ES2731335T3 - Microorganismos mejorados para la producción de ácido succínico - Google Patents

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Abstract

Un microorganismo modificado que tiene, en comparación con su tipo silvestre, una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen pykA, en el que la actividad de la enzima codificada por el gen pykA se reduce por modificación genética, en el que la reducción de la actividad la enzima codificada por el gen pykA está en el intervalo de 15 a 99 %, en el que el tipo silvestre del cual se deriva el microorganismo modificado pertenece a la familia de Pasteurellaceae y en el que el tipo silvestre se refiere al microorganismo de origen natural que no ha sido modificado genéticamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismos mejorados para la producción de ácido succínico
La presente invención se refiere a un microorganismo modificado, a un procedimiento de producción de ácido succínico y al uso de microorganismos modificados.
Los compuestos orgánicos, como los pequeños ácidos dicarboxílicos que tienen 6 o menos carbonos, son productos químicos comercialmente importantes con muchos usos. Por ejemplo, los diácidos pequeños incluyen 1,4-diácidos, como el ácido succínico, el ácido málico y el ácido tartárico, y el ácido itacónico de molécula de 5 carbonos. Otros diácidos incluyen el ácido oxálico de dos carbonos, el ácido malónico de tres carbonos, el ácido glutárico de cinco carbonos y el ácido adípico de 6 carbonos y también existen muchos derivados de dichos diácidos.
Como grupo, los diácidos pequeños tienen cierta similitud química y sus usos en la producción de polímeros pueden proporcionar propiedades especializadas a la resina. Esta versatilidad les permite integrarse fácilmente en los mercados de infraestructura química descendente. Por ejemplo, las moléculas de 1,4-diácido cumplen muchos de los usos del anhídrido maleico químico a gran escala, ya que se convierten en una variedad de productos químicos industriales (tetrahidrofurano, butirolactona, 1,4-butanodiol, 2-pirrolidona) y derivados de succinato succindiamida, succinonitrilo, diaminobutano y ésteres de succinato. El ácido tartárico tiene varios usos en las industrias de alimentos, cuero, metal e impresión. El ácido itacónico forma el material de partida para la producción de 3-metilpirrolidona, metil-BDO, metil-THF y otros.
En particular, el ácido succínico o succinato, estos términos se usan indistintamente en este documento, ha despertado un gran interés porque se ha utilizado como un precursor de muchos productos químicos de importancia industrial en las industrias alimentaria, química y farmacéutica. De hecho, un informe del Departamento de Energía de EE. UU. Informa que el ácido succínico es uno de los 12 principales componentes químicos fabricados a partir de biomasa. Por lo tanto, la capacidad de producir diácidos en bacterias sería de importancia comercial significativa. El documento WO-A-2009/024294 divulga una cepa bacteriana productora de ácido succínico, que es un miembro de la familia de Pasteurellaceae, originalmente aislada del rumen, y capaz de utilizar glicerol como fuente de carbono y variantes y cepas mutantes derivadas de la retención de dicha capacidad, en particular, una cepa bacteriana designada DD1 como depositada en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania) que tiene el número de depósito DSM 18541 (ID 06-614) y que tiene la capacidad de producir ácido succínico. La cepa DD1 pertenece a la especie Basfia succiniciproducens y a la familia de Pasteurellaceae, clasificada por Kuhnert et al., 2010. Mutaciones de estas cepas, en las que el gen IdhA y/o el pfID o pflA se han alterado, se describen en el documento WO-A2010/092155, estas cepas mutantes se caracterizan por un aumento significativo de la producción de ácido succínico a partir de fuentes de carbono como el glicerol o mezclas de glicerol y carbohidratos como la maltosa, en condiciones anaeróbicas en comparación con el DD1 de tipo silvestre descrito en el documento WO-A-2009/024294.
Sin embargo, cuando se usan cepas bacterianas como las divulgadas en los documentos WO-A-2009/024294 o WO-A2010/092155 para la producción o compuestos orgánicos como el ácido succínico, la selectividad con la que las fuentes de carbono se convierten en los compuestos orgánicos deseados y también el rendimiento del compuesto orgánico deseado es todavía mejorable.
Además, se ha observado que cuando se usan las cepas bacterianas de la técnica anterior para la producción de compuestos orgánicos como el ácido succínico en condiciones anaeróbicas, la tasa de crecimiento de los microorganismos también se puede mejorar para hacer que los microorganismos sean más adecuados para la producción de compuestos orgánicos como el ácido succínico a escala industrial.
Por lo tanto, era un objeto de la presente invención superar las desventajas de la técnica anterior.
En particular, un objeto de la presente invención es proporcionar microorganismos que pueden usarse para la producción fermentativa de compuestos orgánicos tales como ácido succínico y que no solo producen los productos orgánicos deseados, tales como ácido succínico, a partir de fuentes de carbono asimilables tales como glicerol, glucosa, sacarosa, xilosa, lactosa, fructosa o maltosa en grandes cantidades, preferiblemente con solo cantidades bajas de productos secundarios, pero que también se caracterizan por un rápido crecimiento en condiciones anaeróbicas.
Una contribución para lograr los objetivos mencionados anteriormente es proporcionada por un microorganismo modificado que tiene, en comparación con su tipo silvestre, una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen pykA, en el que la actividad de la enzima codificada por el gen pykA se reduce por codificación genética, en el que la reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen pykA está en el intervalo de 15 a 99 %, en el que el tipo silvestre del cual el microorganismo modificado que se ha derivado pertenece a la familia de las Pasteurellaceae y en el que el tipo silvestre se refiere al microorganismo de origen natural que no se ha modificado genéticamente. También se describe un microorganismo modificado en el que se han introducido mutaciones en el gen pykA de tipo silvestre, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado pertenece a la familia de las Pasteurellaceae.
Sorprendentemente, se ha descubierto que una reducción de la actividad de la enzima que está codificada por el gen pykA (esta enzima PykA es una piruvato quinasa que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato (EC 2.7.1.40)), preferiblemente Al introducir al menos una mutación en el gen pykA de tipo silvestre, se obtiene una cepa Pasteurellaceae recombinante que, en comparación con el microorganismo correspondiente en el que la actividad de esta enzima no ha disminuido, se caracteriza por un aumento del rendimiento de compuestos orgánicos. como el ácido succínico y también por un crecimiento más rápido en condiciones anaeróbicas.
En contexto con la expresión “un microorganismo modificado que tiene, en comparación con su tipo silvestre, una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen x”, en el que el gen x es el gen pykA y opcionalmente, como se describe más adelante , el gen IdhA, el gen pflA y/o el gen pfID, el término “tipo silvestre” se refiere a un microorganismo en el que la actividad de la enzima que está codificada por el gen x no ha disminuido, es decir a un microorganismo cuyo genoma está presente en un estado como antes de la introducción de una modificación genética del gen x (en particular del gen pykA y opcionalmente el gen IdhA, el gen pflA y/o el gen pfID). Preferiblemente, la expresión “tipo silvestre” se refiere a un microorganismo cuyo genoma, en particular cuyo gen x, está presente en un estado tal como se genera naturalmente como resultado de la evolución. El término se puede usar para todo el microorganismo, pero preferiblemente para genes individuales, por ejemplo, el gen pykA, el gen IdhA, el gen pflA y/o el gen pfID. El término “microorganismo modificado” incluye, por lo tanto, un microorganismo que ha sido alterado, modificado o diseñado genéticamente (por ejemplo, modificado genéticamente) de manera que muestre un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo, cuando la modificación genética afecta la codificación de las secuencias de ácidas nucleico del microorganismo) en comparación con el microorganismo de origen natural de tipo de origen natural del cual se derivó. De acuerdo con una realización particular preferente del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, el microorganismo modificado es un microorganismo recombinante, lo que significa que el microorganismo se ha obtenido usando ADN recombinante. La expresión “ADN recombinante”, como se usa en este documento, se refiere a secuencias de ADN que resultan del uso de procedimientos de laboratorio (clonación molecular) para reunir material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otra manera no se encontrarían en organismos biológicos. Un ejemplo de dicho ADN recombinante es un plásmido en el que se ha insertado una secuencia de ADN heteróloga.
El tipo silvestre del que se derivan los microorganismos de acuerdo con la presente invención pertenece a la familia de las Pasteurellaceae. Pasteurellaceae comprende una gran familia de Proteobacterias Gramnegativas con miembros que van desde bacterias como Haemophilus influenzae hasta comensales de la mucosa animal y humana. La mayoría de los miembros viven como comensales en las superficies mucosas de aves y mamíferos, especialmente en el tracto respiratorio superior. Pasteurellaceae son típicamente en forma de vara, y son un grupo notable de anaerobios facultativos. Se pueden distinguir de las enterobacterias relacionadas por la presencia de oxidasa, y de la mayoría de otras bacterias similares por la ausencia de flagelos. Las bacterias de la familia Pasteurellaceae se han clasificado en varios géneros según las propiedades metabólicas y sus secuencias del ARN 16S y el ARN 23S. Muchas de las Pasteurellaceae contienen genes de piruvato-formiato-liasa y son capaces de fermentar anaeróbicamente las fuentes de carbono a ácidos orgánicos.
De acuerdo con una realización particular preferente del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado pertenece al género Basfia y se prefiere particularmente que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado. Pertenece a la especie Basfia succiniciproducens.
Más preferiblemente, el tipo silvestre del cual se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención es la cepa DD1 de Basfia succiniciproducens depositada en virtud del Tratado de Budapest con DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen, GmbH), Alemania, con el número de depósito DSM 18541. Esta cepa se aisló originalmente del rumen de una vaca de origen alemán. La bacteria Pasteurella se puede aislar del tracto gastrointestinal de los animales y, preferiblemente, de los mamíferos. La cepa bacteriana DD1, en particular, se puede aislar del rumen bovino y es capaz de utilizar glicerol (incluido el glicerol crudo) como fuente de carbono. Otras cepas del género Basfia que se pueden usar para preparar el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención son la cepa Basfia que se ha depositado bajo el número de depósito DSM 22022 con DSZM o las cepas Basdia que se han depositado con la Colección de cultivos de la Universidad de Goterborg (CCUG), Suecia, con los números de depósito CCUG 57335, CCUG 57762, CCUG 57763, CCUG 57764, CCUG 57765 o CCUG 57766. Dichas cepas se aislaron originalmente del rumen de las vacas de origen alemán o suizo. En este contexto, se prefiere particularmente que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención tenga un ADNr 16S de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia, que muestre una secuencia homológica de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,9 % con la SEQ ID NO: 1. También se prefiere que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención tenga un 23S ADNr de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,9 % con la SEQ ID NO: 2.
La identidad en valores porcentuales a los que se hace referencia en relación con los diversos polipéptidos o polinucleótidos que se van a usar para el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se calcula, preferiblemente, como identidad de los residuos en la longitud completa de las secuencias alineadas, tales como como, por ejemplo, la identidad calculada (para secuencias bastante similares) con la ayuda de la aguja del programa del paquete de software de bioinformática EMBOSS (Versión 5.0.0, http://emboss.source-forge.net/what/) con el parámetros predeterminados que son, es decir, espacio abierto (penalización por abrir un espacio): 10,0, espacio extendido (penalización por ampliar un espacio): 0,5, y archivo de datos (archivo de matriz de puntuación incluido en el paquete): EDNAFUL.
