ES2702930T3 - Microorganismo modificado con un comportamiento de separación de biomasa mejorado - Google Patents

Abstract

Un microorganismo modificado de la familia Pasteurellaceae en el cual el gen wcaJ se ha delecionado o en el cual se ha introducido al menos una mutación en el gen wcaJ que conduce a la expresión de una enzima truncada codificada por el gen wcaJ en la cual al menos 100 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se delecionan del extremo C terminal, en el que el gen wcaJ comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: a) ácidos nucleicos que tienen la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 3; b) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; c) ácidos nucleicos que son al menos 70 % idénticos al ácido nucleico de a) o b), siendo la identidad la identidad en la longitud total de los ácidos nucleicos de a) o b); d) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b), siendo la identidad la identidad en la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a) o b), e) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a) o b); y f) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a) o b), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a) o b) anteriores debido a la degeneración del código genético.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo modificado con un comportamiento de separación de biomasa mejorado

La presente invención se refiere a un microorganismo modificado, a un procedimiento para producir un compuesto orgánico y al uso de un microorganismo modificado.

Los compuestos orgánicos, como los pequeños ácidos dicarboxílicos que tienen 6 o menos carbonos, son sustancias químicas comercialmente importantes con muchos usos. Por ejemplo, los diácidos pequeños incluyen 1,4-diácidos, como el ácido succínico, el ácido málico y el ácido tartárico, y la molécula de 5 carbonos, ácido itacónico. Otros diácidos incluyen el ácido oxálico de dos carbonos, el ácido malónico de tres carbonos, el ácido glutárico de cinco carbonos y el ácido adípico de 6 carbonos y también existen muchos derivados de dichos diácidos.

Como grupo, los diácidos pequeños tienen cierta similitud química y sus usos en la producción de polímeros pueden proporcionar propiedades especializadas a la resina. Esta versatilidad les permite integrarse fácilmente en los mercados de infraestructura de productos químicos derivados. Por ejemplo, las moléculas de 1,4-diácido cumplen con muchos de los usos del producto químico anhídrido maleico a gran escala, ya que se convierten en una variedad de productos químicos industriales (tetrahidrofurano, butirolactona, 1,4-butanodiol, 2-pirrolidona) y derivados de succinato succindiamida, succinonitrilo, diaminobutano y ésteres de succinato. El ácido tartárico tiene varios usos en las industrias de alimentos, cuero, metal e impresión. El ácido itacónico forma el material de partida para la producción de 3-metilpirrolidona, metil-BDO, metil-THF y col.

En particular, el ácido succínico o el succinato, estos términos se usan indistintamente en el presente documento, ha despertado un gran interés porque se ha utilizado como un precursor de muchos productos químicos de importancia industrial en las industrias alimentaria, química y farmacéutica. De hecho, un informe del Departamento de Energía de los EE. UU. describe que el ácido succínico es uno de los 12 principales componentes químicos fabricados a partir de biomasa. Por lo tanto, la capacidad de producir diácidos en bacterias sería de importancia comercial significativa.

El documento WO-A-2009/024294 desvela una cepa bacteriana productora de ácido succínico, que es un miembro de la familia de Pasteurellaceae, originalmente aislada del rumen, y capaz de utilizar glicerol como fuente de carbono y cepas variantes y mutantes derivadas de la misma que conservan dicha capacidad, en particular, una cepa bacteriana designada DD1 depositada en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B , D-38124 Braunschweig, Alemania) con el número de depósito DSM 18541 (ID 06-614) y que tiene la capacidad de producir ácido succínico. La cepa DD1 pertenece a la especie Basfia succiniciproducens y a la familia Pasteurellaceae según lo clasificado por Kuhnert et al., 2010. Las mutaciones de estas cepas, en las que se ha alterado el gen IdhA y/o el gen pflD o el gen pflA, se desvelan en el documento WO-A-2010/092155, estando estas cepas mutantes caracterizadas por un aumento significativo de la producción de ácido succínico a partir de fuentes de carbono como el glicerol o mezclas de glicerol y carbohidratos como la maltosa, en condiciones anaerobias en comparación con el tipo silvestre DD1 desvelado en el documento WO-A-2009/024294.

Sin embargo, cuando se utilizan cepas bacterianas como las desveladas en el documento WO-A-2009/024294 o en el documento WO-A-2010/092155 para la producción de compuestos orgánicos tales como ácido succínico, todavía es mejorable la selectividad de las fuentes de carbono para la conversión en los compuestos orgánicos deseados y también el rendimiento del compuesto orgánico deseado.

Además, se ha observado que cuando se usan las cepas bacterianas de la técnica anterior, a veces es difícil separar la biomasa del caldo de fermentación al final del procedimiento de fermentación. Normalmente, la producción fermentativa de compuestos orgánicos, como el ácido succínico, comprende las etapas de cultivar los microorganismos en condiciones de cultivo adecuadas en un medio que comprende al menos una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo produzca el compuesto orgánico deseado y la posterior recuperación de los compuestos orgánicos del caldo de fermentación, en el que, en una primera etapa del procedimiento de recuperación, los microorganismos (es decir, la biomasa) se separan generalmente del medio de cultivo mediante, por ejemplo, sedimentación o centrifugación. Cuando se usan los microorganismos de la técnica anterior, la biomasa no se puede separar fácilmente del caldo de fermentación, que, como parte del caldo de fermentación está atrapado de alguna manera en la biomasa, lo que a veces conduce a la pérdida de una cierta cantidad del caldo de fermentación (y por lo tanto también a una pérdida de una cierta cantidad del compuesto orgánico deseado).

El documento WO 2014/018596 A2 desvela un aislado de la bacteria Escherichia coli (E. coli) que comprende un nivel reducido de actividad p-galactosidasa, una vía defectuosa de síntesis de ácido colónico, una mutación en una proteasa intracelular dependiente de adenosina-5'-trifosfato (ATP), una mutación en el gen lacA, una mutación en el gen thyA, y un ácido nucleico aislado que codifica una enzima a(1,2) fucosiltransferasa que acepta lactosa y el uso de esa bacteria para la producción de un oligosacárido fucosilado.

El documento WO 2013/087884 A1 desvela el uso de un microorganismo mutado y/o transformado que comprende un cambio genético que conduce a una expresión modificada de los reguladores transcripcionales de la proteína de control de la respiración aerobia ArcA y el regulador de isocitrato liasa IcIR, para regular al alza al menos uno de los genes del operón ácido colánico, en el que dicho operón comprende los genes cpsG, cpsB, gmd y fcl que codifican una fosfomanomutasa, una manosa-1-fosfato guanililtransferasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa y GDP-fucosa sintasa, respectivamente.

Por lo tanto, era un objeto de la presente invención superar las desventajas de la técnica anterior.

En particular, un objeto de la presente invención era proporcionar microorganismos que pueden usarse para la producción fermentativa de compuestos orgánicos tales como ácido succínico y que no solo producen los productos orgánicos deseados, tales como ácido succínico, a partir de fuentes de carbono asimilables tales como glicerol, glucosa, sacarosa, xilosa, lactosa, fructosa o maltosa en grandes cantidades, preferentemente solo con cantidades bajas de productos secundarios, pero que también se puedan separar fácilmente del caldo de fermentación en el procedimiento posterior de recuperación del compuesto orgánico, con solo una pequeña cantidad de caldo de fermentación atrapado en la biomasa.

Una contribución para lograr los objetivos mencionados anteriormente es proporcionada por un microorganismo modificado tal como se define en la reivindicación 1.

Sorprendentemente, se ha descubierto que una reducción de la actividad de la enzima que está codificada por el gen wcaJ (esta enzima presumiblemente es una glucosa transferasa), por ejemplo, mediante una deleción del gen wcaJ, da como resultado un microorganismo que, después de la producción fermentativa de compuestos orgánicos como el ácido succínico en un medio de cultivo apropiado, se puede separar, como la biomasa, del medio de cultivo más fácilmente que el microorganismo correspondiente en el que la actividad de este La enzima no ha disminuido. Cuando se usa el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, queda atrapado en la biomasa que se separa en el procedimiento de purificación menos caldo de fermentación, lo que significa que se puede obtener una mayor cantidad de caldo de fermentación por gramo de biomasa utilizado en el procedimiento de fermentación (y por lo tanto una mayor una cantidad del compuesto orgánico deseado, tal como ácido succínico), a partir del cual se aísla el compuesto orgánico.

En este contexto, la expresión “un microorganismo modificado que tiene, en comparación con su tipo silvestre, una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen x”, en el que el gen x es el gen fruA y opcionalmente, como se describe más adelante, el gen IdhA, el gen pflA y/o el gen pflD, la expresión “tipo silvestre" se refiere a un microorganismo en el que la actividad enzima que está codificada por el gen x no ha disminuido, es decir, se refiere a un microorganismo cuyo genoma está presente en un estado como el de antes de la introducción de una modificación genética del gen x. Preferentemente, la expresión “tipo silvestre" se refiere a un microorganismo (por ejemplo, bacterias, células de levadura, células fúngicas, etc.) cuyo genoma, en particular cuyo gen x, está presente en un estado tal como el que se genera naturalmente como resultado de la evolución. La expresión se usa tanto para todo el microorganismo como para genes individuales. Como consecuencia, la expresión “tipo silvestre" preferentemente no abarca, en particular, a aquellos microorganismos, o aquellos genes, cuyas secuencias genéticas han sido modificadas por el hombre, al menos en parte, por medio de procedimientos recombinantes. La expresión “microorganismo modificado" por lo tanto, incluye un microorganismo que ha sido alterado, modificado o diseñado genéticamente (por ejemplo, modificado genéticamente) de manera tal que exhibe un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo, cuando la modificación genética afecta a las secuencias de ácidos nucleicos codificantes del microorganismo) en comparación con el microorganismo de tipo silvestre natural del que se derivó. De acuerdo con una realización particular preferida del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, el microorganismo modificado es un microorganismo recombinante, lo que significa que el microorganismo se ha obtenido usando ADN recombinante. La expresión “ADN recombinante" como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de ADN que resultan del uso de procedimientos de laboratorio (clonación molecular) para reunir material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otra manera no se encontrarían en organismos biológicos. Un ejemplo de dicho ADN recombinante es un plásmido en el que se ha insertado una secuencia de ADN heterólogo.

