は、血清中の豚のウイルス量のレベルを低下させただけでなく、感染後に鼻腔および糞便経路を介してウイルスが排出された時間も短縮させたことが示された。野外試験で遭遇したＰＣＶ２感染は主に無症候性であったが、群中でＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）感染の徴候としての咳が観察された。

野外有効性試験における動物の血清学的およびウイルス学的プロファイリングは、ＰＣＶ２感染がおよそ８ｗｐｖで開始し、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）血清反応がある動物数の増加が１２〜１６ｗｐｖの間で観察されたことを示す。Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）に対する抗体陽転が全般的に感染後およそ３〜４週間で起こることを考慮すると、血清学的プロファイルは、ＰＣＶ２感染のピークとほぼ同時にＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）感染を示す（１２〜１６ｗｐｖ、１５〜１９週齢に対応）。ＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）の二重感染の場合、ＰＣＶ２はＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）病変を重症化させることが示されており、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）はＰＣＶ２ビレアミア（ｖｉｒｅａｍｉａ）を重症化させることが示されている。２つの病原体のうち１つに対するワクチン接種のみでは、動物における両病原体による二重感染を防御するのに十分ではない。したがって、動物生産力における同時感染の影響は、通常この２種類の病原体の何れか単独よりも劇的である。これらの相乗的な疾患影響を防ぐ、混合ＰＣＶ２−Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンの利点は、野外試験において肥育期間（１０〜２２週齢の期間）中にＡＤＷＧが３４ｇ多くなることに反映された。

５．４．結論：
安全性：
−ワクチン接種の結果、ワクチン接種当日に中程度の体温上昇が起こり、低い割合のワクチン接種豚で軽度の全身および局所反応が起こった。

−観察された局所反応は小さく（最大２ｃｍ）、一時的（最大１日）であった。

有効性：
−個々の病原体を用いた短期（免疫開始）および長期（免疫持続期間）攻撃試験において、ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンは、血清、リンパ組織および肺ならびにＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）誘導性肺病変においてＰＣＶ２量を有意に減少させた。

−ＰＣＶ２およびＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）の両方が存在した養豚場でのプラセボ対照野外試験において、３週齢での子豚のワクチン接種の結果、ＰＣＶ２ビレアミア（ｖｉｒｅａｍｉａ）および脱粒が減少し、屠殺時に肺病変スコアが低下した。

−また、肥育期間中の平均１日体重増加（＋３４ｇ／日）においてワクチン接種からの好ましい効果が観察された。

５．５．表：
表２：ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンの安全性の分析

表３：ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンを用いた野外有効性試験における、実験動物およびそれらの性能の記述データ

６．水酸化アルミニウムアジュバントに対するＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の結合のための条件の影響
６．１．導入
さらなる試験において、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の水酸化アルミニウムアジュバントへの結合の条件を変化させて、抗原／アジュバント複合体の形成効率に対するそれらの影響を試験した。

特に、小規模で多数の完全なｏ／ｗワクチン製剤を調製することによって、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の結合に対する温度、ｐＨおよび水酸化アルミニウム量の影響を調べた。次に、完全ワクチンエマルジョンにおいておよびワクチンエマルジョンの遠心分離後のペレットまたは上清の試料においての両方で、抗原／アジュバント複合体において結合したＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量を決定した。

６．２．材料および方法
６．２．１．ワクチンエマルジョンの調製
様々なワクチン製剤の調製は、基本的に実施例３に記載のとおりであった。Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２抗原の標準バッチから、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を６％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、ＰＣＶ２抗原を２５００Ｕ／ｍＬの最終濃度まで添加した。２０ｍＬのワクチンエマルジョンを様々な条件下で調製した（表４参照）。調製後、全ワクチンを試験まで２〜８℃で保存した。

６．２．２．試料調製
１０ｍＬのワクチンを低ｇ値（６００ｘｇで２０分間）で遠心分離し、上清（８．５ｍＬ）を取り出した。水酸化アルミニウムの量がより多いためにペレットの容量が大きくなったので、試料番号７から７．５ｍＬしか上清を取り出すことができなかった。同じ容量の「ペレット」および上清を比較することができるように、０．９％生理塩容量でペレットを補充し、これとともにホモジナイズしたが、これは、取り出した上清の容量に等しかった。

６．２．３．Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原定量
試験試料中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量は、ペレット試料の場合と同様に、上清についても標準Ｅｌｉｓａで測定し得た。測定されたＯＤからの抗原量の計算は、コンピュータプログラムを用いて行った。各試料を２回試験し、個々のブレンド物の、ワクチン、ペレットおよび上清を１枚のマイクロタイタープレート上で同時に試験した。表５で与えられる結果は、各デュプロ（ｄｕｐｌｏ）の平均値である。それらの個々の完全ワクチンエマルジョン中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の量に対して、これを１００％に設定して、ペレットおよび上清の相対効力単位（ＲＰＵ）値を計算した。

６．３．結果
試料の遠心分離を低ｇ値で行い；これは、アジュバントへのその結合とは独立にＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原をペレット化することなく、水酸化アルミニウムをペレット化するのに十分であった。また、これらの低ｇ値でも、上清は依然として水中油型エマルジョンから構成された。

遠心分離が困難でなかったことを確認するために、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）およびＰＣＶ２抗原を空のＥｍｕｎａｄｅ ｏ／ｗエマルジョンと直接混合し、続いて同じ低ｇ値で直ちに遠心分離することによって対照試料を調製した。これらの対照試料の結果から、これらの条件下で、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原自体が相当なレベルまで沈降しなかったことが実証され：このペレット中で検出された１３％のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原は、この試験ワクチンの全容量からのペレットの容量にしか相当しない（１．５ｍＬ〜１０ｍＬ）。