Debe observarse que el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención puede derivarse no solo de los microorganismos de tipo silvestre mencionados anteriormente, especialmente de la cepa DD1 de Basfia succiniciproducens, sino también de variantes de estas cepas. En este contexto, la expresión “una variante de una cepa” comprende cada cepa que tiene las mismas o esencialmente las mismas características que la cepa de tipo silvestre. En este contexto, se prefiere particularmente que el 16S ADNr de la variante tenga una identidad de al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 99 %, más preferiblemente al menos el 99,5 %, más preferiblemente al menos el 99,6 %, más preferiblemente al menos 99,7 %, más preferiblemente al menos 99,8 % y lo más preferiblemente al menos 99,9 % con el tipo silvestre del que se ha derivado la variante. También es particularmente preferido que el 23 S ADNr de la variante tenga una identidad de al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 99 %, más preferiblemente al menos el 99,5 %, más preferiblemente al menos el 99,6 %, más preferiblemente al menos 99,7 %, más preferiblemente al menos 99,8 % y lo más preferiblemente al menos 99,9 % con el tipo silvestre del que se ha derivado la variante. Una variante de una cepa en el sentido de esta definición se puede obtener, por ejemplo, tratando la cepa de tipo silvestre con un agente químico mutagenizante, rayos X o luz UV.
El microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque, en comparación con su tipo silvestre, se reduce la actividad de la enzima que está codificada por el gen pykA.
La reducción de la actividad de la enzima (Aact¡v¡dad) se define preferiblemente de la siguiente manera:
Figure imgf000004_0001
/ - ai ctividad de microorganismos modificados',
^a-c tiv id i i l= I - A ctivid ad d el tip o silve stre x 100 W
en el que, al determinar la Aactividad, la actividad en el tipo silvestre y la actividad en el microorganismo modificado se determinan exactamente en las mismas condiciones. Los procedimientos para la detección y determinación de la actividad de la enzima que está codificada por el gen pykA se pueden encontrar, por ejemplo, en Bergmeyer, H.U., Gawehn, K. y Grassi, M. (1974): “Methods of Enzymatic Analysis”, Segunda Edición, Volumen I, páginas 509-511, Academic Press, Inc., Nueva York, NY.
La actividad reducida de las enzimas divulgadas en este documento, en particular la actividad reducida de la enzima codificada por el gen pykA, la lactato deshidrogenasa y/o el piruvato formiato liasa, puede ser una reducción de la actividad enzimática en un 0,1 a un 99 %, en comparación a la actividad de dicha enzima en el tipo silvestre del microorganismo, o una reducción de la actividad enzimática en al menos 15 %, o al menos 25 %, o al menos 35 %, o al menos 45 %, o al menos 55 %, o al menos 65 %, o al menos 75 % o al menos 85 %, o al menos 86 %, o al menos 87 %, o al menos 88 %, o al menos 89 %, o al menos 90 %, o al menos el 91 %, o al menos el 92 %, o al menos el 93 %, o al menos el 94 %, o al menos el 95 %, o al menos el 96 %, o al menos el 97 %, o al menos el 98 %, o al menos 99 %. La reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen pykA está en el intervalo de 15 a 99 %, más preferiblemente en el intervalo de 50 a 95 % e incluso más preferiblemente en el intervalo de 90 a 99 %. El término “actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen pykA" o, como se describe a continuación, “una actividad reducida de lactato deshidrogenasa” o “una actividad reducida de piruvato formiato liasa” también abarca un microorganismo modificado que no tiene actividad detectable de estas enzimas.
El término “actividad reducida de una enzima” incluye, por ejemplo, la expresión de la enzima por dicho microorganismo modificado genéticamente (por ejemplo, modificado genéticamente) a un nivel inferior al expresado por el tipo silvestre de dicho microorganismo. Las manipulaciones genéticas para reducir la expresión de una enzima pueden incluir, entre otras, eliminar el gen o sus partes que codifican la enzima, alterar o modificar secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión del gen que codifica la enzima (por ejemplo, eliminando promotores fuertes o promotores reprimibles), proteínas modificadoras (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores transcripcionales y similares) implicados en la transcripción del gen que codifica la enzima y/o la traducción del producto génico, o cualquier otro medio convencional para disminuir la expresión de una rutina génica particular en la técnica (incluido, entre otros, el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido u otros procedimientos para eliminar o bloquear la expresión de la proteína diana). Más adelante, se pueden introducir elementos desestabilizantes en el ARNm o introducir modificaciones genéticas que conduzcan al deterioro de los sitios de unión ribosomal (RBS) del ARN. También es posible cambiar el uso del codón del gen de manera que se reduce la eficiencia y la velocidad de la traducción.
También se puede obtener una actividad reducida de una enzima introduciendo una o más mutaciones genéticas que conducen a una actividad reducida de la enzima. Además, una reducción de la actividad de una enzima también puede incluir una inactivación (o la expresión reducida) de las enzimas activadoras que son necesarias para activar la enzima cuya actividad debe reducirse. Mediante este último enfoque, la enzima cuya actividad se va a reducir se mantiene preferiblemente en un estado inactivado.
Los microorganismos que tienen una actividad reducida de la enzima codificada por el gen pykA pueden ocurrir naturalmente, es decir, debido a mutaciones espontáneas. Un microorganismo puede modificarse para que carezca o reduzca significativamente la actividad de la enzima que está codificada por el gen pykA mediante diversas técnicas, como el tratamiento químico o la radiación. Con este fin, los microorganismos se tratarán, por ejemplo, mediante un agente químico mutagenizador, rayos X o luz UV. En una etapa posterior, se seleccionarán aquellos microorganismos que tienen una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen pykA. Los microorganismos modificados también pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación homóloga que pretenden mutar, alterar o extirpar el gen pykA en el genoma del microorganismo o sustituir el gen con un gen correspondiente que codifica una enzima que, en comparación con la enzima codificad por el gen tipo silvestre, tiene actividad reducida.
De acuerdo con una realización preferente del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, la actividad de la enzima codificada por el gen pykA se reduce introduciendo al menos una mutación en el gen pykA, preferiblemente en el gen pykA de tipo silvestre. En este contexto, se prefiere particularmente que la al menos una mutación conduzca a una modificación de la secuencia de ácido nucleico del gen pykA, de modo que la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por el gen modificado difiera de la secuencia de aminoácidos de enzima codificada por el gen pykA de tipo silvestre en al menos un aminoácido.
Se puede introducir una mutación en el gen pykA, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, seguida de una introducción del gen modificado en el genoma del microorganismo por recombinación. Se pueden generar variantes del gen pykA mutando la secuencia de genes SEQ ID NO: 3 mediante PCR. El “Kit de mutagénesis dirigida al sitio de Quickchange” (Stratagene) se puede utilizar para llevar a cabo una mutagénesis dirigida. Se puede realizar una mutagénesis aleatoria sobre toda la secuencia de codificación, o también una parte de la misma, de la SEQ ID NO: 3 con la ayuda del “Kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II” (Stratagene). La tasa de mutagénesis se establece en la cantidad deseada de mutaciones a través de la cantidad de ADN de plantilla utilizada. Se generan múltiples mutaciones por la combinación de mutaciones individuales o por el desempeño secuencial de varios ciclos de mutagénesis.
A continuación, se describe una técnica adecuada para la recombinación, en particular para introducir el gen pykA modificado en el microorganismo.
Esta técnica también a veces se denomina “recombinación de Campbell” en este documento (Leen-houts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 55, páginas 394-400). “Campbell in”, como se usa en el presente documento, se refiere a un transformante de una célula huésped original en la que una molécula de ADN de doble cadena circular completa (por ejemplo, un plásmido) se ha integrado en un cromosoma por un solo evento de recombinación homóloga (un cruce en el evento) , y eso resulta efectivamente en la inserción de una versión linealizada de dicha molécula de ADN circular en una primera secuencia de ADN del cromosoma que es homóloga a una primera secuencia de ADN de dicha molécula de ADN circular. “Campbelled in” se refiere a la secuencia de ADN linealizada que se ha integrado en el cromosoma de un transformante “Campbell in”. Un “Campbell in” contiene una duplicación de la primera secuencia de ADN homóloga, cada copia del cual incluye y rodea una copia del punto de cruce de recombinación homóloga.
“Campbelled out”, como se usa en este documento, se refiere a una célula que desciende de un transformante “Campbelled in”, en la que se produjo un segundo evento de recombinación homóloga (un evento de tachado) entre una segunda secuencia de ADN que está contenida en el ADN insertado linealizado del ADN “Campbelled in”, y una segunda secuencia de ADN de origen cromosómico, que es homóloga a la segunda secuencia de ADN de dicho inserto linealizado, el segundo evento de recombinación que resulta en la eliminación (descarga rápida) de una parte de la secuencia de ADN integrada, pero, lo que es más importante, también resulta en una porción (que puede ser tan pequeña como una sola base) del Campbelled integrado en el ADN que permanece en el cromosoma de tal manera que en comparación con la célula huésped original, la célula “Campbell out” contiene uno o más cambios intencionales en el cromosoma (por ejemplo, una sola base de sustitución, múltiples sustituciones de bases, inserción de un gen heterólogo o secuencia de ADN, inserción de una copia adicional o copias de un gen homólogo o un gen homólogo modificado, o inserción de una secuencia de ADN que comprende más de uno de los ejemplos mencionados anteriormente). Una célula “Campbelled out” se obtiene, preferiblemente, mediante una contra selección contra un gen que está contenido en una parte (la parte que se desea descargar rápidamente) de la secuencia de ADN “Campbelled in”, por ejemplo, Bacillus subtilis sacB-gen, que es letal cuando se expresa en una célula que crece en presencia de aproximadamente 5 % a 10 % de sacarosa. Con o sin una contra-selección, se puede obtener o identificar una célula “Campbelled out” deseada o identificada por selección de la célula deseada, utilizando cualquier fenotipo seleccionable, tal como la morfología de la colonia, el color de la colonia, la presencia o ausencia de resistencia a los antibióticos, presencia o ausencia de una secuencia de ADN dada por la reacción en cadena de la polimerasa, presencia o ausencia de una auxotrofia, presencia o ausencia de una enzima, hibridación de ácidos nucleicos de colonias, detección de anticuerpos, etc. También se puede utilizar el término “Campbelled in” y “Campbelled out” como verbos en varios tiempos para referirse al procedimiento o proceso descrito anteriormente.
Se entiende que los eventos de recombinación homóloga que conducen a una “Campbell in” o “Campbell out” pueden ocurrir en un intervalo de bases de ADN dentro de la secuencia de ADN homóloga, y dado que las secuencias homólogas serán idénticas entre sí por al menos parte de este intervalo, generalmente no es posible especificar exactamente dónde ocurrió el evento de cruce. En otras palabras, no es posible especificar con precisión qué secuencia fue originalmente del ADN insertado y cuál fue originalmente del ADN cromosómico. Además, la primera secuencia de ADN homóloga y la segunda secuencia de ADN homóloga suelen estar separadas por una región de no homología parcial, y es esta región de no homología que permanece depositada en un cromosoma de la célula “Campbell out”.
