BR112016018162B1 - Micro-organismo modificado, método para produzir um composto orgânico e uso de um micro-organismo modificado - Google Patents

Micro-organismo modificado, método para produzir um composto orgânico e uso de um micro-organismo modificado Download PDF

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Abstract

MICRO-ORGANISMO MODIFICADO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO ORGÂNICO E USO DE UM MICRO-ORGANISMO MODIFICADO. A presente invenção refere-se a um micro-organismo modificado que tem, em comparação ao seu tipo selvagem, uma atividade reduzida da enzima que é codificada pelo gene wcaJ. A presente invenção também se refere a um método para produzir um composto orgânico e ao uso de um micro-organismo modificado.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo modificado, a um método para produzir um composto orgânico e ao uso de um micro-organismo modificado.
[002] Compostos orgânicos como ácidos dicarboxílicos pequenos com 6 ou menos carbonos são produtos químicos comercialmente significativos com muitos usos. Por exemplo, os diácidos pequenos incluem 1,4-diácidos, como ácido succínico, ácido málico e ácido tartárico e o ácido itacônico com 5 moléculas de carbono. Outros diácidos incluem o ácido oxálico com dois carbonos, ácido malônico com três carbonos, ácido glutárico com cinco carbonos e o ácido adípico com 6 carbonos, e também existem muitos derivados desses diácidos.
[003] Como um grupo, os diácidos pequenos têm algumas similaridades químicas e seus usos na produção de polímeros podem fornecer propriedades especializadas para a resina. Essa versatilidade permite que eles se adaptem facilmente nos mercados de infraestrutura química a jusante. Por exemplo, as moléculas de 1,4-diácidos cumprem muitos dos usos do produto químico anidrido maleico em grande escala, já que eles são convertidos para uma variedade de produtos químicos industriais (tetrahidrofurano, butirolactona, 1,4-butanodiol, 2-pirrolidona) e os derivados de ssuccinato, succindiamida, succinonitrila, diaminobutano e ésteres de succinato. O ácido tartárico tem uma série de usos nos alimentos, couro, metal e indústrias de impressão. O ácido itacônico forma o material de partida para a produção de 3-metilpirrolidona, metil- BDO, metil-THF e outros.
[004] Em específico, ácido succínico ou succinato, - esses termos são usados de forma intercambiável no presente pedido, - têm atraído interesse considerável porque eles têm sido usados como um precursor de muitos produtos químicos industrialmente importantes nas indústrias de alimentos, química e farmacêutica. Na realidade, um relatório do Departamento de Energia dos EUA relata que o ácido succínico é um dos 12 principais blocos de construção de produtos químicos fabricados a partir da biomassa. Dessa forma, a capacidade para produzir diácidos em bactérias seria de importância comercial significativa.
[005] O documento WO-A-2009/024294 divulga uma linhagem de bactérias produtoras de ácido succínico, sendo um membro da família de Pasteurellaceae, originalmente isolada a partir do rúmen e capaz de utilizar glicerol como fonte de carbono, e a variante e linhagens mutantes derivadas a partir dessa que mantêm a dita capacidade, em particular, uma linhagem de bactérias designada DD1, conforme depositada com DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D38124 Braunschweig, Alemanha) que tem o número de depósito DSM 18541 (ID 06-614) e que tem a capacidade para produzir ácido succínico. A linhagem DD1 pertence à espécie Basfia succiniciproducens e à família de Pasteurellaceae, conforme classificada por Kuhnert et al., 2010. Mutações dessas linhagens, nas quais o gene ldhA e/ou os genes pflD ou pflA foram rompidos são divulgadas no documento WO-A-2010/092155, essas linhagens mutantes são caracterizadas por uma produção significativamente aumentada de ácido succínico a partir de fontes de carbono como glicerol ou misturas de glicerol e carboidratos como maltose, sob condições anaeróbicas, em comparação à DD1 tipo selvagem divulgada no documento WO-A-2009/024294.
[006] No entanto, ao usar linhagens bacterianas como aquelas divulgadas no documento WO-A-2009/024294 ou documento WO-A- 2010/092155 para a produção de compostos orgânicos como ácido succínico, a seletividade na qual as fontes de carbono são convertidas em compostos orgânicos desejados e também o rendimento do composto orgânico desejado são ainda aprimoráveis.
[007] Além disso, foi observado que ao usar as linhagens bacterianas da técnica anterior, algumas vezes é difícil separar a biomassa a partir do caldo de fermentação no final do processo de fermentação. Geralmente, a produção fermentativa de compostos orgânicos como ácido succínico compreende as etapas de cultivo dos micro-organismos sob condições adequadas de cultura em um meio que compreende pelo menos uma fonte de carbono assimilável para permitir que o micro-organismo produza o composto orgânico desejado e a subsequente recuperação dos compostos orgânicos a partir do caldo de fermentação, em que em uma primeira etapa do processo de recuperação os micro-organismos (isto é, a biomassa) geralmente são separados do meio de cultura, por exemplo, por sedimentação ou centrifugação. Ao usar os micro-organismos da técnica anterior, a biomassa não pode ser facilmente separada do caldo de fermentação, a qual, como uma parte do caldo de fermentação está de alguma forma presa na biomassa, algumas vezes leva a uma perda de certa quantidade do caldo de fermentação (e, dessa forma, também uma perda e de certa quantidade do composto orgânico desejado).
[008] Portanto, foi um objeto da presente invenção superar as desvantagens da técnica anterior.
[009] Em específico, foi um objeto da presente invenção fornecer micro-organismos que podem ser usados para a produção fermentativa de compostos orgânicos como ácido succínico e que não apenas produzem os produtos orgânicos desejados, como ácido succínico, a partir de fontes de carbono assimiláveis como glicerol, glicose, sacarose, xilose, lactose, frutose ou maltose em grandes quantidades, preferencialmente apenas com baixas quantidades de subprodutos, mas que também podem ser facilmente separados do caldo de fermentação no processo subsequente de recuperação do composto orgânico, apenas com uma quantidade pequena do caldo de fermentação ficando preso na biomassa.
[010] Uma contribuição para atingir os objetivos mencionados acima é fornecida por um micro-organismo modificado que tem, em comparação ao seu tipo selvagem, uma atividade reduzida da enzima que é codificada pelo gene wcaJ. Uma contribuição para atingir os objetivos mencionados acima é fornecida, em particular, por um micro-organismo modificado no qual o gene wcaJ ou partes do mesmo foram deletadas, ou no qual um elemento regulador do gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo foi deletada ou no qual pelo menos uma mutação foi introduzida no gene wcaJ.
[011] De maneira surpreendente, descobriu-se que uma redução da atividade da enzima que é codificada pelo gene wcaJ (essa enzima presumivelmente sendo uma glicose transferase), por exemplo, por uma deleção do gene wcaJ ou partes do mesmo, resulta em um micro-organismo que, após produção fermentativa dos compostos orgânicos como ácido succínico em um meio de cultura apropriado, podem ser separados, como a biomassa, a partir do meio de cultura mais facilmente em comparação ao micro-organismo correspondente no qual a atividade dessa enzima não foi diminuída. Ao usar o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção, menos caldo de fermentação fica preso na biomassa que é separada no processo de purificação, o que significa que uma maior quantidade de caldo de fermentação por grama de biomassa usada no processo de fermentação (e, dessa forma, uma maior quantidade de compostos orgânicos desejados como ácido succínico) pode ser obtida, a partir da qual o composto orgânico é isolado.
[012] No contexto com a expressão “um micro-organismo modificado que tem, em comparação ao seu tipo selvagem, uma atividade reduzida da enzima que é codificada pelo gene x”, em que o gene x é o gene fruA e opcionalmente, conforme descrito posteriormente, o gene ldhA, o gene pflA e/ou o gene pflD, o termo “tipo selvagem” refere-se a um micro-organismo no qual a atividade da enzima que é codificada pelo gene x não foi diminuída, isto é, para um micro-organismo cujo genoma está presente em um estado como antes da introdução de uma modificação genética do gene x. Preferencialmente, a expressão “tipo selvagem” refere-se a um micro-organismo (por exemplo, bactéria, célula de levedura, célula fúngica, etc.) cujo genoma, em particular, cujo gene x, está presente em um estado como gerado naturalmente como resultado de evolução. O termo é usado tanto para o micro-organismo inteiro como para os genes individuais. Como consequência, o termo “tipo selvagem” preferencialmente não cobre, em específico, aqueles micro-organismos, ou aqueles genes, cujas sequências de genes foram pelo menos em parte modificadas pelo homem por meio de métodos recombinantes. O termo “microorganismo modificado” inclui, dessa forma, um micro-organismo que foi geneticamente alterado, modificado ou elaborado (por exemplo, elaborado geneticamente), de modo que ele exiba um genótipo e/ou fenótipo alterado, modificado ou diferente (por exemplo, quando a modificação genética afeta sequências de ácidos nucleicos codificadoras do micro-organismo), em comparação ao micro-organismo tipo selvagem que ocorre naturalmente a partir do qual foi derivado. De acordo com uma realização preferencial específica do micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção, o microorganismo modificado é um micro-organismo recombinante, o que significa que o micro-organismo foi obtido com o uso de DNA recombinante. A expressão “DNA recombinante”, como usada no presente pedido, refere-se a sequências de DNA que resultam do uso de métodos laboratoriais (clonagem molecular) para reunir o material genético a partir de várias fontes, criando sequências que de outro modo não seriam encontradas em organismos biológicos. Um exemplo desse DNA recombinante é um plasmídeo no qual uma sequência de DNA heteróloga foi inserida.
[013] O tipo selvagem a partir do qual os micro-organismos de acordo com a presente invenção são derivados podem ser leveduras, fungos ou bactérias. Bactérias, leveduras ou fungos adequados são, em particular, essas bactérias, leveduras ou fungos que foram depositados no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ), Brunswick, Alemanha, como linhagens de bactérias, leveduras ou fungos. A expressão “um microorganismo modificado derivado a partir de um tipo selvagem”, como usado no presente pedido, refere-se a um micro-organismo que foi obtido a partir do tipo selvagem por uma modificação genética controlada (por exemplo, elaboração genética), por uma modificação genética (aleatória) não controlada (por exemplo, um tratamento com um agente químico mutagenizante, raios-X, luz UV, etc.) ou por uma combinação desses métodos. Detalhes adicionais da preparação do micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção são dados abaixo.
[014] Bactérias que são adequadas de acordo com a invenção pertencem aos gêneros detalhados abaixo: http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm leveduras que são adequadas de acordo com a invenção pertencem aos gêneros que são detalhados abaixo: http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm e fungos que são adequados de acordo com a invenção são aqueles que estão detalhados abaixo: http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
[015] Preferencialmente, o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção foi derivado é uma célula bacteriana. O termo “célula bacteriana”, como usado no presente pedido, refere-se a um organismo procarionte, isto é, uma bactéria. Bactérias podem ser classificadas com base em suas propriedades bioquímicas e microbiológicas, bem como em sua morfologia. Esses critérios de classificação são bem conhecidos na técnica.
[016] De acordo com uma realização preferencial do microorganismo modificado de acordo com a presente invenção, o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado foi derivado pertence à família das Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Bacillaceae ou Corynebacteriaceae.
