TWI551295B - 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗 - Google Patents

防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗 Download PDF

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Description

防備胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)用疫苗
本發明關於一種供防備胞內勞森菌感染之疫苗，該疫苗為至少提供減輕胞內勞森菌感染之負面影響之組成物，該負面影響為例如組織傷害及/或臨床徵狀諸如體重減輕、下痢等。
增生性腸病(亦稱為腸炎或迴腸炎)在許多動物中(特別是豬)是一種不成熟腺窩上皮細胞黏膜增生之臨床徵狀及病理症候群，主要發生在迴腸末端。可被影響之小腸的其他部位包括空腸、盲腸及結腸。斷奶及年輕成豬是主要的好發族群，且典型臨床症狀為快速體重減輕及脫水。豬之天然臨床疾病在世界各地皆有發生。該疾病一致地與胞內彎曲細菌存在有關，目前被稱為胞內勞森菌。
一般來說，防備胞內勞森菌之口服疫苗被顯示為控制迴腸炎之經濟有效方法，其允許更佳地利用豬之基因生長潛力(豬增生性腸病技術手冊3.0版，2006年7月；百靈佳殷格翰公司出版)。另外，口服將降低非經腸免疫之血液感染傳播諸如PRRS透過使用多次之針頭感染，且減少注射部位反應及遺留在屠體內之針頭。這將減少個別免疫對動物及人之壓力、時間、人事成本及勞力(McOrist：“Ileitis-One Pathogen,Several Diseases”at the IPVS Ileitis Symposium in Hamburg,June 28th,2004)。
一般認為，減毒活疫苗免疫之優點在於免疫效果通常相當好，因為宿主之免疫系統以較為「天然」之方式暴露在有機體之所有抗原性質中。特別是對胞內細菌劑諸如胞內勞森菌來說，活減毒疫苗免疫被認為對免疫動物提供可能獲得之最佳防備作用，因為其引起完全及適當之T細胞基底免疫反應。這與胞內細菌之次單位或死毒疫苗類型所引起之效果不一至不良之免疫性相反。這對絕對胞內細菌諸如胞內勞森菌或披衣菌也特別為真，彼等造成黏膜內之致病性感染。研究顯示，討論中之胞內細菌之全活減毒形式最好被遞送至目標黏膜，彼等需呈全活細菌形式以於目標黏膜產生完全防備之免疫反應，同時彼等的免疫性亦優於使用部分之細菌成分。
防備胞內勞森菌之疫苗需要經口投予(參見前述之技術手冊3.0版)已經變成共識。這是根據身體對抗迴腸炎係根據小腸中之局部免疫之事實，其為細胞性免疫及經抗體(特別是IgA)之局部防衛之產物。根據目前所知，血清抗體(IgG)不提供任何防備作用，單純因為彼等無法到達腸道內。研究已經證實，口服疫苗提供細胞性免疫及小腸局部產生IgA(Murtaugh,in Agrar-und Veterinr-Akademie,Nutztierpraxis Aktuell,Ausgabe 9,Juni 2004；and Hyland et al.in Veterinary Immunology and Immunopathology 102(2004)329-338)。相反的，肌肉內投予不導致防備作用。另外，除了一般所知之成功防備胞內細菌之疫苗必須誘發細胞性免疫及產生局部抗體以外，技藝人士知道只有非常低百分比之經口攝入抗原真正被腸細胞吸收，且胞內勞森菌被納入細胞中係由細菌啟動之主動過程。因此不活化疫苗將無法提供小腸足夠之免疫性抗原(Haesebrouck et al.in Veterinary Microbiology 100(2004)255-268)。這就是為什麼人們認為只有減毒活疫苗在小腸細胞中誘發足夠之細胞性防備作用(參見前述之技術手冊3.0)。目前市面上只有一種防備胞內勞森菌用疫苗(由百靈佳殷格翰公司銷售之Enterisol Ileitis)。此疫苗事實上係供經口投予之活疫苗。
