CZ2010540A3 - Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat - Google Patents
Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010540A3 CZ2010540A3 CZ20100540A CZ2010540A CZ2010540A3 CZ 2010540 A3 CZ2010540 A3 CZ 2010540A3 CZ 20100540 A CZ20100540 A CZ 20100540A CZ 2010540 A CZ2010540 A CZ 2010540A CZ 2010540 A3 CZ2010540 A3 CZ 2010540A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- recombinant
- vaccine
- polypeptide
- immunoprotective
- universal vaccine
- Prior art date
Links
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 50
- 241000282887 Suidae Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 title description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract 26
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 8
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 claims description 8
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150051095 apxIA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150095556 tbpB gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims 14
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 14
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 14
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 7
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 241001478285 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 2 Species 0.000 description 4
- 241001258963 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 7 Species 0.000 description 4
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 4
- LMDKAEWBVKHXMN-QAMPPYGQSA-N rapx Chemical compound C([C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@@]2(O)[C@H](C)CC[C@H](O2)C[C@@H](C(=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)C(C)C[C@@H](C)C(=O)C1)/C)OCC)C1=CC=C(O)C(OC)=C1 LMDKAEWBVKHXMN-QAMPPYGQSA-N 0.000 description 4
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 201000006465 actinobacillosis Diseases 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100021590 Bcl-2-like protein 10 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 101000971082 Homo sapiens Bcl-2-like protein 10 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100148258 Actinobacillus pleuropneumoniae apxID gene Proteins 0.000 description 1
- 241000122975 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1 Species 0.000 description 1
- 241000178944 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 5 Species 0.000 description 1
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100379376 Caenorhabditis elegans apx-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101100245206 Dictyostelium discoideum psmC4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000005119 Necrotizing Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000606752 Pasteurellaceae Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108010062476 Transferrin-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010912 Transferrin-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 101150115143 shroom2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Rešení zahrnuje konstrukci, produkci, purifikaci a využití universální vakcíny pro profylaxi a kontrolu infekcí vyvolaných bakterií Actinobacillus pleuropneumoniae u prasat. Podstata vakcíny spocívá v prítomnosti jednoho nebo více rekombinantních polypeptidu, pripravených insercí príslušného genu z Actinobacillus pleuropneumonie do expresního vektoru, expresí v Escherichia coli a následnou purifikací. Rešení dále zahrnuje využití takovýchto rekombinantních proteinu jako antigenu umožnujících detekci specifické protilátkové odpovedi a rovnež jejich využití jako specifických imunogenu k imunizaci cílového druhu zvírat nebo ruzných druhu experimentálních zvírat za úcelem získání vysoce specifických hyperimunních sér. Tato séra mohou být dále využita v širokém spektru diagnostických metod urcených k detekci proteinu specifických vuci uvedeným postupem pripraveným hyperimunním sérum, s možností jejich následného využití v rámci praktické diagnostiky nebo experimentálního vyšetrování.
Description
Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktorů virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat
Oblast techniky
Vynález se týká konstrukce, produkce a purifikace universální vakciny pro profylaxi a kontrolu Actinobacillus pleuropneumonie u prasat a možností její aplikace, jakož i využiti vymezených rekombinantních proteinů jako diagnostických antigenů a specifických imunogenu.
Dosavadní stav techniky
Actinobacilová pleuropneumonie prasat je v posledních 25 letech celosvětově považována za jedno z onemocněni způsobujících největší ekonomické ztráty v chovech prasat. Původcem tohoto vysoce nakažlivého onemocnění charakterizovaného fibrinohemoragickou nekrotizujici pneumonii je Actinobacillus pleuropneumoniae, malá gramnegativní tyčinka patrici do rodiny Pasteurellaceae. Onemocněni může vyvolat fatální pneumonii či perzistovat v chronické klinické či subklimcké formě, což má za následek sníženi produkce a zvýšeni nákladů na léky a vakcinaci. Kmeny A pleuropneumoniae se dělí do 15 sérotypů (Blackall, P.J., Klaasen, H.L., van den Bosch, H., Kuhnert, P. & Frey, J Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: serovar 15. Vet Microbiol 2002, 84(1-2), 47-52), jejichž serologická specificita je dána kapsulárními polysacharidy a celulárními lipopolysacharidy (LPS).
Mezi nejznámější extraceíulární produkty A. pleuropneumoniae patří čtyři proteiny náležející do rodiny tzv. RTX (Repeat in ToXin) proteinů. ApxlA je silný hemolyzin o velikosti 113 kDa, přítomný u sérotypů 1, 5, 9, 10 a 11. Je kódován operonem apxl, který tvoří geny apxlC, apxlA. apxlB a apxID Apxli je hemolyzin o velikosti 105 kDa. Nachází se u všech známých sérotypů, kromě sérotypů 10 a je Kódován operonem apxll ApxlllA. nehemoiytický cytotoxin o velikosti 115 kDa, kódovaný operonem apxlll. je produkovaný sérotypy 2. 3, 4, 6 a 8 (Frey, J. Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins. Trends Microbiol 1995 3(7), 257-261: Frey, J., Beck. M., Stucki, U. & Nicolet, J. Analysis of hemolysin operons in Actinobacillus pleuropneumoniae. Gene 1993. 123(1), 51-58; Kamp, E.M . Pop:ca
J.K.. Anakotta, J. & Smits, M.A Identification of hemolytic and cytotoxic proteins of ActmobaciHuú pleuropneumoniae by use of monoclonal antibodies. Infect Immun 1991, 59(9). 3079-3085; Inzana. T.j . Todd. J.. Ma. J.N. & Veit. H Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection. Micmb Pathog 1991. 10(4). 281-296).
• · • · « · · · · · · · · · ·· ·♦ ♦ ·♦* ··
Čtvrtý protein (ApxIVA) je produkován všemi sérotypy A pleuropneumoniae, a ačkoli bylo ukázáno že kmeny A pleuropneumoniae s deletovaným genem pro ApxIVA jsou zcela avirulentm, jeho role v patogenezi onemocněni zůstává nejasná (Schaller. A., Kuhn, R , Kuhnert, P et al Characterizařicn of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology 1999. 145 ( Pt 3) 2105-2116; Schaller, A., Djordjevic, SP., Eamens, G.J et al Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR based on the gene apxIVA. Vet Microbiol 2001,79(1), 47-62; Cho, W S. & Chae, C Expression of the apxIV gene in pigs naturally infected with Actinobacillus pleuropneumoniae. J Comp Pathol 2001, 125(1), 34-40).