Preferiblemente, la primera y la segunda secuencia de ADN homóloga tienen al menos aproximadamente 200 pares de bases de longitud, y pueden tener hasta varios miles de pares de bases de longitud. Sin embargo, se puede hacer que el procedimiento funcione con secuencias más cortas o más largas. Por ejemplo, la longitud de la primera y la segunda secuencia homóloga puede variar de aproximadamente 500 a 2000 bases, y la obtención de una “Campbell out” de una “Campbell in” se facilita al organizar la primera y la segunda secuencia homóloga para que sean aproximadamente de la misma longitud, preferiblemente con una diferencia de menos de 200 pares de bases y más preferiblemente, siendo el más corto de los dos al menos el 70 % de la longitud del más largo en pares de bases.
El gen pykA cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, comprende preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
a) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3;
b) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
c) ácidos nucleicos que son al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, más preferiblemente 100 % idéntico al ácido nucleico de a) o b), la identidad es la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de a) o b);
d) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,6 %, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, lo más preferiblemente el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b), la identidad es la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a) o b);
e) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a) o b); y
f) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a) o b), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a) o b) anteriores debido a la degeneración del código genético.
El término “hibridación” como se usa en este documento incluye “cualquier proceso por el cual una hebra de molécula de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través del acoplamiento de bases” (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York). La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre las moléculas de ácido nucleico) se ven afectadas por factores tales como el grado de complementariedad entre las moléculas de ácido nucleico, el rigor de las condiciones involucradas, la Tf del híbrido formado, y la relación G:C dentro de las moléculas de ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, el término 'Tf” se usa en referencia a la “temperatura de fusión”. La temperatura de fusión es la temperatura a la cual una población de moléculas de ácido nucleico de doble cadena se convierte en medio disociada en cadenas simples. La ecuación para calcular la Tf de las moléculas de ácido nucleico es bien conocida en la técnica. Como lo indican las referencias estándar, una estimación simple del valor de Tf se puede calcular mediante la ecuación: Tf = 81,5 0,41 ( % G+C), cuando una molécula de ácido nucleico está en solución acuosa a NaCl 1 M (ver, por ejemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados, que toman en cuenta las características estructurales y de secuencia para el cálculo de Tf. Condiciones rigurosas, son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
En particular, el término “condiciones de rigurosidad” se refiere a las condiciones, en las que 100 nucleótidos contiguos o más, 150 nucleótidos contiguos o más, 200 nucleótidos contiguos o más o 250 nucleótidos contiguos o más que son un fragmento o idéntico a la molécula de ácido nucleico complementaria (ADN, ARN, ADNcs o ARNcs) se hibrida en condiciones equivalentes a la hibridación en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7 %, NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 2 x SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C o 65 °C, preferiblemente a 65 °C, con una molécula de ácido nucleico específica (ADN; ARN, ADNcs o ARNcs). Preferiblemente, las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en dodecil sulfato de sodio al 7 % (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 1 x SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C o 65 °C, preferiblemente 65 °C, más preferiblemente, las condiciones de hibridación son equivalentes a la hibridación en dodecil sulfato de sodio al 7 % (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C o 65 °C, preferiblemente a 65 °C. Preferiblemente, los nucleótidos complementarios se hibridan con un fragmento o con los ácidos nucleicos pykA completos. Alternativamente, las condiciones de hibridación preferidas abarcan la hibridación a 65 °C en 1 x SSC o a 42 °C en 1 x SSC y 50 % de formamida, seguido de lavado a 65 °C en 0,3 x SSC o hibridación a 50 °C en 4 * SSC o a 40 °C en 6 * SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 °C en 2 * SSC. Otras condiciones de hibridación preferidas son 0,1 % SDS, 0,1 SSD y 65 °C. Preferiblemente, los nucleótidos complementarios se hibridan con un fragmento o la totalidad de los ácidos nucleicos pykA. Alternativamente, las condiciones de hibridación preferidas abarcan la hibridación a 65 °C en 1 x SSC o a 42 °C en 1 x SSC y 50 % de formamida, seguido de lavado a 65 °C en 0,3 x SSC o hibridación a 50 °C. en 4 * SSC o a 40 °C en 6 * Ss C y 50 % de formamida, seguido de lavado a 50 °C en 2 * SSC. Otras condiciones de hibridación preferidas son 0,1 % SDS, 0,1 SSD y 65 °C.
El gen pykA en el que por último se introduce una mutación mediante la combinación mencionada anteriormente de mutagénesis dirigida al lado y “recombinación de Campbell” comprende preferiblemente un ácido nucleico como se definió anteriormente.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 corresponde al gen pykA de la cepa DD1 de Basfia succiniciproducens.
De acuerdo con una realización preferente del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, el microorganismo modificado no tiene, en comparación con su tipo silvestre, un nivel incrementado de la actividad de la fosfoenol piruvato carboxicinasa (EC 4.1.1.49), que está codificada por el gen pcK. En este contexto, se prefiere particularmente que en el microorganismo modificado el nivel de actividad de la fosfoenol piruvato carboxiquinasa no se incremente como resultado de la sustitución de secuencias reguladoras nativas del gen pck con secuencias reguladoras alteradas que aumentan la actividad de la fosfoenol piruvato carboxicinasa.
De acuerdo con una realización preferente adicional del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, este microorganismo no solo se caracteriza por una actividad reducida de la enzima codificada por el gen pykA, sino también, en comparación con su tipo silvestre, por
i) a actividad reducida de formiato piruvato liasa,
ii) una actividad reducida de lactato deshidrogenasa, o
iii) una actividad reducida de formiato piruvato liasa y una actividad reducida de lactato deshidrogenasa. Los microorganismos modificados que son deficientes en lactato deshidrogenasa y/o que son deficientes en la actividad de formiato piruvato liasa se divulgan en los documentos WO-A-2010/092155, US 2010/0159543 y WO-A-2005/052135, que divulgan diferentes procedimientos para reducir la actividad de lactato deshidrogenasa y/o liasa de formiato piruvato en un microorganismo, preferiblemente en una célula bacteriana del género Pasteurella, particularmente preferidos en la cepa DD1 de Basfia succiniciproducens, se incorporan aquí como referencia. Los procedimientos para determinar la actividad de la formiato piruvato liasa se describen, por ejemplo, por Asanuma N. e Hino T. en “Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis”, Appl. Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, páginas 3773-3777 y los procedimientos para determinar la actividad de la lactato deshidrogenasa están, por ejemplo, divulgados por Bergmeyer, H.U., Bergmeyer J. y Grassl, M. (1983­ 1986) en “Methods of Enzymatic Analysis”, 3a edición, volumen III, páginas 126-133, Verlag Chemie, Weinheim En este contexto, se prefiere que la reducción de la actividad de la lactato deshidrogenasa se logre mediante una inactivación del gen IdhA (que codifica la lactato deshidrogenasa LdhA; EC 1.1.1.27 o EC 1.1.1.28) y la reducción de la formiato piruvato liasa se logra mediante una inactivación del gen pflA (que codifica para un activador de la formiato piruvato liasa PflA; EC 1.97.1.4) o el gen pfID (que codifica el formiato piruvato liasa PfID; EC 2.3.1.54), en el que la inactivación de estos genes (es decir, IdhA, pflA y pfID) se logra preferiblemente mediante la eliminación de estos genes o partes de los mismos, mediante la eliminación de un elemento regulador de estos genes o al menos una parte de los mismos o mediante una introducción de al menos una mutación en estos genes, en el que estas modificaciones se realizan preferiblemente por medio de la “recombinación de Campbell” como se describió anteriormente.
El gen IdhA cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, comprende preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
a 1) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27;
a 2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28;
a 3) ácidos nucleicos que son al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, más preferiblemente 100 % idéntico al ácido nucleico de a 1) o a 2), la identidad es la identidad sobre el total longitud de los ácidos nucleicos de a 1) o a 2);
a 4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,6 %, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, más preferiblemente el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a 1) o a 2), la identidad es la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de a 1) o a 2)
a 5) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con a 1 ) o a 2); y
a 6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a 1) o a 2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a 1) o a 2) anteriores debido a la degeneración del código genético.
El gen pflA cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención comprende preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
p1) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 29;
p2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30;
p3) ácidos nucleicos que son al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, lo más preferiblemente 100 % idéntico al ácido nucleico de p1) o p2), la identidad es la identidad sobre la longitud total de los ácidos nucleicos de p1) o p2);
p4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,6 %, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, lo más preferiblemente el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de p1) o p2), la identidad es la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de p1) o p2);
p5) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con p1) o p2); y
p6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de p1) o p2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de p1) o p2) anteriores debido a la degeneración del código genético.
El gen pfID cuya actividad se reduce en el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención, comprende preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
y1) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 31;
y2) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32;
y3) ácidos nucleicos que son al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,6 %, al menos 99,7 %, al menos 99,8 % o al menos 99,9 %, más preferiblemente 100 % idéntico al ácido nucleico de y1) o y2), la identidad es la identidad sobre el total longitud de los ácidos nucleicos de y1) o y2);
y4) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, al menos el 99,6 %, al menos el 99,7 %, al menos el 99,8 % o al menos el 99,9 %, más preferiblemente el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de y1) o y2), la identidad es la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de y1) o y2);
y5) ácidos nucleicos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia complementaria de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con y1) o y2); y
y6) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de y1) o y2), pero que difieren de los ácidos nucleicos de y1) o y2) anteriores debido a la degeneración del código genético.
En este contexto, se prefiere que el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención comprende, además:
A) una eliminación del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA; B) una eliminación del gen pfID o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID;
C) una eliminación del gen pfIA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfIA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfIA;
D) una eliminación del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA y
una eliminación de el gen pfID o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID;
o
E) una eliminación del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA y
una eliminación de el gen pfIA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfIA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfIA.
