JP2004222593A - 反芻獣病原細菌の主要外膜タンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】ウシやヒツジなどの反芻動物におけるＨ．ｓｏｍｎｕｓ感染症に対する効果的で安全性の高いワクチンとして用いることができるＨ．ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）及び該タンパク質をコードする遺伝子の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は上記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質、ならびに該タンパク質をコードする遺伝子。
【選択図】 なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は上記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質、ならびに該タンパク質をコードする遺伝子。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、反芻獣病原細菌外膜タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、以下、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓともいう）の主要外膜タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該遺伝子により形質転換された形質転換体、該遺伝子を染色体ＤＮＡに導入した細菌、該タンパク質の製造方法、及びＨ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染防御用ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
病原細菌ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）はウシやヒツジの髄膜脳脊髄炎（ＴＥＭＥ）、敗血症、肺炎や流産等の生殖器疾患の原因菌であり、日本国内はもとより世界各地で発生が認められている。なお、ヒツジからの分離菌についてＨｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｖｉｓ 又はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｇｎｉなどの呼称が用いられるが、これらの菌は分類学的に同一の菌群であることから、本明細書ではＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓという名称を用いることとする。
ウシの髄膜脳脊髄炎の予防を目的とした全菌体不活化ワクチンが野外では用いられているが、肺炎を含めて他の病型に対する効果は不明である。この全菌体不活化ワクチンはワクチン接種動物にＩｇＥ抗体を惹起させることが知られており、ワクチン接種動物で観察される副反応との関連性が指摘されている。従って、さまざまな病型に効果を発揮し、より安全性の高いワクチンの開発が望まれている。また、防御抗原と呼ばれる感染防御免疫誘導に関係する蛋白成分要素（ユニット）の中で本質的な有効成分のみを含むワクチンであるサブユニットワクチンはより高い防御能を期待できるワクチンとして開発が期待されている。
【０００３】
病原細菌の菌体表面構造物は感染宿主と病原細菌の相互作用において重要な役割をもつと考えられている。Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの菌体表面構造である外膜にはさまざまなタンパク質が分布し、そのなかで最も多量に存在するタンパク質が主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）である。これまでにＨ． ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰは、免疫グロブリン結合能があること、グラム陰性菌のポーリンタンパク質とＮ−末端アミノ酸配列において相同性があること、菌株間に共通の又は菌株間で反応性の異なる抗原エピトープが存在すること、実験動物に対して免疫原性があること、感染に伴う菌株特異的な抗体応答が存在すること、菌株間で分子量や抗原性が異なることなどの諸性質を有することが明らかにされている（非特許文献１〜５参照）。このような性質はグラム陰性菌のポーリンタンパク質と共通性が認められ、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰはポーリンタンパク質であると考えられる。ポーリンタンパク質は感染や免疫に伴い、殺菌抗体、オプソニン抗体や防御免疫を付与することが知られている。また、ポーリンタンパク質は感染宿主の細胞への付着・侵入、血清抵抗性や細胞死に関与することが報告されている（非特許文献６〜１０参照）。このようなことから、ポーリンタンパク質は有用なワクチン抗原の候補として着目されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｔａｇａｗａ， Ｙ．， Ｈ．Ｉｓｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｎ．Ｙｕａｓａ， １９９３， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ， Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：９１−９６
【非特許文献２】
Ｔａｇａｗａ， Ｙ．， Ｍ．Ｈａｒｉｔａｎｉ， Ｈ．Ｉｓｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｎ．Ｙｕａｓａ， １９９３， Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１：２２５７−２２５９
【非特許文献３】
Ｔａｇａｗａ， Ｙ．， Ｆ．Ｂａｓｔｉｄａ−Ｃｏｒｃｕｅｒａ ａｎｄ Ｌ．Ｂ．Ｃｏｒｂｅｉｌ， ２０００， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｒｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ， Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７１：２４５−２５４
【非特許文献４】
Ｙａｒｎａｌｌ， Ｍ．， Ｒ．Ｐ．， Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉ， ａｎｄ Ｌ．Ｂ． Ｃｏｒｂｅｉｌ， １９８８ａ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３４：１９９３−１９９９
【非特許文献５】
Ｙａｒｎａｌｌ， Ｍ．， Ｒ．Ｐ．， Ｗｉｄｄｅｒｓ， ａｎｄ Ｌ．Ｂ． Ｃｏｒｂｅｉｌ， １９８８ｂ， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ， Ｓｃａｎｄ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２８： １２９−１３７
【非特許文献６】
Ｂａｕｅｒ， Ｆ．Ｊ．， Ｔ． Ｒｕｄｅｌ， Ｍ．， Ｓｔｅｉｎ， ａｎｄ Ｔ．Ｆ．Ｍｅｙｅｒ， １９９９， Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｐｏｒｉｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ， Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３１：９０３−９１３
【非特許文献７】
Ｍｕｌｌｅｒ． Ａ．， Ｄ．Ｇｕｎｔｈｅｒ， Ｆ．Ｄｕｘ， Ｍ．Ｎａｕｍａｎｎ， Ｔ．Ｆ．Ｍｅｙｅｒ， ａｎｄ Ｔ．Ｒｕｎｄｅｌ， １９９９， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ ｐｏｒｉｎ （ＰｏｒＢ） ｃａｕｓｅｓ ｒａｐｉｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｆｌｕｘ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， １８：３３９−３５２
【非特許文献８】
Ｒａｍ， Ｓ．， Ｍ．Ｃ．Ｃｕｌｌｉｎａｎｃｅ， Ａ．Ｍ．Ｂｌｏｍ， Ｓ．Ｇｕｌａｔｉ， Ｄ．Ｐ．ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ， Ｂ．Ｇ．Ｍｏｎｋｓ，Ｃ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｒ．Ｂｏｄｅｎ， Ｃ．Ｅｌｋｉｎｓ， Ｍ．Ｋ．Ｐａｎｇｂｕｒｎ， Ｂ．Ｄａｈｌｂａｃｋ， ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｒｏｃｅ，２００１， Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｐｏｒｉｎ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９３：２８１−２９５
【非特許文献９】
Ｒａｍ， Ｓ．， Ｄ．Ｐ．ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ， Ｓ．Ｇｕｌａｔｉ， Ｃ．Ｅｌｋｉｎｓ， Ｍ．Ｋ．Ｐａｎｇｂｕｒｎ， ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｒｉｃｅ， １９９８， Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｔｏ ｌｏｏｐ ５ ｏｆ ｐｏｒｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ａ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎｓｉａｌｙｌａｔｅｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８８：６７１−６８０
【非特許文献１０】
ｖａｎ Ｐｕｔｔｅｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｔ．Ｄ．Ｄｕｅｎｓｉｎｇ， ａｎｄ Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎ， １９９８， Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｒｏｖｅｎ ｂｙ Ｐ．ＩＡ， ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｗｉｔｈ ＧＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８８：９４１−９５２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、ウシやヒツジなどの反芻動物におけるＨ． ｓｏｍｎｕｓ感染症に対する効果的で安全性の高いワクチンとして用いることができるＨ． ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ８０２５株から４０ｋＤａの主要外膜タンパク質を精製し、そのアミノ酸配列を決定した。そして該アミノ酸配列を元にプライマーを設計してＰＣＲ法によって主要外膜タンパク質をコードする遺伝子を増幅し、全塩基配列を決定した。本発明者らはまた、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓのさまざまな菌株からの主要外膜タンパク質遺伝子の塩基配列を決定し、推定アミノ酸配列のマルチプルアライメントにより主要外膜タンパク質の２次構造モデルを作成した。これにより主要外膜タンパク質には１６個のβシートと８個のループ構造が存在し、ループ構造はアミノ酸配列の多様性が認められることを明らかにした。さらに、本発明者らは、Ｔ７プロモーター下流に主要外膜タンパク質をコードする遺伝子をつなぐことにより大腸菌で安定かつ高度に組換え外膜主要タンパク質を生産させることに成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質
（２）反芻獣病原細菌がヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）である、上記（１）のタンパク質。
（３）上記（１）又は（２）のタンパク質をコードする遺伝子。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（５）反芻獣病原細菌がヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）である、上記（４）の遺伝子。
（６）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。
（７）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子により形質転換された形質転換体。
（８）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子を染色体ＤＮＡに導入した細菌。
（９）上記（１）のタンパク質の製造方法であって、上記（７）の形質転換体又は上記（８）の細菌を培地に培養し、得られる培養物から該タンパク質を採取することを含む方法。
（１０）上記（７）の形質転換体又は上記（８）の細菌を培養することによって得られたタンパク質を含む反芻獣病原細菌感染防御用ワクチン。
（１１）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子を含む反芻獣病原細菌感染防御用ワクチン。
（１２）配列表の配列番号１に示す塩基配列の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
（１３）反芻獣病原細菌に感染したか、感染する可能性のあるヒトを除く動物に、上記（１０）又は（１１）のワクチンを投与することを含む、反芻獣病原細菌感染の予防方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．本発明の遺伝子のクローニング