K nákaze dochází obvykle aerosolem nebo přímým kontaktem. A. pleuropneumoniae ad hecuje na epitel dolních cest dýchacích a spoušti expresi Apx proteinů. Následné je rychle fagocytován plicnimi alveolárnimi makrofágy. Všechny Apx proteiny jsou pro alveolárni makrofágy, buňky endotelu a alveolárni epitel prokazatelně (Frey J., Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins Trends Microbiol. (1995) 3:257-261) či potenciálně (Cho W.S., Chae C., Expression of the apxIV gene in pigs naturally infected with Actinobacillus pleuropneumoniae J. Comp. Pathol. (2001) 125:34-40: Schaller A., Kuhn R.. Kuhnert P., Nicolet J., Anderson T.J., Maclnnes J 1 , et al.. Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae, Microbiology (1999) 145 21052116) toxické. Mikroorganismy jsou proti likvidaci v makrofázich chráněny kapsuli a jsou rovněž odolné proti účinkům komplementu. Následkem infekce lze v alveolárni tekutině detekovat vysoké hladiny prozánětlivých cytokmů (IL — 1 β a IL - 8) a též tumor-nekrotizujicího faktoru (TNF). Apx toxiny (Apxl-lliA) a hostitelem-produkované cytokiny nesou hlavní podíl na vzniku zánětu a tvorbě lézi. k jejichž vzniku během infekce v plicnim epitelu dochází (Fenwick B.. Osburn B., Immune responses to the lipopolysaccharides and capsular polysaccharides of Haemophilus pleuropneumoniae in convalescent and immunized pigs, Infect. Immun. (1986) 54:575-582). Klinické příznaky se liší podle stáří zvířat, stavu jejich imunity, podmínek prostředí a stupně expozice vůči infekčnímu agens Průběh může být perakutni, akutní nebo chronický (Fenwick B, Henry S., Porcine pleuropneumonia, J. Am. Vet. Med. Assoc. (1994) 204:1334-1340).
Proti actinobacilové pleuropneumonii byla vyvinuta celá řada vakcin inaktivované celobuněčné vakciny a subjednotkové vakcíny Vakcmace inaktivovanými organismy je sérotyp - specifická. Protektivní vlastnosti takové vakciny je možné zvýšit použitím dalších sérotypú A. pleuropneumoniae a použitým adjuvans. Vakcíny druhé skupiny se v současné době stále zdokonaluji a na trhu je již množství různých subjednotkových kombinaci. Vakcíny tohoto typu jsou obvykle velmi účinné proti infekci způsobené sérotypem. z něhož pocházejí antigeny užité pro přípravu vakciny a částečně účinné proti některým dalším sérotypům (Cruijsen T, van Leengoed LA, Ham-Hoffies M, Verheijden JH Convalescent pigs are protected completely against infection with a homologous Actinobacillus pleuropneumoniae strain but incompletely agaínst a heterologous-serotype strain. Infect Immun 1995 Jun 63(6) 2341-3). Všechny v současné době používané vakciny se aplikují parenterálně. zpravidla ve dvou dávkách Jsou určeny pro ochranu rostoucích prasat • ·
Experimentálně se dosáhle jisté ochrany také použitím atenuovaných. zaktivovaných celobuněčných a subjednotkových vakcin aplikovaných perorálné nebo pomoci aerosolu íHensei. A.. Huter V . Katzger, A. et al. Intramuscular ímmunization with geneticaliy inactivated 'ghosts) Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 9 protects pigs against homologous aerosol challenge and prevents carrier statě. Vaccine 2000, 18(26), 2945-2955, Huter, V.. Hensel, A., Brand, E. & Lubítz, W Improved protection against lung colonization by Actinobacillus pleuropneumoniae ghosts: characterization of a geneticaliy inactivated vaccine. J Biotechnol 2000, 83(1-2). 161-172)
K aplikaci vakcíny se obecné přistupuje v období, kdy klesá hladina mateřských protilátek Experimentálně je potvrzeno, že vakcinace provedená v tomto období významně snižuje morbiditu, mortalitu a spotřebu léčiv, nastává po ní zvýšení denního přírůstku a zlepšeni konverze živin (Wongnarkpet S. Pfeiffer Dl), Morris RS, Fenwick SG. An on-farm study of the epidemiology of Actinobacillus pleuropneumoniae infection in pigs as part of a vaccine efficacy trial. Prev Vet Med 1999 Mař 12:39(1):1-11). Dále se zlepšuje kvalita jatečního těla, redukuje se počet konfiskaci z důvodu pneumonie a také náklady na jateční zpracování jsou diky menšímu výskytu pleuritidy a perikarditidy :nžši (Beskow. P.. Robertsson. J. A., Soderlind, O. Testing of remedial measures in fattemng ptg herds affectea with subclinical infections of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, Zentralbl Veterinarmed B, 1993, Oct:40(8):549-58)
I když vakcinace vždy nezabráni vzniku iatentnich přenašečů, používá se ji jako nástroje pro sníženi incidence a zmírněni klinických projevu onemocnění (Tayíor. D. J. Actinobacilová pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae). In: Nemoci prasat 2G03. sír. 249-257) O účinnosti vakcin proti bakteriálním nákazám prasat, včetně actinobacilové pleuropneumome orasat referuje Haesebrouck. F. et ai. (Haesebrouck. F.: Pasmans, F.. Chiers. K. Maes, D. Ducaíeile. R Decostere A . Efficacy of vaccines against bacterial diseases in swine' what can we expect? Veterinář v Microbiology 100(2004) 255-268) Uvádí, že ačkoliv celobuněčné vakcíny mohou snižovat mortalitu prasat po infekci homologním sérotypem, obvykle nejsou protektivní vůči čelenži jiným serotypem. Zlepšeni účinnosti bylo dosaženo používáním subjednotkových vakcin obsahujících Apx toxiny Tyto subiednotkové vakcíny vyvolávají lepší křížovou ochranu proti různým sérotypum. pokud tyto produkuji shodné, nebo alespoň částečné shodné Apx toxiny a snižuji klinické symptomy onemocnění (Cruijsen T. van Leengoed LA, Ham-Hoffies M. Verheijden JH. Convalescent pigs are protected completely against infection with a homologous Actinobacillus pleuropneumoniae strain but incompletely against a heterologous-serotype strain. Infect Irrirnun. 