KR101131845B1 - 유럽 기원의 로소니아 인트라셀룰라리스, 및 이의 백신,진단제 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 엘. 인트라셀룰라리스 감염에 대하여 보호하고 이를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생성물 및 방법은 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스의 신규한 분리체 및 백신 생성물로서 약독화된 유럽형 분리체를 함유하는 동결건조된 생성물을 제조하는 방법 둘다를 포함하여, 부분적으로는 엘. 인트라셀룰라리스의 대규모 공급물을 배양하는 개선된 방법의 결과로서 달성될 수 있다.
로소니아 인트라셀룰라리스, 돼지 증식성 장염, 현탁액 배양
Description
관련 출원
본 출원은 2003년 7월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/490,001호를 우선권으로 주장하며, 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다.
본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis) 백신 및 엘. 인트라셀룰라리스 감염에 대하여 보호하고 이를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생성물 및 방법은 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스의 신규 분리체 및 백신 생성물로서 약독화된 유럽형 분리체를 함유하는 동결건조된 생성물을 제조하는 방법 둘다를 포함하여, 부분적으로는 엘. 인트라셀룰라리스의 대규모 공급물을 배양하는 개선된 방법의 결과로서 달성될 수 있다.
돼지 증식성 장염 ("PPE")의 원인인자인 엘. 인트라셀룰라리스는 사실상 래빗, 페렛, 햄스터, 여우, 말 및 타조와 에뮤와 같은 다양한 기타 동물을 포함하는 모든 동물에 감염된다. 엘. 인트라셀룰라리스는 특히 유럽 뿐만 아니라 미국에서 양돈업 손실의 주된 원인이다.
PPE의 일관된 특징은 장의 감염된 부위내 장세포내에서 세포질내 막 결합되지 않은 곡선형 간균이 존재한다는 것이다. PPE와 관련된 세균은 "캄필로박터 (Campylobacter)-유사 유기체"로서 지칭되어 왔다[참조; "S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26,260-264 (1989)]. 후속적으로, 원인성 세균은 신규한 분류학상 속 및 종으로서 동정되어 회장 공생체 (Ileal symbiont (IS)) 인트라셀룰라리스로서 고유하게 지칭되었다[참조: C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3,533-538 (1993)]. 보다 최근에는, 이들 신규한 세균에게 로소니아(엘.) 인트라셀룰라리스라는 분류학적 명칭이 부여되었다[참조: S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995)]. 이러한 3가지 명칭은 본원에서 추가로 확인되고 기술되는 동일한 유기체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되었다.
엘. 인트라셀룰라리스는 통상의 세포 비함유 배지에서 일반적인 세균학적 방법으로 배양될 수 없고 성장을 위해서는 부착된 상피 세포를 요구하는 것으로 사료되어 온 절대 세포내 세균이다. 문헌[참조: S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 19,4286-4292 (1993) and G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5,1136-1142 (1993)]에는 통상의 조직 배양 플라스크내에서 IEC-18 랫트 장 상피 세포 단층을 사용한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양법이 논의되어 있다. 또한, 문헌[참조: H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-3236 (1991)]에는 통상의 조직 배양 플라스크내에서 장 407 사람 배아 장 세포 단층 및 GPC-16 기니아 피그 결장 선암종 세포 단층을 사용한 배양법이 논의되어 있다.
최근에, 엘. 인트라셀룰라리스 백신은 미국에서 사용이 승인되었으며, 당해 백신은 미국 특허 제5,714,375호 및 제5,885,823호[이들 특허는 둘다 전문이 본원에서 참조로 인용된다]에 기재되어 있고 청구되어 있는 엘. 인트라셀룰라리스 분리체에 기초한다. 상기한 백신은 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., 2621 North Belt Highway, St. Joseph, Missouri 64506-2002)에 의해 상표명 ENTERISOLR Ileitis로서 시판되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 한가지 목적은 유럽 기원의 분리체를 사용한 개선된 엘. 인트라셀룰라리스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엘. 인트라셀룰라리스를 대규모로 배양하는 개선된 방법 및 엘. 인트라셀룰라리스 백신의 개선된 제조 기법을 제공하는 것이다.
상기 및 기타 목적을 달성하기 위해서 그리고 본원에서 구체화되고 광범위하게 기술되는 본 발명의 목적에 따라서, 본 발명은 유럽으로부터 신규하게 분리된 엘. 인트라셀룰라리스, 이러한 분리체를 약독화시키는 방법 및 이의 약독화된 분리체를 제공한다. 본원에서는 또한 투여시 재구성하기 위한 동결건조된 형태의 약독화된 분리체 및 이의 동결건조된 생성물을 포함하는 백신의 제조 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 유럽으로부터 신규하게 분리된 엘. 인트라셀룰라리스인 분리체 DK 15540은 기탁 분리체 ATCC 수탁번호 제PTA-4927로서 기탁되어 있다. 다른 양태에서, 분리체 DK 15540으로부터 유래된 약독화된 분리체는 분리체 B3903, ATCC 수탁번호 제PTA-4926으로서 명명된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "엘. 인트라셀룰라리스"란 용어는 문헌[참조: C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3,533-538 (1993) 및 S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995)][각각은 전문이 본원에서 참조로 인용된다]에 상세히 기술되어 있는 세포내 곡선형 그램-네가티브 세균을 의미하며, 이는 부다페스트 조약하에 2003년 1월 9일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁되어 ATCC 수탁번호 제PTA-4927호를 부여받은 DK15540으로 명명되는 분리체; 당해 분야의 지식 및 본원의 교시가 주어진다면 전세계에 있는 PPE 감염된 돼지 또는 다른 동물로부터 수득될 수 있는 원인성 세균; 및 자발적으로 수득되었는지 또는 인공적으로 수득되었는지에 관계없이 상기 세균의 변이체 또는 돌연변이체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약독화된 분리체"란 용어는 숙주 동물에게 투여시 면역원성 특성을 유지하면서 비병원성을 달성하도록 본원에서 교시된 배양 및 계대에 따라서 제조된 임의의 엘. 인트라셀룰라리스 분리체를 의미하며, 부다페스트 조약하에 2003년 1월 9일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁되어 수탁번호 제PTA-4926호를 부여받은 B-3903으로 명명되는 약독화된 분리체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약독화된 분리체는 조류, 어류 및 소, 돼지, 말 및 영장류를 포함하는 포유동물을 포함하는 동물을 위한 항미생물 백신에서 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 백신은 본원에 포함된 교시가 주어진다면 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법으로 제조할 수 있다. 이러한 백신은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 면역학적 유효량의 약독화된 분리체를 포함한다. 상기 백신은 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 면역학적 유효량은 본원에 포함된 교시가 주어진다면 과도한 실험 없이도 당해 분야에 공지된 수단으로 결정된다. 비병원성 세균의 양은 여전히 비병원성이면서 질환-감수성 동물에서 면역반응을 자극하기에 충분해야 한다. 이는 특정한 동물, 세균 및 관련 질환에 따라 좌우될 것이다. 감수성 동물에게 투여될 권장되는 투여량은 바람직하게는 약 3.0 TCID50 (조직 배양물 감염량 50% 종결점)/투여량 내지 약 6.0 TCID50/투여량, 보다 바람직하게는 약 4.0 TCID50/투여량 내지 약 5.0 TCID50/투여량이다. 바람직한 양태에서, 백신의 역가는 조직 배양물 감염량 50% 종결점 희석 분석법 (TCID50)으로 측정되는 바에 따르면 약 4.9 TCID50/투여량이다. 담체는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 안정화제 및 희석제를 포함한다. 이러한 백신은 적절한 보조제를 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 백신은 다른 백신과 병용하여, 예를 들어, 또 다른 백신의 희석제로서 사용될 수 있다. 백신 제제는 저장의 목적을 위해 또는 액체 백신으로의 후속적 제형화를 위해 예를 들어, 동결 건조시켜 건조시킬 수도 있다.
따라서, 본 발명은 동물 숙주를 병원성의 야생형 엘. 인트라셀룰라리스로부터 보호할 목적으로 동물 숙주에서 병원성의 야생형 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 또한 포함한다. 당해 방법은 숙주에게 면역학적 유효량의 본 발명의 약독화된 세균 또는 사멸된 세균을 투여하는 것, 바람직하게는 본 발명의 백신을 숙주에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대규모 배양"이란 용어는 약 2.0 내지 3.0리터를 초과하는 규모의 엘. 인트라셀룰라리스의 배양을 의미하며 100리터 이상의 규모로 제조함을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "배양"이란 엘. 인트라셀룰라리스의 성장, 생식 및/또는 증식을 촉진시키는 과정을 의미한다.
엘. 인트라셀룰라리스는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 바람직하게는 미국 특허 제5,714,375호 및 제5,885,823호에 따라서 배양할 수 있다. 예를 들어, 배양 세포에 먼저 엘. 인트라셀룰라리스 세균을 포함하는 접종물을 접종시켜 당해 세포가 세균으로 감염되도록 한다. IEC-18 (ATCC 1589)-랫트 장 상피 세포, HEp-2 (ATCC 23)-사람 표피양암종 세포, McCoy (ATCC 1696)-마우스 (비특수화된) 세포, BGMK (Biowhittaker #71-176)-버팔로 녹색 원숭이 신장 세포 및 돼지 장 상피 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 세포주를 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있다. 바람직한 배양 세포는 HEp-2, McCoy 또는 IEC-18 세포이다.
배양 세포가 사용되는 경우, 접종되기 전에 세포는 단층의 형태일 수 있다. 단층을 형성시키기 위해, 세포를 통상의 플라스크에 접종시킬 수 있다. 각각의 플라스크에는 일반적으로 성장 배지와 혼합된 25, 75, 150, 850cm2 플라스크 또는 롤러 병당 약 1x105개 세포 내지 약 10x105개 세포를 접종시킨다. 성장 배지는 질소원, 선택된 배양 세포에 대한 필수 성장 인자 및 탄소원, 예를 들어, 글루코즈 또는 락토즈를 포함하는 세포 배양용의 임의의 배지일 수 있다. 기타 시판 배지가 사용되어 우수한 결과를 제공할 수 있다 해도 바람직한 배지는 1 내지 5% 태아 소 혈청을 함유하는 햄스 F12 (Ham's F12)로 강화된 DMEM이다.
엘. 인트라셀룰라리스의 성공적 배양은 배양 세포를 일정한 성장 상태로 유지시킴으로써 증진시킨다. 따라서, 배양 세포 단층은 접종시 약 20% 내지 약 50% 컨플루언시 (confluency)여야 한다. 바람직하게는, 당해 세포는 접종시 약 30% 내지 약 40% 컨플루언시, 가장 바람직하게는 약 30% 컨플루언시여야 한다.
또는, 세포는 접종되기 전에 하기한 바와 같이 현탁액 중에서 성장시킬 수 있다. 바람직하게는, 세포는 먼저 부착형 시스템, 예를 들어, 롤러 병 시스템에서 단층의 형태로 100% 컨플루언시까지 성장시키고, 이어서 3 내지 3000리터 시스템으로 옮겨서 현탁액 중에서 성장시킨다. 또는, 세포를 접종 전에 당해 시스템에서의 성장에 적합한 파라미터를 사용하여 3 내지 3000리터 용기 (생물반응기, 발효조, 스피너 플라스크 등)내에서 현탁액 중에서 목적하는 세포 밀도, 예를 들어, 2x105개 세포/ml로 성장시킬 수 있다.
접종물은 감염된 돼지 또는 다른 동물로부터 수득된 엘. 인트라셀룰라리스의 순수한 배양물일 수 있다. 바람직하게는, 접종물은 ATCC 수탁번호 제PTA-4927호로부터 수득된 엘. 인트라셀룰라리스의 순수한 배양물일 수 있다.
접종물은 PPE로 감염된 돼지 또는 기타 동물의 회장의 점막을 스크랩하여 제조된 장 균질물일 수 있다. 장 균질물을 제조하는 경우, 배양을 위해 선택된 회장 절편은 중증 병변을 보여야 하며 내장의 두께가 두꺼워야 한다. 세균의 취약성으로 인해서, 샘플은 바람직하게는 부검후 가능한 한 신속하게 -70℃에서 저장해야 한다. 바람직하게는, 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항생제, 예를 들어, 반코마이신, 암포테리신 B 또는 예를 들어, 겐타마이신 및 네오마이신을 포함하는 항생제의 아미노글리코사이드 그룹의 구성원을 접종물에 첨가하여 오염 세균을 억제하면서 엘. 인트라셀룰라리스 성장을 허용한다. 접종물이 순수한 배양물이든지 또는 장 균질물이든 간에 배양 세포의 접종은 본원의 교시가 주어진다면 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 수행할 수 있다.