[017] “Enterobacteriaceae” representam uma grande família de bactérias, incluindo muitas das bactérias mais conhecidas como Salmonella e Escherichia coli. Eles pertencem a Proteobacteria, e eles têm a sua própria ordem (Enterobacteriales). Membros da Enterobacteriaceae têm formato de bastão. Como outras Proteobacteria, elas têm linhagens Gram-negativas e elas são anaeróbicas facultativas, fermentam açúcares para produzir ácido lático e vários produtos finais como ácido succínico. A maioria também reduz nitrato para nitrito. Ao contrário da maioria das bactérias similares, Enterobacteriaceae geralmente são desprovidas de citocromo C oxidase. A maioria tem muitos flagelos usados para se mover, mas poucos gêneros são imóveis. Elas não formam esporos e na maioria das vezes são catalase-positivas. Muitos membros dessa família são uma parte normal da flora intestinal encontrada no intestino de seres humanos e de outros animais, enquanto outros são encontrados na água ou no solo, ou são parasitas em uma variedade de animais e plantas diferentes. Escherichia coli, mais conhecida como E. coli, é um dos mais importantes organismos modelo e sua genética e bioquímica têm sido atentamente estudadas. A maioria dos membros de Enterobacteriaceae tem fímbrias peritríquias Tipo I envolvidas na adesão das células bacterianas aos seus hospederios. Exemplos para as Enterobacteriaceae são E. coli, Proteus, Salmonella e Klebsiella.
[018] “Pasteurellaceae” compreende uma grande família de Proteobacteria Gram-negativa com membros que variam de bactérias como Haemophilus influenzae até comensais da mucosa animal e humana. A maioria dos membros vive como comensais nas superfícies das mucosas de aves e mamíferos, especialmente no trato respiratório superior. Pasteurellaceae tipicamente têm o formato de bastão, e é um grupo notável de anaeróbicos facultativos. Eles podem ser distinguidos das Enterobacteriaceae relacionadas pela presença de oxidase e da maioria das outras bactérias similares pela ausência de flagelos. Bactérias na família Pasteurellaceae foram classificadas em uma série de gêneros com base nas propriedades metabólicas e suas sequências de RNA 16S e RNA 23S. Muitas das Pasteurellaceae contêm genes da piruvato-formato-liase e são capazes de fermentar anaerobicamente fontes de carbono para ácidos orgânicos.
[019] “Bacillaceae” é uma família de bactérias Gram-positivas, heterotróficas, em formato de bastão, que podem produzir endosporos. Membros com mobilidade dessa família são caracterizados por flagelos peritríquios. Algumas Bacillaceae são aeróbicas, enquanto que outras são facultativas ou anaeróbicas estritas. A maioria é não patogênica, mas as espécies de Bacillus são conhecidas por causar doenças em seres humanos. Essa família também compreende o gênero Bacilli que inclui duas ordens, Bacillales e Lactobacillales. As espécies de Bacillus representam grandes bactérias cilíndricas que podem ser cultivadas sob condições aeróbicas a 37°C. Eles são tipicamente não patogênicas. O gênero Bacillales contém as espécies Alicyclobacillaceae, Bacillaceae, Caryophanaceae, Listeriaceae, Paenibacillaceae, Planococcaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Thermoactinomycetaceae, Turicibacteraceae. Muitas das Bacilli contêm genes da piruvato-formato-liase e são capazes de fermentar anaerobicamente fontes de carbono em ácidos orgânicos.
[020] “Corynebacteriaceae” é uma grande família predominantemente de bactérias Gram-positivas, aeróbicas, em formato de bastão e sem mobilidade da ordem Eubacteriales. Essa família também compreende o gênero Corynebacterium, que é um gênero de bactérias Gram- positivas em formato de bastão. Corynebacteria estão amplamente distribuídas na natureza e são na sua maioria inócuas. Algumas são úteis em ambientes industriais como C. glutamicum.
[021] De acordo com uma realização preferencial específica do micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção, o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado foi derivado pertence à família Pasteurellaceae. Nesse contexto é ainda preferencial que o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção foi derivado pertença ao gênero Basfia e é particularmente preferencial que o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado foi derivado pertença à espécie Basfia succiniciproducens.
[022] Com a máxima preferência, o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção foi derivado é Basfia succiniciproducens - linhagem DD1 depositada no Tratado de Budapeste com DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH), Alemanha, que tem o número de depósito DSM 18541. Essa linhagem foi originalmente isolada a partir do rúmen de uma vaca de origem alemã. Bactérias Pasteurella podem ser isoladas a partir do trato gastrointestinal de animais e, preferencialmente, de mamíferos. A linhagem bacteriana DD1, em específico, pode ser isolada a partir do rúmen de bovinos e é capaz de utilizar glicerol (incluindo glicerol bruto) como fonte de carbono. Além disso, as linhagens do gênero Basfia que podem ser usadas para preparar o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção são da linhagem Basfia que foi depositada com o número de depósito DSM 22022 ou das linhagens Basfia que foram depositadas na Culture Collection of the University of Goteborg (CCUG), Suécia, tendo os números de depósitos CCUG 57335, CCUG 57762, CCUG 57763, CCUG 57764, CCUG 57765 ou CCUG 57766. As ditas linhagens foram originalmente isoladas a partir do rúmen de vacas de origem alemã ou suíça.
[023] Nesse contexto, é particularmente preferencial que o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção foi derivado tenha um rDNA 16S de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência, que mostra uma homologia de sequência de pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% com a SEQ ID NO: 1. Também é preferencial que o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção foi derivado tenha um rDNA 23S de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência, que mostra uma homologia de sequência de pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,9 % com a SEQ ID NO: 2.
[024] A identidade nos valores de porcentagens citados em conexão com os vários polipeptídeos ou polinucleotídeos a serem usados para o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção é, preferencialmente, calculada como identidade dos resíduos ao longo do comprimento completo das sequências alinhadas como, por exemplo, a identidade calculada (para sequências especialmente similares) com o auxílio do programa needle do pacote de programa de computação de bioinformática EMBOSS (Versão 5.0.0, http://emboss.source-forge.net/what/) com os parâmetros padrão que são, isto é, abertura de gap (penalidade para abrir um gap): 10.0, estender gap (penalidade para estender um gap): 0,5, e arquivo de dados (arquivo de matriz de escore incluído no pacote): EDNAFUL.
[025] Deve-se notar que os micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção podem ser não somente derivados dos microorganismos tipo selvagem mencionados acima, especialmente a partir da linhagem DD1 de Basfia succiniciproducens, mas também das variantes dessas linhagens. Nesse contexto a expressão “uma variante de uma linhagem” compreende cada linhagem que tem as mesmas ou essencialmente as mesmas características que a linhagem tipo selvagem. Nesse contexto é particularmente preferencial que o rDNA 16S da variante tenha uma identidade de pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 99%, mais preferencialmente pelo menos 99,5%, mais preferencialmente pelo menos 99,6%, mais preferencialmente pelo menos 99,8% e com a máxima preferência pelo menos 99,9% com a tipo selvagem a partir da qual a variante foi derivada. Além disso, é particularmente preferencial que o rDNA 23S da variante tenha uma identidade de pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 99,5%, mais preferencialmente pelo menos 99,6%, mais preferencialmente pelo menos 99,7%, mais preferencialmente pelo menos 99,8% e com a máxima preferência pelo menos 99,9% com a tipo selvagem a partir da qual a variante foi derivada. Uma variante de uma linhagem no sentido dessa definição pode, por exemplo, ser obtida por tratamento da linhagem tipo selvagem com um agente químico mutagenizante, raios-X ou luz UV.
[026] O micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção é caracterizado, em comparação ao seu tipo selvagem, pela atividade da enzima que é codificada pelo gene wcaJ ser reduzida.
[027] A redução da atividade enzimática (Δatividade) é definida da seguinte forma:
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em que, quando a determinação Δatividade, a atividade do tipo selvagem e a atividade do micro-organismo modificado são determinadas exatamente sob as mesmas condições. Métodos para a detecção e determinação da atividade da enzima que é codificada pelo gene wcaJ podem ser encontrados, por exemplo, e Nothaft et al.: “In vivo analysis of HPr reveals a fructose-specific phosphotransferase system that confers high-affinity uptake in Streptomyces coelicolor”, Journal of Bacteriology, Vol. 185 (3), páginas 929-937.
[028] A atividade reduzida das enzimas divulgadas no presente pedido, em particular a atividade reduzida da enzima codificada pelo gene wcaJ, a lactato desidrogenase e/ou a piruvato formato liase, pode ser uma redução da atividade enzimática por pelo menos 50%, em comparação à atividade da dita enzima no tipo selvagem do micro-organismo, ou uma redução da atividade enzimática por pelo menos 90%, ou mais preferencialmente uma redução da atividade enzimática por pelo menos 95%, ou mais preferencialmente uma redução da atividade enzimática por pelo menos 98%, ou ainda mais preferencialmente uma redução da atividade enzimática por pelo menos 99% ou ainda mais preferencialmente uma redução da atividade enzimática por pelo menos 99,9%. O termo “atividade reduzida da enzima que é codificada pelo gene wcaJ”, ou conforme descrito abaixo, “uma atividade reduzida de lactato desidrogenase” ou “uma atividade reduzida de piruvato formato liase”, também engloba um micro-organismo modificado que não tem atividade detectável dessas enzimas.
[029] O termo “atividade reduzida de uma enzima” inclui, por exemplo, a expressão da enzima pelo dito micro-organismo geneticamente manipulado (por exemplo, elaborado geneticamente) a um nível mais baixo do que o expresso pelo tipo selvagem do dito micro-organismo. Manipulações genéticas para reduzir a expressão de uma enzima podem incluir, mas não se limitam a, deleção do gene ou partes dos mesmos que codificam a enzima, alteração ou modificação de sequências reguladoras ou sítios associados com a expressão do gene que codifica a enzima (por exemplo, por remoção de promotores fortes ou promotores repressíveis), modificação de proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressoras, enhancers, ativadoras da transcrição e similares) envolvidas na transcrição do gene que codifica a enzima e/ou na tradução do produto gênico, ou qualquer outro meio convencional de rotina na técnica para diminuir a expressão de um gene específico (incluindo, mas não se limitando ao uso de moléculas de ácido nucleico antisense ou iRNA ou outros métodos para knock-out ou bloqueio da proteína alvo). Além disso, pode-se introduzir elementos desestabilizadores no mRNA ou introduzir modificações genéticas, levando à deterioração de sítios de ligação do ribossomo (RBS) do RNA. Também é possível alterar o uso de códon do gene de forma que a eficiência de tradução e velocidade sejam reduzidas.
[030] Uma atividade reduzida de uma enzima também pode ser obtida por introdução de uma ou mais mutações gênicas que levam a uma atividade reduzida da enzima. Além disso, uma redução da atividade de uma enzima também pode incluir uma inativação (ou a expressão reduzida) de enzimas de ativação que são necessárias para ativar a atividade enzimática que será reduzida. Por essa última abordagem a enzima cuja atividade será reduzida é preferencialmente mantida em um estado inativado.
[031] Micro-organismos que têm uma atividade reduzida da enzima codificada pelo gene wcaJ podem ocorrer naturalmente, isto é, devido a mutações espontâneas. Um micro-organismo pode ser modificado para ser desprovido ou ter atividade significativamente reduzida da enzima que é codificada pelo gene wcaJ por várias técnicas, como tratamento químico ou radiação. Até o final, micro-organismos serão tratados, por exemplo, por um agente químico mutagenizante, raios X ou luz UV. Em uma etapa subsequente, esses micro-organismos que têm uma atividade reduzida da enzima que é codificada pelo gene wcaJ serão selecionados. Micro-organismos modificados também são obtidos por técnicas de recombinação homóloga que visam mutar, romper ou remover o gene wcaJ no genoma do micro-organismo ou substituir o gene por um gene correspondente que codifica uma enzima que, em comparação à enzima codificada pelo gene tipo selvagem, tem uma atividade reduzida.