El tipo silvestre del que se derivan los microorganismos de acuerdo con la presente invención pertenece a la familia Pasteurellaceae.

“Pasteurellaceae" comprende una gran familia de proteobacterias gramnegativas con miembros que van desde bacterias como Haemophilus influenzae hasta los comensales de la mucosa animal y humana. La mayoría de los miembros viven como comensales en las superficies mucosas de aves y mamíferos, especialmente en el tracto respiratorio superior. Pasteurellaceae por lo general, tienen forma de barra y son un grupo notable de anaerobios facultativos. Se distinguen de las Enterobacteriaceae relacionadas por la presencia de oxidasa, y de la mayoría de otras bacterias similares por la ausencia de flagelos. Las bacterias de la familia Pasteurellaceae se han clasificado en varios géneros según las propiedades metabólicas y existen secuencias del ARN 16S y del ARN 23S. Muchas de las Pasteurellaceae contienen genes de la piruvato-formiato-liasa y son capaces de fermentar anaerobiamente las fuentes de carbono en ácidos orgánicos.

En este contexto, se prefiere además que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención pertenezca al género Basfia y se prefiere particularmente que el tipo silvestre del cual se deriva el microorganismo modificado pertenezca a la especie Basfia succiniciproducens.

Lo más preferentemente, el tipo silvestre del cual se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, es Basfia succiniciproducens-cepa DD1 depositado en virtud del Tratado de Budapest en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH), Alemania, con el número de depósito DSM 18541. Esta cepa se aisló originalmente del rumen de una vaca de origen alemán. Las bacterias Pasteurella se pueden aislar del tracto gastrointestinal de los animales y, preferentemente, de los mamíferos. La cepa bacteriana DD1, en particular, puede aislarse del rumen bovino y es capaz de utilizar glicerol (incluyendo glicerol crudo) como fuente de carbono. Otras cepas del género Basfia que pueden usarse para preparar el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención son la cepa de Basfia que ha sido depositada con el número de depósito DSM 22022 o las cepas de Basfia que se depositaron en la Colección de Cultivos de la Universidad de Goteborg (CCUG), Suecia, con los números de depósito CCUG 57335, CCUG 57762, CCUG 57763, CCUG 57764, CCUG 57765 o CCUG 57766. Dichas cepas se aislaron originalmente del rumen de vacas de origen alemán o suizo.

En este contexto, se prefiere particularmente que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención tenga un ADNr 16S de SEQ ID NO: 1 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,9 % con la SEQ ID NO: 1. También se prefiere que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención tenga un ADNr 23S de SEQ ID NO: 2 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,9 % con la SEQ ID NO: 2.

La identidad en valores porcentuales a los que se hace referencia en relación con los diversos polipéptidos o polinucleótidos que se van a usar para el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se calcula, preferentemente, como identidad de los residuos en la longitud completa de las secuencias alineadas, tal como, por ejemplo, la identidad calculada (para secuencias bastante similares) con la ayuda del programa needle del software de bioinformática EMBOSS (Versión 5.0.0, http://emboss.source-forge.net/what/) con los parámetros predeterminados que son, es decir, apertura de un hueco (penalización por apertura de un hueco): 10.0, extensión de un hueco (penalización por extensión de un hueco): 0.5, y archivo de datos (archivo de matriz de puntuación incluido en el paquete): EDNAFUL.

Cabe señalar que los microorganismos recombinantes de acuerdo con la presente invención no solo pueden derivarse de los microorganismos de tipo silvestre mencionados anteriormente, especialmente de Basfia succiniciproducens-cepa DD1, sino también a partir de variantes de estas cepas. En este contexto la expresión “una variante de una cepa" comprende cada cepa que tiene las mismas o esencialmente las mismas características que la cepa de tipo silvestre. En este contexto, se prefiere particularmente que el ADNr 16S de la variante tenga una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 %, más preferentemente al menos el 99,5 %, más preferentemente al menos el 99,6 %, más preferentemente al menos el 99.7 %, más preferentemente al menos el 99,8 % y lo más preferentemente al menos 99,9 % con el tipo silvestre del que se ha derivado la variante. También es particularmente preferido que el ADNr 23 S de la variante tenga una identidad de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 %, más preferentemente al menos el 99,5 %, más preferentemente al menos el 99,6 %, más preferentemente al menos el 99.7 %, más preferentemente al menos el 99,8 % y lo más preferentemente al menos el 99,9 % con el tipo silvestre del que se ha derivado la variante. Una variante de una cepa en el sentido de esta definición se puede obtener, por ejemplo, tratando la cepa de tipo silvestre con un agente químico mutagenizante, rayos X o luz UV.

El microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque, en comparación con su tipo silvestre, la actividad de la enzima que está codificada por el gen wcaJ se reduce.

La reducción de la actividad enzimática (Aactividad) se define como sigue:

en la que, al determinar Aactividad, la actividad en el tipo silvestre y la actividad en el microorganismo modificado se determinan exactamente en las mismas condiciones. Los procedimientos para la detección y determinación de la actividad de la enzima que está codificada por el gen wcaJ se pueden encontrar, por ejemplo, en Nothaft y col.: “ In vivo analysis of HPr reveals a fructose-specific phosphotransferase system that confers high-affinity uptake in Streptomyces coelicolor”, Journal of bacteriology, Vol. 185 (3), páginas 929-937.

La actividad reducida de las enzimas desvelada en el presente documento, en particular la actividad reducida de la enzima codificada por el gen wcaJ, la lactato deshidrogenasa y/o piruvato formiato liasa, puede ser una reducción de la actividad enzimática de al menos un 50 %, en comparación con la actividad de dicha enzima en el tipo silvestre del microorganismo, o una reducción de la actividad enzimática de al menos un 90 %, o más preferentemente una reducción de la actividad enzimática de al menos un 95 %, o más preferentemente una reducción de la actividad enzimática de al menos un 98 %, o incluso más preferentemente una reducción de la actividad enzimática de al menos un 99 % o incluso más preferentemente una reducción de la actividad enzimática de al menos un 99,9 %. La expresión “actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen wcaJ’’ o - como se describe a continuación - “una actividad lactato deshidrogenasa reducida” o “una actividad piruvato formiato liasa reducida”, también abarca un microorganismo modificado que no tiene actividad detectable de estas enzimas.

La expresión “actividad reducida de una enzima’’ incluye, por ejemplo, la expresión de la enzima por dicho microorganismo manipulado genéticamente (por ejemplo, diseñado genéticamente) a un nivel inferior al expresado por el tipo silvestre de dicho microorganismo. Las manipulaciones genéticas para reducir la expresión de una enzima pueden incluir, entre otras, delecionar el gen o partes del mismo que codifican la enzima, alterar o modificar secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión del gen que codifica la enzima (por ejemplo, eliminando promotores fuertes o promotores reprimibles), modificando proteínas (p. ej., proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores transcripcionales y similares) implicados en la transcripción del gen que codifica la enzima y/o la traducción del producto génico, o cualquier otro medio convencional de disminución de la expresión de una rutina génica particular en la técnica (que incluye, pero no se limita a, el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido o ARNi u otros procedimientos para desactivar o bloquear la expresión de la proteína diana). Más adelante, se pueden introducir elementos desestabilizadores en el ARNm o introducir modificaciones genéticas que conduzcan al deterioro de los sitios de unión ribosomal (RBS) del ARN. También es posible cambiar el uso del codón del gen de manera que disminuya la eficiencia y la velocidad de traducción.

También se puede obtener una actividad reducida de una enzima introduciendo una o más mutaciones genéticas que conducen a una actividad reducida de la enzima. Además, una reducción de la actividad de una enzima también puede incluir una inactivación (o la expresión reducida) de las enzimas activadoras que son necesarias para activar la enzima cuya actividad se va a reducir. Mediante este último enfoque, la enzima cuya actividad se va a reducir se mantiene preferentemente en un estado inactivado.

Los microorganismos que tienen una actividad reducida de la enzima codificada por el gen wcaJ pueden ocurrir naturalmente, es decir, debido a mutaciones espontáneas. Un microorganismo puede modificarse para que carezca o reduzca significativamente de la actividad de la enzima que está codificada por el gen wcaJ por diversas técnicas, como el tratamiento químico o la radiación. Para este fin, los microorganismos serán tratados, por ejemplo, por un agente químico mutagenizante, rayos X o luz UV. En una etapa posterior, se seleccionarán los microorganismos que tienen una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen wcaJ. Los microorganismos modificados también se pueden obtener mediante técnicas de recombinación homóloga cuyo objetivo es mutar, interrumpir o escindir el gen wcaJ en el genoma del microorganismo o sustituir el gen con un gen correspondiente que codifica una enzima que, en comparación con la enzima codificada por el gen de tipo silvestre, tiene una actividad reducida.

