CN104470539A - 睡眠嗜组织菌的外膜蛋白及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及睡眠嗜组织菌的外膜蛋白(OMP)的免疫原性组合物，以及提取方法、呼吸道攻击模型、施用方法以及诊断测定法和试剂盒。

Description

睡眠嗜组织菌的外膜蛋白及其方法

技术领域

本发明涉及睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)的外膜蛋白(OMP)的免疫组合物，其用于抗与睡眠嗜组织菌相关的呼吸感染。

背景技术

牛呼吸道疾病症候群(BRDC)由多重微生物病原体组成，并且对养牛业造成巨大的经济损失。治疗成本包括预防性疫苗接种和在爆发后的用药，据估计每年接近$40亿(Griffin,D.1997.Economic Impact Associated withRespiratory Disease in Beef Cattle.Vet.Clin.North Am.Anim.Pract.13；第367-377页)。增加经济影响的是在诊断有BRDC的动物中观察到的性能中的相关损失；伴随对每日平均效益、在收获时的体重和牛肉质量等级的可测量损失(Babcock,A.H.2010.Epidemiology of Bovine Respiratory Diseaseand Mortality in Commercial Feedlots.Kansas State University(博士论文)。关于与性能降低相关的具体金钱损失的报告不同；可能是由于BRDC的不同病例定义，但估计在每只动物$40(Fulton,R.W.等人2002.Evaluation ofHealth Status of Calves and the Impact on Feedlot Performances:Assessment ofa Retained Ownership Program for Postweaning Calves.Can.J.Vet.Res.66,173-180)和几乎$300(Duff和Gaylean 2011.Recent Advances in Managementof Highly Stressed,Newly Received Feedlot Cattle.Journal of Animal Science.85；第823-840页))之间。性能损失也已显示随着动物需要治疗BRDC的次数而显著增加(Fulton等人2002)。

睡眠嗜组织菌(以前的睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus))已鉴定为对BRDC的关键贡献者(Duff和Gaylean 2011)。该革兰氏阴性多形球杆菌属于巴斯德菌科(Pasterellaceae)(Korczak等人2004.Phylogeny of the FamilyPasteurellaceae based on rpoB sequences.International Journal of Systemicand Evolutionary Microbiology.54；第1393-1399页)，构成牛、绵羊及其他反刍动物中的上呼吸道和泌尿生殖道的正常微生物丛的一部分(Ward等人2006.Haemophilus somnus(Histophilus somni)in Bighorn Sheep.CanadianJournal of Veterinary Research.70；第34-42页)。它与牛病原体包括多杀性巴斯德氏菌(Pasteruella multocida)和溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)(这两者也与BRDC相关)以及人病原体杜氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenazae)(Challacombe等人2007.Complete Genome Sequence of Haemophilus somnus(Histophilus somni)strain129Pt and Comparison to Haemophilus durcreyi 35000HP and Haemophilusinfluenzae Rd.Journal of Bacteriology 189(5)；第1890-1898页)相关。

估计将来自健康小牛的上呼吸道的睡眠嗜组织菌分离率置于高达50％，没有疾病的临床表现；然而，诊断有BRDC的动物对于该细菌具有甚至更高的分离率(Griffin,D.2010.Bovine Pasteurellosis and Other BacterialInfections of the Respiratory Tract.Veterinary Clinics of North American FoodAnimal Practice.26(1)；第57-71页)。在应激条件或免疫抑制状态下，睡眠嗜组织菌可以定居下呼吸道、心内膜或中枢神经系统，并且已鉴定为不同疾病例如肺炎、心内膜炎、关节炎、流产、败血病和血栓栓塞性脑膜脑炎(menegoencephalitis)(TEME)的病因作用者(Ward等人2006)。

在屠宰时，小于15％接受BRDC的正确治疗(预防免疫接种和在爆发期间的适当抗生素)的动物显示肺损害的体征，并且这些损害涉及整个肺的小于5％(Griffin,D.2010)。相反，50％未接受正确护理的动物在屠宰时展示肺损害，并且这些损害可以涉及整个肺的15％或更多(Griffin,D.2010)。在超过10,000只动物的一项现场研究中，459只小牛(4.6％)死于一种或另一种形式的该疾病。在该研究的死亡率中，279(60.8％)显示与呼吸疾病相关，并且在具有呼吸道感染的这些中，226(81.0％)与睡眠嗜组织菌相关肺炎、胸膜炎或脓肿相关(Ribble等人1988.Efficacy of Immunization of FeedlotCattle with a Commercial Haemophilus somnus bacterin.Canadian Journal ofVeterinary Research.52；第191-198页)。虽然抗生素治疗可以成功响应睡眠嗜组织菌感染，但抗生素抗性野外分离物的流行率增加值得关注(Duff和Gaylean 2011)。通过疫苗接种的预防性护理将是优选的，因为它是主动性而不是反应性的，并且更具成本效益。

许多睡眠嗜组织菌疫苗目前可得自多个动物保健公司；然而，这些疫苗主要由灭活的菌苗组成并且过去三十年前得到批准，目标是预防TEME。这些菌苗疫苗的使用已针对TEME有效，然而，已显示对饲养场牛群中的呼吸性疾病具有中性或甚至负面的作用。负面副作用包括当被牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)感染的小牛进行疫苗接种时，IgE诱导的过敏性休克和相互作用(Griffin,D.2010)。TEME流行率中的降低以及在美国睡眠嗜组织菌相关肺炎和在加拿大心肌炎的出现在二十世纪八十年代晚期开始，已导致需要进一步研究用于疫苗生产的有效抗原(O’Toole等人2009.DiagnosticExercise:Myocarditis due to Histophilus somni in Feedlot and BackgroundedCattle.Veterinary Pathology.46；第1015-1017页)。

睡眠嗜组织菌相关肺炎是对于牛肉和乳品工业的经济重要因素。在目前可用疫苗中的田间药效存在很少证据，因此进入下一代疫苗产品的研究的需要是有理由的。

发明内容

本发明提供了克服本领域中的缺陷的免疫原性组合物、疫苗和相关方法。该组合物和方法提供了用于治疗反刍动物中的呼吸状况的睡眠嗜组织菌的外膜蛋白(OMP)，所述反刍动物包括但不限于牛、绵羊和野牛。

本发明进一步包括包含睡眠嗜组织菌的OMP的本发明的免疫原性组合物和疫苗。包含如本文定义的至少一种或多种OMP睡眠嗜组织菌多肽的本发明的免疫原性组合物可以进一步包含生理学可接受的媒介物，例如药学或兽医学可接受的载体、佐剂或其组合。

随同提供的OMP睡眠嗜组织菌多肽中的任一种或者包含随同提供的这些OMP睡眠嗜组织菌多肽中的一种或多种的任何免疫原性组合物均可用作药剂，优选用作疫苗或免疫原性组合物，最优选用于针对睡眠嗜组织菌感染预防或治疗受试者。

OMP睡眠嗜组织菌多肽的两种代表性分离物包括Lg2-OK08和LgD1-TN08，其根据布达佩斯条约条款于2012年3月29日保藏于美国典型培养物中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209，并且分别命名为PTA-12755和PTA-12756。

本领域技术人员应当理解本文使用的组合物可以掺入已知的可注射的、生理学可接受的无菌溶液。对于制备用于肠胃外注射或输注的现成可用的溶液，水性等渗溶液例如盐水或血浆蛋白质溶液是可容易获得的。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可以包括兽医学可接受的载体、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。

本发明的方法包括但不限于在受试者中引发针对睡眠嗜组织菌感染的免疫应答的方法，其包括给受试者施用包含如本文定义的一种或多种OMP睡眠嗜组织菌多肽的免疫原性组合物的步骤。优选地，引发针对睡眠嗜组织菌的超过一种血清型或分离物的免疫应答。本发明的组合物可以用于治疗或可替代地预防睡眠嗜组织菌感染。优选地，此类免疫应答减少与由一种或多种睡眠嗜组织菌血清型感染相关的一种或多种临床体征的发病率或严重性。

此处，本发明的组合物可以施用于其的合适受试者和有需要的受试者包括需要用于病毒、微生物、寄生虫、原生动物、细菌或真菌相关感染、疾病或状况的预防或治疗的动物和人。优选的动物包括牛和绵羊。最优选地，免疫应答在牛中得到刺激。

本发明还提供了减少与睡眠嗜组织菌感染相关的一种或多种临床体征的发病率或严重性的方法，其包括施用本发明的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含如随同提供的一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和优选的载体分子，从而使得相对于仍未接受如随同提供的免疫原性组合物的受试者，睡眠嗜组织菌感染的临床体征的发病率或严重性减少至少10％、优选至少20％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少70％、最优选至少100％。此类临床体征包括用力或急促呼吸、咳嗽、厌食症、抑郁症或昏睡、鼻或眼分泌物和死亡率。根据进一步方面，本发明还涉及用于预防睡眠嗜组织菌感染的方法，其包括施用如随同提供的包含一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的本发明免疫原性组合物的步骤。

本发明还提供了制备随同提供的免疫原性组合物中的任一种的方法，所述方法包括使如随同提供的一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽与载体分子混合，优选从而使得一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和载体分子彼此共价偶联或缀合。此类缀合物可以是多价或单价的。多价组合物或疫苗包括多重OMP睡眠嗜组织菌肽与载体分子的免疫缀合。在进一步方面，本发明提供了产生一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的方法，所述方法包括用核酸分子转化宿主细胞，优选原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)，所述核酸分子编码如随同提供的睡眠嗜组织菌肽中的任一种。可替代地，宿主细胞可以是真核细胞例如动物细胞、原生生物细胞、植物细胞或真菌细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物细胞例如CHO、BHK或COS，或真菌细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或昆虫细胞例如Sf9。

本发明的另一个方面提供了产生一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的方法，所述方法包括诱导针对睡眠嗜组织菌的免疫应答。这包括培养经转化的病毒载体，所述表达载体编码并表达本文公开的一种或多种睡眠嗜组织菌肽。所表达的蛋白质或被表达生物体保留或被分泌到培养基内。表达在足以产生OMP睡眠嗜组织菌肽的条件下进行培养，所述OMP睡眠嗜组织菌肽能够诱导针对睡眠嗜组织菌的免疫应答。

制备本发明的组合物的方法可以进一步包括使一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和载体分子的缀合物与生理学可接受的媒介物混合，所述生理学可接受的媒介物例如药学或兽医学可接受的载体、佐剂或其组合。本领域技术人员应认识到媒介物、佐剂或组合的选择将尤其由递送途径、个人偏好和动物物种决定。

在另一个方面，本发明提供了诊断受试者中的睡眠嗜组织菌感染的方法。该方法包括提供一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽；使一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽与得自受试者的样品接触；和如果在样品中检测到能够结合一种或多种睡眠嗜组织菌肽的抗体，则将受试者鉴定为具有睡眠嗜组织菌感染。

在另一个方面，本发明提供了确定受试者先前已暴露于睡眠嗜组织菌感染并能够表达针对睡眠嗜组织菌的免疫应答的方法。该方法包括提供一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽；使一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽与得自受试者的样品接触；和如果在样品中检测到能够结合一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的抗体，则将受试者鉴定为具有睡眠嗜组织菌感染。

本发明还提供了包含下述的试剂盒：包含一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽，优选连同载体分子的免疫原性组合物；用于包装免疫原性组合物的容器；一套印刷说明书；和能够将免疫原性组合物施用于动物的分配器。任选地，一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和载体分子可以作为缀合物或分开的化合物进行包装。当分开供应时，还供应了使一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和载体分子缀合的工具以及适当的印刷说明书。

本发明还提供了用于给动物接种疫苗的试剂盒，其包含一套印刷说明书；能够将随同提供的免疫原性组合物施用于动物的分配器，所述免疫原性组合物包含一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽；并且其中OMP睡眠嗜组织菌肽中至少一种针对与睡眠嗜组织菌感染相关的至少一种疾病有效使动物免疫接种。优选地，一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽选自随同提供的那些。本发明的试剂盒可以进一步包含兽医学可接受的载体、佐剂或其组合。

本发明的试剂盒中的分配器能够将其内容物作为小滴分配；并且当鼻内、经口、真皮内或肌内施用于动物时，在试剂盒中包括的包含如随同提供的OMP睡眠嗜组织菌肽的免疫原性组合物，能够减少睡眠嗜组织菌感染的至少一种临床体征的严重性。优选地，与未经治疗的受感染的动物相比较时，临床体征的严重性减少至少10％、优选至少20％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少70％、最优选至少100％。

还公开了用于治疗或预防与睡眠嗜组织菌相关的感染的方法。该方法包括给受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物，其中所述治疗或预防选自减少睡眠嗜组织菌感染的体征，减少睡眠嗜组织菌感染的临床体征的严重性或发病率，减少来自睡眠嗜组织菌感染的受试者的死亡率及组合。

本发明的组合物进一步包含兽医学可接受的载体、佐剂或其组合。此类组合物可以用作疫苗并包含减毒疫苗、灭活疫苗或其组合。

本领域技术人员应当理解本文使用的组合物可以掺入已知的可注射的、生理学可接受的无菌溶液。对于制备用于肠胃外注射或输注的现成可用的溶液，水性等渗溶液例如盐水或血浆蛋白质溶液是可容易获得的。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可以包括药学或兽医学可接受的载体、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。

本发明的方法还可以包括将本发明的组合物与兽医学可接受的载体、佐剂或其组合混合。本领域技术人员应认识到载体、佐剂或组合的选择将尤其由递送途径、个人偏好和动物物种决定。

本发明还提供了减少动物中的睡眠嗜组织菌感染的严重性的方法，其包括给动物施用包含睡眠嗜组织菌的OMP的组合物。

还公开了用于治疗或预防与睡眠嗜组织菌相关的感染的方法。该方法包括给动物施用有效量的本发明的免疫原性组合物，其中所述治疗或预防选自减少睡眠嗜组织菌感染的体征，减少睡眠嗜组织菌感染的临床体征的严重性或发病率，减少来自睡眠嗜组织菌感染的动物的死亡率及其组合。

优选施用途径包括鼻内、经口、真皮内和肌内。最优选以单次剂量的在饮用水中的施用是优选的。技术人员将认识到本发明的组合物还可以以两个或更多个剂量，以及通过其他施用途径进行施用。例如，此类其他途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内(intraperitnoeally)、鞘内、气管内、皮内、心内、小叶内、髓内、肺内或阴道内。取决于治疗的所需持续时间和有效性，根据本发明的组合物可以施用一次或几次，以及间歇地施用，例如在每天基础上共几天、几周或几个月并且以不同剂量。

本发明还提供了用于给动物接种疫苗的试剂盒，所述试剂盒包含一套印刷说明书；能够将疫苗施用于动物的分配器；和来自睡眠嗜组织菌的OMP的至少一种分离物，其针对至少一种与睡眠嗜组织菌相关的疾病有效使动物免疫接种。本发明的试剂盒可以进一步包含兽医学可接受的载体、佐剂或其组合。

本发明的试剂盒中的分配器能够将其内容物作为小滴分配；并且当鼻内、经口、真皮内或肌内施用于动物时，在试剂盒中包括的分离物能够减少睡眠嗜组织菌感染的至少一种临床体征的严重性。在一些试剂盒中，分离物还能够减少睡眠嗜组织菌感染的至少一种临床体征的严重性。优选地，与未经治疗的、受感染的动物相比较时，临床体征的严重性减少至少10％。

本发明的其他目的、特征和优点根据下述详述将变得显而易见。然而，应当理解详述和具体例子在指示本发明的优选实施方案的同时，仅给出作为举例说明，因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修饰根据该详述对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

下述附图构成本说明书的一部分，并且包括以进一步证实本发明的某些方面。本发明可以通过参考与本文呈现的具体实施方案的详述组合的这些附图中的一个或多个得到更佳理解。本申请含有至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利申请公开的复印件将在提出请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1是举例说明通过处理组的平均直肠温度的图。基线直肠温度通过在一天前以及随后紧在第-1和0时的攻击前的观察获得。直肠温度在攻击后每天进行记录，并且继续直至在第7天时发生最终尸检。误差条代表α＝0.1的置信度。

图2是举例说明肺病理学总百分比的图。肺侵害百分比通过现场主治兽医的观察和每个叶的触诊来决定。总百分比使用通过Jericho和Langford(1982)描述的方法进行计算。误差条代表α＝0.1的置信度。非攻击的对照动物未展示病理学。所有受攻击的组产生足够的病理学，以将攻击视为成功，然而，分离物Lg2-OK08显示最高和最一致的毒力，以及比分离物5166明显更多的病理学(p＝0.08)。

图3是举例说明通过处理组的平均直肠温度的图。基线直肠温度通过在一天前以及随后紧在第-41和42天时的攻击前的观察获得。直肠温度在攻击后每天进行记录，并且继续直至在第49天时发生最终尸检。误差条代表α＝0.1的置信度。

图4是举例说明肺病理学总百分比的图。肺侵害百分比通过现场主治兽医的观察和每个叶的触诊来决定。总百分比使用通过Jericho和Langford(1982)描述的方法进行计算。误差条代表α＝0.1的置信度。当与非接种疫苗的对照相比较时，OMP疫苗显著减少肺病理学(p＝0.001)。

图5是举例说明通过处理组的平均直肠温度的图。基线直肠温度通过在一天前以及随后紧在第-41和42天时的攻击前的观察获得。直肠温度在攻击后每天进行记录，并且继续直至在第49天时发生最终尸检。误差条代表α＝0.1的置信度。

图6是举例说明总肺病理学的图。肺侵害百分比通过现场主治兽医的观察和每个叶的触诊来决定。总百分比使用通过Jericho和Langford(1982)描述的方法进行计算。误差条代表α＝0.1的置信度。当由分离物Lg2-OK08(p＝0.03)和LgD1-TN08(p＝0.05)制备时，当与非接种疫苗的对照相比较时，十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)提取的疫苗产生病理学中的显著减少。分离物LgD1-TN08的SDS提取产生肺病理学的减少，但这不是统计学显著的(p＝0.11)。当与对照组相比较时，156A2的Triton X提取未显示病理学中的差异。

