KR20100113582A

KR20100113582A - Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법

Info

Publication number: KR20100113582A
Application number: KR1020107018401A
Authority: KR
Inventors: 마이클 루프; 마크 에이크메이어
Original assignee: 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2010-10-21
Also published as: US9669086B2; EP2242511A4; MX2010007815A; AU2009234345A1; JP2011520771A; US20150174233A1; BRPI0907438A2; AU2009234345B2; CN101980720A; WO2009126356A3; WO2009126356A2; US20090317423A1; CA2712006A1; EP2242511A2; JP5613061B2

Abstract

엠.히오(M. hyo) 감염의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키기에 효과적인 면역학적 제제, 바람직하게는 엠.히오 박테린을 포함하거나, 또는 엠.히오 박테린 및 돼지의 다른 질환 유발 유기체의 적어도 하나의 면역원성 활성 성분, 바람직하게는 PCV2를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하는 다가 복합 백신이 제공되며, 상기 다가 백신의 바람직한 PCV2 항원은 PCV2 ORF 2 단백질이다.

Description

ＰＣＶ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법{PCV2 Mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions}

관련 출원

본 출원은 2008년 1월 23일에 출원한 미국 임시출원 일련번호 61/023,086 및 2008년 1월 31일에 출원한 미국 임시출원 일련번호 61/025,293에 대해 우선권을 주장하는 출원이다. 이 출원들의 교시 및 내용은 모두 여기에 참고인용된다.

발명의 분야

본 발명의 한 관점에서, 마이코플라즈마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae)(엠.히오(M. hyo))에 의한 감염에 대하여 면역 반응을 유도하는데 효과적인 면역원성 조성물이 제공된다. 더 구체적으로, 본 발명은 이러한 조성물을 투여받은 동물을 보호하고 엠.히오 감염과 관련이 있는 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 임상 증상의 중증도를 경감시키는 면역 반응을 유도, 유발 또는 제공하는데 효과적인 면역원성 조성물에 관한 것이다. 더 더욱 상세하게, 본 발명은 엠.히오에 의한 감염에 대하여 보호 면역 반응을 부여하는, 세포계 항원, 바람직하게는 박테린(bacterin)을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 더욱 더 특히, 본 발명은 박테린의 투여가 엠.히오에 의한 감염에 대하여 보호 면역 반응을 초래하는 엠.히오 박테린을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 가장 특히, 본 발명은 면역원성 조성물을 투여받은 돼지에게 보호 면역 반응을 부여하기에 효과적인 면역원성 조성물로, 이 조성물의 용량에 상대효능(RP)이 적어도 1.22인 엠.히오 박테린을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 이러한 면역원성 조성물을 생산 및 투여하는 방법도 제공한다.

본 발명의 다른 관점에서, 돼지 서코바이러스 2(PCV2)에 의한 감염에 대하여 면역 반응을 유도하기에 효과적인 면역원성 조성물이 제공된다. 더 상세하게는, 본 발명은 PCV2 감염과 관련이 있는 임상 증상의 발생률을 감소시키거나 또는 임상 증상의 중증도를 경감시킴으로써, 조성물을 투여받은 동물을 보호하는 면역반응을 제공하기에 효과적인 면역원성 조성물에 관한 것이다. 더 더욱 상세하게는, 본 발명은 PCV2에 의한 감염에 대하여 보호 면역반응을 부여하는 단백질계 면역원성 조성물에 관한 것이다. 더욱 더 상세하게는, 본 발명은 PCV2-ORF2의 투여가 PCV2에 의한 감염에 대하여 보호 면역 반응을 초래하는 PCV2의 ORF2를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 가장 특히, 본 발명은 면역원성 조성물을 투여받은 돼지에게 보호 면역반응을 부여하기에 효과적인 면역원성 조성물로, PCV2의 ORF2에 의해 발현된 단백질을 함유하고 RP 값이 적어도 1.38인 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 면역원성 조성물을 생산 및 투여하는 방법도 제공한다.

본 발명의 다른 관점에서, 복합 면역원성 조성물, 복합 백신 또는 다가(multivalent) 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다. 더 상세하게는, 본 발명은 엠.히오 및 적어도 하나의 다른 돼지 질환-유발 유기체에 의한 감염에 대하여 면역 반응을 유도하기에 효과적인 면역원성 조성물을 제공한다. 더 더욱 특히, 본 발명은 엠.히오에 의한 감염에 대하여 면역 반응을 유도하고 PCV2에 의한 감염에 대하여 면역 반응을 유도하기에 효과적인 조성물을 제공한다. 엠.히오 및 PCV2에 대한 면역 반응은 각각의 병원체와 관련이 있는 임상 징후 또는 증상의 발생률 또는 중증도를 이의 예방을 비롯하여 그 이하의 수준까지 감소시키기에 충분한 것이 바람직하다. 이러한 면역원성 조성물의 바람직한 형태에서, 이의 엠.히오 부(portion)는 RP 값이 적어도 1.22이고, PCV2 부는 또한 RP 값이 적어도 1.38이다. 또한, 본 발명은 이러한 조성물을 생산 및 투여하는 방법도 제공한다.

마이코플라즈마 히오뉴모니에는 마이코플라즈마타시에(mycoplasmataceae)과에서 분류된 작은 세균(400-1200 nm)이다. 엠.히오는 육성 비육 돼지에서 일반적으로 관찰되는 돼지 호흡기 질환인 유행성 폐렴(Enzootic Pneumonia)과 관련이 있다. 엠.히오는 기관 및 폐의 상피 세포의 섬모를 공격하여 섬모의 비팅(beating)을 정지시키고(섬모정체) 결국에는 폐 부위의 협착을 유발한다. 이 질환의 정도에 따라서, 감염 돼지의 1일 생 체중 증가가 최고 17%까지 감소할 수 있다. 동물 유행성 폐렴은 돼지 집단에서 만연하고 거의 모든 돼지 무리에 존재한다. 엠.히오는 PRRSV 및 다른 호흡기 병원체의 폐 내로의 진입을 용이하게 하는 1차 병원체인 것으로 생각되고 있다. 3가지 다른 균주, 232, J 및 7448은 서열분석된 자신의 게놈을 갖고 있다(Minion et al., J. Bacteriol. 186: 7123-33, 2004; Vascondcelos et al., J. Bacteriol. 187: 5568-77, 2005). 엠.히오 감염의 임상 징후로는 마른 기침, 수행 부전 및 폐 병변을 포함한다.

돼지 서코바이러스 2형(PCV2)은 작은(직경이 17-22nm), 정20면체, 비-외피 DNA 바이러스로, 일본쇄 원형 게놈을 함유한다. PCV2는 돼지 서코바이러스 1형(PCV1)과 약 80%의 서열 동일성을 공유한다. 하지만, 일반적으로 비독성인 PCV1과 대조적으로, PCV2로 감염된 돼지는 이유후전신소모성증후군(PMWS)이라 통칭되는 증후군을 나타낸다. PMWS는 임상적으로 쇠약, 피부 창백, 수척, 호흡 곤란, 설사, 황달을 특징으로 한다. 일부 감염 돼지에서는 모든 증상들이 복합적으로 나타나는 반면, 다른 돼지에서는 이러한 증상 중 하나 또는 2가지 증상만이 나타나기도 한다. 부검 동안, 미시적 및 거시적 병변이 다수의 조직과 기관에서 나타나기도 하며, 림프성 기관이 병변이 가장 일반적인 부위이다. PCV2 핵산 또는 항원의 양과 미시적 림프성 병변의 중증도 간에 강한 상관관계가 관찰되었다. PCV2로 감염된 돼지의 치사율은 80%에 이를 수 있다. PMWS 외에, PCV2는 광견병, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS), 글래서(Glasser) 질환, 연쇄구균성 수막염, 살모넬라증, 이유후 대장균증, 식이요법성 간장증 및 화농 기관지폐렴을 비롯한 여러 다른 감염과 관련이 있다.

PCV2의 개방 판독 프레임 2(ORF2) 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 전개 시 대략 30kDa의 분자량을 나타내며, 과거 PCV2용 백신에서 항원성 성분으로 이용되었다. 이러한 백신에 이용하기 위해 ORF2를 수득하는 통상의 방법은 일반적으로 ORF2를 암호화하는 PCV2 DNA를 증폭시키는 단계, ORF2 DNA로 바이러스 벡터를 형질감염시키는 단계, ORF2 DNA를 함유하는 바이러스 벡터로 세포를 감염시키는 단계, 세포 내에서 바이러스가 ORF2 단백질을 발현하게 하는 단계, 및 세포 용해를 통해 세포로부터 ORF2 단백질을 추출하는 단계로 이루어진다. 이러한 절차는 일반적으로 바이러스 벡터에 의해 세포의 감염 후 최대 약 4일 정도 걸린다. 하지만, 이러한 절차는 추출 절차가 비용이 많이 들고 시간 소모적이라는 점에서 불리하다. 또한, 세포에서 회수되는 ORF2의 양은 크게 많지 않아서, 결과적으로 백신 등에 사용하기에 충분한 양의 재조합 발현 단백질을 수득하기 위해서는 다수의 세포가 다수의 바이러스 벡터에 의해 감염되어야 한다.

따라서, 당업계에서 필요로 하는 것은 PCV2 감염 및 엠.히오 감염과 관련이 있는 임상 징후를 예방하거나 발생률을 감소시키고/시키거나 중증도를 경감시키거나 보호 면역 반응을 부여하는 면역원성 조성물이다. 특히, 당업계에서 필요로 하는 것은 백신의 단일 투여 후에 PCV2 감염 및 엠.히오 감염과 관련이 있는 임상 징후를 예방하거나 중증도를 경감시키고/시키거나 발생률을 감소시키거나, 보호 면역 반응을 부여하기에 충분한 양으로 엠.히오 항원 및 PCV2 항원을 포함하는 복합 백신이다. 이러한 백신은 돼지 백신의 순응도를 향상시킬 것이다.

본 발명은 종래 기술에 내재된 문제를 극복하고 당해 기술 상태의 현저한 진보를 제공한다. 본 발명은 한 관점에서, 엠.히오에 대한 돼지의 보호 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물이 제공된다. 이 면역원성 조성물은 돼지 서코바이러스 2형 항원과 엠.히오 항원을 함유하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 각 용량에서 엠.히오 항원의 양은 상대효능(RP) 값이 적어도 1.22인 것으로, 여기서 1.22의 상대효능 값은 상기 엠.히오 항원 양의 40분의 1(1/40)을 투여받은 마우스의 적어도 95%, 바람직하게는 100%가 엠.히오 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 마우스의 적어도 95%, 바람직하게는 100%에서 검출가능한 엠.히오 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 엠.히오 항원의 40배 양은 돼지 서코바이러스 2형 항원과 함께 투여했을 때 엠.히오 감염에 대하여 보호 면역 반응을 부여하고 엠.히오 감염과 관련이 있는 임상 징후의 발생률을 감소시키고/시키거나 그 중증도를 경감시키거나 예방하기에 충분하다. 환언하면, 전술한 바와 같은 엠.히오 항원의 양은 복합 백신으로 혼합해서 투여 시, PCV2 항원에 의한 임의의 음성적 간섭을 극복할 수 있는 것으로 관찰되었다. 결과적으로, 본 발명은 추가로 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 함유하되, 용량당 엠.히오 항원의 양이 적어도 1.22의 상대 효능(RP) 값을 나타내고, 이 1.22의 RP 값은 치료후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%의 마우스, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 엠.히오 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 엠.히오 항원의 40배 양에 상당하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일부 바람직한 형태에서, 조성물은 추가로 애주번트(adjuvant)를 포함하거나 함유한다. 다양한 애주번트가 본 발명에 유용할 것이고, 당업자라면 선택할 수 있지만, 카보머(carbomer), 더 더욱 바람직하게는 카보폴(Carbopol)이 특히 바람직하다. 유리하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 용량 투여로 돼지에게 투여했을 때, 엠.히오 감염과 관련이 있는 임상 징후에 대하여 보호 면역 반응을 부여하고 그 임상 징후의 발생률을 감소시키고/시키거나 그 임상 징후의 중증도를 경감시키거나 예방한다. 이러한 단일 용량은 돼지에게 투여했을 때 적어도 100일, 더욱 바람직하게는 적어도 110일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 120일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 130일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 140일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 150일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 160일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 170일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 180일, 가장 바람직하게는 적어도 184일의 면역 지속기간을 유발한다. 환언하면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 추가 용량 또는 후속 용량 없이도 동물 또는 동물 그룹에게 적어도 100일(110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일 등) 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 184일 동안 엠.히오 감염의 임상 징후의 감소된 발생률 또는 경감된 중증도를 제공한다. 항체 검출 분석과 관련하여, 당업자는 적당한 제품을 알아내어 이용할 수 있을 것이다. ELISA 분석 및 특히 IDEXX Herdchek M. hyo 검사 키트(IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME)가 바람직하다. 특히, 본 발명에 따른 참조 분석법으로서 IDEXX Herdchek M. hyo 검사 키트(IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME)를 사용했다.