1995 Jun:63(6) 2341 -3: ). Navíc bylo prokázáno, že vakcíny obsahující Apx toxiny a transferrin-binding proteiny (Tbp) vyvolávají lepší ochranu před čelenži viriHentnírni kmeny A pleuropneumoniae než pouze vakcíny vyrobené z Apx toxinu (Van Overbeke i Chiers K. Ducateile R. Haesebrouck F Effect of endobronchial chailenge with Actrcbaoiz-s otóujopneurrioniae serotype 9 of pigs vaccinated with a vaccine contairung Apx toxins and transVrz· binďng protems. J Vet Med 3 Infect Dis Vet Public Health. 2001 FebA8(1 r 15-20) ·· · · *· · · « * · v *··· · · · · · · φ · ♦ • · · · · · · »·« φ« ·« ·· · ··· »4
V nedávných studiích bylo prokázáno, že významnou roli v protekci vůči onemocněni hraji také adheziny. Některe z těchto faktoru jsou dosud velmi málo probádány. Na druhé straně bylo ukázáno, že antigen PalA (hlavni imunogenni protein vnější membrány A. pleuropneumoniae} naopak snižuje vznik protektivni imunity vůči actinobacilovému onemocněni (van den Bosch H, Frey J. fnterfeience ot outer membrane protein PalA with protective immunity against Actinobacillus pleuropneumoniae Ά· · · vaccinated pigs. Vaccine. 2003 Sep 8:21(25-26):3601-7).
O vývoji DIVA (differentiating infected from vaccinated animals) subjednotkových vakem proti infekci A. pleuropneumoniae pojednává práce Maas, A. et al. (Maas, A.. Meens. J, Baltes. N HennigPauka, Geríach. G. F: Development of a DIVA subunit vaccine against Actinobacillus pleuropneumoniae infection. Vaccine 24(2006) 7226-7237). Cílem této práce bylo vytvořit a pro vakemační účely použit vakcinačni kmen kterému chybí jeden imunogenni protein oproti příslušnému terénnímu kmeni. To umožňuje rozlišovat stáda prasat imunizovaných nebo přirozeně infikovaných určitým kmenem A pleuropneumoniae.
Různé studie tedy ukazují, ze Apx toxiny jsou základní komponentou do značné míry se podílející na účinnosti vakcíny, aie je zřejmé, že nejsou jedinými faktory souvisejícími s navozením protektivni imunity. Vysvětlení muže být v samotné patogenezi actinobacilové pleuropneumonie kdy jedním z prvních kroku kolonizace dolních cest dýchacích je adheze A pleuropneumoniae na epiteliátni buňkv termináinich bronchiolu a alveolú, která umožňuje bakterii uvolnit toxiny přímo na povrch hostitelské buněčné membrány a její následnou destrukci dokonce i v přítomnosti neutralizačních protilátek indukovaných vakcinaci To ukazuje, že toxiny produkované adherujícímt bakteriemi na rozdíl od neadherujících bakterii, jsou cílené více efektivně a jsou relativně nepřístupné k neutralizaci protilátkami Zvýše uvedeného mechanismu vyplývá, že protektivni vakcíny by měly kromě antigenů Apx obsanovat navíc i další antigeny - adheziny. Výzkumy potvrzující význam LPS v adherenc; A pleuropneuoniae naznačují, že adheziny mohou být dobrými kandidáty ve složeni vakcín.
Dalšími významnými faktory virulence a částečně protektivními antigeny A. pleuropneumoniae isou transferrin-binding lípoproteiny (Tbp), k jejichž produkci dochází v růstovém prostředí s limitcvaným obsahem železa (Baltes N . Hennig-Pauka, I., Gerlach, G F Both transferrin binding proteins are ·. i ...i:.:nze factors m Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 infection. FEMS Microbiol Lett FEMS V.icrobiol Lett. 2002 Apr 9:209(2):283-7) Protektivita emulse obsahující transferrin-binding lípoproteiny 1 bpB získané ze sérotypu 2 a 9 A. pleuropneumoniae byla úspěšně ověřena na prasatech (Goethe R. Gor.záies OF Lindner Γ. Gerlach GF A nevel stratégy for protective Actinobacillus pleuropneumoniae subímír vaccines. detergent extraction of cultures induced by iron restriction. Vaccine 2000 Nov 22 19(7966-75) *·*·
* » · · · · · · • · · · · · ·« ♦ * · · · ·
Na základě současného stavu poznáni je možno konstatovat, že pro výrobu bezpečné ě účinné vakcíny proti actinobacilové pleuropneumonii prasat je rozhodující standardizovaný obsah vvem-rycn imunogenu, a to především obsah ApxlA, ApxliA. ApxillA a ApxIVA a dalších imunogenu přA-irryrm < -3 povrchu bakteriální buňky (OMP, LPS: Tbp, kapsuiárni antigeny a další)
V současné době jsou vakcíny proti actinobacilové pleuropneumonii prasat vyráběny z vybraných vakcinačnich kmenu původce A pleuropneumoniae s vysokou expresi dominantních faktoru virulence Tyto kmeny jsou kultivovány ve fermentorech a pomnožená bakteriální suspenze je zpracovávána s použitím metod separace, ultrafiitrace. extrakce a sterilní filtrace. Toxické substance jsou šetrně maktivovány. Výslednou složkou vakcíny jsou pak částečně puntíkované antigeny s obsahem subcelulárních frakcí povrchových antigenu a maktivovaných toxinu.