图7是举例说明通过处理组的平均直肠温度的图。基线直肠温度通过在一天前以及随后紧在第-41和42天时的攻击前的观察获得。直肠温度在攻击后每天进行记录，并且继续直至在第49天时发生最终尸检。误差条指示α＝0.1的置信区间，代表当与在第44天时开始并继续通过攻击期的剩余时间的攻击对照组相比较时，SDS提取疫苗的平均直肠温度中的显著降低。

图8是举例说明肺病理学总百分比的图。肺侵害百分比通过现场主治兽医的观察和每个叶的触诊来决定。总百分比使用通过Jericho和Langford(1982)描述的方法进行计算。误差条代表α＝0.1的置信度。当与非接种疫苗的对照组相比较时，十二烷基肌氨酸钠不溶性疫苗原型是未显著减少肺病理学的唯一处理(p＝0.11)。含有十二烷基肌氨酸钠可溶性材料或由SDS提取的材料组成的疫苗提供了观察到的病理学中的显著减少。

图9是举例说明关于睡眠嗜组织菌IgG超过疫苗接种期的ELISA结果的图。S:N比通过将每块平板上的一式两份样品的平均A₄₅₀除以血清阴性对照的平均A₄₅₀进行计算，允许在测定法中的比较。数据代表在分开日完成的三个测定法中运行的一式两份样品(每个样品的6个重复)。误差条指示α＝0.1的置信度。

图10是举例说明关于睡眠嗜组织菌IgG超过疫苗接种期的ELISA结果的图。S:N比通过将每块平板上的一式两份样品的平均A₄₅₀除以血清阴性对照的平均A₄₅₀进行计算，允许在测定法中的比较。数据代表在分开日完成的三个测定法中运行的一式两份样品(每个样品的6个重复)。误差条指示α＝0.1的置信度。

图11是举例说明关于睡眠嗜组织菌IgG超过疫苗接种期的ELISA结果的图。S:N比通过将每块平板上的一式两份样品的平均A₄₅₀除以血清阴性对照的平均A₄₅₀进行计算，允许在测定法中的比较。对于该测定法，测试在每个研究日的每个个别动物的血清样品，允许测定在α＝0.1时的置信区间(由误差条表示)。关于研究4的S:N低于在研究2和3中观察到的那些。这可以归于在这些研究的测试之间所有试剂和对照样品的冷冻库存代。

具体实施方式

本发明提供了用作牛中的呼吸道感染治疗的睡眠嗜组织菌的OMP的免疫原性组合物，包括但不限于来自衍生自分离物Lg2-OK08和LgD1-TN08的睡眠嗜组织菌的两种代表性OMP制剂，所述分离物Lg2-OK08和LgD1-TN08根据布达佩斯条约条款于2012年3月29日保藏于美国典型培养物中心，10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209，并且分别命名为PTA-12755和PTA-12756。

作为革兰氏阴性菌，睡眠嗜组织菌呈递外膜，所述外膜是在该细菌和宿主的宿主系统之间的相互作用的第一个区域。革兰氏阴性菌的外膜由磷脂、脂多糖(LPS)和蛋白质组成。一些估计将外膜的外表面的组成定为41％LPS和59％蛋白质，而内表面预期含有53％磷脂和47％蛋白质(Nikaido和Nakae 1979.The Outer Membrane of Gram Negative Bacteria.Advances inMicrobial Physiology.20；第163-250页)。外膜的磷脂组分含有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油(phosphatidygylcerol)和心磷脂，产生如在其他细胞膜中可见的双层(Nikaido和Nakae 1979)。

大多数革兰氏阴性菌的外膜含有内毒素脂多糖(LPS)。LPS的外部部分在致病性和与宿主免疫系统的相互作用中起重要作用，同时显示即使在单次物种内的极端可变性，并且先前已被称为“O抗原”(Nikaido和Nakae1979)。O抗原通过被称为“R核心”的更保守的多糖与膜连接，所述“R核心”由8碳糖、3-脱氧辛酮糖酸、L-甘油-D-甘露庚糖、磷酸盐、磷酸乙醇胺和焦磷酸乙醇胺组成(Nikaido和Nakae 1979，同上)。连同O抗原和R核心，LPS通常含有脂质A。脂质A由D-葡糖胺基-(1→6)-D-葡糖胺主链组成，伴随由酰胺键或酯键结合的饱和脂肪酸。

睡眠嗜组织菌的外膜已显示缺乏某些高分子量组分，其将构成真正的LPS，因此它的内毒素被称为脂寡糖(LOS)(St.Michael等人2006.StructuralAnalysis of the Lipooligosaccharide-derived Oligosaccharide of Histophilussomni(Haemophilius somnus)strain 8025.Carbohydrate Research.341；第281-284页)。睡眠嗜组织菌的LOS如同其他革兰氏阴性菌的LPS，显示在暴露结构中的高水平的可变性，而膜结合的锚定区域是更保守的(St.Michael等人2006)。

最初的LOS纯化和生物化学测定法显示睡眠嗜组织菌的LOS由十二烷、十四烷和3-羟基十四烷脂肪酸，高比例的己糖，3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(Kdo)，磷酸盐，少量庚糖(L-甘油-D-甘露庚糖)，葡糖胺和脂质A组成(Inzana等人1988.Purification and Characterization of Lipooligosaccharidesfrom Four Strains of Haemophilus somnus.Infection and Immunity.56(11)；第2830-2837页)。进一步的研究已显示睡眠嗜组织菌能够相转变其LOS，起因于磷酸乙醇胺(PEtn)、磷酸胆碱(ChoP)和庚糖侧链的不同呈递(Inzana等人1992.Phenotypic Phase Variation in Haemolphilus somnusLipoologosaccharide During Bovine Pneumonia and After in vitro Passage.Infection and Immunity.60(7)；第2943-2951页；Cox等人1998.StructuralAnalysis of the Phase-Variable Lipooligosacchride from Haemolophilus somnusstrain 738.Eur.J.Biochem.253；第507-516页；Elswaifi 2006.The MolecularCharacterization of Phosphorylcholine(ChoP)on Histophilus somniLipooligosaccharide:Contribution of ChoP to Bacterial Virulence andPathogenesis.Virginia Polytechnic Institute and State University(博士论文)；Howard等人2000.Antigenic Diversity of Haemophilus somnusLipooligosaccharide:Phase-Variable Accessibility of the PhosphorylcholineEpitope.Journal of Clinical Microbiology.28(12)；第4412-4419页)。这连同N-乙酰神经氨酸(通常在哺乳动物细胞表面上发现)一起掺入外膜内，给予睡眠嗜组织菌宿主多种免疫系统逃避方式(Inzana等人2002.Incorporationof N-Acetyleneuraminic Acid into Haemophilus somnus Lipooligosaccharide(LOS):Enhancement of Resistance to Serum and Reduction of LOS AntibodyBinding.Infection and Immunity.70(9)；第4870-4879页)。

作为革兰氏阴性菌，外膜的组分成为有吸引力的免疫学靶。通过使用OMP作为疫苗候选物的基础，它可能能够诱导选择性靶向与毒力相关的表面抗原的免疫应答。由OMP疫苗生成的靶向免疫应答可以干扰睡眠嗜组织菌定居下呼吸道的能力，抑制继续定居所需的铁摄取，或限制多种免疫逃避和干扰模式的影响。

虽然已完成许多工作以扩增基于睡眠嗜组织菌的毒力机制的知识库，但仍不明确的是哪种OMP或OMP组合最终可以显示为免疫学重要的。小鼠模型工作已显示一些希望，然而，宿主动物疫苗功效研究在目前文献中缺乏。该论文的目标是建立OMP疫苗候选物针对呼吸道攻击的功效的概念证明，并与目前可用产品比较任何观察到的功效水平。

为了实现该目标，建立了能够在对照动物中产生一致的肺损害得分的攻击模型。适当的攻击模型应通过在≥50％的未经治疗的对照动物中产生肺损害(其中≥15％的总肺展示损害)，产生与野生型睡眠嗜组织菌感染一致的肺损害。含有多种表面暴露抗原的OMP疫苗候选物在体内进行测试，并且功效与其他疫苗替代物进行比较。这些替代物包括缺乏目前灭活的菌苗产品和某些生物膜形成特征的经修饰的活突变体。为了监控由于疫苗候选物的抗体(IgG)应答，开发了酶联免疫吸附测定法(ELISA)用于血清学测试，并且进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后为蛋白质印迹分析，以测定是否可以鉴定特异性免疫反应性蛋白用于进一步研究。

这些外膜变异机制通过睡眠嗜组织菌的复杂基因组得到促进。几种分离物已完全测序并已发现具有大小范围为2.0Mb至2.3Mb的基因组(Challacombe等人2007.)。通过比较无毒力分离物与其为强毒的分离物的已知基因组，可以实现对致病性的更好理解。睡眠嗜组织菌分离物129Pt从健康动物的泌尿道中分离，并且视为非致病性的。该基因组的分析提供了用于与致病性分离物比较的良好起点。129Pt基因组发现长度为2.0Mb，具有37％的总GC含量。该分离物还含有5.2kb pHS129质粒。在环状、单染色体基因组内，鉴定了1,844种基因编码序列，具有980bp的平均开放读码框。复制起点位于碱基1926721处(Challacombe等人2007)。与杜氏嗜血杆菌和流感嗜血杆菌相比较，这些基因中的许多是保守的，然而，观察到319种对于睡眠嗜组织菌是独特的。发现这些独特基因涉及LOS合成、碳水化合物摄取和代谢、阳离子转运、氨基酸代谢、泛醌和甲萘醌生物合成、细胞表面粘附、辅因子合成和电子传递(Challacombe等人2007)。这些独特基因及其随后表达的蛋白质尤其是可以与外膜区域连接的蛋白质将是涉及疫苗开发所关注的。

已发现致病性睡眠嗜组织菌分离物2336具有略微更大的基因组(2.3Mb)，并且与非致病性129Pt分离物相比较，编码几种另外的基因。已发现另外的基因编码毒力因子例如自转运粘附素、丝状血凝素同系物、局限性修饰(RM)系统、原噬菌体样序列和LOS合成蛋白质(Sandal和Inzana2010.A Genomic Window into the Virulence of Histophilus.Trends inMicrobiology.18(2)；第90-99页)。在两种分离物之间的病原上重要的差异的进一步分析将导致更直接的疫苗开发方法。

通过嗜血杆菌属物种的下呼吸道的成功感染和后续发病通过菌毛以及粘附(Jacques和Paradis 1998.Adhesin-Receptor Interactions inPasteruellaceae.FEMS Microbiol.Rev.22；第45-59页)和LOS(Johnson和Inzana 1986.Loss of Ciliary Activity in Organ Cultures of Rat Trachea Treatedwith Lipo-oligosaccharide from Haemophilus influenzae.J.Med.Microbiol.22；第265-268页.)的存在得到促进。作为非致病性分离物，发现129Pt编码12种更大的粘附素分子，但缺乏与通过致病性分离物例如2336的粘膜表面定居相关的许多菌毛和粘附素基因(Challacombe等人2007)。在致病性分离物中发现还可以负责分泌机制的菌毛基因。这些基因包括pilA、B、C和D(Sandal和Inzana 2010)。

强毒的睡眠嗜组织菌分离物例如2336的基因组还允许通过5’-CAAT-3’可变数串联重复(VNTR)的滑动链错配的LOS抗原相变异。该相变异在分离物129Pt中未观察到。这些VNTR位于起始密码子下游或糖基转移酶的开放读码框(ORF)内。这种翻译修饰在lob2ABCD基因中观察到，并且允许该细菌改变其LOS呈递以逃避宿主免疫应答。N-乙酰基-5-神经氨酸(Neu5Ac)在LOS中的存在还允许该细菌伪装自身免于免疫应答，因为Neu5Ac在宿主的自身细胞的表面上常见(Sandal和Inzana 2010)。

lic1ABCD操纵子已得到进一步研究，并且已显示连同glpQ基因一起控制在睡眠嗜组织菌的LOS上表达的磷酸胆碱(ChoP)的相变异。相似的滑动链错配沿lic1A基因中的串联重复5’-AACC-3’发生，并且导致多种延伸和截短，并且使ORF转变脱离与起始密码子的比对。该激酶的变异看起来不影响lic1BCD基因下游的操作，但的确提供表面呈递中的另一种变化，以逃避宿主防御。ChoP还显示为通过睡眠嗜组织菌的呼吸道定居的促成因子，然而，看起来干扰在全身感染期间的定居(Elswaifi 2006)。最后ChoP已显示通过与血小板活化因子受体(PAF-R)的相互作用使牛血小板聚集(Elswaifi 2006)。

关于睡眠嗜组织菌的致病性分离物将Neu5Ac掺入LOS内的能力的工作还阐明了另一种毒力机制(Inzana等人2002)。通过这样做，该细菌模拟包被牛内皮细胞的乳糖-N-新四糖，并允许另一种免疫系统逃避方法(Sandal和Inzana 2010)。ChoP的变异和Neu5Ac的掺入已显示干扰抗体结合，甚至干扰对于纯化的睡眠嗜组织菌LOS特异性的单克隆抗体，并且还抑制通过恢复期血清的杀死(Sandal和Inzana 2010)。

此外，睡眠嗜组织菌已显示在体外产生生物膜，并且怀疑在体内也产生生物膜，尽管由于通过典型实验室生长方法针对生物膜表型的快速人工选择和在使用非宿主模型中的不准确性，这难以检查(Sandal等2009)。许多细菌通过表多糖(EPS)和纤毛的组合形成生物膜，以粘附至细胞表面和彼此(Costerton 1999)。该细菌使用生物膜形成以维持细胞粘附并使其自身免于严苛的环境条件。膜自身可以由高达90％EPS组成，并且因此屏蔽该细菌免于免疫检测和应答(Costerton 1999)。通过扫描电子显微镜检查(SEM)和荧光原位杂交(FISH)，通过睡眠嗜组织菌形成的生物膜已显示为在体内比巴斯德菌科的其他成员更有组构和更广泛(Sandal等2009)。修改这种特征可以是修改活疫苗的有吸引力的方法。

用于新疫苗的策略还可以靶向存在于外膜中的蛋白质。这些OMP中的几种已得到表征并且一些已发现与宿主血清免疫反应(Sandal和Inzana2010)。OMP允许该细菌与其外部环境相互作用，并且虽然一些跨越几个物种是高度保守的，但许多是物种特异性的。OMP可以赋予以鞭毛或毛状(cilliary)结构形式的运动性，可以允许跨越膜的代谢产物或废物转移，可以促进宿主细胞粘附，或可以允许在免疫逃避中重要的其他结合特征(Challacombe等2007)。

OMP的分离已通过破坏来自纯培养物的细菌细胞来实现，通过用去污剂、有机溶剂、渗透冲击或反复冻融裂解，随后为低速离心以去除细胞碎片(Bollag等1996)。随后对含有OMP的上清液实施超速离心，去除所有不溶性组分。所得到的团块随后在具有2％(wt/vol)N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌氨酸钠)的10mM HEPES缓冲液中悬浮并温育，并且实施另一轮超速离心(Hobb等2009)。所得到的团块可以另外用十二烷基硫酸钠(SDS)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、Tris或磷酸盐缓冲液、硫氰化物离液盐或尿素进行溶解，并且随后通过对于目的蛋白质适当的方法进行纯化(Rehm 2006)。随后通过在蛋白质印迹中使用恢复期血清来检查免疫反应性(Kania等1990)。

以这种方式描述的首批潜在免疫学重要的蛋白质之一是78-kDa蛋白质，其显示在测试的大多数分离物中是保守的，所述分离物包括得自多种疾病状态的分离物以及非致病性分离物(Kania等1990)。随后从TEME相关的睡眠嗜组织菌分离物8025中分离40-kDa大小的另一种OMP，并且实施N末端测序。发现该蛋白质与在流感嗜血杆菌和大肠杆菌中发现的孔蛋白具有高同源性(Tagawa等1993a)。孔蛋白已显示促进溶质跨越膜的低分子量扩散。还鉴定了具有热可修饰的分子量的OMP，具有28-37kDa的分子量，取决于该蛋白质是在60℃还是在100℃下溶解。该蛋白质通过N末端测序显示为与其他革兰氏阴性菌包括大肠杆菌和伴放线菌放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)的OmpA蛋白质同源(Tagawa等1993b)。

进一步的研究注意比较睡眠嗜组织菌的53种分离物的占优势OMP，以测定致病性分类是否可以通过蛋白质谱实现。该研究显示在OMP分子量中的大变异，并且能够将测试的分离物分类成4个不同组和3个亚组。然而，这些分类不对应于与不同分离物相关的疾病状态。OMP的分子量变化是感兴趣的，因为在该研究中鉴定的占优势OMP显示与P2蛋白质的N末端同源性，所述P2蛋白质与流感嗜血杆菌致病性相关(Tagawa等2000)。

睡眠嗜组织菌从其宿主获得铁的能力也是成功感染的重要过程，并且在转铁蛋白结合OMP中的差异可以负责宿主特异性和毒力。巴斯德菌科的许多成员利用由两个OMP，转铁蛋白结合蛋白A和B组成的受体复合物，以从宿主获得转铁蛋白结合的铁(Ekins等2004)。负责Tbp的操纵子这样排列，使得TbpB在TbpA之前，并且通常受控于在可用铁的存在下，涉及三价铁摄取调节剂(Fur)蛋白质的阻遏机制。tbpA基因中的等位基因差异导致已与毒力和无毒力分离物联系的不同转铁蛋白结合机制(Ekins等2004)。tbpA2等位基因的存在导致如对于分离物129Pt注意到的单组分TbpA受体，而tbpA和tbpB基因的组合编码在致病性睡眠嗜组织菌分离物2336和649中鉴定的二分受体复合物(Tremblay等2006)。

仅存在于睡眠嗜组织菌的致病性分离物中的fhaB基因编码免疫球蛋白结合蛋白(IbpA)。分离物2336编码在四个不同基因座处的四种分开的fhaB同系物。IbpA蛋白质是与抑制通过宿主免疫系统的吞噬作用相关的大型胞外蛋白质(Sandal和Inzana 2010)。IbpA与IgG1、IgG2和IgM的Fc部分相互作用，并且已描述为具有270、120和41kDa大小的亚单位的350kDa蛋白质。41kDa亚单位是唯一显示与牛IgG1反应的蛋白质(Yarnall等1988)。

