TWI449533B - 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗 - Google Patents

防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗 Download PDF

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Description

防備胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及豬環狀病毒(Porcine circo virus)用疫苗
本發明關於一種供防備胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之疫苗。防備在此係指疫苗至少提供降低由胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒所引起之負面影響，該負面影響為例如組織傷害及/或臨床症狀諸如體重增加減少、下痢、咳嗽、打噴嚏等。本發明亦關於一種套組，該套組包含第一容器、一或多個其他容器及說明，該第一容器含有於其中之胞內勞森菌之不具有生命的抗原，該一或多個其他容器含有於其中之豬肺炎黴漿菌抗原及豬環狀病毒抗原，且該說明係說明混合胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之抗原以調製一種適合系統性接種之組合疫苗。
增生性腸病(PE或PPE，亦稱為腸炎或迴腸炎)在許多動物中(特別是豬)代表一種不成熟腺窩上皮細胞黏膜增生之臨床徵狀及病理症候群，主要發生在迴腸末端。可被影響之小腸的其他部位包括空腸、盲腸及結腸。離乳及年輕成年豬是主要的好發族群，典型臨床症狀為快速體重減輕及脫水。豬之天然臨床疾病在世界各地皆有發生。該疾病一致地與胞內彎曲菌存在有關，目前被稱為胞內勞森菌。
由細菌性病原體豬肺炎黴漿菌引起之豬黴漿菌性肺炎是廣泛的豬慢性呼吸性疾病。年輕仔豬特別易受此非致命性疾病感染。該地方性肺炎是一種慢性疾病，導致飼料換肉率不良及生長停滯。此疾病具有高度傳染性，通常透過直接接觸經感染之呼吸道分泌物(例如在咳嗽/打噴嚏後呈感染液滴之形式)傳播。
此疾病產生最大的問題在於其使所有呼吸系統二次感染容易發生。據估計例如在美國，99%的所有豬場受到感染。
豬環狀病毒被認為與在年輕豬觀察到的離乳後多系統消耗性症候群(PMWS)有關。1991年此疾病首次在加拿大發生。臨床症狀及病理學於1997年被發表，包括進行性消耗症、呼吸困難、呼吸急促及偶發性黃疸。豬環狀病毒係小型(17奈米)二十面體之不具有封套之病毒，其含有環狀單股之DNA基因組。PDNS(豬皮膚炎及腎病症候群)對豬農而言是另一重大問題，其出現在大約和PMWS相同的時間且亦與豬環狀病毒有關。PDNS之特徵為紅/棕色環狀出血皮膚病灶，通常在耳朵、脅腹、腳及大腿。
關於PE方面，防備胞內勞森菌之口服接種疫苗被顯示為控制迴腸炎之經濟有效方法，其允許更佳地利用豬之基因生長潛力(豬增生性腸病技術手冊3.0版，2006年7月；百靈佳殷格翰公司出版)。另外，口服將減少非經腸接種免疫之血媒感染傳播諸如透過使用多次之針頭感染PRRS，且減少注射部位反應及遺留在屠體內之針頭。這將減少個別接種免疫對動物及人之壓力、時間、人事成本及勞力(McOrist：“Ileitis-One Pathogen,Several Diseases”at the IPVS Ileitis Symposium in Hamburg,June 28th ,2004)。