De acuerdo con la presente invención, una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen wcaJ se logra mediante una deleción del gen wcaJ o mediante una introducción de al menos una mutación en el gen wcaJ. En el contexto de la introducción de al menos una mutación en el gen wcaJ, la al menos una mutación conduce a la expresión de una enzima truncada codificada por el gen wcaJ en el que al menos 100 aminoácidos, preferentemente al menos 125 aminoácidos, más preferido al menos 150 aminoácidos y lo más preferido al menos 160 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se delecionan del extremo C terminal. Tal enzima truncada codificada por el gen wcaJ puede, por ejemplo, obtenerse insertando o delecionando nucleótidos en las posiciones apropiadas dentro del gen wcaJ, lo que conduce a una mutación de cambio de marco, en la que, mediante esta mutación de cambio de marco, se introduce un codón de parada. Por ejemplo, la inserción de un nucleótido en el codón que codifica la lisina entre la timina en la posición 81 y la adenina en la posición 82 conduce a una mutación de cambio de marco mediante la cual se introduce un codón de parada como se muestra en la SEQ ID NO: 16. Tales mutaciones del gen wcaJ puede introducirse, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, seguido de una introducción del gen modificado en el genoma del microorganismo mediante recombinación. Las variantes del gen wcaJ se pueden generar mediante la mutación de la secuencia del gen wcaJ SEQ ID NO: 3 mediante PCR. Se puede utilizar el “Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit”(Stratagene) para llevar a cabo una mutagénesis dirigida. Se puede realizar una mutagénesis aleatoria sobre toda la secuencia codificante, o solo una parte de la misma, de SEQ ID NO: 3 con el “GeneMorph II Random Mutagenesis Kit” (Stratagene).

A continuación, se describe una técnica adecuada para la recombinación, en particular para introducir una mutación o para delecionar secuencias.

Esta técnica también se conoce a veces como la “recombinación de Campbell” en el presente documento (Leenhouts y col. Appl Env Microbiol. (1989), vol. 55, páginas 394-400). “Campbell in”, como se usa en el presente documento, se refiere a un transformante de una célula hospedadora original en la que una molécula de ADN de doble cadena circular completa (por ejemplo, un plásmido) se ha integrado en un cromosoma mediante un solo evento de recombinación homóloga (un evento de entrecruzamiento) y esto da como resultado efectivamente la inserción de una versión linealizada de dicha molécula de ADN circular en una primera secuencia de ADN del cromosoma que es homóloga con una primera secuencia de ADN de dicha molécula de ADN circular. “Campbelled in” se refiere a la secuencia de ADN linealizada que se ha integrado en el cromosoma de un transformante “Campbell in”. Un “Campbell in” contiene una duplicación de la primera secuencia de ADN homóloga, cada copia de la cual incluye y rodea una copia del punto de entrecruzamiento de recombinación homóloga.

“Campbell out”, como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que desciende de un transformante “Campbell in”, en el que se produjo un segundo evento de recombinación homóloga (un evento de entrecruzamiento) entre una segunda secuencia de ADN que está contenida en el ADN insertado linealizado del ADN “Campbelled in”, y una segunda secuencia de ADN de origen cromosómico, que es homóloga a la segunda secuencia de ADN de dicho inserto linealizado, dando como resultado el segundo evento de recombinación la deleción (expulsión) de una parte de la secuencia de ADN integrada, pero, lo que es más importante, dando también resultado a una porción (que puede ser de tan solo una base) del Campbelled integrado en el ADN que permanece en el cromosoma, de manera tal que en comparación con la célula hospedadora original, la célula “Campbell out” contiene uno o más cambios intencionales en el cromosoma (por ejemplo, sustitución de una sola base, sustitución de múltiples bases, inserción de un gen heterólogo o secuencia de ADN, inserción de una copia o copias adicionales de un gen homólogo o un gen homólogo modificado, o inserción de una secuencia de ADN que comprende más de uno de los ejemplos mencionados anteriormente y citados más arriba). Una célula “Campbell out” se obtiene, preferentemente, mediante una contra selección contra un gen que está contenido en una parte (la parte que se desea eliminar) de la secuencia de ADN “Campbelled in”, por ejemplo el gen sacB de Bacillus subtilis, que es letal cuando se expresa en una célula que crece en presencia de aproximadamente 5 % a 10 % de sacarosa. Con o sin una contra selección, se puede obtener o identificar una célula “Campbell out” deseada mediante la selección de la célula deseada, utilizando cualquier fenotipo seleccionable, como, entre otros, la morfología de la colonia, el color de la colonia, la presencia o la ausencia de resistencia a los antibióticos, presencia o ausencia de una secuencia de ADN dada por la reacción en cadena de la polimerasa, presencia o ausencia de una auxotrofia, presencia o ausencia de una enzima, hibridación de ácidos nucleicos de colonias, detección de anticuerpos, etc. El término “Campbell in” y “Campbell out” también se puede utilizar como verbos en varios tiempos para referirse al procedimiento descrito anteriormente.

Se entiende que los eventos de recombinación homóloga que conducen a una “Campbell in” o “Campbell out” pueden ocurrir en un rango de bases de ADN dentro de la secuencia de ADN homóloga, y dado que las secuencias homólogas serán idénticas entre sí por al menos parte de este rango, generalmente no es posible especificar exactamente dónde ocurrió el evento de entrecruzamiento. En otras palabras, no es posible especificar con precisión qué secuencia fue originalmente del ADN insertado y cuál fue originalmente del ADN cromosómico. Además, la primera secuencia de ADN homóloga y la segunda secuencia de ADN homóloga generalmente están separadas por una región de no homología parcial, y es esta región de no homología la que permanece depositada en un cromosoma de la célula “Campbell out”.

Preferentemente, la primera y la segunda secuencia de ADN homólogo tienen al menos aproximadamente 200 pares de bases de longitud, y pueden tener hasta varios miles de pares de bases de longitud. Sin embargo, el procedimiento puede hacerse para trabajar con secuencias más cortas o más largas. Por ejemplo, la longitud de la primera y la segunda secuencia homólogas puede variar de aproximadamente 500 a 2.000 bases, y la obtención de un “Campbell out” a partir de un “Campbell in” es posible al disponer la primera y la segunda secuencia homóloga de modo que sean aproximadamente de la misma longitud, preferentemente con una diferencia de menos de 200 pares de bases y lo más preferentemente, siendo el más corto de los dos al menos el 70 % de la longitud del más largo en pares de bases.

El gen wcaJ cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) ácidos nucleicos que tienen la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 3 ;

b) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ;

c) ácidos nucleicos que son al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % , al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de a) o b), donde la identidad es la identidad en la longitud total de los ácidos nucleicos de a) o b);

d) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b), donde la identidad es la identidad en la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a) o b);

e) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a) o b); y

f) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a) o b), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a) o b) anteriores debido a la degeneración del código genético.

El término “hibridación" como se usa en el presente documento incluye ‘‘cualquier procedimiento por el cual una hebra de molécula de ácido nucleico se une con una hebra complementaria mediante emparejamiento de bases” (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York). La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre las moléculas de ácido nucleico) se ven afectadas por factores tales como el grado de complementariedad entre las moléculas de ácido nucleico, la rigurosidad de las condiciones involucradas, la Tm del híbrido formado, y la relación G:C dentro de las moléculas de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, el término "Tm” se utiliza en referencia a la “temperatura de fusión". La temperatura de fusión es la temperatura a la cual una población de moléculas de ácido nucleico de doble cadena se convierte en medio disociada en cadenas simples. La ecuación para calcular la Tm de las moléculas de ácido nucleico es bien conocida en la técnica. Como lo indican las referencias estándar, una estimación simple del valor de Tm se puede calcular mediante la ecuación: Tm = 81,5 0,41 (% G C), cuando una molécula de ácido nucleico está en solución acuosa en NaCl 1 M (ver, por ejemplo, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados, que tienen en cuenta las características estructurales y de secuencia para el cálculo de Tm. Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la materia y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

En particular, la expresión "condiciones de rigurosidad" se refiere a las condiciones en las que 100 nucleótidos contiguos o más, 150 nucleótidos contiguos o más, 200 nucleótidos contiguos o más o 250 nucleótidos contiguos o más que son un fragmento o idénticos a la molécula de ácido nucleico complementario (ADN, ARN, ADNss o ARNss) se hibridan en condiciones equivalentes a la hibridación en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7 %, NaPO⁴0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 2 * SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C o 65 °C, preferentemente a 65 °C , con una molécula de ácido nucleico específica (ADN; ARN, ADNss o ARNss). Preferentemente, las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7 %, NaPO⁴0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 1 * SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C o 65 °C, preferentemente 65 °C, más preferentemente las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7 %, Na-PO⁴0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C o 65 °C, preferentemente 65 °C. Preferentemente, los nucleótidos complementarios se hibridan con un fragmento o la totalidad de ácidos nucleicos de wcaJ. De modo alternativo, las condiciones de hibridación preferidas abarcan la hibridación a 65 °C en 1 * SSC o a 42 °C en 1 * SSC y 50 % de formamida, seguido de lavado a 65 °C en 0,3 * SSC o hibridación a 50 °C en 4 * SSC o a 40 °C en 6 * SSC y 50 % de formamida, seguido de lavado a 50 °C en 2 * SSC. Otras condiciones de hibridación preferidas son SDS al 0,1 %, SSD 0,1 y 65 °C.

El gen wcaJ que puede delecionarse mediante la "recombinación de Campbell” mencionada anteriormente o en la que se introduce al menos una mutación mediante la "recombinación de Campbell” mencionada anteriormente que comprende un ácido nucleico como se definió anteriormente.

Ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 corresponde al gen wcaJ de Basfia succiniciproducens-cepa DD1.