近期研究已阐明宿主细胞蛋白质通过细菌分泌物的翻译后修饰作为毒力和宿主免疫应答逃避机制的重要性。AMP化是对来自苏氨酸和酪氨酸残基的羟基蛋白质侧链共价添加腺苷一磷酸(AMP)的可逆过程(Woolery等2010)。促进该过程的腺苷酰转移酶含有通过cAMP(Fic)结构域(HPFx(D/E)GN(G/K)R)诱导的丝化现象，所述cAMP(Fic)结构域跨越所有物种是广泛保守的(Xiao等2010)。Fic结构域在真核细胞中天然可见，并且通常在细胞信号传导中起作用(Roy和Mukherjee 2009)。然而，来自原核生物的含Fic结构域蛋白质看起来抑制宿主细胞中的Rho依赖性GTP酶的作用(Worby等2009)。

强毒的睡眠嗜组织菌分离物的IbpA含有在C末端附近的两个连续的Fic结构域(Roy和Mukherje 2009)和在N末端处的粘附素结构域。看起来该蛋白质通过细菌分泌到宿主细胞内，导致宿主细胞GTP酶的AMP化和肌动蛋白细胞骨架的修饰(Woolery等2010)。腺苷酰化在与作为底物的RhoA、Rac1或Cdc42相关的开关1酪氨酸残基处发生(Xiao等2010)。该机制也由来自副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的VopS蛋白质可见，所述VopS蛋白质相反使苏氨酸残基AMP化。这些修饰导致干扰巨噬细胞进行吞噬作用、吞噬体运输、免疫效应物的转录激活、适应性应答的刺激和细胞凋亡的能力(Chimini和Chavrier 2000)。IbpA Fic结构域诱导的细胞毒性仅在致病性分离物例如2336中观察到，并且在非致病性分离物例如129Pt中不可见(Zeckarias等2011)。

已完成测试IbpA亚单位疫苗原型的工作，具有混合结果。在用重组亚单位给5-6周龄NIH Swiss Webster小鼠接种疫苗后，在大肠杆菌中使用pET41a和pET-GSTx产生重组IbpA亚单位A3、A5和DR2(第二个Fic结构域)成功预防睡眠嗜组织菌诱导的败血症(Geertsema等2008)。IbpA DR2亚单位也报告当在分隔三周的两个剂量中施用时，显示在5周龄荷斯坦(Holstein)小牛中针对用睡眠嗜组织菌的呼吸道攻击的保护(Geertsema等2011)。从该研究中外推数据至大群体的能力由于小处理组(各5-6只动物)而很弱。虽然当与对照组相比较时，DR2接种疫苗组的确展示在总肺病理学中统计学显著的降低(p＝0.04)，但这种降低可能不是有生物学意义的，因为对照动物仅展示11％肺病理学。来自测试DR2亚单位的更大型的BIVI研究的未公开数据不能证实这些结果。

疫苗接种策略

成功的疫苗接种在宿主内诱导免疫记忆，允许针对后续感染的加速的靶向应答。存在实现这点的几种策略，并且各自具有其独特的优点和缺点。用于针对细菌感染的免疫接种的目前技术包括使用灭活的菌苗、经修饰的活突变体和基于蛋白质的疫苗。

对细菌毒素的中和表位和嵌入革兰氏阴性细胞壁中的细胞表面蛋白质具有抗原特异性的记忆细胞的增殖是疫苗接种的主要目标。当后续感染更容易耐受并通过个别宿主成功清除时，兽群免疫得到改善。虽然致病性生物体仍可以在个别动物内引起较小问题，但当施用适当疫苗时，不太可能观察到广泛的经济损失。

确保疫苗包括在细胞表面上存在的所有可能的毒力相关抗原的最快方法是使用灭活的菌苗。然而，这些产物可以诱导过敏反应，取决于生产方法和个别动物的敏感性，并且在含有多重生物体的组合产品中，这些事件是更可能的(Roth,2007)。这些产品的利益通常超过这种风险，因为这些疫苗已证明可用于牛操作的疾病预防，并且通常是控制疾病爆发的最成本效益的方式(Babiuk,1994)。

强毒分离物的促进减毒或天然无毒力分离物的分离，导致更低的开发成本，而生产过程的简化降低开销，允许制造商将产品以更低的价格提供给消费者。然而，公司确保其产品的寿命是困难的，因为野生型突变或在野外的其他条件可以在一段时间内降低这些产品的有效性。

当疫苗中存在的抗原不对野生型活分离物赋予免疫时，效力问题出现。在睡眠嗜组织菌疫苗的情况下，已显示在体内产生的某些表面和培养上清液蛋白质在疫苗生产期间在体外未足够地表现(Griffin 2010)。这些蛋白质中的一些怀疑是有免疫学意义的，并且测定多种生长方法、蛋白质纯化策略或基因敲除突变型分离物是否可以改善疫苗功效的工作在进行中(Tagawa,1993；Sandal,2009；Zekarias,2010)。如果没有新的疫苗分离物，则可以通过使用多种佐剂平台作出改善。

在灭活的菌苗疫苗中，因为未引入活病原体，所以掺入佐剂以增加针对重要抗原的免疫应答。目前用于兽医学疫苗中的佐剂包括铝盐(明矾)、油乳剂、皂苷、免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体、微粒、非离子嵌段共聚物、衍生多糖、细胞因子和细菌衍生物(Spickler,2003)。每种佐剂具有决定其作用方式的其自身特性组，所述作用方式依次又可以影响引发的免疫应答类型。

特定佐剂(即，明矾)作用于通过形成更容易吞噬的聚集物来改善抗原呈递细胞的作用(Spickler,2003)。氢氧化铝用作几种商购可得的睡眠嗜组织菌疫苗的佐剂系统，包括Pfizer的Sommubac和BIVI的Elite-9HS。虽然佐剂佐剂是有专利权的，并且许多实际作用机制是未知的，但这类佐剂的一般理论将是主要组织相容性复合物，II型(MHC II)抗体介导的应答的诱导(Murphy,2008)。

油乳剂佐剂将帮助诱导MHC II应答，据报告是由于通过使抗原保留在注射部位原位的“沉积效应”，允许更多抗原呈递细胞在延长时间段内遇到重要抗原(Spickler,2003)。虽然不存在目前使用这类佐剂商业上用于针对睡眠嗜组织菌的疫苗接种的产品，但基于油的氢氧化铝凝胶(由Reheis Inc.商购可得)用于梭菌(Clostridial)疫苗中，所述梭菌疫苗可在组合产品中与睡眠嗜组织菌组合，并且弗氏佐剂照常规作为与之一起测试用于新疫苗候选物的概念证明的初始佐剂用于调查研究中(Babiuk,1994)。

因为睡眠嗜组织菌是细胞外细菌病原体，所以能够增强通过浆细胞的IgG产生的诱导、补体系统的活化和内毒素中和的佐剂将是有益的。为此，通常使用铝盐和水包油乳剂。然而，与更新的技术相比较，这些佐剂趋于很弱，但仍广泛使用，因为它们已被管理机构批准用于兽医学疫苗中，并且不造成全身毒性的威胁(Aguilar和Rodriguez 2007)。

使用无毒力的经修饰的活生物体的疫苗接种不需要使用佐剂，并且已显示更能够产生细胞介导的以及抗体驱动的免疫应答(Detmer和Glenting2006)。这些产品还趋于减少过敏反应的流行。然而，减毒分离物或靶向缺失突变型的开发可以是非常昂贵的，并且与另一种主要危险相关。这些活生物体表现正如其野生型配对物，并且维持其在动物内与其他分离物交换遗传信息的能力。由于这种遗传重组，无毒力的疫苗分离物可以掺入毒力因子并恢复毒力形式。这些生物体可以脱落并且正如任何其他分离物一样传播，如果它们保持无毒力，则这对于兽群免疫力是有益的，但如果发生逆转，则可以引起严重爆发(Detmer和Glenting 2006)。这类疫苗必须经历广泛安全研究以在管理批准前降低这些关注，然而，可能性仍存在。

无细胞的、基于蛋白质的疫苗去除在经修饰的活疫苗中可见的毒力逆转的关注，同时继续降低在菌苗产品中可见的过敏性反应的发病率。这类疫苗将预期以与灭活的菌苗更相同的方式工作，并且可以与相似佐剂组合以诱导MHCII和抗体介导的免疫。这些制剂导致更高浓度的经由疫苗接种递送的免疫学重要的蛋白质，并且因此可以产生更直接的免疫应答。开发成本可以很高，然而，使用适当的重组表达系统，生产成本可以保持很低。这类疫苗的关键是引入毒力相关蛋白质的重要表位，其诱导旨在降低野生型感染扎根(take hold)的能力的免疫应答(Babiuk 1994)。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域技术内的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中充分说明。参见例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第I、II和III卷，第二版(1989)；DNA Cloning,第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑1986)；Immobilized Cells andEnzymes(IRL press,1986)；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；系列Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Protein purification methods–a practical approach(E.L.V.Harris和S.Angal,编辑，IRL Press at Oxford University Press)；和Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986,Blackwell Scientific Publications)。

在详细描述本发明之前，应当理解本发明并不限于特定DNA、多肽序列或过程参数，因为这些当然可以改变。还应当理解本文使用的技术仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，并且不预期是限制性的。必须指出，如本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考。因此，例如，提及“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物，提及“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物等等。

A.定义

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与提交时本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。术语的含义和范围应是明确的；然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。此处，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。本文提及的所有专利和出版物均引入本文作为参考。

“免于疾病的保护”、“保护性免疫”和“功能免疫”和相似术语意指通过施用本发明的一种或多种处理组合物或其组合生成的针对疾病或状况的应答，其导致比在未免疫接种的受试者(其已暴露于疾病或感染)中将预期的更少的有害作用。即，感染的有害作用的严重性在接种疫苗的受试者中减弱。在接种疫苗的受试者中，感染可以减少、减慢或可能完全预防。此处，当意指感染的完全预防时，它是明确陈述的。如果未陈述完全预防，则该术语包括部分预防。

此处，“临床体征的发病率和/或严重性的减少”或“临床症状的减少”意指但不限于与野生型感染相比较，减少组中的受感染受试者数目，减少或消除显示出感染的临床体征的受试者数目，或者减少存在于一个或多个受试者中的任何临床体征的严重性。例如，它应指病原体载量的任何减少，病原体脱落，病原体传播的减少，或任何临床体征的减少。优选地，与未接受该组合物并变得被感染的受试者相比较，这些临床体征在接受本发明的处理组合物的一个或多个受试者中减少至少10％。更优选地，临床体征在接受本发明的组合物的受试者中减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、且甚至更优选至少50％。

术语“增加的保护”在本文中意指但不限于分别在接种疫苗的受试者组相对于非接种疫苗的对照受试者组中，与通过传染剂优选睡眠嗜组织菌的感染相关的一种或多种临床症状的统计学显著的减少。术语“临床症状的统计学显著的减少”意指但不限于在用传染剂攻击后，接种疫苗的受试者组中的至少一种临床症状的发病率频率比非接种疫苗的对照组低至少10％、优选20％、更优选至少30％、甚至更优选50％、且甚至更优选70％。

“长效保护”应指持续至少3周，但更优选至少3个月，再更优选至少6个月的“改善功效”。在家畜的情况下，最优选长效保护应持续直至动物在其下由于肉而销售的平均年龄时。

“免疫原性或免疫组合物”指包含睡眠嗜组织菌的至少一种OMP或其免疫原性部分的物质组合物，其在对组合物具有细胞或抗体介导的免疫应答的宿主中引发免疫学应答。在本发明的优选实施方案中，免疫原性组合物诱导免疫应答，并且更优选地，赋予针对睡眠嗜组织菌感染的临床体征中的一种或多种的保护性免疫。

如本文使用的“免疫原性”或“抗原”指如本文描述的引发免疫学应答的多肽或蛋白质。“免疫原性”睡眠嗜组织菌蛋白质或多肽包括本文鉴定的OMP睡眠嗜组织菌中的任一种或其类似物或免疫原性片段的全长序列。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”指OMP睡眠嗜组织菌的片段或截短的和/或取代的形式，其包括一种或多种表位并且因此引发本文描述的免疫学应答。一般而言，此类截短的和/或取代的形式或片段将包含来自全长OMP睡眠嗜组织菌蛋白质的至少六个邻接氨基酸。更优选地，截短的和/或取代的形式或片段将具有来自全长OMP睡眠嗜组织菌蛋白质的至少10个、更优选至少15个且再更优选至少19个邻接氨基酸。此类片段可以使用本领域众所周知的任何数目的表位作图技术进行鉴定。参见例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,编辑1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，线性表位可以通过下述进行测定：在固体载体上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且在肽仍附着至载体时，使肽与抗体反应。此类技术是已知的，并且在本领域中描述，参见例如美国专利号4,708,871；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；和Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，例如通过例如x射线晶体学和二维核磁共振，通过测定氨基酸的空间构象容易地鉴定构象表位。参见Epitope MappingProtocols，同上。合成抗原也包括在定义内，例如多表位、侧翼表位以及其他重组或合成衍生的抗原。参见例如，Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；和Gardner等人，(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,June 28-July 3,1998。(所述参考文献的教导和内容全部引入本文作为参考)。

“免疫应答”或“免疫学应答”意指但不限于针对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，免疫或免疫学应答包括但不限于下述效应中的一种或多种：特异性针对在目的组合物或疫苗中包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生或活化。优选地，宿主将展示治疗或保护性免疫学(记忆)应答，从而使得将增强对新感染的抗性和/或减少疾病的临床严重性。此类保护将通过下述得到证实：症状数目、症状严重性中的减少，或与病原体感染相关的症状中的一种或多种的缺乏，病毒血症发作的延迟，减少的病毒持续性，总体病毒载量的减少和/或病毒排泄的减少。

此处，“特异性免疫反应性”指这样的免疫反应性蛋白质或多肽，其识别睡眠嗜组织菌感染特征性抗原，但不与严格攻击对照特征性的抗原反应。

如本文使用的，“药学或兽医学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等等。在一些优选实施方案且尤其是包括冻干的免疫原性组合物的实施方案中，用于本发明中的稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。

在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文使用的，“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷例如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂。乳剂可以特别基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油例如角鲨烷或角鲨烯；起因于烯烃特别是异丁烯或癸烯寡聚的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇酯、二缩甘露醇酯(例如无水甘露醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯以及油酸酯、异硬脂酸酯，蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯(其任选是乙氧基化的)，和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter等人，The Theory and PracticalApplication of Adjuvants(编辑Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley and Sons,NY,第51-94页(1995)和Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂是在由M.Powell和M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit andAdjuvant Approach”,Plenum Press,1995的第147页上描述的SPT乳剂，和在同一本书的第183页上描述的乳剂MF59。

佐剂的进一步例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酐和链烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是尤其与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物通过术语卡波姆已知(Phameuropa第8卷,N0.2,June 1996)，本领域技术人员也可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与聚羟基化合物交联的此类丙烯酸聚合物，所述聚羟基化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，所述至少3个羟基的氢原子替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团。优选的原子团是含有2-4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基及其他烯属不饱和基团。不饱和原子团自身可以含有其他取代基例如甲基。以名称卡巴普；(BF Goodrich,Ohio,USA)出售的产品是尤其合适的。它们与烯丙基蔗糖交联或烯丙基季戊四醇交联。其中可以提及卡巴普974P、934P和971P。最优选的是卡巴普971P的使用。在马来酸酐与链烯基衍生物的共聚物中有共聚物EMA(Monsanto)，其为马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物溶于水导致酸性溶液，可以将所述酸性溶液中和，优选中和至生理pH，以便获得免疫原性、免疫学或疫苗组合物自身将掺入其内的佐剂溶液。

进一步的合适的佐剂包括但不限于尤其是RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组体或其他形式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽，或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物，或内源细胞因子释放的刺激剂。

预期佐剂可以以约100μg至约10mg/剂量的量，优选以约100μg至约10mg/剂量的量，更优选以约500μg至约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量的量，并且最优选以约1mg/剂量的量加入。可替代地，佐剂可以为按最终产品的体积计约0.01至50％的浓度，优选约2％至30％的浓度，更优选约5％至25％的浓度，再更优选约7％至22％的浓度，并且最优选10％至20％的浓度。

“稀释剂”可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可以尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。

“分离的”意指“通过人工”由其自然状态改变的，即如果它在自然界中出现，则它已改变或从其原始环境中取出或两者。例如，如该术语在本文中采用的，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。

“安全”意指在疫苗接种后在接种疫苗的动物中的不利后果的不存在，包括但不限于：基于细菌的疫苗对毒力的潜在逆转，临床上显著的副作用例如持续的、全身性疾病或在疫苗施用部位处的无法接受的炎症。

如本文使用的，术语“疫苗接种”或“睡眠嗜组织菌”或其变体意指但不限于包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，当施用于动物时，所述免疫原性组合物在动物中直接或间接引发或能够引发针对睡眠嗜组织菌的免疫应答。

在本发明的上下文中，“死亡率”指与通过睡眠嗜组织菌感染相关的死亡，并且包括其中感染如此严重，从而使得动物实施安乐死以预防痛苦并对其生命提供人道结局的情况。

“减毒”意指减少病原体的毒力。在本发明中，“减毒”与“无毒力的”同义。在本发明中，减毒细菌是其中毒力已减少，从而使得不引起睡眠嗜组织菌感染的临床症状，但在靶动物中能够诱导免疫应答的细菌，但还可以意指与被非减毒的睡眠嗜组织菌感染且未接受该减毒细菌的“对照组”动物相比较，在被减毒的睡眠嗜组织菌感染的动物中临床症状的发生率或严重性减少。在该上下文中，术语“减少/减少的”意指如上文定义的与对照组相比较，减少至少10％、优选25％、甚至更优选50％、再更优选60％、甚至更优选70％、再更优选80％、甚至更优选90％且最优选100％。因此，减毒的、无毒力的睡眠嗜组织菌分离物是适合于掺入包含经修饰的活睡眠嗜组织菌细菌的免疫原性组合物的分离物。