이어서, 세균 및/또는 접종된 배양 세포를 감소된 용존 O2 농도하에 항온처리한다. 10% 초과의 용존 산소 농도에서 엘. 인트라셀룰라리스 성장은 최적 미만이며, 이 범위 밖의 산소 농도에서는 결국 성장이 중단된다. 바람직하게는, 세균 및/또는 접종된 배양 세포는 약 0% 내지 약 10% 범위의 용존 산소 농도에서 항온처리한다. 보다 바람직하게는, 세균 및/또는 세포는 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 항온처리하며, 약 0% 내지 약 3.0%의 산소 농도가 가장 바람직하다.
적절한 이산화탄소 농도도 또한 엘. 인트라셀룰라리스의 적절한 성장에 중요하다. 0% 초과 및 4% 미만의 이산화탄소 농도에서 최적이 아닌 성장이 일어나며 이 범위 밖의 이산화탄소 농도에서는 결국 성장이 중단된다. 바람직하게는, 이산화탄소 농도는 약 6% 내지 약 10%의 범위이며, 약 8.8%의 이산화탄소 농도가 가장 바람직하다.
또한, 세포는 바람직하게는 약 4% 내지 약 10% 범위의 수소 농도에서 항온처리한다. 가장 바람직하게는, 세포는 약 0 내지 약 8.0% O2, 약 8.8% CO2 및 약 4% H2에서 항온처리한다. 질소는 당해 유기체의 성장을 위해 질소 (96%) 및 수소 (4%) 또는 질소 (80%), 이산화탄소 (10%) 및 수소 (10%)를 함유하는 가스 혼합물 중에서 "잔여량"으로서 사용된다. 세포는 바람직하게는 약 80% 내지 96% 범위의 질소 농도에서 항온처리한다. 따라서, 세포는 가장 바람직하게는 약 0 내지 약 8.0% O2, 약 8.8% CO2, 약 4% H2 및 약 96% N2에서 항온처리한다.
접종된 세포는 적절한 수소, 산소 및 이산화탄소 농도를 함유하고 당해 세포가 항온처리동안 현탁되도록 하는 이중 가스 항온처리기 또는 다른 가스 챔버내에서 항온처리할 수 있다. 챔버는 접종된 세포를 현탁액 중에서 유지시키기 위한 수단, 및 가스 모니터 및 적절한 가스 농도를 공급하고 유지시키는 공급원을 함유해야 한다. 항온처리 온도는 30℃ 내지 약 45℃ 범위여야 하며 보다 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 38℃의 범위여야 한다. 가장 바람직하게는, 온도는 약 37℃이다. 배양 및 약독화에 필수적인 장치는 본원의 교시가 주어진다면 당해 분야의 숙련가가 용이하게 입수가능하다. 본 발명을 실시하는데 적합한 장치의 한 예는 세포를 현탁액 중에서 유지시키는 스피너 플라스크와 연관된 이중 가스 항온처리기, 예를 들어 모델 480 (제조원: Lab-Line, Melrose Park, IL)이다. 본 발명에서 바람직한 장치는 약 2리터 이상의 배지를 함유하고 적절한 농도의 가스 살포 또는 다른 기계적 교반 수단을 통해 배양 세포를 현탁액 중에서 유지시킬 수 있으며 배지 중의 용존 O2 수준을 연속적으로 모니터링할 수 있는 발효조, 생물반응기, 교반 플레이트 또는 회전 진탕기를 포함한다. 뉴브룬스윅 (New Brunswick), 브라운 (Braun) 및 다른 업체들이 당해 목적을 위한 적합한 발효조와 생물반응기를 제조하고 있다.
접종된 세포를 항온처리 동안 현탁된 상태로 유지시킴으로써, 세포 및 이에 따른 엘. 인트라셀룰라리스의 최대 성장은 성장 배지 및 수소, 산소와 이산화탄소의 적절한 혼합물에의 각각의 세포의 노출을 증가시킴에 의해 달성된다. 배양 세포는 예를 들어, 배양 플라스크, 롤러 병, 막 배양, 바이오백, WAVETM 생물반응기 시스템, 발효조 및 스피너 플라스크를 포함하는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 현탁액 중에서 교반하고 유지시킬 수 있다. 당해 세포는 당해 세포를 이중 가스 항온처리기 또는 유사 장치 내부에 있는 스피너 플라스크내에서 항온처리함으로써 항온처리 동안 현탁액 중에서 유지시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "스피너 플라스크"란 용어는 패들, 프로펠러 또는 배양물을 교반하고 이 배양물에 함유된 세포를 현탁액 중에서 유지시키는 다른 수단을 사용하는 플라스크 또는 기타 용기를 의미한다.
바람직한 양태에서, 접종된 세포를 당해 세포가 컨플루언시에 도달할 때까지 항온처리한 다음, 당해 세포를 성장 배지를 함유하는 스피너 플라스크에 놓고 이 플라스크를 회전시키면서 이중 가스 항온처리기에서 항온처리한다. 바람직하게는, 접종된 세포를 스크랩하거나 트립신 처리하고 스피너 플라스크로 계대한다. 이는 세포 스크랩퍼를 사용하여 세포를 박리시키는 것과 같은 당해 분야에 공지된 각종 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 일단 세포가 스피너 플라스크로 도입되면, 스피너의 패들은 감염된 세포를 현탁액 중에서 유지시키기 위해 마그네틱 교반 플레이트상에서 통상적으로 약 5 내지 약 500rpm의 범위에서 회전한다.
이어서, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부분을 신선한 배지로 계대하여 엘. 인트라셀룰라리스의 생산을 증가시킨다. "계대 (passaging)"란 용어 또는 이의 변형어는 신선한 세포를 당해 세균으로 감염시키기 위해 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부분을 신선한 배양 세포로 옮기는 과정을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "신선한"이란 용어는 아직 엘. 인트라셀룰라리스로 감염되지 않은 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포는 평균적으로 약 1일 이상 지나지 않은 세포이다.
현탁액 배양물 중의 엘. 인트라셀룰라리스의 계대는 본래 배양물의 일부를 취하고 이를 신선한 배양 세포를 함유하는 새로운 플라스크에 첨가함으로써 달성할 수 있다. 본래 배양물이 많은 수의 세균/ml, 예를 들어, 약 104개 초과의 세균/ml을 갖는 경우, 감염된 플라스크로부터의 배양물의 약 1 내지 10% (용적 대 용적)을신선한 세포를 함유하는 새로운 플라스크에 첨가하는 것이 바람직하다. 이는 50 내지 100%의 세포가 감염되는 경우에 바람직하게 수행된다. 50% 미만의 세포가 감염되는 경우, 계대는 바람직하게는 배양물을 1:2로 새로운 플라스크에 나누어 넣고 신선한 조직 배양 세포 및 배지를 첨가하여 용적을 규모 확대함으로써 달성할 수 있다. 어떠한 경우라도, 선행 기술에서와 같은 단층 배양물의 계대와 대조적으로 세포 용해 및 다른 단계가 요구되지 않는다.
간접 형광 항체 (IFA) 염색, TCID50 또는 다른 유사한 방법으로 측정되는 바에 따라 배양 세포의 충분한 배양 및 후속적으로 엘. 인트라셀룰라리스로의 감염 후, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 적어도 일부분을 수거한다. 수거는 전형적으로 약 60% 이상의 세포 감염성에서 수행하지만, 당해 분야의 숙련가는 수거를 60% 미만의 세포 감염성에서도 수행할 수 있음을 알고 있다. 수거 단계는 본원의 교시가 주어진다면 당해 분야의 숙련가에게 공지된 각종 기술을 사용하여 현탁액으로부터 세균을 분리함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는, 엘. 인트라셀룰라리스 세균은 현탁액의 모두 또는 일부분의 내용물을 원심분리하여 배양 세포를 펠렛화시키고, 수득된 세포 펠렛를 재현탁시키고, 감염된 세포를 용해시킴으로써 수거한다. 전형적으로, 당해 세포 및 세균을 펠렛화시키기 위해서 내용물의 적어도 일부분을 약 20분 동안 약 3000×g에서 원심분리한다. 이어서, 펠렛을 예를 들어, 슈크로즈-포스페이트-글루타메이트 (SPG) 용액에 재현탁시키고, 세포를 용해시키기 위해 25게이지 바늘에 약 20회 통과시킬 수 있다. 추가의 정제가 바람직한 경우, 샘플을 약 145×g에서 약 5분 동안 원심분리하여 세포 핵과 세포 파편을 제거할 수 있다. 이어서, 현탁액을 약 3000×g에서 약 20분 동안 원심분리하고, 수득된 펠렛을 태아 소 혈청을 함유한 SPG와 같은 적절한 희석액 (동결건조, 동결 또는 접종물로서 사용하기에 적합한 수거되 세균을 제조하기 위해) 또는 성장 배지 (신선한 세포로 계대하기에 보다 적합한 수거된 세균을 제조하기 위해)에 재현탁시킬 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, 대규모 생산을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 효과적 성장은 조직 세포가 활발하게 성장하는 상태를 유지시킴으로써 증진된다. 단층의 경우, 배양물이 컨플루언시 상태가 되면, 세포 분열 속도는 실질적으로 감소한다. 엘. 인트라셀룰라리스를 단층 조직 배양물에서 성장시키고자 하는 시도는 성공이 제한되었으며 규모 확대는 가능하지 않았다. 그러나, 현탁액 배양물의 사용은 세포가 활발하게 성장하는 상태의 유지를 상당히 용이하게 하고 연속적 배양물 확장 및 규모 확대를 가능하게 한다. 상기 설명한 바와 같은 발효조 및 약 0 내지 3%의 용존 O2의 사용은 108개 세균/ml 이상의 성장을 가능하게 한다.
IEC-18 세포를 사용하는 경우, 성장 배지와 함께 젤라틴, 아가로스, 콜라겐, 아크릴아미드 또는 실리카 비이드, 예를 들어, Cultisphere-G 다공질 마이크로캐리어 (제조원: HyClone Laboratories, Logan Utah)를 첨가하는 것이 바람직하다. 그러나, HEp-2 세포 등은 본원에서 사용되는 방법에 따라 마이크로캐리어를 요구하지 않는다.
배양물 유지 목적상, HEp-2 배양물의 경우, 바람직하게는 당해 배양물의 25% 내지 50%를 제거하고 이를 1주일 간격으로 신선한 배지로 교체한다. 마이크로캐리어 또는 비이드를 이용한 세포 배양을 위해, 바람직하게는 배양물의 25% 내지 50%를 제거하고 이를 매주 1 내지 2회 신선한 배지로 교체한다. 규모 확대의 목적상, 추가 배지의 25% 내지 50%, 또는 마이크로캐리어를 함유한 배지를 배양물에 첨가할 수 있다.
배양 세포가 감염되는 속도에 따라서, 신선한 세포로의 계대는 일반적으로 약 2일 내지 약 7일마다 수행한다. 배양 세포가 2 내지 7일 이내에 70% 이상 감염된다고 가정하면, 바람직하게는 계대는 약 5 내지 7일마다 수행한다.
본 발명은 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스의 신규 분리체에 대한 백신 및 이러한 백신을 제조하는 방법을 또한 제공한다. 바람직하게는, 감염된 세포를 연장된 시간 (예를 들어, 6 내지 8개월) 동안 현탁액 중에서 유지시킨 후, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 적어도 일부분을 수거하고 잠재적 약독화에 대해 모니터링한다. 이러한 모니터링은 바람직하게는 약독화된 분리체를 선별하기 위한 숙주 동물 또는 동물 모델 시험감염 (challenge)으로 달성한다. 이러한 약독화된 분리체는 본원에 교시된 방법에 따른 백신에서 사용된다.