本発明の４０ ｋＤａの分子量を有するヘモフィルス・ソムナス（Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ）の主要外膜タンパク質（Ｍａｊｏｒ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＯＭＰ）をコードする遺伝子（以下、ＭＯＭＰ遺伝子という）の供与菌は、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓに属する微生物であれば如何なるものでもよく、例えばＨ．ｓｏｍｎｕｓ ８０２５、Ｄ１２３８、ＮＴ２３０１、２３３６、５４０、６４９、１２９Ｐｔ等が挙げられる。
本発明の遺伝子のクローニングは、例えば以下のようにして行うことができる。
【０００９】
（１） Ｈ．ｓｏｍｎｕｓゲノムＤＮＡの調製
Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌の染色体からゲノムＤＮＡを調製するには常法により行うことができる。具体的には、ＴＥバッファーに浮遊させた菌体を、プロテイナーゼＫとＳＤＳ処理により溶菌し、ＣＴＡＢで処理した後、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで除タンパク後、イソプロパノール沈殿とＤＮＡ沈渣のエタノール洗浄を行って精製することによってゲノムＤＮＡを得ることができる。
【００１０】
（２） タンパク質の精製及びアミノ酸配列の決定
Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質の精製はＴａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６１， ９１−９６の記載に従い行うことができる。具体的には、培養菌体を超音波処理により破砕し、遠心分離によって膜画分を回収し、可溶化させた後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により高度に精製し、最終的にポリアクリルアミド電気泳動により、単一のタンパク質に精製し、アミノ酸配列を市販の自動アミノ酸配列決定機を用いて決定する。
【００１１】
（３） ＰＣＲによるＤＮＡ部分断片のクローニング
決定したアミノ酸配列によりコードされうる塩基配列を割り出し、２０塩基程度の長さの数種のＤＮＡプライマーを合成する。ＤＮＡプライマーの合成は、市販の自動ＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。（１）で作成したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記合成ＤＮＡプライマーを用いて常法によりＰＣＲを行い、目的とする遺伝子の部分断片を増幅し、プラスミドベクターにクローニング後、ジデオキシ法 （Ｓａｎｇｅｒ． Ｆ， １９８１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１４， １２０５−１２１０）等の常法によってその塩基配列を決定する。
【００１２】
（４） インバースＰＣＲ法による隣接領域のクローニング
上記で塩基配列を決定された領域の隣接領域のクローニングは、例えばインバースＰＣＲ法により行う。インバースＰＣＲは、ＤＮＡのコア領域の両端に隣接する未知の塩基配列をＰＣＲ法を用いて幾何級数的に増幅する方法である。具体的にはコア領域を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ＰＣＲ増幅に適した大きさの断片としてこの両端をセルフライゲーションして環状とする。その後二つのプライマーをそれぞれ環状分子内のコア領域の両端部分には相補的な配列を持ち、３’末端が未知の隣接領域側に向いているプライマーを用いて未知の隣接領域をＰＣＲ法により増幅する。
【００１３】
以上のようにして取得される本発明のＨ．ｓｏｍｎｕｓ由来の外膜主要タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである。配列番号１の塩基配列において、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、塩基番号２５４−２５６の開始コドンＡＴＧを有する２５４番目のヌクレオチドから始まり、塩基番号１３９３−１３９５の停止コドンＴＡＡを有する１３９５番目のヌクレオチドで終了する。
【００１４】
本発明のタンパク質は、（ａ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質である。
本発明のタンパク質のシグナル配列は配列番号２に示すアミノ酸配列の１番目から１９番目までの１９個のペプチドである。
【００１５】
上記の「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１６】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又は Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキット等を利用して行うことができる。
【００１７】
上記の「反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有する」とは、反芻獣病原細菌による感染から動物を免疫学的に防御するための抗体を生体内で誘導する活性を有することをいい、当該活性が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。より詳細には、当該活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）である限り、分子量等の量的要素は元のタンパク質と異なっていてもよい。
ここで、反芻獣病原細菌としては、具体的には、反芻動物（ウシ、ヒツジなど）に対して髄膜脳脊髄炎、敗血症、肺炎や生殖器疾患を発症しうるヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）をいう。
【００１８】
上記いずれかのタンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。本発明の部分ペプチドとしては、上記防御免疫誘導活性を発揮すれば如何なるものでもよく、該部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である
【００１９】
本発明のタンパク質は、後述のように該タンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。
また、前記部分ペプチドは、公知のペプチド合成法又は前記タンパク質を適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、上記の本発明のタンパク質をコードする遺伝子であればいかなるものでもよく、具体的には、（ａ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【００２１】
上記の「配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ」としては、配列番号１で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００２２】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本発明の遺伝子のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２３】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１） 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を挿入することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等を用いることができる。プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２， ｐＢＲ３２５， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０， ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３， ＹＥｐ２４， ＹＣｐ５０等）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２４】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片を適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を組み込むことができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２５】
かかるベクターとしては、宿主細胞が大腸菌である場合は、例えばｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製） 、ｐＴｒｘＦＵＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） 、ｐＣＹＢベクター（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＭＤ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社製）等が、宿主細胞が酵母である場合は、例えばｐＥＳＰ−１発現ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製） 、ｐＡＵＲ１２３ベクター（宝酒造社製）、ｐＰＩＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が、また宿主細胞が動物細胞である場合は、例えばｐＭＡＭ−ｎｅｏ発現ベクター （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製） 、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） 、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製） 等が、宿主細胞が昆虫細胞である場合は、例えばｐＢａｃＰＡＫベクター （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製） 、ｐＡｃＵＷ３１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製） 、ｐＡｃＰ（＋）ＩＥ１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製） 等がそれぞれ挙げられる。
【００２６】
（２） 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母；サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞；あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２７】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２８】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１等が用いられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が用いられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９７２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ６９， ２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７５， １９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ， Ｈ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３， １６３−１６８）等が挙げられる。
【００３０】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてはＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３１】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
また、上記の各宿主細胞への遺伝子導入は、組換えベクターによらない方法、例えばパーティクルガン法なども用いることができる。
【００３２】
３．遺伝子導入細菌
本発明の遺伝子は、直接又は組換えベクターを介して細菌の染色体ＤＮＡに導入し、該染色体ＤＮＡ内に本発明の遺伝子によって遺伝子置換を起こさせた細菌を作成することができる、ここで、遺伝子を導入する細菌としては、Ｈ ｓｏｍｎｕｓ菌が用いられるが、肺炎菌などであってもよい。複数のＭＯＭＰ遺伝子の導入によって単一の株から抗原性の違う複数のＭＯＭＰを含むワクチン用抗原を調製することも可能である。
【００３３】
４．本発明のタンパク質の製造
本発明のタンパク質は、前記形質転換体又は遺伝子導入細菌を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３４】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３５】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
また、本発明の遺伝子を染色体ＤＮＡに導入することによって得られた遺伝子導入細菌の培養に用いられる培地としては、当該菌の培養を効率的に行うことのできる培地であればいずれの培地を用いてもよい。例えば、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの場合には当該菌の培養に適したブレインハートインヒュージョンブロス培地やコロンビアブロス培地を基礎培地とし、当該菌の発育を増強することが知られているチアミン誘導体や血清・血液成分等を添加したものを用いることができる。
