CN1829529B - 源自欧洲的细胞内罗森氏菌及其疫苗,诊断剂及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞内罗森氏菌疫苗及用于保护免受细胞内罗森氏菌感染及诊断细胞内罗森氏菌感染的方法。在某种程度上，本发明的产物及过程可作为培养大规模供应的细胞内罗森氏菌的改良方法的结果获得，其包括欧洲来源的细胞内罗森氏菌的新的分离株及制备含有作为疫苗产物的减毒欧洲分离株的冻干产物的方法。

Description

源自欧洲的细胞内罗森氏菌及其疫苗，诊断剂及使用方法
相关申请
本发明要求2003-6-25提交的美国临时申请序列号60/490,001的优先权，所述临时申请的全文内容包含在本文作为参考。
技术领域
本发明涉及细胞内罗森氏菌疫苗及用于保护免受细胞内罗森氏菌感染及诊断细胞内罗森氏菌感染的方法。在某种程度上，本发明的产物及过程可作为用于培养大规模供应的细胞内罗森氏菌的改良方法的结果获得，其包括欧洲来源的细胞内罗森氏菌(L.intracellularis of European origin)的新的分离株及制备含有作为疫苗产物的减毒欧洲分离株的冻干产物的方法。
背景技术
细胞内罗森氏菌为猪增生性肠病(″PPE″)的病原体，其实际上会感染所有动物，所述动物包括：兔子、雪貂、仓鼠、狐狸、马及如同鸵鸟及鸸鹋具多样性的其它动物。细胞内罗森氏菌系造成欧洲及美国猪群损失的尤其主要原因。
PPE的一致性特征系在肠感染部分的肠道细胞中出现胞质内、非膜结合的曲状杆菌。与PPE相关的细菌在S.McOrist等人的Vet.Pathol.，Vol.26，260-264(1989)中已被称作″弯曲杆菌样生物″。随后，已确认该致病菌为一种新颖的分类学属及物种，别名称作细胞内回肠共生微生物(Ilealsymbiont)(IS)。C.Gebhart等人，Int′l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-538(1993)。近来，所述新颖细菌的分类学名称命名为细胞内罗森氏菌(L.)。S.McOrist等人，Int′l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.45，No.4，820-825(1995)。这三种名称交换使用，指代本文进一步鉴定及描述的生物体。
细胞内罗森氏菌为一种专性(obligate)细胞内细菌，其无法以常规细菌学方法于常规不含细胞的培养基中培养，且被认为为了生长，需要附着性上皮细胞。S.McOrist等人，Infection and Immunity，Vol.61，No.19，4286-4292(1993)及G.Lawson等人，J.of Clinical Microbiology，Vol.31，No.5，1136-1142(1993)论述了使用IEC-18大鼠肠道上皮细胞单层在常规组织培养烧瓶中培养细胞内罗森氏菌。此外，H.Stills，Infection and Immunity，Vol.59，No.9，3227-3236(1991)讨论了使用肠407人类胚胎肠细胞单层及GPC-16豚鼠结肠腺癌细胞单层在常规组织培养烧瓶中培养细胞内罗森氏菌。
近来，美国已批准使用一种细胞内罗森氏菌疫苗，该疫苗系基于美国专利第5,714,375号及第5,885,823号所述及所申请专利的罗森氏菌分离株，所述两个专利的全文均以引用的方式并入本文中。上述疫苗系由BoehringerIngelheim Vetmedica，Inc.，2621 North Belt Highway，St.Joseph，Missouri64506-2002以ENTERISOLIleitis为商标出售。
发明内容
本发明的一个目的是提供改良的细胞内罗森氏菌疫苗，其使用欧洲来源的分离株。
本发明的另一目的是提供用以大规模培养细胞内罗森氏菌的改良方法及用以制备细胞内罗森氏菌疫苗的改良技术。
为了达成所述及其它目的，且根据如本文体现及广泛描述的本发明目的，本发明提供了来自欧洲的新近经分离的细胞内罗森氏菌、使该分离株减毒的方法及其减毒分离株。本文还提供了包含减毒分离株的疫苗。本文还提供了用以制备包含用于在用药时复原的冻干形式的减毒分离株的疫苗及其冻干产物的方法。
在一个具体实施方案中，来自欧洲的新近经分离的细胞内罗森氏菌为分离株DK 15540，其是以PTA-4927登记号保藏于ATCC中的分离株。在另一具体实施方案中，衍生于分离株DK 15540的减毒分离株命名为分离株B3903，其则以PTA-4926登记号保藏于ATCC中。
具体内容
如本文所用，术语″细胞内罗森氏菌″意谓由C.Gebhart等人，Int′l.J.ofSystemic Bacteriology，Vol.43，No.3，533-538(1993)及S.McOrist等人，Int′l.J.of Systemic Bacteriology，Vol.45，No.4，820-825(1995)详述的细胞内、弯曲的革兰氏阴性细菌，所述文献的全文各自均以引用的方式并入本文中，且该术语包括(但不限于)名为DK 15540的分离株(其在布达佩斯条约(BudapestTreaty)的约束下于2003-1-9保藏于美国典型培养物保藏中心(theAmerican Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209)及ATCC登记号PTA-4927)；根据本领域的知识和本文的教导，自全世界PPE感染的猪及其它动物所获的致病菌；及任何以上细菌的变异体或突变体，无论是以自然方式或是以人工方式取得。
如本文所用，术语″减毒分离株″意谓任何细胞内罗森氏菌分离株，其根据本文所揭示的培养及传代技术所制备以实现当给予宿主动物时无毒性，同时可保持致免疫特性，所述分离株包括(但不限于)命名为B-3903的减毒分离株，其系在布达佩斯条约的约束下于2003-1-9保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，ACTT登记号PTA-4926。
本发明的减毒分离株可作为动物抗微生物疫苗中的免疫原，所述动物包括鸟、鱼及诸如牛、猪、马及灵长类的哺乳动物。以本领域熟练技术人员所知的技术及本文揭示的内容可制备所述疫苗。该疫苗包含在可药用载体中的免疫有效量的减毒分离株。该疫苗可分一或多次给药。根据本文所含有的教示，由本领域已知的手段而无需过度试验来测定免疫学有效量。无毒性细菌的量应足以刺激易患病动物的免疫反应，同时仍保持无毒性。这将取决于所涉及的具体动物、细菌及疾病。待给予易受感染动物的推荐剂量优选为约3.0TCID50(组织培养感染剂量50％终点)/剂量至约6.0TCID50/剂量且更优选为约4.0TCID50/剂量至约5.0TCID50/剂量)。在一优选具体实施方案中，该疫苗的效价如组织培养感染剂量50％终点稀释度测定法(TCID50)所测定为约4.9TCID50/剂量。所述载体是本领域已知的且包括稳定剂及稀释剂。该疫苗也可含有适当的佐剂。本发明的疫苗可与其它疫苗并用，例如作为另一疫苗的稀释剂来使用。也可干燥所述疫苗制剂，例如，通过冷冻干燥来达成储存目的或为了随后将其调配为液态疫苗。
因此，本发明也包含一种为了保护宿主免受细菌感染而在动物宿主中诱导针对毒性、野生型细胞内罗森氏细菌的免疫反应的方法。该方法包含将免疫有效量的本发明的减毒细菌或灭活细菌给予宿主，且优选将本发明的疫苗给予宿主。
如本文所用，术语″大规模培养″意谓细胞内罗森氏菌的培养水平超过约2.0至3.0升且包括以100升或更大的规模来生产。如本文所用，″培养″意谓促进细胞内罗森氏菌的生长、繁殖及/或增殖的过程。
细胞内罗森氏菌可由本领域已知的方法来培养，优选根据美国专利第5,714,375号及第5,885,823号来培养。例如，可首先以包含细胞内罗森氏菌的接种物来接种培养细胞以使细菌感染所述细胞。多种细胞系均可用于实施本发明，其包括(但不限于)：IEC-18(ATCC 1589)-大鼠肠道上皮细胞；HEp-2(ATCC 23)-人类表皮样癌细胞；McCoys(ATCC 1696)-小鼠(未指定)细胞；BGMK(Biowhittaker #71-176)-水牛绿猴肾细胞及猪肠道上皮细胞。优选的培养细胞为HEp-2、McCoys或IEC-18细胞。
若在接种前使用培养细胞，则所述细胞可为单层形式。为了形成单层，可将所述细胞接种于常规烧瓶中。各烧瓶通常接种有与生长培养基混合的约1×105至约10×105个细胞每25、75、150、850cm2烧瓶或滚筒瓶(rollerbottle)。该生长培养基可为任何用于细胞培养的培养基，其包括氮源、用于所选培养细胞的必需生长因子及碳源，例如葡萄糖或乳糖。优选的培养基是用含有1-5％胎牛血清的Ham′s F 12强化的DMEM，但也可使用其它市售培养基来产生良好结果。
通过使培养细胞保持恒定生长状态来增强细胞内罗森氏菌的成功培养。因此，该单层培养细胞在接种时应为约20％至约50％满底。优选地，所述细胞在接种时应为约30％至约40％满底，最优选为约30％满底。