本發明之目的係提供一種防備胞內勞森菌感染之替代性疫苗。就此目的來說，我們設計出一種使用不具有生命之含碳水化合物之組成物以製備供防備胞內勞森菌感染之疫苗，該碳水化合物亦見於活胞內勞森菌細胞及該細胞之外部細胞膜中，且該疫苗係呈適合系統性投予之形式。與如何防備胞內勞森菌之固有共識不同的是，我們意外發現藉由使用含碳水化合物之不具有生命之組成物(例如從胞內勞森菌之外部細胞膜萃取)作為疫苗中之抗原，且當該抗原係以系統性投予時，可以誘發相當於或甚至超越使用活疫苗Enterisol Ileitis(根據產品說明投予)所提供之對胞內勞森菌之防備作用，系統性投予係指抗原藉此到達身體之循環系統(包含心血管及淋巴系統)，因而影響全身而非特定部位諸如胃腸道。系統性投予可藉由例如投予抗原至肌肉組織之中(肌肉內)、真皮之中(皮內)、皮膚以下(皮下)、黏膜以下(黏膜下)、靜脈之中(靜脈內)等進行。除了可以得到非常好的防備作用之外，此不具有生命之疫苗的重要好處在於相較於活疫苗之固有安全性。
整體來說，含碳水化合物之組成物可藉由使用已知技藝之方法被用於製備疫苗，該方法基本上包含混合抗原性含碳水化合物之組成物(或源自彼之組成物，諸如原始組成物或萃取物之稀釋物或濃縮物，一或多個經純化之成分等)與醫藥上可接受之載劑，例如液體載劑諸如(選擇性地經緩衝之)水或固體載劑諸如常用於獲得冷凍乾燥之疫苗。因此，製備可在工業環境中發生，同時抗原也可在例如(立即)實際投予給動物之前與其他疫苗組成分在現場(於獸醫診所、農場等)混合。在該疫苗中，抗原應以免疫有效量存在，也就是說該量足以刺激目標動物之免疫系統以至少減少免疫後用野生型微生物攻毒所引起之不良反應。根據該疫苗之所欲用途或所需性質，選擇性地加入其他物質諸如佐劑、穩定劑、黏度調整劑或其他成分。許多形式適用於系統性免疫，特別是液體劑型(含有經溶解、乳化或懸浮之抗原)，還有固體劑型諸如植入物或中間形式諸如懸浮於液體中之抗原的固體載劑。系統性免疫特別是非經腸免疫(也就是不通過消化道)，及供系統性免疫之適當(物理)形式之疫苗已有超過200年的歷史。
應注意的是，有研究已將胞內勞森菌細胞之次單位作為供防備此細菌之疫苗中之抗原。然而，這些主要是重組蛋白質且到目前為止沒有一個被證實能夠提供良好之防備作用。殺滅細菌(其本身含有亦見於活胞內勞森菌細胞及該外部細胞膜中之碳水化合物)亦被建議作為防備胞內勞森菌用疫苗中之抗原，但是實際上並無以經殺滅之全細胞為基底之疫苗提供良好防備作用之測試報告。除此之外，這些殺滅細菌並非經系統性投予，因為在一般了解的合理期待中，不認為系統性投予之抗原能成功地在局部(也就是小腸中)對抗胞內勞森菌。