一般認為，減毒活疫苗免疫之優點在於免疫效果通常相當好，因為宿主之免疫系統以較為「天然」之方式暴露在有機體之所有抗原性質中。特別是對胞內細菌劑諸如胞內勞森菌來說，活減毒疫苗免疫被認為對接種免疫動物提供可能獲得之最佳防備作用，因為其引起完全及適當之T細胞基底免疫反應。這與胞內細菌之次單位或死毒疫苗類型所引起之效果不一至不良之免疫性相反。這對絕對胞內細菌諸如胞內勞森菌或披衣菌也特別為真，它們造成黏膜內之致病性感染。研究顯示，討論中之胞內細菌之全活減毒形式最好被遞送至目標黏膜，它們需呈全活細菌形式以於目標黏膜產生完全防備之免疫反應，同時它們的免疫性亦優於使用部份之細菌成份。
防備胞內勞森菌之疫苗需要經口投予(參見前述之技術手冊3.0版)已經變成共識。這是根據身體對抗迴腸炎之基礎係小腸中之局部免疫之事實，其為細胞性免疫及經抗體(特別是IgA)局部防衛之產物。根據目前所知，血清抗體(IgG)不提供任何防備作用，單純因為它們無法到達腸道內。研究已經證實，經口接種免疫產生細胞性免疫及小腸局部產生IgA(Murtaugh,in Agrar-und Veterinr-Akademie,Nutztierpraxis Aktuell,Ausgabe 9,Juni 2004；and Hyland et al.in Veterinary Immunology and Immunopathology 102(2004)329-338)。相反的，肌肉內投予不導致防備作用。另外，除了一般所知之成功防備胞內細菌之疫苗必須誘發細胞性免疫同時產生局部抗體以外，技藝人士知道只有非常低百分比之經口攝入抗原真正被腸細胞吸收，且胞內勞森菌被納入細胞中係由細菌啟動之主動過程。因此不活化疫苗將無法提供小腸足夠之免疫性抗原(Haesebrouck et al.in Veterinary Microbiology 100(2004)255-268)。這就是為什麼人們認為只有減毒活疫苗在小腸細胞中誘發足夠之細胞性防備作用(參見前述之技術手冊3.0)。目前市面上只有一種防備胞內勞森菌用疫苗，也就是由百靈佳殷格翰公司銷售之EnterisolIleitis。此疫苗事實上係供經口投予之活疫苗。
到目前為止，胞內勞森菌之組合疫苗已經在先前技術中被提出。然而，實際上沒有很多這種組合經過效果測試。原因在於一般認為抗原與胞內勞森菌抗原之組合只有在所提供之勞森菌抗原為活(減毒)細胞時才能導致成功的防備作用。在這方面，我們參照WO 2005/011731，該專利亦建議以胞內勞森菌為基底之各種組合疫苗。然而，在該專利申請案之發明內容及申請專利範圍中，該專利權人(百靈佳殷格翰)似乎相信，組合疫苗只有在勞森菌抗原係呈活細胞之形式存在時才被預期有合理的成功機會。同樣的WO 2006/099561亦作如此主張，專利權人亦為百靈佳殷格翰。實際上，根據一般知識這是很明顯的想法。然而活抗原之組合並不直接，因為抗原之間很可能會互相干擾且製備這類活組合疫苗有其困難性。
本發明之目的係提供一種防備胞內勞森菌，且同時防備一或多種其他豬病原體之疫苗。就此目的來說，我們設計出一種疫苗，該疫苗包含胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之不具有生命的抗原組合及醫藥上可接受之載劑。與如何防備胞內勞森菌及組合疫苗應包含活包內勞森菌抗原之固有共識不同的是，我們意外發現藉由使用不具有生命之胞內勞森菌抗原與豬肺炎黴漿菌抗原及豬環狀病毒抗原之組合，可提供防備胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之疫苗。