或者，如下文所述，在接种前，所述细胞可生长于悬浮液中。优选地，首先使所述细胞在黏着型系统(如滚筒瓶系统)中以单层形式生长至100％满底，且随后将其转移至3-3000公升器皿中且使其在悬浮液中生长。或者，可在接种前，利用适于细胞在此系统中生长的参数使所述细胞在3-3000公升器皿(生物反应器，发酵器，旋转烧瓶等)中的悬浮中生长至所要细胞密度，例如2×105个细胞/毫升。
该接种物可为获自感染的猪或其它动物的细胞内罗森氏菌的纯培养物。该接种物优选可为获自ATCC登记号PTA-4927的细胞内罗森氏菌的纯培养物。
该接种物可为通过刮取感染了PPE的猪或其它动物的回肠黏膜而制得的肠道匀浆。在制备肠道匀浆时，被选作培养物的回肠切片应显示出伴有肠肥大增厚的严重病变。由于细菌的脆弱性质，在尸检后优选应尽快将样品储存于-70℃。细胞内罗森氏菌对其具有抵抗性的抗生素，例如万古霉素(Vancomycin)、两性霉素(Amphotericin)B或胺基糖苷组抗生素的成员(包括庆大霉素及新霉素，仅举几个实例)，优选将其加入接种物中以抑制污染性细菌同时允许细胞内罗森氏菌生长。根据本文的教示，无论该接种物是否为纯培养物或肠道匀浆，培养细胞的接种均可由本领域中已知的各种技术来进行。
随后在降低的溶解O2浓度条件下保温所述细菌及/或接种的培养细胞。在溶解氧浓度超过10％时，细胞内罗森氏菌的生长并非最优，最终在此范围外的氧浓度下其生长终止。优选地，在约0％至约10％的溶解氧浓度保温所述细菌及/或接种的培养细胞。更优选地，在约0％至约8％的氧浓度保温所述细菌及/或细胞，最优选的氧浓度为约0％至约3.0％。
二氧化碳的适当浓度对于细胞内罗森氏菌的适当生长也具重要性。在二氧化碳浓度超过0％且低于4％时，发生非最优生长，最终在此范围外的二氧化碳浓度其生长终止。二氧化碳浓度优选在约6％至约10％范围内，最优选的二氧化碳浓度约为8.8％。
此外，优选在约4％至约10％范围内的氢浓度保温所述细胞。最优选地，在约0至约8.0％O2、约8.8％CO2及约4％H2保温所述细胞。氮在含有氮(96％)及氢(4％)或氮(80％)、二氧化碳(10％)及氢(10％)的气体混合物中用作″平衡体″以用于此生物生长。优选在约80％至96％的氮浓度保温细胞。因此，最优选在约0至约8.0％O2、约8.8％CO2、约4％H2及约96％N2保温细胞。
可在双气体保温器或其它气体腔室中保温接种细胞，所述腔室含有适当的氢、氧及二氧化碳浓度且让所述细胞在保温期间悬浮。该腔室应包含用于使接种细胞保持悬浮的装置，以及气体监视器及供应源以提供并保持适当的气体浓度。保温温度应在30℃至约45℃的范围内且更优选在约36℃至约38℃的范围内。该温度最优选约为37℃。根据本文的教示，一般技术者易于获得用于培养及减毒的必要设备。适于进行本发明的设备的一实例为双气体保温器，例如与旋转烧瓶并用以使细胞保持悬浮的480型(Lab-Line，Melrose Park，IL)。目前的优选设备包含发酵器、生物反应器、搅拌盘或含有至少约2公升培养基且能够经由适当浓度的喷射气体使培养细胞保持悬浮的旋转振荡器或其它机械搅拌装置，且连续监视培养基中的溶解O2含量。New Brunswick、Braun及其它公司均制备适于达成此目的的发酵器及生物反应器。
使接种细胞在保温期间保持悬浮状态，通过增强各个体细胞对于生长培养基的暴露及增加氢、氧及二氧化碳的适当混合物来达成所述细胞的最大生长，且因此达成细胞内罗森氏菌的最大生长。可搅拌所述培养细胞且由本领域中已知的各种方法使其保持悬浮，所述方法包括(例如)培养烧瓶、滚筒瓶、膜培养、生物袋(biobag)、WAVETM生物反应器系统、发酵器及旋转烧瓶。在保温期间可通过在双气体保温器或类似装置内部的旋转烧瓶中保温所述细胞而使其保持悬浮。如本文所用，术语″旋转烧瓶″意谓烧瓶或其它容器，其采用浆状物、螺旋桨或其它装置来搅拌培养物且使其中所含细胞保持悬浮。
在一优选具体实施方案中，保温所述接种细胞直至其达到满底且随后将所述细胞置于含有生长培养基的旋转烧瓶中且在双气体保温器中保温，同时旋转该烧瓶。优选地，刮下所述接种细胞或使其胰蛋白酶化且使其在旋转烧瓶中传代。这可由本领域中已知的各种方法来达成，例如使用细胞刮器来使细胞脱落。一旦将所述细胞引入旋转烧瓶中，该旋转烧瓶的浆状物一般系在约5至约500rpm范围内在磁性搅拌盘上旋转以使感染细胞保持悬浮。
随后使一部分所培养的细胞内罗森氏菌在新鲜培养物中传代以增加细胞内罗森氏菌的产量。本文所用的术语″传代″或其变化意谓为了使新鲜细胞感染细菌而将一部分所培养的细胞内罗森氏菌转移至新鲜培养细胞中的过程。如本文所用，术语″新鲜″意谓尚未感染细胞内罗森氏菌的细胞。优选地，所述细胞平均仅为约一日龄。
可通过移除一部分原始培养物且将其加入含有新鲜培养细胞的新烧瓶中来实现细胞内罗森氏菌在悬浮培养物中的传代。若原始培养物含有大数量的细菌/毫升(例如超过约104个细菌/毫升)，则最好将来自感染烧瓶的约1至10％(体积/体积)培养物添加于含有新鲜细胞的新烧瓶中。优选在感染了50-100％细胞时完成此操作。若少于50％的细胞被感染，则优选在新烧瓶中使培养物分为1∶2且通过加入新鲜组织培养细胞及培养基而按比例增大容积，由此来实现传代。与先前技术中的单层培养物传代形成直接对照，在两种情况下，均不需要细胞溶解及其它步骤。
如间接荧光抗体(IFA)染色、TCID50或另一对照性方法所判定，在培养细胞充分生长及随后由细胞内罗森氏菌感染以后，随后收获至少一部分所培养的细胞内罗森氏菌细菌。一般在约60％或更高的细胞感染性下进行收获；然而，本领域熟练技术人员了解收获可在低于60％的细胞感染性下进行。根据本文的教示，通过以一般技术者已知的各种技术使细菌自悬浮液中分离可进行收获步骤。优选地，使所有或一部分悬浮液的内容物离心以使所述培养细胞沉淀，使所得细胞沉淀再悬浮且使所述感染细胞溶解，由此来收获所述细胞内罗森氏菌细菌。通常，以约3000xg使至少一部分内容物离心约20分钟以使所述细胞及细菌沉淀。随后可使该沉淀再悬浮于(例如)蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)溶液中且使其通过25号(gauge)针约20次以溶解所述细胞。若需要进一步的纯化，则可以约145xg使所述样品离心约5分钟以移除细胞核及碎片。随后可以约3000xg使上清液离心约20分钟且使所得沉淀再悬浮于适当稀释液中，例如具有胎牛血清的SPG(为了制备适于冻干、冷冻或用作接种剂的所收获细菌)或生长培养基(为了制备更适用于传代至新鲜细胞的所收获细菌)。
如先前所提及，通过使组织细胞保持活跃生长来增强用于大规模生产的细胞内罗森氏菌的有效生长。以单层而言，在培养物满底时，细胞分裂率实质上减少。在单层组织培养物上生长细胞内罗森氏菌的尝试已具有有限的成功且不可能大规模化。然而，使用悬液培养物极大地有助于使所述细胞保持活跃生长且允许连续的培养物膨胀及大规模化。如以上所说明，使用发酵器及在约0至约3％之间的溶解O2可使得多达108个细菌/毫升或更多的细菌生长。
在使用IEC-18细胞时，最好加入凝胶、琼脂糖、胶原蛋白、丙烯酰胺或硅珠(例如Cultisphere-G多孔微载体(HyClone Laboratories，Logan Utah))，以及生长培养基。然而，根据本文所用的方法，HEp-2细胞及其它细胞均不需要微载体。
为了培养物保持的目的，就HEp-2培养物而言，优选以一周的时间间隔移除25％至50％的培养物且以新鲜培养基来置换。就具有微载体或珠粒的细胞培养物而言，优选地每周1-2次移除25％至50％的培养物且以新鲜培养基来置换。为了实现大规模化的目的，可将额外25％至50％的培养基(或具有微载体的培养基)添加于该培养物中。
视其中培养细胞变得受感染的速率而定，通常在约每个2日至约每7日发生新鲜细胞的传代。假设培养细胞在2至7日内有至少70％受感染，传代优选地发生在约每5至7日之间。
本发明也提供了对抗欧洲来源的细胞内罗森氏菌的新颖分离株的疫苗及制备疫苗的方法。优选地，在使受感染细胞在悬浮状态保持一段延长时间(例如6-8个月)的后，收获至少一部分所培养的细胞内罗森氏菌并监视潜在的减毒作用。优选通过宿主动物或动物模型攻击来完成该监视以选出减毒分离株。根据本文所教示的方法将所述减毒分离株用于疫苗。
本发明允许快速培养膨胀、100-1000倍的产量增加及欧洲来源的细胞内罗森氏菌的生产成本的降低。因此，为了疫苗生产的目的而使所得大量供应的细胞内罗森氏菌易于减毒。在悬浮液中使细胞内罗森氏菌生长的方法极大地增加了可用于达成此目的的细菌的易得性(ease)、速率及数目。愈多的细胞及细胞分裂出现，愈高程度的突变就会出现，其对于疫苗发育有益。因此，在悬浮液中的生长增加了由环境调节基因所控制的重要免疫原的表达及其表达产物。
所得减毒分离株虽可在组织培养物单层中培养，但优选在悬浮培养物中培养。其它减毒装置可包括通过使用(例如)N-甲基亚硝基胍及本领域中已知的其它物质所进行的化学减毒。通过使用多重传代或化学装置，为疫苗制备来生产和挑选减毒的细胞内罗森氏菌。在一优选具体实施方案中，所得减毒分离株的ATCC登记号为PTA-4926。