Složení, výroba a použiti vakcin proti pieuropneumonn prasat byla a je i předmětem řady patentu Jako nejvýznamnější vztahující se k dané problematice uvádíme následující'· EP 0861319 pojednává o možnosti vzniku imunity proti actirrobacilové pleuropneumonii prasat při použití RTX toxinu Apx EP 0733708 uvádí možnost použiti transferrin-bindmg proteinu 1 pro diagnostiku a prevenci actinobéc-iove pleuropneumonie prasat. O použiti iipoprotemu A vnější membrány pojednává EP 0669984 O použiti texoidu Apxl pro konstrukci vakcíny pojednává CN '511844. O použití toxoidu Apx IV pro konstrukci vakcíny pojednává EP 1518558. O použiti proteinu o molekulové hmotnosti 43 kD pro konstrukci vakcíny Dojednává US 5911996. Všeobecně o přípravě rekombinantních vakcin proti actinobacilové pleuropneumonii prasat pojednává WO 9106653. Patent WO 9926134 uvádí složení vakcíny z vybraných Apx a OSP antigenu proti actinobacilové pleuropneumonii prasat.
Podstata vynálezu
Výše uvedené patenty související s diagnostikou nebo imunoprofylaxi proti actincbac ove pleuropneumonii prasat nekolidují s předkládaným vynálezem „Konstrukce, produkce, punfikace v,už:tí i-ekombínantnich faktorů virulence A pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi prasat prc-u actinobacilové pleuropneumonii^ Zásadní rozdíl se týká zejména vlastni originální konstrukce produkce a purdikace jednotlivých rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae .A; >·'' iApxilA, rApxlilA. rApxIVA. rTbpB rApfA) k speciálnímu využiti pro specifickou diagnostiku protilátek C antigenu metodami např. ELISA či Western blot. nebo k využiti pro vysoce účinnou imunoprofylaxi prasat těmito jednotlivými rekombinantními proteiny a jejich specifiCKOu originální kombinací vůči nebezpečnému onemocněni actinobacilózou prasat.
Při Klady proveden; vynálezu'
Níže uvedené příklady slouží pouze prc ilustraci a lepši pochopení vynálezu a v žádném í. m nejsoii předkládány proto, aby limitovaly jeho rozsah a/nebo patentové nároky
Přiklad č. 1
Tento příklad provedení demonstruje ověřeni protektivity purifikovaných rekombirantnich proteinu po imunizaci pokusných myši vuč· čelenži virulentními kmeny A. pieurop.neurnomae sérotyp '! a sérotyp 11. v žádném případě však neomezuje patentová práva vztahujíc: se k tomuto patent:;
Ověřeni protektivity puntíkovaných rekombinantních proteinů po imunizaci pokusných myši vuč: čelenži virulentními kmeny A. pleuropneumoniae sérotyp 7 a sérotyp 11:
Příprava pokusných vzorků vakcin
Klonováni, exprese a purifikace rekombinantních faktorů virulence
Pomocí specifických primerů a polymerázové řetězové reakce byly amplifíkovány geny apxlA z genomové DNA (gDNA) A. pleuropneumoniae sérotyp 1. apxllA z gDNA A. pleuropneumoniae sérotyp /. apxlllA z gDNA A. pleuropneumoniae sérotyp 2 apxIVA z gDNA A pleuropneumoniae sérotyp 3. tbpB z gDNA A. pleuropneumoniae sérotyp 7 a apfA z gDNA A. pleuropneumoniae sérotyp 11, Tyto geny byly následně klonovány do komerčního vektoru pET28b (Novagen) vs fázi čtení se sekvencemi kódujícími Na C-koncovou histidinovou kotvu, umožňující purifikaci výsledných rekombinantních proteinu na afinitni matrici. Zároveň byly geny umístěny pod kontrolu transkripčních a translačních iniciačních signálu genu 10 bakteriofága T7
Výsledné piazmidy byly transformovány do expresního kmene Eschenchia coli BL.21 ;λΩΓ·3.ι z ověření růstových vlastnosti kmenu a exprese rekombinantních proteinu rApxiA. 'Άρχί’Α rAuríil·· rAnxiVA. rTbpB a rApfA byly provedeny v laboratorních podmínkách v kulturách do obiemu ' l a v ocloprovoznim měřítku ve fermentorech do objemu 50 I
Byly nalezeny a optimalizovány kultivační podmínky při teplotě 37 CC, které umožňovaly po indukci exprese pomocí IPTG produkci vysoké hladiny rekombinantních proteinu. Všechny proteiny byly produkovány do inkluzních tělisek, z nichž byly izolovány ve formě močovtnových extraktu a puntíkovaný kombinaci íontovýměnné a afinitni chromatografie.
V prvním kroku byla provedena íontovýměnné chromatografie na koloně s náplní DEAE Sepharosy, v druhém byly eluce pc první koloně obsahující daný rekombinantni protein přečištěny pomoci afinitni chromatografie na N--NTA agarose. Celistvost a čistota rApxiA. rApxliA. fAcxiiiA. 'ApxIVA. rTbpB a rApfA byly ověřeny pomoci elektroforetické separace v polyakrylamidovém gelu .SDSa identita proteinu byla potvrzena metodou Western blot Takto purifikované a idennfikovar-e p. otěry byly použity pro přípravu poKusnýcn vzorku vakcin k ověřeni jejich protektivity
K ověřeni bylo použito ve dvou pokusech celkem 400 myši plemene BALB/c o hmotnost1 18-21 g tvtyši oyiy v každém pokusu rozděleny co 10 skupin po 20 ks myši 2 skupin myši bylo imunizováno jednotlivými nebo různými kombinacemi punfikovaných rekcmoinantnich proteinu (τΑρχ'Α AnxllA,
Ί *« tMI « Φ rApxHIA rApxIVA. rTbpB rApfAj v pokusných vzorcích vakem byl vždy každý rekombirantni protein ooužit v množství 2 pg na jednu dávku Jedna skupina myši obdržela placebo - roztok imumtmiv: adjuvans bez rekombinantnich proteinu. Rekombmantni proteiny byly resuspendovány v roztoku Ai O.