在這方面注意到的是，WO 97/20050(Daratech PTY Ltd)提到殺滅胞內勞森菌於免疫豬上之用途。然而未提及系統性投予。根據目前僅經口投予係有效免疫之知識，一般認為在Daratech申請案中所描述之試驗選用的是經口途徑投予。另一提到殺滅細菌之專利申請案係WO 2005/011731(百靈佳殷格翰)。然而，實際揭示的僅是經口投予之活疫苗之用途。該申請案並未顯示殺滅細菌可能有效，僅提及該殺滅疫苗可經系統性投予。EP 843 818(百靈佳殷格翰)描述肌肉內投予殺滅細菌(第[0115]段與第[0119]段)。在第[0115]段中提到，藉由將細菌儲存於正常大氣條件之4℃中以將其殺滅。但是如同一般所知，在該情況下胞內勞森菌係存活的。因此，此文件並未揭示本發明之主題。也應注意的是，含碳水化合物之組成物係由克羅(Kroll)等人得知(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,June 2005,693-699)，其中該碳水化合物亦見於活胞內勞森菌細胞及該細胞之外部細胞膜中。然而，此組成物係用於診斷，其未經測試作為供上述原因之防備性抗原。
在一實施態樣中，該含碳水化合物之組成物係源自殺滅胞內勞森菌細菌所產生之物質。我們發現非常方便的提供本發明之用途之碳水化合物的方法，就是簡單地殺滅胞內勞森菌細胞且使用源自殺滅胞內勞森菌細胞所產生之物質以作為碳水化合物之來源。要自活細胞萃取碳水化合物理論上亦為可行(類似移除細胞壁以產製活幽靈細胞)，但是需要更為精細因此更為昂貴之技術。該物質整體皆可使用，例如全細胞懸浮液或胞內勞森菌細胞之溶解物，或可自該物質純化或甚至分離碳水化合物。此方法可利用相當簡單之已如技術進行。
在較佳之實施態樣中，該含碳水化合物之組成物含有被殺滅之胞內勞森菌細菌之全細胞。這已經證實為最方便的提供該碳水化合物以作為疫苗中之抗原之方法。此外，該疫苗之效果甚至增加，可能是因為這種提供抗原給目標動物之免疫系統之方法較佳地擬似該碳水化合物之天然環境。
在一實施態樣中，該疫苗包含水包油佐劑，該佐劑含有次微米大小之油滴。一般來說，佐劑係非特異性之免疫刺激劑。原則上，各種能幫助或擴大免疫事件之級聯反應中之特定過程之物質，最終導致較佳之免疫反應(也就是對抗原之整合身體反應，特別是由淋巴細胞所媒介之反應且主要關於由特定抗體或先敏感化之淋巴細胞識別抗原)，可被定義為佐劑。已經顯示，使用含有次微米大小之油滴之水包油佐劑提供非常好的防備胞內勞森菌之作用。事實上，這種水包油佐劑之應用通常與不具有生命之抗原有關。然而，一般知道油滴直徑大者得到最佳之免疫刺激性質。具體地說，當認為安全性是一項重要問題時，特別使用直徑小於1微米之油滴。在這種情況下，應使用小型油滴因為已知這些油滴引發較少之組織傷害、臨床症狀等。然而，在經系統性免疫獲得對腸相關疾病之防備作用時(如本發明之情況)，應選擇大型油滴因為可以預期必須顯著加強免疫反應。相反地，我們發現在組成物中使用小型油滴在防備胞內勞森菌方面提供非常好的結果。
在甚至更佳之實施態樣中，該佐劑包含生物可降解性油滴及礦物油滴，該生物可降解性油滴之平均大小係與該礦物油滴之平均大小不同。已經顯示使用生物可降解性油與礦物油之混合物在效果及安全性上提供非常好的結果。除此之外，該組成物之穩定性相當高，其為一項重要的經濟優勢。穩定性被證實相當好，特別是當生物可降解性油滴或礦物油滴之平均(體積加權)大小低於500奈米時(較佳約400奈米)。
在一實施態樣中，該疫苗另包含豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及豬環狀病毒(Porcine circo virus)之抗原。到目前為止，胞內勞森菌之組合疫苗已經在先前技術中被提出。然而，實際上沒有很多這種組合經過效果測試。原因在於一般認為抗原與胞內勞森菌抗原之組合只有在所提供之勞森菌抗原為活(減毒)細胞時才能導致成功的防備作用。在這方面，我們參照WO 2005/011731，該專利亦建議以胞內勞森菌為基底之各種組合疫苗。然而，在該專利申請案之發明內容及申請專利範圍中，該專利權人(百靈佳殷格翰)似乎相信，組合疫苗只有在勞森菌抗原係呈活細胞之形式時才被預期有合理的成功機會。同樣的WO 2006/099561亦作如此主張，專利權人亦為百靈佳殷格翰。實際上，根據一般知識這是很明顯的想法。