De acuerdo con una realización preferida del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, este microorganismo no solo se caracteriza por una actividad reducida de la enzima codificada por el gen wcaJ, sino también, en comparación con el tipo silvestre, por

i) una actividad piruvato formiato liasa reducida,

ii) una actividad lactato deshidrogenasa reducida, o

iii) una actividad piruvato formiato liasa reducida y una actividad lactato deshidrogenasa reducida.

Los microorganismos modificados que son deficientes en actividad lactato deshidrogenasa y/o que son deficientes en actividad piruvato formiato liasa se desvelan en el documento WO-A-2010/092155, US 2010/0159543 y WO-A-2005/052135, que desvelan diferentes enfoques para reducir la actividad lactato deshidrogenasa y/o piruvato formiato liasa en un microorganismo, preferentemente en una célula bacteriana del género Pasteurella, particularmente preferido en Basfia succiniciproducens-cepa DD1. Los procedimientos para determinar la actividad piruvato formiato liasa se desvelan, por ejemplo, por Asanuma N. e Hino T. en "Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis”, Appl. Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, páginas 3773-3777 y los procedimientos para determinar la actividad lactato deshidrogenasa se desvelan, por ejemplo, por Bergmeyer, H.U., Bergmeyer J. y Grassl, M. (1983-1986) en "Methods of Enzymatic Analysis”, 3a Edición, Volumen III, páginas 126-133, Verlag Chemie, Weinheim.

En este contexto, se prefiere que la reducción de la actividad lactato deshidrogenasa se logre mediante una inactivación del gen ldhA (que codifica la lactato deshidrogenasa; LdhA; EC 1.1.1.27 o EC 1.1.1.28) y la reducción de la piruvato formiato liasa se logra mediante una inactivación del gen pflA (que codifica un activador de piruvato formiato liasa; PflA; EC 1.97.1.4) o el gen pflD (que codifica la piruvato formiato liasa; PflD; EC 2.3.1.54), en el que la inactivación de estos genes (es decir, ldhA, pflA y pflD) se logra preferentemente mediante una deleción de estos genes o partes de los mismos, mediante una deleción de un elemento regulador de estos genes o al menos una parte de los mismos o mediante una introducción de al menos una mutación en estos genes, particularmente preferida por medio de "la recombinación de Campbell "como se describe anteriormente.

El gen IdhA cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a l) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10;

a2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;

a3) ácidos nucleicos que son al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % , al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de a1) o a2), donde la identidad es la identidad en la longitud total de los ácidos nucleicos de a1) o a2);

a4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % , al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a1) o a2), donde la identidad es la identidad en la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a1) o a2);

a5) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a1) o a2); y

a6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a1) o a2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a1) o a2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

El gen pflA cuya actividad está reducida en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

p1) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12;

p2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;

p3) ácidos nucleicos que son al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % , al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de p1) o p2), donde la identidad es la identidad en la longitud total de los ácidos nucleicos de p1) o p2);

p4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % , al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de p1) o p2), donde la identidad es la identidad en la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de p1) o p2);

p5) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con p1) o p2); y

p6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de p1) o p2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de p1) o p2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

El gen pflD cuya actividad está reducida en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, comprende preferentemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

Yl) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14;

Y2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;

Y3) ácidos nucleicos que son al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % , al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferentemente 100 % idénticos al ácido nucleico de y1) o y2), donde la identidad es la identidad en la longitud total de los ácidos nucleicos de y1) o y2);

Y4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % , al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, más preferentemente 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de y1) o y2), donde la identidad es la identidad en la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de y1) o y2); Y5) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con y1) o y2); y

Y6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de y1) o y2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de y1) o y2) anteriores debido a la degeneración del código genético.

En este contexto, se prefiere que el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención comprenda además:

A) una deleción del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA;

B) una deleción del gen pfID o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID;

C) una deleción del gen pfIA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pfIA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfIA;

D) una deleción del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA

y

una deleción del gen pfID o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID;

o

E) una deleción del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA

y

una deleción del gen pfIA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pfIA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfIA.

Realizaciones particulares preferidas de los microorganismos modificados de acuerdo con la presente invención son:

- células bacterianas modificadas de la familia PasteureIIaceae, en particular se prefiere del género Basfia y aún más preferido de la especie Basfia succiniciproducens, en la cual el gen wcaJ ha sido delecionado o en la que al menos se ha introducido una mutación en el gen wcaJ, en el que la introducción de la al menos una mutación conduce preferentemente a la expresión de una enzima en la cual al menos 100 aminoácidos, preferentemente al menos 125 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos y lo más preferido al menos 160 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se han delecionado del extremo C terminal;

- células bacterianas modificadas de la familia PasteureIIaceae, en particular se prefiere del género Basfia y aún más preferido de la especie Basfia succiniciproducens, en la cual el gen wcaJ ha sido delecionado o en la que al menos se ha introducido una mutación en el gen wcaJ, en el que la introducción de la al menos una mutación conduce preferentemente a la expresión de una enzima en la cual al menos 100 aminoácidos, preferentemente al menos 125 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos y lo más preferido al menos 160 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se han delecionado del extremo C terminal, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad lactato deshidrogenasa está reducida, preferentemente por una modificación del gen IdhA, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y que codifica una LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11;

- células bacterianas modificadas de la familia PasteureIIaceae, en particular se prefiere del género Basfia y aún más preferido de la especie Basfia succiniciproducens, en la cual el gen wcaJ ha sido delecionado o en la que al menos se ha introducido una mutación en el gen wcaJ, en el que la introducción de la al menos una mutación conduce preferentemente a la expresión de una enzima en la cual al menos 100 aminoácidos, preferentemente al menos 125 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos y lo más preferido al menos 160 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se han delecionado del extremo C terminal, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad piruvato formiato liasa está reducida, preferentemente por una modificación del gen pfIA o el gen pfID, en particular por una modificación del gen pfIA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 y que codifica una PflA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13 o por una modificación del gen pflD que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 14 y que codifica una PflD que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15;

- células bacterianas modificadas de la familia PasteureIIaceae, en particular se prefiere del género Basfia y aún más preferido de la especie Basfia succiniciproducens, en la cual el gen wcaJ ha sido delecionado o en la que al menos se ha introducido una mutación en el gen wcaJ, en el que la introducción de la al menos una mutación conduce preferentemente a la expresión de una enzima en la cual al menos 100 aminoácidos, preferentemente al menos 125 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos y lo más preferido al menos 160 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se han delecionado del extremo C terminal, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad lactato deshidrogenasa y piruvato formiato liasa está reducida, preferentemente por una modificación del gen IdhA y del gen pflA, preferentemente por una modificación del gen IdhA y el gen pfIA, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y que codifica una LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 o por una modificación del gen pflA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 y que codifica una PflA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13, o por una modificación del gen IdhA y del gen pfID, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y que codifica una LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 o por una modificación del gen pfID que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 14 y que codifica una PflD que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15.

Además, se proporciona una contribución para resolver los problemas mencionados al principio por un procedimiento para producir un compuesto orgánico o un producto orgánico secundario que sea diferente del compuesto orgánico como se define en la reivindicación 8.

En la etapa I) del procedimiento el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se cultiva en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado produzca el compuesto orgánico, obteniendo así un caldo de fermentación que comprende el compuesto orgánico. Compuestos orgánicos preferidos que pueden producirse por el procedimiento de acuerdo con la presente invención comprenden ácidos carboxílicos tales como ácido fórmico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido 2-hidroxipropiónico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido 3-hidroxibutírico, ácido acrílico, ácido pirúvico o sales de estos ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos tales como ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glutárico, ácido itacónico, ácido adípico o sales de los mismos, ácidos tricarboxílicos tales como ácido cítrico o sales de los mismos, alcoholes tales como metanol o etanol, aminoácidos tales como L-asparagina, ácido L-aspártico, L-arginina, L-isoleucina, L-glicina, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-cisteína, L-serina, L-tirosina, L-triptófano, L-treonina, L-valina, L-histidina, L-prolina, L-metionina, L-lisina, L-leucina, etc.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invención, el compuesto orgánico es ácido succínico. La expresión “ácido succínico", como se usa en el contexto de la presente invención, debe entenderse en su sentido más amplio y también abarca sales del mismo (es decir, succinato), como por ejemplo sales de metales alcalinos, como sales de Na+ y K+ o sales alcalinotérreas, como sales de Mg2+ y Ca2+ o sales de amonio o anhídridos del ácido succínico.

El microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se incuba, preferentemente, en el medio de cultivo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10 a 60 °C o 20 a 50 °C o 30 a 45 °C a un pH de 5,0 a 9,0 o 5,5 a 8,0 o 6,0 a 7,0.

Preferentemente, el compuesto orgánico, especialmente el ácido succínico, se produce en condiciones anaerobias. Las condiciones anaerobias pueden establecerse por medio de técnicas convencionales, como por ejemplo desgasificando los constituyentes del medio de reacción y manteniendo las condiciones anaerobias introduciendo dióxido de carbono o nitrógeno o mezclas de los mismos y opcionalmente hidrógeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o 0,2 a 0,5 vvm. Las condiciones aerobias se pueden establecer por medio de técnicas convencionales, como por ejemplo introduciendo aire u oxígeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o 0,2 a 0,5 vvm. Si procede, se puede aplicar una ligera sobre presión de 0,1 a 1,5 bar en el procedimiento.

La fuente de carbono asimilable se selecciona preferentemente de sacarosa, maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa, maltoheptaosa, D-fructosa, D-glucosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-galactosa, D-manosa, glicerol y sus mezclas de las mismas o composiciones que contienen al menos uno de dichos compuestos, o se seleccionan de productos de descomposición del almidón, celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa. Preferentemente, la fuente de carbono asimilable comprende D-glucosa, maltosa, sacarosa, glicerol o una mezcla de al menos dos de estos compuestos, en el que mezclas de glicerol y D-glucosa, glicerol y sacarosa, glicerol y D-xilosa, glicerol y maltosa y D-glucosa y fructosa son particularmente preferidas.