J'\: .'Pokus 1). nebo olejového solvens (Emuisigen - 20%) (Pokus 2).
Aplikace byia provedena myším íntraperitoneálně v dávce 0,2 ml testovaných vzorku vakem. Za 14 dni byla provedena shodným způsobem revakcinace. Za 14 dni po revakcmaci byia provedena ntence 50 % pokusných myši bakteriálním kmenem A pleuropneumoniae sérotyp 7 a 50 myši sérotypem 11 v infekční dávce 10GLDr,;/myš/O.2 mí íntraperitoneálně Myši po infekci byly sledovány 7 ani a denně byly zaznamenávány úhyny myší v jednotlivých skupinách. Uspořádáni pokusu a dosažené výsledky jsou presentovány v Tab. 1 Jedná se o pokus 1 (rekombinantni proteiny s 2% AI2O3). Výsledky ve shodném pokusu 2 (rekombinantni proteiny s olejovými solvens) byly prakticky shodné
Dosažené výsledky prokazuji celkové procento protektivity u imunizovaných myší v rozmezí od 25 co 100 %. Nejlepšího výsledku byio dosaženo při aplikaci vzorku vakcíny s obsahem: rApxlA. rApxllA .ΆρχιΙΙΑ. rApxIVA rTbpB a rApfA.
Tabulka č. 1
Ověřeni protektivity rekombinantnich proteinů po imunizaci pokusných myší vůči čelenži virulentními kmeny A. pleuropneumoniae sérotyp 7 a sérotyp 11 (Pokus 1)
| Počet | Infekce sérotyp ί 1 | Infekce sérotyp 11 | |||
| r-íeKombinantni | 1 | H Průměrné p | |||
| 1 mvši | Přežilo | Protektívita i | Přežil | 0 : Protektívita | |
| crotem ; | ! · | protektivity (7 | |||
| 1 (ks) | (ks) | (%) 1 í i | (ks) | (%) | |
| rApxlA 20 | 5 | 50 t | 5 | 1 50 | 50 |
| rApxllA 20 | ‘ 60 Γ | 6 | 60 | 60 | |
| r.ApxlilA 20 | 4 | 40 | | 6 | 60 | .............. ' 50 |
| rApxIVA 20 | 2....... | '............20...... ”i | 3 | ”7’”.....’ 30 | 25 |
| ' 20 | 4 | -V ' | : | 30 | ..... 35 |
| rApfA 20 | 3 | ' 30 : | 3 | I 30 | 30 |
| - adxíA + i!A + | . .. . — - | .......... | |||
| 20 | 8 | 30 | 8 | SO | 80 |
| TA t- iVA | |||||
| rApxlA + ÍÍA V | |||||
| •ii A r IVA + 20 | g | 30 | 10 | 100 | 95 |
| rT opB | |||||
| ΆρχίΑ IIA - | |||||
| TA + IVA - 20 | 10 | 100 | 0 | ; nn . - v- | 100 |
| iToijD + rApfA | I | ||||
| CTTmia (2%............... on | n | Λ |
... ‘ > ΑΡΟ-,ι
0 «* *·
* · «* · · • · · · · 1 1 • » · · · · ·· · * ·· l·''Alan o. 2
Tento přiklad provedení demonstruje ověřeni protektivity puntíkovaných •'ekomcirantních proteinu po imunizaci poKusnych prasat vůči Ceienži virulentními kmeny A p/europneumcň/ae ř a sérotyp 1 i. v žádném případě však neomezuje patentové práva vztahující se k tomuto patentu
Ověřeni protektivity puntíkovaných rekombinantních proteinů po imunizaci pokusných prasat vůči čelenží virulentními kmeny A. pieuropneumoniae sérotyp 2 a sěrotyp 9:
Příprava pokusných vzorků vakcín Klonování, exprese a purifikace rekombinantních faktorů virulence
Pomocí specifických primerů a potymerázové řetězové reakce byly amplifikovány gen,· aoxiA ’ genomově DNA (gDNA) A. pieuropneumoniae sěrotyp i. apxliA z gDNA A pleuiopneumonia-: sdoUp
7. apx.lHA z gDNA A. pieuropneumoniae sérotyp 2. apxiVA z gDNA A. pieuropneumoniae sérotyp 3. z gDNA A. pieuropneumoniae sérotyp 7 a apfA z gDNA A pieuropneumoniae sérotyp 11 Tyto geny byty následné klonovány do komerčního vektoru pET28b (Novagen) ve fázi čtení se sekvencemi kódujícími Na (' koncovou histidinovou kotvu, umožňující purifikaci výsledných rekombinantních proteinu na afinitní matrici. Zároveň byly geny umístěny pod kontrolu transkripčnich a translačních iniciačních signálu genu (0 bakteriofága T7
Výsledné plazmidy byly transformovány do expresního kmene Escherichia (tou BL2 ’;ΛΓ:ňř A} a ověřeni růstových vlastnosti kmenu a exprese rekombinantních proteinu rApxlA. .Άρχΐ; ' Vnii/1. 'ApxiVA. rTbpB a rApfA byly provedeny v laboratorních podmínkách v kulturách do obierm.· i a v poloprovozním měřítku ve fermentorech do objemu 50 i
Byly nalezeny a optimalizovány kultivační podmínky při teplotě 37 CC, které umožňovaly no induKci exprese pomocí IPTG produkci vysoké hladiny rekombinantních proteinů. Všechny proteiny byly produkovány do inkluzních tělísek z nichž byly izolovány ve formě močovinových extraktů a puntiko /m'!,· \m-vmaci iontovýměoné a afinitní chromatografie
V prvním kroku byla převedena .ontovýměnná chromatografie na koloně s náplni DEAESeohercsy. v druhém byly eíuce oe pmm koloně obsahující danv rekombinantni protein pročištěny pomoci afinitní chromatografie na Ni-NTA agarose Celistvost a čistota rApxiA rApxliA r VmVA -ApxiVA rTbpB a rApfA byly ověřeny pomocí eiektroforetické separace v púiyaKryiamidovéim geiu iSům;·AGú; o identita proteinu oyla potvrzena metodou Western blot Takto punfikované á >dentif'kcvanž ·. mmim, pyl; použity pro přípravu pokusných vzorku vakcín k ověřeni jejich protektivity
K ověřeni bylo použito celkem 200 ks selat plemene české bílé ušlechtilé, od nevakcinovaných prasmček proti aktinobacilóze prasat, ve věku 6 týdnů. Selata byla rozdělena do 10 skupin po 20 ks selat 9 skupin selat bylo imunizováno jednotlivými nebo různými kombinacemi rekombinantních proteinu (rApx
I. rApx II, rApx lil, rApx IV, rTbpB, rApfAj. V pokusných vzorcích vakcín byl vždy kazdy rekombmantni protein použit v množství 20 pg na jednu dávku. Jedna skupina selat obdržela placebo - roztok olejového solvens bez rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny byly resuspendovány v olejovém solvens (Emulsigen - 20%) Aplikace pokusným selatům byla provedena intramuskulárně v dávce 2 ml jednotlivých testovaných vzorků vakcín. Za 14 dní byla shodným způsobem provedena revakcinace. Za 14 dní po revakcinaci byla provedena infekce 50 % pokusných selat bakteriálním kmenem A. pleuropneumoniae sérotyp 2 a 50 % prasat sérotypem 9 v infekční dávce 1O0ID5O/5ml/intranazálně/sele Po infekci byla selata sledována 7 dni a denně byly pozorovány a zaznamenávány klinické příznaky onemocnění aktinobacilózou prasat.