Realizaciones particulares preferentes de los microorganismos modificados de acuerdo con la presente invención son:
- células bacterianas modificadas del género Basfia y particularmente preferidas de la especie Basfia succiniciproducens, en la que se ha introducido al menos una mutación en el gen pykA, preferiblemente al menos una mutación, los resultados en la sustitución de al menos un aminoácido en la enzima codificado por el gen pykA, la más preferida es una mutación que resulta al menos en una sustitución de glicina por cisteína en una posición 167, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 o una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución glicina por cisteína, una posición 167 y una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417, o una sustitución de glicina por cisteína, una posición 167 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución glicina por cisteína en la posición 167, una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171 en la enzima codificada por el gen pykA, y en el que se prefiere adicionalmente que la célula bacteriana modificada no tenga, en comparación con el tipo silvestre, una actividad incrementada de la enzima que está codificada por el gen pck;
- células bacterianas modificadas del género Basfia y particularmente preferidas de la especie Basfia succiniciproducens, en la que se ha introducido al menos una mutación en el gen pykA, preferiblemente al menos una mutación, los resultados en la sustitución de al menos un aminoácido en la enzima codificada por el gen pykA, la más preferida es una mutación que produce al menos una glicina de sustitución por cisteína en una posición 167, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 o una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una glicina de sustitución por cisteína una posición 167 y una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417, o una sustitución de glicina por cisteína una posición 167 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución glicina por cisteína en la posición 167, una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171 en la enzima codificada por el gen pykA, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad de la lactato deshidrogenasa se reduce, preferiblemente por una modificación del gen IdhA, en particular por una modificación del gen IdhA, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 27 y que codifica para LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, y en la que se prefiere más que la célula bacteriana modificada no tenga, en comparación con la de tipo silvestre , un aumento de la actividad de la enzima que está codificada por el gen pck;
- células bacterianas modificadas del género Basfia y particularmente preferidas de la especie Basfia succiniciproducens, en la que se ha introducido al menos una mutación en el gen pykA, preferiblemente al menos una mutación, los resultados en la sustitución de al menos un aminoácido en la enzima codificada por el gen pykA, la más preferida es una mutación que produce al menos una glicina de sustitución por cisteína en una posición 167, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 o una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una glicina de sustitución por cisteína una posición 167 y una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417, o una sustitución de glicina por cisteína una posición 167 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución glicina por cisteína en la posición 167, una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171 en la enzima codificada por el gen pykA, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad de la lactato deshidrogenasa se reduce, preferiblemente por una modificación del gen pflA, o el gen pflD, en particular mediante una modificación del gen pflA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 29 y que codifica para PflA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 30, o por una modificación del gen pflD que tiene una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 31 y que codifica para PflD que la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 32, y en el que se prefiere además que la célula bacteriana modificada no tenga, en comparación con el tipo silvestre, una actividad incrementada de la enzima que está codificada por el gen pck; o
- células bacterianas modificadas del género Basfia y particularmente preferidas de la especie Basfia succiniciproducens, en la que se ha introducido al menos una mutación en el gen pykA, preferiblemente al menos una mutación, los resultados en la sustitución de al menos un aminoácido en la enzima codificada por el gen pykA, la más preferida es una mutación que produce al menos una glicina de sustitución por cisteína en una posición 167, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 o una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una glicina de sustitución por cisteína una posición 167 y una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417, o una sustitución de glicina por cisteína una posición 167 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171, o una sustitución glicina por cisteína en la posición 167, una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 417 y una sustitución de alanina por glicina en la posición 171 en la enzima codificada por el gen pykA, y en la cual, en comparación con el tipo silvestre, la actividad de la lactato deshidrogenasa y la liasa de formiato piruvato se reducen, preferiblemente por una modificación del gen IdhA y el gen pflA, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 27 y la codificación de LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 28 o por una modificación del gen pfIA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 29 y la codificación de PfIA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 30, o una modificación del gen IdhA y el gen pfID, en particular por una modificación del gen IdhA que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID. NO: 27 y la codificación para LdhA que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 28 o mediante una modificación del gen pfID que tiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 31 y la codificación de PfID que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con según la SEQ ID NO: 32, y en el que se prefiere además que la célula bacteriana modificada no tenga, en comparación con el tipo silvestre, una actividad incrementada de la enzima que está codificada por el gen pck.
Además, se proporciona una contribución para resolver los problemas mencionados al principio por un procedimiento de producción de ácido succínico que comprende:
I) cultivar el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado produzca el ácido succínico, obteniendo así un caldo de fermentación que comprende el ácido succínico; II) recuperar el ácido succínico del caldo de fermentación obtenido del proceso en la etapa I)
en la etapa de proceso I) el microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se cultiva en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado produzca ácido succínico, obteniendo así un caldo de fermentación que comprende ácido succínico. El término “ácido succínico”, tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, debe entenderse en su sentido más amplio y también abarca sus sales (es decir, succinato), como por ejemplo sales de metales alcalinos, como sales de Na+ y K+, o sales alcalinotérreas, como Mg2+ y Ca2+, o sales de amonio o anhídridos del ácido succínico. El microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención se incuba preferiblemente en el medio de cultivo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10 a 60 °C o 20 a 50 °C o 30 a 45 °C a un pH de 5,0 a 9,0, o 5,5 a 8,0 o 6,0 a 7,0.
Preferiblemente, el ácido succínico, se produce bajo condiciones anaeróbicas. Las condiciones anaeróbicas pueden establecerse por medio de técnicas convencionales, como por ejemplo desgasificando los constituyentes del medio de reacción y manteniendo las condiciones anaeróbicas introduciendo dióxido de carbono o nitrógeno o mezclas de los mismos y opcionalmente hidrógeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o 0,2 a 0,5 vvm. Las condiciones aeróbicas se pueden establecer por medio de técnicas convencionales, como por ejemplo introduciendo aire u oxígeno a un caudal de, por ejemplo, 0,1 a 1 o 0,2 a 0,5 vvm. Si es apropiado, se puede aplicar una ligera sobre presión de 0,1 a 1,5 bar en el proceso.
La fuente de carbono asimilable se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en sacarosa, maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa, maltoheptaosa, D-fructosa, D-glucosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-galactosa, D-manosa, glicerol, mezclas de los mismos y composiciones que contienen al menos uno de dichos compuestos, o se selecciona de productos de descomposición de almidón, celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa. Preferiblemente, la fuente de carbono asimilable se selecciona del grupo que consiste en D-glucosa, maltosa, sacarosa, glicerol y una mezcla de al menos dos de estos compuestos, en el que mezclas de glicerol y D-glucosa, glicerol y sacarosa, glicerol y se prefieren particularmente D-xilosa, glicerol y maltosa y D-glucosa y fructosa.
La concentración inicial de la fuente de carbono asimilable se ajusta preferiblemente a un valor en un intervalo de 5 a 100 g/l, preferiblemente de 5 a 75 g/l y más preferiblemente de 5 a 50 g/l, y puede mantenerse en dicho intervalo durante el cultivo. El pH del medio de reacción puede controlarse mediante la adición de bases adecuadas como, por ejemplo, amoníaco gaseoso, NH4HCO3, (NH^CO a, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3 , KHCO3 , Mg(OH)2, MgCOa , Mg(HCO3)2, Ca(OH)2, CaCO3 , Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2 , C2H7N y/o mezclas de los mismos. Estos agentes de neutralización alcalina son especialmente necesarios si los compuestos orgánicos que se forman en el curso del proceso de fermentación son ácidos carboxílicos o ácidos dicarboxílicos. En el caso del ácido succínico como compuesto orgánico, Mg(OH)2 y MgCO3 son bases preferidas particulares.
La etapa de fermentación I) de acuerdo con la presente invención se puede realizar, por ejemplo, en fermentadores agitados, columnas de burbujas y reactores de bucle. Una descripción general de los posibles tipos de procedimientos, incluidos los tipos de agitadores y diseños geométricos, se puede encontrar en Chmiel: “Bioprozesstechnik: Einführung in die Bioverfahrenstechnik”, Volumen 1. En el proceso de acuerdo con la presente invención, las variantes típicas disponibles son las siguientes variantes conocidas por aquellos expertos en la técnica o explicados, por ejemplo, en Chmiel, Hammes y Bailey: “Biochemical Engineering”: tal como lote, alimentación discontinua, alimentación repetida discontinua o también fermentación continua con y sin reciclaje de la biomasa. Dependiendo de la cepa de producción, salpicar con aire, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, se pueden efectuar mezclas de nitrógeno o gases apropiados para lograr un buen rendimiento (YP/S).
Las condiciones particularmente preferidas para producir ácido succínico en la etapa de proceso I) son:
Fuente de carbono asimilable: glicerol, sacarosa, D-glucosa, maltosa, glicerol D-glucosa, glicerol sacarosa, glicerol maltosa, glicerol D-xilosa, D-glucosa fructosa
Temperatura: 30 a 45 °C
pH: 5.5 a 7.0
Gas suministrado: CO2
Además, se prefiere en la etapa de proceso I) que la fuente de carbono asimilable se convierte a ácido succínico, con un rendimiento de carbono YP/S de al menos 0,5 g/g hasta aproximadamente 1,28 g/g; como por ejemplo un rendimiento de carbono YP/S de al menos 0,6 g/g, de al menos 0,7 g/g, de al menos 0,75 g/g, de al menos 0,8 g/g, de al menos 0,85 g/g, de al menos 0,9 g/g, de al menos 0,95 g/g, de al menos 1,0 g/g, de al menos 1,05 g/g, de al menos 1,1 g/g, de al menos 1,15 g/g, de al menos 1,20 g/g, de al menos 1,22 g/g, o de al menos 1,24 g/g (ácido succínico/carbono).
Además, se prefiere en la etapa de proceso I) que la fuente de carbono asimilable se convierta en ácido succínico, con un rendimiento de productividad específico de al menos 0,6 gg de ácido succínico DCW' 1h' 1, o al menos de 0,65 gg DCW- 1 h- 1 , de al menos 0,7 gg DCW- 1 h- 1 , de al menos 0,75 gg DCW- 1 h-1 o de al menos 0,77 gg de ácido succínico DCW- 1 h- 1.
Además, se prefiere en la etapa de proceso I) que la fuente de carbono asimilable se convierta en ácido succínico, con un rendimiento de tiempo espacial para ácido succínico, de al menos 2,2 g/(L x h) o de al menos 2,5 g/(L x h), al menos 2,75 g/(L x h), al menos 3 g/(L x h), al menos 3,25 g/(L x h), al menos 3,5 g/(L x h), al menos 3,7 g/(L x h), al menos 4,0 g/(L x h) al menos 4,5 g/(L x h) o al menos 5,0 g/(L x h)) de ácido succínico. De acuerdo con otra realización preferente del proceso de acuerdo con la presente invención en la etapa del proceso I), el microorganismo modificado está convirtiendo al menos 20 g/L, más preferiblemente al menos 25 g/l e incluso más preferiblemente al menos 30 g/l de la fuente de carbono asimilable hasta al menos 20 g/l, más preferiblemente hasta 25 g/l, e incluso más preferiblemente al menos 30 g/l de ácido succínico.
Los diferentes parámetros de rendimiento que se describen en este documento (“rendimiento de carbono” o “YP/S”; “rendimiento de productividad específico”; o “rendimiento de espacio-tiempo (STY)”) son bien conocidos en la técnica y se determinan como se describe, por ejemplo, por Song y Lee, 2006. “Rendimiento de carbono” e “YP/S” (cada uno expresado en masa de ácido succínico producido/masa de fuente de carbono asimilable consumida) se utilizan aquí como sinónimos. El rendimiento de productividad específico describe la cantidad de ácido succínico que se produce por hora y el caldo de fermentación L por g de biomasa seca. La cantidad de peso de células secas declarada como “DCW” describe la cantidad de microorganismo biológicamente activo en una reacción bioquímica. El valor se da como g producto por g DCW por h (es decir, g g DCW-1h-1). El espacio-tiempo-rendimiento (STY) se define como la relación entre la cantidad total de ácido succínico formado en el proceso de fermentación y el volumen del cultivo, considerado durante todo el tiempo de cultivo. El rendimiento espacio-temporal también se conoce como la “productividad volumétrica”.
En la etapa del proceso II), el ácido succínico, se recupera del caldo de fermentación obtenido en la etapa del proceso I).