본 발명은 다른 관점으로, PCV2에 대한 돼지의 보호 면역 반응을 유발하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 이 면역원성 조성물은 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 함유하는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 각 용량에서 PCV2 항원의 양이 적어도 1.38의 상대 효능(RP) 값을 나타내는 것이고, 여기서 1.38의 상대 효능 값이란, 상기 PCV2 항원의 양의 20분의 1(1/20)을 투여한 마우스의 적어도 85%가 PCV2 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생한다는 것을 의미한다. 특히, 1.38의 상대 효능 값은 상기 PCV2 항원의 양의 10분의 1(1/10)을 투여한 마우스의 적어도 95%, 바람직하게는 100%가 PCV2 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생하는 것을 의미하는 것이 바람직하다. 따라서, 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 마우스의 적어도 85%에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 20배 양, 또는 바람직하게는 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 마우스의 적어도 95%, 바람직하게는 100%에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 10배 양은 엠.히오 항원과 함께 투여했을 때 PCV2 감염과 관련이 있는 임상 징후에 대하여 보호 면역 반응을 부여하고 그 임상 징후의 발생률을 감소시키고/시키거나 그 임상 징후의 중증도를 경감시키거나 예방하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. 환언하면, 전술한 PCV2 항원의 양은 복합 백신으로 혼합해서 투여했을 때 엠.히오 항원에 의한 임의의 음성적 간섭을 극복할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 본 발명은 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 함유하는 면역원성 조성물로, 용량당 PCV2 항원의 양이 적어도 1.38의 상대 효능(RP) 값을 나타내고, 여기서 1.38의 RP 값이란 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 마우스의 적어도 85%에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 20배 양에 상당하는 것인 조성물에 관한 것이다. 다른 관점에 따르면, 본 발명은 또한 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 함유하는 면역원성 조성물로, 용량당 PCV2 항원의 양이 적어도 1.38의 상대 효능(RP) 값을 나타내고, 여기서 1.38의 RP 값이란 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 마우스의 적어도 95% 및 바람직하게는 100%에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 10배 양에 상당하는 것인 조성물에 관한 것이다.

본 양태의 일부 바람직한 형태에서, 조성물은 추가로 애주번트를 포함하거나 함유한다. 다양한 애주번트가 본 발명에 유용할 것이고, 당업자라면 선택할 수 있지만, 카보머(carbomer), 더 더욱 바람직하게는 카보폴(Carbopol)이 특히 바람직하다. 유리하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 용량 투여로 돼지에게 투여했을 때, PCV2 감염과 관련이 있는 임상 징후에 대하여 보호 면역 반응을 부여하고 그 임상 징후의 발생률을 감소시키고/시키거나 그 임상 징후의 중증도를 경감시키거나 예방한다. 이러한 단일 용량은 돼지에게 투여했을 때 적어도 100일, 더욱 바람직하게는 적어도 110일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 120일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 130일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 140일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 150일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 160일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 170일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 180일, 가장 바람직하게는 적어도 184일의 면역 지속기간을 유발한다. 환언하면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 추가 용량 또는 후속 용량 없이도 동물 또는 동물 그룹에게 적어도 100일(110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일 등) 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 184일 동안 PCV2 감염의 임상 징후의 감소된 발생률 또는 경감된 중증도를 제공한다. 항체 검출 분석과 관련하여, 당업자는 적당한 방법과 제품을 알아내어 이용할 수 있을 것이다. ELISA 분석 및 문헌[Nawagitgul, P., et al. Modified indirect porcine circovirus ( PCV ) type 2- based and recombinant capsid protein ( ORF2 )- based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 33-40(2002)(이 문헌의 교시와 내용은 본 발명에 참고인용됨)]에 기술된 절차가 특히 바람직하다.

본 발명은 다른 관점으로, 엠.히오 항원의 유효량과 PCV2 항원의 유효량을 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 엠.히오 항원과 PCV2 항원은 전술한 바와 같이 각각 적어도 1.22 및 1.38의 RP 값을 나타내는 것이 바람직하며, 여기서 엠.히오에 대한 1.22의 RP 값 및 PCV2에 대한 1.38의 RP 값은 상기 엠.히오 양의 1/40 및 상기 PCV2 항원 양의 1/10을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 엠.히오 및 PCV2 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생한다는 것을 의미한다. 따라서, 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 엠.히오 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 엠.히오 항원의 40배 양 및 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 10배 양은 엠.히오 항원과 함께 투여 시, PCV2 감염 및/또는 엠.히오 감염과 관련이 있는 임상 징후에 대하여 보호 면역 반응을 부여하고, 그 임상 징후의 발생률을 감소시키고/시키거나 임상 징후의 중증도를 경감시키거나 예방하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. 환언하면, 전술한 바와 같은 PCV2 항원 및 엠.히오 항원의 양은 복합 백신으로 혼합해서 투여했을 때 두 항원 간에 임의의 음성적 간섭을 극복할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 본 발명은 또한 돼지 서코바이러스 2형 항원과 엠.히오 항원을 함유하되, 용량당 엠.히오 및 PCV2 항원의 양이 각각 적어도 1.22 및 1.38의 상대 효능 값을 나타내고, 이러한 엠.히오 항원에 대한 1.22의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 엠.히오 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 엠.히오 항원의 40배 양에 상당하고 PCV2 항원에 대한 1.38의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 85%의 마우스에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 20배 양에 상당하는 것인 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기 PCV2 항원에 대한 1.38의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 10배 양에 상당하는 것이 바람직하다. 이러한 양태의 일부 바람직한 형태에 따르면, 조성물은 추가로 애주번트를 포함하거나 함유한다. 다양한 애주번트가 본 발명에 유용할 것이고, 당업자라면 선택할 수 있지만, 카보머(carbomer), 특히 카보폴(Carbopol)이 특히 바람직하다. 유리하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 용량 투여로 돼지에게 투여했을 때, 보호 면역 반응을 유발한다. 이러한 단일 용량은 돼지에게 투여했을 때 적어도 100일, 더욱 바람직하게는 적어도 110일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 120일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 130일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 140일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 150일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 160일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 170일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 180일, 가장 바람직하게는 적어도 184일의 면역 지속기간을 유발한다. 환언하면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 추가 용량 또는 후속 용량 없이도 동물 또는 동물 그룹에게 적어도 100일(110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일 등) 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 184일 동안 엠.히오 및 PCV2 감염의 임상 징후의 감소된 발생률 또는 경감된 중증도를 제공한다. 항체 검출 분석과 관련하여, 당업자는 적당한 방법과 제품을 알아내어 이용할 수 있을 것이다. ELISA 분석 및 문헌[Nawagitgul, P., et al. Modified indirect porcine circovirus ( PCV ) type 2- based and recombinant capsid protein ( ORF2 )- based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 33-40(2002)(이 문헌의 교시와 내용은 본 발명에 참고인용됨)]에 기술된 절차는 특히 PCV2 항체 검출 분석에 바람직하고, IDEXX Herdchek M hyo 검사 키트는 엠.히오 항체 검출 분석에 특히 바람직하다.

다른 관점에서, 본 발명은 엠.히오에 대하여 돼지의 보호 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 필요로 하는 동물, 바람직하게는 돼지에게 투여하는 단계를 포함한다. 면역원성 조성물은 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 포함하는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 각 용량에서 엠.히오 항원의 양은 상대효능(RP) 값이 적어도 1.22인 것으로, 여기서 엠.히오에 대한 1.22의 RP 값은 상기 엠.히오 항원 양의 1/40을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 엠.히오 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생시키는 것을 의미한다. 결과적으로, 본 발명은 추가로 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 함유하되, 용량당 엠.히오 항원의 양이 적어도 1.22의 상대 효능 값을 나타내고, 이 1.22의 RP 값은 치료후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%의 마우스, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 엠.히오 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 엠.히오 항원의 40배 양에 상당하는 것인 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하여, 마이코플라즈마 히오뉴모니에(엠.히오)에 대하여 돼지의 보호 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 일부 바람직한 형태에서, 조성물은 추가로 애주번트를 포함하거나 함유한다. 다양한 애주번트가 본 발명에 유용할 것이고, 당업자라면 선택할 수 있지만, 카보머(carbomer), 더 더욱 바람직하게는 카보폴(Carbopol)이 특히 바람직하다. 유리하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 용량 투여로 돼지에게 투여했을 때, 보호 면역 반응을 유발한다. 이러한 단일 용량은 돼지에게 투여했을 때 적어도 100일, 더욱 바람직하게는 적어도 110일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 120일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 130일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 140일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 150일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 160일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 170일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 180일, 가장 바람직하게는 적어도 184일의 면역 지속기간을 유발한다. 환언하면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 추가 용량 또는 후속 용량 없이도 동물 또는 동물 그룹에게 적어도 100일(110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일 등) 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 184일 동안 엠.히오 감염의 임상 징후의 감소된 발생률 또는 경감된 중증도를 제공한다. 항체 검출 분석과 관련하여, 당업자는 적당한 제품을 알아내어 이용할 수 있을 것이다. ELISA 분석 및 특히 IDEXX Herdchek M. hyo 검사 키트(IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME)가 바람직하다.