Po ukončeni sledovací doby (8. den) byla všechna selata utracena a byla provedena patofogickoanatomická pitva zaměřená zejména na vyhodnocení specifických patognomických aktinobacilových pltcních změn. Pro účely vyhodnocení protektivity testovaných vzorků vakcín byly změny do 50% plochy plicmho parenchymu hodnoceny jako negativní (pozitivní protektivní efekt testované vakcíny), změny nad 50% plochy plicniho parenchymu byly hodnoceny jako pozitivní plicní skóre (negativní protektivní efekt testované vakcíny). Uspořádání pokusu a dosažené výsledky jsou presentovány v Tab 2.
Dosažené výsledky prokazují celkové procento protektivity u imunizovaných selat v rozmezí od 25 do 90 %. Nejlepšiho výsledku bylo dosaženo při aplikaci vzorku vakcíny s obsahem rApxlA, rApxllA. rApxlllA, rApxIVA. rTbpB a rApfA.
*· ·· ·· ···«
Tabulka č. 2
Ověření protektivity rekombinantních proteinů po imunizaci pokusných prasat vůči čelenži virulentními kmeny A. pleuropneumoniae sérotyp 2 a sérotyp 9
Rekombinantní
Počet protein rApxlA rÁpxllA i rApxlllA rApxIVA
Γ rTbpB ’ íApfA : rApxlA + : IHA + IVA rTbpB i rApxlA ! IHA + ; rTbpB + rApfA : Kontrola roztok emulsigenu)
IIA prasat (ks)
Infekce sérotyp 2
Infekce sérotyp 9
Průměrné procento i
| Plicní skóre | Plicní skóre | Plicní skóre | Plicní skóre | protektivity (neg. |
| neg. (ks) | poz. (ks) | neg.(ks) | poz. (ks) | plicní skóre) (%) |
| 5 | 5 | 5 | 5 | 50 |
| 4 | 6 | 4 | 6 | 40 |
| 4 | 6 | 3 | 7 i I 7 | 35 |
| 2 | 8 | 3 | 25 | |
| 2 | 8 | 3 | 7 | 25 |
| 3 | 7 | 3 | 7 | 30 |
| 7 | 3 | 7 | 3 | 70 |
| 8 | 2 | 8 | 2 | 80 |
| 9 | 1 | 9 | i I 1 | 90 |
| 0 | 10 | 0 | 10 | 0 |
Produkce rekombinantních proteinů popsaná ve vynálezu může být provedena v buňkách Escherichia coli BL21(ÁDE3) transformovaných plazmidy odvozenými od vektoru pET28b a nesoucími geny pro příslušné proteiny, jak je detailně popsáno výše v příkladech 1 a 2, ale může být provedena i v pných dostupných rekombinantních expresních systémech. Například, celé kódující oblasti nebo části genu pro proteiny ApxlA, ApxllA, ApxlllA, ApxIVA, TbpB a ApfA mohou být klonovány do expresních vektoru pod kontrolu heterologních expresních sekvencí umožňujících expresi proteinů. Vhodnými hostitelskými buňkami mohou být např. buňky Escherichia coli Bacillus spp., Streptomyces spp Saccharomyces spp.. Pichia spp. a jiné.
·· ···· • ·· • · * <· • · ·
4·· ·* ·· ·· • · · • · ··*
♦
Průmyslová využitelnost
Univerzální vakcínu dle přihlašovaného vynálezu lze využít pro profylaxi a kontrolu Actinobacilliis pleuropneumonie u prasat a lze ji aplikovat nitrosvalově (intramuskulárně), podkožně (suoxutánněi nitrokožně (intradermálné) nebo bezjehelně (transkutánné). Lze ji aplikovat rovněž březím prasmčkám nebo prasnicím pro navozeni kolostrálni a laktogenní imunity u novorozených selat proti actinobacilové pleuropneumonii a taktéž selatům k navozeni aktivní imunity proti actinobaciíové pleuropneumonii od 3 týdnu věku selat. Univerzální vakcínu dle přihlašovaného vynálezu lze aplikovat současně sjinými imunobiologickými přípravky proti virovým, bakteriálním, plísňovým a dalším onemocněním prasat a s jinými přípravky a léčivy pro prasata.
