CN106574236A - 遗传修饰的产生(r)‑乳酸的嗜热细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兼性厌氧的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含：a)内源性(S)‑乳酸脱氢酶基因的失活或缺失；b)(R)‑乳酸脱氢酶基因的引入；c)内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因的失活或缺失。

Description

遗传修饰的产生(R)-乳酸的嗜热细菌
本发明涉及修饰用于同型乳酸(homolactic)和对映体纯(enantiopure)(R)-乳酸生产的嗜热细菌细胞、遗传修饰的细胞和生产对映体纯(R)-乳酸的方法。
乳酸及其盐(称为乳酸盐)是可用于各种领域(包括医药、生物可降解聚合物和食品加工)的商业上可行的产品。兼性厌氧的嗜热细菌(例如土芽孢杆菌属(Geobacillus)物种)似乎是乳酸工业制造的理想生物体。它们能够在37-75℃的温度下生长，最佳温度为55-65℃(Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446)，并且允许在高于50℃的温度下的厌氧工业发酵。当工业规模发酵时，该高温具有几个优点：较小的感染风险和因此更高的对映体纯度，更快的反应，更低的冷却成本等。土芽孢杆菌的兼性厌氧性质允许在厌氧条件下或至少在低的氧分压下发酵，其对于工业规模是期望的，因为其允许相对便宜的设备和加工。此外，这些细菌的营养需求比也允许相对便宜的工业过程的乳酸菌(诸如乳杆菌属(Lactobacillus)物种)的营养需求要求更低。
当在厌氧条件下或至少在低氧分压下生长时，已知兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种产生乳酸。实例是热坚土芽孢杆菌(G.caldotenax)，G.caldoxylosilyticus，G.debilis，嗜热土芽孢杆菌(G.kaustophilus)，苍白土芽孢杆菌(G.pallidus)，嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.stearothermophilus)，G.tepidimans，热反硝化土芽孢杆菌(G.thermodenitrificans)，热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidans)，喜热土芽孢杆菌(G.thermoleovorans)，G.toebii，热带土芽孢杆菌(G.tropicalis)。
已知热葡糖苷酶土芽孢杆菌从木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和纤维二糖产生乳酸(Green等人，2003，WO03/008601)。对于工业应用，含有蔗糖、葡萄糖、木糖或阿拉伯糖或其混合物的原料是最相关的。同时利用葡萄糖和木糖的能力(Green等人，2003，WO03/008601)是热葡糖苷酶土芽孢杆菌在使用来源于木质纤维素原料的可发酵糖时的重要优点。
已知的兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种的一个缺点是它们主要产生(S)-乳酸和极少的(R)-乳酸的事实。由于可生物降解的乳酸聚合物的成功应用将取决于廉价的(S)-乳酸和廉价的(R)-乳酸两者的可用性，因此需要两种对映体的成本有效的生产。目前已知的产生(R)-乳酸的细菌是嗜温的(例如左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)))或具有要求高的营养需求(例如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii))，这使得(R)-乳酸的制造比(S)-乳酸的制造贵得多。
已知的兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种的另一个缺点是它们通常具有混合酸发酵的事实，产生乳酸、乙醇、乙酸和甲酸作为主要发酵产物。在本申请中，术语有机酸意在还包括其相应的盐。
显然需要能够使用对于工业应用具有吸引人的特征(例如低营养需要，广泛的糖消耗能力，生产碳水解酶的能力，高生长速率，高生产力，抗渗透胁迫和遗传可及性)的用于同型乳酸和对映体纯乳酸的生产的细菌菌株(例如土芽孢杆菌属菌株)。
本发明的目的之一是产生兼性厌氧的并通过同型乳酸发酵产生(R)-乳酸的嗜热细菌菌株。应当理解，(R)-乳酸的其它术语是D-乳酸或D(-)-乳酸。在本申请中，这些术语可互换使用。类似地，术语(S)-乳酸、L-乳酸和L(+)-乳酸可互换使用。
本发明的另一个目的是产生兼性厌氧的并且生产对映体纯(R)-乳酸的嗜热细菌菌株。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌被描述为嗜热芽孢杆菌属(Bacillus)物种(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495；Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446；Coorevits等人,2012,Int.Syst.Evol.Microbiol.62:14770-1485)。热葡糖苷酶土芽孢杆菌先前已知为热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495)，其由Nazina等人于2001年重命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidasius)(Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446)，并且后来由Coorevits等人重命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidans)(Coorevits等人,2012,Int.Syst.Evol.Microbiol.62:14770-1485)。从土壤中分离该类型的菌株(Suzuki等人,1976,Appl.Environ.Microbiol.31:807-812)。尽管最初报道为严格需氧的，但后来的研究报道兼性厌氧生长和(S)-乳酸生产(Green等人,2003,WO03/008601；Fong等人,2006,Extremophiles 10:363-372)。温度范围为42至69℃，最佳为62℃(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495)。已经报道了用于乙醇生产的热葡糖苷酶土芽孢杆菌菌株的遗传修饰(Green等人,2001,WO 01/49865；Atkinson等人,2008,WO08/038019)。这包括用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542T的遗传工具和破坏L-乳酸脱氢酶(ldh)基因的方法的描述(Atkinson等人,2006,WO2006/117536和2008,WO2008/038019)。已报道了热葡糖苷酶土芽孢杆菌M10EXG的在木糖和葡萄糖上生长的细胞的代谢途径和通量(Tang等人2009,Biotechnol.Lett.102:1377-1386)。
土芽孢杆菌属物种中乳酸脱氢酶(ldhL)的失活已被显示优化乙醇生产(Payton等人,1985,FEMS Microbiol.Lett.26:333-336；Green等人,2001；Atkinson等人,2006,WO2006/117536；Cripps等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)。Cripps等人显示热葡糖苷酶土芽孢杆菌NCIMB 11955的ldhL-衍生体显示出分批发酵中乳酸生产的强烈减少，但不是完全消除，而乙醇、甲酸盐和丙酮酸盐的产生增加。编码丙酮酸甲酸裂解酶的ldhL和pflB的组合突变消除了甲酸盐的产生(Cripps等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)。