Generalmente, el proceso de recuperación comprende la etapa de separar los microorganismos recombinantes del caldo de fermentación como la llamada “biomasa”. Los procedimientos para eliminar la biomasa son conocidos por los expertos en la técnica y comprenden filtración, sedimentación, flotación o combinaciones de los mismos. En consecuencia, la biomasa se puede eliminar, por ejemplo, con centrifugadoras, separadores, decantadores, filtros o en un aparato de flotación. Para la máxima recuperación del producto de valor, el lavado de la biomasa suele ser recomendable, por ejemplo, en forma de diafiltración. La selección del procedimiento depende del contenido de biomasa en el caldo de fermentación y de las propiedades de la biomasa, y también de la interacción de la biomasa con el ácido succínico (por ejemplo, el producto de valor). En una realización, El caldo de fermentación puede ser esterilizado o pasteurizado. En una realización adicional, el caldo de fermentación se concentra. Dependiendo del requisito, esta concentración se puede hacer por lotes o de manera continua. El intervalo de presión y temperatura debe seleccionarse de modo que, en primer lugar, no se produzcan daños al producto y, en segundo lugar, se requiera un uso mínimo del aparato y la energía. La selección hábil de los niveles de presión y temperatura para una evaporación multietapa en particular permite el ahorro de energía.
El proceso de recuperación puede comprender además etapas de purificación adicionales en las que el ácido succínico, preferiblemente ácido succínico, se purifica adicionalmente. Sin embargo, si el ácido succínico se convierte en un producto orgánico secundario mediante reacciones químicas como se describe a continuación, una purificación adicional del ácido succínico es, dependiendo del tipo de reacción y las condiciones de reacción, no necesariamente requerida. Para la purificación de procedimientos de ácido succínico conocidos por los expertos en la técnica, como por ejemplo cristalización, filtración, electrodiálisis y cromatografía. Por ejemplo, el ácido succínico se puede aislar precipitándolo como un producto de succinato de calcio usando hidróxido de calcio, óxido, carbonato o carbonato de hidrógeno para la neutralización y filtración del precipitado. El ácido succínico se recupera del succinato de calcio precipitado mediante acidificación con ácido sulfúrico, seguido de filtración para eliminar el sulfato de calcio (yeso) que precipita. La solución resultante puede purificarse adicionalmente por medio de cromatografía de intercambio iónico con el fin de eliminar los iones residuales no deseados. Alternativamente, si se han usado hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio o mezclas de los mismos para neutralizar el caldo de fermentación, el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del proceso puede acidificarse para transformar el succinato de magnesio contenido en el medio en la forma ácida (es decir, ácido succínico), que posteriormente puede cristalizarse enfriando el medio acidificado. Ejemplos de otros procesos de purificación adecuados se describen en los documentos EP-A-1 005562, WO-A-2008/010373, WO-A-2011/082378, WO-A-2011/043443, WO-A-2005/030973, WO -A 2011/123268 y WO-A 2011/064151 y EP-A-2-360137.
De acuerdo con una realización preferente del proceso de acuerdo con la presente invención, el proceso comprende además la etapa de proceso:
III) conversión del ácido succínico contenido en el caldo de fermentación obtenido en la etapa de proceso I) o conversión del ácido succínico recuperado obtenido en la etapa de proceso II) en un producto orgánico secundario que es diferente del ácido succínico por al menos una reacción química.
Los productos orgánicos secundarios preferidos se seleccionan del grupo que consiste en ésteres de ácido succínico y sus polímeros, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanodiol (BDO), gamma-butirolactona (GBL) y pirrolidonas. De acuerdo con una realización preferente para la producción de THF, BDO y/o GBL, este proceso comprende: b1) la hidrogenación catalítica directa del ácido succínico obtenida en las etapas del proceso I) o II) a THF y/o BDO y/o GBL o
b2) la esterificación química del ácido succínico y/o las sales del ácido succínico obtenidas en las etapas I) o II) del proceso en su correspondiente éster di-alquilo inferior y posterior hidrogenación catalítica de dicho éster a THF y/o BDO y/o GBL.
De acuerdo con una realización preferente para la producción de pirrolidonas, este proceso comprende:
b) la conversión química de sales de amonio de ácido succínico obtenidas en las etapas del proceso I) o II) en pirrolidonas de una manera conocida per se.
Para detalles de la preparación de estos compuestos, se hace referencia a los documentos US-A-2010/0159543 y WO-A-2010/092155.
Además, se proporciona una contribución para resolver los problemas mencionados al principio por el uso del microorganismo modificado de acuerdo con la presente invención para la producción fermentativa de ácido succínico. Además, las condiciones preferidas para la producción fermentativa de ácido succínico son aquellas condiciones que ya se han descrito en relación con la etapa del proceso I) del proceso de acuerdo con la presente invención.
La invención se explica ahora con más detalle con la ayuda de figuras y ejemplos no limitativos.
La Figura 1 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB (SEQ ID NO: 5).
La Figura 2 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB AldhA (SEQ ID NO: 6).
La Figura 3 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB ApflA (SEQ ID NO: 7).
La Figura 4 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB ApfID (SEQ ID NO: 8).
La Figura 5 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB pykAI (SEQ ID NO: 9).
La Figura 6 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB pykA2 (SEQ ID NO: 10).
La Figura 7 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB pykA3 (SEQ ID NO: 11).
La Figura 8 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB pykA4 (SEQ ID NO: 12).
La Figura 9 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB pykA5 (SEQ ID NO: 13).
La Figura 10 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB pykA6 (SEQ ID NO: 14).
La Figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las piruvato quinasas (pykA tipo silvestre: secuencia de aminoácidos de la piruvato quinasa de la cepa de tipo silvestre Basfia succiniciproducens DD1; pykA2: secuencia de aminoácidos de la piruvato quinasa PykA2 de la cepa AldhA ApflA pykA2 DD1; pykA4: secuencia de aminoácidos de la piruvato quinasa PykA4 de la cepa AldhA ApflD pykA4 DD1; PykA5: secuencia de aminoácidos de la piruvato quinasa PykA6 de la cepa pykA6 AldhA ApflD pykA6 DD1).
Ejemplos
Ejemplo 1: Procedimiento general para la transformación de basfia succiniciproducens
Tabla 1: N m n l r DD1 i ilv r m n m n i n n l mplos
Figure imgf000013_0001
Basfia succiniciproducens DD1 (de tipo silvestre) se transformó con el ADN por electroporación usando el siguiente protocolo:
Para la preparación de un cultivo previo, se inoculó DD1 de un lote congelado en 40 ml de BHI (infusión de cerebro y corazón; Becton, Dickinson and Company) en un matraz de agitación de 100 ml. La incubación se realizó durante la noche a 37 °C; 200 rpm. Para preparar el cultivo principal, se colocaron 100 ml de BHI en un matraz de agitación de 250 ml y se inocularon a una OD final (600 nm) de 0,2 con el precultivo. La incubación se realizó a 37 °C, 200 rpm. Las células se recogieron a una DO de aproximadamente 0,5, 0,6 y 0,7, el sedimento se lavó una vez con glicerol frío al 10 % a 4 °C y se resuspendió en 2 ml de glicerol al 10 % (4 °C).
Se mezclaron 100 |jl de células competentes con 2-8 |jg de Plásmido-ADN y se mantuvieron en hielo durante 2 minutos en una cubeta de electroporación con un ancho de 0,2 cm. Electroporación bajo las siguientes condiciones: 400Q; 25 |iF; 2.5 kV (Gene Pulser, Bio-Rad). Se añadió 1 ml de BHI enfriado inmediatamente después de la electroporación y se realizó la incubación durante aproximadamente 2 horas a 37 °C.
Las células se colocaron en placas con BHI con 5 mg/l de cloranfenicol y se incubaron durante 2-5 días a 37 °C hasta que las colonias Los transformantes eran visibles. Los clones se aislaron y se reiniciaron en BHI con 5 mg/l de cloranfenicol hasta que se obtuvo la pureza de los clones.
Ejemplo 2: Generación de construcciones de eliminación/mutación
1. Generación de construcciones de eliminación
Los plásmidos de eliminación se construyeron en base al vector pSacB (SEQ ID NO: 5). Figura. 1 muestra un mapa esquemático del plásmido pSacB. Las regiones flanqueantes 5' y 3' (aproximadamente 1500 pb cada una) del fragmento cromosómico, que deberían eliminarse, se amplificaron mediante PCR a partir del ADN cromosómico de Basfia succiniciproducens y se introdujeron en dicho vector utilizando técnicas estándar. Normalmente, al menos el 80 % de los ORF fueron objeto de una eliminación. De tal manera, los plásmidos de eliminación para la lactato deshidrogenasa idha, pSacB_delta_/dhA (SEQ ID NO: 6), el piruvato formato liasa enzima activadora de PFIA, pSacB_delta- PFIA (s Eq ID NO: 7) y la piruvato formato liasa PFID, pSacB_delta_pfID (SEQ ID NO: 8) fueron construidos. Las figuras 2, 3 y 4 muestran mapas esquemáticos del plásmido pSacB_delta_/dhA, pSacB_delta_pfIA y pSacB_delta_pfID, respectivamente.
En la secuencia plasmídica de pSacB (SEQ ID NO: 5), el gen sacB está contenido en las bases 2380-3801. El promotor sacB está contenido en las bases 3802-4264. El gen del cloranfenicol está contenido en la base 526-984. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido desde la base 1477-2337 (ver la Figura 1).
En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_/dhA (SEQ ID NO: 6) la región flanqueante 5' del gen /dhA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1519-2850, mientras que la región flanqueante 3' de la /dhA El gen, que es homólogo al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenido de las bases 62-1518. El gene sacB está contenido de las bases 5169-6590. El promotor sacB está contenido en las bases 6591-7053. El gen del cloranfenicol está contenido en la base 3315-3773. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido desde la base 4266-5126 (ver Figura 2).
En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_pf/A (SEQ ID NO: 7) la región flanqueante 5' del gen pf/A, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1506-3005, mientras que la región flanqueante 3' del gen pf/A, que es homólogo al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenido en las bases 6-1505. El gen sacB está contenido en las bases 5278-6699. El promotor sacB está contenido desde las bases 6700-7162. El gen del cloranfenicol está contenido en la base 3424-3882. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido desde la base 4375-5235 (ver Figura 3).
En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_pf/D (SEQ ID NO: 8) la región flanqueante 5' del gen pf/D, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 1533-2955, mientras que la región flanqueante 3' del gen pf/D, que es homólogo al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenido en las bases 62-1532. El gen sacB está contenido en las bases 5256-6677. El promotor sacB está contenido en las bases 6678­ 7140. El gen del cloranfenicol está contenido en la base 3402-3860. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido desde la base 4353-5213 (ver Figura 4).
2. Generación de construcciones utilizadas para la introducción de mutaciones puntuales en el gen pykA
En la secuencia plasmídica de pSacB_pykA1 (SEQ ID NO: 9), la parte del gen pykA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-1185. El gen sacB está contenido en las bases 3458-4879. El promotor sacB está contenido desde las bases 4880-5342. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 1604-2062. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 2555-3415 (ver Figura 5). El plásmido pSacB_pykA2 se generó por mutagénesis dirigida al sitio a partir del plásmido pSac_pykA1. La mutación de G a T introducida en el gen pykA finalmente dará como resultado el intercambio de G (glicina) a C (cisteína) en la posición 167 en la proteína PykA (ver Figura 6). La secuencia de nucleótidos del gen pykA en pSacB_pykA2 se muestra en la SEQ ID NO: 15, la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por este gen en la SEQ ID NO: 16.