Rekombinantní proteiny připravené podle nároku 2 (ApxlA), nároku 3 (ApxliA), nároku 4 (ApxlllA), nároku 5 (ApxIVA), nároku 6 (TbpB) a nároku 7 (ApfA) jsou využitelné jako antigeny pro diagnostické metody (EIA, ELISA. přímá a nepřímá fluorescence. Western blot a podobně) určené k detekci specifických protilátek vůči výše jmenovaným rekombinantním a též přirozeným proteinům u cílového druhu zvířat (prasat), nebo u různých druhů experimentálních zvířat, v rámci praktického nebo experimentálního vyšetřováni. Dále jsou tyto rekombinantní proteiny využitelné jako specifické imunogeny k imunizaci cílového druhu zvířat nebo různých druhu experimentálních zvířat umožňující získáni vysoce specifických hyperimunních sér s možností dalšího využiti v širokém spektru diagnostických metod (EIA, ELISA, přímá a nepřímá fluorescence, Western blot a podobně) zaměřených na detekci specifických proteinu vůči těmto specifickým hyperimunním sérům s možnosti využití v rámci praktické diagnostiky nebo experimentálního vyšetřováni
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Universální vakcina pro profylaxi a kontrolu Actinobacillus pleuropneumoniae u prasat. Je charakterizovaná obsahem jednoho nebo více imunoprotektivnich rekombinantních polypeptidu.
- 2. Universální vakcina podle nároku 1, charakterizovaná obsahem imunoprotektivniho rekombinantního polypeptidu ApxlA Rekombinantní ApxlA polypeptid připravený inserci apxlA genu z Actinobacillus pleuropneumoniae do expresního vektoru a následnou produkcí v Escherichia coli a purifikací. Rekombinantní ApxlA je polypeptid s molekulovou hmotností 113 kDa a je vysoce účinným protektivním imunogenem.
- 3. Universální vakcina podle nároků 1 nebo 2, charakterizovaná obsahem imunoprotektivního rekombinantního polypeptidu ApxllA. Rekombinantní ApxllA polypeptid připravený inserci ApxllA genu z Actinobacillus pleuropneumoniae do expresního vektoru a následnou produkcí v Escherichia coli a purifikací. Rekombinantní ApxllA je polypeptid s molekulovou hmotností 105 kDa a je vysoce účinným protektivním imunogenem.
- 4 Universální vakcina podle nároků 1, 2 nebo 3, charakterizovaná obsahem imunoprotektivního rekombinantního polypeptidu ApxlllA. Rekombinantní ApxlllA polypeptid připravený inserci apxlHA genu z Actinobacillus pleuropneumoniae do expresního vektoru a následnou produkcí v Escherichia coli a purifikací. Rekombinantní ApxlllA je polypeptid s molekulovou hmotnosti 115 kDa a je vysoce účinným protektivním imunogenem.
- 5. Universální vakcina podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, charakterizovaná obsahem imunoprotektivního rekombinantního polypeptidu ApxIVA. Rekombinantní ApxIVA polypeptid připravený inserci apxIVA genu z Actinobacillus pleuropneumoniae do expresního vektoru a následnou produkci v Escherichia coli a purifikací. Rekombinantní ApxIVA je polypeptid s molekulovou hmotností 204 kDa a je vysoce účinným protektivním imunogenem
- 6 Universální vakcina podle nároků 1, 2, 3, 4 nebo 5 charakterizovaná obsahem imunoprotektivního rekombinantního polypeptidu TbpB. Rekombinantní TbpB polypeptid připravený inserci tbpB genu z Actinobacillus pleuropneumoniae do expresního vektoru a následnou produkcí v Escherichia coli a purifikací. Rekombinantní TbpB je polypeptid s molekulovou hmotností 60 kDa a je vysoce účinným protektivním imunogenem
- 7. Universální vakcina podle nároků 1. 2. 3. 4. 5 nebo 6 charakterizovaná obsahem imunoprotektivního rekombinantního polypeptidu ApfA Rekombinantní ApfA polypeptid připravený inserci apfA genu z Actinobacillus pleuropneumoniae do expresního vektoru a následnou produkcí v Escherichia coli a purtfiKaci. Rekombinantní ApfA je oolypeptd s molekulovou hmotnosti 16 kDa a je vysoce účinným protektivním imunogenem
- 8 Universální vakcina podle nároku 1, 2, 3. 4. 5. 6 nebo 7 charakterizovaná obsahem jednoho dvou, tři, čtyř, pěti nebo šesti imunoprotektivnich rekombinantních polypeptidu a je;ich možnou ruznou kombinaci
- 9 Universální vakcina podle nároku 1. 2. 3. 4, 5, 6. 7 nebo 8. charakterizována tím. ze imunoprotektivní rekombinantní polypeptidy mohou být v lyofilizované nebo tekuté formě
- 10 Universální vakcina podle nároku 1. 2. 3. 4 5, 6. 7, 8 nebo 9. charakterizovaná tím, že imunoprotektivní rekombinantní polypeptidy mohou být aplikovány v pufrovaném fyziologickém roztoku
- 11. Universální vakcina podle nároku 1, 2. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10. charakterizovaná tím. že imunoprotektivní rekombinantní polypeptidy mohou být aplikovány s minerálním imunitním adjuvans.
- 12. Universální vakcina podle nároku 1,2, 3, 4. 5. 6, 7, 8. 9, 10 nebo 11. charakterizovaná t m že imunoprotektivní rekombinantní polypeptidy mohou být aplikovány s olejovým iirundním adjuvans
- 13 Universální vakcina podie nároku 1.2,3. 4, 5. 6, 7,8,9,10 11 nebo 12. charakterizovaná tím že imunoprotektivní rekombinantní polypeptidy mohou být aplikovány s imunitním! Komplexy (ISCOM). liposomy a dalšími přírodními nebo syntetickými adjuvans.
- 14. Universální vakcina podle nároků 1, 2, 3. 4, 5, 6. 7 8, 9, 10, 11 12 nebo 13. charakterizovaná tím. že imunoprotektivní rekombinantní polypeptidy mohou být aplikovány ve finátní podobě vakeíny s pH v rozmezí od 4 do 9.