异源基因表达似乎在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中是有问题的。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶的功能性酶仅在52℃(该温度为热葡糖苷酶土芽孢杆菌的亚最适温度)生长而非在54℃、56℃或58℃生长时产生(Thompson等人,2008,Biotechnol.Lett.30:1359-1365)。氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)丙酮酸脱羧酶基因的异源表达需要密码子协调以在45℃的热葡糖苷酶土芽孢杆菌中获得活性，但是不能在52℃提供活性(van Zyl等人,2014,Appl.Microbiol.Biotechnol.98:1247-1259)。
Van Kranenburg等人显示中度嗜热的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)可以通过缺失天然L-乳酸脱氢酶基因并将其替换为获自德氏乳杆菌的异源D-乳酸脱氢酶基因而用于在45℃至54℃的温度下的(R)-乳酸生产(van Kranenburg等人,2007,WO2007/085443)。然而，在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中丙酮酸脱羧酶基因的异源表达实验中没有发现在高于52℃的温度下具有活性的异源蛋白质的实例，而该物种的最适温度通常为约60℃。此外，不知道来自德氏乳杆菌(L.delbrueckii)的D-乳酸脱氢酶在60℃是否有活性。
我们现已发现，嗜热细菌细胞可用于通过破坏内源性L-乳酸脱氢酶基因ldhL并引入编码D-乳酸脱氢酶活性的基因来产生(R)-乳酸。我们独立地引入了编码D-乳酸脱氢酶活性的德氏乳杆菌分离物的ldhA基因(SEQ ID NO：35)和hdhD基因(SEQ ID NO：37)。本领域技术人员知道，可以使用在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中功能性表达的编码D-乳酸脱氢酶活性的其它基因。
兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种显示以乳酸、乙醇、乙酸和甲酸作为主要产物的混合酸发酵。编码在副产物生产中的必需酶的基因的破坏是改善所需产物生产的常用方法。然而，特定基因的破坏的影响取决于宿主的总体代谢而可能具有不同的副作用。编码丙酮酸甲酸裂解酶活化酶的大肠杆菌(Escherichia coli)pflA和编码双功能乙醛-CoA/醇脱氢酶复合物的adhE的单一突变导致伴随增加的丙酮酸副产物形成的改善的乳酸生产、残余乙酸和乙醇生产以及强烈降低的生物量产率(pflA-)或以乙酸作为主要发酵产物的改善的乳酸生产(adhE-)(Zhu&Shimizu,2005,Metab.Eng.7:104-115)。在几种大肠杆菌菌株中，focA-pflAB基因座已被破坏以消除甲酸产生(Zhou等人,2003,Appl.Environ.Microbiol.69:2237-2244；Liu等人,2011,Appl.Biochem.Biotechnol.164:162-169)。最近已经显示编码甲酸盐通道蛋白的focA在培养基中的乳酸积累中的重要性(Beyer等人,2013,J.Bacteriol.195:1428-1435)，因此它将促成具有focA-pflAB缺失的大肠杆菌菌株的表型。在绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中，编码丙酮酸甲酸裂解酶和醇脱氢酶的基因的敲除改善了乳酸发酵，但也增加了细胞外丙三醇和乙酸盐浓度(Catalanotti等人,2012,Plant Cell 24:692-707)。
在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中，pflBA基因趋同地定向于adhE基因。由于实际原因，我们决定通过在一个修饰中删除pflBA和部分adhE来破坏pflA、pflB和adhE。令人惊讶的是，我们能够几乎消除乙醇、乙酸和甲酸副产物形成，而不影响其它副产物并且不影响乳酸发酵性能。例如，在本申请中，副产物形成几乎被消除意味着通过发酵如本文所述的基因工程化细胞，副产物(例如乙醇，乙酸和甲酸)的重量相对于乳酸总产量为不超过10％(w/w)，特别是不超过5％，4％，3％或2％(w/w)。乳酸和副产物的量可以通过本领域已知的方法测定，例如，通过气液色谱法(GLC)或高效液相色谱法(HPLC)的衍生化和分析。
在文献中描述了可在乳酸生产中导致手性杂质的几种选择。(R)-乳酸可以通过D-乳酸脱氢酶的活性由丙酮酸盐形成，其可以通过乳酸消旋酶的活性由(S)-乳酸形成，或者其可以通过甲基乙二醛途径形成。(S)-乳酸可以通过L-乳酸脱氢酶的活性由丙酮酸盐形成，其可以通过乳酸消旋酶的活性由(R)-乳酸形成，或者其可以通过甲基乙二醛途径形成。
甲基乙二醛合成酶(E.C.4.2.99.11)在甲基乙二醛旁路的第一步中催化磷酸二羟丙酮转化为甲基乙二醛和正磷酸。接下来，甲基乙二醛可以通过两种不同的途径转化为(S)-或(R)-乳酸。因此，甲基乙二醛旁路可能是对于产生(S)-和(R)-乳酸的手性污染的来源。在革兰氏阴性嗜温细菌大肠杆菌中，编码甲基乙二醛合成酶的mgsA基因的破坏改善了对于产生(S)-和(R)-乳酸的手性纯度(Grabar等人,2006,Biotechnol.Lett.28:1527-1535)。在革兰氏阳性菌中，对甲基乙二醛途径的活性知之甚少。在嗜温的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，mgsA基因在与编码芽孢杆菌硫醇(bacillithiol)生物合成中的前两种酶的基因一起的操纵子中编码(Gaballa等人,2010,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:6482-6486；Helmann,2011,Antioxidants&Redox signaling 15:123-133)。最近，Chandrangsu等人已经证明芽孢杆菌硫醇参与甲基乙二醛解毒(Chandrangsu等人,2014,Mol.Microbiol.91:706-715)。芽孢杆菌硫醇依赖性甲基乙二醛途径利用乙二醛酶I(GlxA)和乙二醛酶II(FlxB)将甲基乙二醛转化为(R)-乳酸(Chandrangsu等人，2014)。此外，甲基乙二醛可以通过YdeA、YraA和YfkM(预测的乙二醛酶III的同源物)的活性转化为(R)-乳酸(Chandrangsu等人,2014,Mol.Microbiol.91:706-715)。没有关于革兰氏阳性菌中通过甲基乙二醛途径产生(S)-乳酸的报道。
基于基因组信息，预期(S)-乳酸生产不是由乳酸消旋酶(针对其没有发现同源物)引起的，也不是由甲基乙二醛途径(其似乎是不完全的，并且未知在革兰氏阳性生物体中产生(S)-乳酸)引起的。令人惊奇的是，通过破坏内源性L-乳酸脱氢酶基因ldhL并引入编码D-乳酸脱氢酶活性的基因而修饰的产生(R)-乳酸的土芽孢杆菌菌株中产生的微量(S)-乳酸可以通过破坏mgsA基因(其预测编码甲基乙二醛合成酶)而进一步降低。