本發明將進一步利用下列實施例說明。
實施例1描述一種獲得實質上不含蛋白質之含碳水化合物之組成物之方法及利用此組成物製備之疫苗。
實施例2描述一個試驗，其中本發明之第二個疫苗係與目前市售疫苗及包含胞內勞森菌之次單位蛋白質之實驗性疫苗比較。
實施例3描述一個試驗，其中本發明之二種不同的疫苗係與目前市售疫苗比較。
實施例4描述一個試驗，其建立本發明之疫苗之劑量效應。
實施例1
在此實施例中描述一種獲得實質上不含蛋白質之與胞內勞森菌細胞之外部細胞膜有關之碳水化合物之組成物之方法及可利用此組成物製備之疫苗。一般來說，碳水化合物係有機化合物，其含有碳、氫及氧，通常比例為1：2：1。碳水化合物之實例為糖(醣類)、澱粉、纖維素及膠。它們通常作為動物飲食中主要的能量來源。胞內勞森菌係革蘭氏陰性細菌因此含有外部膜，該外部膜不僅由磷脂及蛋白質組成，還包含碳水化合物，特別是多醣(通常為多醣類諸如脂多醣、脂寡醣或甚至非脂多醣類)。
供疫苗製備之碳水化合物部分
取20毫升之含有濃度3.7E8(=3.7x108)細胞/毫升之胞內勞森菌細胞之緩衝水(0.04莫耳PBS磷酸鹽緩衝食鹽水)。將細胞置於100℃中10分鐘以將它們溶解。加入0.04莫耳PBS中之蛋白酶K(10毫克/毫升)至終濃度1.7毫克/毫升。此混合物在60℃中培養60分鐘以降解所有蛋白質並保持碳水化合物之完整。接著，於100℃中培養該混合物10分鐘以不活化蛋白酶K。所產生之物質在進一步使用之前儲存於2-8℃中，該物質為含碳水化合物之組成物，特別是含有存在活胞內勞森菌細菌及它們的外部細胞膜中之碳水化合物(見下段)。該組成物係於Diluvac forte佐劑中調製。此佐劑(亦見EP 0 382 271)包含7.5重量百分比之平均體積加權大小約400奈米之維他命E乙酸酯油滴，懸浮於水並以0.5重量百分比之Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)穩定。每毫升之疫苗含有自1.2E8胞內勞森菌細胞萃取之物質。
勞森菌碳水化合物抗原之免疫沉降
將二批抗胞內勞森菌全細胞之單株抗體(MoAb)根據標準程序在室溫中用飽和硫酸鈉沉澱。該沉澱物經離心(10,000g 10分鐘)以形成團塊。用20%硫酸鈉清洗該團塊並重懸於0.04莫耳PBS中。根據製造廠商手冊，先行用0.1莫耳之磷酸一鈉(pH 7.4)清洗甲苯磺醯基表面活化Dynal磁珠(DynaBeads,DK)。在各批單株抗體中取出140微克，加入2E8先前清洗過之磁珠，於37℃中隔夜培養。磁珠經離心形成團塊，吸取上清液以移除未結合之單株抗體。分光光度測量顯示介於20至35%之添加單株抗體已與磁珠結合。
二批1毫升之胞內勞森菌細胞(3.7E8/毫升)於0.04莫耳PBS中經聲波處理1分鐘。將所產生之細胞溶解物加至甲苯磺醯基表面活化磁珠-單株抗體複合物並於4℃中隔夜培養。用0.1莫耳磷酸一鈉(pH 7.4)清洗該甲苯磺醯基表面活化磁珠-單株抗體複合物三次。連續用0.5毫升之8莫耳尿素於0.04莫耳PBS(E1)；0.5毫升之10毫莫耳甘胺酸pH 2.5(E2)；及0.5毫升50毫莫耳氯化氫(E3)清洗磁珠以洗提已結合之化合物。洗提後，用100微升及200微升之1莫耳Tris/HCl(pH 8.0)中和E2及E3。