- 15 Universální vakcina podie nároku 1, 2, 3, 4. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. 13 nebo 14 charakterizovaná tím, že vakcínu je možno aplikovat prasatům nitrosvalově (intramuskuíárně). podkožně (subkutánně), mtrokožně (intradermálně) nebo bezjehelně (transkutánně) ’6 Universální vakcina podle nároků 1, 2. 3. 4, 5. 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15, charakterizovaná tím, že vakcínu je možno aplikovat březím prasničkám nebo prasnicím pro navozeni kolostrální a laktogenní imunity u novorozených seiat proti actinobaciiové pleuropneurnonii
- 17 Universální vakcina podie nároku 1. 2. 3, 4. 5 6. 7.8 3 10 11. 12. 13 14. 15 nebo 16 charakterizovaná tím. že vakcínu je možno aplikovat selatům k navozeni aktivní imunity proti actinobaciiové pleuropneumonii od 3 týdnu věku selat
- 18 Universální vakcina podle nároku 1. 2, 3, 4. 5. 6. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. 15, 16 nebo 17. charakterizovaná tím, že vakcinu je možno aplikovat současně s jinými imunobiologickyrm přípravky proti virovým, bakteriálním plísňovým a dalším onemocněním prasat.
- 19 Universální vakcina podle nároku 1,2. 3, 4. 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11 12. 13. 14, 15, 16. 17 nebo 18, charakterizovaná tím. že vakcinu je možno aplikovat současně s jinými přípravky a léčivy pro prasata
- 20. Rekombinantní proteiny připravené podle nároku 2 (ApxlA), nároku 3 (ApxllA). nároku 4 (ApxlltA), nároku 5 (ApxIVA), nároku 6 (TbpB) a nároku 7 (ApfA) jsou využitelné jako antigeny pro diagnostické metody (EIA, ELISA, přímá a nepřímá fluorescence, Western blot a podobně) určené k detekci specifických protilátek vůči těmto rekombinantnim proteinům s využitím pro detekci specifické imunitní protilátkové odpovědi u cílového druhu zvířat (prasat), nebo li různých druhů laboratorních zvířat, v rámci praktického nebo experimentálního vyšetřován21 Rekombinantní proteiny připravené podle nároku 2 (ApxlA), nároku 3 (ApxllA). nároku 4 (ApxlllA), nároku 5 (ApxIVA), nároku 6 (TbpB) a nároku 7 (ApfA) jsou využitelné jako specifické imunogeny k imunizaci cílového druhu zvířat nebo různých druhů experimentálních zvířat k získání vysoce specifických hyperimunnich sér s využitím v různých diagnostických metodách (EIA, ELISA, přímá a nepřímá fluorescence, Western blot a podobně) určených k detekci specifických proteinu vůči těmto specifickým hyperimunním sérům s možnosti využiti v rámci praktické diagnostiky nebo experimentálního vyšetřování.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100540A CZ2010540A3 (cs) | 2010-07-08 | 2010-07-08 | Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100540A CZ2010540A3 (cs) | 2010-07-08 | 2010-07-08 | Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010540A3 true CZ2010540A3 (cs) | 2012-01-18 |
Family
ID=45464937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100540A CZ2010540A3 (cs) | 2010-07-08 | 2010-07-08 | Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2010540A3 (cs) |
-
2010
- 2010-07-08 CZ CZ20100540A patent/CZ2010540A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2016222520B2 (en) | Attenuated Streptococcus suis vaccines and methods of making and use thereof | |
| Wu et al. | Protective immunity conferred by recombinant Pasteurella multocida lipoprotein E (PlpE) | |
| Sthitmatee et al. | Protection of chickens from fowl cholera by vaccination with recombinant adhesive protein of Pasteurella multocida | |
| Sadilkova et al. | Type IV fimbrial subunit protein ApfA contributes to protection against porcine pleuropneumonia | |
| Maas et al. | Development of a DIVA subunit vaccine against Actinobacillus pleuropneumoniae infection | |
| US9597386B2 (en) | Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof | |
| Macedo et al. | Immune response to oligopeptide permease A (OppA) protein in pigs naturally and experimentally infected with Haemophilus parasuis | |
| Wu et al. | Cross-protection of recombinant Pasteurella multocida toxin proteins against atrophic rhinitis in mice | |
| TW201739760A (zh) | 豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素蛋白及其應用 | |
| To et al. | Genetic and antigenic characteristics of ApxIIA and ApxIIIA from Actinobacillus pleuropneumoniae serovars 2, 3, 4, 6, 8 and 15 | |
| Donachie | Vaccine development against Pasteurella haemolytica infections in sheep | |
| Lo et al. | Antibody responses of calves to Histophilus somni recombinant IbpA subunits | |
| Liu et al. | Be aware of immunogenic but not protective antigens: the Actinobacillus pleuropneumoniae PalA as an example | |
| CZ2010540A3 (cs) | Konstrukce, produkce, purifikace a využití rekombinantních faktoru virulence Actinobacillus pleuropneumoniae k diagnostice a k imunoprofylaxi actinobacilové pleuropneumonie u prasat | |
| JP2022132447A (ja) | タンパク質、及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａタンパク質を含有する免疫化組成物、ならびに使用方法 | |
| Lee et al. | Antigenicity of partial fragments of recombinant Pasteurella multocida toxin | |
| Jogi et al. | Immunoprotection in mice immunized with native OmpH, recombinant OmpH and HS alum precipitated vaccine of Pasteurella multocida P52 against P. multocida challenge | |
| Przybyl et al. | Antigens of Actinobacillus pleuropneumoniae and their use in the design of vaccines, especially glycoconjugates. | |
| Teng et al. | Immunogenicity and protective efficacy of the recombinant | |
| Wang et al. | TLR4 agonist combined with trivalent protein JointS of Streptococcus suis provides immunological protection in animals. Vaccines (Basel). 2021; 9 (2): 184 | |
| BRAMBILA et al. | Two outer membrane lipoproteins from histophilus somni are Immunogenic in rabbits and sheep and induce protection against bacterial challenge in mice | |
| TWI407969B (zh) | 溶血性曼哈米亞桿菌重組外膜蛋白質疫苗 | |
| Ke-Xia et al. | Cloning, expression and immunogenic characterization of the apxIIA gene of Actinobacillus pleuropneumoniae | |
| SHEEP | Edinburgh EH17 7JH, Scotland | |
| Anderson et al. | Response to Challenge of Nursing Piglets Passively Immunized Against Clostridium perfringens Alpha and Beta2 Toxins |