본 발명은 다른 관점으로, PCV2에 대한 돼지의 보호 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 필요로 하는 동물, 바람직하게는 돼지에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 면역원성 조성물은 돼지 서코바이러스 2형 항원 및 엠.히오 항원을 포함하는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 각 용량에서 PCV2 항원의 양이 적어도 1.38의 상대 효능(RP) 값을 나타내는 것이고, 여기서 PCV2에 대한 1.38의 RP 값이란, 상기 PCV2 항원의 양의 1/20을 투여한 마우스의 적어도 85%가 PCV2 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생한다는 것을 의미한다. 특히, PCV2에 대한 1.38의 RP 값은 상기 PCV2 항원의 양의 1/10을 투여한 마우스의 적어도 95%, 바람직하게는 100%가 PCV2 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생하는 것을 의미하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 본 발명은 PCV2 항원 및 엠.히오 항원을 함유하되 용량당 PCV2 항원의 양이 적어도 1.38의 상대 효능 값을 나타내고, 여기서 1.38의 RP 값이란 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 마우스의 적어도 85%에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 20배 양에 상당하는 것인 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 포함하여 PCV2에 대한 돼지의 보호 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 1.38의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 10배 양에 상당하는 것이 좋다. 이러한 양태의 일부 바람직한 형태에서, 조성물은 추가로 애주번트를 포함하거나 함유한다. 다양한 애주번트가 본 발명에 유용할 것이고, 당업자라면 선택할 수 있지만, 카보머(carbomer), 더 더욱 바람직하게는 카보폴(Carbopol)이 특히 바람직하다. 유리하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 용량 투여로 돼지에게 투여했을 때, 보호 면역 반응을 유발한다. 이러한 단일 용량은 돼지에게 투여했을 때 적어도 100일, 더욱 바람직하게는 적어도 110일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 120일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 130일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 140일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 150일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 160일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 170일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 180일, 가장 바람직하게는 적어도 184일의 면역 지속기간을 유발한다. 환언하면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 추가 용량 또는 후속 용량 없이도 동물 또는 동물 그룹에게 적어도 100일(110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일 등) 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 184일 동안 PCV2 감염의 임상 징후의 감소된 발생률 또는 경감된 중증도를 제공한다. 항체 검출 분석과 관련하여, 당업자는 적당한 방법과 제품을 알아내어 이용할 수 있을 것이다. ELISA 분석 및 문헌[Nawagitgul, P., et al. Modified indirect porcine circovirus ( PCV ) type 2- based and recombinant capsid protein ( ORF2 )- based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 33-40(2002)(이 문헌의 교시와 내용은 본 발명에 참고인용됨)]에 기술된 절차가 특히 바람직하다.

본 발명은 또 다른 관점으로, 엠.히오 감염 및 PCV2 감염에 대하여 보호 면역 반응을 유도하거나 유발하는 방법을 제공한다. 바람직한 형태에서, 이러한 관점은 엠.히오 항원의 유효량과 PCV2 항원의 유효량을 함유하는 면역원성 조성물을 포함한다. 엠.히오 항원과 PCV2 항원은 전술한 바와 같이 각각 적어도 1.22 및 1.38의 RP 값을 나타내는 것이 바람직하며, 여기서 엠.히오에 대한 1.22의 RP 값 및 PCV2에 대한 1.38의 RP 값은 상기 엠.히오 양의 1/40 및 상기 PCV2 항원 양의 1/10을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 엠.히오 및 PCV2 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생한다는 것을 의미한다. 결과적으로, 본 발명은 또한 PCV2 항원과 엠.히오 항원을 함유하되, 용량당 엠.히오 및 PCV2 항원의 양이 각각 적어도 1.22 및 1.38의 상대 효능 값을 나타내고, 이러한 엠.히오 항원에 대한 1.22의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 엠.히오 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 엠.히오 항원의 40배 양에 상당하고 PCV2 항원에 대한 1.38의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 85%의 마우스에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 20배 양에 상당하는 것인 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하여 엠.히오 및 PCV2에 대하여 돼지의 보호 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 상기 PCV2 항원에 대한 1.38의 RP 값은 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 적어도 95%, 바람직하게는 100%의 마우스에서 검출가능한 PCV2 특이적 항체 반응을 유도하는데 필요한 PCV2 항원의 10배 양에 상당하는 것이 바람직하다. 이러한 양태의 일부 바람직한 형태에 따르면, 조성물은 추가로 애주번트를 포함하거나 함유한다. 다양한 애주번트가 본 발명에 유용할 것이고, 당업자라면 선택할 수 있지만, 카보머(carbomer), 특히 카보폴(Carbopol)이 특히 바람직하다. 유리하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 용량 투여로 돼지에게 투여했을 때, 보호 면역 반응을 유발한다. 이러한 단일 용량은 돼지에게 투여했을 때 적어도 100일, 더욱 바람직하게는 적어도 110일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 120일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 130일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 140일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 150일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 160일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 170일, 더 더욱 바람직하게는 적어도 180일, 가장 바람직하게는 적어도 184일의 면역 지속기간을 유발한다. 환언하면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 용량은 추가 용량 또는 후속 용량 없이도 동물 또는 동물 그룹에게 적어도 100일(110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일 등) 동안, 가장 바람직하게는 적어도 184일 동안 엠.히오 및 PCV2 감염의 임상 징후의 감소된 발생률 또는 경감된 중증도를 제공한다. 항체 검출 분석과 관련하여, 당업자는 적당한 방법과 제품을 알아내어 이용할 수 있을 것이다. ELISA 분석 및 문헌[Nawagitgul, P., et al. Modified indirect porcine circovirus ( PCV ) type 2-based and recombinant capsid protein ( ORF2 )- based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9: 33-40(2002)(이 문헌의 교시와 내용은 본 발명에 참고인용됨)]에 기술된 절차는 특히 PCV2 항체 검출 분석에 바람직하고, IDEXX Herdchek M hyo 검사 키트는 엠.히오 항체 검출 분석에 특히 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "보호 면역 반응"은 엠.히오 또는 PCV2 감염에 의한 임상적, 병리학적 또는 조직병리학적 감염 징후를 완전 예방하는 것을 비롯하여 그 이하의 수준까지 발생률을 감소시키거나 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.

본 발명은 다른 관점으로, PCV2 및 엠.히오에 대한 면역 반응을 자극하는 조성물, 바람직하게는 항원성 또는 면역원성 조성물, 예컨대 백신의 제조방법을 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 i) PCV2의 ORF2 유래의 재조합 DNA를 함유하는 작제물을 바이러스에 형질감염시키는 단계, ii) 성장 배지에서 형질감염된 바이러스로 세포를 감염시키는 단계, iii) 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유발하는 단계, iv) 발현된 ORF2 단백질을 상청액으로부터 회수하는 단계, 및 v) 회수한 단백질을 적당한 애주번트 및/또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체, 및 엠.히오 박테린 및 적당한 애주번트와 함께 배합하여 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 면역원성 조성물의 성분들은 장기간 안정성이 있어서, 조성물은 함께 혼합한 후 3년까지 동물에게 투여할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물의 바람직한 형태는 RP 값이 약 1.22 이상, 더욱 바람직하게는 약 1.22와 약 4.5 사이, 더 더욱 바람직하게는 약 1.22와 3.5 사이, 가장 바람직하게는 약 1.22와 2.8 사이인 엠.히오 부를 보유할 것이다. 엠.히오의 RP 값은 1.22의 RP 값과 관련이 있는 엠.히오 항원 양의 1/40로 치료한 마우스의 95%, 더욱 바람직하게는 100%가 엠.히오 항원의 투여 후 또는 치료 후에 21일 이내 또는 21일째에 엠.히오-특이적 항체 검출 분석을 통해 엠.히오에 대한 항체의 검출가능한 양을 발생시킬 때, 약 1.22 이상인 것이다.

본 명세서에 사용된 "애주번트"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 예컨대 QuilA, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 수중유중수 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 경질 액체 파라핀유(유럽 약전 종류); 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머로부터 수득되는 스쿠알렌 또는 스쿠알렌 오일과 같은 이소프레노이드 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 더욱 구체적으로 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 구체적으로 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 오일은 에멀젼 형성을 위해 유화제와 함께 사용된다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 구체적으로 경우에 따라 에톡시화되는, 소르비탄, 만나이드(예, 언하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜과 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 구체적으로 Pluronic 제품, 특히 L121이다[Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.) John Wiley and Sons, NY, pp51-94(1995) 및 Todd et al., Vaccine 15: 564-570(1997)].

예를 들어, 서적["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147쪽에 기술된 SPT 에멀젼 및 동일 서적의 183쪽에 기술된 에멀젼 MF59를 사용하는 것도 가능하다.

애주번트의 또 다른 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택된 화합물이다. 유익한 애주번트 화합물은 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체로, 이것은 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교 결합되어 있다. 이 화합물은 카보머(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)란 용어로 알려져 있다. 또한, 당업자는 하이드록실 기를 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이하로 보유하고 적어도 3개의 하이드록실의 수소 원자가 탄소원자 2 이상인 불포화 지방족 라디칼로 교체된 폴리하이드록시화된 화합물과 가교 결합된 아크릴 중합체를 기술하는 미국 특허 2,909,462를 인용할 수도 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 것, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이다. 불포화 라디칼은 자체적으로 다른 치환체, 예컨대 메틸을 함유할 수 있다. 카보폴(BF Goodrich, Ohio, USA)이란 명칭으로 판매되는 제품이 특히 적당하다. 이 제품은 알릴 수크로오스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합되어 있다. 그 중에서, 카보폴 974P, 934P 및 971P를 예로 들 수 있다. 가장 바람직한 것은 카보폴 971P의 사용이다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)도 고려한다. 이 중합체를 물에 용해 시, 산 용액이 수득되고, 이것은 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체를 첨가할 애주번트 용액을 제공하기 위해 중화, 바람직하게는 생리적 pH로 중화될 것이다. 또한, 적합한 애주번트로는 특히 RIBI 애주번트 시스템(Ribi Inc.), Block 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, Avridine 지질-아민 애주번트, 이.콜라이의 열불안정성 장독소(재조합체 등), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

애주번트는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 더 더욱 바람직하게는, 애주번트는 약 100㎍ 내지 약 10mg/용량의 양으로 첨가한다. 더 더욱 바람직하게는, 애주번트는 약 500㎍ 내지 약 5mg/용량의 양으로 첨가한다. 더 더욱 바람직하게는, 애주번트는 약 750㎍ 내지 약 2.5mg/용량의 양으로 첨가한다. 가장 바람직하게는, 애주번트는 약 1mg/용량의 양으로 첨가한다.

따라서, 추가 관점에 따르면, PCV2 및 엠.히오에 대하여 면역 반응을 유발하기 위해, 백신과 같은 항원성 조성물을 제조하는 방법은 i) PCV2 ORF2 단백질을 엠.히오 박테린 및 적당한 애주번트와 혼합하는 단계를 포함한다. 애주번트는 바람직하게는 카보머이고, 더욱 바람직하게는 카보폴 971P이다. 더 더욱 바람직하게는 카보폴 971P는 약 500㎍ 내지 약 5mg/용량의 양으로, 더 더욱 바람직하게는 약 750㎍ 내지 약 2.5mg/용량의 양으로, 가장 바람직하게는 약 1mg/용량의 양으로 첨가한다.

또한, 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡착 지연제 및 이의 유사물을 포함한다.

면역원성 조성물은 추가로 하나 또는 그 이상의 다른 면역조절제, 예컨대 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토킨을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 젠타미신 및 머티올레에이트를 포함할 수도 있다. 본 발명의 상황에 유용한 애주번트 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자라면 쉽게 측정할 수 있지만, 본 발명은 약 50㎍ 내지 약 2000㎍의 애주번트를 함유하는 조성물, 바람직하게는 약 250㎍/ml 용량의 백신 조성물을 고려한다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 약 1㎍/ml 내지 약 60㎍/ml의 항생제, 더욱 바람직하게는 약 30㎍/ml 이하의 항생제를 포함하는 백신 조성물을 고려한다.