從各步驟中取出樣品並裝填至SDS-PAGE膠體。膠體利用考馬斯亮藍(CBB)染色及銀染或點墨分析。點墨分析係利用與上述相同之單株抗體進行。檢視膠體及墨點顯示，單株抗體識別在CBB膠體上未顯示但在銀染膠體上可見之21及24千道爾頓明顯分子量之條帶。同樣的，此試驗顯示與單株抗體結合之細胞部份係抗蛋白酶K。因此，根據這些結果可得到此部份包含碳水化合物(也就是所有蛋白質被溶解，且經聲波處理之DNA部分不會在銀染中顯示清楚條帶)且該碳水化合物係與胞內勞森菌(也就是抗此部分之單株抗體亦辨識胞內勞森菌全細胞)之外部細胞膜有關(也就是形成外部細胞膜之部分或與其結合)之結論。由於胞內勞森菌係革蘭氏陰性細菌，我們認為該碳水化合物組成物包含多醣(類)。
實施例2
此試驗係用來測試一種調製該碳水化合物抗原於疫苗中之方便方式，也就是經由殺滅全細胞(亦稱為菌苗)。使用市售疫苗Enterisol ileitis及包含蛋白質次單位之實驗性次單位疫苗作為對照。除此之外，未接受免疫之動物亦用來作為對照。
實施例2之試驗設計
如下述製備不活化之全細胞疫苗。收集源自PPE豬小腸之活胞內勞森菌細胞。用0.01% BPL(β-丙內酯)不活化細胞。所產生之物質係以每毫升疫苗約2.8x108細胞之濃度於Diluvac forte佐劑中調製(見實施例1)，該物質從本發明之意義上來說本身係不具有生命之含碳水化合物之組成物(特別是因為它含有存在活胞內勞森菌細菌及它們的外部細胞膜中之碳水化合物)。
次單位疫苗含有EP 1219711揭示之重組P1/2及P4(分別為19/21及37千道爾頓蛋白質)及表現WO2005/070958所描述之基因5074、4320及5464之重組蛋白質。該蛋白質係於Diluvac forte佐劑中調製。該疫苗每毫升含有約50微克之各蛋白質。
使用40頭6週齡之SPF豬。豬被分成4組，每組10頭豬。第1組以2毫升活Enterisol ileitis疫苗(百靈佳殷格翰)根據廠商說明經口免疫一次。第2及3組分別以2毫升之不活化勞森菌全細胞疫苗及如上述之重組次單位組合疫苗(於T=0及T=4週)經肌肉內免疫二次。第4組為未接受免疫之對照組。
在第6週時，所有豬以經胞內勞森菌感染之均質化黏膜經口攻毒。接著每日觀察所有豬之豬增生性腸病(PPE)臨床症狀。在攻毒前後的規律時間點採集豬之血清血液(供血清學)及糞便(供PCR)檢體。第9週所有豬安樂死並剖檢。採集迴腸之組織學檢體並以顯微鏡檢查。
攻毒接種物係從感染黏膜製備：將500克之感染黏膜(從感染小腸刮取)與500毫升之生理食鹽水溶液混合。此混合物以omni均質機在冰上全速均質化一分鐘。所有豬於第6週以20毫升攻毒接種物經口攻毒。
在第0、4、6、7、8及9週時，收集每隻豬的糞便檢體(數克)及血清血液檢體，冷凍儲存直到檢查。糞便檢體以定量PCR(Q-PCR)檢查，以發現量之皮克數(pg)的對數表表示。血清檢體以常用之IFT檢驗(偵測血清中抗胞內勞森菌全細胞之抗體的免疫螢光抗體檢驗)檢測。收集相關之迴腸檢體，用4%緩衝福馬林固定，進行例行包埋及切片以供組織學評分。這些切片以蘇木精-伊紅染色(HE染色)，並使用抗胞內勞森菌單株抗體進行免疫組織化學染色(IHC染色)。切片經顯微鏡檢查。組織學得分如下：
HE染色：
無異常偵測 得分=0
可疑病灶 得分=1/2
輕微病灶 得分=1
中度病灶 得分=2
嚴重病灶 得分=3
IHC染色：
無胞內勞森菌細菌存在 得分=0
可能有細菌存在 得分=1/2
切片中有單一/少量細菌存在 得分=1
切片中有中等數量之細菌存在 得分=2
切片中有大量細菌存在 得分=3