【００３９】
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４０】
５．本発明のタンパク質及び遺伝子の使用
（１）ワクチンの調製
本発明の組換えタンパク質又はその部分ペプチドは、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染防御用ワクチンとして用いることができる。
また、本発明の遺伝子又はその断片を適当なプラスミドＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡもまた、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染防御用ワクチン（ＤＮＡワクチン）として用いることができる。ＤＮＡワクチンとして用いる組換えＤＮＡは、本発明の遺伝子又はその断片に、その転写を可能とする制御領域、例えば動物細胞内での遺伝子発現のための各種プロモーター及びエンハンサーを連結することによって構築される。ＤＮＡワクチンは、抗原タンパク質そのものを免疫原とする場合に比較すると、数回の接種で免疫応答が持続すること、プラスミドＤＮＡの精製が簡便で安定あるという点で有利である。
【００４１】
本明細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味し、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染予防ワクチン、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染による髄膜脳脊髄炎発症の予防ワクチン、並びに髄膜脳脊髄炎の治療ワクチンを含む広い意味で用いられる。
【００４２】
ワクチンとして用いられるタンパクは、上述のようにして製造される組換えタンパク質であるが、化学合成したものでもよい。ワクチンとして用いる部分ペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を適当なタンパク質分解酵素で分解した断片でもよいし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でもよい。部分ペプチドの場合、病原菌の感染を防御する抗体（殺菌抗体、オプソニン抗体、定着阻止抗体）が認識するエピトープを含んでいることが必要である。
【００４３】
本発明のワクチンは、免疫反応を増強するためのアジュバントや薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試薬など）と一緒に配合して医薬組成物の形態で提供することができる。
アジュバンドとしては、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物、ムラミルペプチド、カリウムミョウバン、サポニン若しくはその誘導体、鉱物油又は植物油等を用いることができる。
薬学的に許容可能な担体とは、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトランスフェクションするのに適したものであり、例えば、リポソーム、金粒子、カチオン性ポリマーなどの公知のトランスフェクション試薬が挙げられる。
【００４４】
ワクチン製剤には、更に、リン酸ナトリウム塩、リン酸カリウム塩、水酸化ナトリウム、塩酸等のｐＨ調節剤、硫酸カナマイシン、エリスロマイシン等の抗生物質、乳糖、グルタミン酸カリウム、Ｄ−ソルビトール、アミノ酢酸等の安定剤、塩化ナトリウム等の等張化剤などを加えることも可能である。
【００４５】
本発明のワクチンは、Ｈ．ｓｏｍｕｎｓ感染の防御に有効な量、すなわち、該感染に対して動物において免疫を誘導する量を、単回又は反復投与により投与することができる。ワクチンの投与経路としては、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的又は鼻腔内のいずれであってもよい。また、本発明のワクチンは、他の抗原成分と混合して用いてもよい。
【００４６】
ワクチンの投与量、投与回数は対象動物の種類、症状等より異なるが、例えば本発明のタンパク質を体重あたり１μｇ〜１００ｍｇ程度を、１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することにより動物に防御免疫を誘導することができる。
【００４７】
（２）オリゴヌクレオチドプローブ
上記で決定された配列番号１に示すＨ．ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰの塩基配列において、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌株間で高度に保存される領域の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓのハイブリダイゼーションによる直接検出のためプローブとして用いることができる。上記で決定された配列番号１に示すＨ．ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰの塩基配列において、菌株間で異なる領域の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドは、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの型を判別（タイピング）するためのプローブとして用いることができる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１） 主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）遺伝子のクローニング及び配列決定（１）細菌株及び培養
Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５、 Ｄ１２３８、 ＮＴ２３０１、 ２３３６、５４０ 、６４９及び １２９Ｐｔの７株を用いた。これらの菌株を血液寒天培地又はチアミン及びトリス添加ブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩＴＴブロス）を用いて７％ＣＯ２存在下で培養した。分子生物学的実験では市販の大腸菌株をルリア−バータニ（ＬＢ）培地で培養した。
【００５０】
（２）ＭＯＭＰの内部アミノ酸配列の決定
Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を、Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９３， ６１，９１−９６の記載と同様にして得た。簡単に述べると、ＢＨＩＴＴブロスで１２時間培養した菌体を超音波処理により破砕し、遠心分離して遠心上清を採取した。得られた遠心上清をさらに超遠心分離して沈さを膜画分として回収した。得られた膜画分を２％サルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン・ナトリウム）で可溶化し、超遠心分離により外膜富裕画分を得、これをＭＯＭＰの精製出発材料とした。１％ツウィタージェント３−１４でＭＯＭＰを可溶化したのち、イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過法により精製ＭＯＭＰを得た。精製ＭＯＭＰをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、エレクトロトランスファーによりポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。
クーマシーブルーで染色し、４０ ｋＤａのバンドを切り出し、プロテインシーケンサー ＡＢＩ Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ＨＴにてアミノ酸配列を決定した。
【００５１】
（３）ＭＯＭＰ遺伝子のクローニング
▲１▼ プライマーの設計
プライマーは既に決定されていたＮ末端アミノ酸配列及び新規に決定した２カ所の内部アミノ酸配列に基づいて設計した。各プライマーの構造及び位置を下記表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
ａ 下線を引いた６塩基はＰＣＲ産物のクローニングのための塩基配列を改変。
ｂ 図３に示したＭＯＭＰ配列中の塩基配列番号の位置を示す。
ｃ 図３に示したＭＯＭＰ配列のさらに５’もしくは３’側の配列内に位置することを示す。
【００５４】
▲２▼ コア領域のＰＣＲ法による増幅
ＭＯＭＰの遺伝子領域は３個のＤＮＡ断片としてＰＣＲ法により増幅し、各々のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。これらの配列を解析した結果、ＭＯＭＰ遺伝子をコードするＯＲＦを同定した。さらに塩基配列の確認のため、ＯＲＦとその上・下流の周辺領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、塩基配列を決定した。図１に各ＰＣＲ増幅断片、及びベクターへのクローニングにより得られたクローンを示した。８０２５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＢとＥ又はプライマーＢとＧ、ｒＴａｑポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ反応を行い、０．９５ ｋｂ及び ０．３ ｋｂのＰＣＲ産物を得た。これらのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、得られたクローンをそれぞれｐＳＲＫ４−５及びｐＳＲＫ７−８とした。
【００５５】
▲３▼ 下流域と上流域のＰＣＲ法による増幅
次に、ｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡの下流域のＰＣＲによる増幅のため、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５株のＳａｕ３ＡＩ完全切断染色体ＤＮＡプラスミドライブラリーをテンプレートとして、プライマーＣとＫ、次いでプライマーＣとＬを用いたネステッドＰＣＲにより０．９ ｋｂのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。この産物を上記と同様にＰＣＲクローニングベクターにクローニングし、得られたクローンをｐＳＲＫ８−１とした。
さらにｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡの上流域のＰＣＲによる増幅のためインバースＰＣＲを実施した。まず、インバースＰＣＲに用いる環状化ＤＮＡテンプレートの調製に適した制限酵素を決定するため、サザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。
ｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡ内に１カ所切断部位をもつ制限酵素ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｓａｕ３ＡＩ及びＨｉｎｆＩで８０２５株のゲノムＤＮＡを切断したのち、アガロースゲル電気泳動もかけ、ナイロンメンブレンにブロッティングした後、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブにより検出を行った。結果を図２に示した（レーン１： ＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡ、レーン２： ＨｉｎｄＩＩＩ切断ゲノムＤＮＡ、レーン３： Ｓａｕ３ＡＩ切断ゲノムＤＮＡ、レーン４：ＨｉｎｆＩ切断ゲノムＤＮＡ）。２ ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片がｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡの上流域に位置することが確認された。そこで、この２ ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片をインバースＰＣＲのターゲットとして選んだ。８０２５株のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全切断した後、フェノール・クロロホルムによる抽出とエタノール沈殿により精製し、これをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．１（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて再環状化させた。フェノール・クロロホルムによる抽出とエタノール沈殿により精製したものをテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼを用いて、プライマーｉｎｖＡとｉｎｖＥ、次いでプライマーｉｎｖＢとｉｎｖＦの組み合わせによるネステッドＰＣＲを実施し、１．６ ｋｂのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲクローニングベクターへのクローニングを試みたが、安定してプラスミドを維持するクローンを得ることが困難であり、塩基配列決定はＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングにより、自動ＤＮＡシーケンサー（ジェネティックアナライザー ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００）を用いて行った。
【００５６】
（４）ＭＯＭＰ遺伝子の配列解析
塩基配列の決定の結果を図３に示す。ＭＯＭＰ遺伝子をコードする配列は全長１４４０ｂｐであり、３８０個のアミノ酸をコードしていた（配列番号１）。８０２５株から分離精製されたＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸はＭＯＭＰ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の２０番目アミノ酸に相当していること、最初の１９残基のアミノ酸配列はシグナルペプチドの特徴をもつことから、成熟タンパク質は３６１個のアミノ酸からなり、推定質量は３９９１３ Ｄａであることがわかった。
【００５７】