孢子生成缺陷是芽孢杆菌属物种的工业应用的期望性质。根据欧洲议会和理事会2009年5月6日关于遗传修饰的微生物的有节制的使用的指令2009/41/EC，应当根据其存在的对人类健康和环境的风险来对遗传修饰的微生物的有节制的使用进行分类。芽孢杆菌属物种的具有孢子生成缺陷型表型被认为是使在环境中扩散的风险最小化的手段。已知获得孢子生成缺陷型表型的不同方法，包括选择自发的孢子生成缺陷型衍生体(Green等人，2001，WO01/49865)或孢子生成途径的定向破坏，例如通过破坏spo0A(Gonzy-Tréboul等人,1992,J.Mol.Biol.244:967-979；Atkinson等人,2010,WO2010/052499)或sigF(Fleming等人,1995,Appl.Environ.Microbiol.61:3775-3780；Wang等人,2005,J.Appl.Microbiol.98:761-767；Kovács等人,2010,Appl.Environ.Microbiol.76:4085-4088)。
因此，在第一方面，本发明公开了兼性厌氧的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含
a)内源性(S)-乳酸脱氢酶基因的失活或缺失；
b)(R)-乳酸脱氢酶基因的引入；
c)内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因的失活或缺失。
内源性基因是存在于微生物中的基因。不言而喻的是，如本文所述的其中基因被失活或缺失的细菌需要该基因固有地存在于细菌中。在没有相反指示的情况下，在本申请中，对基因的任何提及意指内源性基因。被引入微生物中的基因(例如引入如本文所述的细菌细胞的(R)-乳酸脱氢酶基因)不是内源性基因。
在本说明书中，热葡糖苷酶土芽孢杆菌的(S)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)的核苷酸序列提供于SEQ ID NO：47中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：48中。
侧接ldhL的核苷酸区域可以通过用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的下游引物SEQ IDNO 11和12以及上游引物SEQ ID NO 13和14来鉴定。
编码(R)-乳酸脱氢酶活性的合适基因是编码SEQ ID NO：36或38的氨基酸序列的那些基因，或编码与SEQ ID NO：36或38的氨基酸序列显示至少90％的同一性程度(优选95％、更优选至少98％和更优选至少99％的同一性程度)的氨基酸序列的同源基因。(R)-乳酸活性可以通过在合适的宿主中过表达基因并随后通过使用酶测定在细胞提取物中定量(R)-乳酸酶活性来显示，或者可以通过补充大肠杆菌ldhA-突变体(例如大肠杆菌FMJ144)的能力来显示。这样的同源序列可以包括由于天然或菌株内变异而可能存在于来自不同群体的或在群体内的细胞中的多态性。同源物可以进一步来源于除了指定的DNA或氨基酸序列所来源于的物种之外的物种，或者可以人工设计和合成。由SEQ ID NO：36和38鉴定的蛋白由德氏乳杆菌的ldhA和hdhD基因编码。两种基因都编码D-乳酸脱氢酶活性。
在根据本发明的一个实施方案中，基因工程化的细胞包含(R)-乳酸脱氢酶基因，其是来自德氏乳杆菌的编码SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少90％、优选95％的同一性、更优选至少98％和更优选至少99％的同一性程度的氨基酸序列的hdhD基因。
在根据本发明的另一个实施方案中，基因工程化的细胞包含(R)-乳酸脱氢酶基因，其是来自德氏乳杆菌的编码SEQ ID NO：36的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％、优选95％的同一性、更优选至少98％和更优选至少99％的同一性的氨基酸序列的ldhA基因。
在另一个实施方案中，根据本发明的细胞中的hdhD基因编码SEQ ID NO：38的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，根据本发明的细胞中的ldhA基因编码SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
在根据本发明的另一个实施方案中，基因工程化的细胞包含根据SEQ ID NO：37的核苷酸序列的hdhD基因。
在另一个实施方案中，基因工程化的细胞包含根据SEQ ID NO：35中的核苷酸序列的ldhA基因。
在优选的实施方案中，内源性丙酮酸甲酸裂解酶基因通过丙酮酸甲酸裂解酶/醇脱氢酶基因座pflBA-adhE的失活或缺失而失活。或者，内源性丙酮酸裂解酶A和/或B基因和内源性醇脱氢酶基因adhE可以在单独的步骤中失活或缺失。侧接pflBA-adhE的核苷酸区域可以通过SEQ ID NO 19-21的PCR引物来鉴定。
在本说明书中，用pflBA意指丙酮酸甲酸裂解酶基因A和B，分别编码丙酮酸甲酸裂解酶活化酶和丙酮酸甲酸裂解酶。
plfA是指丙酮酸甲酸裂解酶A基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶活化酶)，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的序列在SEQ ID NO：39中提供。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：40。plfB是指丙酮酸甲酸裂解酶B基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶)，其核苷酸序列提供于SEQID NO：41中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：42。在本发明中，adhE是指醇脱氢酶基因E，其编码双功能乙醛-CoA/醇脱氢酶复合物，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的核苷酸序列提供于SEQ ID NO：43中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：44。
在优选的实施方案中，通过丙酮酸甲酸裂解酶基因的失活通过丙酮酸甲酸裂解酶/醇脱氢酶基因座pflBA-adhE的失活或缺失而失活。或者，丙酮酸裂解酶A和/或B基因和醇脱氢酶基因adhE可以在单独的步骤中失活或缺失。
在本发明中，侧接adhE的核苷酸区域可以通过用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌杆菌的PCR引物SEQ ID NO 9和10来鉴定。
在根据本发明的另一个实施方案中，在基因工程化的细胞中，内源性甲基乙二醛合成酶基因(mgsA)也被失活或缺失。
在本说明书中，侧接mgsA的核苷酸区域可以通过用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的PCR引物SEQ ID NO：21-24鉴定。
SEQ ID NO：45中提供了热葡糖苷酶土芽孢杆菌的mgsA的核苷酸序列。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：46。
在根据本发明的另一个实施方案中，在基因工程化的细胞中，磷酸转乙酰酶基因(pta)也被失活或缺失。热葡糖苷酶土芽孢杆菌的pta的核苷酸序列提供于SEQ ID NO：49。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：50。pta(其编码磷酸转乙酰酶)的失活或缺失进一步使与内源pta活性相关的残余乙酸生成最小化。所得菌株(具有失活或缺失的pta)是乙酸的营养缺陷型。因此，当将该基因工程化的细胞发酵时，乙酸必须补充到生长培养基中。
在根据本发明的另一个实施方案中，遗传工程化的嗜热细菌细胞另外通过内源性孢子生成基因的失活或缺失而成为孢子生成缺陷型。
在另一个实施方案中，失活或缺失的孢子生成基因是sigF。