"PCV2 항원"은 돼지에게 투여했을 때 PCV2 감염에 대하여 면역 반응을 유도, 자극 또는 증강시킬 수 있는 적어도 하나의 항원을 함유하는 문제의 임의의 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 상기 PCV2 항원은 전체 PCV2 바이러스, 바람직하게는 불활성화된 형태, 변형 또는 약독화된 생 PCV2 바이러스, 적어도 PCV2의 면역원성 아미노산 서열을 함유하는 키메릭 바이러스, 적어도 PCV2의 면역원성 아미노산 서열을 함유하는 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 성분인 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩타이드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"이란 용어는 상기 면역원성 단백질, 면역원성 폴리펩타이드 또는 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 병원체에 대하여 숙주의 면역 반응을 유발하는 임의의 아미노산 서열을 의미한다. 여기에 사용된 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩타이드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"은 임의의 단백질의 전체 길이의 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"이란, 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하여, 관련 병원체에 대하여 면역학적 반응을 유발하는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당업계에 공지된 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 이용해 동정할 수 있다[예컨대, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed., 1997) Human Press, Totowa, New Jersey]. 예를 들어, 선형 에피토프는 고체 지지체 위에 단백질 분자의 부분들에 대응하는 다수의 펩타이드를 동시에 합성하고, 이 펩타이드가 지지체에 부착되어 있는 동안 이 펩타이드를 항체와 반응시킴으로써 측정할 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 미국 특허 4,708,871; Geysen et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al.(1986) Molec. Immunol. 23: 709-715에 기술되어 있다. 이와 유사하게, 형태적 에피토프는 x선 결정학 및 2-차원 핵자기공명 등에 의해 아미노산의 공간적 형태를 측정하여 쉽게 확인할 수 있다. 예컨대, 상기 서적 Epitope Mapping Protocols 참조. 또한, 합성 항원도 상기 정의에 포함되며, 그 예로는 폴리에피토프, 인접 에피토프 및 다른 재조합 항원 또는 합성 유래 항원이 있다. 예컨대, 문헌[Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J . Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998]을 참조한다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 백신 조성물은 PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는 시험관내 배양된 세포에서 발현되고 회수된 상기 단백질을 함유한다. PCV2 ORF2 단백질의 바람직한 예는 국제특허출원 WO 2006-072065에 기술되어 있고, 그 교시와 내용은 전문이 참고인용된다.

간략히 설명하면, 조성물의 제조에 사용되고 또한 본 명세서에 제공된 방법들에 사용된 바와 같은 PCV2 ORF2 DNA 및 단백질은 PCV2 분리물 내에서 고도로 보존적인 도메인으로, 이에 따라 임의의 PCV2 ORF2는 본 명세서에 사용되는 PCV2 ORF2 DNA 및/또는 폴리펩타이드의 근원으로서 효과적일 것이다. 바람직한 PCV2 ORF2 단백질은 서열번호 11에 제시된 것이다. 바람직한 PCV ORF2 폴리펩타이드는 서열번호 5로 제공된 것이지만, 당업자라면 이 서열이 서열 상동성에서 6 내지 10% 만큼 상이하면서 면역원성 조성물에 유용하게 하는 항원성 특징을 보유할 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 변형 항원의 항원성 특징은, 변형 항원이 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 PCV2 ORF2 단백질과 비교했을 때 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%의 보호 면역을 부여하면 그대로 유지되는 것이다. 본 명세서에 사용된 "면역원성 조성물"은 PCV2 ORF2 단백질에 대해 세포-매개 및/또는 항체-매개의 면역 반응이 있는 숙주에서 "면역학적 반응"을 유발하는 PCV2 ORF2 단백질을 의미한다. 이러한 면역원성 조성물은 바람직하게는 PCV2 감염에 대하여 보호 면역 및 이와 관련된 임상 징후를 부여할 수 있다. 일부 형태에서, PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 부가 항원 성분으로 조성물에 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "면역원성 부"란 용어는 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드 각각의 절두형 및/또는 치환형, 또는 단편을 의미한다. 이러한 절두형 및/또는 치환형, 또는 단편은 전체 길이의 ORF2 폴리펩타이드로부터 적어도 6개의 인접 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 절두형 또는 치환형, 또는 단편은 전체 길이의 ORF2 폴리펩타이드의 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 적어도 15개, 더 더욱 바람직하게는 적어도 19개의 인접 아미노산을 보유할 것이다. 이러한 관점에서 2가지 바람직한 서열은 서열번호 9 및 10으로 제공된 것이다. 또한, 이러한 서열들은 더 큰 단편 또는 절두형의 일부일 수도 있는 것으로 이해한다. 본 명세서에 제공된 더욱 바람직한 PCV2 ORF2 폴리펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 하지만, 당업자라면 이러한 서열이 6 내지 20% 가량 서열 상동성이 변동할 수 있으면서 면역원성 조성물에 유용성을 부여하는 항원성 특징을 유지할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 형태에서, ORF2의 절두형 또는 치환형, 또는 단편은 조성물에 항원성 성분으로 사용된다. 이러한 절두형 또는 치환형 또는 단편은 전체 길이의 ORF2 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열번호 3 또는 서열번호 4의 적어도 18개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 절두형 또는 치환형, 또는 단편은 전체 길이의 ORF2 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열번호 3 또는 서열번호 4의 적어도 30개, 더욱 바람직하게는 적어도 45개, 더 더욱 바람직하게는 적어도 57개의 인접 뉴클레오타이드를 보유하는 것이다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이 "서열 동일성"은 2종 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉 참조 서열과 이 참조 서열과 비교되는 주어진 서열 간에 관계를 의미한다. 서열 동일성은 일련의 서열 간에 일치(match)로 측정했을 때 최고의 서열 유사성을 나타내도록 서열을 최적으로 정렬한 후 참조 서열과 주어진 서열을 비교하여 측정한다. 이러한 정렬 후, 서열 동일성은 위치별 기준에 의거해 확인하는데, 예컨대 특정 위치에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 동일하다면, 그 위치의 서열은 "동일"한 것이다. 이러한 위치 동일성의 총 수를 참조 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총 수로 나누면 서열 동일성(%)이 수득된다. 서열 동일성은 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있으며, 그 예로는 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J . Applied Math., 48: 1073 (1988), 이 문헌의 교시들은 본 발명에 참고인용됨]에 기술된 방법이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 서열 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 검사 서열 간에 최대의 일치를 수득하기 위해 설계한다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 주어진 서열 간에 서열 동일성을 측정하는 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다. 이러한 프로그램의 예로는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J . Molec. Biol, 215:403-410 (1990))가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 여타 소스에서 공개적으로 이용가능하다(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J . Molec. Biol, 215:403-410 (1990), 이들의 교시는 본 발명에 참고인용됨). 이 프로그램들은 주어진 서열과 참조 서열 간에 최고의 서열 동일성 수준을 생산하도록 디폴트 갭 가중치(default gap weight)를 이용해 서열을 최적으로 정렬한다. 한 예시로서, 폴리뉴클레오타이드가 참조 뉴클레오타이드 서열과 적어도, 예컨대 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%의 "서열 동일성"이란, 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열이 포함할 수 있는 참조 뉴클레오타이드 서열의 100개 뉴클레오타이드당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더 더욱 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 제외하고는, 주어진 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 환언하면, 참조 뉴클레오타이드 서열과 비교 시, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 더욱 바람직하게는 95%의 동일성이 있는 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오타이드에서, 참조 서열의 뉴클레오타이드 중 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더 더욱 바람직하게는 5% 이하는 결실되거나, 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열의 총 뉴클레오타이드 중 15% 이하, 바람직하게는 10%, 더 더욱 바람직하게는 5% 이하의 다수의 뉴클레오타이드가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어나거나, 이 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 참조 서열의 뉴클레오타이드 중에 개별적으로 산재해서, 또는 참조 서열 내에 하나 이상의 근접 그룹으로 나타날 수 있다. 이와 유사하게, 주어진 아미노산 서열이 참조 아미노산 서열에 대해 적어도, 예컨대 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%의 서열 동일성이 있는 폴리펩타이드란, 주어진 폴리펩타이드 서열이 포함할 수 있는 참조 아미노산 서열의 100개 아미노산당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 더 더욱 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변경을 제외하고는, 주어진 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 환언하면, 참조 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 더욱 바람직하게는 95%인 주어진 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해서, 참조 서열의 아미노산 잔기 중 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더 더욱 바람직하게는 5% 이하는 결실되거나, 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열의 총 아미노산 잔기 수 중 15% 이하, 바람직하게는 10%, 더 더욱 바람직하게는 5% 이하의 다수의 아미노산이 참조 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어나거나, 이 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 참조 서열의 잔기 중에 개별적으로 산재해서, 또는 참조 서열 내에 하나 이상의 근접 그룹으로 나타날 수 있다. 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 다른 것이 바람직하다. 하지만, 보존적 치환은 서열 동일성을 측정할 때에는 일치로 포함되지 않는다.

본 명세서에 사용된 "서열 상동성"은 두 서열의 관련도를 측정하는 방법을 의미한다. 서열 상동성을 측정하기 위해서는 2 이상의 서열을 적절히 정렬시키고, 필요하다면 갭을 도입한다. 하지만, "서열 동일성"과 반대로, 서열 상동성을 측정할 때에는 보존적 아미노산 치환을 일치로 계수한다. 환언하면, 참조 서열과 95%의 서열 상동성인 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 참조 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 85%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%가 다른 아미노산 또는 뉴클레오타이드와 보존적 치환을 포함하거나 일치해야 하고, 또는 참조 서열의 총 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 중 보존적 치환을 제외한 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하의 다수의 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 상동성 서열은 적어도 50개, 더욱 바람직하게는 100개, 더욱 더 바람직하게는 250개, 더 더욱 바람직하게는 500개 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함하는 것이 바람직하다.

"보존적 치환"은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 전반적 기능성이 크게 변화하지 않을 정도로, 크기, 소수성 등의 성질이나 특징이 유사한 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드로 치환된 것을 의미한다.

"분리된"은 자연 상태에서 "인위적으로" 변경된 것을 의미하며, 즉 자연에서 나타나는 경우에는 그 초기 환경에서 변화되거나 분리된, 또는 변화 및 분리된 것을 의미한다. 예를 들어, 생명체에 자연 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니지만, 그 동일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 자연 상태의 공존 물질로부터 분리되었다면, 본 명세서에 이용된 것처럼 "분리된" 것이다.

상기 PCV2 ORF2 단백질은 다음과 같은 것이 바람직하다:

i) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

ii) i)의 폴리펩타이드와 적어도 80% 상동성인 임의의 폴리펩타이드;

iii) i) 및/또는 ii)의 폴리펩타이드의 임의의 면역원성 부;

iv) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열에 포함된 적어도 10개의 인접 아미노산을 함유하는 iii)의 면역원성 부;

v) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 함유하는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드;

vi) v)의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80% 상동성인 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 임의의 폴리펩타이드;

vii) v) 및/또는 vi)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 임의의 면역원성 부;

viii) 상기 면역원성 부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 포함된 적어도 30개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는, vii)의 면역원성 부.

상기 임의의 면역원성 부는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 의해 암호화된 PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 특징을 보유하는 것이 바람직하다.

앞에서 언급한 바와 같이, 조성물의 PCV2 ORF2 부의 상대 효능(RP)은 적어도 1.38, 더욱 바람직하게는 약 1.38 내지 4.5 사이, 더 더욱 바람직하게는 약 1.38 내지 3.5 사이, 더 더욱 바람직하게는 약 1.38 내지 3 사이, 가장 바람직하게는 약 1.38 내지 2.75 사이이다. 엠.히오와 관련하여 RP 값이 적어도 1.22인 측정과 유사하게, PCV2의 RP 값은 1.38의 RP 값과 관련이 있는 PCV2 항원량의 1/20로 치료된 마우스의 85%가 PCV2 항원의 투여 또는 치료 후 21일 이내 또는 21일 째에 PCV2-특이적 항체 검출 분석 시에 PCV2에 대한 항체의 검출가능한 양을 발생할 때 약 1.38 이상이다. PCV2의 RP 값은 1.38의 RP 값과 관련이 있는 PCV2 항원량의 1/10로 치료한 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 PCV2 항원의 투여 또는 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 PCV2-특이성 항체 검출 분석에서 PCV2에 대한 항체의 검출가능한 양을 발생할 때 약 1.38 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물에 사용된 PCV2 ORF2 단백질은 PCV2 ORF2의 분리 및 정제, 표준 단백질 합성 및 재조합 방법을 비롯한 임의의 방식으로 유도될 수 있다. PCV2 ORF2 폴리펩타이드를 수득하는데 바람직한 방법은 미국 특허 출원 일련번호 11/034,797에 상응하는 국제특허출원 WO 2006-072065에도 제공되어 있고, 이 문헌의 교시와 내용은 본 발명에 참고 인용된다.