一般來說，疫苗可藉由使用已知技藝之方法製備，該方法基本上包含混合抗原與載劑。抗原通常與用於乘載抗原之介質組合，該介質通常被簡稱為載劑或「醫藥上可接受之載劑」。該載劑可為任何溶劑、分散介質、包覆劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、及生理上與目標動物相容及可為目標動物接受(例如藉由無菌製成)之類似物。一些該乘載介質之實例為水、食鹽水、磷酸緩衝食鹽水、細菌培養液、葡萄糖、甘油、乙醇及該類似物，及彼等之組合物。根據所欲投予之模式，它們可能提供液體、半固體及固體劑型。如一般所知的是，乘載介質之存在並非疫苗效果所必須，但是它可能顯著簡化抗原之劑量及投予。因此，疫苗之製備可在工業環境中發生，同時抗原也可在例如(立即)實際投予給動物之前與其他疫苗組成份在現場(於獸醫診所、農場等)混合。在該疫苗中，抗原應以免疫有效量存在，也就是說該量足以刺激目標動物之免疫系統以至少減少接種免疫後用野生型微生物攻毒所引起之不良反應。根據該疫苗之所欲用途或所需性質，選擇性地加入其他物質諸如佐劑、穩定劑、黏度調整劑或其他成份。
在一實施態樣中，該疫苗係呈適合系統性投予之形式。申請人意外發現，當本發明之組合疫苗係經系統性投予時，也就是藉此到達身體之循環系統(包含心血管及淋巴系統)，因而影響全身而非特定部位諸如胃腸道，可誘發相當於或甚至超越使用(單一)活疫苗EnterisolIleitis(根據相關說明投予)所提供之對胞內勞森菌之防備作用。系統性投予可藉由例如投予抗原至肌肉組織之中(肌肉內)、真皮之中(皮內)、皮膚以下(皮下)、黏膜以下(黏膜下)、靜脈之中(靜脈內)等進行。許多形式適用於系統性接種免疫，特別是液體劑型(含有經溶解、乳化或懸浮之抗原)，還有固體劑型諸如植入物或中間形式諸如懸浮於液體中之抗原的固體載劑。系統性接種免疫特別是非經腸接種免疫(也就是不經過消化道)，及供系統性接種免疫之適當(物理)形式之疫苗已有超過200年的歷史。此實施態樣之優點是，相同的投予方式可為目前投予豬肺炎黴漿菌抗原或豬環狀病毒抗原之標準方式，也就是非經腸，特別是經肌肉內或皮內注射(後者通常為無針方式)。
在一實施態樣中，該不具有生命之胞內勞森菌抗原係得自一種含碳水化合物之組成物，該碳水化合物亦見於活胞內勞森菌細胞及該細胞之外部細胞膜中。非預期的是，藉由在組合疫苗中使用胞內勞森菌細胞之含碳水化合物之部份(也就是存在於活胞內勞森菌細胞中之含碳水化合物之組成物)，可提供良好之PE防備作用。應注意的是，直接得目胞內勞森菌細胞之含碳水化合物之組成物，還有源自彼之組成物，諸如原始組成物或萃取物之稀釋物或濃縮物，一或多個經純化之成份等可被用於調製疫苗。應注意的是，有研究已將胞內勞森菌細胞之次單位作為供防備此細菌之疫苗中之抗原。然而，這些主要是重組蛋白質且到目前為止沒有一個被證實能夠提供良好之防備作用。也應注意的是，含碳水化合物之組成物係由克羅(Kroll)等人得知(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,June 2005,693-699)，其中該碳水化合物亦見於活胞內勞森菌細胞及該細胞之外部細胞膜中。然而，此組成物係用於診斷，其未經測試作為供上述原因之防備性抗原。