可通过如上所述的离心或微过滤来收获疫苗抗原。随后基于最优的宿主动物免疫反应从而在界定的水平使该抗原标准化，如宿主动物种类中的剂量效价所确定的。可由本领域中已知的方法来灭活细菌，例如，通过使用0.3％福尔马林或其它灭活剂，由此制备灭活的疫苗。随后向该抗原中加入适合的佐剂如氢氧化铝或矿物油中以增强免疫反应。随后将该抗原用以经由肌肉内或皮下感染接种至宿主体内，在猪为约3-4周龄的情况下，必要时给予强化剂量。
优选地，将所述细菌连续传代以诱导及挑选减毒、无毒的活培养物。在宿主动物中测试该培养物的减毒迹象。如前所述来收获该培养物且将其冻干。例如，对猪经口接种1×104至1×106个细菌。在接种疫苗后约28日时，使该猪经口接种来自较少传代(经由来自肠匀浆的原始分离后在活体外传代少于30次)的细胞内罗森氏菌毒性培养物的约1×107个生物体。在攻击后21日时对经感染的动物进行尸检且观察小肠的大体病变及微观病变。也应进行PCR、间接荧光抗体(IFA)或免疫组织化学(IHC)。
约80％的对照动物将显示大体或微观病变且使用PCR、IFA或IHC测试方法来测试细胞内罗森氏菌在肠黏膜细胞中的阳性存在。经疫苗接种的动物将具有如组织学观察所判定的正常黏膜表面且将通过接种后3至4周时所进行的PCR检测而显示为阴性。
通常在连续培养约150至约250日后产生减毒致免疫性细胞内罗森氏菌分离株，在此期间该培养物传代约50-100次。然而，本领域熟练技术人员了解其它减毒培养物可通过改变所述数字而产生。
可冻干本发明的疫苗产物。在收获后，可由本领域中已知的各种方法来浓缩该分离株且使其与稳定剂(例如蔗糖凝胶稳定剂)混合。随后可使该疫苗产物经受冷冻及干燥(冻干)。通常，该冷冻步骤包含递减(ramp)至约-45℃±3℃且保持约150分钟至约480分钟。该干燥步骤可包含一级与二级干燥步骤。例如，一级干燥步骤可包含：(a)递减至约-30℃至约-5℃且保持约120分钟至约1000分钟，及可选(b)递减至约-5℃至约5℃且保持约150分钟至约2000分钟。二级步骤通常包含递减至约27℃±5℃且保持约330分钟至约1120分钟。本领域熟练技术人员了解所述范围可根据条件(例如起始容积)进行调整。
随后制备在可药用载体中包含免疫学有效量的减毒细胞内罗森氏菌的疫苗。在一优选具体实施方案中，疫苗包含在可药用载体中的ACTT登记号PTA-4926。经组合的免疫原及载剂可为水性溶液、乳液或悬浮液。免疫学上的有效量可根据本发明的教导由本领域中已知的手段而无需不适当试验法来判定。一般而言，在使用纯化细菌时，免疫原的量将在5至5000微克之间，且在102.0至109.0TCID50之间，优选在103.0至106.0TCID50之间，更优选在104.0至105.0TCID50之间。
本发明也涵盖组合疫苗，所述疫苗包含指定为ATCC登记号PTA-4926的减毒细胞内罗森氏菌分离株及来自至少一种其它病原体的抗原物质及可药用载体，所述其它病原体包括(但不限于)：沙门氏菌属(Salmonella spp)(例如猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、丹毒丝菌属(Erysipelothrix spp)(例如猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae))、嗜血杆菌属(Haemophilus spp)(例如副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis))、支原体属(Mycoplasma spp)(例如猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia))、钩端螺旋体属(Leptospira spp)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp)(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、艰难梭菌(Clostridium difficile))、链球菌属(Streptococcus spp)(例如猪链球菌(Streptococcus suis))、螺旋体属(Brachyspira spp)(例如猪痢疾蛇形螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae))、博德特氏菌属(Bordetella)(例如支气管败血性博氏杆菌(Bordetella bronchiseptica))、巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)(例如多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida))、环状病毒(circovirus)(例如猪环状病毒2型(porcine circovirus type 2))、猪生殖与呼吸症候群(porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)(PRRS)病毒、猪流感病毒(swine influenzavirus)(SIV)、冠状病毒(例如传染性胃肠炎(transmissible gastro-enteritis)(TGE)病毒、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory corona virus))、细小病毒(parvovirus)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一具体实施方案中，该组合疫苗包含指定为ATCC登记号PTA-4926的减毒细胞内罗森氏菌分离株及来自猪霍乱沙门氏菌、丹毒丝菌、梭状芽孢杆菌属、螺旋体属、传染性胃肠炎(TGE)病毒及大肠杆菌的抗原物质及可药用载体。来自梭状芽孢杆菌属的抗原物质可包括(但不限于)产气荚膜梭菌与艰难梭菌。来自丹毒丝菌属的抗原物质可包括(但不限于)猪丹毒丝菌。
在另一具体实施方案中，该组合疫苗包含ATCC登记号为PTA-4926的减毒细胞内罗森氏菌分离株及来自猪霍乱沙门氏菌及丹毒丝菌属的抗原物质及可药用载体。在另一具体实施方案中，该组合疫苗包含ATCC登记号为PTA-4926的减毒细胞内罗森氏菌分离株及来自猪霍乱沙门氏菌及猪丹毒丝菌的抗原物质及可药用载体。
在另一具体实施方案中，该组合疫苗包含指定为ATCC登记号PTA-4926的减毒细胞内罗森氏菌分离株及来自至少一种其它病原体的抗原物质及可药用载体，所述其它病原体包括(但不限于)：梭状芽孢杆菌属(例如破伤风杆菌)、马流感病毒(EIV)(例如EIV-1、EIV-2)、马疱疹病毒(EHV)(例如EHV-1、EHV-2、EHV-3、EHV-4、EHV-5、EHV-6、EHV-7)、α病毒(例如东方脑炎病毒、西方脑炎病毒、维内瑞拉脑炎病毒)或西尼罗河病毒。
根据本发明的疫苗通常系以一或多个剂量给予易感动物，优选为猪。该活疫苗或死疫苗可于2周的时间间隔用药1或2次。对于减毒活疫苗而言，优选为一次用药。虽然减毒活分离株的优选用药路径为肌肉内、经口或鼻内方式，但对于死疫苗而言，肌肉内与皮下注射路径为最优选。
由于培养致病细菌需要时间而阻碍了PPE的有效诊断。由于本发明，发展快速及准确分析法用以测定易感PPE猪只及其它动物所取出的生物样品中细胞内罗森氏菌的存在的诊断工具目前已具有可能性。
本发明的欧洲来源的细胞内罗森氏菌(或衍生自所述细菌的成分)可作为ELISA或其它免疫分析法(例如免疫荧光抗体测试(″IFA″))中的抗原，以检测疑受所述细菌感染的动物血清及其它体液中对抗细胞内罗森氏菌的抗体。目前优选的免疫分析法为如以下实例所述的IFA。或者，可将本发明的细菌用于Western印迹分析法中。
根据本发明，优选的ELISA实验流程如下：
1.加入0.1毫升每孔经涂覆缓冲剂稀释的抗原。在4℃保温18小时。
2.PBS洗涤3次。
3.培养盘的各孔中加入0.25毫升封闭缓冲剂。在37℃保温2小时。
4.洗涤缓冲剂洗涤3次。
5.用封闭缓冲剂稀释血清，且将0.1毫升添加于培养盘的第一个孔中。使连续的1∶2稀释液通过培养盘。在37℃保温1小时。
6.洗涤缓冲剂洗涤3至5次。
7.封闭缓冲剂稀释偶联物，且将0.1毫升添加于培养盘的槽孔中，且在37℃保温1小时。
8.洗涤缓冲剂洗涤3至5次。
9.加入底物。
10.分光光度计量测光的吸光度。
11.其中未加入抗原的槽孔用作空白槽孔。
12.阳性与阴性对照猪血清应用于每次实验。
优选的Western印迹分析法实验流程如下：
1.抗原在12％SDS-PAGE上跑胶，且将其转移至硝化纤维膜。
2.膜置于封闭缓冲剂中2小时。
3.除封闭缓冲剂且以PBS漂洗1分钟。
4.用封闭缓冲剂稀释血清且将其加入膜中。在室温保温2小时。
5.用洗涤缓冲剂洗涤3次(每次洗涤历时5分钟)。
6.用封闭缓冲剂稀释偶联物且将其加入膜。在室温保温1小时。
7.用洗涤缓冲剂洗涤3次。
8.添加底物，保持10分钟或直至出现强条带。
9.用PBS漂洗。
10.空气干燥且在暗处储存。
本发明的欧洲来源的细胞内罗森氏菌细菌(或衍生自所述细菌的成分)也可用以制备用于诊断、预防或治疗的抗血清或抗体。本发明的欧洲来源的细胞内罗森氏菌细菌(或衍生自所述细菌的成分)可以有效引起免疫反应的量用药于非人类动物，且可根据本领域中已知及本文所述的方法来收集含有抗细胞内罗森氏菌细菌的抗体的抗血清或血浆，或衍生自所述细菌的成分。