此处，“有效剂量”意指但不限于引发或能够引发免疫应答的抗原量，所述免疫应答获得抗原施用于其的动物中的临床症状减少。

如本文使用的，在组合物的背景下，术语“有效量”意指能够诱导免疫应答的免疫原性组合物量，所述免疫应答减少动物中感染的发病率或者减轻感染的严重性或疾病的发病率。特别地，有效量指菌落形成单位(CFU)/剂量。可替代地，在治疗的背景下，术语“有效量”指治疗的量足以减少或改善疾病或病症或其一种或多种症状的严重性或持续时间，预防疾病或病症的进展，引起疾病或病症的恢复，预防与疾病或病症相关的一种或多种症状的再现、发展、发作或进展，或者增强或改善另一种治疗或治疗剂的预防或治疗。

术语“片段”指睡眠嗜组织菌的OMP或编码此类OMP肽的基因的片段或截短的和/或取代的形式，其包括一种或多种表位并且因此引发针对睡眠嗜组织菌的免疫学应答。优选地，此类片段是随同提供的睡眠嗜组织菌肽的片段或截短的和/或取代的形式或者睡眠嗜组织菌基因中的任一种。一般而言，此类截短的和/或取代的形式或片段将包含来自全长序列的至少六个邻接氨基酸。更优选地，截短的和/或取代的形式或片段将具有来自全长序列的至少10个、更优选至少15个且再更优选至少19个邻接氨基酸。此类片段可以使用本领域众所周知的任何数目的表位作图技术进行鉴定。参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,编辑1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，线性表位可以通过下述进行测定：在固体载体上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且在肽仍附着至载体时，使肽与抗体反应。此类技术是已知的，并且在本领域中描述，参见例如美国专利号4,708,871；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；和Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，例如通过例如x射线晶体学和二维核磁共振，通过测定氨基酸的空间构象容易地鉴定构象表位。参见Epitope Mapping Protocols，同上。合成抗原也包括在定义内，例如多表位、侧翼表位以及其他重组或合成衍生的抗原。参见例如，Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；和Gardner等人，(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,June28-July 3,1998。(所述参考文献的教导和内容全部引入本文作为参考)。

如本文使用的术语“对睡眠嗜组织菌的免疫反应性”意指该肽或片段引发针对睡眠嗜组织菌的免疫学应答。

如本文使用的，“序列同源性”指测定两个序列的相关性的方法。为了测定序列同源性，将两个或更多个序列最佳比对，并且在需要时引入缺口。然而，与“序列同一性”形成对比，当测定序列同源性时，保守氨基酸置换计数为匹配。换言之，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中85％、优选90％、甚至更优选95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含由另一种氨基酸或核苷酸的保守置换，或在参考序列中高达15％、优选高达10％、甚至更优选高达5％的总氨基酸残基或核苷酸的氨基酸或核苷酸数目(不包括保守置换)，可以插入参考序列内。优选地，同源序列包含至少50、甚至更优选100、甚至更优选250、甚至更优选500个核苷酸的段。

“保守置换”指氨基酸残基或核苷酸由具有相似特征或特性(包括大小、疏水性等)的另一种氨基酸残基或核苷酸的置换，从而使得总体功能性不显著改变。

如本领域已知的，“序列同一性”指在两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列，即参考序列和待与参考序列相比较的给定序列之间的关系。序列同一性通过下述进行测定：如通过在此类序列的串之间的匹配测定的，在序列已最佳比对以产生最高程度的序列相似性后，比较给定序列与参考序列。在此类比对后，序列同一性在逐个位置的基础上进行确定，例如，如果在特定位置上核苷酸或氨基酸残基是相同的，则序列在该位置上是“相同的”。此类位置同一性的总数目随后除以参考序列中的总核苷酸或残基数目，以给出序列同一性％。序列同一性可以通过已知方法容易地进行计算，所述已知方法包括但不限于下述中所述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,编辑，Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，所述参考文献的教导引入本文作为参考。测定序列同一性的优选方法设计为给出在测试的序列之间的最大匹配。测定序列同一性的方法在可公开获得的计算机程序中汇编，所述计算机程序测定给定序列之间的序列同一性。此类程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,等人，Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可从NCBI及其他来源公开获得(BLASTManual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教导引入本文作为参考)。这些程序使用缺省缺口权最佳比对序列，以便在给定和参考序列之间产生最高水平的序列同一性。作为举例说明，与参考核苷酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，意指给定多核苷酸的核苷酸序列等同于参考序列，除了给定多核苷酸序列可以包括高达15个、优选高达10个、甚至更优选高达5个点突变/参考核苷酸序列的每100个核苷酸之外。换言之，在相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中高达15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可以是缺失的或由另一种核苷酸置换，或参考序列中高达15％、优选10％、甚至更优选5％的总核苷酸的许多核苷酸可以插入参考序列内。参考序列的这些突变可以在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置上或者在这些末端位置之间的任何地方发生，在参考序列的核苷酸中个别散开或在参考序列内的一个或多个邻接组中散开。类似地，与参考氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％序列同一性的给定氨基酸序列的多肽，意指多肽的给定氨基酸序列等同于参考序列，除了给定多肽序列可以包括高达15个、优选高达10个、甚至更优选高达5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的每100个氨基酸之外。换言之，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％同一性的给定多肽序列，参考序列中高达15％、优选10％、甚至更优选5％的氨基酸残基可以是缺失的或由另一种氨基酸置换，或参考序列中高达15％、优选10％、甚至更优选5％的总氨基酸残基数目的许多氨基酸可以插入参考序列内。参考序列的这些突变可以在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上或者在这些末端位置之间的任何地方发生，在参考序列的残基中个别散开或在参考序列内的一个或多个邻接组中散开。优选地，并非等同的残基位置通过保守氨基酸置换而不同。然而，当测定序列同一性时，保守置换不作为匹配包括。

载体分子

本发明的OMP睡眠嗜组织菌肽可以与之缀合或共价连接的载体分子优选是上文描述的那些。用于动物使用的优选载体是牛血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白。适合于人使用的蛋白质载体包括破伤风类毒素、白喉类毒素、非细胞型百日咳疫苗(LPF类毒素)、交叉反应材料(CRM's)，其在抗原上类似于细菌毒素，但借助于突变而是无毒的。例如，可以使用根据Pappenheimer,等人，Immunochemistry,9,891-906(1972)获得的CRM 197及其他细菌蛋白质载体，例如脑膜炎球菌外膜蛋白。优选地，载体蛋白质自身是免疫原。

本发明的OMP睡眠嗜组织菌肽可以通过本领域已知的任何方便方法与载体共价偶联。虽然对称接头例如肥酸二酰肼(如通过Schneerson等人，J.Experimental Medicine,152,361-376(1980)描述的)，或异双功能接头例如N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(如通过Fattom等人，Infection andImmunity,56,2292-2298(1988)描述的)的使用在本发明的范围内，但优选避免任何接头的使用，而是使本发明的睡眠嗜组织菌肽直接与载体分子偶联。此类偶联可以借助于还原胺化实现，如通过Landi等人J.Immunology,127,1011-1019(1981)描述的。

如通过平均分子量定义的，免疫原性组合物的大小是可变的，并且取决于所选的一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和使一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽与载体偶联的方法。因此，它可以是小至1,000道尔顿(10³)或大于10⁶道尔顿。使用还原胺化偶联方法，一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的分子量通常在5,000至500,000，例如300,000至500,000，或例如5,000至50,000道尔顿的范围内。

载体分子，即肽、其衍生物和类似物，以及特异性结合本发明的OMP睡眠嗜组织菌肽的肽模拟物可以通过本领域已知的多种方法产生，所述方法包括但不限于固相合成或通过溶液(Nakanishi等人，1993,Gene137:51-56；Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.15:2149-2154；Neurath,H.等人，编辑，The Proteins,第II卷，第三版，第105-237页,Academic Press,New York,N.Y.(1976)，其整体引入本文作为参考)。

本发明的OMP睡眠嗜组织菌肽或本发明的抗体或其结合部分可通过在具有药学或兽医学载体的稀释剂中溶解或悬浮而以可注射剂量施用。

此类分子的毒性和治疗效果可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学操作进行测定，所述标准药学操作例如用于测定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)。

本发明的疫苗可以是多价的或单价的。多价疫苗由多重OMP睡眠嗜组织菌肽与载体分子的免疫缀合制备。

在一个方面，OMP睡眠嗜组织菌肽组合物包含优选与免疫刺激剂组合的有效免疫接种量的免疫原性缀合物；和生理学可接受的媒介物。如本上下文中使用的，“免疫刺激剂”预期涵盖具有增强免疫系统活性的能力的任何化合物或组合物，无论它是与特异性抗原组合的特异性加强效应，还是简单地对免疫应答的一种或多种元件的活性的独立效应。免疫刺激性化合物包括但不限于矿物质凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇；多聚阴离子；肽；油乳剂；明矾和MDP。本领域已知利用这些材料的方法，并且测定用于给定疫苗的最佳刺激剂的量完全在技术人员的能力内。超过一种免疫刺激剂可以用于给定制剂中。免疫原还可以掺入脂质体内，或与多糖和/或用于疫苗制剂中的其他聚合物缀合。

需要时，组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可以包含含有活性成分的一种或多种单位剂型。该包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。该包装或分配器装置可以伴随关于施用优选施用于哺乳动物尤其是猪的说明书。与一个或多个此类容器相关的可以是通过管理药剂或生物制品的制造、使用或销售的政府机构开出形式的通知，所述通知反映通过制造、使用或销售机构批准用于人施用。

佐剂

为了进一步增加随同提供并且含有一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的免疫原性组合物的免疫原性，还可以包含一种或多种佐剂。

佐剂可以通过先前描述或本领域已知的技术中的任一种进行纯化。优选的纯化技术是硅胶色谱法，特别是“闪式”(快速)色谱法技术，如通过W.Clark Still等人，J.Organic Chemistry,43,2923-2925(1978)描述的。然而，其他色谱方法包括HPLC可以用于佐剂的纯化。结晶也可以用于纯化佐剂。在一些情况下，不需要纯化，因为直接由合成获得分析纯度的产品。

本发明的疫苗组合物通过依照已知技术，在适当的无菌条件下，将佐剂与一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽物理混合进行制备，以产生佐剂化的组合物。一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽和佐剂的复合通过在缀合物上的净负电荷的存在得到促进，所述净负电荷与长链烷基化合物佐剂上存在的正电荷静电吸引。

预期佐剂可以以约100μg至约10mg/剂量的量，优选以约100μg至约10mg/剂量的量，更优选以约500μg至约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量的量，并且最优选以约1mg/剂量的量加入。可替代地，佐剂可以为按最终产品的体积计约0.01％至75％的浓度，优选约2％至60％的浓度，更优选约5％至25％的浓度，再更优选约7％至22％的浓度，并且最优选10％至20％的浓度。

生理学可接受的媒介物

本发明的疫苗组合物可以使用类似于用于其他药物多肽组合物的技术进行配制。因此，佐剂和优选与载体分子缀合和/或与佐剂混合的一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽可以以冻干形式贮存，并且在施用前在生理学可接受的媒介物中重构，以形成悬浮液。可替代地，佐剂和缀合物可以贮存于媒介物中。优选媒介物是无菌溶液，特别是无菌缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。将佐剂和缀合物在媒介物中组合从而使得免疫原性组合物的免疫有效性改善的任何方法均是适当的。

本发明的疫苗的单次剂量的体积可以改变，但一般在常规疫苗中通常采用的范围内。在上文注明的缀合物和佐剂的浓度时，单次剂量的体积优选为约0.1ml至约3ml，优选约0.2ml至约1.5ml，更优选约0.2ml至约0.5ml。

本发明的疫苗组合物可以通过任何方便的方法进行施用。

制剂

包含与载体分子偶联的一种或多种OMP睡眠嗜组织菌肽的免疫原性缀合物可以用作针对睡眠嗜组织菌的一个或多个血清型免疫接种的疫苗。包含在生理学可接受的媒介物中的免疫缀合物的疫苗可用于使动物免疫接种的方法中，所述动物优选反刍动物，包括牛或绵羊，用于治疗或预防通过睡眠嗜组织菌的感染。

通过用免疫原性缀合物免疫接种针对本发明的免疫原性缀合物生成的抗体可以用于被动免疫疗法和抗独特型抗体的生成，用于治疗或预防通过睡眠嗜组织菌的感染。

组合物施用于其的受试者优选是动物，包括但不限于牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、犬、仓鼠、小鼠和大鼠，最优选地，哺乳动物是牛。在另一个实施方案中，受试者是人。

本发明的制剂包含有效免疫接种量的一种或多种免疫原性组合物或针对其的抗体和生理学可接受的媒介物。疫苗包含有效免疫接种量的一种或多种免疫原性组合物或针对其的抗体和生理学可接受的媒介物。制剂应适合施用方式。

需要时，免疫原性组合物还可以含有少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。免疫原性组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。经口制剂可以包括标准载体例如药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

有效剂量

本文描述的化合物可以以治疗有效剂量施用于受试者，以治疗睡眠嗜组织菌相关疾病。该剂量将取决于接受疫苗的宿主以及诸如宿主大小、重量和年龄的因素。

在制剂中待采用的本发明的免疫原性缀合物或抗体的精确量将取决于施用途径和受试者的性质(例如物种、年龄、大小、疾病分期/水平)，并且应根据从业者的判断和每个受试者的环境根据标准临床技术决定。有效免疫接种量是足以治疗或预防受试者中的睡眠嗜组织菌传染病的量。有效剂量还可以从衍生自动物模型测试系统的剂量应答曲线外推，并且可以从0.001mg/kg到100mg/kg不等，并且更优选约400μg/剂量的剂量。

化合物的毒性和治疗效果可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学操作进行测定，所述标准药学操作例如用于测定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中治疗上有效的剂量)。在毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以表示为比LD₅₀/ED₅₀。显示出大治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用显示出毒性副作用的化合物，应小心设计将此类化合物靶向受累组织部位的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损害降到最低和由此减少副作用。

得自细胞培养测定法和动物研究的数据可以用于配制在动物尤其是牛或人中使用的一系列剂量。此类化合物的剂量优选位于包括ED₅₀的循环浓度范围内，伴随很少的毒性或无毒性。剂量可以在该范围内改变，取决于采用的剂型和利用的施用途径。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初由细胞培养测定法进行估计。剂量可以在动物模型中配制，以实现包括如在细胞培养中测定的IC₅₀(即实现症状的半最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更精确地测定受试者中的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法测量。

组合物的免疫原性可以通过使用本领域已知的任何免疫测定法，在用组合物免疫接种后，监控测试受试者的免疫应答进行测定。体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫的生成可以视为免疫应答的指示。测试受试者可以包括动物例如猪、小鼠、仓鼠、犬、猫、兔、牛、马、绵羊、家禽(例如鸡、鸭、鹅和火鸡)和人。

测试受试者的免疫应答可以通过多种方法进行分析，例如：所得到的免疫血清与免疫原性缀合物的反应性，如通过已知技术例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)，免疫印迹，免疫沉淀等测定的；或通过保护免疫接种的宿主免于通过病原体的感染和/或在免疫接种的宿主中由于通过病原体的感染的症状减弱，如通过本领域已知的任何方法测定的，用于测定传染病因子的水平例如细菌水平(例如通过培养来自受试者的样品)，或本领域已知的其他技术。传染病因子的水平也可以通过测量免疫球蛋白针对其的抗原水平进行测定。传染病因子水平的降低或传染病症状的改善指示该组合物是有效的。

在动物或人体内使用之前，本发明的治疗剂可以在体外就所需治疗或预防活性进行测试。例如，可以用于测定特定治疗剂的施用是否指示的体外测定法包括体外细胞培养测定法，其中来自细胞系的适当细胞或者由具有特定疾病或病症的受试者培养的细胞暴露于或另外施用治疗剂，并且观察到对细胞的治疗作用。

可替代地，治疗剂可以通过下述进行测定：使治疗剂与细胞(由受试者培养的或来自培养的细胞系)接触，所述细胞对通过传染病因子的感染敏感但未被传染病因子感染，使所述细胞暴露于传染病因子，并且随后测定与治疗剂接触的细胞的感染率是否低于未与治疗剂接触的细胞的感染率。细胞被传染病因子的感染可以通过本领域已知的任何方法进行测定。

另外，治疗剂可以通过在治疗前、期间或后的合适时间间隔，测量抗体在动物模型或人受试者中针对其的分子的水平进行评价。在分子的量中的任何变化或变化的不存在可以得到鉴定，并与治疗对受试者的作用关联。分子的水平可以通过本领域已知的任何方法进行测定。

在使用本发明的方法和组合物对动物接种OMP睡眠嗜组织菌后，本领域已知的任何结合测定法均可以用于评价在所得到的抗体和特定分子之间的结合。还可以进行这些测定法，以选择对于特定抗原显示出更高亲和力或特异性的抗体。

检测和诊断方法

起因于本发明的OMP睡眠嗜组织菌肽使用的抗体或其结合部分可用于检测样品中睡眠嗜组织菌细菌的存在。该检测方法包括下述步骤：提供针对本发明的OMP睡眠嗜组织菌肽产生的分离的抗体或其结合部分，将分离的抗体或其结合部分加入怀疑含有一定量的睡眠嗜组织菌的样品，并且检测包含与睡眠嗜组织菌结合的分离的抗体或其结合部分的复合物存在。

本发明的抗体或其结合部分还可用于检测样品中睡眠嗜组织菌肽的存在。该检测方法包括下述步骤：提供针对睡眠嗜组织菌肽产生的分离的抗体或其结合部分，将分离的抗体或其结合部分加入怀疑含有一定量的睡眠嗜组织菌肽的样品，并且检测包含与睡眠嗜组织菌肽结合的分离的抗体或其结合部分的复合物的存在。

结合其为结合对成员的特异性分子的免疫球蛋白，特别是抗体(及其功能活性片段)可以用作如本文描述的诊断剂和预后剂。在多个实施方案中，本发明提供了结合对成员的测量，和此类测量在临床应用中的用途。在本发明中的免疫球蛋白可以例如用于检测生物样品中的抗原，由此受试者可以测试免疫球蛋白与之结合的分子的异常水平，和/或异常形式的此类分子的存在。“异常水平”意指相对于来自身体一部分或不具有受试者的类似样品中存在的，或代表存在的标准水平增加或降低的。本发明的抗体还可以作为试剂包括在用于诊断或预后技术的试剂盒中。