個別紀錄每隻豬的所有資料。每組的分數係以攻毒後陽性動物不同參數之平均值計算。非參數曼-惠特尼U檢定係用來評估統計顯著性(雙尾檢定及顯著性標準設定為0.05)。
實驗2之結果 血清學
在第一次免疫之前，所有豬之IFT抗體力價檢測為血清陰性。經全細胞菌苗(第2組)免疫後，豬出現高IFT抗體力價，然而對照組及以次單位疫苗免疫之豬在攻毒前維持陰性(表1)。二隻經Enterisol免疫之豬(第1組)出現中度IFT力價，然而此組中所有其他之豬仍維持血清陰性。經過攻毒之後，所有豬出現高IFT抗體力價。平均結果如表1所示(以使用之稀釋倍數而言，1.0為較低側之偵測水準)。
糞便檢體之即時PCR
在攻毒前所有糞便檢體皆呈陰性。在攻毒後所有組別都出現陽性反應。第1組(p=0.02)、第2組(p=0.01)及第3組(p=0.03)相較於對照組具有顯著較低之排放量。攻毒後結果如表2所示。
組織學評分
第2組具有最低之組織學HE得分(p=0.05)、IHC得分(p=0.08)及組織學總分(p=0.08)。其他組別之分數較高，並與對照組無顯著差異。見表3。
有關實施例2之結論
從這些結果可以得到的結論是，系統性投予不具有生命之胞內勞森菌全細胞疫苗誘發至少部分防備作用，該疫苗本身含有亦見於活胞內勞森菌細胞之外部細胞膜之碳水化合物。所有研究之參數及組織學評分均顯著或幾乎顯著優於對照組。
實施例3
此試驗係用來測試含有含碳水化合物之組成物作為抗原之疫苗。第二個被測試之疫苗除了經殺滅之胞內勞森菌全細胞之外，含有豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之抗原(「組合」疫苗)。對照組使用市售Enterisol ileitis疫苗。此外，未接受免疫之動物被用來作為第二對照組。
實施例3之試驗設計
實質上不含蛋白質之含碳水化合物組成物為基底之疫苗係如實施例1所述得到。
實驗性組合疫苗含有1.7x108細胞/毫升之量之不活化胞內勞森菌全細胞抗原(見實施例2提供不活化細菌所使用之方法)。除此之外，其含有不活化PCV-2抗原(每毫升20微克之PCV之ORF 2編碼蛋白質；該蛋白質係表現於該領域常見之桿狀病毒表現系統，例如WO 2007/028823所述)及不活化豬肺炎黴漿菌抗原(和市售疫苗荷蘭博克斯梅爾市英特威(Intervet)之Porcilis Mhyo含有相同劑量之相同抗原)。該抗原係於雙重乳化佐劑“X”中調製。此佐劑係5倍體積部分之佐劑“A”與1倍體積部分之佐劑“B”之混合物。佐劑“A”係由近似平均(體積加權)大小約1微米之礦物油滴組成，由Tween 80在水中穩定。佐劑“A”包含25重量%之礦物油及1重量%之Tween。其餘為水。佐劑“B”係由近似平均(體積加權)大小約400奈米之生物可降解性維他命E乙酸酯液滴組成，亦由Tween 80穩定。佐劑“B”包含15重量%之維他命E乙酸酯及6重量%之Tween 80，其餘為水。
使用60頭3日齡之SPF豬。豬被分成4組每組14頭豬，及1組8頭豬(第4組)。第1組於3日齡以2毫升之組合疫苗經肌肉內免疫，接著於25日齡進行第二次免疫。第2組於25日齡以2毫升之組合疫苗經肌肉內注射免疫一次。第3組於25日齡以2毫升Enterisol ileitis疫苗(百靈佳殷格翰)根據說明經口免疫。第4組於3及25日齡以2毫升之非蛋白質碳水化合物疫苗經肌肉內免疫。第5組未接受免疫作為攻毒對照組。所有豬於46日齡以均質化之感染黏膜經口攻毒。接著每日觀察所有豬之豬增生性腸病(PPE)臨床症狀。在攻毒前後的規律時間點採集豬之血清血液及糞便檢體以分別進行血清學及PCR檢測。所有豬於68日齡安樂死並於死後剖檢。迴腸進行組織學檢查。