또 다른 양태에 따르면, 상기 PCV2 항원은 Ingelvac®CircoFLEX, (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA), CircoVac® (Merial SAS, Lyon, France), CircoVent (Intervet Inc., Millsboro, DE, USA), 또는 Suvaxyn PCV-2 One Dose® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, USA), 또는 앞에서 언급한 임의의 백신에 포함된 임의의 PCV2 항원이다. PCV2 항원은 Ingelvac®CircoFLEX에 포함된 것 또는 Ingelvac®CircoFLEX 이다.

"엠.히오 항원"은 돼지에게 투여했을 때 엠.히오 감염에 대하여 면역 반응을 유도, 자극 또는 증진할 수 있는 적어도 하나의 항원을 포함하는 문제의 임의의 조성물을 의미한다. 상기 엠.히오 항원은 바람직하게는 불활성화 형태의 전체 엠.히오 박테린, 변형 또는 약독화된 생 엠.히오 세균, 최소한 엠.히오의 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 바이러스, 또는 엠.히오의 적어도 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 성분인 것이 바람직하다. 엠.히오 항원은 불활성화된 엠.히오 박테린이다. 더욱 바람직하게는 엠.히오 항원은 엠.히오 J-균주 유래인 것이다. 가장 바람직하게는, 엠.히오 박테린은 Ingelvac®MycoFlex 백신(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA)에 포함된 불활성화된 엠.히오 박테린 또는 Ingelvac®MycoFlex이다. 하지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 엠.히오 항원은 또한 다음 백신 조성물에 포함된 어느 하나 중에서 선택될 수도 있다. Porcilis M. hyo, Myco Silencer® BPM, Myco Silencer® BPME, Myco Silencer® ME, Myco Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH(모두 Intervet Inc., Millsboro, DE, USA 제품) Stellamune Mycoplasma (Pfizer Inc., New York, NY, USA), Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn M. hyo, Suvaxyn MH-One (모두 Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, USA (Wyeth) 제품).

주사 시기는 유연성이 있다. 본 명세서에 기술된 조성물은 마이코플라즈마 히오뉴모니에에 노출하기 전 최소 2주 전에 백신접종을 목적으로 돼지를 양돈장에서 이송할 때 그 시기까지 연령이 3주령인 정도로 조기에 돼지에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 피부내, 기관내 또는 질내를 비롯한 모든 통상적인 방식으로 적용할 수 있다. 조성물은 근육내 또는 질내로 바람직하게 적용할 수 있다. 동물 몸체의 경우, 정맥내 주사 또는 표적 조직에 직접 주사를 통해 전술한 약제학적 조성물을 적용하는 것이 유리하다는 것을 입증할 수 있다. 전신 적용 시에는 정맥내, 혈관내, 근육내, 비내, 동맥내, 복강내, 구강 또는 경막내 경로가 바람직하다. 더 많은 국소 적용은 피하, 피부내, 피내, 심장내, 골수내, 폐내, 또는 치료할 조직(결합조직, 뼈조직, 근육 조직, 신경 조직, 상피 조직)에 직접 또는 그 부근에 시술할 수 있다. 치료의 바람직한 기간 및 효과에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 1일 기준으로 1회 또는 수회 간헐적으로 다른 투약량으로 투여할 수 있다. 하지만, 본 명세서에 상세히 설명한 바와 같이, 엠.히오 박테린 및 PCV2 ORF2의 배합은 오로지 1회 용량 이후 상기 조성물을 투여받은 돼지의 엠.히오 및/또는 PCV2 감염과 관련이 있는 임상 징후의 발생률 또는 중증도를 감소시키고/시키거나 효과적인 면역성을 제공하는 면역원성 조성물을 제공한다.

"임상적, 병리학적 및/또는 조직병리학적 징후의 발생률 또는 중증도의 저하 또는 감소"는 이러한 임의의 징후가 백신의 면역학적 활성 성분(들)이 유래된 병원체로 감염되거나 항원공격 받았을 때 백신 또는 면역원성 조성물의 투여를 받지 않은 "대조군"의 동물에 비해 백신 투여 받은 동물에서 발생률 또는 중증도가 감소한다는 것을 의미할 것이다. 이러한 상황에서, "저하" 또는 "감소"란 용어는 앞에서 정의한 대조군에 비해 백신접종 받은 그룹에서 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더 더욱 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100%의 감소를 의미한다.

"임상 징후"는 증상과 같이 살아있는 동물에서 직접 관찰할 수 있는 병원체로 인한 감염의 징후를 의미한다. 대표적인 예는 선택된 병원체에 다르겠지만, 코 분비물, 기면, 기침, 높은 열, 체중 증감, 탈수, 설사, 종창, 파행 등과 같은 것을 포함할 수 있다. PCV2 임상 징후로는 쇠약, 피부 창백, 수척, 호흡 곤란, 설사, 황달을 포함할 수 있다. 엠.히오 감염의 임상 징후로는 마른 기침, 수행 부전 및 폐 병변을 포함한다.

"병리학적" 징후는 현미경적 또는 분자 수준에서 생화학적 검사를 통해 관찰할 수 있거나, 부검 시에 육안으로 관찰할 수 있는 감염의 징후를 의미할 것이다. PCV2의 경우, 병리학적 징후로는 다수의 조직과 기관에서 나타나는 미시적 및 거시적 병변을 포함할 것이며, 림프성 기관이 가장 일반적으로 병변 부위이다.

"조직병리학적" 징후는 감염으로부터 초래되는 조직 변화의 징후를 의미할 것이다.

본 발명의 다른 양태에서, 엠.히오 항원, 바람직하게는 엠.히오 박테린은 돼지의 다른 질환 유발 유기체 유래의 항원과 배합된다. 이러한 경우에, 엠.히오 부의 RP 값은 전술한 바와 같다. 본 발명의 다른 양태에서, PCV2 항원은 돼지의 다른 질환 유발 유기체 유래의 항원과 배합된다. 이러한 경우에, PCV2 부의 RP 값은 전술한 바와 같다. 또한, 본 발명의 다른 양태에서, PCV2 항원 및 엠.히오 항원, 바람직하게는 엠.히오 박테린은 돼지의 다른 질환 유발 유기체 유래의 항원과 배합된다. 이러한 경우에, 엠.히오 및 PCV2 부의 RP 값은 전술한 바와 같다.

상기 돼지의 다른 질환 유발 유기체는 다음 유기체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다: 악티노바실러스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumonia) (1); 아데노바이러스(Adenovirus) (2); 알파바이러스(Alphavirus), 예컨대 동부 말 뇌척수염 바이러스(Eastern equine encephalomyelitis viruses) (3); 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica) (4); 브라키스피라 종(Brachyspira spp.) (5), 바람직하게는 비.히오디엔테리에(B. hyodyentheriae) (6); 비.피오시콜리(B. piosicoli) (7); 브루셀라 수이스(Brucella suis), 바람직하게는 생물형 1, 2 및 3 (8); 고전적 돼지열 바이러스 (9); 클로스트리듐 종(Clostridium spp.) (10), 바람직하게는 클로스트리듐 디피실레(Cl. difficile) (11), 클로스트리듐 퍼프린젠스 A, B 및 C형(Cl. perfringens types A, B, and C) (12), 클로스트리듐 노비이(Cl. novyi) (13), 클로스트리듐 셉티컴(Cl. septicum) (14), 클로스트리듐 테타니(Cl. tetani) (15); 코로나바이러스(Coronavirus)(16), 바람직하게는 돼지 호흡기 코로나 바이러스(Porcine Respiratory Corona virus) (17); 에페리트로주노시스 수이스(Eperythrozoonosis suis)(18); 에리시펠로트릭스 루시오패티에(Erysipelothrix rhusiopathiae) (19); 에세리치아 콜라이(Escherichia coli) (20); 헤모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 바람직하게는 아형 1, 7 및 14 (21); 적혈구응집성 뇌척수염 바이러스(Hemagglutinating encephalomyelitis virus) (22); 일본 뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis Virus) (23); 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)(24); 렙토스피라 종(Leptospira spp.)(25), 바람직하게는 렙토스피라 오스트랄리스(Leptospira australis) (26); 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola)(27); 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa)(28); 렙토스피라 익테로헤모라지케(Leptospira icterohaemorrhagicae) (29); 및 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans) (30); 렙토스피라 포모나(31); 렙토스피라 타라소비(Leptospira tarassovi) (32); 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.) (33); 바람직하게는 엠.아비움(M. avium) (34), 엠.인트라셀룰라레(M. intracellulare)(35) 및 엠.보비스(M.bovis) (36); 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) (37); 돼지 사이토메갈로바이러스(Porcine cytomegalovirus)(38); 돼지 파르보바이러스(Porcine Parvovirus)(39); 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) (PRRS) 바이러스(40); 슈도라비스 바이러스(Pseudorabies virus)(41); 로타바이러스(Rotavirus) (42); 살모넬라 종(Salmonella spp.) (43), 바람직하게는 에스.티피뮤리엄(S. thyphimurium)(44) 및 에스.콜레라에수이스(S. choleraesuis)(45); 스타프. 히이쿠스(Staph. hyicus) (46); 스타필로코커스 종(Staphylococcus spp.) (47), 바람직하게는 스트렙토코커스 종(48), 바람직하게는 스트렙. 수이스(Strep. suis) (49); 돼지 헤르페스 바이러스(Swine herpes virus) (50); 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine Influenza Virus) (51); 돼지 폭스 바이러스(Swine pox virus) (52); 돼지 폭스 바이러스(Swine pox virus) (53); 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus) (54); 돼지 수포성 발진증 바이러스(55); 렙토스피라 하드조(Leptospira Hardjo) (56); 돼지 서코바이러스(Porcine circovirus) (57); 및/또는 마이코플라즈마 히오시노비에(Mycoplasma hyosynoviae) (58).

다음에 돼지 병원체와 관련하여 이루어진 임의의 언급은 병원체, 예컨대 파스퇴렐라 멀토시다를 명명하거나, 또는 앞서 제시한 병원체 뒤의 () 안의 숫자를 참조하여 언급할 수 있다. 예를 들어, 파스퇴렐라 멀토시다에 대한 언급은 파스퇴렐라 멀토시다 또는 (37)로 언급할 수 있다.

따라서, 본 발명은 엠.히오 및/또는 PCV2 감염(들)의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는데 효과적인 면역학적 제제, 및 추가로 돼지 병원체 (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53), (54), (55), (56), (57) 및/또는 (58) 중 임의의 병원체에 의해 유발된 감염을 치료 및/또는 예방하는데 효과적인 면역학적 활성 성분을 포함하거나, 또는 상기 돼지 병원체(들)의 면역학적 활성 성분인, 돼지의 치료 및/또는 예방용 복합 백신에 관한 것이다.

본 명세서에 사용된 "면역학적 활성 성분"은 이 성분이 투여된 동물에서 면역 반응을 유도하거나 자극하는 성분을 의미한다. 바람직한 양태에 따르면, 상기 면역 반응은 상기 성분을 함유하는 미생물 또는 상기 성분에 대해 유도된다. 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 면역학적 활성 성분은 약독화된 미생물, 예컨대 변형 생 바이러스(MLV), 사멸 미생물 및 미생물의 최소한 면역학적 활성 부이다.