sigF是指孢子生成基因，其对于热葡糖苷酶土芽孢杆菌的核苷酸序列提供于SEQID NO：51中。编码的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：52。侧接sigF的核苷酸序列可以通过PCR引物SEQ ID NO：3-6来鉴定。
在另一个实施方案中，根据本发明的遗传工程化的嗜热细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞。优选地，细胞属于芽孢杆菌属，更优选土芽孢杆菌属。
在另一个实施方案中，根据本发明的遗传工程化的嗜热细菌细胞是热葡糖苷酶土芽孢杆菌。
本发明的目的之一是生产兼性厌氧的并通过同型乳酸发酵产生(R)-乳酸的土芽孢杆菌菌株。
因此，一方面，本发明公开了通过遗传工程遗传修饰中等嗜热土芽孢杆菌属物种的方法，所述土芽孢杆菌属物种是兼性厌氧的和同型乳酸的。
在本发明中，同型乳酸发酵被定义为从烃源产生乳酸，其中形成不超过15％(w/w)，优选不超过10％(w/w)，更优选不超过5％、4％、3％或2％(w/w)的副产物例如甲酸、乙酸和乙醇。该百分比涉及副产物的总重量相对于乳酸(包括(R)-乳酸和可能存在的任何(S)-乳酸)的总重量。乳酸和乙醇、乙酸和甲酸的量可以通过本领域已知的方法测定，例如，通过气液色谱法(GLC)或高效液相色谱法(HPLC)的衍生化和分析。
在几个实施方案中，基于甲酸、乙醇或乙酸的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，形成的甲酸、乙醇和乙酸中的至少一种的量不超过5％(w/w)，特别是不超过2％，1％，0.25％或0.1％(w/w)。换句话说，在同型乳酸发酵中形成的甲酸的重量可以是相对于乳酸的总重量的例如不超过5％(w/w)，更特别地不超过2％，1％，0.25％或0.1％(w/w)。类似地，乙醇的重量可以是不超过5％，2％，1％，0.25％或0.1％(w/w)，以及乙酸的量可以不超过5％，2％，1％，0.25％或0.1％(w/w)。
手性纯度是生产聚乳酸聚合物的重要方面。因此，必要的是生产对映体纯的(R)-乳酸用于商业应用。
因此，本发明还提供了遗传工程化的嗜热细菌细胞，其产生具有至少98％，更优选至少99.5％，99.8％或99.9％的对映体纯度的(R)-乳酸。
在本发明的一个方面，提供了生产对映体纯乳酸的方法。该方法包括以下步骤：使用合适的含可发酵碳的原料培养根据本发明的嗜热细菌细胞和分离(R)-乳酸。
在另一方面，本发明提供了生产对映体纯乳酸的方法，其中所述含碳原料包括木糖、葡萄糖或蔗糖。
培养温度优选在50℃至70℃，更优选在55℃至65℃的温度下进行。
在本发明的上下文中，基因的失活或缺失可以是编码待由细胞产生的所需多肽的基因和/或编码参与细胞的初级或次级代谢物产生的多肽的基因的修饰。原则上，这可以通过降低编码的蛋白质的细胞水平来实现。可以例如通过编码目标酶的基因的靶向失活实现细胞水平的降低。基因可以被整体去除。然而，作为替代，基因的部分缺失也可能导致编码的蛋白质的活性降低。或者或另外地，可以修饰或去除负责基因调节或表达的核苷酸序列，例如启动子增强子、翻译起始位点等。影响目标蛋白质活性的另一种方法可以是修饰转运信号(如果需要的话)或引入反义RNA。
染色体修饰是优选的，因为染色体修饰将确保基因的功能性在子代细胞上的稳定分布。染色体中所需功能的缺失可以用非同源以及同源重组进行。同源重组是优选的，因为其打开了引入、去除或同时引入和去除功能性的机会。
当意欲进行同源重组时，转化DNA还包含与待工程化的特定细胞的基因组靶序列同源的DNA序列。本领域技术人员将理解，不需要100％的同一性来获得同源重组。80％、优选90％、95％或98％的百分比同一性也是足够的。最优选99％。通常，待通过同源重组插入染色体中的感兴趣的DNA序列由具有足够长度的同源序列侧接以能够进行同源重组。这样的长度可以为至少约200bp，例如约200至约1500bp，优选约200至约1000bp。
为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度是指两个序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法确定同一性程度，其描述于Altschul,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。Blastp算法参数的默认设置是：10的期望阈值，3的字长，0的查询范围中的最大匹配，矩阵为BLOSUM62，11的间隙成本存在(GapCosts Existence)，和1的扩展，条件组成分数矩阵调整上的组成调整。
为了本发明的目的，两个核苷酸序列之间的同一性程度是指两个序列之间相同的核苷酸的百分比。使用BLAST算法确定同一性程度，其描述于Altschul,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。Blastn算法参数的默认设置为：10的期望阈值，28的字长，0的查询范围中的最大匹配，1、-2的匹配/不匹配分数，线性的间隙成本。
如上所述，鉴定热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的上述基因的序列均不需要是100％同一的，以便通过遗传工程修饰目标基因。此外，在来自其它物种的相关的嗜热细菌细胞中，基因可能偏离这些序列。然而，与这些基因同源并且具有相同功能性的热葡糖苷酶土芽孢杆菌基因序列的利用可以容易地由本领域技术人员鉴定，并且可以制备相应的引物用于在这些菌株中进行同源重组。因此，即使在某一菌株中存在与上述基因的序列的偏差，也可以容易地鉴定同源基因。其核苷酸序列可以使用本领域已知的技术确定，并且如果需要，可以将新的一组引物确定为与侧翼基因序列相同或互补。
根据本发明的细胞可以使用本领域已知的技术制备。通过电穿孔将DNA引入嗜热细菌的具体方法已由Van Kranenburg等人,2007,WO2007/085433和Cripps等人2009,Metab.Eng.11:398-408描述。
通过电穿孔转化这些芽孢杆菌属物种可以通过高电压放电通过包含兼性厌氧和同型乳酸的中等嗜热芽孢杆菌物种和具有所需功能性的合适转化DNA和/或与特定芽孢杆菌的基因组序列同源的DNA序列的悬浮液来实现。
(R)-乳酸可以通过本领域已知的方法在碳水化合物源(例如葡萄糖和/或木糖)的存在下发酵本文所述的遗传工程化的嗜热细菌细胞来获得。在发酵期间，由微生物排出的乳酸通常使用碱(例如碱金属或碱土金属的碱性盐，例如钠、钾、镁和/或钙的氢氧化物、碳酸盐和/或碳酸氢盐)中和。镁碱(例如，氢氧化镁，碳酸镁和/或碳酸氢镁)通常是优选的。因此，在几个方面，本发明特别涉及生产对映体纯(R)-乳酸的方法，所述方法包括使用合适的可发酵的含碳原料在镁碱(例如选自氢氧化镁、碳酸镁和碳酸氢镁中的至少一种)的存在下培养如本文所述的嗜热细菌细胞，和分离(R)-乳酸。
发酵后，通过已知的从水溶液中分离乳酸和/或乳酸盐的许多常规技术中的任一种将(R)-乳酸(或其盐)从发酵液中分离。在分离之前可以除去底物的颗粒或微生物(生物质)以提高分离效率。所述分离可以通过离心、过滤、絮凝、浮选或膜过滤进行。这例如从WO01/38283中已知，其中描述了通过发酵制备乳酸的连续方法。尽管在本说明书中对发酵的讨论通常是指分批过程，但是整个过程的部分或全部可以连续进行。
在从发酵液中分离(R)-乳酸(或其盐)后，可以对产物进行一个或多个纯化步骤，例如萃取、蒸馏、结晶、电渗析、过滤、用活性炭离子交换处理，等等。各种残余流可任选在处理后再循环至发酵容器或任何先前进行的纯化步骤。
实施例
材料和方法
菌株和质粒
本研究中使用的菌株和质粒列于表1中。
在需氧条件下，大肠杆菌在LB肉汤中常规培养(Sambrook&Russell,2001,Molecular Cloning,a laboratory manual.3rd edition.Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。当合适时，氯霉素和/或氨苄青霉素分别以20mg/L和100mg/L的浓度使用。