La concentración inicial de la fuente de carbono asimilable se ajusta preferentemente a un valor en un rango de 5 a 100 g/l, preferentemente de 5 a 75 g/l y más preferentemente de 5 a 50 g/l y se puede mantener en dicho rango durante el cultivo. El pH del medio de reacción se puede controlar mediante la adición de bases adecuadas como, por ejemplo, amoníaco gaseoso, NH⁴HCO³ , (NH⁴)²CO³, NaOH, Na²CO³, NaHCO³, KOH, K²CO³, KHCO³, Mg(OH)², MgCO³, Mg(HCO³)², Ca(OH)², CaCO³, Ca(HCO³)², CaO, CH⁶N²O², C²H⁷N y/o mezclas de los mismos. Estos agentes de neutralización alcalina son especialmente necesarios si los compuestos orgánicos que se forman durante el transcurso del procedimiento de fermentación son ácidos carboxílicos o ácidos dicarboxílicos. En el caso del ácido succínico como compuesto orgánico, Mg(OH)² y MgCO³ son bases particulares preferidas.

La etapa de fermentación I) de acuerdo con la presente invención se puede realizar, por ejemplo, en termentadores agitados, columnas de burbujas y reactores de bucle. Puede encontrar una descripción general de los posibles tipos de procedimientos, incluidos los tipos de agitadores y los diseños geométricos, en Chemiel: “Bio-prozesstechnik: Einführung in die Bioverfahrenstechnik”, Volumen 1. En el procedimiento de acuerdo con la presente invención, las variantes típicas disponibles son las siguientes variantes conocidas por los expertos en la materia o explicadas, por ejemplo, en Chemiel, Hammes y Bailey: “Biochemical Engineering”, tales como alimentación por lotes, alimentación discontinua, alimentación repetida discontinua o también fermentación continua con y sin reciclaje de la biomasa. Dependiendo de la cepa de producción, se pueden efectuar mezclas de aire, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno o gases apropiados para lograr un buen rendimiento (YP/S).

Las condiciones particularmente preferidas para producir el ácido orgánico, especialmente el ácido succínico, en la etapa I) del procedimiento son:

Fuente de carbono asimilable: glicerol, sacarosa, D-glucosa, maltosa, glicerol D-glucosa, glicerol

sacarosa, glicerol maltosa, glicerol D-xilosa, D-glucosa fructosa Temperatura: 30 a 45 °C

pH: 5,5 a 70

Gas suministrado: CO²

Además, se prefiere en la etapa I) del procedimiento que la fuente de carbono asimilable se convierta en el compuesto orgánico, preferentemente en ácido succínico, con un rendimiento de carbono YP/S de al menos 0,5 g/g a aproximadamente 1,28 g/g; como por ejemplo un rendimiento de carbono YP/S de al menos 0,6 g/g, de al menos 0,7 g/g, de al menos 0,75 g/g, de al menos 0,8 g/g, de al menos 0,85 g/g , de al menos 0,9 g/g, de al menos 0,95 g/g, de al menos 1,0 g/g, de al menos 1,05 g/g, de al menos 1,1 g/g, de al menos 1,15 g/g, de al menos 1,20 g/g, de al menos 1,22 g/g, o de al menos 1,24 g/g (compuesto orgánico/carbono, preferentemente ácido succínico/carbono).

Además, se prefiere en la etapa I) del procedimiento que la fuente de carbono asimilable se convierta en el compuesto orgánico, preferentemente en ácido succínico, con un rendimiento de productividad específico de al menos 0,6 g/g D C W V 1 del compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, o al menos de al menos 0,65 g/g D C W V , de al menos 0,7 g/g D C W V , de al menos 0,75 g/g D C W V o de al menos 0,77 g/g D C W V del compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico.

Además, se prefiere en la etapa I) del procedimiento que la fuente de carbono asimilable se convierta en el compuesto orgánico, preferentemente en ácido succínico, con un rendimiento espacio-temporal para el compuesto orgánico, preferentemente para el ácido succínico, de al menos 2,2 g/(l x h) o de al menos 2,5 g/(l x h), al menos 2,75 g/(l x h), al menos 3 g/(l x h), al menos 3,25 g/(l x h), al menos 3,5 g/(l x h), al menos 3,7 g/(l x h), al menos 4,0 g/(l x h) al menos 4,5 g/(l x h) o al menos 5,0 g/(l x h) del compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico. De acuerdo con otra realización preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invención en la etapa I) del procedimiento, el microorganismo modificado está convirtiendo al menos 20 g/l, más preferentemente al menos 25 g/l e incluso más preferentemente al menos 30 g/l de fuente de carbono asimilable, preferentemente una fuente de carbono asimilable seleccionada de sacarosa, maltosa, D-fructosa, D-glucosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-galactosa, D-manosa y/o glicerol, en al menos 20 g/l, más preferentemente al menos 25 g/l e incluso más preferentemente al menos 30 g/l del compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico.

Los diferentes parámetros de rendimiento descritos en el presente documento (“rendimiento de carbono’’ o “ YP/S’; “rendimiento de productividad específico"; o “rendimiento espacio-temporal (STY)") son bien conocidos en la técnica y se determinan como se describe, por ejemplo, por Song and Lee, 2006. “Rendimiento de carbono’’ e “ YP/S" (cada uno expresado en masa del compuesto orgánico producido/masa de fuente de carbono asimilable consumida) se usan en el presente documento como sinónimos. El rendimiento de productividad específico describe la cantidad de un producto, como el ácido succínico, que se produce por h y l de caldo de fermentación L por g de biomasa seca. La cantidad de peso de células secas indicada como “DCW describe la cantidad de microorganismo biológicamente activo en una reacción bioquímica. El valor se da como g de producto por g de DCW por h (es decir, g/g D C W V ). El rendimiento espacio-temporal (STY) se define como la relación entre la cantidad total de compuesto orgánico formado en el procedimiento de fermentación y el volumen del cultivo, considerado durante todo el tiempo de cultivo. El rendimiento espacio-temporal también se conoce como “productividad volumétrica’’.

En la etapa II del procedimiento, el compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, se recupera del caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento.

Normalmente, el procedimiento de recuperación comprende la etapa de separar los microorganismos recombinantes del caldo de fermentación como la llamada “biomasa”. Los procedimientos para eliminar la biomasa son conocidos por los expertos en la materia y comprenden filtración, sedimentación, flotación o combinaciones de los mismos. En consecuencia, la biomasa se puede eliminar, por ejemplo, con centrifugadoras, separadores, decantadores, filtros o en un aparato de flotación. Para una recuperación máxima del producto de valor, el lavado de la biomasa suele ser recomendable, por ejemplo, en forma de diafiltración. La selección del procedimiento depende del contenido de biomasa en el caldo de fermentación y de las propiedades de la biomasa, y también de la interacción de la biomasa con el compuesto orgánico (por ejemplo, el producto de valor). En una realización, el caldo de fermentación se puede esterilizar o pasteurizar. En una realización adicional, el caldo de fermentación se concentra. Dependiendo del requisito, esta concentración se puede hacer por lotes o de manera continua. El rango de presión y temperatura debe seleccionarse de modo que, en primer lugar, no se produzcan daños en el producto y, en segundo lugar, se requiera un uso mínimo del aparato y la energía. La selección adecuada de los niveles de presión y temperatura para una evaporación multietapa en particular permite el ahorro de energía.

El procedimiento de recuperación puede comprender además etapas de purificación adicionales en las que el compuesto orgánico, preferentemente ácido succínico, se purifica adicionalmente. Sin embargo, si el compuesto orgánico se convierte en un producto orgánico secundario mediante reacciones químicas como se describe a continuación y dependiendo del tipo de reacción y las condiciones de reacción, no necesariamente se requiere una purificación adicional del compuesto orgánico. Para la purificación del compuesto orgánico obtenido en la etapa II) del procedimiento, preferentemente para la purificación del ácido succínico, se pueden usar procedimientos conocidos por los expertos en la materia, como por ejemplo cristalización, filtración, electrodiálisis y cromatografía. En el caso del ácido succínico como compuesto orgánico, por ejemplo, el ácido succínico se puede aislar precipitándolo como un producto de succinato de calcio usando hidróxido, óxido, carbonato o hidrógenocarbonato de calcio para neutralizar y filtrar el precipitado. El ácido succínico se recupera del succinato de calcio precipitado mediante acidificación con ácido sulfúrico, seguido de filtración para eliminar el sulfato de calcio (yeso) que precipita. La solución resultante puede purificarse adicionalmente por medio de cromatografía de intercambio iónico con el fin de eliminar los iones residuales no deseados. De modo alternativo, si se han usado hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio o mezclas de los mismos para neutralizar el caldo de fermentación, el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento puede acidificarse para transformar el succinato de magnesio contenido en el medio en la forma ácida (es decir, ácido succínico), que posteriormente puede cristalizarse enfriando el medio acidificado. Ejemplos de otros procedimientos de purificación adecuados se describen en los documentos EP-A-1 005 562, WO-A-2008/010373, WO-A-2011/082378, WO-A-2011/043443, WO-A-2005/030973, WO-A-2011/123268 y WO-A-2011/064151 y EP-A-2 360 137.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invención, el procedimiento comprende además la etapa del procedimiento:

III) convertir el compuesto orgánico contenido en el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento o convertir el compuesto orgánico recuperado obtenido en la etapa de procedimiento II) en un producto orgánico secundario que es diferente del compuesto orgánico en al menos una reacción química.