En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_pykA2 (SEQ ID NO: 10) la parte del gen pykA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-1185. El gen sacB está contenido en las bases 3458-4879. El promotor sacB está contenido desde las bases 4880-5342. El gen del cloranfenicol está contenido en la base 1604-2062. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido desde la base 2555-3415 (ver Figura 7).
En la secuencia plasmídica de pSacB_pykA3 (SEQ ID NO: 11) la parte del gen pykA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-909. El gen sacB está contenido en las bases 3729­ 5150. El promotor sacB está contenido en las bases 5151-5613. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 1875-2333. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 2826-3686 (ver Figura 8). El plásmido pSacB_pykA4 se generó por mutagénesis dirigida desde el plásmido pSac_pykA3. La mutación de G a A introducida en el gen pykA finalmente dará como resultado el intercambio de C (cisteína) a Y (tirosina) en la posición 417 en la proteína PykA (ver Figura 8). La secuencia de nucleótidos del gen pykA en pSacB_pykA4 se muestra en la SEQ ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por este gen en la SEQ ID NO: 18. Además, se generó un sitio de restricción DraI por mutación silenciosa. Este sitio de restricción ayudará a identificar los transformantes correctos. En la secuencia plasmídica de pSacB_delta_pykA4 (SEQ ID NO: 19), la parte del gen pykA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-909. El gen sacB está contenido en las bases 3729-5150. El promotor sacB está contenido en las bases 5151-5613. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 1875-2333. El origen de replicación para E. coli (ori EC) está contenido en las bases 2826-3686 (ver Figura 9).
El plásmido pSacB_pykA5 se generó por mutagénesis dirigida desde el plásmido pSac_pykA1. La mutación de C a G introducida en el gen pykA finalmente dará como resultado el intercambio de A (alanina) a G (glicina) en la posición 171 en la proteína PykA (ver Figura 9). La secuencia de nucleótidos del gen pykA en pSacB_pykA5 se muestra en la SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por este gen en la SEQ ID NO: 20. Además, se generó un sitio de restricción HpaI por mutación silenciosa. Este sitio de restricción ayudará a identificar los transformantes correctos. En la secuencia plasmídica de pSacB_pykA5 (SEQ ID NO: 13), la parte del gen pykA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-1185. El gen sacB está contenido en las bases 3458-4879. El promotor sacB está contenido desde las bases 4880-5342. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 1604-2062. El origen de replicación de E. coli (ori EC) está contenido en las bases 2555-3415.
El plásmido pSacB_pykA6 se generó por mutagénesis dirigida desde el plásmido pSac_pykA1. La mutación de G a T introducida en el gen pykA finalmente dará como resultado el intercambio de G (glicina) a C (cisteína) en la posición 167 en la proteína PykA (ver Figura 10). La secuencia de nucleótidos del gen pykA en pSacB_pykA6 se muestra en la SEQ ID NO: 21, la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por este gen en la SEQ ID NO: 22. Además, se generó un sitio de restricción HpaI por mutación silenciosa. Este sitio de restricción ayudará a identificar los transformantes correctos. En la secuencia plasmídica de pSacB_pykA6 (SEQ ID NO: 14) la parte del gen pykA, que es homóloga al genoma de Basfia succiniciproducens, está contenida en las bases 6-1185. El gen sacB está contenido en las bases 3458-4879. El promotor sacB está contenido desde las bases 4880-5342. El gen del cloranfenicol está contenido en las bases 1604-2062. El origen de replicación de E. coli (ori EC) está contenido en las bases 2555-3415.
Ejemplo 3: Generación de cepas productoras de succinato mejoradas
1. Generación de mutantes de eliminación
a) Basfia succiniciproducens DD1 se transformó como se describió anteriormente con pSacB_delta_/dhA y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación y la integración en el genoma de Basfia succiniciproducens se confirmaron por PCR, produciendo bandas para el evento de integración del plásmido en el genoma de Basfia succiniciproducens.
La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” utilizando placas de agar que contenían sacarosa como un medio de selección contraria, seleccionando la pérdida (de función) del gen sacB. Por lo tanto, las cepas de “Campbell in” se incubaron en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI sin antibióticos) a 37 °C, 220 rpm durante la noche. El cultivo durante la noche se extendió luego sobre placas de sacarosa que contenían BHI recién preparadas (10 %, sin antibióticos) y se incubó durante la noche a 37 °C (“primera transferencia de sacarosa”). Una única colonia obtenida de la primera transferencia se sembró nuevamente en placas de sacarosa recién preparadas que contenían BHI (10 %) y se incubó durante la noche a 37 °C (“segunda transferencia de sacarosa”). Este procedimiento se repitió hasta una finalización mínima de cinco transferencias (“tercera, cuarta, quinta transferencia de sacarosa”) en sacarosa. El término “primera a quinta transferencia de sacarosa” se refiere a la transferencia de una cepa después de la integración cromosómica de un vector que contiene un gen sacB-levan-sacarosa sobre la sacarosa y un medio de crecimiento que contiene placas de agar con el fin de seleccionar cepas con la pérdida de gen sacB y las secuencias de plásmidos circundantes. Una sola colonia de las quintas placas de transferencia se inoculó en 25-35 ml de medio no selectivo (BHI que no contiene antibióticos) y se incubó a 37 °C, 220 rpm durante la noche. El cultivo durante la noche se diluyó en serie y se colocó en placas de BHI para obtener colonias individuales aisladas.
Las cepas “Campbelled out” que contenían la situación de tipo silvestre del /dhA-locus o la mutación/eliminación del gen /dhA se confirmaron mediante la sensibilidad al cloranfenicol. Los mutantes de mutación/eliminación entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto llevó al mutante de eliminación IdhA Basfia succiniciproducens AldhA DD1.
b) Basfia succiniciproducens AldhA DD1 se transformó con pSacB_delta_pfIA como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación e integración fue confirmada por PCR. La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” como se describió anteriormente. Los mutantes de eliminación entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo a la mutación de supresión doble IdfA pflD-Basfia succiniciproducens AldhA ApflA DD1.
c) Basfia succiniciproducens AldhA se transformó con pSacB_delta_pfID como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La transformación e integración fue confirmada por PCR. La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” como se describió anteriormente. Los mutantes de eliminación entre estas cepas se identificaron y confirmaron mediante análisis de PCR. Esto condujo a la mutación de supresión doble IdfA pfID Basfia succiniciproducens AldhA ApflD DD1.
2. Generación de mutaciones en el gen pykA.
a) Basfia succiniciproducens AldhA ApflA DD1 se transformó con pSacB_pykA2 como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” como se describió anteriormente. La región codificadora de pykA se amplificó mediante PCR y se secuenció para identificar los clones de “Campbell out” que llevan una mutación dentro del gen pykA. Esto llevó al mutante Basfia succiniciproducens AldhA ApflA pykA2 DD1.
b) Basfia succiniciproducens AldhA ApflD DD1 se transformó con pSacB_pykA4 como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” como se describió anteriormente. Para identificar los clones de “Campbell out” que llevan una mutación dentro del gen pykA, se amplificó una parte del locus pykA mediante PCR con los cebadores pykA4_fw (SEQ ID NO: 23) y pykA4_ry (SEQ ID NO: 24). En la pre-selección, el fragmento de ADN resultante se digirió con la enzima de restricción Dral. Los fragmentos que mostraban el sitio de restricción Dral adicional se secuenciaron para confirmar la mutación puntual esperada cerca del sitio de restricción Dral introducido dentro del gen pykA. Esto llevó al mutante Basfia succiniciproducens AldhA ApflD pykA4 DD1. c) Basfia succiniciproducens AldhA ApflD se transformó con pSacB_pykA5 como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” como se describió anteriormente. Para identificar los clones de “Campbell out” que llevan una mutación dentro del gen pykA, se amplificó una parte del locus pykA mediante PCR con los cebadores pykA5/6_fw (SEQ ID NO: 25) y pykA5/6_rv (SEQ ID NO: 26). En la pre-selección, el fragmento de ADN resultante se digirió con la enzima de restricción Hpal. Los fragmentos que mostraron el sitio de restricción Hpal adicional se secuenciaron para confirmar la mutación puntual esperada cerca del sitio de restricción Hpal introducido dentro del gen pykA. Esto condujo al mutante Basfia succiniciproducens AldhA ApflD pykA5 DD1.
d) Basfia succiniciproducens AldhA ApflD se transformó con pSacB_pykA6 como se describió anteriormente y “Campbelled in” para producir una cepa “Campbell in”. La cepa “Campbell in” fue luego “Campbelled out” como se describió anteriormente. Para identificar los clones de “Campbell out” que llevan una mutación dentro del gen pykA, se amplificó una parte del locus pykA mediante PCR con los cebadores pykA5/6_fw (SEQ ID NO: 25) y pykA5/6 ry (SEQ iD NO : 26). En la pre-selección, el fragmento de ADN resultante se digirió con la enzima de restricción Hpal. Los fragmentos que mostraron el sitio de restricción Hpal adicional se secuenciaron para confirmar la mutación puntual esperada cerca del sitio de restricción Hpal introducido dentro del gen pykA. Esto condujo al mutante Basfia succiniciproducens AldhA ApflD pykA6 DD1.
Ejemplo 4: Actividad de piruvato quinasa
Las cepas de Basfia se cultivaron anaeróbicamente en botellas de suero en el medio como sigue (Medio BHl (Becton Dickinsion, que contiene las siguientes adiciones MOPS: 9,4 g/L , Mg (OH)2: 0,625 g/L , BlS-TRlS: 5,8 g/L, NaHCOa: 1,8 g/L durante 18 horas a 37 °C. Las células se recogieron por centrifugación y se congelaron. Las bolitas de células se resuspendieron en HEPES-Na 60 mM, KCL 60 mM, MgCh 8,5 mM pH 7,5. Se lisaron las células usando Ribolyser (Máquina de ThermoHybaid) y tubos de matriz azul. Los extractos se centrifugaron durante 10 minutos a 14000 rpm en una centrífuga eppedorf a 4 °C y se mantuvieron en hielo hasta que se realizó el ensayo. Se usaron los sobrenadantes para analizar la actividad de la piruvato quinasa utilizando el siguiente ensayo: se determinó la actividad enzimática de Pyka de acuerdo con los procedimientos de análisis enzimático, 2a edición en inglés, Vol. 1, Bergmeyer, HU, ed, Academic Press (Nueva York, NY: 1974), pp 509-511. Las concentraciones de proteína en extractos celulares se determinaron mediante el ensayo de proteína azul de Biorad utilizando lgG como el estándar de proteína para la calibración. Las actividades enzimáticas se expresan como actividades específicas (U/mg de proteína y mín.) y relativamente como porcentaje de la actividad de la cepa AldhA ApflD DD1 que lleva un alelo pykA no mutado. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Resultados de la prueba de actividad PykA-enzima
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Ejemplo 5: Cultivo de Diversas cepas DD1 en glucosa, sacarosa y maltosa/glicerol
La productividad de la cepa AldhA ApflA DD1 se comparó con la productividad de la cepa mutante AldhA ApflA pykA2 DD1 en presencia de glucosa, sacarosa, o maltosa y glicerol como fuente de carbono (tablas 6, 7 y 8). La productividad se analizó utilizando los medios y las condiciones de incubación que se describen a continuación.