以下实例进一步描述了本发明，所述实例仅为达成说明的目的且未被理解为本发明的限制。事实上，一般技术者将易于明白本发明的其它变异。
本文所提及的所有公开出版物及专利的全文均以引用的方式并入本文中。
实施例1
细胞内罗森氏菌疫苗的制备
来自患有猪增生性肠病(PPE)的欧洲猪的肠的细胞内罗森氏菌的分离及减毒：
细胞内罗森氏菌毒性分离株DK 15540(DK 15540，DK-15540及DK-15540在本文中可交换使用)系由明尼苏达大学(the University ofMinnesota)自感染了急性猪出血性肠病的丹麦猪的回肠匀浆中分离而得。此分离株系在布达佩斯条约的约束下于2003-1-9保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，登记号PTA-4927。此分离过程包括自回肠刮下黏膜、匀浆、胰蛋白酶消化30分钟，及使其通过组织匀浆器。随后使该回肠匀浆通过一系列包括5.0、1.0及0.65μm的过滤器。在具有10％胎牛血清(FBS)的蔗糖磷酸谷氨酸酯缓冲剂中稀释该匀浆。制得匀浆的等分试样(6×1毫升)且将其储存于低于-70℃。将该匀浆用作接种物以感染T-75cm2烧瓶中的McCoy细胞。刮下McCoy细胞单层，以氯化钾处理使细胞溶解，且将浓缩细胞沉淀置于使用对细胞内罗森氏菌具特异性的单克隆抗体以IFA法染色的显微镜载玻片上，每日监视培养物的McCoy细胞感染。在贴壁(anchorage)依赖性细胞培养物上传代11次的后，将来自第11次传代的接种物转移至含有McCoy细胞的250毫升旋转烧瓶中且使其在悬浮液中生长直至收获。通过连续的活体外传代在McCoy细胞中使细胞内罗森氏菌的丹麦分离株(ATCC登记号PTA-4927)减毒80周且由单克隆抗体来测试同一性。将该减毒分离株指定为B3903(B3903、B 3903及B-3903在本文中可交换使用)。分离株B3903系在布达佩斯条约的约束下于2003-1-9保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，ATCC登记号为PTA-4926。
培养物：
鉴定
利用特征生长要求、PCR反应及单克隆抗体反应来鉴定细胞内罗森氏菌主种子及工作种子材料。
纯度
以单克隆抗体染色、细菌及病毒的常规外源试剂测试来检查培养物且进行无菌支原体测试，由此来判定细胞内罗森氏菌的主种子及工作种子的纯度。
毒性
如主种子及直肠(back passage)接种物缺乏产生在易受感染的猪暴露于毒性细胞内罗森氏菌后所观察到的临床迹象及大体病变的能力所证明，细胞内罗森氏菌的主种子不具毒性，如下文实例2进一步说明。
传代培养物的范围
由细胞内罗森氏菌的生产所最终收获的材料不超出主种子的11次传代。
培养基组合物
EU McCoy主细胞群(MCS)系在具有Ham′s加强的F12(DMEM/F12)及1-10％(体积/体积)新生牛血清(NBS)或胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(细胞生长及保存的培养基)中生长及保存。
将主种子及工作种子储存于具有1-10％(体积/体积)NBS或FBS及5-15％(体积/体积)甘油的DMEM/F12(主种子及工作种子储存培养基)中。
将最终的收获产物储存于蔗糖凝胶稳定剂(SGS)(最终产物储存培养基)中。
繁殖(Propagation)
使用上述细胞生长及保存培养基，使细胞内罗森氏菌的主种子及工作种子的培养物系在EU McCoy MCS中繁殖并保存在小于或约-35℃。
组织来源
细胞内罗森氏菌的种子及生产生物体在McCoy主细胞群(ATCC登记号CRL 1696，批号F-10422)中生长。该主细胞群系在X代被鉴定为3894MMCSS传代X。该主细胞群系额外传代6次且经鉴定为EU McCoy MCS X+0。将EUMcCoy MCS的X+0代储存于-70℃±5℃或更低的温度。通过第40次传代在EU McCoy MCS细胞株传代培养物中制备生产疫苗。
培养物容器
使EU McCoy MCS在具有25-150cm2表面积的组织培养物烧瓶、Costar细胞立方体、具有850cm2至22250cm2的滚筒瓶、多达40L容量的旋转烧瓶及具有3L至500L容量的生物反应器中繁殖。
细胞内罗森氏菌的种子培养物在250-40000毫升旋转烧瓶、850cm2至2250cm2滚筒瓶、具有25-150cm2表面积的组织培养烧瓶或具有3L至500L容量的生物反应器中生长。
细胞内罗森氏菌的生产培养物在6L至40L的旋转烧瓶或具有3L至500L容量的生物反应器中生长。
用于播种或接种的悬浮液的制备方法
播种培养物
在室温(25℃±3℃)或37℃±2℃使冷冻或新鲜细胞内罗森氏菌的主或膨胀工作种子解冻。使先前以细胞密度为50,000至500,000个细胞/毫升的McCoy细胞播种的生物反应器、旋转烧瓶或瓶子感染浓度为1至10％(体积/体积)或MOI为0.08至1.0的细胞内罗森氏菌。在降低的氧浓度下通过覆盖(overlay)由86％N2、4％H2和10％CO2组成的气体混合物来保温受感染的培养物。在37℃±2℃、pH6.7至7.3将该培养物保温3至10日，且连续搅动(10至100rpm)来维持细胞充分混合以保持悬浮状态。
生产培养物
在室温(25℃±3℃)或37℃±2℃使冷冻或新鲜细胞内罗森氏菌的主种子或膨胀的工作种子解冻。使先前以细胞密度为50,000至500,000个细胞/毫升的McCoy细胞播种(0至7日)的生物反应器或旋转烧瓶(容量为3L至500L)感染浓度为1至10％(体积/体积)或MOI为0.08至1.0的细胞内罗森氏菌。在降低的氧浓度下通过覆盖或喷布(sparge)由96％N2、4％H2组成的气体混合物来保温受感染的培养物。在37℃±2℃、pH6.7至7.3将该培养物保温3至8日，且连续搅动(10至100rpm)来维持细胞充分混合以保持悬浮状态。
播种及生产培养物的接种技术
种子培养物
将多达10％(体积/体积)的主种子或工作种子接种(MOI＝0.08至1.0)在0-7日接种到播种了McCoy细胞的生物反应器、旋转烧瓶或瓶子中的生长培养基中。
生产培养物
在0-7日，将多达10％(体积/体积)的生产种子接种(MOI＝0.08至1.0)于播种了McCoy细胞的适当容积的生长培养基中，所述培养基位于3L至500L容量的器皿中，并具有适当的McCoy细胞密度。
微生物的保温
在37℃±2℃在降低的氧气氛下将所述培养物保温3至10日，同时搅拌以保持悬浮。可加入额外的培养基及/或McCoy细胞以继续该生长过程。
在保温期间肉眼观察培养物异常生长或污染迹象的证据。
收获：
培养物的加工及制备
由间接荧光抗体(IFA)染色来检查培养物的细菌适当生长的迹象。准备收获的培养物例证了60至100％的细胞感染率。通过观察至少3个视野来测定感染百分数，各视野含有足以填满至少80％区域的McCoy细胞。考虑到感染，大约50％的细胞填满了细菌。
在37℃±2℃保温6日后，通过在使用特异性单克隆抗体(抗细胞内罗森氏菌的单克隆抗体VPM 53 Lot 31599或其等价物；抗小鼠IgG-荧光素偶联物(FITC)(ICN No.55499))来固定及染色的McCoy细胞上进行样品滴定来测试收获培养物的效力。
肉眼检查培养物的任何明显污染迹象。收获发生于接种后3至10日。
收获技术及说明书
将生产培养物的生物反应器、旋转烧瓶及瓶中的细胞及流体内容物部分或完全地收集于无菌接受器皿中。单独收获各生物反应器、旋转烧瓶及瓶中的生产培养物或通过添加SGS使若干器皿中的内容物汇聚且将其储存于1℃至7℃或更低的温度。对所收获的生产培养物抽样，以通过TCID50来确定其效力且通过IFA染色对其进行鉴定。
由IFA染色使生产培养物显示了至少4.9 TCID50/毫升且在显微观察时未发现任何污染证据。
疫苗产物的制备：
浓缩方法
可由多种方法来浓缩疫苗产物，例如通过让培养物与随后倾析的上清液一起停留、通过膜过滤(0.22μm或更小)、灌注或通过离心过滤来浓缩疫苗产物。
蔗糖凝胶稳定剂(SGS)
使凝胶与去离子水或注射用水以大约25％的SGS批量最终总容积混合且使其在高压釜中在121℃水解120分钟，由此来制备经水解的凝胶溶液。
随后使经水解的凝胶溶液(40.0g/L)与去离子水或注射用水以大约75％的SGS批量最终总容积混合。加入氢氧化钾(AR)(0.548g/L)、L-谷氨酸(1.440g/L)、磷酸二钾(AR)(2.508g/L)、磷酸二氢钾(AR)(1.030g/L)及蔗糖(AR)(150.00g/L)且充分混合该溶液。随后以盐酸或氢氧化钠溶液将该稳定剂的pH值调节至6.8至7.0。加入去离子水或注射用水至100％的所要SGS最终容积。充分混合所有稳定剂，且通过使其滤过0.1微米过滤器来对整个溶液进行消毒。
制备一个系列的单元总成的实例如表1所示：
表1
  细胞内罗森氏菌   200,000-300,000毫升
  蔗糖凝胶稳定剂(SGS)   100,000毫升(25％体积/体积)