試驗設計中之其他組織和實施例2所述相同，除非另外說明。
實施例3之結果 血清學
在第一次免疫之前，所有豬之IFT勞森菌抗體力價檢測為血清陰性。經組合疫苗(第1及2組)及非蛋白質碳水化合物疫苗(第4組)免疫後，許多豬出現IFT抗體力價，然而對照組及以Enterisol免疫之豬在攻毒前維持血清陰性。經攻毒後，所有豬(除了Enterisol組中的2隻)出現IFT抗體力價。所得到之綜合平均結果見表4(由於相較於實施例2使用較高之稀釋倍數，偵測水準為4.0)。
在豬肺炎黴漿菌部分，在試驗開始及補強免疫當天(25日齡)所有豬呈豬肺炎黴漿菌血清陰性。經補強免疫後，第1組出現高豬肺炎黴漿菌抗體力價，相當於市售疫苗得到之力價。
在PCV部分，3日齡之豬具有高母源PCV抗體力價。在補強免疫當天(25日齡)，免疫組(第1組)之力價與第2組及對照組類似。25日齡之PCV力價稍低於3日齡之PCV力價。經25日齡之免疫後，第1組(2次免疫於第3及25天)及第2組(1次免疫於第25天)維持高力價，然而對照仔豬顯示母源抗體正常降低。所獲得之PCV力價相當於市售疫苗獲得之力價。
糞便檢體之即時PCR
攻毒後3週，第1、2及4組之豬的糞便相較於第3及5組具有較少勞森菌(DNA)。僅第1組與第3組(Enterisol)之間及第4組與第3組之間的差異有顯著差異(p<0.05，曼-惠特尼U檢定)。平均結果見表5。
組織學評分
第1及4組之組織學得分顯著低於第3及5組(p<0.05，雙尾曼-惠特尼U檢定)(見表6)。確診PPE之豬數為第1組2/13、第2組6/12、第3組12/14、第4組2/7及第5組對照組12/14。第1及4組相較於第3及5組具有較低之PPE發生率(p<0.05，雙尾費雪精確檢定)。
實施例3之結論
從這些結果可以得到的結論是，在3日齡及25日齡系統性投予不論是全細胞勞森菌菌苗與PCV及Mhyo抗原之組合，或是投予包含(實質上不含蛋白質)碳水化合物之疫苗，二者皆誘發對實驗性胞內勞森菌感染之部分防備作用。特別令人意外的是，當初次投予於離乳前(小於21至25日齡)發生時，該疫苗係有效的。應注意的是，在實施例2及3中之疫苗就勞森菌抗原而言，每毫升包含源自超過1E8胞內勞森菌細胞之抗原性物質。由於這些疫苗(即使使用溫和佐劑，也就是包含小型液滴且不含或含少量礦物油之佐劑)提供對迴腸炎之良好防備作用，特別是當與市售疫苗Enterisol Ileitis比較時，因此抗原劑量可能可以減少。這可藉由投予較少之疫苗(低至例如0.2毫升，適用於例如皮內注射)，或減少該疫苗之抗原性內容物達成。根據疫苗技術中之類似技術，我們相信源自或包含1E7細胞(特別是2.5E7細胞或更高)之抗原劑量(每次免疫)仍然與市售疫苗所得到的結果相同或甚至更佳。由於組合疫苗提供豬肺炎黴漿菌及PCV抗體力價之量相當於市售單一疫苗所獲得之量，我們認為組合疫苗亦提供對豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒之防備作用。
實施例4
此試驗係用來建立本發明之疫苗之劑量效應。同樣的在本試驗中未接受免疫之動物用來作為對照組。
實施例4之試驗設計
如實施例2中所述製備不活化全細胞疫苗。抗原物質係以每毫升疫苗約2.0x108細胞之濃度於Diluvac forte佐劑中調製，分別為每毫升疫苗5.0x107及1.25x107細胞。使用60頭3日齡之SPF豬。豬被分成4組，每組15隻豬。第1、2及3組之豬於3日齡及25日齡接受每次2毫升疫苗經肌肉內(頸部)免疫。第4組為未接受免疫之對照組。所有豬於46日齡以勞森菌細菌經口攻毒，如實施例2所述。所有豬於67日齡安樂死並檢查。進行如實施例2所述之檢驗。除此之外，在黏膜檢體進行PCR。為此，採集每隻動物之迴腸檢體，適用區域為顯示增厚之區域。