乳酸乳杆菌(L.lactis)常规地在补充有0.5％葡萄糖的M17肉汤(BDBiosciences)中在30℃下在厌氧条件下培养。当合适时，氯霉素以5mg/L的浓度使用。
除非另有说明，热葡糖苷酶土芽孢杆菌在52℃、55℃或60℃在需氧条件下常规生长在TGP培养基中。TGP培养基(Taylor等人,2008,Plasmid 60:45-52)包含17g/L胰蛋白胨、3g/L大豆蛋白胨、5g/L NaCl、2.5g/L K2HPO4，pH7.0，并且在高压灭菌后加入4ml/L甘油和4g/L丙酮酸钠。对于TGP板，使用10g/L琼脂。当合适时，培养基补充氯霉素(8μg/mL)。
表1.本研究中使用的菌株和质粒
DNA操作技术
如Sambrook和Russell(Sambrook&Russell,2001,Molecular Cloning,alaboratory manual.3rd edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)所述进行标准DNA操作技术。
在大肠杆菌中进行pNW33N衍生物的构建。
使用Jetstar 2.0Plasmid Maxiprep(Genomed)按照制造商的说明书进行从100mL培养物的大规模大肠杆菌质粒DNA分离。使用Nucleospin Plasmid Quick(Macherey-Nagel)试剂盒按照制造商的说明书进行从1mL培养物的小规模大肠杆菌质粒DNA分离。
如Sambrook和Russell(Sambrook&Russell,2001,Molecular Cloning,alaboratory manual.3rd edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)所述，使用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞并通过热休克转化。
在乳酸乳杆菌中进行pNZ124衍生物的构建。
使用Jetstar 2.0Plasmid Maxiprep(Genomed)从100mL培养物中分离乳酸乳杆菌质粒DNA。将细胞沉淀重悬于10ml修饰的E1缓冲液(10mM Tris/HCL pH8；50mM NaCl；10mM EDTA；20％蔗糖；4g/L溶菌酶(Sigma Aldrich))中，并在50℃下孵育1小时。随后，从细胞裂解开始按照制造商的说明书操作。
如Holo和Nes(Holo,H.,and I.F.Nes.1989.Appl.Environ.Microbiol.55:3119-3123)所述，通过电穿孔转化乳酸乳杆菌。
根据制造商的说明书，使用高保真Pwo聚合酶(Roche)进行用于克隆目的的PCR反应。
对于菌落PCR分析，用牙签挑取菌落，并将少量细胞材料转移到PCR反应管中。通过在微波炉中在1000W孵育1分钟破坏细胞。根据制造商的推荐制备具有DreamTaqTM DNA聚合酶(Thermo ScientificTM)的25μL的PCR反应混合物，并加入到具有破碎细胞的反应管中。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌的电穿孔
基于Cripps等人描述的方案(Cripps,等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)，通过电穿孔转化热葡糖苷酶土芽孢杆菌。热葡糖苷酶土芽孢杆菌在55℃下生长过夜，并使用1mL接种具有挡板的250ml锥形瓶中的50ml预热的TGP培养基。将细胞在60℃(180rpm)孵育直至OD600为≈1.0。将烧瓶在冰上冷却10分钟。并通过离心(4℃)沉淀细胞。接下来，将细胞用冰冷的电穿孔缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％(v/v)甘油)洗涤四次。洗涤步骤的体积为50ml，25ml，10ml和10ml。将最终的沉淀物重悬于1.3ml冰冷的电穿孔缓冲液中，并将60μl等分试样的电感受态细胞储存在-80℃或直接用于电穿孔。
将60μl等分试样的电感受态细胞(解冻的)与1-2μg质粒DNA混合，随后转移至冷却的电穿孔杯(间隙宽度0.1cm)。使用Bio-Rad基因脉冲发生器电穿孔仪的电穿孔条件为2,5kV、10μF和600Ω。电穿孔后，将细胞转移到50ml塑料管中的1ml预热(52℃)TGP中，并在52℃、180rpm下恢复2小时。将恢复的细胞悬浮液沉淀，除去所有上清液但留下150μl。将沉淀重悬于剩余的上清液中。将1/10和9/10的体积铺在含有8μg/L氯霉素的TGP平板上。将平板在52℃孵育24-48小时。将出现在平板上的菌落转移到含有8μg/L氯霉素的新鲜TGP平板中，并在55℃孵育过夜。通过使用引物1和2(表2)的菌落PCR测试生长的那些菌落的质粒的存在。
整合
如先前所述(Cripps等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)，将土芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pNW33n用作热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的整合载体。用来自甘油储备液的转化菌株接种含有8μg/mL氯霉素的20mL TGP。在55℃、180rpm下过夜生长后，将适当的稀释液铺在含有8μg/mL氯霉素的TGP平板上。然后将这些板在68℃下孵育24小时。将单菌落划线到新的平板(在52℃孵育)，并对这些菌落进行菌落PCR以鉴定具有单交换的菌落。使用合适的引物组合来鉴定通过上游或下游片段的单交换(表2；分别地用于整合pRM3的引物组合655-170和656-571，用于整合pRM12的引物组合744-170和808-571，用于整合pFS3的引物组合629-170和630-571，用于整合pJS43的引物组合754-170和991-571)。接下来，使用Masterpure革兰阳性DNA纯化试剂盒(Epicentre Biotechnologies)分离阳性菌落的染色体DNA并确认菌落PCR的结果，在分离的染色体DNA上重复上述PCR。选择通过上游侧翼区的单交换和通过下游侧翼区的单交换用于第二重组步骤。
为了获得双交换，将初步整合体在不含氯霉素的TGP中传代培养几次。将适当的稀释液(10-4,10-5,10-6)铺在TGP平板上。将分离的菌落转移至具有8μg/mL氯霉素的TGP平板和不具有8μg/mL氯霉素的一个TGP平板。双交换突变体是氯霉素敏感的。使用适当的引物组合的PCR分析(表2；用于ΔsigF的引物组合655-656，用于ΔpflBA-adhE的744-808和用于ΔmgsA的754-991)用于区分野生型和缺失突变体，并验证不存在质粒。通过PCR产物的测序确认所有修饰。
将乳球菌克隆载体pNZ124用作用于ldhA的热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的整合载体。用2μg pJS65质粒DNA转化具有相对高转化效率(至少103CFU/g pNW33n)的新鲜制备的热葡糖苷酶土芽孢杆菌感受态细胞。将转化平板在60℃下孵育16小时，在68℃下孵育8小时，在55℃下孵育20小时。将单个菌落划线至新的平板(在52℃孵育)，并对这些菌落进行菌落PCR以鉴定具有单交换的菌落。使用适当的引物组合鉴定通过上游或下游片段(表2；引物组合1539-205和204-630)的单交换。
表2.本研究中使用的引物
发酵