본 명세서에 사용된 "미생물의 면역학적 활성 부"는 상기 성분이 투여된 동물에서 면역 반응을 유도하거나 자극하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 미생물의 단백질-, 당- 및/또는 당단백질-함유 분획을 의미한다. 바람직한 양태에 따르면, 상기 면역 반응은 미생물의 면역학적 활성 부에 대해 또는 상기 면역학적 활성 부를 포함하는 미생물에 대해 유도된다.

또 다른 관점에 따르면, 복합 백신의 또 다른 면역학적 활성 성분은 Enterisol® Ileitis, Enterisol® Ileitis FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterisol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC, Ingelvac® AR4, Ingelvac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-G1, Reprocyc® PRRS PLE, Reprocyc® PLE, Tetguard™, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plus Parasuis(모두 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, USA) 제품); Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilis APP, Porcilis AR-T, Porcilis AR-T DF, Porcilis Porcoli, Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, Porcilis Porcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I.D.A.L., Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Rhinogen® BPE, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® E II, Sow Bac® CE II, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSystem® Pillmune, ProSystem® Rotamune® with Imugan® II, ProSystem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG-Emune® Rota with Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSystem® TG-Emune® with Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ with Spur®, MaGESTic® 7 with Spur®, MaGESTic® 8 with Spur®, End-FLUence® with Imugen® II, End-FLUence® 2, PRRomiSE®, PRV-Begonia with Diluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® with Imugen® II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (모두 Intervet Inc. (Millsboro, DE, USA) 제품); Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- (모두 Merial LTD (Duluth, GA) 제품); ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®, ER BAC® Leptoferm-5®, Farrowsure®, Farrowsure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/ER BAC PLus®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSURE™/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/RespiSure 1 ONE®/ER BAC Plus®, FLUSURE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE™/RESPISURE 1 ONE®, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Respisure One, Respisure®, Respisure 1 ONE®, Respisure 1 One®/ER Bac Plus®, Enduracell T, Zylexis (이전에 Baypamune으로 공지됨), Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm- 5°°Parvo-Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®-Killed, PR- Vac®, PR- Vac Plus™ (모두 Pfizer Inc. (New York, NY, USA) 제품); Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn Aujeszky Bartha + Diluent, Suvaxyn Aujeszky Bartha + o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783 + o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, M. hyo Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend® APP, Suvaxyn RespiFend® HPS, Suvaxyn RespiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Suvaxyn® EC-4, Suvaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® E-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot (모두 Fort Dodge Animal Health 제품 (Overland Park, KS, USA (Wyeth)); SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMUNE®-CR, AR-PAC®-PD+ER, AR-PARAPAC®+ER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Excell®3, MaxiVac® H1N1, MaxiVac® H3N2, MaxiVac®-FLU, MaxiVac®-M+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAP AC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhusigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax plus, M-Parapac™SS PAC® (모두 쉐링-플라우 애니멀 헬쓰 코포레이션(Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA) 제품); AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLASSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN- MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (모두 레보레이토리오스 히프라 에스.에이.(Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, Spain) 제품); Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 (모두 IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany) 제품); Mypravac Suis (Albrecht GmbH, Germany); Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P, Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini Shield™ TX4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD, Clostratox® C, Clostratox® Ultra C 1300, Porcine Ecolizer® 3 + C, Porcine Pili Shield ™+C, Porcine Pili Shield ™Porcine Ecolizer® 3, Ery Serum™Ery Shield™Ery Vac Oral, Ery Shield™ +L5, PanSTAR™ Ery, Erycell™Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™ 5, Myco Shield™Salmo Shield® 2, Salmo Shield® Live, Amitox Tet™C. Perfringens Type A Toxoid(모두 Novartis Animal Health, Basel, Switzerland) 제품); Nitro-Sal (Akro); 또는 전술한 조성물들에 포함된 임의의 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

이하 실시예는 본 발명에 따른 바람직한 재료와 절차를 설명한다. 하지만, 이러한 실시예는 단지 예증을 위한 것으로, 여기에 어떠한 것도 본 발명의 전체 범위에 대한 제한으로 간주해서는 안 된다.

실시예 1

본 연구 설계는 복합 산물에서 엠.히오를 2종의 다른 내포 수준으로 한, 완전 용량 및 2 x 1/2 용량에서 PCV2-엠.히오의 복합 효능을 평가하고, 1가 엠.히오와 비교하여 복합 산물의 임의의 간섭을 입증하도록 조성했다.

재료 및 방법:

돼지는 6개 그룹으로 나누었다. 항원공격 그룹(그룹 1-5)은 모두 각 그룹당 돼지 약 19 마리였다. 치료를 받지 않고 항원공격도 받지 않은 돼지를 포함한 대조 그룹(그룹 6)은 5마리의 돼지로 구성되었다. 돼지들을 모두 연구 61일째 부검했다. 조사 스케줄은 이하 표 1에 제시했다.

연구 일 (대략)	연구 내용
0일 전 (D0)	ID 돼지; 건강 조사
D0 전	돼지를 5개 그룹 중 한 그룹으로 무작위 배정함
D-2	모든 돼지: 혈액 샘플 수집; 임상 평가
D0	모든 돼지: 임상 평가
D0	조사용 수의용 산물 1(IVP1)을 그룹 1에 투여; 조사용 수의용 산물 2(IVP2)를 그룹 2에 투여; 조사용 수의용 산물 3(IVP3)을 그룹 3에 투여; 조사용 수의용 산물 3(IVP3)을 그룹 4에 투여; 대조용 산물(CP)을 그룹 5에 투여.
D1 내지 D33	모든 돼지: 임상 평가
D12	모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집. IVP-3을 그룹 3에 투여; CP는 그룹 5에 투여
D32	적어도 완전한 대조 그룹(그룹 6)을 별도의 방으로 이동
D33	모든 돼지: 혈액 샘플 수집 모든 돼지: 마취; 병독성 엠.히오뉴모니에 균주 232로 항원공격
D32 내지 D63	모든 돼지: 매일 임상 관찰
D47	모든 돼지: 혈액 샘플 수집
D61	모든 돼지: 혈액 샘플 수집 모든 돼지: 안락사; 부검; 폐 점수부여; 폐 샘플 수집

이것은 0일째(D0) 대략 21±6일령인 최소 100마리의 새끼돼지에서 수행된 백신접종-항원공격 효능 연구이다.

연구를 시작하기 전에, 새끼돼지의 혈청을 뽑아 엠.히오뉴모니에 및 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 대한 혈청학적 상태에 대해 스크리닝했다. 혈청에서 엠.히오뉴모니에 및 PRRSV 항체가 음성인 새끼돼지만을 본 연구에서 고려했다. 표 2는 본 연구를 정리한 것이다.

그룹	마리	D0에서의 치료	D12에서의 치료	D33에서 엠.히오뉴모니에를 이용한 항원공격	부검일
1	≥19	목 부위에 IVP -1 (50ml: 엠.히오 박테린 50ml) IM 1.0ml	N/A	예	D6l
2	≥19	목 부위에 IVP -2 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 2.0ml	N/A	예	D61
3	≥19	목 부위에 IVP -3 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 1.0ml	목 부위에 IVP -3 (100ml: 엠.히오 백신 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 1.0ml	예	D61
4	≥19	목 부위에 IVP -3 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 2.0ml	N/A	예	D61
5	≥19	목 부위에 CP (50ml 식염수) IM 2.0ml	목 부위에 CP (50ml 식염수) IM 1.0ml	예	D61
6	≥5	N/A	N/A	N/A	D61

IVP-1(1가 엠.히오)은 1.44의 방출 RP 및 18개월째 1.22의 RP를 나타내는 시리얼 273-011B였다. IVP-2(PCV2-엠.히오)는 엠.히오 시리얼 273-011B(18개월째 1.22의 RP)를 이용했고, PCV2 시리얼 309-035(방출 RP 1.38) IVP-3(PCV2- 엠.히오)은 엠.히오 시리얼 273-010B(방출 RP 2.8) 및 PCV2 시리얼 309-035(방출 RP 1.38)로 구성되었다.

D0 이전에, 모든 돼지는 전부 6 그룹 중 하나로 무작위로 할당했다. 그룹 1은 돼지 ≥19마리로 구성되었고 엠.히오 백신 치료 그룹(조사용 수의용 산물-1(IVP-1)) 치료된 그룹으로 할당했다. 그룹 2는 ≥19마리의 돼지로 구성되었고, 엠.히오-PCV2 백신(조사용 수의용 산물-2(IVP-2)) 치료 그룹으로 할당했고 0일째 1 x 2.0ml 용량으로 투여했다. 그룹 3은 ≥19마리 돼지로 구성되었고, 엠.히오-PCV2 백신 치료 그룹(IVP-3)으로 할당하여, 0일과 12일째에 1.0ml 용량을 투여했다. 그룹 4는 ≥19마리 돼지로 구성되었고 0일째 엠.히오-PCV2 백신(IVP-3) 1 x 2.0ml를 투여받았다. 그룹 5는 항원공격 대조군으로 제공했고, 0일째 대조용 산물 2.0ml와 12일째 대조용 산물 1.0ml를 투여받았다. 그룹 6은 완전한 대조군으로 제공하여 어떠한 산물도 투여받지 않았다. 0일 전에, 각 돼지는 전반적인 건강에 대한 조사를 받고 각각의 혈액을 채취했다.

0일째, 1) 그룹 1로 할당된 ≥19마리 새끼돼지는 IVP-1 IM 1.0ml를 투여받았다; 2) 그룹 2로 할당된 ≥19마리 새끼돼지는 IVP-2 IM 2.0ml를 투여받았다; 3) 그룹 3으로 할당된 ≥19마리 새끼돼지는 0일과 12일에 IVP-3 IM 1.0ml를 투여받았다; 4) 그룹 4로 할당된 ≥19마리 새끼돼지는 0일에 IVP-3 IM 2.0ml를 투여받았다; 5) 그룹 5로 할당된 ≥19마리 새끼돼지는 연구 0일에 CP IM 2.0ml, 연구 12일에 IM 1.0ml를 투여받았다; 6) 그룹 6으로 할당된 ≥5마리 새끼돼지는 산물을 투여받지 않고 완전한 대조군으로 제공했다.

연구 0일에는 귀 밑과 어깨 지점 사이 중간인 우측 목 부위로 치료를 받았다. 연구 12일에는 귀 밑과 어깨 지점 사이 중간인 좌측 목 부위로 치료를 받았다. 모든 새끼돼지는 D1부터 D33까지 모든 부정적 사건 및 전반적 건강에 대해 매일 관찰했다. D33에 전체 새끼돼지의 혈액을 샘플링했다. D33에, 각 돼지에게 독성 엠.히오뉴모니에 10ml를 기관내 공격했다. D32부터 D61까지 질환의 임의의 임상 징후에 대해 모든 돼지를 매일 관찰했다. D47과 D61에 모든 돼지의 혈액 샘플을 수집했다. IVP 투여 전에 수집한 혈액 샘플은 엠.히오뉴모니에 및 PRRS 혈청학에 대해 검사했다. D12, D33, D47 및 D61에 수집한 혈액 샘플은 엠.히오뉴모니에 혈청학에 대해서만 검사했다. D61에, 모든 돼지를 안락사시키고 부검했다. 폐와 기관을 떼어내고 폐의 점수를 매겼다. 각 폐에서 샘플을 취하여 엠.히오뉴모니에 DNA에 대해 PCR로 검사했다. 연구 목적이 달성되었는지를 측정하기 위해, 그룹 1, 2, 3 및 4의 폐 병변 점수 데이터의 통계적 유효 차이에 대해 대조군(그룹 5)과 비교했다. 그룹 6의 데이터는 모든 통계 분석에 포함시키지 않고 단지 정보 목적으로만 사용했다. 그룹 1, 2, 3 및 4와 대조군(그룹 5) 간에 분석된 다른 엠.히오뉴모니에 파라미터로는 엠.히오뉴모니에 혈청학, 백신접종후 임상 평가 및 항원공격후 임상 징후가 있다. 엠.히오뉴모니에 DNA의 존재에 대한 PCR 검사는 효과적인 항원공격을 입증하기 위해 폐에서 채취한 샘플에서 완수했다.