在一个方面，与睡眠嗜组织菌肽免疫特异性结合的本发明的抗体可以用于诊断、预后或筛选睡眠嗜组织菌感染。

在另一个方面，本发明提供了诊断或筛选睡眠嗜组织菌感染或针对其的免疫的存在的方法，其包括在受试者中测量抗体与衍生自受试者的样品的免疫特异性结合水平，其中抗体免疫特异性结合睡眠嗜组织菌肽，其中相对于在来自不具有传染病因子的受试者的类似样品中的所述免疫特异性结合水平，所述免疫特异性结合水平中的增加指示睡眠嗜组织菌的存在。

检测睡眠嗜组织菌肽或其拮抗剂存在的合适测定法的例子包括但不限于ELISA、放射性免疫测定法、凝胶扩散沉淀反应测定法、免疫扩散测定法、凝集测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法或免疫电泳测定法。

用于特定分子的免疫测定法通常将包括在可检测标记的抗体存在下，使样品例如生物流体、组织提取物、新鲜收获的细胞或培养细胞的裂解产物温育，并且通过本领域众所周知的许多技术中的任一种检测结合的抗体。

给定抗体的结合活性可以根据众所周知的方法进行测定。本领域技术人员将能够通过采用例行实验测定每种测定的操作和最佳测定条件。

本发明的另外方面涉及用于检测或测量睡眠嗜组织菌的诊断试剂盒。提供了诊断用途的试剂盒，其包含在一个或多个容器中的抗睡眠嗜组织菌肽抗体，和任选地针对抗体的标记的结合配偶体。可替代地，OMP睡眠嗜组织菌肽抗体可以是标记的(使用可检测标记，例如化学发光、酶促、荧光或放射性部分)。相应地，本发明提供了包含抗OMP睡眠嗜组织菌肽抗体和对照免疫球蛋白的诊断试剂盒。在具体实施方案中，容器的前述化合物之一可以是可检测标记的。试剂盒可以任选进一步包含在容器中的通过试剂盒的抗体识别的预定量的OMP睡眠嗜组织菌肽，用作标准或对照。

对受试者的施用

优选施用途径包括但不限于鼻内、经口、真皮内和肌内。最优选以单次剂量的在饮用水中的施用是期望的。技术人员将认识到本发明的组合物还可以以一个、两个或更多个剂量，以及通过其他施用途径进行施用。例如，此类其他途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、小叶内、髓内、肺内和阴道内。取决于治疗的所需持续时间和有效性，根据本发明的组合物可以施用一次或几次，以及间歇地施用，例如在每天基础上共几天、几周或几个月并且以不同剂量。

包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下述实施例中公开的技术代表由本发明人发现在本发明实践中起很好作用的技术，并且因此可以视为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在公开的具体实施方案中作出许多变化，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明精神和范围。

实施例

实施例1：在CD小牛中的呼吸道攻击模型的开发

A.目的

为了评估任何原型疫苗，需要满意和一致的攻击模型，以显示适当疾病在未经处理的动物中体现。大多数公开文献以及通过BIVI Research andDevelopment Lab的先前工作已使用得自University of California–San Diego(UCSD)的分离物5166用于攻击目的，但这产生不一致的结果。在开发更一致模型的努力中，更近期获得的野外分离物用于与5166分离物比较，以确定哪种将提供足够的临床体征、肺病理学和死亡率，以在进一步工作中作用于评估疫苗原型。根据先前文献，在野外保持未经处理的野生型感染导致平均15％的肺侵害(Griffin 2009)。这种测量用于测定攻击模型的成功。

B.材料与方法

细菌分离物

分离物5166得自UCSD用作对照。从诊断有细菌性肺炎的野外病例中回收分离物35576(得自Iowa State University Veterinary Diagnostics Lab-ISUVDL)、LgD1-TN08(PTA-12756)和Lg2-OK08(PTA-12755)。所有分离物原种制备并贮存于Cryobeads(Copan Diagnostics)上。生长通过利用无菌10uL环将珠划线培养至含有5％绵羊血(Remel)的Columbia Blood Agar(CBA)平板来完成，并且在37℃下伴随10％CO₂温育24小时。个别菌落从这些平板中选择，并且划线培养至新的CBA平板用于菌苔生长并且再次温育24小时。将细菌菌苔收获到1.0mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS–Gibco)内，并且300uL用于接种T-150烧瓶(Corning)中的CBA，并且通过使用无菌玻璃珠扩散。更大的容器再次在37℃下伴随10％CO₂一起温育，并且随后通过利用玻璃珠在生长十八小时的攻击当日收获，以将培养物移出到含有5％胎牛血清(FBS-SAFC)/烧瓶的6.0mL RPMI-1640培养基(Hyclone)内。先前工作已显示在610nm处75％的透射率与大约3.0x10⁸CFU/mL关联。使用这个近似值，培养物在3.0x10⁸CFU/mL中稀释至1.0x10⁹CFU/mL的最终浓度。

小牛

十六-十七只初乳剥夺的荷斯坦小牛得自Dykstra Dairy(Strubble,IA)，这些小牛通过耳切口对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的持续性感染，通过鼻拭子的q-PCR对牛支原体(Mycoplasma bovis)的持续性感染测试为阴性，并且仍未接受任何睡眠嗜组织菌疫苗接种。在研究起始前，所有小牛通过主治兽医在Sioux Center,IA的BIVI研究农场现场测定为健康良好。在攻击时，小牛年龄范围为55至71天，具有59天的平均值。动物根据实验室操作喂养对于其年龄和重量适当的日粮。水借助于对每个围栏可接近的橡胶容器可随意获得。小牛随机指定至五组中的每一组，并且随后指定至以每块十个排列的个别围栏。

攻击

在攻击前对严格对照动物实施安乐死并进行尸检，以确保缺乏来自来源的呼吸道病理学。其他对照动物经由内窥镜气管内施用2x20.0mL剂量的含有5％FBS的RPMI 1640培养基，无睡眠嗜组织菌。对于所有实验动物，来自指定分离物的20.0mL收获的睡眠嗜组织菌稀释至1.0x10⁹CFU/mL，并且经由内窥镜在第一分叉水平处气管内施用于每只小牛，共2.0x10¹⁰CFU的总估计的攻击剂量。这随后为用含有5％FBS的RPMI-1640培养基的20.0mL洗涤。

临床观察

每天观察临床体征和直肠温度，共攻击后七天。尽管观察所有身体系统，但特别关注呼吸窘迫的体征。显示严重呼吸窘迫的体征，变得不能站立，或如果没有帮助不能到达食物和/或水的动物，由于人道原因而实施安乐死并进行尸检。所有剩余动物在攻击后七天时实施安乐死并进行尸检。在尸检时，通过主治兽医记录每个肺叶中存在的肉眼病理学和肺病理学百分比。收集由来自损害边缘的组织和良好组织组成的肺样品。每只小牛收集两个样品，并且贮存于冰上直至递送至实验室用于测试时。来自每只小牛的另外样品在10％福尔马林中固定用于组织病理学检查。

细菌回收

使用丙烷火炬使组织烤焦，并且随后无菌切割以暴露内表面。将干拭子插入组织内并旋转取样。将拭子浸入5ml BHI肉汤内，所述BHI肉汤补充有tris缓冲液和硫胺素一磷酸盐，如通过Asmussen和Baugh(1981)提出的。肉汤管在37℃下伴随130rpm振荡温育24-72小时。将第二组组织贮存于-70℃下。在温育后，与阳性和阴性对照管相比较，基于浊度就生长将肉汤培养物评分为阳性或阴性的。

PCR

为了验证在来自受感染肺的培养物内的睡眠嗜组织菌的存在，从每种肉汤培养物获得50uL样品，并实施DNA提取(Qiagen DNA试剂盒)并通过q-PCR测试睡眠嗜组织菌DNA的存在。利用的引物为对于16S rDNA内的序列特异性的睡眠嗜组织菌物种-正向引物(5'-GAAGGCGATTAGTTTAAGAG-3')和反向引物(5'-TTCGGGCACCAAGTRTTCA-3')(Angen等1998)。使用CFX-96Thermocycler(Bio-Rad)与Bio-Rad Master Mix、0.4ug/uL牛血清白蛋白(BSA)和一组过程中对照引物，在25uL体积中在96孔形式中进行PCR，以验证每个孔中的反应的效力。睡眠嗜组织菌DNA的标准曲线在每块平板上运行。进行在95.0℃下五分钟的初始活化步骤，随后为在95.0℃下十五秒变性和在60.0℃下三十秒退火/延伸步骤的四十五个循环，伴随在每个循环结束时探针荧光的实时捕获。使用Bio-Rad CFX软件捕获并分析数据。样品一式两份运行，并且平均阈值循环(C_t)与标准相比较，以测定每种样品是阳性的还是阴性的。在样品具有一个阳性孔和一个阴性孔的情况下，样品一式三份地再运行，通过其结果在>50％的测试孔中表示测定阳性的最终测定。

组织病理学

在10％福尔马林中固定的肺样品运输至在Ames,IA的ISU-VDL用于组织病理学检查。使用0-4的评分系统。得分0指示无显微损害，1指示轻度或局灶性损害，2指定中等或多局灶性损害，3指定严重或扩散的显微损害，并且4指定严重、扩散的显微损害。

结果

当经过研究过程与对照组相比较时，所有受攻击的组均显示在平均直肠温度中的可检测增加。分离物5166在第1天时最快达到峰温度，然而，分离物35576实现在第2天时观察到的最高直肠温度。用每种分离物攻击的组的直肠温度显示在第1或2天时从峰温度的平均值中的降低。当比较组间观察到的直肠温度时，仅分离物35576显示温度超过其他分离物的显著增加(p＝0.004)。经过攻击期过程的平均直肠温度概括于图1中。

临床体征例如抑郁症、食欲降低、呼吸急促、用力呼吸、头部低下、不愿移动、眼和鼻分泌物在受攻击的动物中全部观察到。体征在攻击后的第1天直到第3天时是最严重和最普遍的。最严重和最高数目的症状在组2(分离物Lg2-OK08)中观察到，其中十五只动物中的十一只到第3天时发现死亡或由于人道原因而实施安乐死。死亡率概括于表1中。

细菌培养和后续q-PCR分析显示从所有受攻击组的肺的高回收率。组2(Lg2-OK08)仅获得未观察到来自其肺组织培养的阳性PCR的一只动物。

在每只动物的尸检后测量总肺病理学。观察到具有范围从红色到灰色到黄色的肝样变的肺实变。损害遵循支气管树。还可见具有与肋架粘附的纤维蛋白标签，伴随在一些动物的胸腔中和心包囊上的过量流体。一些动物还具有胸膜炎。组2(Lg2-OK08)产生36.89％±8.64％(α＝0.1)总肺侵害。组1(5166)产生22.16％±7.66％(α＝0.1)总肺侵害。这个差异是统计学显著的(p＝0.08)。肺病理学概括于图2中。

肺组织关于损害的严重性并且观察与细菌性肺炎是否相容(0-4等级)进行评分。在组间未观察到显著差异，但通过用每种分离物攻击的肺炎的成功因果关系得到支持。关于组织病理学检查的严重性得分概括于表2中。

表1：处理组的死亡率

*分离物Lg2-OK08产生比5166明显更高的死亡率(p＝0.01)

**分离物35576产生比5166明显更高的死亡率(p＝0.02)

死亡率报告为在观察到此类事件的每天时在每组中的死亡数目。百分比代表受侵袭处理组的比例。在第3天早晨和在第7天时的最终尸检之间没有动物死亡。

C.结论

该研究的目的是测定与先前使用的分离物5166相比较，分离物Lg2-OK08、LgD1-TN08和35576是否可以用于成功攻击模型中。分离物Lg2-OK08在产生疾病的临床表现方面优于原始分离物5166，包括经过研究过程的相等平均直肠温度，在该实验中具有在第2天时更高的峰温度，更多可见的临床体征，显著更高的死亡率和显著增加的肺损害百分比。分离物Lg2-OK08还产生比其他测试的分离物(LgD1-TN08或35576)中任一种更一致的结果。虽然如通过模型预期的，测试的所有分离物均产生细菌性肺炎并且展示所需肺病理学(≥15％)，但分离物Lg2-OK08看起来在与其他分离物的比较中显示最强的毒力。因为该分离物产生在处理组内一致的足够发病机制，并且由于其更近期的分离，可以更精确地反映目前的野生型呼吸道感染；Lg2-OK08作为攻击生物体用于进一步工作。

表2：来自组织病理学检查的严重性评分

严重性评分基于通过ISU-VDL的技术员的评价进行指定。百分比指示展示显微损害的给定严重性的处理组比例。

评分:0＝无显微损害

1＝轻度或局灶性损害

2＝中等或多局灶性损害

3＝严重或扩散的损害

4＝严重、扩散的损害

实施例2：在CD小牛模型中的疫苗策略评估

A.目的

该研究的目的是评估代表目前可用的疫苗技术的多种疫苗原型针对实施例1中所述的呼吸道攻击模型的功效。在该研究中调查的疫苗包括灭活的菌苗，在生物膜形成基因中具有缺失的两种经修饰的活突变体，和通过十二烷基肌氨酸钠提取获得的粗OMP提取物。呼吸道攻击的成功再次针对在野外研究中观察到的肺病理学进行测量，通过细菌回收、睡眠嗜组织菌特异性PCR和显微损害的组织病理学检查证实。疫苗的功效基于与未接种疫苗的对照相比较的肺病理学减少进行评估。

B.材料与方法

细菌分离物

睡眠嗜组织菌分离物Lg2-OK08(PTA-12755)用于OMP提取以及用于攻击。缺乏某些生物膜形成特征的两种经修饰的活缺失突变体得自VirginiaPolytechnic Institute and State University(VATech)。获得商购可得的灭活的菌苗产品，以充当目前可用方法和原型的功效之间的比较。用于OMP提取的分离物Lg2-OK08生长在下述部分中描述。用于攻击的该分离物的生长，以及经修饰的活疫苗分离物的生长与对于实施例1报告的方法相同地进行。

OMP提取

用于OMP提取的方法由通过Bollag等(1996)和Rehm(2006)描述的方法进行修饰。贮存于Cryobeads(Copan Diagnostics)上的分离物Lg2-OK08(PTA-12755)划线培养至含有5％小牛血(Remel)的CBA平板，并且在37℃下与10％CO₂一起温育24小时。随后将菌落转移至50mL锥形管(Corning)中的10mL有专利权的肉汤培养基(BIVI)，所述肉汤培养基补充有FBS(SAFC)、酵母提取物(BIVI)和右旋糖(BIVI)。肉汤在37℃下伴随130rpm振荡温育二十四小时。与典型睡眠嗜组织菌生长一致的浊度通过使用分光光度计测量在610nm处的光密度(OD)加以验证，并且将1.5mL这种初始培养物接种到2.8L摇瓶中的1.5L新鲜培养基内。更大型的培养在37℃下伴随130rpm振荡温育十八小时。通过将培养物以10,000x G离心十分钟收获细菌。收获的细胞随后以10x浓度重悬浮于含有蛋白酶抑制剂(Sigma)的10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(Sigma)中。随后对重悬浮的团块实施三个冻融循环以开始细胞裂解。在第三次解冻后，使用牛角杯(cup horn)通过三轮超声处理对培养物实施进一步的细胞裂解，伴随以完全振幅的0.5秒爆裂共一分钟。随后将细胞裂解产物以17,000x G离心二十分钟，以去除细胞碎片。所得到的上清液随后以100,000x G在4℃下离心一小时，以使膜结合的蛋白质形成团块。来自该离心的团块以10x浓度重悬浮于具有蛋白酶抑制剂(Sigma)的10mM HEPES中，并且随后用2.0％十二烷基肌氨酸钠(Sigma)在室温下处理三十分钟，以溶解非蛋白质组分。经处理的悬浮液再次以100,000x G在4℃下离心一小时，以使蛋白质形成团块。所得到的团块随后重悬浮于10mM HEPES中，并且稀释至如通过BCATotal Protein Assay Kit(Thermo)测定的1.0mg/mL的最终浓度。

提取过程显示在产生的蛋白质总量中比预期的更不有效，还观察到来自最终处理的许多蛋白质保留在可溶级分中。使用来自已接受灭活的菌苗疫苗的小牛的血清的这些制备物的蛋白质印迹指示这两种级分的蛋白质概况是几乎相同的。为了提供足够的材料用于疫苗接种，来自十二烷基肌氨酸钠处理的不溶性和可溶性级分两者均用于该疫苗接种中。

小牛

十七只初乳剥夺的荷斯坦小牛通过耳切口通过BVDV持续性感染，通过鼻拭子的q-PCR就牛支原体的持续性感染测试为阴性，并且仍未接受任何先前睡眠嗜组织菌疫苗接种，得自J&R Livestock(Iowa)。在第一次疫苗接种时小牛年龄范围为41到51天，在攻击时具有90天的平均年龄。在研究起始前，所有小牛通过主治兽医在Cosby,MO的BIVI研究农场现场测定为处于良好健康。动物根据实验室操作喂养对于其年龄和重量适当的日粮。水借助于对每个围栏可接近的橡胶容器可随意获得。小牛随机指定至五组中的每一组，并且根据处理指定至块中的个别板条箱。对于该研究的疫苗接种期，对照动物指定至与经修饰的活疫苗接种尽可能远的板条箱。此外，对于疫苗接种的持续时间，动物始终以相同次序参与：对照、菌苗疫苗接种、OMP疫苗接种和随后经修饰的活疫苗接种。

疫苗接种和攻击

在研究的第0天时施用疫苗，并且随后三周后在第21天时给予加强。攻击对照动物仅施用PBS。如制造商的标签上建议的，菌苗疫苗接种皮下(SQ)给予2.0mL剂量。OMP疫苗接种给予在弗氏不完全佐剂(Sigma)中的400ug OMP材料/剂量SQ。经修饰的活疫苗接种通过两种不同途径(SQ和鼻内(internasally)-IN)接受2.0mL剂量，具有估计的1.0x10⁹CFU/剂量。