實施例4之結果 體重增加
從14天之後，各組間的總體重增加呈現顯著差異。第1組顯示平均總重增加約5350克。第2組為5150克。第3組顯示約4250克之體重增加，然而第4組顯示4550克之體重增加。
糞便檢體之即時PCR
攻毒後3週所有組別呈現陽性反應。第1組及第2組相較於對照組具有顯著較低之排放量。攻毒後感染動物(由PCR決定)之數量見表7。
黏膜檢體之即時PCR
攻毒後3週所有組別皆出現陽性反應。第1組及第2組相較於對照組具有顯著較低之排放率。攻毒後感染動物(以PCR決定)之數量見表8。
組織學評分
組織學總分及證實感染PPE之動物數量如表9所示。
實施例4之結論
與預期相反的是，結果顯示防備作用在這些試驗所使用之最低劑量附近非常突然地降低。雖然源自2.5x107細胞之抗原性物質的劑量仍提供相當於市售疫苗之防備作用，事實上與僅高出0.6對數之劑量相比其降低非常顯著(在體重增加、感染動物數量及黏膜PCR方面幾乎沒有任何效果；然而，呈現PPE症狀之動物數量仍有減少)，因此我們知道一般來說，抗原之切實可行的最低有效劑量可源自：少於源自或含有1x107細胞之抗原的量在實際目前的市場環境中將不導致具有經濟效益之重要結果。此明顯之界限值存在的原因並不是100%確定。當劑量降低通常認為防備作用較為緩慢地降低。這可能是因為經由系統性衍生之免疫反應在防備小腸黏膜之局部感染上需要最低之抗原量。
除了上述之外，在實施例3見到意外效果，也就是當初次投予發生在離乳前(小於21至25日齡)，系統性投予以碳水化合物抗原為基底之疫苗係有效的，此試驗利用其他佐劑證實此一效果。因此我們合理的認為此一特徵係通用於不具有生命之含碳水化合物抗原之疫苗。

Claims (6)

  1. 一種殺滅之胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)細菌的全細胞於製備供防備胞內勞森菌感染之疫苗之用途，該疫苗係呈適合非經腸投予之形式且包含每毫升等於或大於1 x 107殺滅之胞內勞森菌細菌細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該疫苗包含水包油佐劑，該佐劑含有次微米大小之油滴。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該佐劑包含生物可降解性油滴及礦物油滴，該生物可降解性油滴之平均大小係與該礦物油滴之平均大小不同。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中與經口服投予之包含減毒的活胞內勞森菌細菌之疫苗相比較，包含殺滅之胞內勞森菌細菌之疫苗當經非經腸投予時可引起能於早期4週內產生較高之抗體力價的活體內免疫反應。
  5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該包含殺滅之胞內勞森菌細菌之疫苗係藉由肌肉內注射投予。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其中該疫苗另包含豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)之抗原及豬環狀病毒(Porcine circo virus)之抗原。
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