[032] De acordo com uma realização preferencial do microorganismo modificado de acordo com a presente invenção, uma redução da atividade da enzima codificada pelo gene wcaJ é obtida por uma modificação do gene wcaJ, sendo que essa modificação genética é preferencialmente realizada por uma deleção do gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo, como uma sequência promotora, ou por uma introdução de pelo menos uma mutação no gene wcaJ. No contexto, com a introdução de pelo menos uma mutação no gene wcaJ é particularmente preferencial que pelo menos uma mutação leve à expressão de uma enzima truncada codificada pelo gene wcaJ. Além disso, é preferencial que na enzima truncada pelo menos 100 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 125 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos e com a máxima preferência pelo menos 160 aminoácidos da enzima tipo selvagem codificada pelo gene wcaJ sejam deletadas da extremidade C-terminal. Essa enzima truncada codificada pelo gene wcaJ pode, por exemplo, ser obtida por inserção ou deleção de nucleotídeos em posições apropriadas dentro do gene wcaJ, que leva a uma mutação de mudança de quadro, sendo que por meio dessa mutação de mudança de quadro um códon de parada é introduzido. Por exemplo, a inserção de um nucleotídeo no códon que codifica a lisina entre timina na posição 81 e adenina na posição 82 leva a uma mutação de mudança de quadro, por meio da qual um códon de parada é introduzido conforme mostrado na SEQ ID NO: 16. Essas mutações do gene wcaJ podem ser introduzidas, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida ou aleatória, seguido por uma introdução do gene modificado no genoma do micro-organismo por recombinação. Variantes do gene wcaJ podem ser geradas por mutação da sequência do gene wcaJ SEQ ID NO: 3 por meio de PCR. O kit “Quickchange Site-directed Mutagenesis” (Stratagene) pode ser usado para realizar uma mutagênese dirigida. A mutagênese aleatória sobre toda a sequência codificadora, ou somente parte do mesmo, de SEQ ID NO: 3 pode ser realizada com o auxílio do “GeneMorph II Random Mutagenesis Kit” (Stratagene).
[033] Na sequência, uma técnica adequada para recombinação, em particular para introduzir uma mutação ou deleção de sequências, é descrita.
[034] Essa técnica é também por vezes citada como “recombinação de Campbell” no presente pedido (Leenhouts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 55, páginas 394-400). “Campbell in”, como usado no presente pedido, refere-se a um transformante de uma célula hospedeira original no qual uma molécula de DNA dupla fita circular (por exemplo, um plasmídeo) se integrou em um cromossomo por um único evento de recombinação homóloga (um cruzamento no evento), e que efetivamente resulta na inserção de uma versão linearizada da dita molécula de DNA circular em uma primeira sequência de DNA do cromossomo que é homóloga a uma primeira sequência de DNA da dita molécula de DNA circular. “Campbelled in” refere-se à sequência de DNA que foi integrada no cromossomo de um transformante “Campbell in”. Um “Campbelled in” contém uma duplicação da primeira sequência homóloga de DNA, cada cópia desta inclui e circunda uma cópia do ponto de cruzamento de recombinação homóloga.
[035] “Campbell out”, como usado no presente pedido, refere-se a uma célula descendente de um transformante “Campbell in”, na qual um segundo evento de recombinação homóloga (um evento de cruzamento) ocorreu entre uma segunda sequência de DNA que está contida no DNA inserido linearizado do DNA de “Campbelled in”, e uma segunda sequência de DNA de origem cromossômica, que é homóloga à segunda sequência de DNA do dito inserto linearizado, o segundo evento de recombinação resultando na deleção (abandono jettisoning) de uma porção da sequência de DNA integrada mas, sobretudo, também resultando em uma porção (isso pode ser tão pouco como uma única base) do Campbelled integrado no DNA remanescente no cromossomo, de modo que em comparação à célula hospedeira original, a célula “Campbell out” contém uma ou mais alterações intencionais no cromossomo (por exemplo, uma única substituição de base, múltiplas substituições de base, inserção de um gene ou sequência de DNA heteróloga, inserção de uma cópia ou cópias adicionais de um gene homólogo ou de um gene homólogo modificado, ou inserção de uma sequência de DNA que compreende mais de um desses exemplos anteriormente mencionados listados acima). Uma célula “Campbell out” é preferencialmente obtida por uma contra-seleção contra um gene que está contido em uma porção (a porção que será abandonada jettisoned) da sequência de DNA “Campbelled in”, por exemplo, o gene sacB de Bacillus subtilis que é letal quando expresso em uma célula que é cultivada na presença de cerca de 5% a 10% de sacarose. Tanto com ou sem um contra-seleção, uma célula “Campbell out” pode ser obtida ou identificada por triagem para a célula desejada, com o uso de qualquer fenótipo capaz de ser triado como, mas não se limitando a, morfologia da colônia, cor da colônia, presença ou ausência de resistência a antibióticos, presença ou ausência de uma determinada sequência de DNA pela reação em cadeia da polimerase, presença ou ausência de uma auxotrofia, presença ou ausência de uma enzima, hibridização de ácido nucleico em colônia, triagem de anticorpo etc. O termo “Campbell in” e “Campbell out” também podem ser usados como verbos em vários tempos para se referir ao método ou ao processo descrito acima.
[036] Entende-se que os eventos de recombinação homóloga que levam a uma “Campbell in” ou “Campbell out” podem ocorrer ao longo de uma faixa de bases de DNA dentro das sequências homólogas de DNA, e visto que as sequências homólogas serão idênticas para cada um dos outros por pelo menos parte dessa faixa, geralmente não é possível especificar exatamente onde o evento de cruzamento ocorreu. Em outras palavras, não é possível especificar precisamente que sequência era originalmente do DNA inserido, e qual foi originalmente do DNA cromossômico. Além disso, a primeira sequência homóloga de DNA e a segunda sequência homóloga de DNA são geralmente separadas por uma região de homologia não parcial, e é essa região de não homologia que permanece depositada em um cromossomo da célula “Campbell out”.
[037] Preferencialmente, a primeira e segunda sequências de DNA homólogas têm pelo menos cerca de 200 pares de base de comprimento, e podem ter até vários milhares de pares de base de comprimento. No entanto, o procedimento pode ser feito para trabalhar com sequências mais curtas ou mais longas. Por exemplo, um comprimento para a primeira e segunda sequências homólogas pode variar de cerca de 500 a 2000 bases, e a obtenção de um “Campbell out” a partir de um “Campbell in” é facilitada por organizar a primeira e segunda sequências homólogas a terem aproximadamente o mesmo comprimento, preferencialmente com uma diferença de menos de 200 pares de base e com a máxima preferência com a menor das duas sendo pelo menos 70% do comprimento da mais longa nos pares de base.
[038] O gene wcaJ cuja atividade é reduzida no micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: a) ácidos nucleicos que têm a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; b) ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; c) ácidos nucleicos que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 % ou pelo menos 99,9 %, com a máxima preferência 100% idênticos ao ácido nucleico de a) ou b), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total dos ácidos nucleicos de a) ou b); d) ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8 % ou pelo menos 99,9 %, com a máxima preferência 100% idêntica à sequência de aminoácidos codificada pelo ácido nucleico de a) ou b), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos codificada pelos ácidos nucleicos de a) ou b) e) ácidos nucleicos capazes de hibridizar sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com a) ou b); e f) ácidos nucleicos que codificam a mesma proteína como qualquer um dos ácidos nucleicos de a) ou b), mas que diferem dos ácidos nucleicos de a) ou b) acima devido à degenerescência do código genético.
[039] O termo “hibridização” como usado no presente pedido inclui “qualquer processo pelo qual uma fita de molécula de ácido nucleico se une a uma fita complementar através de pareamento de bases” (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre as moléculas de ácido nucleico) são afetadas por esses fatores como o grau de complementaridade entre as moléculas de ácido nucleico, estringência das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado, e a razão G:C dentro das moléculas de ácido nucleico.
[040] Como usado no presente pedido, o termo “Tm” é usado em referência à “temperatura de fusão”. A temperatura de fusão é a temperatura em que uma população de moléculas de ácido nucleico de fita dupla torna-se metade dissociada em fitas simples. A equação para calcular a Tm de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica. Conforme indicado por referências padrão, uma estimativa simples do valor de Tm pode ser calculada pela equação: Tm = 81,5 + 0,41(% G+C), quando uma molécula de ácido nucleico está em solução aquosa em NaCl 1 M (consulte, por exemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)). Outras referências incluem cálculos mais sofisticados, que levam em conta características estruturais bem como de sequência para o cálculo de Tm. Condições estringentes, são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
[041] Em particular, o termo “condições de estringência” refere-se a condições em que 100 nucleotídeos contíguos ou mais, 150 nucleotídeos contíguos ou mais, 200 nucleotídeos contíguos ou mais ou 250 nucleotídeos contíguos ou mais que são um fragmento ou idênticos à molécula de ácido nucleico complementar (DNA, RNA, ssDNA ou ssRNA) hibridizam sob condições equivalentes à hibridização em dodecil sulfato de sódio 7% (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 2x, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente a 65°C, com uma molécula de ácido nucleico específica (DNA, RNA, ssDNA ou ss RNA). Preferencialmente, as condições de hibridização são equivalentes à hibridização em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 1X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente 65°C, mais preferencialmente as condições de hibridização são equivalentes à hibridização em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 0,1X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente 65°C. Preferencialmente, os nucleotídeos complementares hibridizam com um fragmento ou com os ácidos nucleicos inteiros de wcaJ. Alternativamente, condições de hibridização preferenciais englobam hibridização a 65°C em SSC 1x ou a 42°C em SSC 1x e formamida 50%, seguido por lavagem a 65°C em SSC 0,3x ou hibridização a 50°C em SSC 4x ou a 40°C em SSC 6x e formamida 50%, seguido por lavagem a 50°C em SSC 2x. Condições de hibridização ainda preferenciais são SDS 0,1%, SSD 0,1 e 65°C.
[042] O gene wcaJ ou partes desse que podem ser deletados pela mencionada acima “recombinação Campbell” ou no qual pelo menos uma mutação é introduzida pela mencionada acima “recombinação Campbell” preferencialmente é constituído por um ácido nucleico conforme definido acima.
[043] O ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 corresponde ao gene wcaJ da linhagem DD1 de Basfia succiniciproducens.
[044] De acordo com uma realização preferencial adicional do micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção, esse microorganismo não é somente caracterizado por uma expressão aumentada e/ou atividade da enzima codificada pelo gene AlaD, mas também, em comparação ao tipo selvagem, por i) uma atividade reduzida de piruvato formato liase, ii) uma atividade reduzida de lactato desidrogenase, ou iii) uma atividade reduzida de piruvato formato liase e uma atividade reduzida de lactato desidrogenase.