  DMEM/F12(可将其加入以使产物标准化)   0-150,000毫升
  总容积   400,000毫升
平均系列容积为50L至500L。
冻干法
根据表2中所概括的程序以10剂量循环(填入6.0毫升)或根据表3中所概括的程序以50/100剂量循环(填入10.0毫升)来冻干该疫苗产物。
表2
步骤 ℃ 速率(分钟)  保持时间(分钟) 压力(mT)
  预冷却*   5℃   Na  Na   大气压
  冷冻   -47℃+3℃   尽可能快  150   大气压
1℃干燥，1st   -15℃±2℃ 120 120 100-150
  1℃干燥，2nd   0℃±2℃   120  180   100-150
  2℃干燥，1st   32℃±2℃   240  180   60-80
  2℃干燥，2nd   26℃±2℃   240  尽可能快   60-80
总时间：1352分钟(22.5小时)
*在冻干剂的装载期间，使架子(shelves)预冷却至5±2℃。
表3
步骤 ℃   速率(分钟)   保持时间(分钟)   压力(mT)
  预冷却*   5℃   N/A   N/A   大气压
冷冻   -48℃±3℃ 60 90 大气压
1℃干燥   -15℃±2℃ 60 1500 100-150
2℃干燥   26℃±2℃ 60 600 60-80
总时间：2370分钟(39.5小时)
*在冻干剂的装载期间，将架子预冷却至5±2℃。
实施例2
细胞内罗森氏菌疫苗的安全性(safety)
目的：
此项研究的目标为两方面。此项研究的第一目标为观察及比较由三种不同细胞内罗森氏菌的低传代分离株(两种源自美国及一种源自欧洲)在61/2周龄的猪中所造成疾病的发病率。第二目标为在61/2周龄的猪中观察两种细胞内罗森氏菌的高传代分离株(均为欧洲来源)的安全性。
材料及方法：
测试物质
1.US细胞内罗森氏菌低传代分离株N343
2.US细胞内罗森氏菌低传代分离株N101494
3.EU细胞内罗森氏菌低传代分离株DK 15540 p20
4.EU系细胞内罗森氏菌高传代分离株DK 15540 p60
5.EU系细胞内罗森氏菌高传代分离株DK 15540 p80(主种子命名为B3903)。
测试物质的配制
将低传代分离株在McCoy细胞悬浮液中分离后连续生长10-20周。将高传代分离株在McCoy细胞悬浮液中分离后连续生长60-80周。以10,000RPM离心15分钟收获所有培养物。将含有罗森氏菌的McCoy细胞培养物离心沉淀物再悬浮于含有10％FBS的蔗糖-磷酸盐-谷氨酰胺(SPG)溶液中。
测试物质的储存
将所收取的培养物储存在-70℃，直至进行攻击那天。将不同收取日但相同分离株的攻击培养物解冻，且将其并入塑料疫苗瓶中，标记，且储存于4℃或冰上，直至攻击时。
测试物质的测定
在攻击时(第0日)，对所有汇聚的攻击分离株进行TCID50。
平均效价(n＝3)(TCID50/毫升)如表4：
表4
  测试物质   平均效价(TCTD50/毫升)
  细胞内罗森氏菌N343   6.4
  细胞内罗森氏菌N101494   6.1
  细胞内罗森氏菌DK 15540 p20   6.2
  细胞内罗森氏菌DK 15540 p60   6.87
  细胞内罗森氏菌DK 15540 p80   7.4
研究设计
该研究系由5个试验组及一个对照组组成。在研究的第0日，组1(10只猪，61/2周龄)接受了一剂10毫升或等量胃内(IG)剂量的美国细胞内罗森氏菌低传代分离株N343。组2(10只猪，61/2周龄)接受了一剂10毫升或等量IG剂量的美国细胞内罗森氏菌低传代分离株N101494。组3(10只猪，61/2周龄)接受了一剂10毫升或等量IG剂量的欧洲细胞内罗森氏菌低传代分离株DK15540p20。组4(10只猪，61/2周龄)接受了一剂10毫升或等量IG剂量的欧洲细胞内罗森氏菌高传代分离株DK15540 60周。组5(20只猪，6周龄)接受了一剂10毫升或等量剂量的欧洲细胞内罗森氏菌高传代分离株DK15540 p80。设计作为″严格对照组″的组6(10只猪，61/2周龄)则不接受处理。
从研究开始至测试动物的适当攻击日，每日进行健康观察。从攻击日(第0日)至研究结束日(第21天)，每日以1至4的等级纪录评分临床健康状态(行为、食欲、身体症状、被毛及排泄物稠度)。从攻击日(第0日)至研究结束日(第21天)，计算平均每日重量增加(ADWG)。在第0、7、14及21日评估细胞内罗森氏菌的排泄物脱落。在研究中检查一只死去动物(来自组1)的大体及微观病变。如组织学及PCR分析所证实，判定死亡系由与PPE相关的病变造成；该动物未被放回原处。由PCR及回肠及结肠处的细胞内罗森氏菌的组织学评估来评估排泄物中罗森氏菌含量的定性分析。在此研究的第0、7、14及21日收集血清。
结果：
研究结果的概述
表5
 组  处理  猪编号  效价(TCID50/毫升)  血清学  排泄物脱落  PCR  FA  组织学   大体病变   ADWG   临床评分
 1  N343  9  7.4  19％  11％  0％  11％  44％   1   0.61   5.23
 2  N101494  10  7.1  10％  10％  10％  30％  30％   1.2   0.8   5.15
 3  DK15540p20  10  7.2  18％  13％  30％  10％  20％   1.2   0.86   5.01
 4  DK15540p60  10  7.87  5％  0％  0％  0％  10％   1   0.9   5
 5  DK15540p80  20  8.4  0％  0％  0％  0％  0％   1   1.05   5
 6  严格对照组  10  0  0％  0％  0％  0％  0％   1.05   0.91   5
一般观察
每日健康观察直至攻击。研究期间的攻击后，每日评估动物的临床症状。观察包括：行为、食欲、身体症状、被毛及排泄物稠度。所述动物的临床症状系基于数值点系统来进行评估，该系统反映了疾病的严重程度。各参数的评分在1至4范围内。将具有正常、健康外表的动物评为1分，将表达严重临床迹象的动物评为3分，且将已死亡动物评4分。严格对照组、DK15540 p60及DK15540 p80的平均每日评分为5.0。低传代材料的平均每日评分为N343(5.23)、N101494(5.15)及DK15540 p20(5.01)。使用Kruskal-WallisRank Sum Test对所述结果所进行的统计分析表明处理组与对照组之间没有差异。
每日平均重量增加(ADWG)
由攻击时(第0日)至研究结束的时(第21日)计算平均每日重量增加。严格对照组的平均每日重量增加为0.9磅。低传代处理组的平均重量增加仅为0.6(N343)、0.8(N101494)及0.86(DK15540 p20)磅/日。高传代处理组揭示了与严格对照组相比相同或增加的每日平均重量增加，其分别未接受以0.9磅/日(DK15540 p60)及1.05磅/日(DK15540 p80)所进行的攻击。在研究的第21日时，N343处理组中的平均每日重量增加的平均差异与较高传代处理组(DK15540 p60和p80)及严格对照组相比显著较低。(Pearson Chi-squarep＜0.05)。
血清转换(Seroconversion)
使用IFAT分析法来测试抗罗森氏菌抗体的存在，由此来量测在猪中对于罗森氏菌暴露的血清转换。在第0日，仅在N343处理组的2/10只猪观察到了可检测的血清转换。在第7日观察到2/9只猪(N343)及1/10只猪(DK15540p20)对于罗森氏菌抗体呈IFA阳性。在第14日，N343处理组的2/9只猪、DK15540 p20及p60的1/10只猪分别呈IFA阳性。在第21日揭示了1/10只猪(N343)、4/10只猪(N101494)及6/10只猪(DK15540 p20)呈IFA阳性，而高传代处理组(DK15540 p60及p80)显示了不可检测的血清转换。在研究的第21日，在接受了美国及欧洲低传代细胞内罗森氏菌分离株的处理组中对于罗森氏菌暴露的血清转换有所增加。
排泄物脱落
排泄物的PCR检测证明在第14日开始细胞内罗森氏菌的脱落，其中在N343中的4/9、在N101494中的4/10及在DK15540 p20中的5/10只低传代动物在测试时呈阳性。在第14日，高传代处理组及严格对照组呈PCR阴性。在第21日，DK15540 p20处理组有一只动物呈PCR阳性，而所有其它处理组及对照组均呈PCR阴性。在研究期间使用PCR在高传代分离株组(DK15540 p60及p80)中没有观察到脱落物的证据。PCR阳性动物显示了在研究的第14日在其排泄物中的罗森氏菌的活性脱落物与低传代分离株组及严格对照组相比更明显(Pearson Chi-square p＜0.05)。
第21日的PCR：回肠及结肠