在一實施態樣中，該含碳水化合物之組成物係源自殺滅胞內勞森菌細菌所產生之物質。我們發現非常方便的提供本發明之用途之碳水化合物的方法，就是只要將胞內勞森菌細胞殺滅且使用源自殺滅胞內勞森菌細胞所產生之物質以作為碳水化合物之來源。自活細胞萃取碳水化合物理論上亦為可行(類似移除細胞壁以產製活幽靈細胞)，但是需要更為精細因此更為昂貴之技術。該物質整體皆可使用，例如全細胞懸浮液或胞內勞森菌細胞之溶解物，或可自該物質純化或甚至分離碳水化合物。此方法可利用相當簡單之已知技術進行。
在較佳之實施態樣中，該含碳水化合物之組成物含有被殺滅之胞內勞森菌細菌之全細胞。這已經被證實是最方便的提供該碳水化合物以作為疫苗中之抗原之方法。此外，該疫苗之效果甚至進一步增加，可能是因為這種提供抗原給目標動物之免疫系統之方法較佳地擬似該碳水化合物之天然環境。
在一實施態樣中，該疫苗包含水包油佐劑，該佐劑含有次微米大小之油滴。一般來說，佐劑係非特異性之免疫刺激劑。原則上，各種能幫助或擴大免疫事件之級聯反應中之特定過程之物質，最終導致較佳之免疫反應(也就是對抗原之整合身體反應，特別是由淋巴細胞所媒介之反應且主要關於由特定抗體或先敏感化之淋巴細胞識別抗原)，可被定義為佐劑。已經顯示，使用含有次微米大小之油滴之水包油佐劑提供非常好的防備胞內勞森菌之作用。事實上，這種水包油佐劑之應用通常與不具有生命之抗原有關。然而，一般知道油滴直徑大者得到最佳免疫刺激性質。具體地說，當認為安全性是一項重要問題時，特別使用直徑小於1微米之油滴。在這種情況下，應使用小型油滴因為已知這些油滴引發較少之組織傷害、臨床症狀等。然而，在經系統性接種免疫獲得對腸相關疾病之防備作用時(如本發明之情況)，應選擇大型油滴因為可以預期必須顯著加強免疫反應。相反地，我們發現在組成物中使用小型油滴在防備胞內勞森菌方面提供非常好的結果。
在甚至更佳之實施態樣中，該佐劑包含生物可降解性油滴及礦物油滴，該生物可降解性油滴之平均大小係與該礦物油滴之平均大小不同。已經顯示使用生物可降解性油與礦物油之混合物在效果及安全性上提供非常好的結果。除此之外，該組成物之穩定性相當高，其為一項重要的經濟優勢。穩定性被證實相當好，特別是當生物可降解性油滴或礦物油滴之平均(體積加權)大小低於500奈米時(較佳約400奈米)。
本發明亦關於一種套組，該套組包含第一容器、一或多個其他容器及說明，該第一容器含有於其中之胞內勞森菌之不具有生命的抗原，該一或多個其他容器含有於其中之豬肺炎黴漿菌抗原及豬環狀病毒抗原，且該說明係說明混合胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之抗原以調製一種適合系統性接種之組合疫苗。在此實施態樣中，套組提供分開之胞內勞森菌抗原之容器，該套組亦含有其他抗原(它們不是像先前技術般被組合於一容器中，就是存在於分開之容器中以形成該套組之內容物之部份)。此實施態樣之優點在於，在投予該疫苗之前可防止勞森菌抗原與其他抗原發生交互作用。同樣的，由於抗原係處於分開之容器中，將發生較少之生產損失。在一實施態樣中，豬肺炎黴漿菌抗原及豬環狀病毒抗原係包含於一個容器中且係調製於水包油佐劑中。在此實施態樣中，勞森菌抗原可在要使用之前再與其他抗原混合。
本發明將進一步利用下列實施例說明。
實施例1描述一種獲得實質上不含蛋白質之含碳水化合物之組成物之方法及利用此組成物製備之疫苗。
實施例2描述一個試驗，其中不具有生命之胞內勞森菌疫苗係與目前市售疫苗及包含胞內勞森菌之次單位蛋白質之實驗性疫苗比較。
實施例3描述一個試驗，其中二種包含不具有生命之胞內勞森菌抗原之不同疫苗係與目前市售之活疫苗比較。
實施例1