[045] Micro-organismos modificados que são deficientes em lactato desidrogenase e/ou que são deficientes em atividades de piruvato formato liase são divulgados no documento WO-A-2010/092155, patente US 2010/0159543 e documento WO-A-2005/052135, cuja divulgação dos quais em relação às diferentes abordagens de redução da atividade de lactato desidrogenase e/ou piruvato formato liase em um micro-organismo, preferencialmente em uma célula bacteriana do gênero Pasteurella, particularmente preferencial na linhagem DD1 de Basfia succiniciproducens, é incorporada ao presente pedido como referência. Métodos para determinar a atividade de piruvato formato liase são, por exemplo, divulgadas por Asanuma N. and Hino T. em “Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis”, Appl. Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, páginas 3773-3777 e métodos para determinar a atividade de lactato desidrogenase são, por exemplo, divulgados em Bergmeyer, H.U., Bergmeyer J. e Grassl, M. (1983-1986) em “Methods of Enzymatic Analysis”, 3a Edição, Volume III, páginas 126-133, Verlag Chemie, Weinheim.
[046] Nesse contexto é preferencial que a redução da atividade de lactato desidrogenase seja obtida por uma inativação do gene ldhA (que codifica a lactato desidrogenase; LdhA; EC 1.1.1.27 ou EC 1.1.1.28) e a redução da piruvato formato liase seja obtida por uma inativação do gene pflA (que codifica um ativador de piruvato formato liase; PflA; EC 1.97.1.4) ou do gene pflD (que codifica a piruvato formiato liase; PflD; EC 2.3.1.54), em que a inativação desses genes (isto é, ldhA, pflA e pflD) é preferencialmente obtida por uma deleção desses genes ou partes dos mesmos, por uma deleção de um elemento regulador desses genes ou pelo menos uma parte dos mesmos ou por uma introdução de pelo menos uma mutação nesses genes, particularmente preferencial por meio da “recombinação Campbell”, conforme descrito acima.
[047] O gene IdhA cuja atividade é reduzida no micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: α1) ácidos nucleicos que têm a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10; α2) ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; α3) ácidos nucleicos que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%, com a máxima preferência 100% idênticos aos ácidos nucleicos de α1) ou α2), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total dos ácidos nucleicos de α1) ou α2); α4) ácidos nucleicos que codificam uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%, com a máxima preferência 100% idêntica à sequência de aminoácidos codificada pelo ácido nucleico de α1) ou α2), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos codificada pelos ácidos nucleicos de α1) ou α2); α5) ácidos nucleicos capazes de hibridizar sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com α1) ou α2); e α6) ácidos nucleicos que codificam a mesma proteína como qualquer um dos ácidos nucleicos de α1) ou α2), mas que diferem dos ácidos nucleicos de α1) ou α2) acima devido à degenerescência do código genético.
[048] O gene pflA cuja atividade é reduzida no micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: β1) ácidos nucleicos que têm a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12; β2) ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; β3) ácidos nucleicos que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%, com a máxima preferência 100% idênticos aos ácidos nucleicos de β1) ou β2), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total dos ácidos nucleicos de β1) ou β2); β4) ácidos nucleicos que codificam uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%, com a máxima preferência 100% idêntica à sequência de aminoácidos codificada pelo ácido nucleico de β1) ou β2), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos codificada pelos ácidos nucleicos de β1) ou β2); β5) ácidos nucleicos capazes de hibridizar sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com β1) ou β2); e β6) ácidos nucleicos que codificam a mesma proteína como qualquer um dos ácidos nucleicos de β1) ou β2), mas que diferem dos ácidos nucleicos de β1) ou β2) acima devido à degenerescência do código genético.
[049] O gene pflD cuja atividade é reduzida no micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em: y1) ácidos nucleicos que têm a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14; y2) ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y3) ácidos nucleicos que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%, com a máxima preferência 100% idênticos aos ácidos nucleicos de y1) ou y2), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total dos ácidos nucleicos de y1) ou y2); y4) ácidos nucleicos que codificam uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%, com a máxima preferência 100% idêntica à sequência de aminoácidos codificada pelo ácido nucleico de y1) ou y2), a identidade sendo a identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos codificada pelos ácidos nucleicos de y1) ou y2); y5) ácidos nucleicos capazes de hibridizar sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com y1) ou y2); e y6) ácidos nucleicos que codificam a mesma proteína como qualquer um dos ácidos nucleicos de y1) ou y2), mas que diferem dos ácidos nucleicos de y1) ou y2) acima devido à degenerescência do código genético.
[050] Nesse contexto, é preferencial que o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção ainda compreenda: A) uma deleção do gene ldhA ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene ldhA ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene ldhA; B) uma deleção do gene pflD ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene pflD ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene pflD; C) uma deleção do gene pflA ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene pflA ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene pflA; D) uma deleção do gene ldhA ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene ldhA ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene ldhA e uma deleção do gene pflD ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene pflD ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene pflD; ou E) uma deleção do gene ldhA ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene ldhA ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene ldhA e uma deleção do gene pflA ou pelo menos uma parte do mesmo, uma deleção de um elemento regulador do gene pflA ou pelo menos uma parte do mesmo, ou uma introdução de pelo menos uma mutação no gene pflA.
[051] Realizações particularmente preferenciais dos microorganismos modificados de acordo com a presente invenção são: - Células bacterianas modificadas da família Pasteurellaceae, particularmente preferenciais do gênero Basfia e ainda mais preferenciais da espécie Basfia succiniciproducens, em que o gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo foi deletada, ou em que pelo menos uma mutação foi introduzida no gene wcaJ, sendo que a introdução de pelo menos uma mutação preferencialmente leva à expressão de uma enzima na qual pelo menos 100 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 125 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos e com a máxima preferência pelo menos 160 aminoácidos da enzima tipo selvagem codificada pelo gene wcaJ são deletados da extremidade C-terminal; - células bacterianas modificadas da família Pasteurellaceae, particularmente preferenciais do gênero Basfia e ainda mais preferencial da espécie Basfia succiniciproducens, em que o gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo foi deletada ou em que pelo menos uma mutação foi introduzida no gene wcaJ, sendo que a introdução de pelo menos uma mutação preferencialmente leva à expressão de uma enzima na qual pelo menos 100 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 125 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos e com a máxima preferência pelo menos 160 aminoácidos da enzima tipo selvagem codificada pelo gene wcaJ são deletados da extremidade C-terminal e na qual, em comparação à tipo selvagem, a atividade da lactato desidrogenase é reduzida, preferencialmente por uma modificação do gene ldhA, em particular por uma modificação do gene ldhA que tem a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 10 e que codifica LdhA que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11; - células bacterianas modificadas da família Pasteurellaceae, particularmente preferenciais do gênero Basfia e ainda mais preferencial da espécie Basfia succiniciproducens, em que o gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo foi deletada ou em que pelo menos uma mutação foi introduzida no gene wcaJ, sendo que a introdução de pelo menos uma mutação preferencialmente leva à expressão de uma enzima na qual pelo menos 100 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 125 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos e com a máxima preferência pelo menos 160 aminoácidos da enzima tipo selvagem codificada pelo gene wcaJ são deletados da extremidade C-terminal e na qual, em comparação à tipo selvagem, a atividade da piruvato formato liase é reduzida, preferencialmente por uma modificação do gene pflA ou do gene pflD, em particular por uma modificação do gene pflA que tem a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 12 e que codifica PflA que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou por uma modificação do gene pflD que tem a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 14 e que codifica PflD que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 15; - células bacterianas modificadas da família Pasteurellaceae, particularmente preferenciais do gênero Basfia e ainda mais preferencial da espécie Basfia succiniciproducens, em que o gene wcaJ ou pelo menos uma parte do mesmo foi deletada ou em que pelo menos uma mutação foi introduzida no gene wcaJ, sendo que a introdução de pelo menos uma mutação preferencialmente leva à expressão de uma enzima na qual pelo menos 100 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 125 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos e com a máxima preferência pelo menos 160 aminoácidos da enzima tipo selvagem codificada pelo gene wcaJ são deletados da extremidade C-terminal e na qual, em comparação à tipo selvagem, a atividade da lactato desidrogenase e da piruvato formato liase é reduzida, preferencialmente por uma modificação do gene ldhA e do gene pflA, preferencialmente por uma modificação do gene ldhA e do gene pflA, em particular por uma modificação do gene ldhA que tem a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 10 e que codifica LdhA que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11 ou por uma modificação do gene pflA que tem a sequência de ácidos nucleicos de acordo com a SEQ ID NO: 12 e que codifica PflA que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 13, ou uma modificação do gene ldhA e do gene pflD, em particular por uma modificação do gene ldhA que tem a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 10 e que codifica LdhA que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 11 ou por uma modificação do gene pflD que tem a sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 14 e que codifica PflD que tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 15.
[052] Uma contribuição para resolver os problemas mencionados no início é, além disso, fornecida por um método para produzir um composto orgânico que compreende: (I) cultivar o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção em um meio de cultura que compreende pelo menos uma fonte de carbono assimilável para permitir que o micro-organismo modificado produza o composto orgânico, obtendo assim um caldo de fermentação que compreende o composto orgânico; (II) recuperar o composto orgânico a partir do caldo de fermentação obtido na etapa (I) do processo.
[053] Na etapa (I) do processo, o micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção é cultivado em um meio de cultura que compreende pelo menos uma fonte de carbono assimilável para permitir que o micro-organismo modificado produza o composto orgânico, obtendo assim um caldo de fermentação que compreende o composto orgânico. Compostos orgânicos preferenciais que podem ser produzidos pelo processo de acordo com a presente invenção compreendem ácidos carboxílicos como ácido fórmico, ácido lático, ácido propiônico, ácido 2-hidroxipropiônico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido 3-hidroxibutírico, ácido acrílico, ácido pirúvico ou sais desses ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos como ácido malônico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glutárico, ácido itacônico, ácido adípico ou sais dos mesmos, ácidos tricarboxílicos como ácido cítrico ou sais dos mesmos, alcoóis como metanol ou etanol, aminoácidos como L-asparagina, ácido L-aspártico, L-arginina, L-isoleucina, L-glicina, L-glutamina, ácido L- glutâmico, L-cisteína, L-serina, L-tirosina, L- triptofano, L-treonina, L-valina, L-histidina, L-prolina, L-metionina, L-lisina, L- leucina, etc.
[054] De acordo com uma realização preferencial do processo de acordo com a presente invenção, o composto orgânico é ácido succínico: O termo “ácido succínico”, como usado no contexto da presente invenção, tem de ser entendido no seu sentido mais amplo e também engloba sais do mesmo (isto é, succinato) como, por exemplo, sais de metais alcalinos, como sais de Na+ e K+, ou sais alcalinos terra, como sais Mg2+ e Ca2+ ou sais de amônio ou anidridos de ácido succínico.
[055] O micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção é, preferencialmente, incubado no meio de cultura a uma temperatura na faixa de cerca de 10 a 60°C ou 20 a 50°C ou 30 a 45°C em um pH de 5,0 a 9,0 ou 5,5 a 8,0 ou 6,0 a 7,0.
[056] Preferencialmente, o composto orgânico, especialmente ácido succínico, é produzido sob condições anaeróbicas. Condições anaeróbicas podem ser estabelecidas por meio de técnicas convencionais como, por exemplo, por desgaseificação dos constituintes do meio de reação e manutenção de condições anaeróbicas por introdução de dióxido de carbono ou nitrogênio ou misturas dos mesmos e, opcionalmente, hidrogênio a uma taxa de fluxo de, por exemplo, 0,1 a 1 ou 0,2 a 0,5 vvm. Condições aeróbicas podem ser estabelecidas por meio de técnicas convencionais, como, por exemplo, por meio de introdução de ar ou oxigênio em uma taxa de fluxo de, por exemplo, 0,1 a 1 ou 0,2 a 0,5 vvm. Se apropriado, uma ligeira sobrepressão de 0,1 a 1,5 bar pode ser aplicada no processo.