在尸检的后(第21日)进行来自回肠及结肠的黏膜刮擦物的PCR检测。对于细胞内罗森氏菌建群(colonization)呈PCR阳性的样品在N101494(2/10结肠)及DK 15540 p20低传代分离株组中(2/10回肠，及4/10结肠)。在该研究的第21日，所有其它处理及对照组在组织中均呈PCR阴性。结果显示与所有处理及对照组相比，在DK15540 p20中的猪回肠及结肠中，罗森氏菌更明显建群(*Pearson Chi-square p＜0.05)。
组织学
在尸检后(第21日)收集末端回肠及结肠切片，且将其置于用于组织学分析的缓冲的福尔马林中。在以苏木精与曙红(H&E)及Warthin-Starry银试剂染色的4/9只猪(N343)、3/10只猪(N101494)、2/10只猪(DK15540 p60)及1/20只猪(DK15540 p80)组织中观察到细胞内细菌及腺管增生的存在。通过使用对抗在1/9只猪(N343)、3/10只猪(N101494)及1/10只猪(DK15540 p60)中的罗森氏菌的单克隆抗体进行荧光抗体染色来确认病变的发展。FA未检测到由所有处理及对照组的结肠中的罗森氏菌所造成的病变。FA结果显示，N101494处理组与所有处理及对照组相比在猪回肠中的明显病变发展。H&E/银染色显示了与所有处理及对照组相比在N343处理组中与PPE相关的明显病变发展。(Pearson Chi-square p＜0.05)。
总分数
在尸检时(第21日)对回肠与结肠的与PPE相关的病变进行评分。将具有正常外表(无病变发展)的组织评为1分，将病变证实为轻微增厚的组织评为2分，将病变证实为中度增厚的组织评为3分且将病变证实为严重增厚的组织评为4分。严格对照组所具有的平均临床评分为1.05、N343(1.0)、N101494(1.2)、DK15540 p20(1.2)及DK15540 p60及p80(1.0)。使用用于多重对照的ANOVA测试所得的平均总病变分数在对照及处理组之间显示为无统计学差异。
结论：
基于所收集的资料，此项研究证实了以超过1×107个细菌/剂量的TCID50用低传代剂量N343、N101494及DK15540所攻击的猪增加了PPE在所述动物中的发生率。以超过1×107的TCID50给予相同年龄猪的高传代分离株(DK15540 p60及p80)经证实具安全性且显示了建群及与PPE相关的病变发展的减少。此结论系基于在回肠黏膜上的PCR、组织病理学及组织切片的FA染色。
与低传代分离株相比，在高传代分离株中由PCR判定排泄物中细胞内罗森氏菌脱落物减少。与给出低传代分离株的组(尤其N343处理组中的动物)相比，给出高传代分离株的组及严格对照组证实了阳性一致每日重量增加，由此使所计算出的所有处理及对照组的平均每日重量增加支持了此结论。此观察显示了给出低传代材料的动物中的重量增加的减少，其支持了给出高传代材料的动物与接受无攻击材料的动物的充分及类似的生长效能。与严格对照组相比，高传代分离株基于临床评分对于重量增加及总健康未显示出负面影响。
实施例3
效率及最小保护效价
目的：
此项研究的目标是测定在3周龄猪中经口灌给予的包含分离株B3903(经冻干)(DK 15540，传代80次)(″B3903(经冻干)疫苗″及″B3903疫苗″在本文中可交换使用)的疫苗的最小保护效价及证实对抗用低传代细胞内罗森氏菌(猪的猪增生性肠病(PPE)的病原体)所攻击的毒性异源纯培养物攻击的效率。
材料及方法：
测试物质：细胞内罗森氏菌的减毒活培养物，分离株B3903。
B3903(经冻干)疫苗的配制
在McCoy细胞悬浮液中分离后使DK 15540分离株连续生长80周。通过以10,000RPM离心15分钟来收获所有培养物。使含有罗森氏菌的McCoy细胞培养物沉淀再悬浮于具有10％FBS的蔗糖-磷酸盐-谷氨酰胺(SPG)溶液中。如上文实施例1所述来进行干燥过程。使经冻干的产物在注射用水(足量的2.0毫升)中溶解。
B3903(经冻干)疫苗的储存
将该疫苗储存于2℃-8℃直至准备使用。再悬浮后，将该疫苗储存于冰上直至用药。
B3903(经冻干)疫苗的剂量
1.高剂量(处理组1)：在研究的第0日经由直接经口灌药1×2毫升(6.0logs/剂量)。
2.中等剂量(处理组2)：在研究的第0日经由直接经口灌药1×2毫升(4.9logs/剂量)。
3.低剂量(处理组3)：在研究的第0日经由直接经口灌药1×2毫升(3.8logs/剂量)。
测试物质：安慰剂
在研究的第0日将由悬浮于以5％NBS加强的DMEM/F12生长培养基中的未感染McCoy组织培养细胞组成的安慰剂给予处理组4(攻击对照组)及5(阴性对照组)。在处理组4中通过直接经口灌药将此物质施以小猪且给予各测试动物1×2毫升的安慰剂。
测试物质：细胞内罗森氏菌N101494毒性攻击
细胞内罗森氏菌N101494获自来自印度农场的12周龄猪的肠(美国专利第5,714,375号)。
细胞内罗森氏菌N101494毒性攻击的调配
在自经感染的肠组织的最初分离后，使细胞内罗森氏菌攻击材料在McCoy细胞悬浮液中连续生长仅仅30代。使被鉴定为SF 1422及SF 1423以及(1L)SF 1421的活性培养物(2×3L)在McCoy细胞悬浮液中生长7日直至15-30％的McCoy细胞感染。在攻击之日(第21日)，通过以10,000RPM离心15分钟收获活性培养物，并用SPG稳定剂将细胞沉淀物悬浮于350毫升总容积中。汇聚所收获的活性培养物与各个代(分离后传代24至27次)的低传代N101494的300毫升冷冻10X至20X浓缩攻击母液。
细胞内罗森氏菌N101494毒性攻击的储存
将准备用于攻击的最终调配物储存于2℃至8℃或冰上直至接种。
预/后接种及攻击效价
来自TCID50测定的结果证实了在接种及攻击期间用药于各测试动物每剂量的活的细胞内罗森氏菌的量。B3903疫苗及攻击材料(细胞内罗森氏菌N101494)的滴定前及滴定后的平均效价(n＝5)如下表6：
表6
  组   处理(logs/剂量)   平均logs/剂量(2毫升)预接种(TCID50/毫升)   平均logs/剂量(2毫升)后接种(TCID50/毫升)   总平均logs/剂量
  1   B3903疫苗高剂量   6.07   5.89   6.0
  2   B3903疫苗中等剂量   4.94   4.84   4.9
  3   B3903疫苗低剂量   3.9   3.5   3.8
  4   攻击对照组   7.85   7.57   7.71
研究设计
在此项研究中将65只3周龄的健康的细胞内罗森氏菌阴性断奶小猪随机分成5个处理组且对其分别进行圈养。在第0日，使处理组1(15只猪)通过直接经口灌注接受了2毫升剂量(6.0logs/剂量)的B3903疫苗。使处理组2(15只猪)通过直接经口灌注接受了以4.9logs/剂量滴定的1×2毫升剂量的B3903疫苗。使处理组3(15只猪)通过直接经口灌注接受了以3.8logs/剂量滴定的1×2毫升剂量的B3903疫苗。
使处理组4与5(每组10只猪)通过直接经口灌注接受了1×2毫升剂量的安慰剂。
在研究的第21日(接种后3周)，使处理组1-4中的测试猪由胃管饲法接受了1×10毫升剂量的毒性低传代纯培养物细胞内罗森氏菌异源分离株N101494。
在研究的第42日(攻击后3周)，对所有处理组(1-5)均施以安乐死且对其进行尸检以获得大体及微观病变来分析PPE。
自研究开始至攻击之日对各测试动物进行每日健康观察。自攻击之日(第21日)至研究结束(第42日)每日对临床健康状况(腹泻、行为及身体症状)评分。在接种之日(第0日)、攻击之日(第21日)及研究结束之日(第42日)记录重量以计算各处理组的平均每日重量增加。由聚合酶链式反应(PCR)通过在研究的第0、7、14、21、28、35及42日测试排泄物拭子来评估细胞内罗森氏菌的排泄物脱落。检查所有在研究结束(第42日)施以安乐死的动物的大体及微观病变。在研究的第42日，由PCR(t-PCR)连同回肠、结肠、扁桃体及肠系膜淋巴结中的细胞内罗森氏菌的组织学评估来对组织中细菌含量的定性分析进行评估。在研究的第0、7、14、21、28、35及42日收集血清。使用间接荧光抗体测试(IFAT)来测试血清以在测试动物中检测抗罗森氏菌的抗体。通过对接种后及攻击后的平均每日重量增加、临床评分、血清转换率(IFAT)、建群(t-PCR)、排泄物脱落(f-PCR)、大体病变及由免疫组织化学(IHC)所得的微观病变发展对数据进行分析来对处理组进行比较。
结果：
原始结果的概述
表7
  处理组   每组的猪   处理组ID(logs/剂量)   平均大体病变分数(回肠)   平均大体病变分数(结肠)   平均微观病变分数(回肠)   平均微观病变分数(结肠)
  1   15   B3903疫苗高剂量(6.0)   1.5ab   1.2a   0.2ab   0.1a
  2   15   B3903疫苗中等剂量(4.9)   1.2ab   1.0a   0.4ab   0.0a
  3   15   B3903疫苗低剂量(3.8)   2.5b   1.5b   1.0b   0.3a
  4   10   攻击对照组   3.6c   2.2b   2.4c   1.5b
  5   10   严格对照组   1.0a   1.0a   0.0a   0.0a
*同样的字母表示无显著差异(p＜0.05)