在此實施例中描述一種獲得實質上不含蛋白質之與胞內勞森菌細胞之外部細胞膜有關之碳水化合物之組成物之方法及可利用此組成物製備之疫苗。一般來說，碳水化合物係有機化合物，其含有碳、氫及氧，通常比例為1：2：1。碳水化合物之實例為糖(醣類)、澱粉、纖維素及膠。它們通常作為動物飲食中主要的能量來源。胞內勞森菌係革蘭氏陰性細菌因此含有外部膜，該外部膜不僅由磷脂及蛋白質組成，還包含碳水化合物，特別是多醣(通常為多醣類諸如脂多醣、脂寡醣或甚至非脂多醣類)。
供疫苗製備之碳水化合物部份
取20毫升之含有濃度3.7E8(=3.7x108 )細胞/毫升之胞內勞森菌細胞之緩衝水(0.04莫耳PBS磷酸鹽緩衝食鹽水)。將細胞置於100℃中10分鐘以將它們溶解。加入於0.04莫耳PBS中之蛋白酶K(10毫克/毫升)至終濃度1.7毫克/毫升。此混合物在60℃中培養60分鐘以降解所有蛋白質並保持碳水化合物之完整。接著，於100℃中培養該混合物10分鐘以不活化蛋白酶K。所產生之物質在進一步使用之前儲存於2至8℃中，該物質為含碳水化合物之組成物，特別是含有存在活胞內勞森菌細菌及它們的外部細胞膜中之碳水化合物(見下段)。該組成物係於Diluvac forte佐劑中調製，該佐劑亦用來作為抗原之載劑。此佐劑(亦見EP 0 382 271)包含7.5重量百分比之平均體積加權大小約400奈米之維他命E乙酸酯油滴，懸浮於水並以0.5重量百分比之Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)穩定。每毫升之疫苗含有自1.2E8胞內勞森菌細胞萃取之物質。
勞森菌碳水化合物抗原之免疫沉降
將二批抗胞內勞森菌全細胞之單株抗體(MoAb)根據標準程序在室溫中用飽和硫酸鈉沉澱。該沉澱物經離心(10,000g 10分鐘)以形成團塊。用20%硫酸鈉清洗該團塊並重懸於0.04莫耳PBS中。根據製造廠商手冊，先行用0.1莫耳之磷酸一鈉(pH 7.4)清洗甲苯磺醯基表面活化Dynal磁珠(DynaBeads,DK)。在各批單株抗體中取出140微克，加入2E8先前清洗過之磁珠，於37℃中隔夜培養。磁珠經離心形成團塊，吸取上清液以移除未結合之單株抗體。分光光度測量顯示介於20至35%之添加單株抗體已與磁珠結合。
二批1毫升之胞內勞森菌細胞(3.7E8/毫升)於0.04莫耳PBS中經聲波處理1分鐘。將所產生之細胞溶解物加至甲苯磺醯基表面活化磁珠-單株抗體複合物並於4℃中隔夜培養。用0.1莫耳磷酸一鈉(pH 7.4)清洗該甲苯磺醯基表面活化磁珠-單株抗體複合物三次。連續用0.5毫升之8莫耳尿素於0.04莫耳PBS(E1)；0.5毫升之10毫莫耳甘胺酸pH 2.5(E2)；及0.5毫升50毫莫耳氯化氫(E3)清洗磁珠以洗提已結合之化合物。洗提後，用100微升及200微升之1莫耳Tris/HCl(pH 8.0)中和E2及E3。
從各步驟中取出樣品並裝填至SDS-PAGE膠體。膠體利用考馬斯亮藍(CBB)染色及銀染或點墨分析。點墨分析係利用與上述相同之單株抗體進行。檢視膠體及墨點顯示，單株抗體識別在CBB膠體上未顯示但在銀染膠體上可見之21及24千道爾頓明顯分子量之條帶。同樣的，此試驗顯示與單株抗體結合之細胞部份係抗蛋白酶K。因此，根據這些結果可得到此部份包含碳水化合物(也就是所有蛋白質被溶解，且經聲波處理之DNA部份不會在銀染中顯示清楚條帶)且該碳水化合物係與胞內勞森菌(也就是抗此部份之單株抗體亦辨識胞內勞森菌全細胞)之外部細胞膜有關(也就是形成外部細胞膜之部份或與其結合)之結論。由於胞內勞森菌係革蘭氏陰性細菌，我們認為該碳水化合物組成物包含多醣(類)。
實施例2