[057] A fonte de carbono assimilável é preferencialmente selecionada a partir de sacarose, maltose, maltotriose, maltotetrose, maltopentose, maltohexose, maltoheptose, D-frutose, D-glicose, D-xilose, L- arabinose, D-galactose, D-manose, glicerol e misturas das mesmas ou composições que contém pelo menos um dos ditos compostos, ou é selecionada a partir de produtos de decomposição do amido, celulose, hemicelulose e/ou lignocelulose. Preferencialmente, a fonte de carbono assimilável compreende D-glicose, maltose, sacarose, glicerol ou uma mistura de pelo menos dois desses compostos, em que as misturas de glicerol e D-glicose, glicerol e sacarose, glicerol e D-xilose, glicerol e maltose e D-glicose e frutose são particularmente preferenciais.
[058] A concentração inicial da fonte de carbono assimilável é preferencialmente ajustada para um valor em uma faixa de 5 a 100 g/L, preferencialmente de 5 a 75 g/L e mais preferencialmente 5 a 50 g/L e pode ser mantida na dita faixa durante o cultivo. O pH do meio de reação pode ser controlado por adição de bases adequadas como, por exemplo, amônia gasosa, NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, Mg(HCO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N e/ou misturas dos mesmos. Esses agentes de neutralização alcalina são especialmente necessários se os compostos orgânicos que são formados no decurso do processo de fermentação são ácidos carboxílicos ou ácidos dicarboxílicos. No caso de ácido succínico como o composto orgânico, Mg(OH)2 e MgCO3 são bases particularmente preferenciais.
[059] A etapa de fermentação (I) de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser realizada em fermentadores agitados, colunas de bolhas e reatores de circuito fechado. Uma visão geral abrangente dos tipos de métodos possíveis incluindo tipos de agitadores e projetos geométricos pode ser encontrada em Chmiel: “Bioprozesstechnik: Einführung in die Bioverfahrenstechnik”, Volume 1. No processo de acordo com a presente invenção, variantes típicas disponíveis são as seguintes variantes conhecidas pelos técnicos no assunto ou explicadas, por exemplo, em Chmiel, Hammes e Bailey: “Biochemical Engineering”, como batelada, batelada alimentada ou batelada repetida, ou de outro modo, fermentação contínua com e sem reciclagem da biomassa. Dependendo da linhagem de produção, aspersão com ar, oxigénio, dióxido de carbono, hidrogênio, nitrogênio ou misturas apropriadas de gás podem ser efetuadas a fim de obter um bom rendimento (YP/S).
[060] Condições particularmente preferenciais para produzir o ácido orgânico, especialmente ácido succínico, na etapa (I) do processo são:
[061] Fonte de carbono assimilável: glicerol, sacarose, D- glicose, maltose, glicerol + D-glicose, glicerol + sacarose, glicerol + maltose, glicerol + D-xilose, D-glicose + frutose: Temperatura: 30 a 45°C pH: 5,5 a 7,0 Gás fornecido: CO2
[062] Além disso, é preferencial na etapa (I) do processo que a fonte de carbono assimilável seja convertida para o composto orgânico, preferencialmente para ácido succínico, com um rendimento de carbono YP/S de pelo menos 0,5 g/g até cerca de 1,28 g/g; como, por exemplo, uma rendimento de carbono YP/S de pelo menos 0,6 g/g, de pelo menos 0,7 g/g, de pelo menos 0,75 g/g, de pelo menos 0,8 g/g, de pelo menos 0,85 g/g, de pelo menos 0,9 g/g, de pelo menos 0,95 g/g, de pelo menos 1,0 g/g, de pelo menos 1,05 g/g, de pelo menos 1,1 g/g, de pelo menos 1,15 g/g, de pelo menos 1,20 g/g, de pelo menos 1,22 g/g ou de pelo menos 1,24 g/g (composto orgânico/carbono, preferencialmente ácido succínico/carbono).
[063] Além disso, é preferencial na etapa (I) do processo que a fonte de carbono assimilável seja convertida para o composto orgânico, preferencialmente para ácido succínico, com um rendimento de produtividade específico de pelo menos 0,6 g g-1 DCW h-1 de composto orgânico, preferencialmente ácido succínico, ou de pelo menos 0,65 g g-1 DCW h-1, de pelo menos 0,7 g g-1 DCW h-1, de pelo menos 0,75 g g-1 DCW h-1 ou de pelo menos 0,77 g g-1 DCW h-1 de composto orgânico, preferencialmente ácido succínico.
[064] Além disso, é preferencial na etapa (I) do processo que a fonte de carbono assimilável seja convertida para o composto orgânico, preferencialmente para ácido succínico, com uma produção por espaço de tempo para o composto orgânico, preferencialmente para ácido succínico, de pelo menos 2,2 g/(L*h) ou pelo menos 2,5 g/(L*h), pelo menos 2,75 g/(L*h), pelo menos 3 g/(L*h), pelo menos 3,25 g/(L*h), pelo menos 3,5 g/(L*h), pelo menos 3,7 g/(L*h), pelo menos 4,0 g/(L*h), pelo menos 4,5 g/(L*h) ou pelo menos 5,0 g/(L*h) do composto orgânico, preferencialmente ácido succínico. De acordo com outra realização preferencial do processo de acordo com a presente invenção na etapa (I) do processo, o micro-organismo modificado converte pelo menos 20 g/L, mais preferencialmente pelo menos 25 g/L e até mesmo mais preferencialmente pelo menos 30 g/L da fonte de carbono assimilável, preferencialmente uma fonte de carbono assimilável selecionada a partir de sacarose, maltose, D-frutose, D-glicose, D-xilose, L-arabinose, D-galactose, D-manose e/ou glicerol, para pelo menos 20 g/L, mais preferencialmente para pelo menos 25 g/L e até mesmo mais preferencialmente pelo menos 30 g/L do composto orgânico, preferencialmente ácido succínico.
[065] Os diferentes parâmetros de rendimento conforme descrito no presente pedido (“rendimento de carbono” ou “YP/S”; “rendimento de produtividade específica”; ou “rendimento por espaço de tempo (STY)”) são bem conhecidos na técnica e são determinados, por exemplo, por Song e Lee, 2006. “Rendimento de carbono” e “YP/S” (cada um expresso em massa de composto orgânico produzido/massa de fonte de carbono assimilável consumida) são usados no presente pedido como sinônimos. O rendimento de produtividade específica descreve a quantidade de um produto, como o ácido succínico, que é produzido por h e L de caldo de fermentação por g de biomassa seca. A quantidade de peso seco celular declarado como “DCW” descreve a quantidade de micro-organismo biologicamente ativo em uma reação bioquímica. O valor é dado como g de produto por g de DCW por h (isto é, g g-1DCW h-1). O rendimento por espaço de tempo (STY) é definido como a razão da quantidade total de composto orgânico formado no processo de fermentação para o volume da cultura, considerado ao longo do tempo completo de cultivo. O rendimento por espaço de tempo também é conhecido como “produtividade volumétrica”.
[066] Na etapa (II) do processo, o composto orgânico, preferencialmente ácido succínico é recuperado a partir do caldo de fermentação obtido na etapa (I) do processo.
[067] Usualmente, o processo de recuperação compreende a etapa de separar os micro-organismos recombinantes a partir do caldo de fermentação como a também denominada “biomassa”. Os processos para remover a biomassa são conhecidos pelos técnicos no assunto, e compreendem filtração, sedimentação, flotação ou combinações dos mesmos. Consequentemente, a biomassa pode ser removida, por exemplo, com centrífugas, separadores, decantadores, filtros ou em um aparelho de flotação. Para a recuperação máxima do produto de valor, a lavagem da biomassa é com conveniente frequência, por exemplo, sob a forma de uma diafiltração. A seleção do método depende do conteúdo de biomassa no caldo de fermentação e das propriedades da biomassa, e também da interação da biomassa com o composto orgânico (isto é, o produto de valor). Em uma realização, o caldo de fermentação pode ser esterilizado ou pasteurizado. Em uma realização adicional, o caldo de fermentação é concentrado. Dependendo do requisito, essa concentração pode ser feita em modo de batelada ou continuamente. A faixa de pressão e temperatura deve ser selecionada de modo que em primeiro lugar não ocorra dano ao produto, e em segundo lugar que seja necessário usar o mínimo de aparelho e energia. A seleção habilidosa de níveis de pressão e temperatura para uma evaporação multiestágio, em particular permite economia de energia.
[068] O processo de recuperação pode ainda compreender etapas de purificação adicionais, nas quais o composto orgânico, preferencialmente ácido succínico é ainda purificado. Se, no entanto, o composto orgânico é convertido em um produto orgânico secundário por reações químicas conforme descrito abaixo, uma purificação adicional do composto orgânico, dependendo do tipo de reação e das condições de reação, não é necessariamente exigida. Para a purificação do composto orgânico obtido na etapa (II) do processo, preferencialmente para a purificação de ácido succínico, métodos conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados como, por exemplo, cristalização, filtração, eletrodiálise e cromatografia. No caso de ácido succínico como o composto orgânico, por exemplo, o ácido succínico pode ser isolado por precipitação como um produto succinato de cálcio pelo uso de hidróxido, óxido, carbonato de cálcio ou carbonato de hidrogênio por neutralização e filtração do precipitado. O ácido succínico é recuperado a partir do succinato de cálcio precipitado por acidificação com ácido sulfúrico seguido por filtração para remover o sulfato de cálcio (gesso) que precipita. A solução resultante pode ser, além disso, purificada por meio de cromatografia de troca iônica a fim de remover os íons residuais indesejados. Alternativamente, se o hidróxido de magnésio, carbonato de magnésio ou misturas dos mesmos foram usados para neutralizar o caldo de fermentação, o caldo de fermentação obtido na etapa (I) do processo pode ser acidificado para transformar o succinato de magnésio contido no meio na forma de ácido (isto é, ácido succínico), que subsequentemente pode ser cristalizado por resfriamento do meio acidificado. Exemplos de processos de purificação adequados adicionais são divulgados na patente EP-A-1 005 562, documento WO-A- 2008/010373, documento WO-A-2011/082378, documento WO-A- 2011/043443, documento WO-A-2005/030973, documento WO-A- 2011/123268 e documento WO-A-2011/064151 e patente EP-A-2 360 137.
[069] De acordo com uma realização preferencial do processo de acordo com a presente invenção, o processo ainda compreende a seguinte etapa do processo: I) conversão do composto orgânico contido no caldo de fermentação obtido na etapa (I) do processo ou conversão do composto orgânico recuperado obtido na etapa (II) do processo em um produto orgânico secundário sendo diferente do composto orgânico por pelo menos uma reação química.
[070] No caso de ácido succínico como o composto orgânico, produtos orgânicos secundários preferenciais são selecionados a partir do grupo que consiste em ésteres de ácido succínico e polímeros dos mesmos, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanodiol (BDO), gama-butirolactona (GBL) e pirrolidonas.