各处理组的最后测试结果揭示了：不考虑组1、2及3(p＜0.05)中的剂量(高、中及低)，未接种的攻击对照猪(组4)与疫苗接种猪相比在回肠及结肠中出现了显著的大体及微观病变发展(p＜0.05)。疫苗低剂量结肠的平均大体病变分数与攻击对照组相比无显著差异。该疫苗低剂量组(组3)是唯一接受疫苗的处理组，其在整个研究中与未接受接种、安慰剂或攻击的严格对照组相比，具有显著病变发展(大体及微观)。
临床分数
自攻击之日(第21日)至尸检时(第42日)每日记录各动物的临床分数。计算临床分数以获得平均每日临床分数，其反映了由于接受细胞内罗森氏菌的毒性攻击而在处理组中出现的疾病的严重程度及持续时间。表8中概述了各处理组的平均临床分数。
表8
  处理组   组鉴定   平均临床分数
  1   B3903疫苗-高剂量   3.1a
  2   B3903疫苗-中等剂量   3.0a
  3   B3903疫苗-低剂量   3.0a
  4   攻击对照组   3.0a
  5   严格对照组   3.0a
*相同字母表示自攻击之日至尸检时平均临床分数没有显著差异(p＜0.05)。
通过回顾与接受平均临床分数的处理组相关的资料使用单因子变异数分析(1-way ANOVA)来完成临床分数的统计分析。非接种的攻击对照组及严格对照组与高、中等或低剂量疫苗组相比，没有显著差异的证据。
平均每日重量增加
自疫苗用药时(第0日)起，至攻击用药(第21日)时，至研究结束(第42日)时计算平均每日重量增加(ADWG)。高剂量疫苗与未接种的攻击对照处理组之间的重量增加差异的统计分析(lbs.＝磅)揭示了自攻击用药时至尸检时显著差异的证据(p＜0.05)。表9概述了重量数据。
表9
  处理组  组鉴定   平均初始重量(lbs.)   ADWG(第0-21日)(lbs.)   ADWG(第21-42日)(lbs.)  总ADWG(lbs.)(接种时至尸检时)
  1  B3903疫苗高剂量   17.8a   0.94a   1.63a  1.29a
  2  B3903疫苗中等剂量   17.7a   1.00a   1.60ab  1.30a
  3  B3903疫苗低剂量   18.0a   0.94a   1.48ab  1.21a
  4  攻击对照组   17.7a   0.96a   1.45b  1.21a
  5  严格对照组   17.7a   0.94a   1.63ab  1.28a
*相同字母表示自接种疫苗之日至攻击时及自攻击之日至尸检时在处理组之间未出现ADWG的显著差异(p＜0.05)。
血清转换(IFAT)
每周自各处理组的所有测试动物中收集血清样品且在研究的第0、7、14、21、28、35及42日测试抗罗森氏菌IgG抗体的存在。阳性及阴性IFAT对照组样品在此项研究所进行的所有测定中均为100％准确。在第0日至第21日(接种疫苗后3周)，各处理组的所有测试动物均呈IFA阴性。在研究的第28日(攻击后1周)，疫苗高剂量处理组的1/15(6.7％)只测试动物呈IFA阳性而所有其它测试动物均呈IFA阴性。在研究的第35日(攻击后2周)，疫苗高剂量及中等剂量处理组的4/15(26.7％)只猪与未接种的攻击对照处理组的1/10(10％)只猪均对罗森氏菌抗体呈IFA阳性。在第35日，低剂量疫苗与严格对照处理组均呈IFA阴性。在研究的第42日(攻击后3周)，攻击对照组的8/10(80％)只猪、中等剂量疫苗组的6/15(40％)只猪、低剂量疫苗组的5/15(33.3％)只猪及高剂量疫苗组的3/15(20％)只猪均呈IFA阳性。在研究结束时(第42日)，严格对照处理组呈IFA阴性。
使用卡方(Chi-square)统计来分析血清转换资料。关于自严格对照处理组所得到的结果，由于研究过程中在各测试动物中所发现的100％阴性反应而不计算卡方统计。在接受疫苗或安慰剂的处理组中，使用卡方统计与精确p值(Monte-Carlo)的估计来比较IFAT结果。在研究的第42日(攻击后3周)，由接受了毒性纯培养攻击物的攻击组所得到的阳性IFAT的结果显著高于由接受了高剂量疫苗及低剂量疫苗的组所得到的结果(p＜0.05)。
细胞内罗森氏菌的排泄物脱落(PCR)
每周由各处理组的所有动物来收集排泄物拭子且在研究的第0、7、14、21、28、35及42日由PCR来测试细胞内罗森氏菌的存在。阳性及阴性DNA萃取及PCR反应对照组对于此项研究中所进行的各分析法均为100％准确。自第0日(接种疫苗)至第21日(攻击)，各处理组中所有测试动物的排泄物对于细胞内罗森氏菌均呈PCR阴性。在研究期间，严格对照组中的猪对于其排泄物中的细胞内罗森氏菌保持排泄物PCR阴性。在攻击接种后，细胞内罗森氏菌的排泄物脱落(排泄物PCR阳性)每周在各种处理组中均较明显。表10概述了所述结果。
表10
  处理组   组鉴定   第28日(攻击后1周)   第35日(攻击后2周)   第42日(攻击后3周)
  1   B3903疫苗高剂量   0/15(0％)a   2/15(13.3％)a   0/15(0％)a
  2   B3903疫苗中等剂量   6/15(40％)ab   5/15(33.3％)a   0/15(0％)a
  3   B3903疫苗低剂量   4/15(26.7％)ab   8/15(53.3％)ab   2/15(13.3％)ab
  4   攻击对照组   4/10(40％)b   7/10(70％)b   4/10(40％)b
  5   严格对照组   0/10(0％)   0/10(0％)   0/10(0％)
*相同字母表示接受了攻击的处理组无显著差异(p＜0.05)。
使用卡方统计与精确p值(Monte Carlo)的估计所进行的统计分析比较了各疫苗处理组与未接种的攻击对照组中的阳性反应。因为在研究过程中每只猪对于细胞内罗森氏菌均呈100％排泄物PCR阴性，所以自组比较中取出来自严格对照组的结果。在第28日(攻击后1周)，接受高剂量疫苗的猪与未接种的攻击猪(p＝0.017)相比具有显著较少的细胞内罗森氏菌脱落物。在第35日(攻击后2周)，接受高剂量(p＝0.0024)及中等剂量(p＝0.041)疫苗的猪与未接种的攻击猪相比，前两者排泄物中具有显著较少的细胞内罗森氏菌脱落物。在第42日(研究结束)，同样地，接受高剂量及中等剂量(p＝0.017)疫苗的猪与未接种的攻击猪相比，前两者的排泄物中具有显著较少的细胞内罗森氏菌脱落物。在攻击后的任一日，低剂量组中的猪与攻击对照组相比未出现PCR阳性的显著减少。
细胞内罗森氏菌组织建群(PCR)
在尸检后(研究第42日)进行末端回肠、结肠、扁桃体及肠系膜淋巴结的组织切片的聚合酶链式反应检测。在高剂量疫苗组中，1/15(6.7％)只猪对扁桃体中的细胞内罗森氏菌建群呈PCR阳性，而所有其它处理组均呈PCR阴性。肠系膜淋巴组织的回肠炎PCR检测揭示了在未接种的攻击对照组中3/10(30％)只猪对于细胞内罗森氏菌建群呈阳性，而所有其它处理组均呈PCR阴性。末端回肠的黏膜刮擦物的回肠炎PCR检测揭示了在攻击对照组中的4/10(40％)只猪、在低剂量疫苗组中的4/15(26.7％)只猪、在中等剂量疫苗组中的2/15(13.3％)只猪及在高剂量疫苗组中的1/15(6.7％)只猪对细胞内罗森氏菌建群呈PCR阳性。结肠的回肠炎PCR检测揭示了在攻击对照组中的3/10(30％)只猪、在低剂量疫苗组中的5/15(33.3％)只猪、在中等剂量疫苗组中的1/15(6.7％)只猪及在高剂量疫苗组中的2/15(13.3％)只猪对细胞内罗森氏菌建群呈PCR阳性。在严格对照组的组织中未发现细胞内罗森氏菌建群的证据。
使用卡方统计与精确p值的蒙地卡罗(Monte Carlo)近似值来比较处理组中回肠炎PCR阳性结果的统计分析。肠系膜淋巴结PCR结果表明了在未接种的攻击对照组与接受疫苗处理的所有处理组中存在显著差异的证据(p＝0.054)。在研究的第42日，在处理组的回肠、结肠或扁桃体的细胞内罗森氏菌建群中未出现统计显著性的证据。
组织学(IHC/H&E)
为了组织学分析而在尸检后(第42日)收集扁桃体、肠系膜淋巴结、末端回肠及结肠的2至4cm长的切片且将其置于10％缓冲福尔马林中。在尸检时，所有处理组的扁桃体切片的IHC染色未检测出细胞内罗森氏菌。在尸检时，通过所有组织样品的IHC发现，严格对照组对细胞内罗森氏菌呈阴性。在未接种的攻击对照组中的9/10(90％)只猪、低剂量疫苗组中的6/15(40％)只猪、中等剂量疫苗组中的3/15(20％)只猪及高剂量疫苗组中的1/15(6.7％)只猪的回肠中分别发现细胞内罗森氏菌及与PPE相关的微观病变的存在。在攻击对照组的8/10(80％)只猪、低剂量疫苗组的3/15(20％)只猪及高剂量疫苗组的1/15(6.7％)只猪的结肠中均出现明显微观病变。接受中等剂量的疫苗组结肠中的细胞内罗森氏菌呈IHC阴性。肠系膜淋巴结的染色切片仅在攻击组中发现具有细胞内罗森氏菌的1/10(10％)只猪。在处理组中，回肠及结肠切片中的阳性IHC结果与由H&E操作法所证实的标记的隐窝增生的存在较好相关性。