此試驗係用來測試一種調製該碳水化合物抗原於疫苗中之方便方式，也就是經由殺滅全細胞(亦稱為菌苗)。使用市售疫苗Enterisolileitis及包含蛋白質次單位之實驗性次單位疫苗作為對照。除此之外，未接受免疫接種之動物亦用來作為對照。
實施例2之試驗設計
如下述製備不活化之全細胞疫苗。收集源自PPE豬小腸之活胞內勞森菌細胞。用0.01% BPL(β-丙內酯)不活化細胞。所產生之物質係以每毫升疫苗約2.8x108 細胞之濃度於Diluvac forte佐劑中調製(見實施例1)，該物質從本發明之意義上來說本身係不具有生命之含碳水化合物之組成物(特別是因為它含有存在活胞內勞森菌細菌及它們的外部細胞膜中之碳水化合物)。
次單位疫苗含有EP 1219711揭示之重組P1/2及P4(分別為19/21及37千道爾頓蛋白質)及表現WO2005/070958所描述之基因5074、4320及5464之重組蛋白質。該蛋白質係於Diluvac forte佐劑中調製。該疫苗每毫升含有約50微克之各種蛋白質。
使用40頭6週齡之SPF豬。豬被分成4組，每組10頭豬。第1組以2毫升活Enterisolileitis疫苗(百靈佳殷格翰)根據廠商說明經口免疫接種一次。第2及3組分別以2毫升之不活化勞森菌全細胞疫苗及如上述之重組次單位組合疫苗(於T=0及T=4週)經肌肉內免疫接種二次。第4組為未接受免疫接種之對照組。在第6週時，所有豬以經胞內勞森菌感染之均質化黏膜經口攻毒。接著每日觀察所有豬之豬增生性腸病(PPE)臨床症狀。在攻毒前後的規律時間點採集豬之血清血液(血清學)及糞便(PCR)檢體。第9週所有豬安樂死並剖檢。採集迴腸之組織學檢體並以顯微鏡檢查。
攻毒接種物係從感染黏膜製備：將500克之感染黏膜(從感染小腸刮取)解凍並與500毫升之生理食鹽水溶液混合。此混合物以omni均質機在冰上全速均質化一分鐘。所有豬於第6週以20毫升攻毒接種物經口攻毒。
在第0、4、6、7、8及9週時，收集每隻豬的糞便檢體(數克)及血清血液檢體，冷凍儲存直到檢查。糞便檢體以定量PCR(Q-PCR)檢查，以發現量之皮克數(pg)的對數表表示。血清檢體以常用之IFT檢驗(偵測血清中抗胞內勞森菌全細胞之抗體的免疫螢光抗體檢驗)檢測。收集相關之迴腸檢體，用4%緩衝福馬林固定，進行例行包埋及切片以供組織學評分。這些切片以蘇木精-伊紅染色(HE染色)，並使用抗胞內勞森菌單株抗體進行免疫組織化學染色(IHC染色)。切片經顯微鏡檢查。組織學得分如下：
HE染色：
無異常偵測 得分=0可疑病灶 得分=1/2輕微病灶 得分=1中度病灶 得分=2嚴重病灶 得分=3
IHC染色：
無胞內勞森菌細菌存在 得分=0可能有細菌存在 得分=1/2切片中有單一/少量細菌存在 得分=1切片中有中等數量之細菌存在 得分=2切片中有大量細菌存在 得分=3
個別紀錄每隻豬的所有資料。每組的分數係以攻毒後不同參數陽性動物之平均值計算。非參數曼-惠特尼U檢定係用來評估統計顯著性(雙尾檢定及顯著性標準設定為0.05)。
實驗2之結果 血清學
在第一次免疫接種之前，所有豬之IFT抗體力價檢測為血清陰性。經全細胞菌苗(第2組)免疫接種後，豬出現高IFT抗體力價，然而對照組及以次單位疫苗免疫接種之豬在攻毒前維持陰性(表1)。二隻經Enterisol免疫接種之豬(第1組)出現中度IFT力價，然而此組中所有其他之豬仍維持血清陰性。經過攻毒之後，所有豬出現高IFT抗體力價。平均結果如表1所示(以使用之稀釋倍數而言，1.0為較低側之偵測水準)。
糞便檢體之即時PCR
在攻毒前所有糞便檢體皆呈陰性。在攻毒後所有組別都出現陽性反應。第1組(p=0.02)、第2組(p=0.01)及第3組(p=0.03)相較於對照組具有顯著較低之排放量。攻毒後結果如表2所示。