在第41天(攻击前一天)时，将动物再次随机指定至新围栏，以充当应激物。在第42天时，以与先前研究相同的方法，用在含有5％FBS的RPMI-1640中稀释的1.0x10¹⁰CFU分离物Lg2-OK08攻击动物。所有攻击后观察、收集的样品、测试方法和人道终点等同于实施例1中所述的那些。疫苗接种和攻击时间表概括于表3中。

表3：实验设计

疫苗接种在研究的第0天和第21天时发生。攻击在第42天时发生。

临床观察

攻击后，每天观察临床体征和贮存温度，共七天。尽管观察所有身体系统，但特别关注呼吸窘迫的体征。显示严重呼吸窘迫的体征，变得不能站立，或如果没有帮助不能到达食物和/或水的动物，由于人道原因而实施安乐死并进行尸检。所有剩余动物在攻击后七天时实施安乐死并进行尸检。在尸检时，通过主治兽医记录每个肺叶中存在的肉眼病理学和损害百分比。收集由来自损害边缘的组织和良好组织组成的肺样品。每只小牛收集两个样品，并且贮存于冰上直至递送至实验室用于测试时。来自每只小牛的另外样品在10％福尔马林中固定用于组织病理学检查。

细菌回收

肺组织的拭子用于细菌检测。在等同于研究1的方法中，肺组织在明火上烤焦，移动至无菌通风橱，并且作出切口，使得可以无菌擦拭组织的内表面。这些拭子随后转移至生长培养基。由于在温育后观察到的混浊缺乏，随后使已贮存于-70℃下的第二个肺组织样品解冻。重复来自研究1的上述操作，并且第二个拭子用于划线培养具有5％绵羊血(Remel)的Columbia Blood Agar(CBA)平板。第二个拭子还保留用于直接PCR。来自每个肉汤培养物的样品、琼脂平板的拭子和来自第二组测试的拭子各自实施DNA提取和PCR分析。

PCR

为了验证在来自受感染肺的培养物内的睡眠嗜组织菌的存在，从每种肉汤培养物获得50uL样品，并实施DNA提取(Qiagen DNA试剂盒)，并使用如关于研究1描述的对于睡眠嗜组织菌16S基因特异性的引物，通过q-PCR测试睡眠嗜组织菌DNA的存在。使用CFX-96Thermocycler(Bio-Rad)与Bio-Rad Master Mix、0.4ug/uL牛血清白蛋白(BSA)和一组过程中对照引物，在25uL体积中在96孔形式中进行PCR，以验证每个孔中的反应的效力。睡眠嗜组织菌DNA的标准曲线在每块平板上运行。进行在95.0℃下五分钟的初始活化步骤，随后为在95.0℃下十五秒变性和在60.0℃下三十秒退火/延伸步骤的四十五个循环，伴随在每个循环结束时探针荧光的实时捕获。使用Bio-Rad CFX软件捕获并分析数据。样品一式两份运行，并且平均阈值循环(C_t)与标准相比较，以测定每种样品是阳性的还是阴性的。在样品具有一个阳性孔和一个阴性孔的情况下，样品一式三份地再运行，通过其结果在>50％的测试孔中表示测定阳性的最终测定。

组织病理学

在10％福尔马林中固定的肺样品运输至在Ames,IA的ISU-VDL用于组织病理学检查。使用0-4的评分系统。得分0指示无显微损害，1指示轻度或局灶性损害，2指定中等或多局灶性损害，3指定严重或扩散的显微损害，并且4指定严重、扩散的显微损害。

结果

所有组的直肠温度在攻击后当天增加大约三度。接种菌苗疫苗的组显示最高的平均温度，而接种突变体1疫苗的动物具有最低平均温度。对于疫苗中的任一种，不存在直肠温度中的显著减少。直肠温度概括于图3中。

在先前工作中，来自肺拭子的肉汤培养物在24-72小时温育后变得混浊。在目前研究中，未观察到这种混浊，指示缺乏来自肺组织的活细菌的回收。第二组肉汤培养物再次显示在72小时温育后在37℃下伴随130rpm振荡无混浊。然而，在37℃下伴随10％CO₂的24小时温育后，CBA平板展示睡眠嗜组织菌典型的菌落，没有任何非睡眠嗜组织菌生物体的明显生长。如表4中所述，关于肉汤培养物、铺平板菌落和直接拭子各自的PCR分析全部指示睡眠嗜组织菌的存在。

表4：来自受攻击动物的睡眠嗜组织菌检测

百分比指示通过对于16s rRNA基因特异性q-PCR提供睡眠嗜组织菌的成功检测的每组比例。新鲜和冷冻肉汤培养物均不产生混浊，所述混浊指示睡眠嗜组织菌的成功生长，如先前已常规可见的，然而，PCR证实可检测(如果并非活的)生物体，并且铺平板的培养物指示不存在其他污染细菌。

观察到的临床体征包括抑郁症、食欲降低、急促和/或用力呼吸、咳嗽、鼻分泌物、寒战和疫苗注射部位的隆起。关于所有组的临床体征在攻击期自始至终持续；然而，OMP疫苗接种在攻击后5天仅剩下咳嗽。当与对照组相比较时，用OMP疫苗处理导致在观察到的抑郁症发病率中的显著降低(p＝0.06)，食欲降低天数的减少(p＝0.02)，鼻分泌物的减少(p＝0.03)和观察到的临床体征总数目的减少(p＝0.05)。突变体1疫苗是唯一不降低用力呼吸发生率或降低鼻分泌物的所测试处理。

对照组中的五只动物在攻击期结束前死亡。商业菌苗组中的两只动物、突变体1组中的三只动物和突变体2组中的三只动物也在攻击期过程期间死亡。接受OMP疫苗的动物无一在尸检前死亡，当与对照相比较时，这是显著的(p＝0.02)。死亡率概括于表5中。

表5：通过处理组的死亡率

*OMP疫苗产生比对照组明显更低的死亡率(p＝0.02)

死亡率报告为在观察到此类事件的每天时在每组中的死亡数目。百分比代表受累处理组的比例。

虽然当与攻击对照组相比较时，两种经修饰的活突变体分离物均显示肺损害平均百分比中的降低(突变体1的24.38％和突变体2的24.47％)，但这种差异未发现是统计学显著的。然而，OMP疫苗候选物产生13％肺损害的平均值，当与在对照组中观察到的32.47％相比较时，其为显著的(p＝0.001)。当与对照组相比较时，商购可得的灭活的菌苗疫苗未显示损害得分中的差异(32.10％)。肺病理学概括于图4中。

组织学检查与细菌性肺炎一致。研究者报告小叶间隔通常加宽/膨胀伴随水肿，炎症细胞和淋巴管的血栓形成。在组间未注意到差异，并且这个数据仅用于构象目的。

C.结论

关于所讨论的疫苗的功效评估使得OMP制备物材料重新成为有希望的疫苗候选物，当与对照组相比较时，显示在总体临床体征、肺病理学百分比和死亡率中的显著降低。经修饰的活候选物显示这些变量减少的趋势，然而，未观察到在该研究中是统计学显著的。商购可得的菌苗产品未显示针对呼吸道攻击的功效。

在细菌回收期间关于肉汤培养物的浊度的缺乏可能已经是培养基或其组分之一的特定批次的假象。浊度的缺乏不与通过PCR可检测的睡眠嗜组织菌的不存在关联。肉汤培养方法对于进一步工作可抛弃，因为直接拭子方法显示相同水平的睡眠嗜组织菌回收，同时使加工时间减少直到72小时。

虽然OMP候选物看起来有希望，但应当指出OMP疫苗由攻击分离物(BIVI–Lg2-OK08)生成，并且由于获得用于疫苗接种的蛋白质必要量所需的大量培养物和在蛋白质提取中使用超速离心，OMP制备的十二烷基肌氨酸钠方法目前无法转移至大量生产水平。将需要评估对于生产有效的可替代提取方法(即更高的蛋白质得率伴随过滤浓度或更低速的离心)，并且应检查异源OMP制剂的功效。

实施例3：基于蛋白质提取方法的OMP疫苗原型的功效

A.目的

对于来自研究2中观察到的攻击分离物(Lg2-OK08)的十二烷基肌氨酸钠提取的OMP制剂的功效，评估异源疫苗制剂变得重要。选择分离物LgD1-TN08和156A2用于该目的。在研究2中利用的OMP提取的十二烷基肌氨酸钠方法导致对于可溶性和不溶性级分的相似蛋白质概况，指示过程中的无效，并且提供低于预期的总蛋白质得率。还检查了使用SDS和Triton-X提取的OMP的功效，与十二烷基肌氨酸钠方法不同，所述SDS和Triton-X提取可扩大至大量生产水平。

B.材料与方法

细菌分离物

睡眠嗜组织菌分离物Lg2-OK08(PTA-12755)、LgD1-TN08(PTA-12756I)和156A2(BIVI)用于该研究。分离物Lg2-OK08和LgD1-TN08的培养物生长和十二烷基肌氨酸钠提取等同于研究2中使用的方法。对于两种分离物，再次注意到十二烷基肌氨酸钠方法产生相对少量的总蛋白质，并且大多数最终蛋白质保留在十二烷基肌氨酸钠可溶性级分中。可溶性和不溶性级分两者均用于疫苗配制。如下一个部分中所述的SDS提取用于分离物LgD1-TN08，并且Triton X用于156A2。SDS方法对于分离物LgD1-TN08在实验室规模下进行，并且生产规模Triton-X方法用于分离物156A2，其用于目前疫苗产品中。

SDS提取

Triton-X利用空心纤维过滤提取外膜蛋白的方法通过在Fort Dodge,IA的BIVI生产设施概述。简言之，对活培养物实施通过用0.2um截止滤器的空心纤维过滤(HFF)的浓缩，重悬浮，用Triton-X处理，并且随后恢复其原始体积。随后对经处理的抗原实施使用5kDa截止滤器的第二轮HFF，并且浓缩至所需蛋白质载量。通过该设施在生产规模生成的来自分离物156A2的抗原用于给一组接种疫苗。

第二组使用来自研究分离物LgD1-TN08的SDS提取的材料进行疫苗接种。对于该实验室规模操作，该分离物的肉汤培养物如对于研究2中的十二烷基肌氨酸钠提取方法描述的进行制备，并且通过以10,000x G离心十分钟而不是0.2um HFF进行收获。随后将团块以10X浓度重悬浮于具有蛋白酶抑制剂(Sigma)的10mM HEPES中。这种悬浮液随后在60℃下温育一分钟。SDS以0.04％总浓度加入，并且在41℃下温育三十分钟。经处理的提取物随后以9,500x G离心二十四分钟，以去除细胞碎片。上清液随后使用具有蛋白酶抑制剂的10mM HEPES回到1X浓度，并且使用空心纤维过滤通过5kDa滤器浓缩至20X。

小牛

十七只初乳剥夺的荷斯坦小牛得自J&R Livestock(Iowa)，它们通过耳切口就BVDV的持续性感染，通过鼻拭子的q-PCR就牛支原体的持续性感染测试为阴性，并且仍未接受任何睡眠嗜组织菌疫苗接种。在第一次疫苗接种时小牛年龄范围为44到54天，在攻击时具有92天的平均年龄。在研究起始前，所有小牛通过主治兽医在Sioux Center,IA的BIVI研究农场现场测定为处于良好健康。动物根据实验室操作喂养对于其年龄和重量适当的日粮。水借助于对每个围栏可接近的橡胶容器可随意获得。小牛随机指定至五组中的每一组，并且随后指定至以每组十个排列的围栏。攻击前一天，将所有小牛再次随机指定至新围栏，以充当应激物。

疫苗接种和攻击

所有疫苗原型均在弗氏不完全佐剂(Sigma)中以400ug蛋白质/剂量的浓度进行配制。如对于研究2中的OMP疫苗完成的，在第0天和第21天时以2.0mL SQ注射施用疫苗。围栏指定的再次随机化在第41天时发生，并且等同于研究2中的攻击在第42天时进行。疫苗接种和攻击时间表概括于表6中。

临床观察

攻击后，每天观察临床体征和贮存温度，共七天。尽管观察所有身体系统，但特别关注呼吸窘迫的体征。显示严重呼吸窘迫的体征，变得不能站立，或如果没有帮助不能到达食物和/或水的动物，由于人道原因而实施安乐死并进行尸检。所有剩余动物在攻击后七天时实施安乐死并进行尸检。在尸检时，通过主治兽医记录每个肺叶中存在的肉眼病理学和肺病理学百分比。收集由来自损害边缘的组织和良好组织组成的肺样品。每只小牛收集两个样品，并且贮存于冰上直至递送至实验室用于测试时。来自每只小牛的另外样品在10％福尔马林中固定用于组织病理学检查。

表6：实验设计

细菌回收

如实施例2中完成的，将尸检后的肺样品在-70℃下冷冻并在加工前解冻。将解冻的样品在明火上烤焦，移动至无菌环境，切开并且擦拭内表面。拭子用于划线培养CBA平板(Remel)，所述CBA平板在37℃下伴随10％CO₂温育过夜，以验证外来试剂的不存在。随后对拭子实施DNA提取和PCR，以验证睡眠嗜组织菌的存在。

PCR

为了验证来自受感染肺的拭子的睡眠嗜组织菌的存在，对拭子实施DNA提取(Qiagen DNA试剂盒)，并使用如关于研究1描述的对于睡眠嗜组织菌16S基因特异性的引物，通过q-PCR测试睡眠嗜组织菌DNA的存在。使用CFX-96Thermocycler(Bio-Rad)与Bio-Rad Master Mix、0.4ug/uL牛血清白蛋白(BSA)和一组过程中对照引物，在25uL体积中在96孔形式中进行PCR，以验证每个孔中的反应的效力。睡眠嗜组织菌DNA的标准曲线在每块平板上运行。进行在95.0℃下五分钟的初始活化步骤，随后为在95.0℃下十五秒变性和在60.0℃下三十秒退火/延伸步骤的四十五个循环，伴随在每个循环结束时探针荧光的实时捕获。使用Bio-Rad CFX软件捕获并分析数据。样品一式两份运行，并且平均阈值循环(C_t)与标准相比较，以测定每种样品是阳性的还是阴性的。在样品具有一个阳性孔和一个阴性孔的情况下，样品一式三份地再运行，通过其结果在>50％的测试孔中表示测定阳性的最终测定。

组织病理学

在10％福尔马林中固定的肺样品运输至在Ames,IA的ISU-VDL用于组织病理学检查。使用0-4的评分系统。得分0指示无显微损害，1指示轻度或局灶性损害，2指定中等或多局灶性损害，3指定严重或扩散的显微损害，并且4指定严重、扩散的显微损害。

结果

所有组的直肠温度在攻击后当天(第43天)增加大约三度。最高峰温度在用Triton-X提取的分离物156A2接种疫苗的组中观察到，在攻击后一天达到～104.0°F。虽然当与攻击对照相比较时，对于一些疫苗组在个别日观察到在温度中的显著差异，但这些观察看起来作为保护指示剂不是有生物学意义的，因为这些差异由组观察到，与其观察到的肺病理学百分比中的减少无关。直肠温度概括于图5中。

先前研究指示指示来自冷冻和解冻肺组织的拭子的直接q-PCR将允许成功检测来自这些样品的睡眠嗜组织菌。允许成功检测的样品数目在目前研究中很低，如提供用于培养物生长的活睡眠嗜组织菌的样品数目一样。虽然测定该过程的原因超出该研究的范围，但它可以指示由于疫苗施用在感染清除中的增加。在组中未注意到显著差异，但在缺乏任何观察到的疫苗功效的组中观察到更高水平的检测和回收。这个参数继续在进一步研究中进行检查。睡眠嗜组织菌回收在表7中描述。

表7：来自受攻击动物的睡眠嗜组织菌检测

在攻击后一天开始注意到观察到的临床体征，并且包括抑郁症、食欲降低、急促和/或用力呼吸和咳嗽。在攻击后三天开始对于一些动物注意到严重的鼻分泌物。关于所有组的临床体征在攻击期自始至终持续。在组中未注意到与任何个别体征或展示的体征总数目有关的显著差异。

对照组中的三只动物在攻击期结束前死亡。156A2组中的四只动物、通过十二烷基肌氨酸钠的LgD1-TN08OMP组中的两只动物和通过SDS的LgD1-TN08OMP组中的三只动物也在攻击期过程期间死亡。接受通过十二烷基肌氨酸钠的Lg2-OK08OMP疫苗的动物无一在尸检前死亡。与攻击对照组相比较的任何差异不是统计学显著的。死亡率概括于表8中。

表8：通过处理组的死亡率

死亡率报告为在观察到此类事件的每天时在每组中的死亡数目。百分比代表受累处理组的比例。

当与攻击对照组相比较时，由通过分离物Lg2-OK08(13.72％,p＝0.045)和分离物LgD1-TN08(14.14％,p＝0.037)的十二烷基肌氨酸钠提取生成的OMP组成的疫苗显示在总肺病理学中的显著减少(28.37％)。使用分离物LgD1-TN08的SDS提取生成的OMP疫苗(16.22％,p＝0.114)显示对于组观察到的平均肺病理学减少中的相似趋势。然而，由于组内的变化，损害得分未观察到显著不同于攻击对照组。当与攻击对照组相比较时，通过TritonX 100提取的156A2抗原(25.36％,p＝0.814)未显示肺病理学中的差异。肺病理学百分比概括于图6中。

肺组织的组织学检查与细菌性肺炎一致。气道塞、水肿、胸膜炎、坏死(necorsis)和肺不张的存在也在所有组中的动物中报告，但在攻击对照组中最严重。预期在疫苗接种组中的这些发现的存在，因为用于这种检查的样品得自损害边缘。这未给出在个别动物中观察到的总体病理学的指示，并且仅应视为指示攻击再次是成功的。

C.结论

当与攻击对照动物相比较时，使用通过来自睡眠嗜组织菌分离物(与攻击分离物同源(Lg2-OK08,p＝0.045)或异源(LgD1-TN08,p＝0.037))的十二烷基肌氨酸钠提取制备的材料的二剂量疫苗接种显示总肺病理学中的显著降低。使用异源分离物LgD1-TN08的SDS提取的相同疫苗接种时间表显示在总肺病理学中的相似降低，但由于组内的可变性，在该研究中未观察到是显著的(p＝0.114)。当与对照组相比较时，通过Triton-X提取制备的156A2抗原未显示总肺病理学中的差异(p＝0.814)。总肺病理学继续是用于功效比较的最有关参数。还应注意到在该研究中使用的400ug蛋白质/剂量低于其中使用156A2抗原的实际商业疫苗的效力标准。增加蛋白质浓度或使用常规、更免疫感受态的小牛可以改变在该研究中观察到的结果。