使用单因子变异数分析及Kruskal-Wallis Rank Sum检测来对定量IHC数据进行统计分析，然后对每个疫苗剂量组，对攻击组及严格对照组与各疫苗剂量组进行了p值的具体对比(specific contrast)。在研究第42日，由于攻击对照组(与疫苗接种的猪相比，不考虑剂量)的回肠及结肠中的细胞内罗森氏菌(p＜0.001)，统计分析揭示了显著病变发展的证据。与严格对照处理组相比，在接受高或中等剂量疫苗的接种动物中回肠及结肠的平均IHC病变分数未出现明显的统计学显著性(p＞0.05)。与严格对照组相比，接受低剂量疫苗的猪由于回肠中的细胞内罗森氏菌而具有显著较高的平均微观病变分数(p＜0.05)。
大体分数
在尸检时(第42日)对各测试动物的回肠及结肠中与PPE相关的大体病变进行评分。来自严格对照组中的测试猪的组织正常，不含有病变，且接受了1.1(回肠)及1.0(结肠)的平均病变分数。在处理组中，在未接种的攻击对照组中，测试动物的组织接受了回肠(3.6)及结肠(2.0)的最高平均大体病变分数。低剂量疫苗组中的测试猪接受了2.5(回肠)及1.5(结肠)的平均大体病变分数。中等剂量组中的测试猪接受了1.5(回肠)及1.0(结肠)的平均大体病变分数。高剂量疫苗组中的组织接受了1.5(回肠)及1.2(结肠)的平均大体病变分数。
使用单因子变异数分析来完成处理组中平均大体病变分数的统计分析。平均大体病变分数表明了未接种的攻击对照组与中等及高剂量疫苗组之间分别出现显著差异的证据(p＜0.001)。与低剂量疫苗组相比，在攻击对照组的平均大体回肠分数中观察到显著差异的证据(p＜0.001)。分别与中等及高剂量组相比，结肠的平均大体病变分数在攻击对照组中显著较高(p＜0.05)。此外，与严格对照组相比，在低剂量疫苗组的回肠中观察到显著大体病变发展(p＜0.001)。与严格对照处理组相比，在中等与高剂量疫苗组中，没有平均大体病变分数(回肠与结肠)出现统计显著性的证据。
结论
此项研究证实：在经口给予2毫升剂量的B3903(经冻干)疫苗(每剂量含有最少的4.9logs活的细胞内罗森氏菌)时，完成保护3周龄猪免受PPE感染。在攻击前3周时接受了6.0logs/剂量的高剂量疫苗处理组中明显出现了类似(或稍好)的保护作用。与接受高或中等剂量的试验疫苗的测试动物相比，低剂量疫苗组(3.8logs/剂量)不表明足够的保护免受毒性纯培养物异源的攻击。在低剂量疫苗与非接种的攻击对照组中，回肠与结肠的微观病变的严重程度(p＜0.001)及回肠的平均大体病变分数(p＜0.01)的统计学差异是明显的。然而，与未接受疫苗或攻击的严格对照组相比，在此组的回肠(微观病变)及结肠(大体病变)中观察到显著的PPE病变。
总而言之，来自此项研究的资料证实：(1)单独经口将B3903(经冻干)疫苗给予3周龄猪的最小保护效价为4.9logs/剂量；(2)B3903(经冻干)疫苗对抗毒性低传代培养物纯细胞内罗森氏菌、异源分离株N101494有效；及(3)与未接种的猪相比，B3903(经冻干)疫苗有助于减少疫苗接种猪中的细胞内罗森氏菌的大体及微观病变、组织建群及排泄物脱落。

Claims (25)

1.细胞内罗森氏菌的无毒分离株，其中该无毒分离株为细胞内罗森氏菌保藏分离株ATCC No.PTA-4926。
2.用于免疫动物的疫苗，其包含医药有效量的权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株及可药用载体。
3.权利要求2的疫苗，其中该医药上有效量的细胞内罗森氏菌无毒分离株每剂量为103TCID50至106TCID50。
4.用于免疫动物的疫苗，其包含权利要求1的细胞内罗森氏菌无毒分离株及选自至少一种下列病原体的抗原物质：沙门氏菌属(Salmonella spp)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix spp)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp)、支原体属(Mycoplasma spp)、钩端螺旋体属(Leptospira spp)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp)、链球菌属(Streptococcus spp)、螺旋体属(Brachyspira spp)、环状病毒(circovirus)、猪生殖与呼吸症候群(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)病毒、猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)、传染性胃肠炎(transmissible gastro-enteritis，TGE)病毒、细小病毒(parvovirus)及大肠杆菌(Escherichia coli)；且包含可药用载体。
5.用于免疫动物的疫苗，其包含权利要求1的细胞内罗森氏菌无毒分离株及至少一种选自下列病原体的抗原物质：猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、丹毒丝菌属、传染性胃肠炎(TGE)病毒、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌属或螺旋体属；且包含可药用载体。
6.用于免疫动物的疫苗，其包含权利要求1的细胞内罗森氏菌无毒分离株及选自猪霍乱沙门氏菌和/或丹毒丝菌属的抗原物质；及可药用载体。
7.用于免疫动物的疫苗，其包含权利要求1的细胞内罗森氏菌无毒分离株及至少一种选自下列病原体的抗原物质：梭状芽孢杆菌属、马流感病毒(equine influenza virus，EIV)、马疱疹病毒(equine herpes virus，EHV)、α病毒及西尼罗河病毒(West Nile virus)；且包含可药用载体。
8.医药组合物，其用于刺激动物免疫系统以便对病原性细胞内罗森氏菌的免疫抗原产生反应，所述医药组合物含有权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株。
9.医药组合物，其用于免疫动物以对抗猪增生性肠病，所述医药组合物包括医药学上可接受量的权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株，其中该医药学上有效量的细胞内罗森氏菌无毒分离株为每剂量103TCID50至106TCID50。
10.制备疫苗的方法，其用于诱导动物对细胞内罗森氏菌的免疫反应，该方法包含步骤：(a)在小于10％的氧浓度下，将权利要求1的细胞内罗森氏菌分离株在悬浮状态的培养细胞中保温以培养所述细菌；及(b)将所述培养的细菌与可药用载体混合。
11.权利要求10的方法，其进一步包含杀死所述培养的细菌的步骤，以制备含有经灭活的细胞内罗森氏菌的疫苗。
12.培养权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株的方法，其包含：
(a)以包含权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株的接种物感染培养细胞，
(b)在小于10％的氧浓度下保温所述感染细胞同时通过搅拌所述细胞使所述感染的细胞保持悬浮状态足够长的时间，以增加所述细胞内罗森氏菌的产量，及
(c)收取至少一部分的所述细胞内罗森氏菌。
13.权利要求12的方法，其中该氧浓度为0％至8％。
14.权利要求13的方法，其中该氧浓度为0％至3％。
15.权利要求12的方法，其中该保温在6％至10％的二氧化碳下进行。
16.权利要求12的方法，其中所述培养的细胞选自由HEp-2、McCoy及IEC-18细胞所组成的组。
17.权利要求16的方法，其中所述IEC-18细胞在微载体上培养。
18.权利要求12的方法，其中所述感染的细胞根据步骤(c)保温2至10日的时间。
19.权利要求12的方法，其进一步包含冻干权利要求1的细胞内罗森氏菌无毒分离株的步骤(d)。
20.权利要求19的方法，其中该冻干步骤包含一级干燥步骤及二级干燥步骤。
21.冻干的权利要求1的细胞内罗森氏菌无毒分离株，其以权利要求19的方法制得。
22.权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株在免疫原组合物的制备中的用途，所述免疫原组合物用于刺激动物免疫系统以便对病原性细胞内罗森氏菌的免疫抗原产生反应。
23.权利要求1的细胞内罗森氏菌的无毒分离株在药物制备中的用途，所述药物用于免疫动物以对抗猪增生性肠病。
24.权利要求1的细胞内罗森氏菌分离株在检测抗细胞内罗森氏菌抗体的分析法中的用途，所述分析法包括：
(a)将样品与权利要求1的细胞内罗森氏菌分离株接触，以形成抗原-抗体复合物；及
(b)检测该复合物的形成，
其中该复合物的存在与抗细胞内罗森氏菌抗体成正相关。
25.权利要求24的用途，其中该分析法包含选自下组的分析法：放射性免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、荧光免疫分析法及免疫电泳分析法。
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