1. Preparación del medio
La composición y preparación del medio de cultivo es como se describe en las siguientes tablas 3, 4 y 5.
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0003
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2. Cultivos y análisis
Para cultivar las bacterias del cultivo principal de una placa de agar BHI recién cultivada (incubada durante la noche a 37 °C en condiciones anaeróbicas) se usó para inocular a OD600 = 0,75 una botella de 100 ml de suero con tapón de caucho de butilo hermético que contiene 50 ml del medio líquido descrito en las tablas 3, 4 y 5 con una atmósfera de CO2 con sobrepresión de 0,8 bar. Las botellas se incubaron a 37 °C y 160 rpm (diámetro de agitación: 2,5 cm). El consumo de las fuentes C y la producción de ácidos carboxílicos se cuantificó mediante HPLC (los procedimientos de HPLC se describen en las tablas 9 y 10) después de 24 h. El crecimiento celular se midió midiendo la absorbancia a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro (Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Suecia).
3. Resultados
Los resultados de los experimentos de cultivo con para diferentes cepas DD1 se muestran en las Tablas 6 a 8.
T l : liv l Al hA A flA- DD1 l Al hA A flA A kA2 DD1 n l l
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continuación
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Tabla 7: Cultivo de la cepa AldhA ApflA DD1 y la cepa AldhA, ApflA ApykA2 DD1 en sacarosa
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Una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen pykA conduce a un crecimiento más rápido de las células en sacarosa. Esto se hace evidente cuando se comparan los valores para el consumo de sacarosa en la tabla 7: dentro de las 16 h, la cepa AldhA ApflA DD1 consumió 18,55 g/L de sacarosa; durante el mismo tiempo (también 16 h), la cepa AldhA ApflA ApykA2 DD1 ya consumió 50,90 g/L de sacarosa.
Figure imgf000019_0003
continuación
Figure imgf000020_0003
Tabla 9: Procedimiento de HPLC (ZX-THF50) para análisis de glucosa, maltosa, glicerol, ácido succínico, ácido
Figure imgf000020_0001
T l 1: Pr imi n HPL F - H r nlii l r
Figure imgf000020_0002
continuación
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Ejemplo 6: Cultivo de AldhA ApfID pykA4 DD1 en presencia de glucosa, o sacarosa, o glicerol y glucosa
La productividad de la cepa AldhA ApflD DD1 se ha comparado con la productividad de la cepa mutante AldhA ApfID pykA4 DD1 en presencia de glucosa, o sacarosa, o glucosa y glicerol como fuente de carbono.
La productividad se analizó utilizando los medios y las condiciones de incubación que se describen a continuación.
1. Preparación del medio
La composición y preparación del medio de cultivo CGM es como se describe en la siguiente tabla 11.
Tabla 11: La com osición del medio de cultivo CGM.
Figure imgf000021_0002
La composición de la LSM_3_glucose medio de cultivo, LSM_3_sucrose medio, y LSM_3_glycerol_glucose medio es como se describe en la siguiente tabla 14, 15 y 16.
Tabla 12: Com osición de solución de elementos traza 5
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continuación
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T l 1: m ii n l l i n vi min .
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T l 14: m iin l m i L M l .
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continuación
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T l 1: m ii n l m i L M r
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T l 1 : m ii n l m i L M li rl l .
Figure imgf000023_0002
continuación
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2. Cultivos y análisis
Para cultivar las bacterias de pre-cultivo de una placa de agar BHI recién cultivada (incubada durante la noche a 37 °C en condiciones anaeróbicas) se usó para inocular una botella de 100 ml de suero con tapón de caucho de butilo hermético que contiene 50 ml del medio líquido CGM descrito en la tabla 11 con una atmósfera de CO2. Las botellas se incubaron a 37 °C y 170 rpm (diámetro de agitación: 2,5 cm). Para cultivar el cultivo principal, se utilizaron 2,5 ml del cultivo bacteriano en el medio CGM (después de 10 horas de incubación) para inocular un frasco de 100 ml de suero con tapón de caucho de butilo hermético que contiene 50 ml del medio líquido LSM_glucosa (o el medio LSM_3_sucrose, o el medio LSM_3_glicerol_glucose) descrito en la tabla 14 (medio LSM_3_sucrosa: Tabla 15, medio LSM_3_glicerolglucosa: Tabla 16) con una atmósfera de CO2. El consumo de la fuente de C y la producción de ácidos carboxílicos se cuantificó mediante HPLC (los procedimientos de HPLC se describen en las tablas 9 y 10) después de 6 h y 30 h. El crecimiento celular se midió midiendo la absorbancia a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro (Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Suecia).
3. Resultados
Los resultados de los experimentos de cultivo con la cepa AldhA ApfID pykA4 DD1 en glucosa, sacarosa y maltosa/glicerol se muestran en las tablas 17, 18 y 19.
T l 17: liv l Al hA A flD DD1 Al hA A flD kA4 DD1 n l .
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Tabla 18: Cultivo de la ce a AldhA A flD DD1 la ce a AldhA A flD kA4 DD1 en sacarosa.
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Figure imgf000025_0002
Una reducción de la actividad de la enzima codificada por el gen pykA conduce a un crecimiento más rápido de las células en glucosa, sacarosa y también glicerol/mezcla de glucosa. Esto se hace evidente cuando se compara la cepa AldhA ApfID DD1 con la cepa AldhA ApfID pykA4 DD1 que crece en la glucosa (Tabla 17), en la sacarosa (Tabla 18), y en glicerol/glucosa (Tabla 19).
Secuencias
SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de la cepa DD1) tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccga cgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatat cttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctacc aagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagca gtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtg acgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggt aatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgg gcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagag atgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggatt agataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgacc gcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatg caacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctg catggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgg gaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctaca cacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagt ctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccg cccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggg gtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcgg
SEQ ID NO:2 (secuencia de nucleótidos del ADNr 23S de la cepa DD1) agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcaga ggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaaccc agtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgagg aaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaat cggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcggga cacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaagg aaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtga ctgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaact gggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggacc gaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttctccccg aaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcggctagggggccatcccggcttaccaacccgatgc aaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagacacacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagacc gccagctaaggtcccaaagtttatattaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatc atttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagctgcggc atcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggctgctggacgtatcacgagtgcg aatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaagaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcag ggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgtagtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggg gacggagtaggttaggttatcgacctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaaca ccgagagatgatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagattataata aaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtgaaggaactaggcaaaata gcaccgtaacttcgggagaaggtgcgccggcgtagattgtagaggtatacccttgaaggttgaaccggtcgaagtgacccgctggct gcaactgtttattaaaaacacagcactctgcaaacacgaaagtggacgtatagggtgtgatgcctgcccggtgctggaaggttaattg atggcgttatcgcaagagaagcgcctgatcgaagccccagtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattcctt gtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcataatgatggccaggctgtctccacccgagactcagtgaaattgaaatcgccgtgaa gatgcggtgtacccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactatagcttgacactgaaccttgaattttgatgtgtaggatag gtgggaggctttgaagcggtaacgccagttatcgtggagccatccttgaaataccaccctttaacgtttgatgttctaacgaagtgcccg gaacgggtactcggacagtgtctggtgggtagtttgactggggcggtctcctcccaaagagtaacggaggagcacgaaggtttgcta atgacggtcggacatcgtcaggttagtgcaatggtataagcaagcttaactgcgagacggacaagtcgagcaggtgcgaaagcag gtcatagtgatccggtggttctgaatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccgccca agagttcatatcgacggcggtgtttggcacctcgatgtcggctcatcacatcctggggctgaagtaggtcccaagggtatggctgttcgc catttaaagtggtacgcgagctgggtttaaaacgtcgtgagacagtttggtccctatctgccgtgggcgttggagaattgagaggggct gctcctagtacgagaggaccggagtggacgcatcactggtgttccggttgtgtcgccagacgcattgccgggtagctacatgcggaa gagataagtgctgaaagcatctaagcacgaaacttgcctcgagatgagttctcccagtatttaatactgtaagggttgttggagacgac gacgtagataggccgggtgtgtaagcgttgcgagacgttgagctaaccggtactaattgcccgagaggcttagccatacaacgctca agtgtttttggtagtgaaagttattacggaataagtaagtagtcagggaatcggct
SEQ ID NO: 3 (secuencia de nucleótidos del gen pykA de la cepa DD1) atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgc tgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctc ataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaat atcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgc aagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccg aagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctgccgatgcattaaccgaaaaag ataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccg tcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatg gacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcag aaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgac tcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatc cggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacg ttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaa caagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgc gcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaaga cgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgtt gaataa
SEQ ID NO 4: (secuencia de aminoácido de PykA de la cepa DD1)
M S R R L R R T K I V C T M G P A T D K G N N L E K I I A A G A N V V R M N F S H G T P E D H I G R A E K V R E I A H K L G K H V A I L G D L Q G P K I R V S T F K E G K I F L N I G D K F I L D A E M P K G E G N Q E A V G L D Y K T L P Q D V V P G D I L L L D D G R V Q L K V L A T E G A K V F T E V T V G G P L S N N K G I N K L G G G L S A D A L T E K D K A D 11 T A A R I G V D Y L A V S F P R S S A D L N Y A R Q L A K D A G L D A K I V A K V E R A E T V E T D E A M D D I I N A A D V I M V A R G D L G V E I G D P E L V G V Q K K L I R R S R Q L N R V V I T A T Q M M E S M I S N P M P T R A E V M D V A N A V L D G T D A V M L S A E T A A G Q Y P A E T V A A M A K V A L G A E K M P S I N V S K H R M N V Q F E S I E E S VAM S AM YAAN H M R G V A A I I T L T S S G R T A R L M S R I S S G L P I F A L S R N E S T L N L C A L Y R G V T P V H F D K D S R T S E G A T A A V Q L L K D E G F L V S G D L V L L T Q G D A S S S S G T N L C R T L I V E
SEQ ID NO: 5 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB)
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SEQ ID NO: 6 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_delta_ldhA)
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SEQ ID NO: 7 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_delta_pflA) tcgagtcaatgcggatttgacttatgatgtggcaaacaaccgatttccgattattactacacgtaaaagttattggaaagcggcgattgcg gagtttctgggttatatccgcggctacgataatgcggcggatttccgtaaattaggagcaaaaacctgggatgccaacgctaatgaaa atcaggtatggctgaataaccctcatcgcaaaggcaccgacgacatggggcgcgtttacggcgtacagggcagagcctggcgtaa gcctaacggcgaaaccgttgatcaattacgcaaaattgtcaacaatttaagtcgcggcattgatgatcgcggcgaaattctgaccttttt aaacccgggcgaattcgatctcggttgtctgcgcccttgtatgtacaatcacacgttttctttgctgggcgatacgctttatttaaccagttat caacgctcctgtgacgtacctttaggcttgaatttcaatcaaattcaagtatttacattcttagctttaatggcgcagattaccggtaaaaaa gccggtcaggcatatcacaaaatcgtcaatgcgcatatttacgaagaccagctggaactaatgcgcgacgtgcagttaaaacgcga accgttcccgtcgccaaaactggaaattaatccggacattaaaacccttgaagatttagaaacctgggtaaccatggatgatttcaacg tcgttggttaccaatgccacgaaccgataaaatatccgttctcggtataaaccgacaaaagtgcggtcaaaaatttaatattttcatctgtt atagaaaatatttttcaacataaaatctagggatgcctgtttggcgtccgtaaatacgcagaaaaatattaaatttttgaccgcacttttttc 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SEQ ID NO: 8 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_delta_pflD) tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatgggatcgagctcttttccttgccgaca aggcggaagctttaggggaaattcccgtaggtgccgtattggtggatgaacggggcaatatcattggtgaaggctggaacctctctatt gtgaactcggatcccaccgcccatgccgaaattattgcgttgcgtaacgccgcgcagaaaatccaaaattaccgcctgctcaatacc actttatacgtgactttagaaccctgcaccatgtgcgccggcgcgattttacacagccgaatcaaacgcttggtattcggggcgtccgat tacaaaaccggtgcggtgggttccagatttcatttttttgaggattataaaatgaatcatggggttgagatcacaagcggtgtcttatagga tcaatgcagtcagaagttaagccgctttttccaaaagcgcagggaacagaaaaaacaacaaaaagctaccgcacttttacaacacc cccggcttaactcctctgaaaaatagtgacaaaaaaaccgtcataatgtttacgacggtttttttatttcttctaatatgtcacattaagcccg tagcctgcaagcaaccccttaacatgctccattaattcttttgtcggcggttttacatcttcaagctcgtatttatcgccgagtacttcccattta tgggcgcctagacggtgataaggtaataattccactttttcgatattcttcatatctttaatgaaattccccagcatgtgcaaatcttcgtcact atctgtataacccggcactacaacatggcggatccaggtacgctgatttcgatccgctaaatattttgcgaattcgagcactcttttattcg 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SEQ ID NO: 9 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_pykA1)
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SEQ ID NO: 10 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_pykA2)
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SEQ ID NO: 11 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_pykA3) tcgagagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgccc gtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaat ggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttca gaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccga ctcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatat ccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaac gttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacatta acaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatg cgcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaag acgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattg 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SEQ ID NO: 12 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_pykA4)
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SEQ ID NO: 13 (secuencia de nucleótido completa del plásmido pSacB_pykA5)
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actttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggat tgcaactggtctattttcctcttttgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttctt ttcattctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaata atagtgaacggcaggtatatgtgatgggttaaaaaggatcggcggccgctcgatttaaatc