본 발명은 신속한 배양물 확장, 수율의 100 내지 1000배 증가 및 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스의 제조 비용의 감소를 가능하게 한다. 그 결과로서, 제조된 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 풍부한 공급물이 백신 제조 목적을 위해 용이하게 약독화된다. 엘. 인트라셀룰라리스를 현탁액 중에서 성장시키는 방법은 당해 목적을 위해 사용가능한 세균의 용이성, 속도 및 수를 크게 증가시킨다. 보다 많은 세포 및 세포 분열이 일어날 수록 보다 높은 수준의 돌연변이가 일어나고, 이는 백신 개발에 있어서 유리하다. 따라서, 현탁액 중의 성장은 환경적으로 조절되는 유전자와 이의 발현 산물에 의해 제어되는 중요한 면역원의 발현을 증가시킨다.
수득된 약독화된 분리체는 조직 배양물 단층에서 배양할 수 있지만, 바람직하게는 현탁액 배양물 중에서 배양한다. 다른 약독화 수단에는 예를 들어, N-메틸 니트로소구아니딘 사용에 의한 화학적 약독화 및 당해 분에 공지된 다른 수단들이 포함될 수 있다. 다중 계대에 의한 것이든지 또는 화학적 수단에 의한 것이든지 간에, 백신 제조용으로 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스가 생산되고 선별된다. 바람직한 양태에서, 수득된 약독화된 분리체는 ATCC 수탁번호 제PTA-4926호이다.
백신 항원은 상기한 바와 같은 원심분리 또는 미세여과에 의해 수거될 수 있다. 이어서, 상기 항원을 숙주 동물 종에서 투여량 역가측정에 의해 측정된 최적의 숙주 동물 면역반응에 근거하여 규정된 수준에서 표준화시킨다. 세균을 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 0.3% 포르말린 또는 다른 불활성화제를 사용하여 불활성화시켜 사백신을 제조할 수 있다. 이어서, 항원을 면역반응을 증진시키는 수산화알루미늄 또는 광유와 같은 적합한 보조제내로 혼입시킨다. 이어서, 항원을 사용하여, 약 3주 내지 4주령의 돼지의 경우에 근육내 또는 피하 주입을 통해서 숙주를 백신 접종하고, 필요에 따라서 부스터를 투여한다.
바람직하게는, 세균을 연속적으로 계대하여, 약독화된 비병원성 생 배양물을 유도하고 선별한다. 배양물은 숙주 동물에서 약독화 징후에 대해 시험한다. 배양물을 이미 기술한 바와 같이 수거하고 동결건조시킨다. 예를 들어, 돼지는 1x104 내지 1x106 세균으로 경구 백신 접종한다. 백신 접종 약 28일 후, 돼지에게 엘. 인트라셀룰라리스의 적은 횟수로 계대한 (장 균질물로부터 초기 분리 후 시험관내에서 30회 미만 계대) 병원성 배양물로부터의 약 1x107개 유기체를 경구 접종시킨다. 감염된 동물을 시험감염한지 21일 후에 부검하고 소장을 육안적 병변 및 현미경적 병변에 대해 관찰한다. PCR, 간접 형광 항체 (IFA) 또는 면역조직화학 (IHC)도 또한 수행해야 한다.
대조 동물의 약 80%가 육안적 또는 현미경적 병변을 보일 것이며 PCR, IFA 또는 IHC 시험 방법을 사용한 경우에 장의 점막 세포내 엘. 인트라셀룰라리스의 존재에 대해 양성반응을 보일 것이다. 백신 접종된 동물은 조직학적 관찰로 측정되는 바에 따르면 정상적인 점막 표면을 가질 것이며 접종 3 내지 4주 후에 PCR 시험에 의해 음성인 것으로 나타날 것이다.
일반적으로, 약독화된 면역원성 엘. 인트라셀룰라리스 분리체는 약 150일 내지 약 250일 동안의 연속적 배양 후에 생산되며, 이 기간 동안에 배양물은 50 내지 100회 계대한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 다른 약독화된 배양물은 이러한 수치들을 변화시킴으로써 생산될 수 있다는 것을 알고 있다.
본 발명의 백신 생성물은 동결건조될 수 있다. 수거 후, 분리체를 당해 분야에 공지된 각종 방법으로 농축시키고 안정화제, 예를 들어, 슈크로즈 젤라틴 안정화제와 혼합할 수 있다. 이어서, 백신 생성물을 동결 및 건조 (동결건조)시킬 수 있다. 일반적으로, 동결 단계는 약 -45℃±3으로 변화시키고 약 150분 내지 약 480분 동안 유지시킴을 포함한다. 건조 단계는 1차 및 2차 건조 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1차 건조 단계는 (a) 약 -30℃ 내지 약 -5℃로 변화시키고 약 120분 내지 약 1000분 동안 유지시키고, 임의로 (b) 약 -5℃ 내지 약 5℃로 변화시키고, 약 150분 내지 약 2000분 동안 유지시킴을 포함한다. 2차 단계는 일반적으로 약 27℃±5℃로 변화시키고 약 330분 내지 약 1120분 동안 유지시킴을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 범위가 조건, 예를 들어, 출발 용적에 따라 조정될 수 있음을 알고 있다.
이어서, 백신을 약제학적으로 허용되는 담체 중에 면역학적 유효량의 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스를 포함하도록 제조한다. 바람직한 양태에서, 백신은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 ATCC 수탁번호 제PTA-4926호를 포함한다. 배합된 면역원과 담체는 수용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있다. 면역학적 유효량은 본원에 포함된 교시가 주어진다면 과도한 실험 없이 당해 분야에 공지된 수단으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 면역원의 양은 5 내지 5000㎍이고, 정제된 세균이 사용되는 경우에 102.0 내지 109.0TCID50, 바람직하게는 103.0 내지 106.0TCID50, 보다 바람직하게는 104.0 내지 105.0TCID50이다.
본 발명은 또한 ATCC 수탁번호 제PTA-4926로 명명된 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 분리체와, 살모넬라 종 (Salmonella spp.) (예: 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella choleraesuis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)), 에리시펠로트릭스 종 (Erysipelothrix spp.) (예: 에리시펠로트릭스 류시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae)), 해모필루스 종 (Haemophilus spp.) (예: 해모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis)), 마이코플라즈마 종 (Mycoplasma spp.) (예: 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopenumonia)), 렙토스피라 종 (Leptospira spp.), 클로스트리디움 종 (Clostridium spp.) (예: 클로스트리디움 퍼핑겐스 (Clostridium perfingens) 및 클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficil)), 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.) (예: 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis)), 브라키스피라 종 (Brachyspira spp.) (예: 브라키스피라 하이오디센테리애 (Brachyspira hyodysenteriae)), 보르데텔라 (Bordetella) (예: 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica)), 파스튜렐라 종 (Pasteurella spp.) (예: 파스튜렐라 멀코시다 (Pasteurella multocida)), 서코바이러스 (예: 돼지 서코바이러스 2형) 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 코로나바이러스 (예: 전염성위장염 (TGE) 바이러스, 돼지 호흡기 코로나 바이러스), 파보바이러스 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 병원체로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 배합 백신을 포함한다.
하나의 양태에서, 배합 백신은 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 분리체 ATCC 수탁번호 제PTA-4926과, 살모넬라 콜레라수이스, 에리시펠로트릭스 종, 클로스트리디움 종, 브라키스피라 종, 전염성위장염 (TGE) 바이러스 및 에스케리키아 콜라이로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 클로스트리디움 종으로부터의 항원성 물질은 클로스트리디움 퍼핑겐스 및 클로스트리디움 디피실을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 에리시펠로트릭스 종으로부터의 항원성 물질은 에리시펠로트릭스 류시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 양태에서, 배합 백신은 ATCC 수탁번호 제PTA-4926호로 지정된 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 분리체와, 살모넬라 콜레라수이스 및 에리시펠로트릭스 종으로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 배합 백신은 ATCC 수탁번호 제PTA-4926호로 지정된 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 분리체와, 살모넬라 콜레라수이스 및 에리시펠로트릭스 류시오파티애로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 배합 백신은 ATCC 수탁번호 제PTA-4926호로 지정된 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 분리체와, 클로스트리디움 종 (예: 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 말 인플루엔자 바이러스 (EIV) (예: EIV-1, EIV-2), 말 헤르페스 바이러스 (EHV) (예: EHV-1, EHV-2, EHV-3, EHV-4, EHV-5, EHV-6, EHV-7), 알파바이러스 (예: 동부 뇌염 바이러스, 서부 뇌염 바이러스, 베네쥬엘라 뇌염 바이러스) 또는 웨스트 나일 바이러스로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명에 따른 백신은 일반적으로 감수성 동물, 바람직하게는 돼지에게 1회 이상의 투여량으로 투여된다. 생백신 또는 사백신은 2주 간격으로 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 약독화된 생백신의 경우, 1회 투여가 바람직하다. 약독화된 생 분리체의 바람직한 투여 경로는 근육내, 경구 또는 비내 투여이지만, 사백신에는 근육내 및 피하 주사 경로가 가장 바람직하다.
PPE의 효과적 진단은 원인성 세균을 배양하는데 요구되는 시간에 의해서도 방해되었다. 본 발명의 결과로서, 돼지 및 PPE에 민감한 기타 동물로부터 채취된 생물학적 샘플 중의 엘. 인트라셀룰라리스의 존재에 대한 신속하고 정확한 분석을 촉진하는 진단 툴이 현재 가능하다.
본 발명의 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스 세균 또는 상기 세균으로부터 유래된 성분을 ELISA 또는 면역형광 항체 시험 ("IFA")과 같은 다른 면역분석법에서 항원으로서 사용하여, 당해 세균으로 감염된 것으로 추측되는 혈청 중 및 동물의 기타 체액 중에서 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 지시된 항체를 검출할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 면역분석법은 하기 실시예에 기술된 IFA이다. 또는, 본 발명의 세균은 웨스턴 블롯 분석법에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 ELISA 프로토콜은 다음과 같다:
1. 피복 완충액에 희석된 0.1ml/웰의 항원을 첨가한다. 4℃에서 18시간 동안 항온처리한다.
2. PBS로 3회 세척한다.
3. 차단 완충액 0.25ml을 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 1 내지 2시간 동안 항온처리한다.
4. 세척 완충액으로 3회 세척한다.
5. 혈청을 차단 완충액에 희석시키고 0.1ml을 플레이트의 제1 웰에 첨가한다. 플레이트에 걸쳐서 일련의 1:2 희석액을 제조한다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다.
6. 세척 완충액으로 3 내지 5회 세척한다.
7. 접합체를 차단 완충액에 희석시키고 0.1ml를 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다.
8. 세척 완충액으로 3 내지 5회 세척한다.
9. 기질을 첨가한다.
10. 분광광도계로 광의 흡광도를 측정한다.
11. 항원이 첨가되지 않은 웰을 블랭크로서 사용한다.
12. 양성 및 음성 대조 돼지 혈청도 또한 각 시험에서 사용해야 한다.
바람직한 웨스턴 블롯 프로토콜은 다음과 같다:
1. 항원을 12% SDS-PAGE에서 전개시키고 니트로셀룰로즈 막으로 전달시킨다.
2. 막을 차단 완충액 중에 2시간 동안 놓아둔다.
3. 차단 완충액을 제거하고 1분 동안 PBS로 세정한다.
4. 혈청을 차단 완충액에 희석시키고 막에 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 항온처리한다.
5. 세척 완충액으로 3회 세척한다 (각 세척시 5분간)
6. 접합체를 차단 완충액에 희석시키고 막에 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.
7. 세척 완충액으로 3회 세척한다.
8. 기질을 10분 동안 또는 강한 결합이 일어날 때까지 첨가한다.
9. PBS로 세정한다.
10. 공기 건조시키고 암실에서 저장한다.
본 발명의 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스 세균 또는 상기 세균으로부터 유래된 성분은 또한 진단, 예방 또는 치료용 항혈청 또는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 유럽 기원의 엘. 인트라셀룰라리스 세균 또는 상기 세균으로부터 유래된 성분은 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 사람이 아닌 동물에게 투여될 수 있고, 당해 엘. 인트라셀룰라리스 세균 또는 상기 세균으로부터 유래된 성분에 대한 항체를 함유하는 항혈청 또는 혈장을 당해 분야에 공지되어 있고 본원에서 기술하는 방법에 따라서 수집할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되며, 실시예는 예시적 목적을 위해서만 제공되며 제한하기 위함이 아니다. 물론, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 다른 변형을 용이하게 인지할 것이다.
본원에 인용된 모든 공보 및 특허는 이의 전문이 본원에서 참조로 인용된다.