결과 및 고찰:

부검 시에 폐의 점수를 매겼다. 그룹 1의 한 동물에서는 경화 및 다발 농양이 있었고 그룹 2의 한 동물에서는 경화 및 흉막염이 있었다. 이 두 동물과 함께, 그리고 이 두 동물 없이 통계 분석을 수행했다. 이하에 제시된 바와 같이, 그룹 3은 백신접종 그룹 중 가장 낮은 폐 점수, 즉 2.20의 점수를 나타냈다. 그룹 4는 백신접종 그룹 중 가장 높은 폐 점수, 즉 4.19의 점수를 나타냈다. 그룹 1과 2는 각각 동물 729와 712를 제외했을 때, 더 낮은 폐 점수, 즉 상기 동물의 제외 시에 그룹 1은 2.13의 폐 점수 및 그룹 2는 2.56의 폐 점수를 나타냈다. 모든 백신접종 그룹의 폐 점수는 항원공격을 하고 백신 투여는 하지 않은 그룹 5의 폐 점수(14.27)보다 훨씬 낮았다.

폐 점수:

다음은 통계적 쌍체(pairwise) 비교 결과를 정리한 것이다. 이것은 상반 요인이 있는 두 동물과 함께 한 분석과 상기 두 동물을 제외한 분석을 포함한다.

쌍체 검정 결과-점수

모든 백신접종 그룹은 대조군과 비교했을 때 통계적으로 유의적인 결과를 나타냈다. 2x 1/2 용량과 1x2ml 용량(그룹 3 및 4) 간에는 차이가 있었다. 이들 그룹의 폐 점수는 각각 2.2 및 4.19였다. 또한, 1가 그룹과 고 엠.히오 항원 내포 콤보 그룹(그룹 1 대 4) 간에도 차이가 있었다. 이 연구 결과는 PCV2와 함께 엠.히오를 돼지에게 투여했을 때 면역원성 효과를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 엠.히오 성분의 효능을 보존할 수 있다는 놀라운 결과를 제공한다. 또한, 이 결과는 조성물의 단일 용량이 빠르고 장기 지속성 면역을 제공한다는 것을 보여준다. 이러한 종류의 단일 용량은 시간과 수작업을 덜 필요로 하고 돼지도 스트레스를 덜 받는다.

실시예 2

본 연구 설계는 복합 백신의 면역 지속기간을 측정하기 위해 조성한 것이다.

재료 및 방법:

돼지는 6 그룹으로 분할했다. 항원공격 그룹(그룹 1-5)은 모두 각 그룹 당 돼지가 약 19마리였다. 치료받지 않고 항원공격도 받지 않은 돼지를 함유하는 대조군(그룹 6)은 그룹에 돼지가 5마리였다. 조사 스케줄은 이하 표 3에 제시했다.

그룹	마리	D0 치료	D12 치료	D33에 엠.히오뉴모니에 항원공격
1	≥19	목 부위에 IVP -1 (엠.히오 박테린 50ml) IM 1.0ml	N/A	예
2	≥19	목 부위에 IVP -2 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 2.0ml	N/A	예
3	≥19	목 부위에 IVP -3 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 1.0ml	목 부위에 IVP -3 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 1.0ml	예
4	≥19	목 부위에 IVP -3 (100ml: 엠.히오 박테린 50ml 및 PCV2 백신 50ml) IM 2.0ml	N/A	예
5	≥19	목 부위에 CP (50ml 식염수) IM 2.0ml	목 부위에 CP (50ml 식염수) IM 1.0ml	예
6	≥5	N/A	N/A	N/A

항원공격 그룹의 돼지는 연구 D184에 항원공격을 받았다. 모든 새끼돼지는 모든 부정적 사건과 전반적 건강에 대해 D1부터 D33까지 매일 관찰했다. D33에 모든 새끼돼지의 혈액을 수집했다. D184에 각 돼지에게 독성 엠.히오뉴모니에 10ml로 항원공격을 수행했다. D32부터 D184까지 질환의 임의의 임상 징후에 대해 모든 돼지를 매일 관찰했다. D47과 D61에 모든 돼지의 혈액을 채취했다. IVP 투여 전에 수집한 혈액 샘플은 엠.히오뉴모니에 및 PRRS 혈청학에 대해 검사했다. D184에 모든 돼지를 안락사시키고 부검했다. 폐와 기관을 떼어내어 폐의 점수를 매겼다.

결과 및 고찰

돼지를 부검한 후 폐를 떼어내고 폐 병변에 대해 폐를 관찰했다. 백신접종된 그룹(그룹 1-4)은 평균 총 폐 병리가 6.2%(P>0.0023)였고, 항원공격 대조군(그룹 5)은 평균 총 폐 병리가 14.9%였으며, 완전 대조군(그룹 6)은 평균 총 폐 병리가 1.6%였다. 이러한 결과는 이하 표 4에 정리했다.

백신접종 26주 후 Ingelvac MycoFLEX의 효능

치료 그룹	평균 총 폐 병리(폐의 %)
Ingelvac MycoFLEX	6.2%(P<0.0023)
항원공격 대조군	14.9%
완전 대조군	1.6%

본 연구 결과는 엠.히오 및 PCV2의 백신 배합이 돼지에서 적어도 184일 또는 백신접종 후 26주인 장기 지속성 효과를 나타낸다는 것을 시사한다. 이것은 엠.히오 및 PCV2 항원의 배합이 신규 배합이라는 점에서 놀라운 결과이다.

실시예 3

본 연구는 PCV2 항원과 엠.히오 항원을 혼합할 때 관찰된 간섭의 양을 측정하기 위해 수행했다. 본 연구는 백신의 엠.히오 성분이 PCV2의 존재 중에서도 유효하다는 것을 입증했다.

재료 및 방법

돼지는 백신접종 시에 3주령±5일령이었다. 그룹 1에게는 박테린 형태의 엠.히오 항원을 2ml 단일 용량으로 백신접종했다. 그룹 2에게는 동량의 엠.히오 항원과 PCV2 항원을 2ml 단일 용량으로 백신접종했다. 그룹 3은 항원공격 대조군이고 그룹 4는 완전 대조군이다. 그룹 1 내지 3에게는 이어서 D33에 독성 엠.히오 분리물을 항원공격했다. 본 연구에서 모든 동물은 D61에 부검했다.

결과 및 고찰

부검 후, 폐의 점수를 매겼다. 엠.히오 항원으로 백신접종된 그룹 1은 5.5%(P>0.001)의 평균 총 폐 병리를 나타냈다. 엠.히오 항원과 PCV2 항원으로 백신접종한 그룹 2는 3.9%(P>0.001)의 평균 총 폐 병리를 나타냈다. 항원공격 대조군인 그룹 3은 14.3%의 평균 총 폐 병리를, 완전 대조군인 그룹 4는 0의 평균 총 폐 병리를 나타냈다. 결과는 이하 표 5에 정리했다.

1가로서 및 CircoFLEX와 혼합 후의 Ingelvac MycoFLEX의 효능

치료 그룹	평균 총 폐 병리(폐의 %)
Ingelvac MycoFLEX	5.5%(P<0.001)
CircoFLEX와 혼합한 MycoFLEX	3.9%(P<0.001)
항원공격 대조군	14.3%
완전 대조군	0

본 연구의 결과는 엠.히오 항원만으로 백신접종한 돼지와 엠.히오 및 PCV2 항원의 배합물을 백신접종한 돼지 간에 폐 병리의 차이가 통계적으로 유의적이지 않음을 보여준다. 따라서, 본 연구는 놀랍게도 PCV2 항원이 엠.히오 항원 성분의 면역원성 효과를 간섭하지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 엠.히오 항원과 PCV2 항원을 함유하는 복합 백신이 엠.히오의 감염에 효능이 있게 해준다. 또한, 이러한 항원의 신규 배합이 혼합되어 단일 용량 후 그 병원체들에 대해 필요한 보호 효과를 제공할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 4

본 연구는 PCV2로 항원공격되었을 때, 엠.히오 항원과 PCV2 항원을 포함한 조성물의 효능을 측정하기 위한 것이다.

재료 및 방법

PCV2 효능 평가는 60마리의 제왕절개로 꺼내어 초유를 먹이지 않은 새끼돼지에게 수행했다. 약 3주령의 새끼돼지에게 Ingelvac® MycoFLEX™, Ingelvac® PRRS MLV™ 및 Ingelvac® CircoFLEX™을 단일 2ml 용량으로 백신접종했다. 백신접종 후 31일째, 백신접종된 동물 및 대조용 동물에게 독성 PCV2 항원공격 바이러스를 투여했다. 항원공격물을 투여하고 22일 후에, 모든 동물을 안락사시키고 선택 조직을 떼어내어 PCV2에 대한 면역조직화학(IHC) 및 조직학 검사를 위해 맡겼다. 새끼돼지의 취급 및 사육에 대한 모든 절차는 실시예 1에 기술된 바와 같이 준수했다.

결과 및 고찰

PCV2 효능 평가의 기준은 림프구 고갈, 림프구 염증 및 림프구 IHC였다. 백신접종 그룹은 림프구 고갈 0%, 림프구 염증 4.2%(1/24), 및 림프구 IHC 8.3%(2/24)를 나타냈다. 대조군은 림프구 고갈 83.3%(20/24), 림프구 염증 87.5%(21/24) 및 림프구 IHC 91.7%(22/24)를 나타냈다. 결과는 이하 표 6에 정리했다.

PCV2 1차 항원공격 결과의 요약

치료	림프구 고갈 + /총합 (%)	림프구 염증 + /총합 (%)	림프구 IHC + /총합 (%)
백신	0/24 (0.0%)	1/24 (4.2%)	2/24 (8.3%)
대조군	20/24 (83.3%)	21/24 (87.5%)	22/24 (91.7%)
그룹 간의 P-값	<0.0001	<0.0001	<0.0001

백신 혼합물이 원인일 수 있는 주사 부위 또는 다른 부정적 반응은 전혀 나타나지 않았다.

이러한 결과는 실시예 1에 기술된 엠.히오 항원공격 연구의 결과와 함께, 단일 2ml 용량으로 전달된 엠.히오 항원과 PCV2 항원의 혼합물이 엠.히오 및 PCV2에 의한 감염에 대해 효능적임을 입증한다. 상기 항원의 혼합능은 엠.히오 및 PCV2 병원균에 대한 필요한 보호 효과를 제공할 뿐만 아니라 주사 부위의 수를 감소시키고 이어서 동물에게 가해지는 스트레스를 줄이면서 각 백신의 안전성을 희생시킴이 없이 2가지 분리 백신을 투여하는데 필요한 노동을 감소시키는 역할을 한다. 또한, 이 결과는 백신 배합이 PCV2 감염에 대해 효능이 있음을 입증한다.

실시예 5

본 실시예는 본 발명에 따른 엠.히오 항원 또는 PCV2 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 투여한 후 엠.히오 또는 PCV2에 대한 항체를 검출가능한 수준으로 생산하는 마우스의 수를 측정했다.