SEQ ID NO: 14 (secuencia de nucleótidos completa del plásmido pSacB_pykA6) tcgagcagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattg ctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgct cataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaa tatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgc aagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccg aagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggctgcggtttatctgccgatgcgttaaccgaaaaaga taaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgt caattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatg gacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcag aaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgac 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catatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccag cagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgctt cttccagccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgccaaagtatac actttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggat tgcaactggtctattttcctcttttgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttctt ttcattctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaata atagtgaacggcaggtatatgtgatgggttaaaaaggatcggcggccgctcgatttaaatc
SEQ ID NO: 15 (secuencia de nucleótidos del gen pykA de la cepa AldhA ApflA pykA2 DD1)
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SEQ ID NO: 16 (secuencia de aminoácidos de PykA2 de la cepa AldhA ApflA pykA2 DD1) MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANWRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKH VAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLD DGRVQLKVLATEGAKVFTEVTVGGPLSNNKGINKLGCGLSADALTEKDKADIITAARIGVDYLAV SFPRSSADLNYARQLAKDAGLDAKIVAKVERAETVETDEAMDDIINAADVIMVARGDLGVEIGDP ELVGVQKKLIRRSRQLNRVVITATQMMESMISNPMPTRAEVMDVANAVLDGTDAVMLSAETAA GQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLT SSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLCALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGF LVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE
SEQ ID NO: 17 (secuencia de nucleótidos del gen pykA de la cepa AldhA ApflD pykA4 DD1) atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgc tgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctc ataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaat atcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgc aagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccg aagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctgccgatgcattaaccgaaaaag ataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccg tcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatg gacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcag aaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgac tcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatc cggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacg ttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaa caagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacTttaaacttatac gcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaaga cgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgtt gaataa
SEQ ID NO: 18 (secuencia de aminoácido de PykA4 de la cepa AldhA ApflD pykA4 DD1)
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SEQ ID NO: 19 (secuencia de nucleótidos del gen pykA de la cepa AldhA ApflD pykA5 DD1) atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgc tgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctc ataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaat atcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgc aagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccg aagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctggcgatgcGttaaccgaaaaag ataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccg tcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatg gacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcag aaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgac tcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatc cggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacg ttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaa caagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgc gcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaaga cgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgtt gaataa
SEQ ID NO: 20 (secuencia de aminoácidos de PykA5 de la cepa AldhA ApflD pykA5 DD1)
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SEQ ID NO: 21 (secuencia de nucleótidos del gen pykA de la cepa AldhA ApflD pykA6 DD1)
atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgc tgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctc ataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaat atcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgc aagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccg aagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggdgcggtttatctgccgatgcGtjaaccgaaaaag ataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccg tcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatg gacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcag aaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgac tcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatc
cggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacg ttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaa caagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgc gcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaaga cgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgtt gaataa
SEQ ID NO: 22 (secuencia de aminoácidos de PykA6 de la cepa AldhA ApflD pykA6 DD1)
MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANWRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKH
VAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLD
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GQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLT
SSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLCALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGF
LVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE SEQ ID NO: 23 (secuencia del cebador pykA4_fw)
aatgcggcggacgtaatcat
SEQ ID NO: 24 (secuencia del cebador pykA4_rv)
tggagaacctatccatgaagtatca
SEQ ID NO: 25 (secuencia del cebador pykA5/6_fw)
tggggcctgcaacagacaaa
SEQ ID NO: 26 (secuencia del cebador pykA5/6_rv)
aaacgagcagtacgaccgct
SEQ ID NO: 27 (secuencia de nucleótidos del gen IdhA de la cepa DD1) ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttgg cgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgta ttttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaat aatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcg atcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggtttt aatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgtt ctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgtta tcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaata ccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggatgtttatg aaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataatgtgctttttac cggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaac gtgcgaaaatagcgttgaaggctaa
SEQ ID NO: 28 (secuencia de aminoácido de LdhA de la cepa DD1) MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFV NDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKWRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLN RRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAE ALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEAL KRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVT LSNIQAVSKNATCENSVEG SEQ ID NO: 29 (secuencia de nucleótidos del gen pflA de la cepa DD1)
atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaa tgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtg acctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactgg ttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgat gacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcg aattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgc acatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaa gtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctac gggcttaatgtgacatattag
SEQ ID NO: 30 (secuencia de aminoácido de pflA de DD1 cepa) MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTWDLHGGKEISVEELMKEWTY RHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDWFRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLV LLDLKEMNERVHESLIGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHVWPGYTDSDEDLHMLGNFIKD MKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY
SEQ ID NO: 31 (secuencia de nucleótidos del gen pflD de la cepa DD1) atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgacttt atccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtga tggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctgg ttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaat gatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaagg cgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatc ggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaa gcgggcgaagacattcaggcaactatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatgg cggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagcggtt aaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatca ctgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattatt ctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgt attacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgt gcgaaagtatctattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcat
gctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaac ggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcg aacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatg aagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatc cgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatcga cttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaa aaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaa accggtaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggt gcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattag gtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaa cacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcag gttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo modificado que tiene, en comparación con su tipo silvestre, una actividad reducida de la enzima que está codificada por el gen pykA, en el que la actividad de la enzima codificada por el gen pykA se reduce por modificación genética, en el que la reducción de la actividad la enzima codificada por el gen pykA está en el intervalo de 15 a 99 %, en el que el tipo silvestre del cual se deriva el microorganismo modificado pertenece a la familia de Pasteurellaceae y en el que el tipo silvestre se refiere al microorganismo de origen natural que no ha sido modificado genéticamente.
2. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado tiene un ADNr 16S de SEQ ID NO: 1 o una secuencia, que muestra una homología de secuencia de al menos el 96 % con la SEQ. ID NO: 1.
3. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado pertenece al género Basfia.
4. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado pertenece a la especie Basfia succiniciproducens.
5. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el tipo silvestre del que se deriva el microorganismo modificado es la cepa DD1 de Basfia succiniciproducens depositada bajo el DSM 18541 con el DSMZ, Alemania.
6. Microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el gen pykA de tipo silvestre comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
a) ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3;
b) ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
c) ácidos nucleicos que son al menos el 70 % idénticos al ácido nucleico de a) o b), siendo la identidad sobre la longitud total del ácido nucleico de a) o b);
d) ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b), siendo la identidad sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de a) o b), y
e) ácidos nucleicos que codifican la misma proteína que cualquiera de los ácidos nucleicos de a) o b), pero que difieren de los ácidos nucleicos de a) o b) anteriores debido a la degeneración del código genético.
7. Microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la actividad de la enzima codificada por el gen pykA se reduce introduciendo al menos una mutación en el gen pykA.
8. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la al menos una mutación conduce a una modificación de la secuencia de ácido nucleico del gen pykA, de manera que la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por el gen modificado difiere de la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por el gen pykA de tipo silvestre en al menos un aminoácido.
9. Microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el microorganismo recombinante tiene, además, en comparación con su tipo silvestre,
i) una actividad reducida de formiato piruvato liasa,
ii) una actividad reducida de lactato deshidrogenasa, o
iii) una actividad reducida de formiato piruvato liasa y una actividad reducida de lactato deshidrogenasa.
10. Microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el microorganismo comprende:
A) una eliminación del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA; B) una eliminación del gen pfID o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID; C) una eliminación del gen pfIA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfIA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfIA; D) una eliminación del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA y
una eliminación de el gen pfID o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfID o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfID; o
E) una eliminación del gen IdhA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen IdhA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen IdhA y
una eliminación del gen pfIA o al menos una parte del mismo, una eliminación de un elemento regulador del gen pfIA o al menos una parte del mismo o una introducción de al menos una mutación en el gen pfIA.
11. Un procedimiento de producción de ácido succínico que comprende:
I) cultivar el microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono asimilable para permitir que el microorganismo modificado produzca ácido succínico, obteniendo así un caldo de fermentación que comprende ácido succínico;
II) recuperar ácido succínico del caldo de fermentación obtenido en la etapa del proceso I).
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la fuente de carbono asimilable se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, maltosa, D-glucosa, glicerol, mezclas de glicerol y D-glucosa, mezclas de glicerol y sacarosa, mezclas de glicerol y D-xilosa, mezclas de glicerol y mezclas de maltosa y D-glucosa y fructosa.
13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 a 12, en el que el proceso comprende además la etapa del proceso:
III) conversión del ácido succínico contenido en el caldo de fermentación obtenido en la etapa I) del proceso o conversión del ácido succínico recuperado obtenido en la etapa II) del proceso en un producto orgánico secundario que es diferente del ácido succínico mediante al menos una reacción química.
14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el producto orgánico secundario se selecciona del grupo que consiste en ésteres de ácido succínico o polímeros de los mismos, tetrahidrofurano (THF), 1,4-butanodiol (BDO), gamma-butirolactona (GBL) y pirrolidonas.
15. Uso de un microorganismo modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la producción fermentativa de ácido succínico.
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