실시예 1
엘. 인트라셀룰라리스 백신의 제조
돼지 증식성 장염 (PPE)에 걸린 유럽 돼지의 장으로부터 엘. 인트라셀룰라리스의 분리 및 약독화:
엘. 인트라셀룰라리스 병원성 분리체 DK 15540 (DK 15540, DK-15540 및 15540은 본원에서 상호교환적으로 사용된다)는 급성 돼지 출혈성 장염에 감염된 덴마크산 돼지의 회장 균질물로부터 미네소타 대학에 의해 분리되었다. 상기 분리체는 부다페스트 조약하에 2003년 1월 9일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁되어 ATCC 수탁번호 제PTA-4927호를 부여받았다. 분리 과정은 회장으로부터 점막을 스크랩하고, 균질화시키고, 30분 동안 트립신 처리하고, 조직 분쇄기에 통과시킴을 포함한다. 이어서, 회장 균질물을 5.0, 1.0 및 0.65㎛로 이루어진 일련의 필터를 통해 통과시켰다. 균질물을 10% 태아 소 혈청 (FBS)으로 슈크로즈 포스페이트 글루타메이트 완충액에 희석시켰다. 균질물의 분취액 (6x1 ml)을 제조하고 -70℃에서 저장하였다. 균질물은 McCoy 세포의 T-75 cm2 플라스크를 감염시키기 위한 접종물로서 사용하였다. McCoy 세포 단층을 스크랩하고, 세포를 염화칼륨 처리하여 용해시키고 농축된 세포 펠렛을 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 IFA로 염색한 현미경 슬라이드상에 놓아서 배양물을 McCoy 세포 감염에 대해 매일 모니터링하였다. 부착 의존성 (anchorage dependent) 세포 배양물에서 11회 계대 후, 11번째 계대로부터의 접종물을 McCoy 세포를 함유하는 250ml 스피너 플라스크로 옮기고 수거할 때까지 현탁된 상태로 성장시켰다. 엘. 인트라셀룰라리스의 덴마크 분리체 (ATCC 수탁번호 제PTA-4927호)를 McCoy 세포에서 80주 동안 계속해서 시험관내 계대하여 약독화시키고 모노클로날 항체로 그 존재를 시험하였다. 약독화된 분리체를 B3903 (B3903, B 3903 및 B-3903는 본원에서 상호교환적으로 사용한다)라 명명하였다. 분리체 B3903는 부다페스트 조약하에 2003년 1월 9일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁되어 ATCC 수탁번호 제PTA-4926호를 부여받았다.
배양물:
동정
특징적 성장 요건, PCR 반응 및 모노클로날 항체 반응을 사용하여 엘. 인트라셀룰라리스 마스터 종균 (Master Seed) 및 제조용 종균 (Working Seed) 물질을 확인하였다.
순도
엘. 인트라셀룰라리스의 마스터 종균 및 제조용 종균의 순도를, 배양물을 모노클로날 항체 염색, 세균 및 바이러스에 대한 통상의 외래성 제제 시험 및 멸균성 마이코플라즈마 시험으로 검사함으로써 측정하였다.
병원성
엘. 인트라셀룰라리스의 마스터 종균은, 하기 실시예 2에 추가 예시된 바와 같이, 마스터 종균 및 역계대 접종물이 병원성 엘. 인트라셀룰라리스의 노출 후에 감수성 돼지에서 관찰되는 임상 징후 및 육안적 병변을 생성하는 능력이 결여되었음으로 입증되는 바에 따르면 병원성이 아니었다.
계대배양의 범위
엘. 인트라셀룰라리스의 생성으로부터 최종적 수거 물질은 마스터 종균으로부터 11회 계대를 초과하지 않았다.
배지 조성
EU McCoy 마스터 세포 스톡 (MCS)을 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 함께 1 내지 10% (v/v) 신생아 소 혈청 (NBS) 또는 태아 소 혈청 (FBS) (세포 성장 및 유지 배지)를 함유하는 햄스 강화 F12 (Ham's Fortified F12) (DMEM/F12)에서 성장시키고 유지시켰다.
마스터 종균 및 제조용 종균을 1 내지 10% (v/v) NBS 또는 FBS 및 5 내지 15% (v/v) 글리세롤을 함유한 DMEM/F12 (마스터 종균 및 제조용 종균 저장 배지)에 저장하였다.
최종 수거 생성물을 슈크로즈 젤라틴 안정화제 (SGS) (최종 생성물 저장 배지) 속에 저장하였다.
증식
엘. 인트라셀룰라리스의 마스터 종균 및 제조용 종균 배양물을 상기한 세포 성장 및 유지 배지를 사용하여 EU McCoy MCS에서 증식시키고 약 -35℃ 이하에서 저장하였다.
조직 공급원
엘. 인트라셀룰라리스 종균 및 생산 유기체를 McCoy 마스터 세포 스톡 (ATCC 수탁 번호 제CRL 1696호, 뱃치 번호 F-10422)에서 성장시켜다. 마스터 세포 스톡을 X번째 계대에서 3894MMCSS로서 지정하였다. 마스터 세포 스톡을 추가로 6회 계대하고 EU McCoy MCS X+0로서 지정하였다. EU McCoy MCS 계대 X+0을 -70℃±5℃ 또는 그 이하에서 저장하였다. 제조 백신을 40번째 계대 동안에 EU McCoy MCS 세포주 계대배양물에서 제조하였다.
배양 용기
EU McCoy MCS를 표면적이 25 내지 150cm2인 조직 배양 플라스크, 코스타 셀 큐브 (Costar cell cube), 표면적이 850 내지 2,2250cm2인 롤러 병, 40L 이하 용적의 스피너 플라스크 및 3L 내지 500L 용적의 생물반응기에서 증식시켰다.
엘. 인트라셀룰라리스의 종균 배양물을 250 내지 40,000ml 스피너 플라스크, 850cm2 내지 2,250cm2 롤러 병, 표면적이 25 내지 150cm2인 조직 배양 플라스크 또는 3L 내지 500L 용적의 생물반응기에서 성장시켰다.
엘. 인트라셀룰라리스의 제조 배양물을 6L 내지 40L 스피너 플라스크 또는 3L 내지 500L 용적의 생물반응기에서 성장시켰다.
씨딩 또는 접종용 현탁액의 제조 방법
씨딩 배양물
동결된 또는 신선한 엘. 인트라셀룰라리스 마스터 종균 또는 확장된 제조용 종균을 실온 (25℃±3℃) 또는 37℃±2℃에서 해동시켰다. 50,000 내지 500,000개 세포/ml의 세포 밀도로 McCoy 세포가 미리 씨딩된 생물반응기, 스피너 플라스크 또는 병을 엘. 인트라셀룰라리스로 1 내지 10% (v/v)의 농도 또는 0.08 내지 1.0의 MOI로 감염시켰다. 감염된 배양물을 감소된 산소 농도하에 86% N2, 4% H2 및 10% CO2로 이루어진 가스 혼합물로 오버레이하여 항온처리하였다. 배양물을 연속적으로 교반하면서 (10 내지 100rpm) 37℃±2℃, pH 6.7 내지 7.3에서 3 내지 10일 동안 항온처리하여 적절한 혼합을 유지함으로써 세포가 현탁액 중에 보유되도록 하였다.
제조 배양물
동결된 또는 신선한 엘. 인트라셀룰라리스 마스터 종균 또는 확장된 제조용 종균을 실온 (25℃±3℃) 또는 37℃±2℃에서 해동시켰다. 50,000 내지 500,000개 세포/ml의 세포 밀도로 McCoy 세포가 미리 씨딩된 생물반응기 또는 스피너 플라스크를 엘. 인트라셀룰라리스로 1 내지 10% (v/v)의 농도 또는 0.08 내지 1.0의 MOI로 감염시켰다. 감염된 배양물을 감소된 산소 농도하에 96% N2, 4% H2로 이루어진 가스 혼합물로 오버레이하거나 살포하여 항온처리하였다. 배양물을 연속적으로 교반하여 (10 내지 100rpm) 적절한 혼합을 유지시키면서 37℃±2℃, pH 6.7 내지 7.3에서 3 내지 8일 동안 항온처리하여 세포가 현탁액 중에 보유되도록 하였다
종균 배양물 및 제조 배양물에 대한 접종 기법
종균 배양물
마스터 종균 또는 제조용 종균의 10% (v/v) 이하를 성장 배지에서 0 내지 7일된 McCoy 세포를 함유한 생물반응기, 스피너 플라스크 또는 병에 접종시켰다 (MOI=0.08 내지 1.0).
제조 배양물
제조용 종균의 10% (v/v) 이하를 3L 내지 500L 용적 용기내에서 적절한 McCoy 세포 밀도로 0 내지 7일된 McCoy 세포가 씨딩된 적절한 용적의 성장 배지에 접종시켰다 (MOI=0.08 내지 1.0).
미생물의 항온처리
배양물을 교반하여 현탁액을 유지시키면서 감소된 산소 대기하에 37℃±2℃에서 3 내지 10일 동안 항온처리하였다. 추가의 배지 및/또는 McCoy 세포를 첨가하여 계속해서 성장을 진행시켰다.
배양물을 항온처리 기간 동안 비정상적 성장 또는 오염 징후의 증거에 대해 현미경으로 관찰하였다.
수거:
배양물의 취급 및 제조
배양물을 간접 형광 항체 (IFA) 염색으로 적절한 세균 성장의 징후에 대해 검사하였다. 수거 준비가 된 배양물은 60 내지 100% 세포 감염성을 나타냈다. 감염성%를, 각각의 필드가 면적의 80% 이상을 채우기에 충분한 McCoy 세포를 함유하는 3개 이상의 필드를 관찰하여 측정하였다. 세포의 약 50% 이상이 세균으로 충전되면, 감염된 것으로 고려된다.
수거 배양물의 효능은, 37℃± 2℃에서 6일 동안 항온처리한 후 특이적 모노클로날 항체 (항-엘. 인트라셀룰라리스 모노클로날 항체 VPM 53 롯트 31599 또는 등가물; 항-마우스 IgG-플루오레세인 접합체 (FITC) (ICN 번호 55499)를 사용하여 고정시키고 염색한 McCoy 세포에서 샘플을 역가측정하여 시험한다.
배양물을 임의의 명백한 오염 징후에 대해 가시적으로 검사하였다. 접종한지 3 내지 10일 후에 수거를 수행하였다.
수거 기법 및 세부사항
제조 배양물 생물반응기, 스피너 플라스크 및 병내의 세포 및 유동성 내용물을 멸균된 수용 용기에 부분적으로 또는 완전히 수집하였다. 각 제조 배양물 생물반응기, 스피너 플라스크 및 병을 개별적으로 수거하거나, 몇몇 용기의 내용물을 SGS를 첨가하여 모으고 1℃ 내지 7℃ 이하에서 저장하였다. 수거된 제조 배양물을 TCID50에 의한 효능 및 IFA 염색에 의한 확인을 위해 샘플링하였다.
제조 배양물은 IFA 염색에 의해 4.9 이상의 TCID50/ml을 나타냈으며 현미경적 관찰하에 어떠한 오염 증거도 갖지 않았다.
백신 생성물의 제조:
농축 방법
백신 생성물은 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 배양물을 정치시킨 다음, 경사분리하거나, 막 여과 (0.22㎛ 이하), 관류 또는 원심분리에 의해 농축시킬 수 있다.
슈크로즈 젤라틴 안정화제 (SGS)
가수분해된 젤라틴 용액은 젤라틴과 탈이온수 또는 주사용수를 SGS 뱃치 크기의 25% 최종 총 용적으로 혼합하고 121℃에서 120분 동안 오토클레이브에서 가수분해시켜 제조한다.
이어서, 가수분해된 젤라틴 용액 (40.0g/L)와 탈이온수 또는 주사용수를 SGS 뱃치 크기의 약 25% 최종 용적으로 혼합하였다. 수산화칼륨 (AR) (0.548g/L), L-글루탐산 (1.440g/L), 인산이칼륨 (AR) (2.508g/L), 인산이수소칼륨 (AR) (1.030g/L) 및 슈크로즈 (AR) (150.00g/L)를 첨가하고, 용액을 철저히 혼합하였다. 이어서, 안정화제의 pH를 염산 또는 수산화나트륨 용액을 사용하여 6.8 내지 7.0으로 조정하였다. 탈이온수 또는 주사용수를 SGS의 목적하는 최종 용적 100%가 되도록 첨가하였다. 완전 안정화제를 철저히 혼합하고, 전체 용액을 0.1㎛ 필터를 통해 여과하여 멸균시켰다.