[071] De acordo com uma realização preferencial para a produção de THF, BDO e/ou GBL esse processo compreende: b1) tanto a hidrogenação catalítica direta do ácido succínico obtido nas etapas (I) ou (II) do processo para THF e/ou BDO e/ou GBL, como b2) a esterificação química de ácido succínico e/ou sais de ácido succínico obtidos nas etapas (I) ou (II) do processo para seus ésteres de dialquila inferiores correspondentes e hidrogenação catalítica subsequente dos ditos ésteres para THF e/ou BDO e/ou GBL.
[072] De acordo com uma realização preferencial para a produção de pirrolidonas, esse processo compreende: b) a conversão química de sais de amônio de ácido succínico obtidos nas etapas (I) ou (II) do processo para pirrolidonas de uma forma conhecida por si.
[073] Para detalhes de preparação desses compostos, é feita referência à patente US-A-2010/0159543 e documento WO-A-2010/092155.
[074] Uma contribuição para a resolução dos problemas mencionados no início, além disso, é fornecida pelo uso do micro-organismo modificado de acordo com a presente invenção para a produção fermentativa de compostos orgânicos. Compostos orgânicos preferenciais são os compostos que já foram mencionados em conjunto com o processo de acordo com a presente invenção, ácido succínico sendo o composto orgânico de máxima preferência. Além disso, condições preferenciais para a produção fermentativa de compostos orgânicos, preferencialmente de ácido succínico, são as condições que já foram descritas em conjunto com a etapa (I) do processo de acordo com a presente invenção.
[075] A invenção é agora explicada em mais detalhes com o auxílio de Figuras e Exemplos não limitantes.
[076] A Figura 1 mostra um mapa esquemático do plasmídeo pSacB (SEQ ID NO: 5).
[077] A Figura 2 mostra um mapa esquemático do plasmídeo pSacB ΔldhA (SEQ ID NO: 6).
[078] A Figura 3 mostra um mapa esquemático do plasmídeo pSacB ΔpflA (SEQ ID NO: 7).
[079] A Figura 4 mostra um mapa esquemático do plasmídeo pSacB ΔwcaJ (SEQ ID NO: 8).
[080] A Figura 5 mostra um mapa esquemático do plasmídeo pSacB ΔpflD (SEQ ID NO: 9).
[081] A Figura 6 mostra um pélete (pellet) de células obtidas por sedimentação de diferentes meios de cultura. EXEMPLOS EXEMPLO 1 MÉTODO GERAL PARA A TRANSFORMAÇÃO DE BASFIA SUCCINICIPRODUCENS TABELA 1 NOMENCLATURA DO DDI-TIPO SELVAGEM E MUTANTES CITADOS NOS EXEMPLOS
Figure img0002
[082] DD1 de Basfia succiniciproducens (tipo selvagem) foi transformado com DNA por eletroporação com o uso do seguinte protocolo:
[083] Para preparar uma pré-cultura, DD1 foi inoculado a partir de estoque congelado em 40 mL de BHI (infusão cérebro e coração; Becton Dickinson and Company), em frasco agitador de 100 mL. A incubação foi realizada durante a noite a 37°C, 200 rpm. Para preparar a cultura principal, 100 mL de BHI foi colocado em um frasco agitador de 250 mL e inoculado a uma OD final (600 nm) de 0,2 com a pré-cultura. A incubação foi realizada a 37°C, 200 rpm. As células foram coletadas em uma OD de aproximadamente 0,5, 0,6 e 0,7, o pélete foi lavado uma vez com glicerol frio 10% a 4°C e ressuspenso em 2 mL de glicerol 10% (4°C).
[084] 100 μL de células competentes foram misturadas com 2 a 8 μg de DNA plasmidial e mantidas no gelo por 2 min em um cadinho de eletroporação com uma largura de 0,2 cm. Eletroporação sob as seguintes condições: 400 Q; 25 μF; 2,5 kV (Gene Pulser, Bio-Rad). 1 mL de BHI resfriado foi adicionado imediatamente após a eletroporação e a incubação foi realizada por aproximadamente 2 h a 37°C.
[085] As células foram plaqueadas em BHI com 5 mg/L de cloranfenicol e incubadas por 2-5 dias a 37°C até que as colônias dos transformantes ficaram visíveis. Os clones foram isolados e reaplicadas por esfregaço sobre BHI com 5 mg/L cloranfenicol até que foi obtida pureza de clones.
EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE CONSTRUCTOS DE DELEÇÃO
[086] Plasmídeos de mutação/deleção foram construídos com base no vetor pSacB (SEQ ID NO: 5). A Figura 1 mostra um mapa esquemático de plasmídeo pSacB. As regiões de flanqueamento 5’- e 3’- (aproximadamente 1500 bp cada) do fragmento cromossômico, que deve ser deletado foram amplificadas por PCR a partir de DNA cromossômico de Basfia succiniciproducens e introduzidas no dito vetor com o uso de técnicas padrão. Normalmente, pelo menos 80 % da ORF foi direcionado para uma deleção. Dessa forma, os plasmídeos de deleção para a lactato desidrogenase ldhA, pSacB_delta_ldhA (SEQ ID NO: 6), 6), a enzima de ativação de piruvato formato liase pflA, pSacB_delta_pflA (SEQ ID NO: 7), o transportador específico de frutose putativo wcaJ, pSacB_delta_wcaJ (SEQ ID NO: 8) e piruvato formato liase pflD, pSacB_delta_ pflD (SEQ ID NO: 9) foram construídos. As Figuras 2, 3, 4 e 5 mostram mapas esquemáticos dos plasmídeos pSacB_delta_ldhA, pSacB_delta_pflA, pSacB_delta_wcaJ and pSacB_delta_pflD, respectivamente.
[087] Na sequência de plasmídeos de pSacB (SEQ ID NO: 5) o gene sacB está contido a partir das bases 2380 a 3801. O promotor sacB está contido a partir das bases 3802 a 4264. O gene de cloranfenicol está contido a partir das bases 526 a 984. A origem de replicação para E. coli (ori EC) está contida a partir das bases 1477 a 2337 (consulte a Figura 1).
[088] Na sequência de plasmídeos de pSacB_delta_ldhA (SEQ ID NO: 6) a região flanqueadora 5’ do gene ldhA, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 1519 a 2850, enquanto a região flanqueadora 3’ do gene ldhA, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 62 a 1518. O gene sacB está contido a partir das bases 5169 a 6590. O promotor sacB está contido a partir das bases 6591 a 7053. O gene de cloranfenicol está contido a partir das bases 3315 a 3773. A origem de replicação para E. coli (ori EC) está contida a partir das bases 4266 a 5126 (consulte a Figura 2).
[089] Na sequência de plasmídeos de pSacB_delta_pflA (SEQ ID NO:7) a região flanqueadora 5’ do gene pflA, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 1506 a 3005, enquanto a região flanqueadora 3’ do gene pflA, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 6 a 1505. O gene sacB está contido a partir das bases 5278 a 6699. O promotor sacB está contido a partir das bases 6700 a 7162. O gene de cloranfenicol está contido a partir das bases 3424 a 3882. A origem de replicação para E. coli (ori EC) está contida a partir das bases 4375 a 5235 (consulte a Figura 3).
[090] Na sequência de plasmídeos de pSacB_delta_ldhA (SEQ ID NO: 8) a região flanqueadora 5’ do gene pflA, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 1506 a 3122, enquanto a região flanqueadora 3’ do gene wcaJ, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 6 a 1505. O gene sacB está contido a partir das bases 5395 a 6816. O promotor sacB está contido a partir das bases 6817 a 7279. O gene de cloranfenicol está contido a partir das bases 3541 a 3999. A origem de replicação para E. coli (ori EC) está contida a partir das bases 4492 a 5352 (consulte a Figura 4).
[091] Na sequência de plasmídeos de pSacB_delta_pflA (SEQ ID NO: 9) a região flanqueadora 5’ do gene pflD, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 1533 a 2955, enquanto a região flanqueadora 3’ do gene pflD, que é homóloga ao genoma de Basfia succiniciproducens, está contida a partir das bases 62 a 1532. O gene sacB está contido a partir das bases 5256 a 6677. O promotor sacB está contido a partir das bases 6678 a 7140. O gene de cloranfenicol está contido a partir das bases 3402 a 3860. A origem de replicação para E. coli (ori EC) está contida a partir das bases 4353 a 5213 (consulte a Figura 5). EXEMPLO 3 GERAÇÃO DE LINHAGENS PRODUTORAS DE SUCCINATO APRIMORADAS a) DD1 de Basfia succiniciproducens foi transformada conforme descrito acima com o pSacB_delta_ldhA e “Campbelled in” para produzir uma linhagem “Campbell in”. Transformação e integração no genoma de Basfia succiniciproducens foram confirmadas por PCR que produz bandas para o evento integrador do plasmídeo no genoma de Basfia succiniciproducens.
[092] A linhagem “Campbell in” foi então “Campbelled out” com o uso de placas de ágar contendo sacarose como um meio de seleção contador, selecionando a perda (de função) do gene sacB. Portanto, as linhagens “Campbell in” foram incubadas em 25 a 35 mL de meio não seletivo (BHI que não contém antibiótico) a 37°C, 220 rpm durante a noite. A cultura da noite anterior foi então reaplicada por esfregaço sobre BHI recém-preparado contendo placas de sacarose (10%, sem antibióticos) e incubada durante a noite a 37°C (’’primeira transferência de sacarose”). Colônias únicas obtidas junto à primeira transferência foram novamente aplicadas por esfregaço sobre BHI recém-preparado contendo placas de sacarose (10%) e incubadas durante a noite a 37°C (“segunda transferência de sacarose”). Esse procedimento foi repetido até uma conclusão mínima de cinco transferências (“terceira, quarta, quinta transferência de sacarose”) em sacarose. O termo “primeira a quinta transferência de sacarose” refere-se à transferência de uma linhagem após integração cromossômica de um vetor contendo um gene sacB-levan-sucrase sobre sacarose e meio de cultura contendo placas de ágar para o propósito de seleção de linhagens com a perda do gene sacB e das sequências de plasmídeos circundantes. Colônias únicas a partir da quinta placa de transferência foram incubadas sobre 25 a 35 mL de meio não seletivo (BHI que não contém antibiótico) e incubadas a 37°C, 220 rpm durante a noite. A cultura da noite anterior foi diluída em série e plaqueada sobre placas de BHI para obter colônias únicas isoladas.