TMM培养基改良自Fong等人(Fong等人，2006)并且每L含有：60g/L葡萄糖；30g/L木糖；8.37g MOPS，0.23g K2HPO4；0.51g NH4Cl；0.50g NaCl；1.47g Na2SO4；0.08g NaHCO3；0.25gKCl；1.87g MgCl2.6H2O；0.41g CaCl2.2H2O；16.0mg MnCl2.4H2O；1.0mg ZnSO4.7H2O；2.0mgH3BO3；0.1mg CuSO4.5H2O；0.1mg Na2MoO4.2H2O；1.0mg CoCl2.6H2O；7.0mg FeSO4.7H2O；0.1mg硫胺素；0.1mg核黄素；0.5mg烟酸；0.1mg泛酸；0.5mg吡哆胺，HCl；0.5mg吡哆醛，HCl；0.1mgD-生物素；0.1mg叶酸；0.1mg对氨基苯甲酸；0.1mg钴胺素。将pH调节至pH 7.2。将葡萄糖、木糖、金属和维生素过滤灭菌。培养基经高压灭菌。TMM1、TMM2.5和TMM5分别补充1g/L、2.5g/L和5g/L酵母提取物(Oxoid)。
STMM不同于TMM的是K2HPO4(1.00g/L)、NH4Cl(2.50g/L)、NaCl(5.00g/L)和CaCl2.2H2O(50mg/L)的浓度，并补充有D,L-甲硫氨酸(68.5mg/L)和甜菜碱(0.14g/L)。使用蔗糖(90g/L)代替葡萄糖和木糖。STMM5补充有5g/L酵母提取物(Biospringer)。
使用TMM5或STMM5中的100mL预培养物在配备有冷凝器(用大约15℃的流动自来水冷却)的0.75L Multifors发酵罐(Infors)中接种(10％v/v)400mL TMM1、TMM2.5或STMM5。通过加入无菌的2.5M KOH或无菌的75g/L Ca(OH)2将pH控制在pH 7.2。温度为60℃。搅拌器速度为300rpm。
从发酵中取出样品用于测量(R)-和(S)-乳酸和可能的副产物。将样品离心，并使用Millex GP 0.22μm过滤器(Millipore)通过过滤除去剩余的碎片。滤液储存在-21℃直至进一步分析。
使用Thermo CarboPac SA-10柱(Dionex)通过HPLC测量糖。使用Bio-Rad AminexHPX-87C柱(Bio-Rad)通过HPLC测量甲酸。使用衍生化和气液色谱(GLC)测量其它有机酸(乳酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，丙酮酸)和乙醇。(R)-和(S)-乳酸盐被甲基化为甲基乳酸盐，并通过在手性柱上的顶空分析进行测量。
实施例1
使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌的同型乳酸生产
构建整合质粒pRM3以缺失热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的sigF基因。通过使用DSM2542的基因组DNA作为模板和使用引物组合653和654(表2)以获得上游片段以及引物651和652(表2)以获得下游片段的PCR产生sigF基因的上游和下游侧翼区。首先，将下游片段作为KpnI-SalI片段克隆到用相同的酶消化的pNW33n中。接下来，将上游片段作为SalI-HindIII片段克隆到用相同的酶消化的该构建体中，得到质粒pRM3。在大肠杆菌TG90中构建pRM3。通过DNA测序证实pRM3序列的完整性。
将质粒pRM3电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542。如材料和方法中所述的，选择单个转化体菌落并用于获得单交换突变体。选择两个菌落用于进一步的工作，一个具有通过上游侧翼区的单交换，一个具有通过下游侧翼区的单交换。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中的单交换整合体传代培养后获得的60个菌落转移到具有和没有氯霉素的TGP平板中。十五个菌落对氯霉素敏感。12个菌落具有所需的修饰，3个菌落恢复为野生型。选择一个菌落并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF。通过测序证实缺失。
表3.在TMM2.5上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF葡萄糖/木糖混合物的发酵。
热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF在使用TMM2.5的pH受控的(KOH)发酵中评估。发酵转移4次，并分析最终的发酵。结果总结在表3中。热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF同时消耗木糖和葡萄糖。
实施例2
使用hdhD的产生(R)-乳酸的热葡糖苷酶土芽孢杆菌衍生体的构建。
构建质粒pFS3以促进天然ldhL基因被来自德氏乳杆菌的编码D-乳酸脱氢酶活性的hdhD基因的基因置换。构建为使得hdhD起始和终止密码子取代原始ldhL起始和终止密码子的位置，并导致hdhD与ldhL启动子的翻译融合。使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合624和631通过PCR产生ldhL基因的下游侧翼区。产物用SalI和SphI消化，并连接到用SalI和SphI消化的pNW33n中。所得质粒命名为pFS2。在大肠杆菌DH5α中进行pFS2的构建。
使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合1057和1203通过PCR产生ldhL基因的上游侧翼区。通过使用德氏乳杆菌基因组DNA作为模板和引物组合1202和1189的PCR产生hdhD基因(SEQ ID NO：37)。该基因也可以基于SEQ ID NO：37合成。所得到的两个PCR产物随后使用引物组合1057和1189在重叠PCR中用作模板以将它们融合在一起。产物用BamHI和XhoI消化，并连接在用BamHI和SalI消化的pFS2中。所得质粒命名为pFS3。在大肠杆菌TG90中进行pFS3的构建。通过测序证实pFS3核苷酸序列的完整性。
将质粒pFS3电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF。选择单个转化体菌落并用于获得如材料和方法中所述的单交换突变体。在测试的多个菌落中，仅获得通过下游侧翼区的单交换突变体。其中的一个被选择用于进一步工作。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合体后获得的菌落转移至具有和不具有氯霉素的TGP平板。通过PCR检查17个对氯霉素敏感的菌落。一个菌落具有所需的修饰，16个菌落恢复为野生型。选择ldhL被交换为hdhD的菌落，并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD。
为了进一步优化热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，希望消除甲酸、乙酸和乙醇副产物形成。尽管已知pflA和/或pflB和adhE的突变影响许多细菌中的甲酸和乙醇生产，但是破坏那些基因的副作用是不可预测的。
为了评价这些基因的破坏的影响，构建了质粒(pRM12)以缺失热葡糖苷酶土芽孢杆菌中的基因pflB、pflA和adhE(部分地)。通过使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合739和805以获得上游pflBA片段以及引物806和807以获得上游adhE片段的PCR来产生pflBA的上游侧翼区和趋同取向的adhE的上游侧翼区。所得的两个PCR产物随后在重叠PCR中用作模板使用引物组合739和807以将它们融合在一起。将该产物作为BamHI-PstI片段克隆到用BamHI和PstI消化的质粒pNW33n中，得到质粒pRM12。pRM12的构建在大肠杆菌TG90中进行。通过测序证实pRM12核苷酸序列的完整性。
将质粒pRM12电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD。选择单个转化体菌落并用于获得如材料和方法中所述的单交换突变体。选择两个菌落用于进一步的工作，一个具有通过上游pflBA侧翼区的单交换，一个具有通过上游adhE侧翼区的单交换。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合体后获得的120个菌落转移至具有和不具有氯霉素的TGP平板。通过PCR检查5个对氯霉素敏感的菌落。两个菌落具有所需的修饰，三个菌落恢复为野生型。选择具有所需修饰的一个菌落并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，ΔpflBA-ΔadhE。