（５）Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの他の菌株のＭＯＭＰ遺伝子の配列解析
プライマーＦＷ１とＲＶ１、ただし１２９Ｐｔ株にはプライマーＥｘｐＦＷ３とＥｘｐＲＶ４を用いてＭＯＭＰ遺伝子をＰＣＲ反応により増幅し、塩基配列を決定した。各株の塩基配列及び推定アミノ酸配列の特徴を下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
上記の表中、１２９Ｐｔの決定塩基数はＭＯＭＰ遺伝子の内部に相当する８９７塩基であるが、よく保存された５’及び３’の２８塩基及び２３塩基を８０２５株の塩基配列から加えて９４８塩基として計算を行った。
【００６０】
（６）二次構造モデルの作成
各株のＭＯＭＰの推定アミノ酸配列について多重配列解析と二次構造解析を実施することにより、βストランド及びループ構造に関するＭＯＭＰの二次構造モデルを作成した。結果を図４に示す。図４中、配列中のバーはアライメントにより生じたギャップを示し、空欄は８０２５株の配列と同じであることを示す。ＭＯＭＰのβストランド領域（β１からβ１６）及びループ構造領域（Ｌ１からＬ８）を配列の上部に示した。各配列の左の記号はＨ． ｓｏｍｎｕｓの菌株名又は二次構造が既に報告されているポーリンタンパク質の名称を示す。ＭＯＭＰは１６個のβストランドとこれらを結ぶそれぞれ８個の長いループ構造と短いターン構造で構成されていた。配列上の特徴としてβストランドは菌株間でよく保存されているが、ループ構造は菌株間で配列の著しい違いが認められた。ＭＯＭＰの抗原性と質量の違いによる型別において８０２５株と同じＭＯＭＰタイプ１に属するＤ１２３８株及びＮＴ２３０１株ではそれぞれループＬ４で１カ所、Ｌ７で１カ所のアミノ酸配列の違いが認められ、同じくタイプ１の２３３６株ではループＬ７で６カ所、ループＬ８で１カ所のアミノ酸配列の違いが認められた。一方、ＭＯＭＰタイプ３ａの１２９Ｐｔ株、ＭＯＭＰタイプ３ｃの５４０株と６４９株ではＭＯＭＰ遺伝子の後ろ半分で大きく違いが認められ、特にループ構造内にアミノ酸の置換、欠失、挿入が認められた。このように菌体の表面に露出し、感染宿主で惹起される抗体との反応に関与するＭＯＭＰ分子のループ構造、特にＬ４からＬ８においてアミノ酸配列に違いが生じていることはＭＯＭＰを利用するワクチンを設計する上で、重要な知見である。
【００６１】
（実施例２）大腸菌でのＭＯＭＰ遺伝子の発現
（１）発現ベクターへのＭＯＭＰ遺伝子のクローニング
ＭＯＭＰ遺伝子の大腸菌での発現を試みる場合、注意しなければならないのは発現制御の確かなプロモーターの利用と高度に発現した産物の大腸菌外膜への輸送による毒性発現の制御である。この問題点を解決するためにＴ７プロモーターをもつ発現ベクターと成熟ＭＯＭＰに相当するコード領域を利用した。また、全長ＭＯＭＰの発現の可能性についても検討した。すなわち、８０２５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、成熟ＭＯＭＰの発現用にはプライマーＥｘｐＦＷ５とＥｘｐＲＶ３、全長ＭＯＭＰ発現用にはプライマーＥｘｐＦＷ３とＥｘｐＲＶ３をプライマーとして用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．２ｋｂのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、ＤＮＡフラグメントの精製を行い、ｐＥＴ２４（ａ）＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩサイトへ結合し、得られた組換えベクターにてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、目的遺伝子の挿入の確認されたクローンｐＳＲＫ−１８、及びｐＳＲＫ−１２を得た。Ｔ７プロモーター及びターミネータープライマーとＭＯＭＰ遺伝子内部配列に基づくプライマーを用いて塩基配列の決定を行い、このクローンが正しい配列をもつことを確認した。
【００６２】
（２）組み換えタンパク質の発現
組み換えＭＯＭＰの発現にはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ） ｐＬｙｓＳ Ｇｏｌｄ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を用いた。発現実験に用いた培地にはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ） クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した。ｐＳＲＫ−１８プラスミドＤＮＡ及びｐＳＲＫ−１２プラスミドＤＮＡをこの宿主大腸菌株にそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体のシングルコロニーを１０ ｍｌのＬＢブロスに接種し、培養液のＡ６００が０．４−０．６になるまで、３７℃で２５０ｒｐｍ振とうしながら培養した。発現誘導にはＩＰＴＧを最終濃度１ ｍＭになるように培養液に加え、同じ培養条件でさらに１．５時間、３時間、オーバーナイト培養し、各時間の培養菌を遠心分離によりペレットとして回収し、−２０℃で保存した。組み換えＭＯＭＰの発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットにより解析した。すなわち、組み換えＭＯＭＰを含む菌体ペレットをＳＤＳサンプルバッファーに浮遊後、１００℃にて５分間煮沸し、遠心分離後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク染色による確認のためにはクーマシーブルーでゲルを染色し、ウェスタンブロットにはゲルを転写バッファー（２５ ｍＭ トリス１９２ ｍＭグリシン ２０％メタノール ０．０２％ ＳＤＳ）中で１５分間平衡化したのち、電気ブロッティング装置（ミニトランスブロット；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて１００Ｖ３時間転写を行った。転写膜をブロックエース（大日本製薬）でブロッキングしたのち、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で１回洗浄し、ウサギ抗精製ＭＯＭＰ免疫血清（１０００倍希釈）又は抗ＭＯＭＰマウスモノクローナル抗体（クローン５９−８−２；１００００倍希釈）と室温で２時間反応させた。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＴＢＳ）で３回膜を洗浄した後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）又は同抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で１時間反応させた。洗浄バッファーで３回、ＴＢＳで１回洗浄後、ＨＲＰ発色用試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてブロット膜を発色させ、蒸留水による洗浄で発色反応を停止させた。図５にＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットの結果を示す（レーン１：Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５株、レーン２：ｐＳＲＫ１２形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導前）、レーン３：ｐＳＲＫ１２形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導３時間後）、レーン４：ｐＳＲＫ１８形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導前）、レーン５：ｐＳＲＫ１８形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導３時間後）、レーン６：ｐＥＴ２４ａ（＋）形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導前）、レーン７：ｐＥＴ２４ａ （＋） 形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導３時間後））。図５中、パネルＡは１０％分離ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色の結果を示す。パネルＢはＡと同様のゲルをウェスタンブロットし、ウサギ抗精製ＭＯＭＰ免疫血清と反応させた結果を示し、パネルＣは抗ＭＯＭＰマウスモノクローナル抗体（クローン５９−８−２）と反応させた結果を示す。
クーマシーブルー染色ゲルでＩＰＴＧによる発現誘導後、４０ ｋＤａのバンドが検出された。このバンドはウェスタンブロットにおいてもＭＯＭＰに対する特異性をもつ２種類の抗体のいずれとも明瞭な反応を示した。なお、図には示していないが、ＩＰＴＧによる発現誘導後のオーバーナイトカルチャーにおいても組み換えＭＯＭＰが認められ、生菌数の顕著な低下も認められなかったため、ｐＳＲＫ−１８及びｐＳＫ−１２は安定した発現系であることが示された。
【００６３】
また、ｐＳＲＫ−１２及びｐＳＲＫ−１８から発現させた４０ｋＤａのタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥとＰＶＤＦ膜へのエレクトロトランスファーを行ったのち、４０ｋＤａのバンドを切り出し、Ｎ末端のアミノ酸配列解析を行ったところ、ｐＳＲＫ−１２からの発現タンパク質の配列はＴＴＶＹＮＱＮＧＴＫであり、全長ＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸配列ではなく、成熟ＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸配列に相当する配列であった。一方、ｐＳＲＫ−１８からの発現タンパク質の配列は２種類の配列を含んであり、ひとつはＭＭＫＲＮＩＬＡＶＩで、大腸菌のＯｍｐＦ全長タンパク質のＮ末端アミノ酸と一致し、もうひとつはＴＴＶＹＮＱＮＧＴＫで成熟ＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸配列と一致した。ｐＳＲＫ−１８からの発現タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥへのアプライ量を減らして解析したところ、４０ｋＤａの位置に極めて近接して２本のバンドが観察されたため、解析用に切り出した４０ｋＤａのバンドにはＭＯＭＰとともに大腸菌のＯｍｐＦが含まれていたと考えられる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）及び該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。本発明のＭＯＭＰ及びそれをコードする遺伝子は、ＭＯＭＰに対する抗体の調製、ウシやヒツジ等の反芻動物におけるＨ． ｓｏｍｎｕｓ感染症に対する効果的で安全性の高いワクチンの調製、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓのハイブリダイゼーションによる直接検出のための、あるいはＨ． ｓｏｍｎｕｓの型を判別（タイピング）するためのプローブの調製などに利用できる。ＭＯＭＰ遺伝子は菌株間又はタイプ間で配列の違いが認められるため、複数の抗原性の異なるＭＯＭＰを免疫学的予防に使用する必要が生じるが、本発明において複数の株から単離同定された配列の異なるＭＯＭＰ遺伝子からそれぞれ組み換えＭＯＭＰが提供できる。またＨ． ｓｏｍｎｕｓへの複数のＭＯＭＰ遺伝子の導入により単一の株から抗原性の違う複数のＭＯＭＰを含むワクチン用抗原を調製することも可能となる。
【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は８０２５株のＭＯＭＰ遺伝子の同定・単離及び発現のために行ったＰＣＲの産物とその産物のプラスミドベクターへのクローニングにより得た組み換えＤＮＡの模式図である。ＰＣＲに用いたプライマーを矢印で示した。
【図２】図２はｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡのジゴキシゲニン標識プローブを用いた８０２５株のゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果である。図の左にＤＮＡ サイズマーカーの位置を、図の右に２ ｋｂのＤＮＡフラグメントの位置を示す。
【図３】図３は８０２５株のＭＯＭＰ遺伝子とその周辺領域の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列である。プロモーター配列（−３５及び１０）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）、開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）、停止コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）、ターミネーター 配列（ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅａｔ）を上線で示した。シグナルペプチド配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を下線で示した。
【図４】図４はＭＯＭＰアミノ酸配列の多重配列解析とＭＯＭＰの二次構造予測モデルである。
【図５】図５は大腸菌でのＭＯＭＰ発現プラスミドｐＳＲＫ１８によるＭＯＭＰ発現実験の結果である。図の左に質量マーカーの位置を、図の右に４０ ｋＤａのＭＯＭＰの位置を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、反芻獣病原細菌外膜タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及びそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、以下、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓともいう）の主要外膜タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該遺伝子により形質転換された形質転換体、該遺伝子を染色体ＤＮＡに導入した細菌、該タンパク質の製造方法、及びＨ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染防御用ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