재료 및 방법

항체 생산은 각각 마우스 20마리씩인 5개의 다른 치료 그룹의 마우스에서 측정했다. 제1 그룹에게는 엠.히오 항원 용량을 투여했고, 제2 그룹 및 제3 그룹에게는 PCV2 항원 용량을 투여했으며, 마지막 2 그룹에게는 대조군으로서 생리식염수 및 카보폴(Carbopol) 용량을 투여했다. 그룹 1의 각 마우스에게는 방출 RP가 1.44이고 18개월째 RP가 1.22인 시리얼 273-011B의 IVP-1(1가 엠.히오 항원)을 0.1ml 투여했다(실시예 1 참조). 투여 전에 그룹 1의 각 용량에서 엠.히오 항원은 1:4로 희석했다. 따라서, 마우스에게 투여된 항원의 양은 실시예 1에서 돼지에게 투여한 항원 양보다 40배 적다. 그룹 2의 각 마우스에게는 PCV2 항원 시리얼 309-035(방출 RP 1.38)를 0.2ml 투여했다(상기 실시예 1 참조). 그룹 1의 엠.히오 항원과 유사하게, 그룹 2의 각 용량당 PCV2 항원은 생리식염수로 1:2로 희석하여 상기 실시예 1에서 돼지에게 투여한 PCV2 항원의 1/10을 함유했다. 그룹 3의 각 마우스에게는 생리식염수로 1:4로 희석하여 상기 실시예 1에서 돼지에게 투여한 PCV2 항원의 1/20을 함유한 PCV2 항원 시리얼 309-035(방출 RP 1.38)를 0.2ml 투여했다. 그룹 4 및 5에게는 생리식염수/카보폴을 0.1ml(그룹 4) 또는 0.2ml(그룹 5)씩 투여했다. 21일 후, 항체 생산은 그룹 1과 4에 대해서는 특이적 엠.히오 항체 검출 분석(ELISA)으로 측정하고, 그룹 2, 3 및 5에 대해서는 특이적 PCV2 항체 검출 분석(ELISA)으로 측정했다. 이 분석을 이용해 항체의 검출가능한 양이 발견되었다면, 결과는 "양성"으로 표시했다. 이 분석에 의해 항체의 검출가능한 양이 발견되지 않았다면, 결과는 "음성"으로 표시했다.

결과

항원 함유 조성물을 투여한 후 21일째, 그룹 1의 모든 마우스는 엠.히오 항체의 검출가능한 수준을 나타내고 그룹 2의 모든 마우스는 PCV2 항체의 검출가능한 수준을 나타내는 것으로 발견되었다. 이에 반해, 생리식염수/카보폴 조성물을 투여한 후 21일째, 그룹 4에서는 엠.히오 항체의 검출가능한 수준이 발견되지 않았고, 그룹 5에서는 PCV2 항체의 검출가능한 수준이 발견되지 않았다. 따라서, 돼지에서 보호 면역 반응을 유도하는데 효과적인 항원의 1/40은 본 발명에 따른 조성물을 투여받은 마우스 100%에서 엠.히오에 대한 항체를 검출가능한 양으로 생산할 수 있었다. 이 양은 엠.히오의 경우 1.22의 RP로 정의되었다. 또한, 돼지에서 보호 면역 반응을 유도하는데 효과적인 항원의 1/10은 본 발명에 따른 조성물을 투여받은 마우스 100%에서 PCV2에 대한 항체의 검출가능한 양을 생산할 수 있었다. 이 양은 PCV2의 경우 1.38의 RP로 정의되었다.

<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. <120> PCV2 Mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions <130> 40077 <150> US 61/023,086 <151> 2008-01-23 <150> US 61/025,293 <151> 2008-01-31 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a modified Kozak's sequence <400> 1 ccgccatg 8 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a recombinant Eco R1 sequence. <400> 2 gaattc 6 <210> 3 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 3 cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180 aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact 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140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 6 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This sequence is from porcine circovirus type 2, open reading frame 2, together with a portion from the pGEM T-easy vector. <400> 7 gcggccgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60 caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc 180 ttcggatata 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tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700 agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760 aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820 ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880 aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940 aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000 aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060 aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120 gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180 atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240 ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300 aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360 catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420 aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480 tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540 aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600 tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660 tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720 aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780 acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840 ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900 ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960 atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020 gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080 aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg 4140 cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa 4200 gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc 4260 cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca 4320 ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga 4380 tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac 4440 cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca 4500 cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa 4560 aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc 4620 aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg 4680 attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa 4740 atgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca 4800 atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg 4860 aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa 4920 ggtacccggg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa 4980 atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc 5040 tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa 5100 gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa 5160 ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg 5220 atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag 5280 ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc 5340 atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct 5400 gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca 5460 ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac 5520 atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt 5580 aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt 5640 tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt 5700 cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt 5760 tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc 5820 gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta 5880 tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct 5940 tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa 6000 ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta 6060 attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6120 gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6180 acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc 6240 ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc 6300 ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct 6360 ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg 6420 accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg 6480 tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca 6540 gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt 6600 ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc 6660 accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg 6720 ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt 6780 gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta 6840 ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta 6900 cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa 6960 aaacgtcgtt ggcaagcttt aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt 7020 tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt 7080 gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc 7140 tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa 7200 actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta 7260 ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt 7320 ttaacgctga cgaaataaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa 7380 tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc 7440 ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata 7500 ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg 7560 acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt 7620 acggattgtg caaacacgaa aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta 7680 gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt 7740 aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 7800 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 7860 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 7920 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 7980 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 8040 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 8100 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 8160 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8220 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8280 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8340 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 8400 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 8460 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8520 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8580 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 8640 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 8700 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 8760 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8820 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 8880 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 8940 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 9000 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 9060 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 9120 aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 9180 ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 9240 tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 9300 ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 9360 cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 9420 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 9480 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 9540 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 9600 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 9660 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 9720 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9780 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9840 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9900 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 9960 aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 10020 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 10080 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc 10140 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 10200 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 10260 agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 10320 aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 10380 cagtgcc 10387 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 9 Ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His Pro Pro Ser 1 5 10 15 His Leu Gly Gln 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 10 Pro Arg His His Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr 1 5 10 15 Thr Leu Ser <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> This is an amino acid sequence for porcine circovirus type 2, open reading frame 2. <400> 11 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

Claims

마이코플라즈마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae)(엠.히오(M. hyo))에 대한 돼지의 보호 면역 반응을 유발하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물은 돼지 서코바이러스 2형(porcine circovirus type 2) 항원과 엠.히오 항원을 포함하고, 용량당 상기 엠.히오 항원의 양은 상대효능(RP) 값이 적어도 1.22이며, 여기서 엠.히오에 대한 1.22의 RP 값은 상기 엠.히오 항원 양의 40분의 1(1/40)을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 엠.히오 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생시키는 것을 의미하는, 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 용량당 돼지 서코바이러스 2형 항원의 양이 적어도 1.38의 상대효능(RP) 값을 갖고, 돼지 서코바이러스 2형 항원에 대한 1.38의 RP 값은 상기 돼지 서코바이러스 2형 항원 양의 10분의 1(1/10)을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 돼지 서코바이러스 2형 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내에 검출가능한 양의 항체를 발생시키는 것을 의미하는, 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 애주번트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제3항에 있어서, 애주번트가 카보머(carbomer)인 면역원성 조성물.
제4항에 있어서, 상기 카보머가 카보폴(Carbopol)인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 단일 용량 투여로 돼지에게 투여되는 경우 엠.히오에 대한 보호 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 단일 용량 투여로 돼지에게 투여되는 경우 엠.히오 및 돼지 서코바이러스 2형에 대하여 보호 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 돼지에게 투여되는 경우 적어도 130일의 엠.히오 및/또는 돼지 서코바이러스 2형에 대한 면역 지속기간을 유발하는 면역원성 조성물.
제8항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 돼지에게 투여되는 경우 적어도 150일의 엠.히오 및/또는 돼지 서코바이러스 2형에 대한 면역 지속기간을 유발하는 면역원성 조성물.
제8항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 돼지에게 투여되는 경우 적어도 184일의 엠.히오 및/또는 돼지 서코바이러스 2형에 대한 면역 지속기간을 유발하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 항체 검출 분석이 ELISA인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 엠.히오 특이적 항체를 검출하기 위한 특이적 항체 검출 분석이 IDEXX Herdchek 엠.히오 검사 키트인 면역원성 조성물.
제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 서코바이러스 2형 특이적 항체를 검출하기 위한 특이적 항체 검출 분석이 문헌[Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:33-40(2002)]에 예시적으로 기술된 바와 같은 PCV 에 대한 항체를 검출하기 위한 변형된 간접 돼지 서코바이러스 ( PCV ) 2형 기반 및 재조합 캡시드 단백질( ORF2 )-기반의 ELISA인 면역원성 조성물.
돼지 서코바이러스 2형 항원 및 마이코플라즈마 히오뉴모니에(엠.히오) 항원을 포함하는 상기 면역원성 조성물을 돼지에게 투여함을 포함하여, 엠.히오에 대한 돼지의 보호 면역 반응을 유발하기 위한 방법으로서, 용량당 상기 엠.히오 항원의 양은 상대효능(RP) 값이 적어도 1.22이고, 여기서 엠.히오에 대한 1.22의 RP 값은 상기 엠.히오 항원 양의 40분의 1(1/40)을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 엠.히오 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내 또는 21일째에 검출가능한 양의 항체를 발생시키는 것을 의미하는, 방법.
제14항에 있어서, 용량당 돼지 서코바이러스 2형 항원의 양이 적어도 1.38의 상대효능(RP) 값을 갖고, 돼지 서코바이러스 2형 항원에 대한 1.38의 RP 값은 상기 돼지 서코바이러스 2형 항원 양의 10분의 1(1/10)을 투여받은 마우스의 95%, 바람직하게는 100%가 돼지 서코바이러스 2형 특이적 항체 검출 분석에서 치료 후 21일 이내에 검출가능한 양의 항체를 발생시키는 것을 의미하는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 조성물이 애주번트를 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 애주번트가 카보머인 방법.
제17항에 있어서, 상기 카보머가 카보폴인 방법.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 단일 용량 투여로 상기 돼지에게 투여되는 경우 엠.히오에 대한 보호 면역 반응을 유발하는 방법.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 단일 용량 투여로 상기 돼지에게 투여되는 경우 엠.히오 및 돼지 서코바이러스 2형에 대하여 보호 면역 반응을 유발하는 방법.
제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 상기 돼지에게 투여되는 경우 적어도 130일의 엠.히오 및/또는 돼지 서코바이러스 2형에 대한 면역 지속기간을 유발하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 상기 돼지에게 투여되는 경우 적어도 150일의 엠.히오 및/또는 돼지 서코바이러스 2형에 대한 면역 지속기간을 유발하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 상기 돼지에게 투여되는 경우 적어도 184일의 엠.히오 및/또는 돼지 서코바이러스 2형에 대한 면역 지속기간을 유발하는 방법.
제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 항체 검출 분석이 ELISA인 방법.
제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 항체 검출 분석이 IDEXX Herdchek 엠.히오 검사 키트인 방법.
제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 서코바이러스 2형 특이적 항체를 검출하기 위한 특이적 항체 검출 분석이 문헌[Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:33-40(2002)]에 예시적으로 기술된 바와 같은 PCV 에 대한 항체를 검출하기 위한 변형된 간접 돼지 서코바이러스 ( PCV ) 2형 기반 및 재조합 캡시드 단백질( ORF2 )-기반의 ELISA인 방법.