在使用含有5g/L酵母提取物和90g/L蔗糖的STMM5培养基的pH受控的(Ca(OH)2)发酵中评估热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，ΔpflBA-ΔadhE。转移发酵物并分析第二次发酵的同型乳酸(R)-乳酸的产生。热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，ΔpflBA-ΔadhE能够以有限量的乙醇、甲酸和乙酸副产物产生同型乳酸(R)-乳酸。因此，与丙酮酸甲酸裂解酶和醇脱氢酶复合基因的破坏组合的HdhD D-乳酸脱氢酶的引入导致在60℃下具有有限量的乙醇、甲酸和乙酸副产物的同型乳酸(R)-乳酸发酵。
实施例3
使用ldhA的产生(R)-乳酸的热葡糖苷酶土芽孢杆菌衍生体的构建。
已知在大肠杆菌中克隆源自乳杆菌属物种的ldhA基因是有问题的(Bernard等人,1991.FEBS Lett.290:61-64)。为了规避可能的克隆问题，我们决定使用乳酸乳杆菌作为中间宿主，使用pNZ124作为克隆载体。构建质粒pJS65以促进天然ldhL基因被源自德氏乳杆菌的编码D-乳酸脱氢酶活性的ldhA的基因替换。构建使得ldhA起始和终止密码子取代了原始ldhL起始和终止密码子的位置，并导致ldhA与ldhL启动子的翻译融合。
使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合1589和957通过PCR产生ldhL基因的下游侧翼区。产物用SacI和XhoI消化，并连接到用SacI和XhoI消化的pNZ124中。所得质粒命名为pJS64。pJS64的构建在乳酸乳杆菌MG1363中进行。
使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合1537和676通过PCR产生ldhL基因的上游侧翼区。通过使用德氏乳杆菌基因组DNA作为模板和引物组合675和564的PCR产生ldhA基因(SEQ ID NO：35)。基因也可以基于SEQ ID NO：35合成，并考虑合成基因应优选克隆在pNZ124和乳酸乳杆菌中。所得的两个PCR产物随后在重叠PCR中用作模板使用引物组合1537和564以将它们融合在一起。产物用XbaI和SalI消化，并连接在用XbaI消化并用SalI部分消化的pJS64中。所得质粒命名为pJS65。pJS65的构建在乳酸乳杆菌MG1363中进行。
将质粒pJS65电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，ΔpflBA-ΔadhE用于直接整合。获得具有通过上游ldhL侧翼区的单交换的单个转化体菌落。实现在热葡糖苷酶土芽孢杆菌基因组中的直接整合需要使用新鲜制备的具有至少103CFU/g pNW33n的相对高转化效率的感受态细胞。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合体后获得的240个菌落转移至具有和不具有氯霉素的TGP平板。通过PCR检查十三个对氯霉素敏感的菌落。十个菌落具有所需的修饰，三个恢复为野生型。选择ldhL被交换为ldhA的一个菌落，并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE。
表4.在STMM5上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE的发酵
在使用含有5g/L酵母提取物和90g/L蔗糖的STMM5培养基的pH受控的(Ca(OH)2)发酵中评估热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE。转移发酵物并分析第二次发酵。结果总结在表4中。这些数据清楚地表明，与丙酮酸甲酸裂解酶和醇脱氢酶复合基因的破坏组合的LdhA D-乳酸脱氢酶的引入导致具有有限量的乙醇、甲酸和乙酸副产物的同型乳酸(R)-乳酸发酵。
实施例4
使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌的对映体纯的同型乳酸
构建质粒pJS43以缺失热葡糖苷酶土芽孢杆菌的mgsA基因(423bp)中的267bp。通过使用DSM 2542的基因组DNA作为模板和引物组合750和999以获得mgsA下游片段以及引物1000和753以获得上游mgsA片段的PCR来产生mgsA基因的上游和下游侧翼区。所得的两个PCR产物随后在重叠PCR中用作模板使用引物组合750和753以将它们融合在一起。将产物作为BamHI-PstI片段克隆到用BamHI和PstI消化的质粒pNW33n中，得到质粒pJS43。在大肠杆菌TG90中进行pJS43的构建。通过测序证实pJS43核苷酸序列的完整性。
将质粒pJS43电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，ΔpflBA-ΔadhE。选择单个转化体菌落并用于获得如材料和方法中所述的单交换突变体。选择两个菌落用于进一步的工作，一个具有通过上游侧翼区的单交换，一个具有通过下游侧翼区的单交换。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合子后获得的400个菌落转移到具有和不具有氯霉素的TGP平板中。在这些中213个菌落对氯霉素敏感。通过PCR就双交换检查39个对氯霉素敏感的菌落。八个菌落具有所需的修饰，31个恢复为野生型。选择具有所需修饰的单个菌落并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::hdhD，ΔpflBA-ΔadhE，ΔmgsA。通过测序证实缺失。
将质粒pJS43电穿孔至热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE。选择单个转化体菌落并用于获得如材料和方法中所述的单交换突变体。选择两个菌落用于进一步的工作，均具有通过上游侧翼区的单交换。没有获得通过下游侧翼区的单交换。
按照材料和方法中所述的程序获得双交换突变体。将在没有氯霉素的TGP中传代培养单交换整合体后获得的240个菌落转移至具有和不具有氯霉素的TGP平板。239个菌落对氯霉素敏感，其中134个菌落通过PCR就双交换进行检查。一个具有所需的修饰，并且133恢复为野生型。选择具有所需修饰的单个菌落并命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE，ΔmgsA。通过测序证实缺失。
表5.在STMM5上使用热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE，ΔmgsA的发酵
在使用含有5g/L酵母提取物和90g/L蔗糖的STMM5培养基的pH受控的(Ca(OH)2)发酵中评估热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM 2542ΔsigF，ΔldhL::ldhA，ΔpflBA-ΔadhE，ΔmgsA。转移发酵物并分析第二次发酵。结果总结在表5中。对于低浓度的乳酸(<5g/kg)，所产生的(R)-乳酸的手性纯度为>99.0％，而对于较高浓度的乳酸(>20g/kg)，所产生的(R)-乳酸的手性纯度为>99.7，其比来自不破坏mgsA的菌株的乳酸更纯(表5)。这些数据清楚地表明，尽管热葡糖苷酶土芽孢杆菌中甲基乙二醛途径的明显不完整性，但mgsA的破坏导致产生手性纯(R)-乳酸的能力，从而导致同型乳酸和手性纯(R)-乳酸发酵。
序列表
<110> PURAC Biochem B.V.