病原細菌ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）はウシやヒツジの髄膜脳脊髄炎（ＴＥＭＥ）、敗血症、肺炎や流産等の生殖器疾患の原因菌であり、日本国内はもとより世界各地で発生が認められている。なお、ヒツジからの分離菌についてＨｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｖｉｓ 又はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｇｎｉなどの呼称が用いられるが、これらの菌は分類学的に同一の菌群であることから、本明細書ではＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓという名称を用いることとする。
ウシの髄膜脳脊髄炎の予防を目的とした全菌体不活化ワクチンが野外では用いられているが、肺炎を含めて他の病型に対する効果は不明である。この全菌体不活化ワクチンはワクチン接種動物にＩｇＥ抗体を惹起させることが知られており、ワクチン接種動物で観察される副反応との関連性が指摘されている。従って、さまざまな病型に効果を発揮し、より安全性の高いワクチンの開発が望まれている。また、防御抗原と呼ばれる感染防御免疫誘導に関係する蛋白成分要素（ユニット）の中で本質的な有効成分のみを含むワクチンであるサブユニットワクチンはより高い防御能を期待できるワクチンとして開発が期待されている。
【０００３】
病原細菌の菌体表面構造物は感染宿主と病原細菌の相互作用において重要な役割をもつと考えられている。Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの菌体表面構造である外膜にはさまざまなタンパク質が分布し、そのなかで最も多量に存在するタンパク質が主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）である。これまでにＨ． ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰは、免疫グロブリン結合能があること、グラム陰性菌のポーリンタンパク質とＮ−末端アミノ酸配列において相同性があること、菌株間に共通の又は菌株間で反応性の異なる抗原エピトープが存在すること、実験動物に対して免疫原性があること、感染に伴う菌株特異的な抗体応答が存在すること、菌株間で分子量や抗原性が異なることなどの諸性質を有することが明らかにされている（非特許文献１〜５参照）。このような性質はグラム陰性菌のポーリンタンパク質と共通性が認められ、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰはポーリンタンパク質であると考えられる。ポーリンタンパク質は感染や免疫に伴い、殺菌抗体、オプソニン抗体や防御免疫を付与することが知られている。また、ポーリンタンパク質は感染宿主の細胞への付着・侵入、血清抵抗性や細胞死に関与することが報告されている（非特許文献６〜１０参照）。このようなことから、ポーリンタンパク質は有用なワクチン抗原の候補として着目されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｔａｇａｗａ， Ｙ．， Ｈ．Ｉｓｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｎ．Ｙｕａｓａ， １９９３， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ， Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：９１−９６
【非特許文献２】
Ｔａｇａｗａ， Ｙ．， Ｍ．Ｈａｒｉｔａｎｉ， Ｈ．Ｉｓｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｎ．Ｙｕａｓａ， １９９３， Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１：２２５７−２２５９
【非特許文献３】
Ｔａｇａｗａ， Ｙ．， Ｆ．Ｂａｓｔｉｄａ−Ｃｏｒｃｕｅｒａ ａｎｄ Ｌ．Ｂ．Ｃｏｒｂｅｉｌ， ２０００， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｒｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ， Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７１：２４５−２５４
【非特許文献４】
Ｙａｒｎａｌｌ， Ｍ．， Ｒ．Ｐ．， Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉ， ａｎｄ Ｌ．Ｂ． Ｃｏｒｂｅｉｌ， １９８８ａ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３４：１９９３−１９９９
【非特許文献５】
Ｙａｒｎａｌｌ， Ｍ．， Ｒ．Ｐ．， Ｗｉｄｄｅｒｓ， ａｎｄ Ｌ．Ｂ． Ｃｏｒｂｅｉｌ， １９８８ｂ， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ， Ｓｃａｎｄ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２８： １２９−１３７
【非特許文献６】
Ｂａｕｅｒ， Ｆ．Ｊ．， Ｔ． Ｒｕｄｅｌ， Ｍ．， Ｓｔｅｉｎ， ａｎｄ Ｔ．Ｆ．Ｍｅｙｅｒ， １９９９， Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｐｏｒｉｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ， Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３１：９０３−９１３
【非特許文献７】
Ｍｕｌｌｅｒ． Ａ．， Ｄ．Ｇｕｎｔｈｅｒ， Ｆ．Ｄｕｘ， Ｍ．Ｎａｕｍａｎｎ， Ｔ．Ｆ．Ｍｅｙｅｒ， ａｎｄ Ｔ．Ｒｕｎｄｅｌ， １９９９， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ ｐｏｒｉｎ （ＰｏｒＢ） ｃａｕｓｅｓ ｒａｐｉｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｆｌｕｘ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， １８：３３９−３５２
【非特許文献８】
Ｒａｍ， Ｓ．， Ｍ．Ｃ．Ｃｕｌｌｉｎａｎｃｅ， Ａ．Ｍ．Ｂｌｏｍ， Ｓ．Ｇｕｌａｔｉ， Ｄ．Ｐ．ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ， Ｂ．Ｇ．Ｍｏｎｋｓ，Ｃ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｒ．Ｂｏｄｅｎ， Ｃ．Ｅｌｋｉｎｓ， Ｍ．Ｋ．Ｐａｎｇｂｕｒｎ， Ｂ．Ｄａｈｌｂａｃｋ， ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｒｏｃｅ，２００１， Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｃ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｐｏｒｉｎ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９３：２８１−２９５
【非特許文献９】
Ｒａｍ， Ｓ．， Ｄ．Ｐ．ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ， Ｓ．Ｇｕｌａｔｉ， Ｃ．Ｅｌｋｉｎｓ， Ｍ．Ｋ．Ｐａｎｇｂｕｒｎ， ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｒｉｃｅ， １９９８， Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｔｏ ｌｏｏｐ ５ ｏｆ ｐｏｒｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ａ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎｓｉａｌｙｌａｔｅｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８８：６７１−６８０
【非特許文献１０】
ｖａｎ Ｐｕｔｔｅｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｔ．Ｄ．Ｄｕｅｎｓｉｎｇ， ａｎｄ Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎ， １９９８， Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｒｏｖｅｎ ｂｙ Ｐ．ＩＡ， ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｗｉｔｈ ＧＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８８：９４１−９５２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、ウシやヒツジなどの反芻動物におけるＨ． ｓｏｍｎｕｓ感染症に対する効果的で安全性の高いワクチンとして用いることができるＨ． ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ８０２５株から４０ｋＤａの主要外膜タンパク質を精製し、そのアミノ酸配列を決定した。そして該アミノ酸配列を元にプライマーを設計してＰＣＲ法によって主要外膜タンパク質をコードする遺伝子を増幅し、全塩基配列を決定した。本発明者らはまた、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓのさまざまな菌株からの主要外膜タンパク質遺伝子の塩基配列を決定し、推定アミノ酸配列のマルチプルアライメントにより主要外膜タンパク質の２次構造モデルを作成した。これにより主要外膜タンパク質には１６個のβシートと８個のループ構造が存在し、ループ構造はアミノ酸配列の多様性が認められることを明らかにした。さらに、本発明者らは、Ｔ７プロモーター下流に主要外膜タンパク質をコードする遺伝子をつなぐことにより大腸菌で安定かつ高度に組換え外膜主要タンパク質を生産させることに成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質
（２）反芻獣病原細菌がヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）である、上記（１）のタンパク質。
（３）上記（１）又は（２）のタンパク質をコードする遺伝子。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（５）反芻獣病原細菌がヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）である、上記（４）の遺伝子。
（６）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。
（７）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子により形質転換された形質転換体。
（８）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子を染色体ＤＮＡに導入した細菌。
（９）上記（１）のタンパク質の製造方法であって、上記（７）の形質転換体又は上記（８）の細菌を培地に培養し、得られる培養物から該タンパク質を採取することを含む方法。
（１０）上記（７）の形質転換体又は上記（８）の細菌を培養することによって得られたタンパク質を含む反芻獣病原細菌感染防御用ワクチン。
（１１）上記（３）から（５）のいずれかの遺伝子を含む反芻獣病原細菌感染防御用ワクチン。
（１２）配列表の配列番号１に示す塩基配列の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
（１３）反芻獣病原細菌に感染したか、感染する可能性のあるヒトを除く動物に、上記（１０）又は（１１）のワクチンを投与することを含む、反芻獣病原細菌感染の予防方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．本発明の遺伝子のクローニング
本発明の４０ ｋＤａの分子量を有するヘモフィルス・ソムナス（Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ）の主要外膜タンパク質（Ｍａｊｏｒ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＯＭＰ）をコードする遺伝子（以下、ＭＯＭＰ遺伝子という）の供与菌は、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓに属する微生物であれば如何なるものでもよく、例えばＨ．ｓｏｍｎｕｓ ８０２５、Ｄ１２３８、ＮＴ２３０１、２３３６、５４０、６４９、１２９Ｐｔ等が挙げられる。
本発明の遺伝子のクローニングは、例えば以下のようにして行うことができる。
【０００９】
（１） Ｈ．ｓｏｍｎｕｓゲノムＤＮＡの調製
Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌の染色体からゲノムＤＮＡを調製するには常法により行うことができる。具体的には、ＴＥバッファーに浮遊させた菌体を、プロテイナーゼＫとＳＤＳ処理により溶菌し、ＣＴＡＢで処理した後、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで除タンパク後、イソプロパノール沈殿とＤＮＡ沈渣のエタノール洗浄を行って精製することによってゲノムＤＮＡを得ることができる。
【００１０】
（２） タンパク質の精製及びアミノ酸配列の決定
Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質の精製はＴａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６１， ９１−９６の記載に従い行うことができる。具体的には、培養菌体を超音波処理により破砕し、遠心分離によって膜画分を回収し、可溶化させた後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により高度に精製し、最終的にポリアクリルアミド電気泳動により、単一のタンパク質に精製し、アミノ酸配列を市販の自動アミノ酸配列決定機を用いて決定する。
【００１１】
（３） ＰＣＲによるＤＮＡ部分断片のクローニング
決定したアミノ酸配列によりコードされうる塩基配列を割り出し、２０塩基程度の長さの数種のＤＮＡプライマーを合成する。ＤＮＡプライマーの合成は、市販の自動ＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。（１）で作成したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記合成ＤＮＡプライマーを用いて常法によりＰＣＲを行い、目的とする遺伝子の部分断片を増幅し、プラスミドベクターにクローニング後、ジデオキシ法 （Ｓａｎｇｅｒ． Ｆ， １９８１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１４， １２０５−１２１０）等の常法によってその塩基配列を決定する。
【００１２】
（４） インバースＰＣＲ法による隣接領域のクローニング
上記で塩基配列を決定された領域の隣接領域のクローニングは、例えばインバースＰＣＲ法により行う。インバースＰＣＲは、ＤＮＡのコア領域の両端に隣接する未知の塩基配列をＰＣＲ法を用いて幾何級数的に増幅する方法である。具体的にはコア領域を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ＰＣＲ増幅に適した大きさの断片としてこの両端をセルフライゲーションして環状とする。その後二つのプライマーをそれぞれ環状分子内のコア領域の両端部分には相補的な配列を持ち、３’末端が未知の隣接領域側に向いているプライマーを用いて未知の隣接領域をＰＣＲ法により増幅する。
【００１３】
以上のようにして取得される本発明のＨ．ｓｏｍｎｕｓ由来の外膜主要タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである。配列番号１の塩基配列において、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、塩基番号２５４−２５６の開始コドンＡＴＧを有する２５４番目のヌクレオチドから始まり、塩基番号１３９３−１３９５の停止コドンＴＡＡを有する１３９５番目のヌクレオチドで終了する。
【００１４】
本発明のタンパク質は、（ａ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質である。
本発明のタンパク質のシグナル配列は配列番号２に示すアミノ酸配列の１番目から１９番目までの１９個のペプチドである。
【００１５】
上記の「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１６】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又は Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキット等を利用して行うことができる。
【００１７】
上記の「反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有する」とは、反芻獣病原細菌による感染から動物を免疫学的に防御するための抗体を生体内で誘導する活性を有することをいい、当該活性が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。より詳細には、当該活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）である限り、分子量等の量的要素は元のタンパク質と異なっていてもよい。
ここで、反芻獣病原細菌としては、具体的には、反芻動物（ウシ、ヒツジなど）に対して髄膜脳脊髄炎、敗血症、肺炎や生殖器疾患を発症しうるヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）をいう。
【００１８】
上記いずれかのタンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。本発明の部分ペプチドとしては、上記防御免疫誘導活性を発揮すれば如何なるものでもよく、該部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である
【００１９】
本発明のタンパク質は、後述のように該タンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。
また、前記部分ペプチドは、公知のペプチド合成法又は前記タンパク質を適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、上記の本発明のタンパク質をコードする遺伝子であればいかなるものでもよく、具体的には、（ａ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【００２１】
上記の「配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ」としては、配列番号１で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００２２】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本発明の遺伝子のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２３】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１） 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を挿入することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等を用いることができる。プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２， ｐＢＲ３２５， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０， ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３， ＹＥｐ２４， ＹＣｐ５０等）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２４】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片を適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を組み込むことができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２５】
かかるベクターとしては、宿主細胞が大腸菌である場合は、例えばｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製） 、ｐＴｒｘＦＵＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） 、ｐＣＹＢベクター（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＭＤ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社製）等が、宿主細胞が酵母である場合は、例えばｐＥＳＰ−１発現ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製） 、ｐＡＵＲ１２３ベクター（宝酒造社製）、ｐＰＩＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が、また宿主細胞が動物細胞である場合は、例えばｐＭＡＭ−ｎｅｏ発現ベクター （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製） 、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） 、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製） 等が、宿主細胞が昆虫細胞である場合は、例えばｐＢａｃＰＡＫベクター （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製） 、ｐＡｃＵＷ３１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製） 、ｐＡｃＰ（＋）ＩＥ１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製） 等がそれぞれ挙げられる。
【００２６】
（２） 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母；サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞；あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２７】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２８】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１等が用いられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が用いられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９７２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ６９， ２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７５， １９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ， Ｈ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３， １６３−１６８）等が挙げられる。
【００３０】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてはＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３１】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
また、上記の各宿主細胞への遺伝子導入は、組換えベクターによらない方法、例えばパーティクルガン法なども用いることができる。
【００３２】
３．遺伝子導入細菌
本発明の遺伝子は、直接又は組換えベクターを介して細菌の染色体ＤＮＡに導入し、該染色体ＤＮＡ内に本発明の遺伝子によって遺伝子置換を起こさせた細菌を作成することができる、ここで、遺伝子を導入する細菌としては、Ｈ ｓｏｍｎｕｓ菌が用いられるが、肺炎菌などであってもよい。複数のＭＯＭＰ遺伝子の導入によって単一の株から抗原性の違う複数のＭＯＭＰを含むワクチン用抗原を調製することも可能である。
【００３３】
４．本発明のタンパク質の製造
本発明のタンパク質は、前記形質転換体又は遺伝子導入細菌を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３４】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３５】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
また、本発明の遺伝子を染色体ＤＮＡに導入することによって得られた遺伝子導入細菌の培養に用いられる培地としては、当該菌の培養を効率的に行うことのできる培地であればいずれの培地を用いてもよい。例えば、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの場合には当該菌の培養に適したブレインハートインヒュージョンブロス培地やコロンビアブロス培地を基礎培地とし、当該菌の発育を増強することが知られているチアミン誘導体や血清・血液成分等を添加したものを用いることができる。
【００３９】
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４０】
５．本発明のタンパク質及び遺伝子の使用
（１）ワクチンの調製
本発明の組換えタンパク質又はその部分ペプチドは、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染防御用ワクチンとして用いることができる。
また、本発明の遺伝子又はその断片を適当なプラスミドＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡもまた、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染防御用ワクチン（ＤＮＡワクチン）として用いることができる。ＤＮＡワクチンとして用いる組換えＤＮＡは、本発明の遺伝子又はその断片に、その転写を可能とする制御領域、例えば動物細胞内での遺伝子発現のための各種プロモーター及びエンハンサーを連結することによって構築される。ＤＮＡワクチンは、抗原タンパク質そのものを免疫原とする場合に比較すると、数回の接種で免疫応答が持続すること、プラスミドＤＮＡの精製が簡便で安定あるという点で有利である。
【００４１】
本明細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味し、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染予防ワクチン、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌感染による髄膜脳脊髄炎発症の予防ワクチン、並びに髄膜脳脊髄炎の治療ワクチンを含む広い意味で用いられる。