연속물을 제조하기 위한 단위들의 조합 예를 하기 표 1에 제시한다.
| 엘. 인트라셀룰라리스 | 200,000 내지 300,000ml |
| 슈크로즈 젤라틴 안정화제(SGS) | 100,000ml(25% v/v) |
| DMEM/F12(생성물을 안정화시키기 위해 첨가될 수 있다) | 0 내지 150,000ml |
| 총 용적 | 400,000ml |
평균 연속물의 용적은 50 내지 500ℓ였다.
동결건조
백신 생성물을 10회 투여 사이클 (6.0ml 충전)을 위해서 표 2에 개요된 과정에 따라서 동결건조시키거나, 50회/100회 투여 사이클 (10.0ml 충전)을 위해서 표 3에 개요된 과정에 따라서 동결건조시켰다.
| 단계 | ℃ | 속도(분) | 유지(분) | 압력(mT) |
| 사전냉각* | 5° | Na | Na | Atm |
| 동결 | -47°±3° | 가능한 신속하게 | 150 | Atm |
| 1°건조, 1차 | -15°±2° | 120 | 120 | 100 내지 150 |
| 1°건조, 2차 | 0°±2° | 120 | 180 | 100 내지 150 |
| 2°건조, 1차 | 32°±2° | 240 | 180 | 60 내지 80 |
| 2°건조, 2차 | 26°±2° | 240 | 가능한 신속하게 | 60 내지 80 |
| 전체 시간: 1352분(22.5시간) * 선반을 동결건조기의 부하 동안 5°±2°로 사전냉각시킨다. |
||||
| 단계 | ℃ | 속도(분) | 유지(분) | 압력(mT) |
| 사전냉각* | 5° | N/A | N/A | Atm |
| 동결 | -48°±3° | 60 | 90 | Atm |
| 1°건조 | -15°±2° | 60 | 1500 | 100 내지 150 |
| 2°건조 | 26°±2° | 60 | 600 | 60 내지 80 |
| 전체 시간: 2370분(39.5시간) * 선반을 동결건조기의 부하 동안 5°±2°로 사전 냉각시킨다. |
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실시예 2
엘. 인트라셀룰라리스 백신의 안정성
목적
당해 연구의 목적은 2가지였다. 당해 연구의 제1 목적은 6 ½주령의 돼지에서 엘. 인트라셀룰라리스의 3가지 상이한 낮은 계대 분리체 (2개의 미국 기원 및 1개의 유럽 기원)에 의해 유발된 질환의 발생율을 관찰하고 비교하는 것이었다. 제2 목적은 6 ½주령의 돼지에서 엘. 인트라셀룰라리스의 2가지 높은 계대 분리체 (둘다 유럽 기원)의 안전성을 관찰하는 것이었다.
재료 및 방법
시험 물질
1. 엘. 인트라셀룰라리스 낮은 계대 미국 분리체 N343
2. 엘. 인트라셀룰라리스 낮은 계대 미국 분리체 N101494.
3. 엘. 인트라셀룰라리스 낮은 계대 유럽 분리체 DK 15540 p20
4. 엘. 인트라셀룰라리스 높은 계대 유럽 분리체 DK 15540 p60
5. 엘. 인트라셀룰라리스 높은 계대 유럽 분리체 DK 15540 p80 (마스터 종균 명칭 B3903).
시험 물질의 제형
낮은 계대 분리체를 McCoy 세포 현탁액에서 분리한 후에 10 내지 20주 동안 연속적으로 성장시켰다. 높은 계대 분리체를 McCoy 세포 현탁액에서 분리한 후에 60 내지 80주 동안 연속적으로 성장시켰다. 모든 배양물은 10,000RPM에서 15분 동안 원심분리하여 수거하였다. 로소니아를 함유하는 McCoy 세포 배양물 펠렛을 10% FBS를 함유한 슈크로즈-포스페이트-글루타민 (SPG) 용액에 재현탁시켰다.
시험 물질의 저장
수거된 배양물을 시험감염일까지 -70℃에서 저장하였다. 동일하지만 수거 날짜가 다양한 분리체의 시험감염 배양물을 해동시키고 플라스틱 백신 병에 배합해 넣고, 표지하고, 시험감염시킬 때까지 4℃에서 또는 빙상에서 저장하였다.
시험 물질의 분석
TCID50을 시험감염시 (0일째)에 모든 모아진 시험감염 분리체에서 측정하였다. 평균 역가 (n=3) (TCID50/ml)는 하기 표 4에 제시한다.
| 시험 물질 | 평균 역가(TCID50/ml) |
| 엘. 인트라셀룰라리스 N343 | 6.4 |
| 엘. 인트라셀룰라리스 N101494 | 6.1 |
| 엘. 인트라셀룰라리스 DK 15540 p20 | 6.2 |
| 엘. 인트라셀룰라리스 DK 15540 p60 | 6.87 |
| 엘. 인트라셀룰라리스 DK 15540 p80 | 7.4 |
연구 설계
당해 연구는 5개의 실험군과 1개의 대조군으로 이루어졌다. 연구 0일째에, 그룹 1 (10마리 돼지, 6 ½주령)에게 1회 10ml 또는 등가의 위내 (IG) 투여량의 엘. 인트라셀룰라리스 낮은 계대 미국 분리체 N343를 투여하였다. 그룹 2 (10마리 돼지, 6 ½주령)에게 1회 10ml 또는 등가의 IG 투여량의 엘. 인트라셀룰라리스 낮은 계대 미국 분리체 N101494를 투여하였다. 그룹 3 (10마리 돼지, 6 ½주령)에게 1회 10ml 또는 등가의 IG 투여량의 엘. 인트라셀룰라리스 낮은 계대 미국 분리체 DK15440 p20를 투여하였다. 그룹 4 (10마리 돼지, 6 ½주령)에게 1회 10ml 또는 등가의 IG 투여량의 엘. 인트라셀룰라리스 높은 계대 유럽 분리체 DK15440 60주 (weeks)를 투여하였다. 그룹 5 (20마리 돼지, 6 ½주령)에게 1회 10ml 또는 등가 투여량의 엘. 인트라셀룰라리스 높은 계대 유럽 분리체 DK15440 p80을 투여하였다. "엄격한 대조군"으로서 지정한 그룹 6 (10마리 돼지, 6 ½주령)은 처리하지 않았다.
연구 초기부터 적절한 시험 동물의 시험감염일까지 매일 건강 상태를 관찰하였다. 1 내지 4 스케일의 임상적 건강 (행동, 식욕, 신체 상태, 모피 및 분변 경도)를 시험감염일 (0일째)부터 연구 종결 (21일째)까지 매일 스코어화하였다. 평균 1일 체중 증가량 (ADWG)을 시험감염일 (0일째)부터 연구 종결 (21일째)까지 계산하였다. 엘. 인트라셀룰라리스의 분변 방출 (fecal shedding)을 0, 7, 14 및 21일째에 평가하였다. 연구 전반에 걸쳐서 사망한 1마리 동물 (그룹 1로부터의 동물)을 육안적 및 현미경적 병변에 대해 검사하였다. 사망은 조직학 및 PCR 분석으로 확인된 PPE와 연관된 병변 때문인 것으로 결정되었다. 분변 중의 로소니아 함량의 정량적 분석을 회장 및 결장상의 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 조직학적 평가와 함께 PCR로 평가하였다. 혈청을 연구 0일, 7일, 14일 및 21일째에 수집하였다.
결과
연구 결과의 요약
| 그룹 | 처리 | 돼지 마릿수 | 역가(TCID50/ml) | 혈청학 | 분변 방출 | PCR | FA | 조직학 | 육안적 병변 | ADWG | 임상적 스코어 |
| 1 | N343 | 9 | 7.4 | 19% | 11% | 0% | 11% | 44% | 1 | 0.61 | 5.23 |
| 2 | N101494 | 10 | 7.1 | 10% | 10% | 10% | 30% | 30% | 1.2 | 0.8 | 5.15 |
| 3 | DK 15540 p20 | 10 | 7.2 | 18% | 13% | 30% | 10% | 20% | 1.2 | 0.86 | 5.01 |
| 4 | DK 15540 p60 | 10 | 7.87 | 5% | 0% | 0% | 0% | 10% | 1 | 0.9 | 5 |
| 5 | DK 15540 p80 | 20 | 8.4 | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% | 1 | 1.05 | 5 |
| 6 | 엄격한 대조군 | 10 | 0 | 0% | 0% | 0% | 0% | 0% | 1.05 | 0.91 | 5 |
전반적 관찰
시험감염할 때까지 매일 건강 상태를 관찰하였다. 연구 기간 동안 시험감염후 동물의 임상 상태를 매일 평가하였다. 관찰에는 행동, 식욕, 신체 상태, 모피 및 분변 경도가 포함된다. 이들 동물의 임상 상태를 질환의 중증도를 반영하는 수치 점수 시스템에 근거하여 평가하였다. 스코어는 각 파라미터에 대해 1 내지 4 범위였다. 정상의 건강한 외관을 갖는 동물은 스코어를 1로 매기고, 중증의 임상 징후를 나타내는 동물은 스코어를 3으로 매기고, 사망한 동물은 스코어를 4로 매겼다. 엄격한 대조군, DK15540 p60 및 DK15540 p80에 대한 평균 1일 스코어는 5.0이었다. 낮은 계대 물질에 대한 평균 1일 스코어는 N343 (5.23), N101494 (5.15) 및 DK15540 p20 (5.01)였다. 이러한 결과들에 대한 통계학적 분석은 크루스칼-월리스 등급 합산 검정 (Kruskal-Wallis Rank Sum Test)을 사용한 경우에 처리군과 대조군간에 차이가 없었음을 나타냈다.
평균 1일 체중 증가량 (ADWG)
평균 1일 체중 증가량 (ADWG)을 시험감염일 (0일째)부터 연구 종결시 (21일째)까지 계산하였다. 엄격한 대조군에 대한 1일당 평균 체중 증가량은 0.9파운드였다. 낮은 계대 처리군에 대한 평균 체중 증가량은 단지 0.6 (N343), 0.8 (N101494) 및 0.86 (DK15540 p20) 파운드/일이었다. 높은 계대 처리군은 1일당 평균 체중 증가량이 각각 0.9파운드/일 (DK11540 p60) 및 1.05 파운드/일 (DK15540 p80)로서, 시험감염물을 투여하지 않은 엄격한 대조군과 비교하여 동일하거나 증가하였다. 평균 1일 체중 증가량의 평균 차이는 연구 21일째에 높은 계대 처리군 (DK15540 p60 및 p80) 및 엄격한 대조군과 비교하여 N343 처리군에서 유의적으로 낮았다 (피어슨 카이제곱 p<0.05).
혈청전환
돼지에서 로소니아 노출에 대한 혈청전환을 IFAT 분석을 사용하여 항-로소니아 항체의 존재를 시험함으로써 측정하였다. 0일째에, N343 처리군만이 2/10마리 돼지에서 검출가능한 혈청전환이 관찰되었다. 7일째에, 2/9마리 돼지 (N343) 및 1/10마리 돼지 (DK15540 p20)가 로소니아 항체에 대해 IFA 양성으로 관찰되었다. 14일째에, N343 처리군의 2/9마리 돼지가 IFA 양성이었고, 각각 DK15540 p20 및 p60 처리군의 1/10마리 돼지가 양성이었다. 21일째에 1/10마리 돼지 (N343), 4/10마리 돼지 (N101494) 및 6/10마리 돼지 (DK15540 p20)는 IFA 양성인 반면에, 높은 역가 처리군 (DK15540 p60 및 p80)은 검출가능한 혈청전환을 나타내지 않았다. 로소니아 노출에 대한 혈청전환은 연구 21일째에 낮은 계대 엘. 인트라셀룰라리스의 미국 및 유럽 분리체 둘다를 투여한 처리군에서 증가하였다.