衍生自十二烷基肌氨酸钠提取的材料的疫苗已使用十二烷基肌氨酸钠不溶性团块以及十二烷基肌氨酸钠可溶性上清液的组合进行配制，因为在团块自身内的蛋白质得率对于疫苗接种仍是不足够的。蛋白质印迹分析显示相似分子量的免疫反应性蛋白质存在于两种级分中。应完成进一步工作，以在增加总蛋白质得率的尝试中改善该过程的效率，并且增加在不溶性团块中沉积的蛋白质的量。用于这种提取方法的超声处理和离心的方法可以是可能的改善点。

当通过SDS-PAGE分开并实施蛋白质印迹分析时，SDS提取方法是更有效的，但产生不同蛋白质概况。虽然可以观察到与十二烷基肌氨酸钠制剂相似的条带，但它们在总制备物中稀释得多，并且还观察到重要性未知的几种其他蛋白质。这可以导致在接受SDS提取物疫苗接种的动物中的肺病理学中观察到的降低，以及在组内的成功的可变性。

虽然当使用同源十二烷基肌氨酸钠提取物疫苗(Lg2-OK08)时，研究2也显示在观察到的抑郁症、用力呼吸、总临床体征和死亡率中的显著降低，但这在目前研究中未见到。接受Lg2-OK08的十二烷基肌氨酸钠提取物的组在目前研究中未展示任何死亡率，这与先前观察一致。所有其他研究组显示在攻击后在14.3％(Lg2-OK08的十二烷基肌氨酸钠提取)和26.7％(156A2的Triton-X提取)之间的死亡率。虽然临床体征不是目前用于这些研究中的疫苗比较的主要参数，但一致临床体征和死亡率的产生对于涉及疫苗比较的任何未来工作将是有益的。

检查的其他参数包括直肠温度、通过培养和q-PCR的睡眠嗜组织菌回收和注射部位反应比较。这些无一显示在组中的任何显著差异。具有相似的回收和PCR检测并不出乎意料，因为这些测试的目的是用于证实损害中睡眠嗜组织菌的存在，与其损害牵涉百分比无关。虽然睡眠嗜组织菌回收低于先前研究中观察到的，但它对于所有组更低，提示攻击跨越组是一致的。虽然研究2指示新鲜肺样品的冷冻不影响睡眠嗜组织菌回收，但冷冻/解冻可能对回收具有负面影响。因此，当对于来自肺组织的细菌的成功回收可能时，推荐未来研究使用新鲜(非冷冻)肺的拭子。必须指出虽然q-PCR用于检测，但结果待就存在或不存在进行定性解释，并且C_t值不是用于检测到的细菌量的精确定量测量，因为测定法仍未得到验证。

实施例4：通过十二烷基肌氨酸钠和SDS方法提取的OMP级分的功效

D.目的

十二烷基肌氨酸钠提取的OMP疫苗继续显示通过研究3中的呼吸道攻击引起的在肺叶病理学中的显著减少，然而，提取过程自身继续是无效的。通过修改超声处理步骤以改善细胞裂解并修改离心步骤以改善可溶性和不溶性级分的分离，实现更高的总得率和在最终不溶性级分中更高浓度的蛋白质。因为先前功效已基于占优势地由不溶性级分组成的疫苗接种，但重要的是分开检查这些级分的功效。另外，SDS提取方法产生在研究3中的总肺得分中的明显减少，然而，这未发现是统计学显著的。再测试这种疫苗候选物视为重要的。

E.材料与方法

细菌分离物

分离物LgD1-TN08用于制备用于该研究的所有疫苗原型。关于这种分离物的培养物生长和SDS提取方法等同于研究3中使用的操作。关于这种分离物的十二烷基肌氨酸钠提取方法的变化在下文描述。分离物Lg2-OK08用于制备用于该研究的攻击材料。攻击材料的生长、收获和制备等同于所有先前研究中使用的操作。

十二烷基肌氨酸钠提取

用于该研究的十二烷基肌氨酸钠提取方法在增加总蛋白质得率和增加分离最终制剂中的不溶性蛋白质效率的尝试中进行修改。为了增加总蛋白质得率，使用直接插入培养物内的探针而不是使用如先前完成的牛角杯完成超声处理。这导致改善的细胞裂解，如通过BSA Total Protein Assay(Thermo)证实的，在17k x G离心步骤后将更多膜结合的蛋白质释放到上清液内，比较两种制备方法的上清液中的蛋白质浓度(数据未示出)。为了改善不溶性蛋白质分离的效率，所有需要超速离心的步骤使用70Ti固定角转头而不是先前已使用的SW28浮桶式转头进行。固定角转头允许更有效沉降。这两种修饰导致所需效应。使用仅十二烷基肌氨酸钠不溶性级分或仅十二烷基肌氨酸钠可溶性级分，对于分开疫苗的制剂获得足够的蛋白质得率。还制备两种级分的组合，以允许与用于先期研究中的疫苗制剂比较。

小牛

六十八只初乳剥夺的小牛得自J&R Livestock(Iowa)，它们通过耳切口就BVDV的持续性感染，通过鼻拭子的q-PCR就牛支原体的持续性感染测试为阴性，并且仍未接受任何睡眠嗜组织菌疫苗接种。在第一次疫苗接种时小牛年龄范围为36到50天，在攻击时具有90天的平均年龄。在研究起始前，所有小牛通过主治兽医在Sioux Center,IA的BIVI研究农场现场测定为处于良好健康。动物根据实验室操作喂养对于其年龄和重量适当的日粮。水借助于对每个围栏可接近的橡胶容器可随意获得。小牛随机指定至五组中的每一组，并且随后指定至以每组十个排列的围栏。攻击前一天，将所有小牛再次随机指定至新围栏，以充当应激物。

疫苗接种和攻击

在第0天和第21天时，在含有400ug总蛋白质的2.0mL剂量中SQ施用疫苗接种。攻击对照组接受仅含有无菌PBS(Gibco)和弗氏不完全佐剂(Sigma)的相似注射。攻击在第42天时发生，并且由在具有5％FBS的RPMI-1640培养基中稀释的睡眠嗜组织菌分离物Lg2-OK08的新鲜培养物组成，以含有在20.0mL体积中经由内窥镜气管内施用的1.0x10⁹CFU/mL，随后为用具有5％FBS的RPMI-1640培养基的20.0mL洗涤。疫苗接种和攻击时间表连同组大小和剂量在表9中描述。

临床观察

攻击后，每天观察临床体征和贮存温度，共七天。尽管观察所有身体系统，但特别关注呼吸窘迫的体征。显示严重呼吸窘迫的体征，变得不能站立，或如果没有帮助不能到达食物和/或水的动物，由于人道原因而实施安乐死并进行尸检。所有剩余动物在攻击后七天时实施安乐死并进行尸检。在尸检时，通过主治兽医记录每个肺叶中存在的肉眼病理学和肺病理学百分比。收集由来自损害边缘的组织和良好组织组成的肺样品。每只小牛收集两个样品，并且贮存于冰上直至递送至实验室用于测试时。来自每只小牛的另外样品在10％福尔马林中固定用于组织病理学检查。

表9：实验设计

细菌回收

尸检后的肺样品贮存于4℃下直至它们可以进行加工时。将这些样品在明火上烤焦，移动至无菌环境，切开并且擦拭内表面。拭子用于划线培养CBA平板(Remel)，所述CBA平板在37℃下伴随10％CO₂温育过夜，以验证外来试剂的不存在。随后对拭子实施DNA提取和PCR，以验证睡眠嗜组织菌的存在。

PCR

为了验证来自受感染肺的拭子的睡眠嗜组织菌的存在，对拭子实施DNA提取(Qiagen DNA试剂盒)，并使用如关于研究1描述的对于睡眠嗜组织菌16S基因特异性的引物，通过q-PCR测试睡眠嗜组织菌DNA的存在。使用CFX-96Thermocycler(Bio-Rad)与Bio-Rad Master Mix、0.4ug/uL牛血清白蛋白(BSA)和一组过程中对照引物，在25uL体积中在96孔形式中进行PCR，以验证每个孔中的反应的效力。睡眠嗜组织菌DNA的标准曲线在每块平板上运行。进行在95.0℃下五分钟的初始活化步骤，随后为在95.0℃下十五秒变性和在60.0℃下三十秒退火/延伸步骤的四十五个循环，伴随在每个循环结束时探针荧光的实时捕获。使用Bio-Rad CFX软件捕获并分析数据。样品一式两份运行，并且平均阈值循环(C_t)与标准相比较，以测定每种样品是阳性的还是阴性的。在样品具有一个阳性孔和一个阴性孔的情况下，样品一式三份地再运行，通过其结果在>50％的测试孔中表示测定阳性的最终测定。

组织病理学

在10％福尔马林中固定的肺样品就组织病理学检查进行评估。使用0-4的评分系统。得分0指示无显微损害，1指示轻度或局灶性损害，2指定中等或多局灶性损害，3指定严重或扩散的显微损害，并且4指定严重、扩散的显微损害。

结果

所有处理组的直肠温度再次观察到在攻击后当天增加大约三度。未接种疫苗的对照组观察到经过攻击期过程维持最高平均直肠温度。所有疫苗接种组均显示经过相同时帧在平均直肠温度中的降低，然而，用十二烷基肌氨酸钠提取的级分的组合或SDS提取物接种疫苗的组在其平均直肠温度减少中更显著和一致。直肠温度观察概括于图7中。

当利用冷冻样品时，来自新鲜肺组织的睡眠嗜组织菌的回收增加超过先前研究中观察到的那种。在处理组中未注意到显著差异，尽管活回收在未接种疫苗的对照组中最高。这些观察概括于表10中。

表10：来自受攻击动物的睡眠嗜组织菌检测

百分比指示通过对于16s rRNA基因特异性的q-PCR提供睡眠嗜组织菌的成功检测的每组比例。

表5.3：通过处理组的死亡率

死亡率报告为在观察到此类事件的每天时在每组中的死亡数目。百分比代表受累处理组的比例。在第45、46或48天时没有动物死亡。

在先前研究中观察到的常见临床体征包括呼吸困难、咳嗽、抑郁症和厌食症。对于目前研究，这四个参数在0–3的量表上标准化，指示在给定日时的体征严重性。在对照组中观察到最高数目的临床体征和最高严重性。由于评分系统的顺序性质，在组中未注意到统计学显著的差异。

对照组中的四只动物在攻击期结束前死亡。十二烷基肌氨酸钠团块组中的一只动物、十二烷基肌氨酸钠组合组中的两只动物和SDS组中的一只动物也在攻击期过程期间死亡。接受十二烷基肌氨酸钠上清液疫苗的动物无一在尸检前死亡。与攻击对照组相比较的任何差异不是统计学显著的。死亡率在表11中描述。

表11：通过处理组的死亡率

死亡率报告为在观察到此类事件的每天时在每组中的死亡数目。百分比代表受累处理组的比例。在第45、46或48天时没有动物死亡。

关于该研究的疫苗功效比较的主要参数仍是肺叶病理学百分比。发现用十二烷基肌氨酸钠不溶性级分接种疫苗的一只动物缺乏右颅叶。因为该叶仅仅由于解剖学异常而不存在，并且无法给出完全得分，所以该动物从分析中去除。未接种疫苗的对照具有31.02％的平均肺病理学得分。通过用十二烷基肌氨酸钠可溶性上清液(19.70％,p＝0.05)，十二烷基肌氨酸钠可溶性和十二烷基肌氨酸钠不溶性级分的组合(17.08％,p＝0.02)，或SDS提取的OMP(8.60％,p<0.01)的疫苗接种来实现肺病理学中的显著减少。用十二烷基肌氨酸钠不溶性团块材料的疫苗接种显示肺病理学中的轻微降低，但不产生显著减少(22.98％,p＝0.11)。该数据概括于图8中。

样品再次提交用于组织病理学检查。气道塞、小叶间水肿、坏死和肺不张的观察；全部与细菌性肺炎一致再次在跨越所有组中的动物中观察到，然而，测定为在攻击对照组中最严重，并且在SDS提取的OMP疫苗中最不严重。

结论

当与未接种疫苗的对照相比较时，含有十二烷基肌氨酸钠可溶性材料或使用SDS提取的OMP材料的二剂量疫苗接种提供了在总肺病理学中的统计学显著的减少。仅接受用十二烷基肌氨酸钠不溶性材料的疫苗接种的动物显示总肺病理学中的降低，但这未发现是统计学显著的。

当与实施例3相比较时，通过q-PCR的睡眠嗜组织菌检测和通过培养肺样品的活睡眠嗜组织菌回收在目前研究中都是更有效的。

在目前研究中，肺样品在实验室操作前维持在4℃下而不是冷冻。在组中未注意到在检测或活回收中的显著差异；然而，两者在未接种疫苗的组中均是最高的。

在研究的攻击期过程中每天记录疾病的临床体征，包括直肠温度、呼吸困难、咳嗽、抑郁症和厌食症。当与未接种疫苗的对照组相比较时，用SDS提取的抗原的疫苗接种导致在第44天(攻击后两天)时开始的显著更低的直肠温度，并且继续通过在第49天时的研究终止。当比较观察到的临床体征的存在或严重性时，在组中未注意到其他显著差异。

该数据集指示SDS和十二烷基肌氨酸钠提取方法均获得蛋白质，所述蛋白质提供针对用睡眠嗜组织菌的呼吸道攻击的有效免疫应答。十二烷基肌氨酸钠不溶性级分的功效缺乏指示一些东西保存在可溶性级分中，其对于在这个研究以及以前研究中观察到的功效是必需的。这是特异性蛋白质、LOS的非蛋白质组分还是十二烷基肌氨酸钠自身仍有待测定。蛋白质印迹分析将用于测定是否可以鉴定特异性免疫反应性蛋白质，其对于十二烷基肌氨酸钠级分或SDS提取物中任一种是独特的。

实施例5：监控牛抗睡眠嗜组织菌滴度的血清学ELISA

A.目的

虽然比较处理组中的最终病理学得分作为主要参数是重要的，但这未给出关于何种免疫应答实际上在疫苗接种和攻击过程期间在动物内发生的指示。因为预期MHCII应答，所以IgG活性的测量将是谨慎的。通过开发能够检测在一段时间内抗体应答中的变化的血清学ELISA，将能够测定与施用的疫苗相关的体液应答的重要性。

B.材料与方法

包被抗原

睡眠嗜组织菌分离物Lg2-OK08已用于先前研究中的攻击目的。因此必须指出针对这种分离物的抗体应答通过在攻击前施用的疫苗生成。为了实现这点，这种分离物的培养物如先前描述的在肉汤中生长。收获通过以10,000x G离心十分钟并且随后为在PBS(Gibco)中的三次洗涤来完成，其中团块在PBS中回到3X浓度，并且以10,000x G离心十分钟。在最终PBS洗涤后，培养物以3X浓度重悬浮于具有蛋白酶抑制剂的10mM HEPES中。

血清样品

每周一次从先前研究中的每只动物收集血清，并且在-40℃下贮存于～2.0mL体积/样品中。对于每个时间点，通过合并来自组中每只动物的100uL血清来生成每组的血清库。

ELISA

实验用假定阳性和阴性的血清样品来完成(对照动物在第0天时为阴性，和Lg2-OK08十二烷基肌氨酸钠OMP疫苗接种在第41天时为阳性)，其决定待使用的适当试剂浓度。报告的浓度确保读数代表来自稀释曲线的线性部分的数据。

Lg2-OK08衍生的3X包被抗原(如上所述制备)在碳酸盐包被缓冲液(Sigma)中稀释至1:300，并且以100uL/孔加入96孔培养基结合微量滴定板(Greiner)，并且在37℃下温育两小时。使用微量滴定板洗涤器(Dynex)，通过TBS+Tween 20(BIVI)的三次洗涤来洗掉未结合的抗原。孔的未占据面积随后通过添加250uL Protein Free Blocking Buffer(Thermo)进行封闭，并且在37℃下温育一小时，随后为另一个洗涤步骤。在每个时间点关于每组的血清库(研究2和3)，或来自个别动物的血清(研究4)随后在封闭缓冲液中稀释至1:1,600，并且以100uL体积加入平板上的一式两份孔，并且在37℃下温育一小时，随后为另一个洗涤步骤。兔抗牛辣根过氧化物酶缀合物(Jackson Immunolabs)随后在封闭缓冲液中稀释至1:10,000，以100uL/孔加入，在37℃下温育四十五分钟，并且洗掉过量。通过添加100uL/孔并且在室温下温育6分钟，在所述点时加入100uL 1N HCl以停止反应，使用Sureblue 1-Component Substrate(KPL)使孔显色。使用SpectraMax M5分光光度计(Molecular Devices)，在450nm处阅读吸光度。每块平板含有阴性血清标准和阳性血清标准，以允许在平板中的比较，以及无抗原和无血清对照孔，以确保在平板中的本底信号中无增加。通过将每种样品的平均吸光度除以阴性血清标准的平均吸光度，将吸光度数据转化为“信噪”比。

C.结果

实施例2

在该研究内使用的所有疫苗处理均产生在疫苗接种过程中的IgG应答增加。用商购可得的菌苗接种疫苗的组产生最不普遍的应答，而用经修饰的活缺失突变体接种疫苗的动物产生最高水平的IgG应答。OMP接种疫苗的组最快产生IgG应答。对于经修饰的活组和OMP组检测到的IgG水平在第42天攻击时几乎相同。未接种疫苗的对照不产生抗体生产中的可检测增加，但在第28天时观察到来源未确定的小增加。这种增加在研究中的以后日期时未观察到。该数据概括于图9中。