En el caso del ácido succínico como compuesto orgánico, los productos orgánicos secundarios preferidos se seleccionan del grupo que consiste en ésteres de ácido succínico y sus polímeros, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanodiol (BDO), gamma-butirolactona (GBL) y pirrolidonas.

De acuerdo con una realización preferida para la producción de THF, BDO y/o GBL, este procedimiento comprende:

b1) o bien la hidrogenación catalítica directa del ácido succínico obtenido en las etapas I) o II) del procedimiento a THF y/o BDO y/o GBL o

b2) la esterificación química del ácido succínico y/o las sales del ácido succínico obtenidas en las etapas I) o II) del procedimiento en su correspondiente éster di-alquilo inferior y la subsiguiente hidrogenación catalítica de dicho éster a THF y/o BDO y/o GBL.

De acuerdo con una realización preferida para la producción de pirrolidonas, este procedimiento comprende:

b) la conversión química de las sales de amonio del ácido succínico obtenidas en las etapas I) o II) del procedimiento en pirrolidonas de una manera conocida per se.

Para detalles de la preparación de estos compuestos se hace referencia a los documentos US-A-2010/0159543 y WO-A-2010/092155.

Además, se proporciona una contribución para resolver los problemas mencionados al principio mediante el uso del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención para la producción fermentativa de compuestos orgánicos. Compuestos orgánicos preferidos son aquellos compuestos que ya se han mencionado en relación con el procedimiento de acuerdo con la presente invención, siendo el ácido succínico el compuesto orgánico más preferido. Además, las condiciones preferidas para la producción fermentativa de compuestos orgánicos, preferentemente de ácido succínico, son aquellas condiciones que ya se han descrito en relación con la etapa I) del procedimiento del procedimiento de acuerdo con la presente invención.

La invención se explica ahora con más detalle con la ayuda de figuras y ejemplos no limitativos.

La Figura 1 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB (SEQ ID NO: 5).

La Figura 2 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB AldhA (SEQ ID NO: 6).

La Figura 3 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB ApflA (SEQ ID NO: 7).

La Figura 4 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB AwcaJ (SEQ ID NO: 8).

La Figura 5 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB ApflD (SEQ ID NO: 9).

La Figura 6 muestra un sedimento de células obtenido por sedimentación de diferentes medios de cultivo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Procedimiento general para la transformación de Basfia succiniciproducens

Tabla 1: Nomenclatura de la DD1 de tipo silvestre y mutantes mencionados en los ejemplos

Basfia succiniciproducens DD1 (tipo silvestre) se transformó con ADN mediante electroporación utilizando el siguiente protocolo:

Para preparar un cultivo previo, se inoculó DD1 de un lote congelado en 40 ml de BHI (infusión de cerebro y corazón; Becton, Dickinson and Company) en un matraz de agitación de 100 ml. La incubación se realizó durante la noche a 37 °C; 200 rpm. Para preparar el cultivo principal, se colocaron 100 ml de BHI en un matraz de agitación de 250 ml y se inocularon hasta una DO final (600 nm) de 0,2 con el precultivo. La incubación se realizó a 37 °C, 200 rpm. Las células se recogieron a una DO de aproximadamente 0,5, 0,6 y 0,7, el sedimento se lavó una vez con glicerol frío al 10 % a 4 °C y se resuspendió en 2 ml de glicerol al 10 % (4 °C).

Se mezclaron 100 pl de células competentes con 2-8 pg de ADN de plásmido y se mantuvieron en hielo durante 2 minutos en una cubeta de electroporación con un ancho de 0,2 cm. Electroporación en las siguientes condiciones: 400 O; 25 pF; 2,5 kV (Gene Pulser, Bio-Rad). Se añadió 1 ml de BHI enfriado inmediatamente después de la electroporación y se realizó la incubación durante aproximadamente 2 horas a 37 °C.

Las células se colocaron en placas con BHI con 5 mg/l de cloranfenicol y se incubaron durante 2 a 5 días a 37 °C hasta que las colonias de los transformantes eran visibles. Los clones se aislaron y se volvieron a sembrar en estría en BHI con 5 mg/l de cloranfenicol hasta que se obtuvo la pureza de los clones.

Ejemplo 2: Generación de construcciones de deleción

Los plásmidos de mutación/deleción se construyeron basándose en el vector pSacB (SEQ ID NO: 5). La Figura 1 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB. Las regiones flanqueantes en 5' y 3' (aproximadamente 1500 pb cada una) del fragmento cromosómico, que deberían delecionarse, se amplificaron mediante PCR a partir del ADN cromosómico de Basfia succiniciproducens y se introdujeron en dicho vector utilizando técnicas estándar. Normalmente, al menos el 80 % del ORF fue objeto de una deleción. De esta manera, se construyeron los plásmidos de deleción para la lactato deshidrogenasa ldhA, pSacB_delta_ldhA (SEQ ID NO: 6), la enzima activadora de la piruvato formiato liasa pflA, pSacB_delta_pflA (SEQ ID NO: 7), el supuesto transportador específico de fructosa wcaJ, pSacB_delta_wcaJ (s Eq ID NO: 8) y la piruvato formiato liasa pfID, pSacB_delta_pfD> (Se Q ID NO: 9). Las Figuras 2, 3, 4 y 5 muestran mapas esquemáticos del plásmido pSacB_delta_IdhA, pSacB_delta_pflA, pSacB_delta_wcaJ y pSacB_delta_pflD, respectivamente.

En la secuencia plasmídica de pSacB (SEQ ID NO: 5) el gen sacB está contenido en las bases 2380-3801. El promotor sacB está contenido en las bases 3802-4264. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 526­ 984. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 1477-2337 (ver fig. 1).

En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_ldhA (SEQ ID NO: 6) la región flanqueante en 5' del gen IdhA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1519-2850, mientras que la región flanqueante en 3' del gen ldhA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 62-1518. El gen sacB está contenido en las bases 5169-6590. El promotor sacB está contenido en las bases 6591-7053. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 3315-3773. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 4266-5126 (ver fig. 2).

En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_pflA (SEQ ID NO: 7) la región flanqueante en 5' del gen pflA, que es homologa al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1506-3005, mientras que la región flanqueante en 3' del gen pflA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-1505. El gen sacB gen está contenido en las bases 5278-6699, el promotor sacB está contenido en las bases 6700-7162. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 3424-3882. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 4375-5235 (ver fig. 3).

En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_wcaJ (SEQ ID NO: 8) la región flanqueante en 5' del gen wcaJ, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1506-3122, mientras que la región flanqueante en 3' del gen wcaJ, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-1505. El gen sacB está contenido en las bases 5395-6816. El promotor sacB está contenido en las bases 6817-7279. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 3541-3999. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 4492-5352 (ver fig. 4).

En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_pflD (SEQ ID NO: 9) la región flanqueante en 5' del gen pflD, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1533-2955, mientras que la región flanqueante en 3' del gen pflD, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 62-1532. El gen sacB está contenido en las bases 5256-6677. El promotor sacB está contenido en las bases 6678-7140. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 3402-3860. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 4353-5213 (ver fig. 5).

Ejemplo 3: Generación de cepas productoras de succinato mejoradas

a) Basfia succiniciproducens DD1 se transformó como se describió anteriormente con el pSacB_delta_ldhA y fue “Campbelled in” para producir la cepa “Campbell in”. La transformación e integración en el genoma de Basfia succiniciproducens fue confirmado por PCR para obtener el evento de integración del plásmido en el genoma de Basfia succiniciproducens.

La cepa “Campbell in” fue a continuación “Campbelled out” utilizando placas de agar que contenían sacarosa como un medio de selección de contador, seleccionando la pérdida (de función) del gen sacB. Por lo tanto, las cepas “Campbell in” se incubaron en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI sin antibióticos) a 37 °C, 220 rpm durante la noche. El cultivo durante la noche se extendió luego sobre placas de sacarosa que contenían BHI recién preparado (10 %, sin antibióticos) y se incubó durante la noche a 37 °C (“primera transferencia de sacarosa”). Una sola colonia obtenida de la primera transferencia se sembró nuevamente en placas de sacarosa que contenían BHI recién preparado (10 %) y se incubó durante la noche a 37 °C (“segunda transferencia de sacarosa”). Este procedimiento se repitió hasta un mínimo de cinco transferencias (“tercera, cuarta, quinta transferencia de sacarosa”) en sacarosa. La expresión “primera a quinta transferencia de sacarosa” se refiere a la transferencia de una cepa después de la integración cromosómica de un vector que contiene un gen sacB de la levansacarosa sobre placas de agar que contienen sacarosa y medio de crecimiento con el fin de seleccionar cepas con la pérdida del gen sacB y las secuencias plasmídicas circundantes. Una sola colonia de las quintas placas de transferencia se inoculó en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI sin antibióticos) y se incubó a 37 °C, 220 rpm durante la noche. El cultivo de una noche se diluyó en serie y se sembró en placas de BHI para obtener colonias individuales aisladas.