インキュベートのｐＨ値または温度の逸脱がある試料を除いて、他の試料のｐＨは６．８〜７．３であり、実験時の周囲温度は２２℃であった。

標準条件は、Ｏ／Ｎインキュベート、周囲温度、ｐＨ６．５〜７．５および９．８ｗ／ｗ％水酸化アルミニウムアジュバントであった。

様々な試料のペレットおよび上清中で測定したＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原のパーセンテージＲＰＵを表５で示す。温度およびｐＨに関して、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の水酸化アルミニウムアジュバントへの結合において顕著な影響は観察されなかった。水酸化アルミニウム相中で検出されたＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量は、これらの条件に対して７４〜８２％の間であった。

しかし、エマルジョン中の水酸化アルミニウムの量は、顕著な影響を有し：９．８〜５％ｗ／ｗの減少によって、ペレット中のＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の相対量がほぼ半分となり（４８％）、一方で水酸化アルミニウム量を２５％に増加させた場合は、Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原のほぼ完全な結合（９６％）が示された。

６．４．結論
Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原と水酸化アルミニウムとの結合に関して、結合の温度またはｐＨ条件が変動した場合に有意差は見られなかった。結合時に水酸化アルミニウム量の変動の影響が見られた。

ＰＣＶ２攻撃実験の結果： ｑＰＣＲによって検出される場合の、抗ＰＣＶ２抗体力価およびＰＣＶ２ウイルス量で表される、免疫の開始および持続時間である。 Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）攻撃実験の結果： 抗Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗体力価および肺病変スコアで表される、免疫の開始および持続時間である。 野外有効性試験からのＰＣＶ２データ： 実験の第８週と第１２週との間にＰＣＶ２野外感染を発生させた野外有効性試験からの結果である。結果は、血清学およびウイルスＤＮＡ検出から示される。 野外有効性試験からのＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）データ： 実験の第１２週前後にＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）野外感染を発生させた野外有効性試験からの結果である。結果は、血清学および肺病変スコアから与えられる。

Claims (15)

1. 豚用の即時使用型混合ワクチン用の抗原組成物を調製するための工程であって、前記組成物が、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ））および豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の抗原を含み、該工程が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されたＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の予め形成された抗原／アジュバント複合体にＰＣＶ２抗原を混合する段階を含むことを特徴とする、工程。
2. 前記抗原／アジュバント複合体が、
   ａ．水様性担体中で、前記水酸化アルミニウムアジュバントが正に荷電するｐＨにて、前記水酸化アルミニウムアジュバントおよび前記Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を混合し、
   ｂ．前記Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原を前記水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させ、抗原／アジュバント複合体を形成させるために、段階ａの混合物をインキュベートする、
   段階により予め形成されることを特徴とする、請求項１に記載の工程。
3. 前記Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原がＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）バクテリンである；前記ＰＣＶ２抗原がＰＣＶ２ ＯＲＦ２によってコードされる；前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２にコードされる抗原がウイルス様粒子である；段階ａの前記水様性担体が平衡塩類溶液である；段階ａの前記水様性担体のｐＨが６〜８である；段階ａの前記混合物が本質的に他の成分を含まない；段階ｂのインキュベートが１０〜２０時間である；段階ｂのインキュベートが室温である；および、段階ｂのインキュベートが、インキュベートされた混合物の穏やかな撹拌を含む、
   からなる群から選択される条件の１つ以上または全てを適用することを特徴とする、請求項１または２に記載の工程。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載の工程によって得られうる抗原組成物。
5. 前記Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原の少なくとも５０％が前記抗原／アジュバント複合体中にあることを特徴とする、請求項４に記載の抗原組成物。
6. 前記水酸化アルミニウムアジュバントのタンパク質結合能の少なくとも５０％が前記Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）抗原によって使用されることを特徴とする、請求項５に記載の抗原組成物。
7. Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための豚用の即時使用型ワクチンであって、請求項１〜３の何れか１項に記載の工程によって得られうる抗原組成物または請求項４〜６の何れか１項に記載の抗原組成物、および、追加のアジュバントを含む、豚用の即時使用型ワクチン。
8. 前記ワクチンが水中油型エマルジョンであり、前記追加のアジュバントが鉱油であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
9. 前記ワクチンが、豚に対して病原性の微生物に由来する追加の抗原性物質を含むことを特徴とする、請求項７または８の何れか１項に記載のワクチン。
10. 請求項１〜３の何れか１項に記載の工程によって得られうる抗原組成物または請求項４〜６の何れか１項に記載の抗原組成物および追加のアジュバントを混合する段階を含む、請求項７に記載のワクチンを調製するための工程。
11. 請求項１〜３の何れか１項に記載の工程によって得られうる抗原組成物または請求項４〜６の何れか１項に記載の抗原組成物、および、鉱油を水中油型エマルジョンになるように乳化する段階を含む、請求項８に記載のワクチンを調製するための工程。
12. Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための豚用のワクチンにおける使用のための、請求項１〜３の何れか１項に記載の工程によって得られうる抗原組成物または請求項４〜６の何れか１項に記載の抗原組成物。
13. Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するためのワクチンの製造のための、請求項１〜３の何れか１項に記載の工程によって得られうる抗原組成物または請求項４〜６の何れか１項に記載の抗原組成物の使用。
14. Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための、請求項７〜９の何れか１項に記載のワクチンまたは請求項１０または１１の何れか１項に記載の工程によって得られうるワクチンの使用。
15. 請求項７〜９の何れか１項に記載のワクチンまたは請求項１０または１１の何れか１項に記載の工程によって得られうるワクチンの豚への投与を含む、豚におけるＭ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）またはＰＣＶ２による感染および関連する疾患徴候を予防または軽減するための方法。

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