实施例3

在该研究中使用的所有疫苗再次均产生在疫苗接种过程中的IgG的可检测增加。这些水平在第14天时达到峰值，并且在第21天时下降，并且随后在当天再接种疫苗后急剧增加。峰再次在第35天时观察到，在第42天时攻击前具有小跌落。来自攻击分离物Lg2-OK08的十二烷基肌氨酸钠提取的OMP产生最高IgG应答，而156A2Triton X疫苗产生最低IgG应答。来自用来自分离物LgD1-TN08的制剂接种疫苗的动物的应答是相似的。未接种疫苗的动物未展示经过疫苗接种过程在IgG水平中的可检测增加。该数据概括于图10中。

实施例4

在该研究中的疫苗接种产生与先前研究相似的结果，具有在研究2011034中观察到的较不显著的峰。SDS提取物组产生最高的IgG应答，而所有十二烷基肌氨酸钠处理产生相似结果。未接种疫苗的对照组展示在第35天时开始的IgG应答中的增加并且继续通过第42天。在进一步审查后，这种增加可归于四只个别动物。图11中代表α＝0.1的置信区间的误差条指示在这些时间点的数据集内的极端离群值的存在。在未接种疫苗的动物中该IgG应答的原因单独基于数据无法容易解释。

D.结论

对于所有研究IgG抗体应答中的增加可以经过疫苗接种过程在疫苗接种组中观察到。该应答增加至疫苗接种后两周，并且随后开始拉平或下降，但再次通过在第21天时发生的第二次疫苗接种而增加。最高的抗体应答水平在第28天和第42天之间发生，其中明显峰在第35天时。

当攻击在所有研究中的第42天发生时，由先前峰的抗体水平的任何下降可能已影响观察到的功效。在研究3中的第35天时来自156A2Triton-X衍生的抗原的抗体应答水平类似于在第42天时在十二烷基肌氨酸钠接种疫苗的组中观察到的水平。如果生成针对疫苗制剂内的重要保护表位的这些应答，则不同评估可以随着更早的攻击而发生。看见抗体应答拉平而不是下降是更鼓舞人心的，然而，这可能是疫苗剂量太低、不适当佐剂或极其年幼的CD小牛的弱免疫系统的假象。

虽然当与其他相比较时，数据看起来显示最终研究中的突变抗体应答，必须指出用于ELISA的最终试剂原液在测试前两个研究后进行制备。这些试剂包括包被抗原和对照血清，其等分到单次使用小瓶内并贮存于-70℃下。这预期改善在一段时间内的抗原稳定性，但最初冷冻和解冻可以已降低包被抗原的结合亲和力。为此，应避免在研究之间的信噪比的直接比较，然而，在每个研究内完成的测试通过相同处理的试剂产生。

在对照组中未发生抗体检测中的增加，除在最后研究中的第35和42天时的四只动物之外。关于这些动物的抗体检测中的这种增加的原因这时是未知的，但可能是错误处理的样品、这些动物对睡眠嗜组织菌的过早暴露、或这些动物对另一种革兰氏阴性菌的暴露的结果，所述另一种革兰氏阴性菌具有与睡眠嗜组织菌相似的交叉反应性表面抗原。看起来该测定法的确能够测量在一段时间内的抗体水平差异；然而，将需要检查该测定法的特异性。该测定法测量一般的IgG应答，并且检查这些抗体的特异性也是重要的。

实施例6：免疫反应性蛋白质的蛋白质印迹分析

A.目的

虽然在第6章中描述的ELISA给出经过疫苗接种过程的总IgG应答的测量，但它未给出关于这些抗体或这些抗体针对其生成的蛋白质的特异性。完成使用来自接种疫苗的动物的血清来探测多种疫苗制剂的蛋白质印迹，以更好地鉴定在显示保护的这些制备物内存在的免疫学相关蛋白质。通过比较来自显示肺病理学中的降低的组与未显示增加的组的这种应答，应鉴定重要的蛋白质。

B.材料与方法

SDS-PAGE

在疫苗制备物中存在的蛋白质使用电泳通过分子量进行分离。使用具有单孔或十二孔配置的NuPAGE 10％Bis-Tris SDS凝胶(Invitrogen)。对于单孔凝胶，将含有12.0ug总蛋白质的样品与含有β-巯基乙醇(Sigma)作为还原剂的SDS Loading Buffer(Invitrogen)组合，并且以400uL体积装载。NovexSharp Pre-stained Ladder(Invitrogen)的10uL载量用于梯孔中。使用X-cellElectrophoresis Module(Bio-Rad)，这些凝胶在3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液(Invitrogen)中在200V下运行十五分钟。这些凝胶随后用于如下所述的膜转移和后续蛋白质印迹。对于十二孔凝胶，将含有2.0ug总蛋白质的样品与含有β-巯基乙醇(Sigma)作为还原剂的SDS上样缓冲液(Invitrogen)组合，并且以20uL体积装载。Novex Sharp Pre-stained Ladder(Invitrogen)的5uL载量用于比较。使用X-cell Electrophoresis Module(Bio-Rad)，这些凝胶也在MOPS缓冲液(Invitrogen)中在200V下运行十五分钟。这些凝胶随后用于如下所述的考马斯染色。

考马斯染色

以十二孔形式的电泳后，将凝胶浸没在Imperial Blue Gel Stain(Thermo)中，并且伴随轻轻摇动染色一小时。随后去除染剂，并且允许凝胶在RO水中脱色十二小时。将水更换两次，一次在三十分钟后，并且一次在一小时后。染色的凝胶随后使用Model M Imager(Bio-Sciences)进行成像并分析。

膜转移

以单孔形式的电泳后，将凝胶插入X-cell Blot Module(Bio-Rad)内。对PVDF膜(Invitrogen)的转移在Transfer Buffer(Invitrogen)中在30V下在室温下完成九十分钟。成功转移通过Novex Pre染色的梯的目视检查进行测定。膜随后用于如下所述的蛋白质印迹。

蛋白质印迹

在转移操作后，使PVDF膜在Protein Free Blocking Buffer(PFBB)(Thermo)中在室温下伴随轻轻振荡温育三十分钟，或在4℃下温育过夜。在封闭后，使用通过BIVI Central Services制备的含有Tween的Tris缓冲盐水(TTBS)，将膜洗涤三次，共两分钟，伴随轻轻振荡。随后将洗涤的膜转移至Mini-Prep Multi-Screen Gasket(Bio-Rad)。这个垫片提供了用于探测分开样品的二十个泳道。在第0天、第21天或第35天时来自每个研究组的血清库在PFBB中稀释至1:500，并且装载有600uL体积/孔。膜随后在室温下伴随轻轻振荡温育一小时。样品随后通过真空从垫片中取出。对于操作的剩余部分，随后将膜转移至塑料皿。将在PFBB中1:2500稀释的兔抗牛IgG(Jackson Immunolabs)加入每个膜，并且在室温下伴随轻轻振荡温育一小时，随后为另外洗涤。如通过底物的制造商说明书建议的，用TTBS的最终洗涤随后为用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的两次另外洗涤。根据制造商的说明书制备Opti-4CN Substrate(Bio-Rad)，并且加入洗涤膜中。允许底物显色五分钟，以使条带形成达到最大同时使本底降到最低。RO水用于停止反应。允许显色的印迹干燥十二小时，并且随后使用Model M Imager(Bio-Sciences)进行成像并分析。

结果

考马斯染色的凝胶给出在原型疫苗制剂中使用的多种OMP制剂级分内存在的所有蛋白质的表示，与其免疫反应重要性无关。染色揭示在十二烷基肌氨酸钠不溶性团块中大小在35kDa至40kDa之间的蛋白质的高度集中，具有在大约80kDa、60kDa、28kDa和25kDa处的较不集中的条带。具有更低浓度的不同分子量的更高数目的条带，可以在十二烷基肌氨酸钠可溶性上清液和SDS提取物级分中观察到。每个级分的概况是不同的，然而，各自显示提供先前描述的研究中的至少一种中的病理学降低。测定这些蛋白质中的哪些在这种保护中起作用通过蛋白质印迹得到促进。

实施例2

在最初功效研究中，仅OMP疫苗候选物产生显著更低的肺病理学。来自该疫苗的抗原通过SDS-PAGE分离，并且用于蛋白质印迹分析，使用来自在第0天、第21天和第35天时的研究组的血清库。在该研究中的攻击对照组在测试的时间点中任一个时未显示抗体应答。所有疫苗接种组均产生在80kDa和18kDa处的反应性条带。因为当与对照相比较时，这些在肺病理学中未显示差异的组中观察到，所以它们看起来不是免疫学重要的。关注的是在35kDa–40kDa范围内的蛋白质检测，其仅在OMP疫苗接种组中观察到。

实施例3

在第二个疫苗接种研究中，进行提取方法和分离物的比较。攻击对照组再次观察到经过疫苗接种过程不产生抗体应答。同样地，不产生肺病理学减少的用分离物156A2的SDS提取接种疫苗的组，显示在抗体应答中可忽略不计的增加。用分离物Lg2-OK08的十二烷基肌氨酸钠提取物、LgD1-TN08的十二烷基肌氨酸钠提取物或LgD1-TN08的SDS提取物接种疫苗的其他组显示平均肺得分中的相似减少，并且再次展示针对在35kDa–40kDa范围内的蛋白质的高浓度的抗体应答。

实施例4

最终宿主动物功效研究检查十二烷基肌氨酸钠提取物的可溶性和不溶性级分，这些级分的组合(如已用于先前研究中的)，并且再检查SDS提取方法。用于该研究的所有疫苗由分离物LgD1-TN08生成。对于该研究，疫苗制剂各自经由SDS-PAGE进行分离，并且再次使用第0、21和35天，用来自研究组的血清库进行探测。用十二烷基肌氨酸钠不溶性团块的疫苗接种产生在肺病理学中的轻度减少，其未发现与对照组是统计学显著的。观察到这种疫苗产生相似的结合模式，如在来自先前研究的印迹中观察到，具有在80kDa和18kDa处的不重要条带。然而，它还产生在35-40kDa范围中的条带，其通过先前检查视为免疫学重要的(图7)。还应指出尽管经由在研究4中的第35天和第42天时的对照动物血清库的ELISA测试观察到增加的IgG水平，但蛋白质印迹不反映该结果。虽然在ELISA中检测到与在全细胞包被制剂中存在的睡眠嗜组织菌抗原结合的IgG，但这些对于疫苗中存在的任何抗原均不是特异性的。

当十二烷基肌氨酸钠可溶性级分经由电泳分离并用相同血清库探测时，大多数35-40kDa反应性缩小。观察到更高和更低分子量的表面上不重要的蛋白质，然而，如同在80kDa和18kDa处的那些，这些是所有疫苗组共同的，与观察到的功效无关。一个条带仅在十二烷基肌氨酸钠不溶性级分和SDS提取物疫苗接种中观察到，具有40kDa的近似分子量。这些条带的强度再次看起来经过研究的疫苗接种期的过程而增加。

当对SDS提取物实施相同蛋白质印迹操作时，当与用十二烷基肌氨酸钠不溶性级分观察到的相比较时，在35kDa-40kDa范围内的反应性再次减少。类似于十二烷基肌氨酸钠可溶性级分，检测到具有更高或更低分子量的几种蛋白质，与处理组无关。几个条带是SDS疫苗接种独特的，大小在40kDa至80kDa之间。如用可溶性级分的印迹观察到的，观察到大小大约40kDa的蛋白质在十二烷基肌氨酸钠可溶性级分以及SDS级分中反应，并且可以与观察到的功效直接相关。

C.结论

通过设计为鉴定免疫学重要的蛋白质的蛋白质印迹检查，所述蛋白质在疫苗接种期间生成IgG应答，鉴定了几种免疫反应性蛋白质。与所有组一致，与疫苗功效无关，是估计分子量分别为80kDa和18kDa的蛋白质。虽然针对这些蛋白质产生抗体，但它们单独看起来不是保护性的。产生肺病理学中的显著减少的疫苗全部共享与在35kDa至40kDa范围内的蛋白质反应的抗体的产生。当用于探测含有十二烷基肌氨酸不溶性材料的疫苗时，然而，其中该条带是最浓缩的十二烷基肌氨酸不溶性级分单独不赋予保护。在减少肺病理学中均观察到有效的十二烷基肌氨酸可溶性级分和SDS提取方法，产生独特的大小大约40kDa(尽管更低强度)的条带，连同在多种分子量处观察到的多重其他弱条带，其在十二烷基肌氨酸不溶性级分中未特异性看见。

实施例5

通过在10％三氯乙酸中在4℃下温育30分钟，随后以20,000xG离心5分钟，来沉淀来自分离物LgD1-TN08的SDS提取的OMP。蛋白质团块在冰冷的丙酮中洗涤两次，并且随后使用8M尿素、2％CHAPS和100mM DTT的溶液重悬浮。并非来自提取物的所有蛋白质在这种悬浮液中都是可溶的，但使用来自用提取物接种疫苗的动物的血清的后续SDS-PAGE分离和蛋白质印迹揭示已回收三种免疫学相关的蛋白质。从染色的PVDF膜中切除具有41、38和23kDa的近似分子量的蛋白质条带，并且提交给在Iowa StateUniversity的蛋白质实验室用于埃德曼N末端测序。测序结果随后插入BLAST分析内，以测定与先前测序的蛋白质的同源性。

测序结果指示41kDa蛋白质与睡眠嗜组织菌分离物2336和129Pt的纤毛亚单位(fimA)的高N末端同源性，并且可能与菌毛形成和/或分泌机制相关。这种蛋白质还与杜氏嗜血杆菌和流感嗜血杆菌的pilA蛋白质同源。在用来自LgD1-TN08分离物的SDS提取的OMP接种疫苗的动物中的有效应答已与针对这种蛋白质的IgG应答的诱导关联。

发现38kDa蛋白质与孔蛋白ompA具有高N末端同源性，所述ompA已证实在巴斯德菌科的许多成员中是高度保守的。再次，由来自LgD1-TN08提取物的SDS提取的OMP组成的疫苗功效已与针对这种蛋白质的IgG应答的诱导关联。

23kDa蛋白质与Hs_0779最紧密联系，所述Hs_0779是仅通过来自睡眠嗜组织菌分离物129Pt的基因组学数据表征的假定蛋白质。这种蛋白质的功能先前未得到描述。针对这种蛋白质的IgG应答已由用来自LgD1-TN08提取物的SDS提取的OMP接种疫苗的动物观察到，然而，这种应答已在所有疫苗接种中发生，与疫苗功效无关。

BLAST结果如下提供：

样品：Hs_LGD1_061812-1

注释：观察到～41kDa免疫反应性OMP与概念证明OMP疫苗研究中的功效关联

序列：ELMIVVAIIGILAGIAIPQYQLG

BLAST结果

E值＝4e^-11：睡眠嗜组织菌2336和129Pt的纤毛亚单位(fimA)

fimA怀疑为菌毛组分或分泌机制的一部分

与通过杜氏嗜血杆菌和流感嗜血杆菌及许多其他展示的pilA同源

样品：Hs_LGD1_061812-2

注释：观察到～38kDa免疫反应性OMP与概念证明OMP疫苗研究中的功效关联

序列：APQANTFYAGA？L

BLAST结果

E值＝1e^-6:ompA

在巴斯德菌科中高度保守的孔蛋白充当小亲水分子的非特异性通道

样品：Hs_LGD1_061812-3

注释：在所有疫苗接种动物中观察到～23kDa免疫反应性OMP，与功效无关

序列：SINIAPQITEILAINGL？Q？

BLAST结果

E值＝0.19：睡眠嗜组织菌129Pt的假定蛋白质Hs_0779

许多细菌共有的保守蛋白质未得到表征和功能未知

Tblast N 8/11

钙转运蛋白

根据本公开内容无需过度实验，可以制备并执行本文公开和请求保护的所有组合物和方法。虽然本发明的组合物和方法已根据优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对组合物和方法以及本文描述的方法的步骤或步骤顺序施加变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的某些试剂可以取代本文描述的试剂，同时将实现相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似取代物和修饰视为在如通过下述权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

在说明书中引用的所有参考文献均在此引入作为参考。

下述参考文献特异性引入本文作为参考，其程度至它们提供补充本文所述那些的示例性操作或其他细节。

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Claims (13)

1.一种免疫原性组合物，其包含至少一种外膜蛋白(OMP)睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)肽和生理学可接受的媒介物，其中所述OMP睡眠嗜组织菌肽对睡眠嗜组织菌有免疫反应性。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述生理学可接受的媒介物选自药学或兽医学可接受的载体、佐剂或其组合。

3.权利要求1的免疫原性组合物，其包含PTA-12755、PTA-12756及其组合。

4.一种引发针对睡眠嗜组织菌感染的免疫应答的方法，其包括给受试者施用权利要求1的免疫原性组合物。

5.一种减少与睡眠嗜组织菌感染相关的临床体征的发病率或严重性的方法，其包括给有此需要的受试者施用权利要求1的免疫原性组合物，其中所述临床体征的发病率或严重性相对于未接受所述免疫原性组合物的受试者减少至少10％。

6.权利要求5的方法，其中所述临床体征选自用力或急促呼吸、咳嗽、厌食症、抑郁症或昏睡、鼻和眼分泌物、以及死亡。

7.权利要求5的方法，其中所述受试者是选自牛或绵羊的动物。

8.一种制备权利要求1的免疫原性组合物的方法，其包括使至少一种OMP睡眠嗜组织菌肽与生理学可接受的媒介物混合。

9.一种诊断受试者中的睡眠嗜组织菌感染的方法，其包括提供至少一种OMP睡眠嗜组织菌肽，使所述睡眠嗜组织菌肽与得自所述受试者的样品接触，并且如果在所述样品中检测到能够结合所述睡眠嗜组织菌肽的抗体，则将所述受试者鉴定为具有睡眠嗜组织菌感染。

10.一种试剂盒，其包含至少一种OMP睡眠嗜组织菌肽、免疫原性载体、用于包装所述OMP睡眠嗜组织菌肽和免疫原性载体的容器、一套印刷说明书；和能够将疫苗施用于动物的分配器。

11.一种用于制备权利要求1的免疫原性组合物的试剂盒，其包含(i)所述OMP睡眠嗜组织菌肽和(ii)所述生理学可接受的媒介物，其中(i)和(ii)分开包装。

12.权利要求11的试剂盒，其进一步包含试剂盒的使用说明书。

13.权利要求11的试剂盒，其进一步包含分配器。