[093] As linhagens “Campbelled out” contendo a mutação/deleção do gene ldhA foram confirmadas por sensibilidade a cloranfenicol. Os mutantes de mutação/deleção entre essas linhagens foram identificados e confirmados por análise PCR. Isso levou ao mutante de deleção de ldhA de DD1 ΔldhA de Basfia succiniciproducens. b) DD1 ΔldhA de Basfia succiniciproducens foi transformado com pSacB_delta_pflD, conforme descrito acima e “Campbelled in” para produzir uma linhagem “Campbell in”. A transformação e integração foram confirmadas por PCR. A linhagem “Campbell in” foi então “Campbelled out” conforme descrito anteriormente. Os mutantes de deleção entre essas linhagens foram identificados e confirmados por análise PCR. Isso levou ao mutante de dupla deleção de ldhA pflD, DD1 ΔldhA ΔpflD de Basfia succiniciproducens c) DD1 ΔldhA ΔpflD de Basfia succiniciproducens foi transformado com pSacB_delta_wcaJ, conforme descrito acima e “Campbelled in” para produzir uma linhagem “Campbell in”. A transformação e integração foram confirmadas por PCR. A linhagem “Campbell in” foi então “Campbelled out” conforme descrito anteriormente. Os mutantes de deleção entre essas linhagens foram identificados e confirmados por análise PCR. Isso levou ao mutante de tripla deleção ldhA pflD wcaJ de DD1 ΔldhA ΔpflD ΔwcaJ de Basfia succiniciproducens . d) DD1 ΔldhA de Basfia succiniciproducens foi transformado com pSacB_delta_pflA, conforme descrito acima e “Campbelled in” para produzir uma linhagem “Campbell in”. A transformação e integração foram confirmadas por PCR. A linhagem “Campbell in” foi então “Campbelled out” conforme descrito anteriormente. Os mutantes de deleção entre essas linhagens foram identificados e confirmados por análise PCR. Isso levou ao mutante de dupla deleção de ldhA pflA, DD1 ΔldhA ΔpflA de Basfia succiniciproducens. e) DD1 ΔldhA de Basfia succiniciproducens foi transformado com pSacB_delta_pflD, conforme descrito acima e “Campbelled in” para produzir uma linhagem “Campbell in”. A transformação e integração foram confirmadas por PCR. A linhagem “Campbell in” foi então “Campbelled out” conforme descrito anteriormente. Os mutantes de deleção entre essas linhagens foram identificados e confirmados por análise PCR. Isso levou ao mutante de tripla deleção de ldhA pflA wcaJ, DD1 ΔldhA ΔpflA ΔwcaJ de Basfia succiniciproducens. f) DD1 de Basfia succiniciproducens foi transformado com pSacB_delta_wcaJ, conforme descrito acima e “Campbelled in” para produzir uma linhagem “Campbell in”. A transformação e integração foram confirmadas por PCR. A linhagem “Campbell in” foi então “Campbelled out” conforme descrito anteriormente. Os mutantes de deleção entre essas linhagens foram identificados e confirmados por análise PCR. Isso levou ao mutante de deleção de wcaJ de DD1 ΔwcaJ de Basfia succiniciproducens.
EXEMPLO 4 CULTIVO DE VÁRIAS LINHAGENS DD1 EM GLICOSE E SACAROSE
[094] A produtividade da DD1 foi comparada com a produtividade da linhagem mutante DD1 ΔwcaJ na presença de glicose ou sacarose como fonte de carbono.
[095] A produtividade da DD1 ΔldhA ΔpflD foi comparada com a produtividade da linhagem mutante DD1 ΔldhA ΔpflD ΔwcaJ na presença de glicose ou sacarose como fonte de carbono.
[096] A produtividade da DD1 ΔldhA ΔpflA foi comparada com a produtividade da linhagem mutante DD1 ΔldhA ΔpflA ΔwcaJ na presença de glicose ou sacarose como fonte de carbono.
[097] A produtividade foi analisada utilizando condições de meios e incubação descritas abaixo.
1. PREPARAÇÃO DO MEIO
[098] A composição e a preparação do meio de cultivo são conforme descritas nas tabelas 2, 3, 4 e 5 a seguir. TABELA 2 COMPOSIÇÃO DA SOLUÇÃO DE ELEMENTOS TRAÇO
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TABELA 3 COMPOSIÇÃO DE SOLUÇÃO DE VITAMINA
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TABELA 4 COMPOSIÇÃO DE MEIO LSM PARA CULTIVO EM GLICOSE
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TABELA 5 COMPOSIÇÃO DE MEIO LSM PARA CULTIVO EM SACAROSE
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2 CULTIVOS E ANALÍTICA
[099] Para o crescimento da cultura principal, bactérias de uma placa de ágar BHI recém-cultivada foram usadas para inocular a OD600 = 0,75 uma garrafa com 100 mL de soro com tampa de borracha butílica apertada com gás contendo 50 mL do meio líquido descrito nas tabelas 2 e 3 com uma atmosfera de CO2. As garrafas foram incubadas a 37°C e 160 rpm (diâmetro de agitação: 2,5 cm). O consumo das fontes de C e a produção de ácidos carboxílicos foram quantificados através de HPLC (métodos de HPLC são descritos nas Tabela 10 e 11) após 24 h ou 48 h. O crescimento celular foi medido por medição da absorbância a 600 nm (OD600) com o uso de um espectrofotômetro (Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Suécia).
3. RESULTADOS
[100] Os resultados dos experimentos de cultivo com diferentes linhagens DD1 são mostrados nas tabelas 6, 7 e 8. Como pode ser visto a partir desses resultados, uma redução da atividade da enzima que é codificada pela célula ΔwcaJ leva à produção aumentada de ácido succínico.
[101] Além disso, as amostras obtidas por cultivo da linhagem DD1 ΔldhA ΔpflD/DD1 ΔldhA ΔpflA e da linhagem DD1ΔldhA ΔpflD ΔwcaJ/DD1ΔldhA ΔpflA ΔwcaJ após 24h ou 48 h de incubação foram transferidas para um tubo de15 mL para medir os volumes de sobrenadante obtidos após centrifugação. Conforme mostrado na tabela 9, uma redução da atividade da enzima que é codificada pela célula ΔwcaJ leva a micro-organismos modificados que mostram um comportamento de sedimentação significativamente aprimorado (um pélete celular mais denso é obtido após centrifugação) e que pode, dessa forma, ser removido mais facilmente do meio de cultura no processo de purificação subsequente. TABELA 6 CULTIVO DA LINHAGEM DD1 E DA LINHAGEM DD1 Δ WCAJ EM GLICOSE E SACAROSE
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a tempo de cultivo b consumo de substrato (glicose ou sacarose) C formação de ácido succínico, ácido lático, ácido fórmico, ácido acético, ácido pirúvico, ácido propiônico e etanol g produção de SA (razão de SA por substrato consumido) h Descobriu-se que os limites de detecção para ácido acético, ácido lático, ácido málico e ácido fórmico eram inferiores a 0,01g/L no dado método de HPLC TABELA 7 CULTIVO DA LINHAGEM DD1 Δ LDHA Δ PFLD E DA LINHAGEM DD1 Δ LDHA Δ PFLD Δ WCAJ EM GLICOSE E SACAROSE
Figure img0010
a tempo de cultivo b consumo de substrato (glicose ou sacarose) C formação de ácido succínico, ácido lático, ácido fórmico, ácido acético, ácido pirúvico, ácido propiônico e etanol g produção de SA (razão de SA por substrato consumido) h Descobriu-se que os limites de detecção para ácido acético, ácido lático, ácido málico e ácido fórmico eram inferiores a 0,01g/L no dado método de HPLC TABELA 8 CULTIVO DA LINHAGEM DD1 ΔLDHA ΔPFLA E DA LINHAGEM DD1 ΔLDHA ΔPFLA ΔWCAJ EM GLICOSE E SACAROSE
Figure img0011
a tempo de cultivo b consumo de substrato (glicose ou sacarose) C formação de ácido succínico, ácido lático, ácido fórmico, ácido acético, ácido pirúvico, ácido propiônico e etanol g produção de SA (razão de SA por substrato consumido) h Descobriu-se que os limites de detecção para ácido acético, ácido lático, ácido málico e ácido fórmico eram inferiores a 0,01g/L no dado método de HPLC TABELA 9 VOLUMES DE SOBRENADANTE OBTIDO APÓS CENTRIFUGAÇÃO (4.600 RPM, 10 MIN) DE 10 ML DE CULTURAS BACTERIANAS.
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TABELA 10 MÉTODO HPLC (ZX-THF50) PARA ANÁLISE DE GLICOSE, ÁCIDO SUCCÍNICO, ÁCIDO FÓRMICO, ÁCIDO LÁTICO, ÁCIDO ACÉTICO, ÁCIDO PIRÚVICO E ETANOL
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TABELA 11 MÉTODO HPLC (FAST-CH) PARA ANÁLISE DE GLICOSE E SACAROSE
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SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE RDNA 16S DA LINHAGEM DD1)
[102] tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaa cggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggctt atggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcg ggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacg atctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggc agcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcg ggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaa gcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcg taaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagact gggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaa taccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacag gattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagct aacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccg cacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatc ctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaa atgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaagg agactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggcta cacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcat cgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgc ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatag cttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtagg ggaacctgcgg
SEQ ID NO: 2 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE RDNA 23S DA LINHAGEM DD1)
[103] agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgac taagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggt gagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaat aaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaat caaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagag gaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttg cgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactc ctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaata gaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtgactgcgtaccttttgtataatgggtca gcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaactgggcgtcg agttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactgga ggaccgaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgg gagatagctggttctccccgaaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcg gctagggggccatcccggcttaccaacccgatgcaaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagaca cacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagaccgccagctaaggtcccaaagtttat attaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatcatttaaaga aagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagc tgcggcatcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggct gctggacgtatcacgagtgcgaatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaa gaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcagggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgta gtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggggacggagtaggttaggttatcgac ctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaacaccgagagat gatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagatta taataaaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtg aaggaactaggcaaaatagcaccgtaacttcgggagaaggtgcgccggcgtagattgtagaggtataccctt gaaggttgaaccggtcgaagtgacccgctggctgcaactgtttattaaaaacacagcactctgcaaacacga aagtggacgtatagggtgtgatgcctgcccggtgctggaaggttaattgatggcgttatcgcaagagaagcgc ctgatcgaagccccagtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaag ttccgacctgcacgaatggcataatgatggccaggctgtctccacccgagactcagtgaaattgaaatcgccg tgaagatgcggtgtacccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactatagcttgacactgaaccttg aattttgatgtgtaggataggtgggaggctttgaagcggtaacgccagttatcgtggagccatccttgaaatacc accctttaacgtttgatgttctaacgaagtgcccggaacgggtactcggacagtgtctggtgggtagtttgactgg ggcggtctcctcccaaagagtaacggaggagcacgaaggtttgctaatgacggtcggacatcgtcaggttag tgcaatggtataagcaagcttaactgcgagacggacaagtcgagcaggtgcgaaagcaggtcatagtgatc cggtggttctgaatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccgc ccaagagttcatatcgacggcggtgtttggcacctcgatgtcggctcatcacatcctggggctgaagtaggtcc caagggtatggctgttcgccatttaaagtggtacgcgagctgggtttaaaacgtcgtgagacagtttggtccctat ctgccgtgggcgttggagaattgagaggggctgctcctagtacgagaggaccggagtggacgcatcactggt gttccggttgtgtcgccagacgcattgccgggtagctacatgcggaagagataagtgctgaaagcatctaagc acgaaacttgcctcgagatgagttctcccagtatttaatactgtaagggttgttggagacgacgacgtagatagg ccgggtgtgtaagcgttgcgagacgttgagctaaccggtactaattgcccgagaggcttagccatacaacgct caagtgtttttggtagtgaaagttattacggaataagtaagtagtcagggaatcggct
SEQ ID NO: 3 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DDO GENE WCAJ DA LINHAGEM DD1)
[104] atgataaaacgccttttcgatattgttgtcgcattgatagcattgattttgttttcgccctt atatttgtttgtggcttataaggtaaaacaaaatttgggatcaccggtgttatttaaacaaacccgccccggattgc atggtaaaccctttgagatgattaagttcagaacaatgaaagacggcgcagatgaaaacggtaatattttgcc ggatgcggagcgcttaacacctttcggcaaaatgttgcgcgctaccagtctggacgagttgccggaactttgga atgtattaaaaggtgatatgagtctggtggggccgcgtcctctactgatggaatatttgccgctgtataacgaaa gacaggctaagcgccatgaagtgaaacccggaattaccggttatgcacaggtaaacggtcgcaatgccatc agttgggagcagaaatttgaattggatgcctggtatgttgaacatcaatccttgtggctggatttgaaaattatcgc aaagaccatccaaaaagtgatcgcaaaagacgatattaatgcggcagatgatgccaccatgcctaaatttga agggaataaaaaatcatga
SEQ ID NO: 4 (SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA ENZIMA CODIFICADA PELO gene wcaJ acima)