분뇨 방출
분뇨의 PCR 시험은 엘. 인트라셀룰라리스의 방출이 14일째부터 시작되었음을 입증하였으며, 이때 N343의 4/9마리, N101494의 4/10마리 및 DK15540 p20 낮은 계대 동물의 5/10마리는 양성으로 시험되었다. 높은 계대 처리군 및 엄격한 대조군은 둘다 14일째에 PCR 음성이었다. 21일째에, DK15540 p20 처리군은 1마리의 동물이 PCR 양성인 반면에, 모든 나머지 처리군 및 대조군은 PCR 음성이었다. 연구 전반에 걸쳐, PCR을 사용한 경우에 높은 계대 그룹 (DK15540 p60 및 p80)에서 방출 증거는 관찰되지 않았다. 분변중에 로소니아의 활발한 방출을 나타내는 PCR 양성 동물은 연구 14일째에 높은 계대 분리체 그룹 및 엄격한 대조군과 비교하여 낮은 계대 분리체 그룹 (N343, N101494 및 DK15540 p20)에서 보다 유의적이었다 (피어슨 카이제곱 p<0.05).
21일째의 PCR: 회장 및 결장
회장 및 결장으로부터 스크랩한 점막의 PCR 시험을 부검 후 (21일째)에 수행하였다. 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화에 대해 PCR 양성인 샘플은 N101494 (2마리/10마리 결장) 및 (2마리/10마리 회장 및 4마리/10마리 결장) DK 15540 p20 낮은 계대 분리체 그룹의 것이었다. 모든 나머지 처리군 및 대조군은 연구 21일째에 조직에서 PCR 음성이었다. 당해 결과는 DK15540 p20에서 돼지의 회장 및 결장이 모든 처리군 및 대조군과 비교하여 엘. 인트라셀룰라리스로 보다 유의적으로 콜로니화되었음을 나타냈다 (피어슨 카이제곱 p<0.05).
조직학
회장 말단부 및 결장의 절편을 부검시 (21일째)에 수집하고 조직학적 분석을 위해 완충된 포르말린 속에 놓아두었다. 세포내 세균 및 음와 과다증식증의 존재가 4/9마리 돼지 (N343), 3/10마리 돼지 (N101494), 2/10마리 돼지 (DK15540 p60) 및 1/20마리 돼지 (DK15540 p80)의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 와틴-스태리 (Warthin-Starry) 은 시약으로 염색된 조직에서 관찰되었다. 병변 발생은 1/9마리 돼지 (N343), 3/10마리 돼지 (N101494) 및 1/10마리 돼지 (DK15540 p60)에서 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 형광 항체 염색으로 확인되었다. FA로는 모든 처리군 및 대조군의 결장에서 로소니아에 의해 유발된 병변이 검출되지 않았다. FA 결과는 모든 처리군 및 대조군과 비교하여 N101494 처리군에서 돼지의 회장내에 유의적 병변이 발생했음을 나타냈다. H&E/은 염색은 모든 처리군 및 대조군과 비교하여 N343 처리군에서 PPE와 관련된 유의적인 병변 발생을 보였다 (피어슨 카이제곱 p<0.05).
육안적 병변 스코어
회장과 결장을 부검시 (21일째)에 PPE와 관련된 병변에 대해 스코어화하였다. 조직을 정상적 외관 (병변이 발생하지 않음)에 대해 스코어를 1로 매기고, 경미한 비후 (thickening)를 나타내는 병변에 대해 스코어를 2로 매기고, 중간정도의 비후에 대해서 스코어를 3으로 매기고 중증 비후에 대해 스코어를 4로 매겼다. 엄격한 대조군은 평균 임상 스코어가 1.05이고, N343은 1.0, N101494는 1.2, DK15540 p20은 1.2이며, DK15540 p60 및 p80은 1.0이었다. 평균적인 육안적 병변 스코어에서는 다중 비교를 위한 ANOVA 검정을 사용한 경우에 대조군과 처리군 사이에 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.
결론
수집된 데이타에 근거하여, 당해 연구는 TCID50가 1X107개 세균/투여량을 초과하는 낮은 계대 투여량의 N343, N101494 및 DK15540로 시험감염된 동물이 이들 동물에서의 PPE의 발생율이 증가되었음을 입증하였다. 동일한 연령의 돼지에게 투여된, TCID50가 1X107개 세균/투여량을 초과하는 높은 계대 분리체 (DK15540 p60 및 p80)는 안정한 것으로 입증되었으며 콜로니화 및 PPE와 관련된 병변의 발생의 감소를 보인다. 이러한 결론은 회장의 점막상의 PCR, 조직병리학 및 조직 절편의 FA 염색에 근거하였다.
PCR로 측정된 분변 중에 방출된 엘. 인트라셀룰라리스의 감소는 낮은 계대 분리체에 비해서 높은 계대 분리체에서 명백하였다. 모든 처리군 및 대조군에 대해 계산된 평균 1일 체중 증가량은 낮은 계대 분리체가 투여된 그룹, 특히 N343 처리군의 동물과 비교하여 높은 계대 분리체가 투여된 그룹 및 엄격한 대조군에서의 명확하고 일정한 1일 체중 증가량을 입증함으로써 이러한 결론을 뒷받침한다. 이러한 관찰은 낮은 계대 물질이 투여된 동물에서 체중 증가량의 감소를 나타내며, 이는 높은 계대 물질이 투여된 동물과 시험감염 물질이 투여되지 않은 동물의 적절하고 유사한 성장능을 뒷받침한다. 엄격한 대조군과 비교하여 높은 계대 분리체는 체중 증가량 및 임상 스코어에 근거한 전반적 건강에 대한 음성적 영향을 나타내지 않았다.
실시예 3
효능 및 최소 보호 역가
목적:
당해 연구의 목적은 3주령의 돼지에게 경구 약물 (drench)로 투여된 분리체 B3903 (동결건조됨) (DK 15540, 계대 80) ("B3903 (동결건조됨) 백신" 및 "B3903 백신"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다)의 최소 보호 역가를 측정하고 돼지에서 돼지 증식성 장염 (PPE)의 원인인자인 낮은 계대 엘. 인트라셀룰라리스를 함유한 병원성의 이종성 순수 배양 시험감염물에 대한 효능을 입증하는 것이다.
재료 및 방법
시험 물질: 엘. 인트라셀룰라리스 분리체 B3903의 약독화된 생 배양물
B3903 (동결건조됨) 백신의 제형
DK 15540 분리체를 McCoy 세포 현탁액에서 분리한 후 80주 동안 연속적으로 성장시켰다. 모든 배양물을 10,000RPM에서 15분 동안 원심분리하여 수거하였다. 로소니아를 함유하는 McCoy 세포 배양물 펠렛을 10% FBS를 함유한 슈크로즈-포스페이트-글루타민 (SPG) 용액에 재현탁시켰다. 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 건조를 수행하였다. 동결건조된 생성물을 2.0ml가 되도록 하는 양의 주사용수 속에 재구성하였다.
B3903 (동결건조됨) 백신의 저장
백신을 사용 준비가 될 때까지 2℃ 내지 8℃에서 저장하였다. 재현탁시킨 후, 백신을 투여할 때까지 빙상에서 저장하였다.
B3903 (동결건조됨) 백신의 투여량
1. 고 투여량 (처리군 1) : 연구 0일째에 직접적 경구 약물을 통한 1 x 2mL (6.0 log/투여량).
2. 중간 투여량 (처리군 2): 연구 0일째에 직접적 경구 약물을 통한 1 x 2mL (4.9 log/투여량).
3. 저 투여량 (처리군 3): 연구 0일째에 직접적 경구 약물을 통한 1 x 2mL (3.8 log/투여량).
처리 물질: 위약
5% NBS가 강화된 DMEM/F12 성장 배지에 현탁된 감염되지 않은 McCoy 조직 배양 세포로 이루어진 위약을 연구 0일째에 처리군 4 (시험감염 대조군) 및 5 (음성 대조군)에게 투여하였다. 상기 물질을 처리군 4의 자돈에게 시험 동물당 위약 1×2mL로서 직접적 경구 약물로 투여하였다.
시험 물질: 엘. 인트라셀룰라리스 N101494 병원성 시험감염물
엘. 인트라셀룰라리스 N101494를 인디아나 농장의 12주령 돼지의 소장으로부터 수득하였다 (미국 특허 제5,714,375호).
엘. 인트라셀룰라리스 N101494 병원성 시험감염물의 제형
엘. 인트라셀룰라리스 시험감염 물질을, 감염된 창자 조직으로부터 초기 분리하고 30회 미만의 계대 후에 McCoy 세포 현탁액에서 연속적으로 성장시켰다. (1L) SF 1421 이외에 SF 1422 및 SF 1423로서 확인된 활성 배양물 (2 x 3L)을 15 내지 30% McCoy 세포가 감염되도록 7일 동안 McCoy 세포 현탁액에서 성장시켰다. 시험감염 당일 (21일째)에, 활성 배양물을 10,000RPM에서 15분 동안 원심분리하여 수거하고, 세포 펠렛을 SPG 안정화기를 사용하여 350ml의 총 용적에 재현탁시켰다. 수거된 활성 배양물을 다양한 계대 (분리 후 계대 24번째 내지 27번째)에서 낮은 계대 N101494의 동결된 10X 내지 20X 농축된 시험감염물 스톡 300mL과 함께 모았다.
엘. 인트라셀룰라리스 N101494 병원성 시험감염물의 저장
시험감염 준비가 된 최종 제형을 접종할 때까지 2℃ 내지 8℃에서 또는 빙상에서 저장하였다.
백신 접종 및 시험감염 전/후의 역가
TCID50 분석으로부터의 결과는 백신 접종 및 시험감염 동안에 투여량당 각 시험 동물에게 투여된 생 엘. 인트라셀룰라리스의 양을 확인시켰다. B3903 백신 및 시험감염 물질 (엘. 인트라셀룰라리스 N101494)에 대한 역가측정 전 및 역가측정 후의 평균 역가 (n=5)는 하기 표 6에 제시한다:
| 그룹 | 처리물(log/투여량) | 평균 log/투여량(2ml) 백신 접종 전(TCID50/ml) |
평균 log/투여량(2ml) 백신 접종 후(TCID50/ml) |
전체 평균 log/투여량 |
| 1 | B3903 백신 고 투여량 | 6.07 | 5.89 | 6.0 |
| 2 | B3903 백신 중간 투여량 | 4.94 | 4.84 | 4.9 |
| 3 | B3903 백신 저 투여량 | 3.9 | 3.5 | 3.8 |
| 4 | 시험감염 대조군 | 7.85 | 7.57 | 7.71 |
연구 설계
65마리의 건강한 3주령의 엘. 인트라셀룰라리스 음성 이유자돈을 무작위적으로 5개의 처리군으로 분류하고 연구 동안에 개별적으로 사육하였다. 0일째에, 처리군 1 (15마리 돼지)에게 직접적 경구 약물에 의해 B3903 백신 2mL 투여량 (6.0 log/투여량)을 투여하였다. 처리군 2 (15마리 돼지)에게 직접적 경구 약물에 의해 4.9 log/투여량으로 역가측정된 B3903 백신을 1×2mL 투여량으로 투여하였다. 처리군 3 (15마리 돼지)에게 직접적 경구 약물에 의해 3.8log/투여량으로 역가측정된 B3903 백신을 1 x 2mL 투여량으로 투여하였다.
처리군 4 및 5 (10마리 돼지/그룹)에게 직접적 경구 약물에 의해 1×2mL 투여량을 투여하였다.
시험 21일째 (백신 접종 후 3주째), 처리군 1 내지 4의 시험 돼지에게 병원성의 낮은 계대 순수 배양물 엘. 인트라셀룰라리스 이종성 분리체 N101494를 1×10mL 투여량으로 투여하였다.
연구 42일째 (시험감염 후 3주째)에 모든 처리군 (1 내지 5)를 안락사시키고 PPE에 대한 육안적 및 현미경적 병변 분석을 위해 부검하였다.