Las cepas “Campbelled out” que contienen la mutación/deleción del gen ldhA fueron confirmados por la sensibilidad al cloranfenicol. Los mutantes de mutación/deleción entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo al mutante de deleción de ldhA de Basfia succiniciproducens DD1 NdhA.

b) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA fue transformada con pSacB_delta_pflD como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación e integración se confirmó por p Cr . La cepa “Campbell in” fue a continuación “Campbelled out” como se describió anteriormente. Los mutantes de deleción entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo al mutante de doble deleción de ldhA pflD de Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApflD.

c) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApflD fue transformada con pSacB_delta_wcaJ como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación e integración se confirmó por p Cr . La cepa “Campbell in” fue a continuación “Campbelled out” como se describió anteriormente. Los mutantes de deleción entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo al mutante de triple deleción de IdhA pflD wcaJ de Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApflD AwcaJ.

d) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA fue transformada con pSacB_delta_pflA como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación e integración se confirmó por p Cr . La cepa “Campbell in” fue a continuación “Campbelled out” como se describió anteriormente. Los mutantes de deleción entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo al mutante de doble deleción de ldhA pflA de Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApflA.

e) Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApflA fue transformada con pSacB_delta_wcaJ como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación e integración se confirmó por PCR. La cepa “Campbell in” fue a continuación “Campbelled out” como se describió anteriormente.

Los mutantes de deleción entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo al mutante de triple deleción de IdhA pflA wcaJ de Basfia succiniciproducens DD1 AldhA ApflA AwcaJ.

f) Basfia succiniciproducens DD1 se transformó con pSacB_delta_wcaJ como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa de “Campbell in”. La transformación e integración se confirmó por PCR.

La cepa “Campbell in” fue a continuación “Campbelled out” como se describió anteriormente. Los mutantes de deleción entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo al mutante de deleción de wcaJ de Basfia succiniciproducens DD1 AwcaJ.

Ejemplo 4: Cultivo de varias cepas DD1 en glucosa y sacarosa

La productividad de la DD1 se comparó con la productividad de la cepa mutante DD1 AwcaJ en presencia de glucosa o sacarosa como fuente de carbono.

La productividad de la DD1 AldhA ApflD se comparó con la productividad de la cepa mutante DD1 AldhA ApflD AwcaJ en presencia de glucosa o sacarosa como fuente de carbono.

La productividad de la DD1 AldhA ApflA se comparó con la productividad de la cepa mutante DD1 AldhA ApflA AwcaJ en presencia de glucosa o sacarosa como fuente de carbono.

La productividad se analizó utilizando los medios y las condiciones de incubación que se describen a continuación.

1. Preparación del medio

La composición y preparación del medio de cultivo es como se describe en las siguientes tablas 2, 3, 4 y 5.

Tabla 2: Composición de la solución de oligoelementos.

Tabla 3: Composición de la solución de vitaminas.

Tabla 4: Composición del medio LSM para el cultivo en glucosa.

Tabla 5: Composición del medio LSM para el cultivo en sacarosa.

2. Cultivos y análisis.

Para cultivar las bacterias del cultivo principal de una placa de BHI-agar recién cultivada se usó para inocular hasta una DO600 = 0,75 una botella de 100 ml de suero con tapón de caucho de butilo hermético que contiene 50 ml del medio líquido descrito en las tablas 2 y 3 con una atmósfera de CO². Las botellas se incubaron a 37 °C y 160 rpm (diámetro de agitación: 2,5 cm). El consumo de las fuentes de C y la producción de ácidos carboxílicos se cuantificó mediante HPLC (los procedimientos de HPLC se describen en las tablas 10 y 11) después de 24 h o 48 h. El crecimiento celular se midió midiendo la absorbancia a 600 nm (DO600) utilizando un espectrofotómetro (Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Suecia).

3. Resultados

Los resultados de los experimentos de cultivo con diferentes cepas DD1 se muestran en las tablas 6, 7 y 8. Como se puede ver a partir de estos resultados, una reducción de la actividad de la enzima que está codificada por la célula AwcaJ conduce a una mayor producción de ácido succínico.

Además, muestras obtenidas por cultivo de la cepa DD1 AldhA ApflD/DD1 AldhA ApflA y la cepa DDIAldhA ApflD AwcaJ/DDIAIdhA ApflA AwcaJ después de 24 horas o 48 horas de incubación se transfirieron a un tubo de 15 ml para medir los volúmenes de sobrenadante obtenidos después de la centrifugación. Como se muestra en la tabla 9, una reducción de la actividad de la enzima que está codificada por la célula AwcaJ conduce a microorganismos modificados que muestran un comportamiento de sedimentación significativamente mejorado (se obtiene un sedimento celular más denso después de la centrifugación) y, por lo tanto, se pueden eliminar más fácilmente del medio de cultivo en el procedimiento de purificación posterior.

Tabla 6: Cultivo de la cepa DD1 y la cepa DD1 AwcaJ en glucosa y sacarosa.

Tabla 7: Cultivo de la cepa DD1 AldhA ApflD y la cepa DD1 AldhA ApflD AwcaJ en glucosa y sacarosa.

Tabla 8: Cultivo de la cepa DD1 AldhA ApflA y la cepa DD1 AldhA ApflA AwcaJ en glucosa y sacarosa

Tabla 9: Volúmenes de sobrenadante obtenidos después de la centrifugación (4.600 rpm, 10 min) de 10 ml de cultivos bacterianos.

Tabla 10: Procedimiento de HPLC (ZX-THF50) para el análisis de glucosa, ácido succínico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido acético, ácido pirúvico y etanol

continuación

Tabla 11: Procedimiento de HPLC (Fast-CH) para el análisis de glucosa y sacarosa

SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 (secuencia nucleotídica del ADNr 16 S de la cepa DD1)

tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggággaaagcttgctttctttgccga cgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatat cttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctacc aagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagca gtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtg acgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggt aatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttltaagtgagatgtgaaagccccgg gcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagag atgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggatt agata ccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgacc gcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatg caacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctg catggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgg gaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctaca cacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagt ctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccg cccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggg gtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcgg

SEQ ID NO: 2 (secuencia nucleotídica del ADNr 23 S de la cepa DD1) agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcaga ggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaaccc agtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgagg aaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaat cggctgggaagccgggcggcacagggtgatagceecgtacttgaaaatoattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcggga cacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaagg aaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtga ctgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaact gggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggacc gaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggclgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttctccccg aaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcggctagggggccatcccggcttaccaacccgatgc aaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagacacacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagacc gccagctaaggtcccaaagtttatattaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatc atttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagctgcggc atcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggctgctggacgtatcacgagtgcg aatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaagaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcag ggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgtagtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggg gacggagtaggttaggttatcgacctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaaca ccgagagatgatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagattataata aaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtgaaggaactaggcaaaata

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SEQ ID NO: 3 (secuencia nucleotídica del gen wcaJ de la cepa DD1)

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SEQ ID NO: 4 (secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por el gen wcaJ anterior)

MIKRLFDIWALIALILFSPLYLFVAYKVKQNLGSPVLFKQTRPGLHGKPFEMIKFRTMKDGADEN GNILPDAERLTPFGKMLRATSLDELPELWNVLKGDMSLVGPRPLLMEYLPLYNERQAKRHEVK PGITGYAQVNGRNAISWEQKFELDAWYVEHQSLWLDLKIIAKTIQKVIAKDDINAADDATMPKFE GNKKS

SEQ ID NO: 5 (secuencia nucleotídica completa del plásmido pSacB) tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatatcgtcgacatcgatgctcttctgcgtt aattaacaattgggatcctctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttatt ttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgca aacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcgg atgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggagg acggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccg gattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcg atattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttcc ggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaa cattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgatacca gattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatca

ccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttc atcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctg tatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcg cttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgtttlttattggtg agaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcg 'ctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggtt atccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgc gttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacagg actataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttc tcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcac gaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactgg cagcagccacíggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctaca ctagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctctlgatccggcaaacaaacc accgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacgg ggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaagg ccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttct tgccttlgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgatlgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacatt gtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgtt cagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcaittttgat ccgcgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagc ggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgca gaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttcc agtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttc atcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctg atgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcaga tgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccag cgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcattt1taggatctccggctaatgc aaagacgatgtggtagccgtgatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcaga agagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaata tgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaagg ttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgtlcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttga agatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgccaaagtatacactttgccctttacacatttt aggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggattgcaactggtctattttcct cttttgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttcttttcattctctgtattttttata gtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaataatagtgaacggcaggt atatgtgatgggttaaaaaggatcggcggccgctcgatttaaatc