【００４２】
ワクチンとして用いられるタンパクは、上述のようにして製造される組換えタンパク質であるが、化学合成したものでもよい。ワクチンとして用いる部分ペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を適当なタンパク質分解酵素で分解した断片でもよいし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でもよい。部分ペプチドの場合、病原菌の感染を防御する抗体（殺菌抗体、オプソニン抗体、定着阻止抗体）が認識するエピトープを含んでいることが必要である。
【００４３】
本発明のワクチンは、免疫反応を増強するためのアジュバントや薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試薬など）と一緒に配合して医薬組成物の形態で提供することができる。
アジュバンドとしては、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物、ムラミルペプチド、カリウムミョウバン、サポニン若しくはその誘導体、鉱物油又は植物油等を用いることができる。
薬学的に許容可能な担体とは、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトランスフェクションするのに適したものであり、例えば、リポソーム、金粒子、カチオン性ポリマーなどの公知のトランスフェクション試薬が挙げられる。
【００４４】
ワクチン製剤には、更に、リン酸ナトリウム塩、リン酸カリウム塩、水酸化ナトリウム、塩酸等のｐＨ調節剤、硫酸カナマイシン、エリスロマイシン等の抗生物質、乳糖、グルタミン酸カリウム、Ｄ−ソルビトール、アミノ酢酸等の安定剤、塩化ナトリウム等の等張化剤などを加えることも可能である。
【００４５】
本発明のワクチンは、Ｈ．ｓｏｍｕｎｓ感染の防御に有効な量、すなわち、該感染に対して動物において免疫を誘導する量を、単回又は反復投与により投与することができる。ワクチンの投与経路としては、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的又は鼻腔内のいずれであってもよい。また、本発明のワクチンは、他の抗原成分と混合して用いてもよい。
【００４６】
ワクチンの投与量、投与回数は対象動物の種類、症状等より異なるが、例えば本発明のタンパク質を体重あたり１μｇ〜１００ｍｇ程度を、１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することにより動物に防御免疫を誘導することができる。
【００４７】
（２）オリゴヌクレオチドプローブ
上記で決定された配列番号１に示すＨ．ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰの塩基配列において、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ菌株間で高度に保存される領域の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓｏｍｎｕｓのハイブリダイゼーションによる直接検出のためプローブとして用いることができる。上記で決定された配列番号１に示すＨ．ｓｏｍｎｕｓのＭＯＭＰの塩基配列において、菌株間で異なる領域の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドは、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの型を判別（タイピング）するためのプローブとして用いることができる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１） 主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）遺伝子のクローニング及び配列決定（１）細菌株及び培養
Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５、 Ｄ１２３８、 ＮＴ２３０１、 ２３３６、５４０ 、６４９及び １２９Ｐｔの７株を用いた。これらの菌株を血液寒天培地又はチアミン及びトリス添加ブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩＴＴブロス）を用いて７％ＣＯ２存在下で培養した。分子生物学的実験では市販の大腸菌株をルリア−バータニ（ＬＢ）培地で培養した。
【００５０】
（２）ＭＯＭＰの内部アミノ酸配列の決定
Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５株の主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を、Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９３， ６１，９１−９６の記載と同様にして得た。簡単に述べると、ＢＨＩＴＴブロスで１２時間培養した菌体を超音波処理により破砕し、遠心分離して遠心上清を採取した。得られた遠心上清をさらに超遠心分離して沈さを膜画分として回収した。得られた膜画分を２％サルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン・ナトリウム）で可溶化し、超遠心分離により外膜富裕画分を得、これをＭＯＭＰの精製出発材料とした。１％ツウィタージェント３−１４でＭＯＭＰを可溶化したのち、イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過法により精製ＭＯＭＰを得た。精製ＭＯＭＰをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、エレクトロトランスファーによりポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。
クーマシーブルーで染色し、４０ ｋＤａのバンドを切り出し、プロテインシーケンサー ＡＢＩ Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ＨＴにてアミノ酸配列を決定した。
【００５１】
（３）ＭＯＭＰ遺伝子のクローニング
▲１▼ プライマーの設計
プライマーは既に決定されていたＮ末端アミノ酸配列及び新規に決定した２カ所の内部アミノ酸配列に基づいて設計した。各プライマーの構造及び位置を下記表１に示す。
【００５２】
【表１】
ａ 下線を引いた６塩基はＰＣＲ産物のクローニングのための塩基配列を改変。
ｂ 図３に示したＭＯＭＰ配列中の塩基配列番号の位置を示す。
ｃ 図３に示したＭＯＭＰ配列のさらに５’もしくは３’側の配列内に位置することを示す。
【００５４】
▲２▼ コア領域のＰＣＲ法による増幅
ＭＯＭＰの遺伝子領域は３個のＤＮＡ断片としてＰＣＲ法により増幅し、各々のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。これらの配列を解析した結果、ＭＯＭＰ遺伝子をコードするＯＲＦを同定した。さらに塩基配列の確認のため、ＯＲＦとその上・下流の周辺領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、塩基配列を決定した。図１に各ＰＣＲ増幅断片、及びベクターへのクローニングにより得られたクローンを示した。８０２５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＢとＥ又はプライマーＢとＧ、ｒＴａｑポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ反応を行い、０．９５ ｋｂ及び ０．３ ｋｂのＰＣＲ産物を得た。これらのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、得られたクローンをそれぞれｐＳＲＫ４−５及びｐＳＲＫ７−８とした。
【００５５】
▲３▼ 下流域と上流域のＰＣＲ法による増幅
次に、ｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡの下流域のＰＣＲによる増幅のため、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５株のＳａｕ３ＡＩ完全切断染色体ＤＮＡプラスミドライブラリーをテンプレートとして、プライマーＣとＫ、次いでプライマーＣとＬを用いたネステッドＰＣＲにより０．９ ｋｂのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。この産物を上記と同様にＰＣＲクローニングベクターにクローニングし、得られたクローンをｐＳＲＫ８−１とした。
さらにｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡの上流域のＰＣＲによる増幅のためインバースＰＣＲを実施した。まず、インバースＰＣＲに用いる環状化ＤＮＡテンプレートの調製に適した制限酵素を決定するため、サザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。
ｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡ内に１カ所切断部位をもつ制限酵素ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｓａｕ３ＡＩ及びＨｉｎｆＩで８０２５株のゲノムＤＮＡを切断したのち、アガロースゲル電気泳動もかけ、ナイロンメンブレンにブロッティングした後、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブにより検出を行った。結果を図２に示した（レーン１： ＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡ、レーン２： ＨｉｎｄＩＩＩ切断ゲノムＤＮＡ、レーン３： Ｓａｕ３ＡＩ切断ゲノムＤＮＡ、レーン４：ＨｉｎｆＩ切断ゲノムＤＮＡ）。２ ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片がｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡの上流域に位置することが確認された。そこで、この２ ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片をインバースＰＣＲのターゲットとして選んだ。８０２５株のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全切断した後、フェノール・クロロホルムによる抽出とエタノール沈殿により精製し、これをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．１（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて再環状化させた。フェノール・クロロホルムによる抽出とエタノール沈殿により精製したものをテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼを用いて、プライマーｉｎｖＡとｉｎｖＥ、次いでプライマーｉｎｖＢとｉｎｖＦの組み合わせによるネステッドＰＣＲを実施し、１．６ ｋｂのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲクローニングベクターへのクローニングを試みたが、安定してプラスミドを維持するクローンを得ることが困難であり、塩基配列決定はＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングにより、自動ＤＮＡシーケンサー（ジェネティックアナライザー ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００）を用いて行った。
【００５６】
（４）ＭＯＭＰ遺伝子の配列解析
塩基配列の決定の結果を図３に示す。ＭＯＭＰ遺伝子をコードする配列は全長１４４０ｂｐであり、３８０個のアミノ酸をコードしていた（配列番号１）。８０２５株から分離精製されたＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸はＭＯＭＰ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の２０番目アミノ酸に相当していること、最初の１９残基のアミノ酸配列はシグナルペプチドの特徴をもつことから、成熟タンパク質は３６１個のアミノ酸からなり、推定質量は３９９１３ Ｄａであることがわかった。
【００５７】
（５）Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの他の菌株のＭＯＭＰ遺伝子の配列解析
プライマーＦＷ１とＲＶ１、ただし１２９Ｐｔ株にはプライマーＥｘｐＦＷ３とＥｘｐＲＶ４を用いてＭＯＭＰ遺伝子をＰＣＲ反応により増幅し、塩基配列を決定した。各株の塩基配列及び推定アミノ酸配列の特徴を下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
上記の表中、１２９Ｐｔの決定塩基数はＭＯＭＰ遺伝子の内部に相当する８９７塩基であるが、よく保存された５’及び３’の２８塩基及び２３塩基を８０２５株の塩基配列から加えて９４８塩基として計算を行った。
【００６０】
（６）二次構造モデルの作成
各株のＭＯＭＰの推定アミノ酸配列について多重配列解析と二次構造解析を実施することにより、βストランド及びループ構造に関するＭＯＭＰの二次構造モデルを作成した。結果を図４に示す。図４中、配列中のバーはアライメントにより生じたギャップを示し、空欄は８０２５株の配列と同じであることを示す。ＭＯＭＰのβストランド領域（β１からβ１６）及びループ構造領域（Ｌ１からＬ８）を配列の上部に示した。各配列の左の記号はＨ． ｓｏｍｎｕｓの菌株名又は二次構造が既に報告されているポーリンタンパク質の名称を示す。ＭＯＭＰは１６個のβストランドとこれらを結ぶそれぞれ８個の長いループ構造と短いターン構造で構成されていた。配列上の特徴としてβストランドは菌株間でよく保存されているが、ループ構造は菌株間で配列の著しい違いが認められた。ＭＯＭＰの抗原性と質量の違いによる型別において８０２５株と同じＭＯＭＰタイプ１に属するＤ１２３８株及びＮＴ２３０１株ではそれぞれループＬ４で１カ所、Ｌ７で１カ所のアミノ酸配列の違いが認められ、同じくタイプ１の２３３６株ではループＬ７で６カ所、ループＬ８で１カ所のアミノ酸配列の違いが認められた。一方、ＭＯＭＰタイプ３ａの１２９Ｐｔ株、ＭＯＭＰタイプ３ｃの５４０株と６４９株ではＭＯＭＰ遺伝子の後ろ半分で大きく違いが認められ、特にループ構造内にアミノ酸の置換、欠失、挿入が認められた。このように菌体の表面に露出し、感染宿主で惹起される抗体との反応に関与するＭＯＭＰ分子のループ構造、特にＬ４からＬ８においてアミノ酸配列に違いが生じていることはＭＯＭＰを利用するワクチンを設計する上で、重要な知見である。