연구 시작일로부터 각 시험 동물에 대한 시험감염일까지 매일 건강을 관찰하였다. 임상적 건강 (설사, 행동 및 신체 상태)를 시험감염일 (21일째)부터 연구 종결시 (42일째)까지 매일 스코어화하였다. 백신 접종일 (0일째), 시험감염일 (21일째) 및 연구 종결일 (42일째)에 체중을 측정하여 각 시험군의 평균 1일 체중 증가량을 계산하였다. 엘. 인트라셀룰라리스의 분변 방출을 연구 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일째에 분변 면봉 시험에 의한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (f-PCR)으로 평가하였다. 연구 종결시 (42일째)에 안락사시킨 모든 동물을 육안적 및 현미경적 병변에 대해 검사하였다. 조직내의 세균 함량의 정량적 분석을 연구 42일째에 PCR (t-PCR)과 함께 회장, 결장, 편도 및 장간막 림프절내의 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 조직학적 평가로 평가하였다. 혈청을 연구 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일째에 수집하였다. 혈청을 간접 형광 항체 시험 (IFAT)을 사용하여 시험함으로써 시험 동물에서 항-로소니아 항체를 검출하였다. 백신 접종 후 및 시험감염 후의 평균 1일 체중 증가량, 임상 스코어, 혈청전환율 (IFAT), 콜로니화 (t-PCR), 분변 방출 (f-PCR), 면역조직화학적 분석 (IHC)에 의한 육안적 병변 및 현미경적 병변 발생의 데이타 분석에 의해 처리군들을 비교하였다.
결과:
1차 결과의 요약
| 처리군 | 그룹당 돼지수 | 처리군 확인(log/투여량) | 평균 육안적 병변 스코어(회장) | 평균 육안적 병변 스코어(결장) | 평균 현미경적 병변 스코어(회장) | 평균 현미경적 병변 스코어(결장) |
| 1 | 15 | B3930 백신 고 투여량(6.0) | 1.5ab | 1.2a | 0.2ab | 0.1a |
| 2 | 15 | B3930 백신 중간 투여량(4.9) | 1.2ab | 1.0a | 0.4ab | 0.0a |
| 3 | 15 | B3930 백신 저 투여량(3.8) | 2.5b | 1.5b | 1.0b | 0.3a |
| 4 | 10 | 시험감염 대조군 | 3.6c | 2.2b | 2.4c | 1.5b |
| 5 | 10 | 엄격한 대조군 | 1.0a | 1.0a | 0.0a | 0.0a |
| * 문자는 유의차가 없음을 나타낸다(p<0.05) | ||||||
각 처리군에 대한 최종 시험 결과는, 투여량 (고 투여량, 중간 투여량 및 저 투여량)과 관계없이 그룹 1, 2 및 3의 백신 접종된 돼지와 비교하여, 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군 돼지 (그룹 4)에서 회장 및 결장의 유의적 육안적 및 현미경적 병변 발생을 나타냈다 (p<0.05). 백신 저투여량 결장의 평균 육안적 병변 스코어는 시험감염 대조군과 유의적으로 상이하지 않았다. 백신 저투여량 그룹 (그룹 3)은 백신이 투여되어, 연구 동안에 백신, 위약 또는 시험감염물을 투여받지 않은 엄격한 대조군과 비교하여 유의적 병변 발생 (육안적 및 현미경적)을 나타낸 유일한 처리군이다.
임상 스코어
임상 스코어를 시험감염일 (21일째)로부터 부검 (42일째)까지 각 동물에 대해 매일 기록하였다. 임상 스코어를 계산하여, 엘. 인트라셀룰라리스의 병원성 시험감염물을 투여받음으로 인한 처리군 간의 질환의 중증도 및 지속기간을 반영하는 평균 1일 임상 스코어를 수득하였다. 각 처리군에 대한 평균 임상 스코어는 표 8에 요약되어 있다.
| 처리군 | 그룹 확인 | 평균 임상 스코어 |
| 1 | B3930 백신-고 투여량 | 3.1a |
| 2 | B3930 백신-중간 투여량 | 3.0a |
| 3 | B3930 백신-저 투여량 | 3.0a |
| 4 | 시험감염 대조군 | 3.0a |
| 5 | 엄격한 대조군 | 3.0a |
| * 문자는 시험감염일부터 부검까지의 평균 임상 스코어 간에 유의차가 없음을 나타낸다(p<0.05) | ||
평균 임상 스코어를 부여받은 처리군과 관련된 데이타를 1원 ANOVA를 사용하여 검토함으로써 임상 스코어의 통계학적 분석을 수행하였다. 고 투여량, 중간 투여량 또는 저 투여량 백신 그룹과 비교하여, 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군 및 엄격한 대조군 간에 유의적 차이의 증거는 없었다.
평균 1일 체중 증가량
평균 1일 체중 증가량 (ADWG)를 백신 투여 시점 (0일째)부터 시험감염물 투여 (21일째)까지 및 연구 종결시 (42일째)까지 계산하였다. 백신 고 투여량 처리군과 백신 접종하지 않은 시험감염 대조 처리군 간의 체중 증가 차이 (Ibs.= 파운드)의 통계학적 분석으로 시험감염물 투여시부터 부검시까지의 유의적 차이의 증거가 밝혀졌다 (p<0.05). 체중 데이타는 표 9에 제시한다.
| 처리군 | 그룹 확인 | 평균 초기 체중 (Ibs.) |
ADWG (0일부터 21일까지) (Ibs.) |
ADWG (21일부터 42일까지) (Ibs.) |
ADWG 전체(Ibs.) (백신 접종부터 부검시까지) |
| 1 | B3930 백신-고 투여량 | 17.8a | 0.94a | 1.63a | 1.29a |
| 2 | B3930 백신-중간 투여량 | 17.7a | 1.00a | 1.60ab | 1.30a |
| 3 | B3930 백신-저 투여량 | 18.0a | 0.94a | 1.48ab | 1.21a |
| 4 | 시험감염 대조군 | 17.7a | 0.96a | 1.45b | 1.21a |
| 5 | 엄격한 대조군 | 17.7a | 0.94a | 1.63ab | 1.28a |
| * 문자는 백신 접종일부터 시험감염일까지 및 시험감염일부터 부검시까지의 ADWG에 있어 처리군들 간에 유의차가 없음을 나타낸다(p<0.05) | |||||
혈청전환 (IFAT)
혈청 샘플을 각 처리군의 모든 시험 동물로부터 매주 수집하고, 연구 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일째에 항-로소니아 IgG 항체의 존재를 시험하였다. 양성 및 음성 IFAT 대조 샘플은 당해 연구에서 수행된 모든 분석법에서 100% 정확하였다. 0일째부터 21일째 (백신 접종 후 3주째)에, 각 처리군의 모든 시험 동물은 IFA 음성이었다. 연구 28일째 (시험감염 후 1주일째)에, 백신 고 투여량 처리군의 1/15마리 (6.7%) 시험 동물은 IFA 양성인 반면에, 모든 나머지 동물은 IFA 음성으로 시험되었다. 연구 35일째 (시험감염 후 2주째)에 백신 고 투여량 및 중간 투여량 처리군의 4/15마리 (26.7%) 돼지 및 백신 접종하지 않은 시험감염 대조 처리군은 로소니아 항체에 대해 IFA 양성이었다. 백신 저 투여량 및 엄격한 대조 처리군은 둘다 35일째에 IFA 음성이었다. 연구 42일째 (시험감염 후 3주째)에, 시험감염 대조군의 8/10마리 (80%) 돼지, 백신-중간 투여량 그룹의 6/15마리 (40%) 돼지, 백신-저투여량 그룹의 5/15마리 (33.3%) 돼지 및 백신 고 투여량 그룹의 3/15마리 (20%) 돼지는 IFA 양성이었다. 엄격한 대조 처리군은 시험 종결시 (42일째)에 IFA 음성이었다.
혈청전환 데이타를 카이제곱 통계치를 사용하여 분석하였다. 엄격한 대조 처리군에서 수득된 데이타의 경우, 카이제곱 통계치는 연구 전반에 걸쳐 각 시험 동물에 대해 확인된 100% 음성 반응으로 인해 산정하지 않았다. 백신 또는 위약을 투여받은 처리군에서, IFAT 결과를 정확한 p-값의 추정 (몬테칼로 (Monte-Carlo))과 함께 카이제곱 통계치를 사용하여 비교하였다. 병원성의 순수한 배양물 시험감염물을 투여받은 시험감염 그룹으로부터 수득된 양성 IFAT 결과는 연구 42일째 (시험감염 후 3주째)에 백신-고 투여량 및 백신-저 투여량을 투여받은 그룹보다 유의적으로 높았다 (p<0.05).
엘. 인트라셀룰라리스의 분변 방출 (PCR)
분변 면봉을 각 처리군의 모든 시험 동물로부터 매주 수집하고, 연구 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일째에 PCR에 의해 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 시험하였다. 양성 및 음성 DNA 추출 및 PCR 반응 대조는 당해 연구에서 수행된 각 분석법마다 100% 정확하였다. 각 처리군의 모든 시험 동물은 0일째 (백신 접종)부터 21일째 (시험감염)까지 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 분변 PCR 음성이었다. 엄격한 대조군의 돼지는 연구 전반에 걸쳐 이들의 분변중에 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 분변 PCR 음성이었다. 엘. 인트라셀룰라리스의 분변 방출 (분변 PCR 양성)은 시험감염물 접종 후에 각 주마다 다양한 처리군에서 명백하였다. 이러한 결과는 하기 표 10에 요약되어 있다.
| 처리군 | 그룹 확인 | 28일째(시험감염 후 1주째) | 35일째(시험감염 후 2주째) | 42일째(시험감염 후 3주째) |
| 1 | B3930 백신-고 투여량 | 0/15(0%)a | 2/15(13.3%)a | 0/15(0%)a |
| 2 | B3930 백신-중간 투여량 | 6/15(40%)ab | 5/15(33.3%)a | 0/15(0%)a |
| 3 | B3930 백신-저 투여량 | 4/15(26.7%)ab | 8/15(53.3%)ab | 2/15(13.3%)ab |
| 4 | 시험감염 대조군 | 4/10(40%)b | 7/10(70%)b | 4/10(40%)b |
| 5 | 엄격한 대조군 | 0/10(0%) | 0/10(0%) | 0/10(0%) |
| * 문자는 시험감염물을 투여받은 처리군들 간에 유의차가 없음을 나타낸다(p<0.05) | ||||
정확한 p-값의 추정 (몬테칼로)과 함께 카이제곱 통계치를 사용한 통계학적 분석으로 각각의 백신 처리군에서의 양성 반응을 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군과만 비교하였다. 엄격한 대조군으로부터의 결과는 각 돼지가 당해 연구 전반에 걸쳐 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 100% 분변 PCR 음성이었기 때문에 그룹 비교에서 누락시켰다. 28일째 (시험감염 후 1주일째)에, 고 투여량의 백신을 투여받은 돼지는 백신 접종하지 않은 시험감염된 돼지에 비해서 이들의 분변 중에 엘. 인트라셀룰라리스의 방출이 유의적으로 적었다 (p = 0.017). 35일째 (시험감염 후 2주째)에, 고 투여량의 백신 (p=0.0024) 및 중간 투여량의 백신 (p=0.041)을 투여받은 돼지는 백신 접종하지 않은 시험감염된 돼지에 비해서 이들의 분변 중에 엘. 인트라셀룰라리스의 방출량이 유의적으로 적었다. 또한, 42일째 (연구 종결)에도, 고 투여량의 백신 및 중간 투여량의 백신 (p=0.017)을 투여받은 돼지는 백신 접종하지 않은 시험감염된 돼지에 비해서 이들의 분변 중에 엘. 인트라셀룰라리스의 방출량이 유의적으로 적었다. 저 투여량 그룹의 돼지는 시험감염 후 어떠한 날에도 시험감염 대조군에 비해서 유의적으로 덜한 PCR 양성은 아니었다.
엘. 인트라셀룰라리스 조직 콜로니화 (PCR)
회장 말단부, 결장, 편도 및 장간막 림프절의 조직 절편의 폴리머라제 연쇄 반응을 부검 후 (연구 42일째)에 수행하였다. 백신-고 투여량 그룹에서, 1/15마리 (6.7%) 돼지는 편도내 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화에 대해 PCR 양성인 반면에, 모든 나머지 처리군은 PCR 음성이었다. 장간막 림프 조직의 회장염 PCR 시험으로, 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군의 3/10마리 (30%) 돼지가 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화에 대해 양성인 반면, 모든 나머지 처리군은 PCR 음성임이 밝혀졌다. 회장 말단부를 스크랩한 점막의 회장염 PCR 시험으로 시험감염 대조군의 4/10마리 (40%) 돼지, 백신 저투여량 그룹의 4/15마리 (26.7%) 돼지, 백신 중간 투여량 그룹의 2/15마리 (13.3%) 돼지 및 백신 고투여량 그룹의 1/15마리 (6.7%) 돼지가 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화에 대해 PCR 양성임이 밝혀졌다. 결장의 회장염 PCR 시험으로 시험감염 대조군의 3/10마리 (30%) 돼지, 백신-저투여량 그룹의 5/15마리 (33.3%) 돼지, 백신 중간 투여량 그룹의 1/15마리 (6.7%) 돼지 및 백신 고 투여량 그룹의 2/15마리 (13.3%) 돼지가 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화에 대해 PCR 양성이었음이 밝혀졌다. 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화의 증거는 엄격한 대조군의 조직에서는 보이지 않았다.