[105] MIKRLFDIVVALIALILFSPLYLFVAYKVKQNLGSPVLFKQT RPGLHGKPFEMIKFRTMKDGADENGNILPDAERLTPFGKMLRATSLDELPELW NVLKGDMSLVGPRPLLMEYLPLYNERQAKRHEVKPGITGYAQVNGRNAISWE QKFELDAWYVEHQSLWLDLKIIAKTIQKVIAKDDINAADDATMPKFEGNKKS
SEQ ID NO: 5 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS COMPLETA DO PLASMÍDEO PSACB)
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SEQ ID NO: 6 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS COMPLETA DO PLASMÍDEO PSACB DELTA LDHA)
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SEQ ID NO: 7 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS COMPLETA DO PLASMÍDEO PSACB DELTA PFLA)
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SEQ ID NO: 8 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS COMPLETA DO PLASMÍDEO PSACB WCAJ)
[109] tcgagtaagccgattcagctgatccgccacatggggaaaaagcctaatctgcgg aatatgaaaccgataccagtccagtaaagttgacaaatcgacatcatattgctcaaccaagtattgaaaagcg ttttcaccgcgatgatacaattcgaccagccggttaaataacgtttcactccgttccggtgccaaacgagacgc aatatgcttataggcggaatacagaaaatcgatttccgcataaagcgtatcgtccaaatctaaaaccaacgctt tatttttcataatgatgagccagtacttccgcgtcataccgcaacattaataaatccgcttcccagtcttcgaacgc aggaatcggctgattaaacaaatattcctgaatcaaccaacggggataattggctcccgccagataactcaac ggataaccgccgccgaacctagggttaatttcaataccaagaatttcagcggtggattccttataaaatacttgg attgttaagcaaccgcgcgcccccggtaaacgggacaatttttccgataattgcgtcacgatggcattttttctggt cacacctttgttaatttcccccgctctgacaaaaattctctttctcggtaccgcacttttcagttcggaatttttatcaaa ataacaatccacggtatattcgtcgtattccgccggcgaaatatattgcataaacattaattcgggattttccaatt gctccggtgaaatatcttccggtttctccgccacaaaaattcctttacttaaactaccgttgtaaggcttcacaaaa acaggatattcaaattgacctttttcaaactgcttcggtaccgcaatattatgttcaataaacagttgattggttaatc gtttgtcgcgacattttctgacaaactctgtatcactaacggaaataaaaatacctttttctttaaaccgttgcagat 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SEQ ID NO: 9 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS COMPLETA DO PLASMÍDEO PSACB PFLD)
[110] tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacc tagggatgggatcgagctcttttccttgccgacaaggcggaagctttaggggaaattcccgtaggtgccgtattg gtggatgaacggggcaatatcattggtgaaggctggaacctctctattgtgaactcggatcccaccgcccatgc cgaaattattgcgttgcgtaacgccgcgcagaaaatccaaaattaccgcctgctcaataccactttatacgtga ctttagaaccctgcaccatgtgcgccggcgcgattttacacagccgaatcaaacgcttggtattcggggcgtcc gattacaaaaccggtgcggtgggttccagatttcatttttttgaggattataaaatgaatcatggggttgagatcac aagcggtgtcttataggatcaatgcagtcagaagttaagccgctttttccaaaagcgcagggaacagaaaaa acaacaaaaagctaccgcacttttacaacacccccggcttaactcctctgaaaaatagtgacaaaaaaacc gtcataatgtttacgacggtttttttatttcttctaatatgtcacattaagcccgtagcctgcaagcaaccccttaacat gctccattaattcttttgtcggcggttttacatcttcaagctcgtatttatcgccgagtacttcccatttatgggcgccta gacggtgataaggtaataattccactttttcgatattcttcatatctttaatgaaattccccagcatgtgcaaatcttc gtcactatctgtataacccggcactacaacatggcggatccaggtacgctgatttcgatccgctaaatattttgcg aattcgagcactcttttattcggcacgccaatcaggctttcgtgaacccgttcattcatttctttcaggtcaagcaac 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SEQ ID NO: 10 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE LDHA DA LINHAGEM DD1)
[111] ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagt actaaaaattatgatcgcaaacatctggatttggcgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttactt gatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgtattttcgtcaatgatgatgcgagccgc ccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaataatgtggattt ggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagc atgcgatcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttct ctggaaggattggtcggttttaatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggc ggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgttctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgt tgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgttatcactttgcattgcccggctacggc ggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaataccagccgc ggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggat gtttatgaaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgccttt cttcctgtcataatgtgctttttaccggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtg actttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaacgtgcgaaaatagcgttgaaggctaa
SEQ ID NO: 11 (SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE LDHA DA LINHAGEM DD1)
[112] MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFEL HFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFVNDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNN VDLEAAKELGLKVVRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLNRRIHKAYQRTRDANFSLE GLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAEALGAKYV GLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAI EALKRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQA FLTEEALNNIADVTLSNIQAVSKNATCENSVEG
SEQ ID NO: 12 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE PFLA DA LINHAGEM DD1)
[113] atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggcc gggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttg cacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttatgaacgcctc gggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactggttcagagcct gccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattg attgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgt gccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgtt gtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgcacatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatc gaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaagtactcggcgataaatacgagc ttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctacgggcttaa tgtgacatattag
SEQ ID NO: 13 (SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE PFLA DA LINHAGEM DD1)
[114] MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNR DTWDLHGGKEISVEELMKEVVTYRHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDW FRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLVLLDLKEMNERVHESLIGVP NKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHVVVPGYTDSDEDLHMLGNFIKDMKNIEKVEL LPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY
SEQ ID NO: 14 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE PFLD DA LINHAGEM DD1)
[115] atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggt gaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgactttatccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcatt cttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtgatggaaggcatcaaaatcgaaaaca aaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctggttatatcaataa agatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatca aaatgatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgt aaaacccataaccaaggcgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaacc ggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatcggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctg atgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaagcgggcgaagacattcaggcaact atccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatggcggcatcttac ggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagc ggttaaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgac ttaaaacgcggtttaatcactgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggt tcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattattctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccg gtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgtattacatactttatacactatgggtact tctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgtgcgaaagtatc tattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatc gcatgctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaac tatgttatacgcaattaacggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgatta cagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcgaacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgt aaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatgaagcggcattgatggcgttccacgatc gcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatccgcaatcaaata tgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatc gacttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagactta gttgaacgtttcatgaaaaaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctga ctatcacttctaacgtggtatacggtaagaaaaccggtaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccatt cggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggtgcggttgcttcacttacttctgtggctaaa cttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattaggtaaagatgacg aagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtc aacacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaa ttaaccattcgtgtttcaggttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactc gtacgtttacacaatcaatgtaa
SEQ ID NO: 15 (AMINOÁCIDOS DE PFLD DA LINHAGEM DD1)
[116] MAELTEAQKKAWEGFVPGEWQNGVNLRDFIQKNYTPYE GDESFLADATPATSELWNSVMEGIKIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINK DLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGRKLDPQVEFIFTEYRKTHN QGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYLMKDKKA QFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQ EAIQWTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMD HLVMKLRMVRFLRTPEYDQLFSGDPMWATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLH TLYTMGTSPEPNLTILWSEQLPEAFKRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNN DDYAIACCVSPMVVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGIDEKNGMQVGPKTA PITDEVLNFDTVIERMDSFMDWLATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAALMAFHDRD VFRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNVVASNVAIDFEIEGE YPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNVVYGKK TGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTF SIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDGYFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDA MENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM
SEQ ID NO: 16 (SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE WCAJ DA LINHAGEM DD1 COM INSERÇÃO DE ClTOSINA ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 81 E 82)
[117] Atgataaaacgccttttcgatattgttgtcgcattgatagcattgattttgttttcgccctt atatttgtttgtggcttatçaaggtaaaacaaaatttgggatcaccggtgttatttaaacaaacccgccccggattg catggtaaaccctttgagatgattaagttcagaacaatgaaagacggcgcagatgaaaacggtaatattttgc cggatgcggagcgcttaacacctttcggcaaaatgttgcgcgctaccagtctggacgagttgccggaactttgg aatgtattaaaaggtgatatgagtctggtggggccgcgtcctctactgatggaatatttgccgctgtataacgaa agacaggctaagcgccatgaagtgaaacccggaattaccggttatgcacaggtaaacggtcgcaatgccat cagttgggagcagaaatttgaattggatgcctggtatgttgaacatcaatccttgtggctggatttgaaaattatcg caaagaccatccaaaaagtgatcgcaaaagacgatattaatgcggcagatgatgccaccatgcctaaatttg aagggaataaaaaatcatga

Claims (5)

1. MICRO-ORGANISMO MODIFICADO da família Pasteurellaceae, caracterizado pelo gene wcaJ ter sido deletado ou em que pelo menos uma mutação foi introduzida no gene wcaJ que leva à expressão de uma enzima truncada codificada pelo gene wcaJ em que pelo menos 100 aminoácidos da enzima tipo selvagem codificada pelo gene wcaJ são deletados da extremidade C-terminal, em que o gene wcaJ compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: a) ácidos nucleicos que têm a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; b) ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; em que o tipo selvagem a partir do qual o micro-organismo modificado foi derivado é da linhagem DD1 de Basfia succinicproducens, conforme depositado como DSM 18541 no DSMZ, Alemanha.
2. MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO ORGÂNICO ou um produto orgânico secundário sendo diferente do composto orgânico, caracterizado por compreender: (I) cultivar o micro-organismo modificado, conforme definido na reivindicação 1, em um meio de cultura que compreende pelo menos uma fonte de carbono assimilável para permitir que o micro-organismo modificado produza o composto orgânico, obtendo assim um caldo de fermentação que compreende o composto orgânico; (II) recuperar o composto orgânico a partir do caldo de fermentação obtido na etapa (I) do processo; e opcionalmente; (III) conversão do composto orgânico contido no caldo de fermentação obtido na etapa (I) do processo ou conversão do composto orgânico recuperado obtido na etapa (II) do processo em um produto orgânico secundário sendo diferente do composto orgânico por pelo menos uma reação química, em que o composto orgânico é o ácido succínico.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela fonte de carbono assimilável ser selecionada a partir do grupo que consiste em sacarose, maltose, D-glicose, glicerol, misturas de glicerol e D-glicose, misturas de glicerol e sacarose, misturas de glicerol e D-xilose, misturas de glicerol e misturas de maltose e D-glicose e frutose.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado pelo produto orgânico secundário ser selecionado a partir do grupo que consiste em ésteres de ácido succínico ou polímeros dos mesmos, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanodiol (BDO), gama-butirolactona (GBL) e pirrolidonas.
5. USO DE UM MICRO-ORGANISMO MODIFICADO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para a produção fermentativa de ácido succínico por um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 4.
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