【００６１】
（実施例２）大腸菌でのＭＯＭＰ遺伝子の発現
（１）発現ベクターへのＭＯＭＰ遺伝子のクローニング
ＭＯＭＰ遺伝子の大腸菌での発現を試みる場合、注意しなければならないのは発現制御の確かなプロモーターの利用と高度に発現した産物の大腸菌外膜への輸送による毒性発現の制御である。この問題点を解決するためにＴ７プロモーターをもつ発現ベクターと成熟ＭＯＭＰに相当するコード領域を利用した。また、全長ＭＯＭＰの発現の可能性についても検討した。すなわち、８０２５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、成熟ＭＯＭＰの発現用にはプライマーＥｘｐＦＷ５とＥｘｐＲＶ３、全長ＭＯＭＰ発現用にはプライマーＥｘｐＦＷ３とＥｘｐＲＶ３をプライマーとして用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．２ｋｂのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、ＤＮＡフラグメントの精製を行い、ｐＥＴ２４（ａ）＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩサイトへ結合し、得られた組換えベクターにてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、目的遺伝子の挿入の確認されたクローンｐＳＲＫ−１８、及びｐＳＲＫ−１２を得た。Ｔ７プロモーター及びターミネータープライマーとＭＯＭＰ遺伝子内部配列に基づくプライマーを用いて塩基配列の決定を行い、このクローンが正しい配列をもつことを確認した。
【００６２】
（２）組み換えタンパク質の発現
組み換えＭＯＭＰの発現にはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ） ｐＬｙｓＳ Ｇｏｌｄ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を用いた。発現実験に用いた培地にはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ） クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した。ｐＳＲＫ−１８プラスミドＤＮＡ及びｐＳＲＫ−１２プラスミドＤＮＡをこの宿主大腸菌株にそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体のシングルコロニーを１０ ｍｌのＬＢブロスに接種し、培養液のＡ６００が０．４−０．６になるまで、３７℃で２５０ｒｐｍ振とうしながら培養した。発現誘導にはＩＰＴＧを最終濃度１ ｍＭになるように培養液に加え、同じ培養条件でさらに１．５時間、３時間、オーバーナイト培養し、各時間の培養菌を遠心分離によりペレットとして回収し、−２０℃で保存した。組み換えＭＯＭＰの発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットにより解析した。すなわち、組み換えＭＯＭＰを含む菌体ペレットをＳＤＳサンプルバッファーに浮遊後、１００℃にて５分間煮沸し、遠心分離後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク染色による確認のためにはクーマシーブルーでゲルを染色し、ウェスタンブロットにはゲルを転写バッファー（２５ ｍＭ トリス１９２ ｍＭグリシン ２０％メタノール ０．０２％ ＳＤＳ）中で１５分間平衡化したのち、電気ブロッティング装置（ミニトランスブロット；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて１００Ｖ３時間転写を行った。転写膜をブロックエース（大日本製薬）でブロッキングしたのち、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で１回洗浄し、ウサギ抗精製ＭＯＭＰ免疫血清（１０００倍希釈）又は抗ＭＯＭＰマウスモノクローナル抗体（クローン５９−８−２；１００００倍希釈）と室温で２時間反応させた。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＴＢＳ）で３回膜を洗浄した後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）又は同抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で１時間反応させた。洗浄バッファーで３回、ＴＢＳで１回洗浄後、ＨＲＰ発色用試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてブロット膜を発色させ、蒸留水による洗浄で発色反応を停止させた。図５にＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットの結果を示す（レーン１：Ｈ． ｓｏｍｎｕｓ ８０２５株、レーン２：ｐＳＲＫ１２形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導前）、レーン３：ｐＳＲＫ１２形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導３時間後）、レーン４：ｐＳＲＫ１８形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導前）、レーン５：ｐＳＲＫ１８形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導３時間後）、レーン６：ｐＥＴ２４ａ（＋）形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導前）、レーン７：ｐＥＴ２４ａ （＋） 形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＩＰＴＧ誘導３時間後））。図５中、パネルＡは１０％分離ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色の結果を示す。パネルＢはＡと同様のゲルをウェスタンブロットし、ウサギ抗精製ＭＯＭＰ免疫血清と反応させた結果を示し、パネルＣは抗ＭＯＭＰマウスモノクローナル抗体（クローン５９−８−２）と反応させた結果を示す。
クーマシーブルー染色ゲルでＩＰＴＧによる発現誘導後、４０ ｋＤａのバンドが検出された。このバンドはウェスタンブロットにおいてもＭＯＭＰに対する特異性をもつ２種類の抗体のいずれとも明瞭な反応を示した。なお、図には示していないが、ＩＰＴＧによる発現誘導後のオーバーナイトカルチャーにおいても組み換えＭＯＭＰが認められ、生菌数の顕著な低下も認められなかったため、ｐＳＲＫ−１８及びｐＳＫ−１２は安定した発現系であることが示された。
【００６３】
また、ｐＳＲＫ−１２及びｐＳＲＫ−１８から発現させた４０ｋＤａのタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥとＰＶＤＦ膜へのエレクトロトランスファーを行ったのち、４０ｋＤａのバンドを切り出し、Ｎ末端のアミノ酸配列解析を行ったところ、ｐＳＲＫ−１２からの発現タンパク質の配列はＴＴＶＹＮＱＮＧＴＫであり、全長ＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸配列ではなく、成熟ＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸配列に相当する配列であった。一方、ｐＳＲＫ−１８からの発現タンパク質の配列は２種類の配列を含んであり、ひとつはＭＭＫＲＮＩＬＡＶＩで、大腸菌のＯｍｐＦ全長タンパク質のＮ末端アミノ酸と一致し、もうひとつはＴＴＶＹＮＱＮＧＴＫで成熟ＭＯＭＰのＮ末端アミノ酸配列と一致した。ｐＳＲＫ−１８からの発現タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥへのアプライ量を減らして解析したところ、４０ｋＤａの位置に極めて近接して２本のバンドが観察されたため、解析用に切り出した４０ｋＤａのバンドにはＭＯＭＰとともに大腸菌のＯｍｐＦが含まれていたと考えられる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）及び該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。本発明のＭＯＭＰ及びそれをコードする遺伝子は、ＭＯＭＰに対する抗体の調製、ウシやヒツジ等の反芻動物におけるＨ． ｓｏｍｎｕｓ感染症に対する効果的で安全性の高いワクチンの調製、Ｈ． ｓｏｍｎｕｓのハイブリダイゼーションによる直接検出のための、あるいはＨ． ｓｏｍｎｕｓの型を判別（タイピング）するためのプローブの調製などに利用できる。ＭＯＭＰ遺伝子は菌株間又はタイプ間で配列の違いが認められるため、複数の抗原性の異なるＭＯＭＰを免疫学的予防に使用する必要が生じるが、本発明において複数の株から単離同定された配列の異なるＭＯＭＰ遺伝子からそれぞれ組み換えＭＯＭＰが提供できる。またＨ． ｓｏｍｎｕｓへの複数のＭＯＭＰ遺伝子の導入により単一の株から抗原性の違う複数のＭＯＭＰを含むワクチン用抗原を調製することも可能となる。
【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は８０２５株のＭＯＭＰ遺伝子の同定・単離及び発現のために行ったＰＣＲの産物とその産物のプラスミドベクターへのクローニングにより得た組み換えＤＮＡの模式図である。ＰＣＲに用いたプライマーを矢印で示した。
【図２】図２はｐＳＲＫ４−５インサートＤＮＡのジゴキシゲニン標識プローブを用いた８０２５株のゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果である。図の左にＤＮＡ サイズマーカーの位置を、図の右に２ ｋｂのＤＮＡフラグメントの位置を示す。
【図３】図３は８０２５株のＭＯＭＰ遺伝子とその周辺領域の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列である。プロモーター配列（−３５及び１０）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）、開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）、停止コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）、ターミネーター 配列（ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅａｔ）を上線で示した。シグナルペプチド配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を下線で示した。
【図４】図４はＭＯＭＰアミノ酸配列の多重配列解析とＭＯＭＰの二次構造予測モデルである。
【図５】図５は大腸菌でのＭＯＭＰ発現プラスミドｐＳＲＫ１８によるＭＯＭＰ発現実験の結果である。図の左に質量マーカーの位置を、図の右に４０ ｋＤａのＭＯＭＰの位置を示す。
Claims (13)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質 - 反芻獣病原細菌がヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）である、請求項１に記載のタンパク質。
- 請求項１又は２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ） 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ反芻獣病原細菌感染に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 反芻獣病原細菌がヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）である、請求項４に記載の遺伝子。
- 請求項３から５のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項３から５のいずれかに記載の遺伝子により形質転換された形質転換体。
- 請求項３から５のいずれかに記載の遺伝子を染色体ＤＮＡに導入した細菌。
- 請求項１に記載のタンパク質の製造方法であって、請求項７に記載の形質転換体又は請求項８に記載の細菌を培地に培養し、得られる培養物から該タンパク質を採取することを含む方法。
- 請求項７に記載の形質転換体又は請求項８に記載の細菌を培養することによって得られたタンパク質を含む反芻獣病原細菌感染防御用ワクチン。
- 請求項３から５のいずれかに記載の遺伝子を含む反芻獣病原細菌感染防御用ワクチン。
- 配列表の配列番号１に示す塩基配列の部分配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
- 反芻獣病原細菌に感染したか、感染する可能性のあるヒトを除く動物に、請求項１０又は１１に記載のワクチンを投与することを含む、反芻獣病原細菌感染の予防方法。
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|---|---|---|---|---|
| JP2015519305A (ja) * | 2012-04-05 | 2015-07-09 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | ヒストフィルス・ソムニの外膜タンパク質とその方法 |
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2003
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