회장염 PCR 양성 결과의 통계학적 분석을 정확한 p-값의 몬테칼로 근사법과 함께 카이제곱 통계치를 사용하여 처리군들 간에 비교하였다. 장간막 림프절 PCR 결과는 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군 및 백신 처리물을 투여받은 모든 처리군 간에 유의차의 증거를 나타냈다 (p=0.054). 통계학적 유의성은 연구 42일째에 회장, 결장 또는 편도내 엘. 인트라셀룰라리스 콜로니화에 있어 처리군들 간에 명백하지 않았다.
조직학 (IHC/H&E)
편도, 장간막 림프절, 회장 말단부 및 결장의 2 내지 4cm 길이의 절편을 부검시 (42일째)에 수집하고 조직학적 분석을 위해 10% 완충된 포르말린 속에 놓아두었다. 로소니아 인트라셀룰라리스는 부검시에 모든 처리군의 편도 절편의 IHC 염색에 의해 검출되지 않았다. 엄격한 대조군은 부검시에 채취된 모든 조직 절편에서 IHC 염색한 결과 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 음성이었다. 엘. 인트라셀룰라리스 및 PPE와 관련된 현미경적 병변의 존재는 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군의 9/10마리 (90%) 돼지, 백신 저 투여량 그룹의 6/15마리 (40%) 돼지, 백신 중간 투여량 그룹의 3/15마리 (20%) 돼지 및 백신 고 투여량 그룹의 1/15마리 (6.7%) 돼지에서 확인되었다. 현미경적 병변은 시험감염 대조군의 8/10마리 (80%) 돼지, 백신 저 투여량 그룹의 3/15마리 (20%) 돼지 및 백신 고 투여량 그룹의 1/15마리 (6.7%) 돼지에서 명백하였다. 중간 투여량을 투여받은 백신 그룹은 결장내 엘. 인트라셀룰라리스에 대해 IHC 음성이었다. 장간막 림프절의 염색된 절편은 엘. 인트라셀룰라리스를 갖는 시험감염 대조군의 1/10마리 (10%) 돼지에서만 발생하였다. 양성 IHC는 H&E 방법으로 입증된 현저한 음와 과다증식증의 존재와 매우 상관관계가 있는 처리군 간에 회장 및 결장의 절편을 야기하였다.
정량적 IHC 데이타의 통계학적 분석을 1원 ANOVA 및 크루스칼-월리스 등급 합산 검정 (Kruskal-Wallis Rank Sum Test)에 이어서 시험감염 그룹과 엄격한 대조군의 각 백신 투여량 그룹에 대한 특정한 대비를 사용하여 달성하였다. 통계학적 분석으로 연구 42일째에 투여량에 관계없이 백신 접종된 돼지와 비교하여 시험감염 대조군의 회장 및 결장내 엘. 인트라셀룰라리스로 인한 유의적 병변 발생의 증거가 있음이 밝혀졌다 (p<0.001). 통계학적 유의성은 엄격한 대조 처리군과 비교하여 높은 또는 중간 투여량의 백신을 투여받은 백신 접종된 동물의 회장 및 결장의 평균 IHC 병변 스코어에 있어 명백하지 않았다 (p>0.05). 저 투여량의 백신을 투여받은 돼지는 회장내 엘. 인트라셀룰라리스로 인한 평균 현미경적 병변 스코어가 엄격한 대조군과 비교하여 유의적으로 높았다 (p<0.05).
육안적 병변 스코어
각 시험 동물의 회장 및 결장을 부검시에 PPE와 관련된 육안적 병변에 대해 스코어화하였다. 엄격한 대조군의 시험 돼지로부터의 조직은 정상적이었고, 병변을 함유하지 않았으며, 평균 병변 스코어가 1.1 (회장) 및 1.0 (결장)으로 매겨졌다. 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군의 시험 동물의 조직은 처리군들 중에서 회장 (3.6) 및 결장 (2.0)에 대한 평균 육안적 병변 스코어가 가장 높았다. 백신 저 투여량 그룹의 시험 돼지는 평균 육안적 병변 스코어가 2.5 (회장) 및 1.5 (결장)으로 매겨졌다. 백신 중간 투여량 시험 돼지는 평균 육안적 병변 스코어가 1.5 (회장) 및 1.0 (결장)으로 매겨졌다. 백신 고 투여량 그룹의 조직은 평균 육안적 병변 스코어가 1.5 (회장) 및 1.2 (결장)으로 매겨졌다.
처리군들 간의 평균 육안적 병변 스코어의 통계학적 분석은 1원 ANOVA를 사용하여 달성하였다. 평균 육안적 병변 스코어는 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군과, 각각 백신 중간 투여량 및 고 투여량 그룹 간의 유의차의 증거를 나타냈다 (p<0.001). 유의차의 증거는 백신 저 투여량 그룹과 비교한 시험감염 대조군의 평균 육안적 회장 스코어에서 관찰되었다 (p<0.01). 결장의 평균 육안적 병변 스코어는 각각 백신 중간 투여량 및 고 투여량 그룹에 비해서 시험감염 대조군에서 유의적으로 높았다 (p<0.05). 또한, 유의적인 육안적 병변 발생은 엄격한 대조군과 비교하여 백신 저 투여량 그룹의 회장에서 관찰되었다 (p<0.001). 평균 육안적 병변 스코어 (회장 및 결장)에서의 통계학적 유의성의 증거는 엄격한 대조 처리군과 비교하여 백신-중간 투여량 및 고 투여량 그룹에서 명백하지 않았다.
결론
당해 연구는 PPE에 대한 3주령 돼지의 보호가 투여량당 최소량의 4.9log의 생 엘. 인트라셀룰라리스를 함유하는 B3903 (동결건조됨) 백신의 경구 투여량 2mL를 투여받은 경우에 달성되었음을 입증하였다. 보다 우수하지 않지만 유사한 보호는 시험감염 3주 전에 6.0log/투여량을 투여받은 백신 고 투여량 처리군에서 명백하였다. 저 투여량 백신 그룹 (3.8log/투여량)은 실험 백신의 높은 또는 중간 투여량을 투여받은 시험 동물과 비교하여 병원성의 순수한 배양물 이종 시험감염에 대한 적절한 보호를 나타내지 않았다. 통계학적 차이는 회장 및 결장내 현미경적 병변의 중증도 (p<0.001) 및 회장의 평균 육안적 병변 스코어 (p<0.01)과 관련하여 백신 저 투여량 그룹 및 백신 접종하지 않은 시험감염 대조군들 간에 명백하였다. 그러나, 유의적 PPE 병변이 백신 또는 시험감염물을 투여받지 않은 엄격한 대조군과 비교하여 상기 그룹의 회장 (현미경적 병변) 및 결장 (육안적 병변)에서 관찰되었다.
요약하면, 당해 연구로부터의 데이타는 (1) 3주령 돼지에 대한 B3903 (동결건조됨) 백신의 단일 경구 투여의 최소 보호 역가가 4.9log/투여량이고; (2) B3903 (동결건조됨) 백신이 병원성의 낮은 계대 순수한 배양물 엘. 인트라셀룰라리스, 이종 분리체 N101494에 대해 효과적이며; (3) B3903 (동결건조됨) 백신이 백신 접종되지 않은 돼지에 비해서 육안적 및 현미경적 병변, 조직 콜로니화 및 엘. 인트라셀룰라리스의 분변 배출을 감소시키는데 있어 도움이 됨을 입증하였다.
Claims (28)
- 삭제
- 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis) ATCC PTA-4926인, 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스.
- 제2항에 따른 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물의 면역화용 백신.
- 제3항에 있어서, 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스의 약제학적 유효량이 투여량당 103 TCID50 내지 106 TCID50인 백신.
- 제2항에 따른 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스와, 살모넬라 종 (Salmonella spp.), 에리시펠로트릭스 종 (Erysipelothrix spp.), 해모필루스 종 (Haemophilus spp.), 마이코플라즈마 종 (Mycoplasma spp.), 렙토스피라 종 (Leptospira spp.), 클로스트리디움 종 (Clostridium spp.), 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 브라키스피라 종 (Brachyspira spp.), 서코바이러스, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 전염성위장염 (TGE) 바이러스, 파보바이러스 및 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 중 하나 이상의 병원체로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물 면역화용 백신.
- 제2항에 따른 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스와, 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella choleraesuis), 에리시펠로트릭스 종, 전염성위장염 (TGE) 바이러스, 에스케리키아 콜라이, 클로스트리디움 종 및 브라키스피라 종으로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물 면역화용 백신.
- 제2항에 따른 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스와, 살모넬라 콜레라수이스 및 에리시펠로트릭스 종으로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물 면역화용 백신.
- 제2항에 따른 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스와, 병원체 클로스트리디움 종, 말 인플루엔자 바이러스 (EIV), 말 헤르페스 바이러스 (EHV), 알파바이러스 및 웨스트 나일 바이러스 중 하나 이상으로부터의 항원성 물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물 면역화용 백신.
- 제2항에 따른 비병원성의 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스를 함유하는 면역원성 조성물을 사람이 아닌 동물에게 투여함을 포함하여, 병원성 로소니아 인트라셀룰라리스의 면역원성 항원에 반응하도록 사람이 아닌 동물의 면역계를 자극하는 방법.
- 제3항에 있어서, 돼지 증식성 장염에 대해 동물을 보호하기 위해 사용되는 백신.
- (a) 제2항에 따른 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스를 10% 미만의 산소 농도에서 현탁된 상태로 존재하는 배양 세포 중에서 항온처리하여 당해 세균을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세균을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하여, 동물에서 로소니아 인트라셀룰라리스 세균에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신을 제조하는 방법.
- 삭제
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- (a) 배양된 세포를 제2항에 따른 비병원성 로소니아 인트라셀룰라리스를 함유하는 접종물로 감염시키는 단계,(b) 상기 감염된 세포를 교반함으로써 현탁된 상태로 유지시키면서 10% 미만의 산소 농도에서 항온처리하는 단계, 및(c) 상기 로소니아 인트라셀룰라리스의 일부 또는 전체를 수거하는 단계를 포함하는, 로소니아 인트라셀룰라리스의 배양 방법.
- 제14항에 있어서, 산소 농도가 0% 내지 8%의 범위인 방법.
- 제15항에 있어서, 산소 농도가 0% 내지 3%의 범위인 방법.
- 제14항에 있어서, 항온처리를 6% 내지 10%의 이산화탄소 범위에서 수행하는 방법.
- 제14항에 있어서, 배양된 세포가 HEp-2, McCoy 및 IEC-18 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제18항에 있어서, IEC-18 세포가 마이크로캐리어에서 배양되는 방법.
- 제14항에 있어서, 감염된 세포가 2일 내지 10일 동안 단계 (b)에 따라 항온처리되는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제14항에 있어서, 수거된 로소니아 인트라셀룰라리스를 동결건조시키는 단계 (d)를 추가로 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 동결건조가 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계를 포함하는 방법.
- 삭제
- (a) 사람이 아닌 동물 피험체로부터의 샘플을 제2항에 따른 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계 및(b) 상기 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복합체의 존재가 돼지 증식성 장염의 진단과 양성적으로 상관관계가 있는 것인, 사람이 아닌 동물 피험체에서 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하는 분석을 수행함을 포함하는 돼지 증식성 장염의 진단 방법.
- 제26항에 있어서, 분석이 방사선면역분석, 효소 연관 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay), 형광 면역분석 및 면역전기영동 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분석을 포함하는 방법.
- (a) 제2항에 따른 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스를 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 사람이 아닌 동물에게 투여하는 단계 및(b) 상기 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 함유하는 항혈청 또는 혈장을 수집하는 단계를 포함하여, 사람이 아닌 동물에서 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항혈청을 생산하는 방법.
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