組織學評分
第2組具有最低之組織學HE得分(p=0.05)、IHC得分(p=0.08)及組織學總分(p=0.08)。其他組別之分數較高，並與對照組無顯著差異。見表3。
有關實施例2之結論
從這些結果可以得到的結論是，不具有生命之胞內勞森菌全細胞疫苗誘發至少部份防備作用，該疫苗本身含有亦見於活胞內勞森菌細胞之外部細胞膜之碳水化合物。所有研究之參數及組織學評分均顯著或幾乎顯著優於對照組。
實施例3
此試驗係用來測試疫苗，該疫苗含有實質上不含蛋白質之含碳水化合物之組成物以作為抗原。第二個被測試之疫苗除了經殺滅之胞內勞森菌全細胞之外，含有豬肺炎黴漿菌之抗原及豬環狀病毒之抗原(「組合」疫苗)。對照組使用市售Enterisolileitis疫苗。此外，未接受免疫接種之動物被用來作為第二對照組。
實施例3之試驗設計
以實質上不含蛋白質之含碳水化合物組成物為基底之疫苗係如實施例1所述得到。
實驗性組合疫苗含有1.7x108 細胞/毫升之量之不活化胞內勞森菌全細胞抗原(見實施例2提供不活化細菌所使用之方法)。除此之外，其含有不活化PCV-2抗原(每毫升20微克之PCV之ORF 2編碼蛋白質；該蛋白質係表現於該領域常見之桿狀病毒表現系統，例如WO 2007/028823所述)及不活化豬肺炎黴漿菌抗原(和市售疫苗荷蘭博克斯梅爾市英特威(Intervet)之Porcilis Mhyo含有相同劑量之相同抗原)。該抗原係於雙重乳化佐劑“X”中調製。此佐劑係5倍體積部份之佐劑“A”與1倍體積部份之佐劑“B”之混合物。佐劑“A”係由近似平均(體積加權)大小約1微米之礦物油滴組成，由Tween 80在水中穩定。佐劑“A”包含25重量%之礦物油及1重量%之Tween。其餘為水。佐劑“B”係由近似平均(體積加權)大小約400奈米之生物可降解性維他命E乙酸酯液滴組成，亦由Tween 80穩定。佐劑“B”包含15重量%之維他命E乙酸酯及6重量%之Tween 80，其餘為水。
使用64頭3日齡之SPF豬。豬被分成4組每組14頭豬，及1組8頭豬(第4組)。第1組於3日齡以2毫升之組合疫苗經肌肉內免疫接種，接著於25日齡進行第二次免疫接種。第2組於25日齡以2毫升之組合疫苗經肌肉內免疫接種一次。第3組於25日齡以2毫升Enterisolileitis疫苗(百靈佳殷格翰)根據說明經口免疫接種。第4組於3及25日齡以2毫升之非蛋白質碳水化合物疫苗經肌肉內免疫接種。第5組未接受免疫接種以作為攻毒對照組。所有豬於46日齡以均質化之感染黏膜經口攻毒。接著每日觀察所有豬之豬增生性腸病(PPE)臨床症狀。在攻毒前後的規律時間點採集豬之血清血液及糞便檢體以分別進行血清學及PCR檢測。所有豬於68日齡安樂死並於死後剖檢。迴腸進行組織學檢查。
試驗設計中之其他部份和實施例2所述相同，除非另外說明。
實施例3之結果 血清學 1勞森菌
在第一次免疫接種之前，所有豬之IFT勞森菌抗體力價檢測為血清陰性。經組合疫苗(第1及2組)及非蛋白質碳水化合物疫苗(第4組)免疫接種後，許多豬出現IFT抗體力價，然而對照組及以Enterisol免疫接種之豬在攻毒前維持血清陰性。經攻毒後，所有豬(除了Enterisol組中的2隻)出現IFT抗體力價。所得到之綜合平均結果見表4(由於相較於實施例2使用較高之稀釋倍數，偵測水準為4.0)。
2豬肺炎 黴漿菌