SEQ ID NO: 6 (secuencia nucleotídica completa del plásmido pSacB_delta_/dM) tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatgggtcagcctgaacgaaccgcactt gtatgtaggtagttttgaccgcccgaatattcgttataccttggtggaaaaattcaaaccgatggagcaattatacaattttgtggcggcgc aaaaaggtaaaagcggtatcgtctattgcaacagccgtagcaaagtggagcgcattgcggaagccctgaagaaaagaggcatttc cgcagccgcttatcatgcgggcatggagccgtcgcagcgggaagcggtgcaacaggcgtttcaacgggataatattcaagtggtgg tggcgaccattgcttttggtatggggatcaacaaatctaatgtgcgttttgtggcgcattttgatttatctcgcagcattgaggcgtattatcag

gaaaccgggcgcgcggggcgggacgacctgccggcggaagcggtactgttttacgagccggcggattatgcctggttgcataaaat tttattggaagagccggaaagcccgcaacgggatattaaacggcataagctggaagccatcggcgaatttgccgaaagccagacc tgccgtcgtttagtgctgttaaatJatttcggcgaaaaccgccaaacgccatgtaataactgtgatatctgcctcgatccgccgaaaaaat atgacggattattagacgcgcagaaaatcctttcgaccatttatcgcaccgggcaacgtttcggcacgcaatacgtaatcggcgtaatg cgcggtttgcagaatcagaaaataaaagaaaatcaacatgatgagttgaaagtclacggaatfggcaaagataaaagcaaagaat actggcaatcggtaattcgtcagctgattcatttgggctttgtgcaacaaatcatcagcgatttcggcatggggaccagattacagctcac cgaaagcgcgcgtcccgtgctgcgcggcgaagtgtctttggaactggccatgccgagattatcttecattaccatggtacaggctccgc aacgcaatgcggtaaccaactacgacaaagatttatttgcccgcctgcgtttcctgcgcaaacagattgccgacaaagaaaacattc cgccttatattgtgttcagtgacgcgaccttgcaggaaatgtcgttgtatcagccgaccagcaaagtggaaatgctgcaaatcaacggt gtcggcgccatcaaatggcagcgcttcggacagccttttatggcgattattaaagaacatcaggctttgcgtaaagcgggtaagaatc cgttggaattgcaatcttaaaatttttaactttttgaccgcacttttaaggttagcaaattccaataaaaagtgcggtgggttttcgggaattttt 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SEQ ID NO: 7 (secuencia nucleotídica completa del plásmido pSacB_delta _pflA)

tcgagtcaatgcggatttgacttatgatgtggcaaacaaccgatttccgattattactacacgtaaaagttattggaaagcggcgattgcg gagtttctgggttatatccgcggctacgataatgcggcggatttccgtaaattaggagcaaaaacctgggatgccaacgctaatgaaa atcaggtatggctgaataaccctcatcgcaaaggcaccgacgacatggggcgcgtttacggcgtacagggcagagcctggcgtaa gcctaacggcgaaaccgttgatcaattacgcaaaattgtcaacaatttaagtcgcggcattgatgatcgcggcgaaattctgaccttttt aaacccgggcgaattcgatctcggltgtctgcgcccttgtatgtacaatcacacgttttctttgctgggcgatacgctttatttaaccagttat caacgctcctgtgacgtacctttaggcttgaatttcaatcaaattcaagtatttacattcttagctttaatggcgcagattaccggtaaaaaa gccggtcaggcatatcacaaaatcgtcaatgcgcatatttacgaagaccagctggaactaatgcgcgacgtgcagttaaaacgcga accgttcccgtcgccaaaactggaaattaatccggacattaaaacccttgaagatttagaaacctgggtaaccatggatgatttcaacg tcgttggttaccaatgccacgaaccgataaaatatccgttctcggtataaaccgacaaaagtgcggtcaaaaatttaatattttcatctgtt atagaaaatatttttcaacataaaatctagggatgcctgtttggcgtccgtaaatacgcagaaaaatattaaatttttgaccgcacttttttc 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SEQ ID NO: 8 (secuencia nucleotídica completa del plásmido pSacB_wcaJ)

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SEQ ID NO: 9 (secuencia nucleotídica completa del plásmido pSacB_pflD)

tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatgggatcgagctcttttccttgccgaca aggcggaagctttaggggaaattcccgtaggtgccgtattggtggatgaacggggcaatatcattggtgaaggctggaacctctctatt gtgaactcggatcccaccgcccatgccgaaattattgcgttgcgtaacgccgcgcagaaaatccaaaattaccgcctgctcaatacc actttatacgtgactttagaaccctgcaccatgtgcgccggcgcgattttacacagccgaatcaaacgcttggtattcggggcgtccgat tacaaaaccggtgcggtgggltccagatttcatttttttgaggattataaaatgaatcatggggttgagatcacaagcggtgtcttatagga tcaatgcagtcagaagttaagccgctttttccaaaagcgcagggaacagaaaaaacaacaaaaagctaccgcacttttacaacacc cccggcttaactcctctgaaaaatagtgacaaaaaaaccgtcataatgtttacgacggtttttttatttcttctaatatgtcacattaagcccg tagcctgcaagcaaccccttaacatgctccattaattcttttgtcggcggttttacatcttcaagctcgtatttatcgccgagtacttcccattta tgggcgcctagacggtgataaggtaataattccactttttcgatattcttcatatctttaatgaaattccccagcatgtgcaaatcttcgtcact atctgtataacccggcactacaacatggcggatccaggtacgctgatttcgatccgctaaatattttgcgaattcgagcactcttttattcg 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SEQ ID NO: 10 (secuencia nucleotídica del gen IdhA de la cepa DD1)

ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttgg cgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgta ttttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaat aatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcg atcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccalaaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggtttt aatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgtt ctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgtta tcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaata ccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctcteggtatggatgtttatg aaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataalgtgctttttac cggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaac gtgcgaaaatagcgttgaaggctaa

SEQ ID NO: 11 (secuencia de aminoácidos de la LdhA de la cepa DD1)

MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFV NDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKWRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLN RRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAE ALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEAL KRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVT LSNIQAVSKNATCENSVEG

SEQ ID NO: 12 (secuencia nucleotídica del gen pflA de la cepa DD1)

atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaa tgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtg acctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactgg

ttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgat gacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagigctcg aattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgc acatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaa gtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctac gggcttaatgtgacatattag

SEQ ID NO: 13 (secuencia de aminoácidos de PflA de la cepa DD1)

MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTWDLHGGKEISVEELMKEWTY RHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDWFRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLV LLDLKEMNERVHESUGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHWVPGYTDSDEDLHMLGNFIKD MKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY

SEQ ID NO: 14 (secuencia nucleotídica del gen pflD de la cepa DD1)

atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgacttt atccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtga tggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctgg ttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaat gatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaagg cgtattcgacgtttatacgccggatattttacgdgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgíggtcgtattatc ggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaa gcgggcgaagacattcaggcaactatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatgg cggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagcggtt aaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatca ctgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattatt ctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaadaaaaacagcttccgcgt attacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgt gcgaaagtatctattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcat gctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaac ggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcg aacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatg aagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatc cgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatcga cttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaa aaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaa accgglaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggt gcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattag gtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaalggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaa cacttgaatgttaacgttdtaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcag gttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa

SEQ ID NO: 15 (aminoácidos de PfID de la cepa DD1)

KIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINKDLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGR KLDPQVEFIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYL MKDKKAQFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQEAIQ WTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMDHLVMKLRMVRFLRT PEYDQLFSGDPMWATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLHTLYTMGTSPEPNLTILWSEQLPEAF KRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMWGKOMQFFGARANLAKTMLYAI NGGIDEKNGMQVGPKTAPITDEVLNFDTVIERMDSFMDWLATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAAL MAFHDRDVFRTMACGiAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNWASNVAIDFElEGEYPQ FGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNWYGKKTGNTPDGRRAGAP FGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDG YFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRT FTQSM ,

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo modificado de la familia Pasteurellaceae en el cual el gen wcaJ se ha delecionado o en el cual se ha introducido al menos una mutación en el gen wcaJ que conduce a la expresión de una enzima truncada codificada por el gen wcaJ en la cual al menos 100 aminoácidos de la enzima de tipo silvestre codificada por el gen wcaJ se delecionan del extremo C terminal, en el que el gen wcaJ comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) ácidos nucleicos que tienen la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 3;

b) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

c) ácidos nucleicos que son al menos 70 % idénticos al ácido nucleico de a) o b), siendo la identidad la identidad en la longitud total de los ácidos nucleicos de a) o b);

d) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b), siendo la identidad la identidad en la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a) o b),

e) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a) o b); y

f) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a) o b), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a) o b) anteriores debido a la degeneración del código genético.

2. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado tiene un ADNr 16S de SEQ ID NO: 1 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos 96 con la SEQ ID NO: 1.

3. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado pertenece al género Basfia.

4. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado pertenece a la especie Basfia succiniciproducens.

5. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado es la cepa DD1 de Basfia succiniciproducens depositada como DSM 18541 en la DSMZ, Alemania.

6. Microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo tiene además, en comparación con su tipo silvestre,

i) una actividad piruvato formiato liasa reducida,

ii) una actividad lactato deshidrogenasa reducida, o

iii) una actividad piruvato formiato liasa reducida y una actividad lactato deshidrogenasa reducida.

7. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el microorganismo comprende:

A) una deleción del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA;

B) una deleción del gen pfID o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID;

C) una deleción del gen pflA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pflA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pflA;

D) una deleción del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA

y

una deleción del gen pfID o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID;

o

E) una deleción del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA

y

una deleción del gen pflA o al menos una parte del mismo, una deleción de un elemento regulador del gen pflA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pflA.

8. Un procedimiento para producir un compuesto orgánico o un producto orgánico secundario que sea diferente del compuesto orgánico que comprende:

I) cultivar el microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado produzca el compuesto orgánico, obteniendo así un caldo de fermentación que comprende el compuesto orgánico;

II) recuperar el compuesto orgánico del caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento; y opcionalmente

III) convertir el compuesto orgánico contenido en el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del procedimiento o convertir el compuesto orgánico recuperado obtenido en la etapa II) del procedimiento en un producto orgánico secundario que es diferente del compuesto orgánico en al menos una reacción química

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el compuesto orgánico es ácido succínico.

10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en el que la fuente de carbono asimilable se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, maltosa, D-glucosa, glicerol, mezclas de glicerol y D-glucosa, mezclas de glicerol y sacarosa, mezclas de glicerol y D-xilosa, mezclas de glicerol y mezclas de maltosa y D-glucosa y fructosa.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en el que el compuesto orgánico es ácido succínico y en el que el producto orgánico secundario se selecciona del grupo que consiste en ésteres del ácido succínico o polímeros del mismo, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanodiol (BDO), gamma-butirolactona (GBL) y pirrolidonas.

12. Uso de un microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la producción fermentativa de un compuesto orgánico.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el compuesto orgánico es ácido succínico.