在豬肺炎黴漿菌部份，在試驗開始及補強免疫接種當天(25日齡)所有豬呈豬肺炎黴漿菌血清陰性。經補強免疫接種後，第1組出現高豬肺炎黴漿菌抗體力價，相當於市售之初次-補強疫苗Porcilis Mhyo得到之力價。結果如下列表5所示。很明顯的，在這些情況下(經肌肉內投予)，只有當給予補強免疫接種時，46日之抗體力價達到偵測水準之上(使用之方法為6.0)。然而已知的是，用豬肺炎黴漿菌抗原單次注射免疫接種可能提供足夠的防備作用，特別是經皮內投予(參見例如WO 2007/103042)。
3豬環狀病毒
在PCV部份，3日齡之豬具有高母源PCV抗體力價。在補強免疫當天(25日齡)，免疫接種組(第1組)之力價與第2組及對照組類似。25日齡之PCV力價稍低於3日齡之PCV力價。經25日齡之免疫接種後，第1組(2次免疫接種於第3及25天)及第2組(1次免疫接種於第25天)維持高力價，而對照仔豬顯示母源抗體正常降低。獲得之PCV力價相當於含有相同抗原之單一疫苗(例如英特威之Circumvent PCV，該疫苗提供相當好之防備PCV之作用)所獲得之力價。綜合平均結果見下表。
糞便檢體之即時PCR
攻毒後3週，第1、2及4組之豬的糞便相較於第3及5組具有較少勞森菌(DNA)。僅第1組與第3組(Enterisol)之間及第4組與第3組之間的差異有統計顯著性(p<0.05，曼-惠特尼U檢定)。平均結果見表7。
組織學評分
第1及4組之組織學得分顯著低於第3及5組(p<0.05，雙尾曼-惠特尼U檢定)(見表8)。確診PPE之豬數為第1組2/13、第2組6/12、第3組12/14、第4組2/7及第5組對照組12/14。第1及4組相較於第3及5組具有顯著較低之PPE發生率(p<0.05，雙尾費雪精確檢定)。
實施例3之結論
從這些結果可得到的結論是，該碳水化合物外部細胞膜抗原提供相當好的迴腸炎防備作用。本發明也發現該全細胞勞森菌菌苗係提供碳水化合物抗原給防備迴腸炎之疫苗之良好方式。另外，由於該組合疫苗所提供之豬肺炎黴漿菌抗體力價及PCV抗體力價相當於適用於防備這些微生物之市售單一疫苗所獲得之量，經證實包含不具有生命之胞內勞森菌抗原與豬肺炎黴漿菌抗原及PCV抗原之組合的組合疫苗係適用於防備胞內勞森菌和豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒。

Claims (5)

  1. 一種供系統性投予之疫苗，該疫苗包含被殺滅之胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis )之全細胞及豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae )和豬環狀病毒(Porcine circo virus)之不具有生命的抗原之組合及載劑。
  2. 如申請專利範圍第1項之疫苗，其中該疫苗包含水包油佐劑，該佐劑含有次微米大小之油滴。
  3. 如申請專利範圍第2項之疫苗，其中該佐劑包含生物可降解性油滴及礦物油滴，該生物可降解性油滴之平均大小係與該礦物油滴之平均大小不同。
  4. 一種套組，該套組包含第一容器、一或多個其他容器及說明，該第一容器含有於其中之被殺滅之胞內勞森菌之全細胞，該一或多個其他容器含有於其中之豬肺炎黴漿菌和豬環狀病毒之不具有生命的抗原，且該說明係說明混合胞內勞森菌、豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之抗原以調製一種適合系統性接種之組合疫苗。
  5. 如申請專利範圍第4項之套組，其中該豬肺炎黴漿菌和豬環狀病毒之不具有生命的抗原係包含於一個容器中且係調製於水包油佐劑中。
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