<120> 遗传修饰的产生(R)-乳酸的嗜热细菌
<130> 22753
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 1
tcgccttctt ctgtgtcatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 2
ctggaggaga gcaatgaaac 20
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 3
gcgcgggtac ccagcaaacc gagcggaatc ag 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 4
gcgcggtcga cggatgggta ggcatccatt c 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 5
gcgcggtcga cgtctccctt agttacataa cgc 33
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 6
gcgcgaagct tgcttcgcag tccaatcgtc gc 32
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 7
gcgcgggatc ccccaaatgg cattaccggt gtg 33
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 8
tgttattgct ggcagtttcc ctcccatgca tctg 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 9
ggagggaaac tgccagcaat aacaccaaca ggct 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 10
gcgcgctgca gcgaaagcga acgaaattgc caac 34
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 11
gcgcggtcga cctgactttg aatacaacaa ggtgaac 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 12
gcgcggcatg ccggcaaaca gagctttaaa accaggc 37
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 13
cccgcatgct tagccaacct taactggagt ttcag 35
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 14
tttagtcatc gctgtctgtc atcctttcc 29
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 15
gatgacagac agcgatgact aaaatttttg cttacgcaat tcg 43
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 16
gcgcggtcga cttagccaac cttaactgga gtttcag 37
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 17
gcgcgggatc cctcgttgta tttgggcata cgtcg 35
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 18
ctgacattat acatggcaat tttagtcatc gctgtctgtc atcctttcc 49
<210> 19
<211> 49
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 19
ggaaaggatg acagacagcg atgactaaaa ttgccatgta taatgtcag 49
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 20
cggctcgagt tacaggttaa cgatgcttct tggc 34
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 21
gcgcgggatc cgctttccgt ttgccatttg ccg 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 22
tatgcgacgg gcgcgtggag gaatattgtc cgc 33
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 23
attcctccac gcgcccgtcg catacagttc atgttg 36
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 24
gcgcgctgca gggcaagact gacagaagag cttgg 35
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 25
gccctcgaga gggctcgcct ttgggaag 28
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 26
gctcgttata gtcgatcggt tc 22
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 27
gctaagatcg gccatacgtt aagc 24
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 28
ggagacgagc ttggcgtcct g 21
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 29
gccaagatgg atatgggcgt tagc 24
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 30
ccggagatgg acggaattga ag 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 31
gactgggcgc aagcggtgat g 21
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 32
cctgttgctg atacaaggtc tagc 24
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 33
cagcagtaac ggcatccgat tg 22
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 34
gcggatatga ttgaatttgt gactgcc 27
<210> 35
<211> 1002
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1002)
<400> 35
atg act aaa att ttt gct tac gca att cgt gaa gat gaa aag cca ttc 48
Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe
1 5 10 15
ttg aag gaa tgg gaa gac gct cac aag gac gtc gaa gtt gaa tac act 96
Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr
20 25 30
gac aag ctt ttg acc cca gaa act gct gct ttg gca aag ggt gct gac 144
Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp
35 40 45
ggt gtt gtt gtt tac caa caa ctt gac tac acc gct gaa act ctg caa 192
Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln
50 55 60
gct ttg gca gac aac ggc atc act aag atg agc ctg cgt aac gtt ggt 240
Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly
65 70 75 80
gtt gac aac atc gac atg gct aag gct aag gaa ctt ggc ttc caa atc 288
Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile
85 90 95
acc aac gtt cca gtt tac tca cca aac gcc atc gca gaa cat gct gct 336
Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala
100 105 110
atc caa gct gcc cgc atc ctg cgt caa gcc aag gct atg gac gaa aag 384
Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys
115 120 125
gtt gcc cgt cac gac ttg cgt tgg gca cca act atc ggc cgt gaa gtt 432
Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val
130 135 140
cgc gac caa gtt gtt ggt gtt gta ggt act ggc cac atc ggt caa gtc 480
Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val
145 150 155 160
ttc atg caa atc atg gaa ggc ttc ggc gct aag gtt atc gct tac gac 528
Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp
165 170 175
atc ttc cgc aac cca gaa ttg gaa aag aag ggc tac tac gta gac tca 576
Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser
180 185 190
ctt gac gac ctg tac aag caa gct gac gtt att tcc ctg cac gtt cct 624
Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro
195 200 205
ggc gtt cca gct aac gtt cac atg atc aac gac aag tca atc gct aaa 672
Gly Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys
210 215 220
atg aag caa gac gta gtt atc gtt aac gta tca cgt ggt tca ttg gtt 720
Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Ser Leu Val
225 230 235 240
gac act gac gcg gtt atc cgt ggt ttg gac tca ggc aag gtc ttc ggt 768
Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly
245 250 255
tac gca atg gac gtt tac gaa ggt gaa gtt ggc gtc ttc aac gaa gac 816
Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp
260 265 270
tgg gaa ggc aag gaa ttc cca gac gca cgt tta gct gac ttg atc gct 864
Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala
275 280 285
cgt cca aac gtt ctg gta act cca cac act gct ttc tac act act cac 912
Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His
290 295 300
gct gtt cgc aac atg gta att aag gcc ttc gac aac aac ctt gca ttg 960
Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Ala Leu
305 310 315 320
att gaa ggc aag gaa gct gaa act cca gtt aag gtt ggc taa 1002
Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly
325 330
<210> 36
<211> 333
<212> PRT
<213> 德氏乳杆菌
<400> 36
Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe
1 5 10 15
Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr
20 25 30
Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp
35 40 45
Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln
50 55 60
Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly
65 70 75 80
Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile
85 90 95
Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala
100 105 110
Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys
115 120 125
Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val
130 135 140
Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val
145 150 155 160
Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp
165 170 175
Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser
180 185 190
Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro
195 200 205
Gly Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys
210 215 220
Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Ser Leu Val
225 230 235 240
Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly
245 250 255
Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp
260 265 270
Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala
275 280 285
Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His
290 295 300
Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Ala Leu
305 310 315 320
Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly
325 330
<210> 37
<211> 1002
<212> DNA
<213> 德氏乳杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1002)
<400> 37
atg act aaa att gcc atg tat aat gtc agc ccg atc gaa gtg cct tac 48
Met Thr Lys Ile Ala Met Tyr Asn Val Ser Pro Ile Glu Val Pro Tyr
1 5 10 15
att gaa gac tgg gct aag aaa aac gat gtc gaa att aag acg acc gac 96
Ile Glu Asp Trp Ala Lys Lys Asn Asp Val Glu Ile Lys Thr Thr Asp
20 25 30
cag gcc ttg acc agc gcg act gta gat tta gct gaa ggg tgc agc agc 144
Gln Ala Leu Thr Ser Ala Thr Val Asp Leu Ala Glu Gly Cys Ser Ser
35 40 45
gtt tcc ctt aag cca ctt ggc ccg gtt gac gaa gaa gtt gtt tac caa 192
Val Ser Leu Lys Pro Leu Gly Pro Val Asp Glu Glu Val Val Tyr Gln
50 55 60
aaa ttg agc gaa tac ggg gtc aag tgc atc ggc ctc aga atc gtt ggc 240
Lys Leu Ser Glu Tyr Gly Val Lys Cys Ile Gly Leu Arg Ile Val Gly
65 70 75 80
ttc aac acc atc aac ttc gac tgg acc aag aag tac aac ttg ctg gtc 288
Phe Asn Thr Ile Asn Phe Asp Trp Thr Lys Lys Tyr Asn Leu Leu Val
85 90 95
acc aac gtt ccg gtc tac tcc ccg cgg gcg atc gct gaa atg acg gtt 336
Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Met Thr Val
100 105 110
acc cag gcc atg tac ctc ctg cgc aag atc ggg gaa ttc cgc tac cgg 384
Thr Gln Ala Met Tyr Leu Leu Arg Lys Ile Gly Glu Phe Arg Tyr Arg
115 120 125
atg gac cat gac cat gac ttt acc tgg cca agt aac ttg atc agc aat 432
Met Asp His Asp His Asp Phe Thr Trp Pro Ser Asn Leu Ile Ser Asn
130 135 140
gaa atc tac aac ttg act gtc ggc ttg atc ggg gtc ggt cac atc ggc 480
Glu Ile Tyr Asn Leu Thr Val Gly Leu Ile Gly Val Gly His Ile Gly
145 150 155 160
agc gcc gtg gca gaa atc ttc tca gcc atg ggg gcc aag gtc atc gcc 528
Ser Ala Val Ala Glu Ile Phe Ser Ala Met Gly Ala Lys Val Ile Ala
165 170 175
tat gac gtg gct tac aac ccg gaa ttt gaa cca ttt ttg acc tac acc 576
Tyr Asp Val Ala Tyr Asn Pro Glu Phe Glu Pro Phe Leu Thr Tyr Thr
180 185 190
gac ttt gac acg gtc ttg aaa gaa gct gac atc gtc tcc ctc cac act 624
Asp Phe Asp Thr Val Leu Lys Glu Ala Asp Ile Val Ser Leu His Thr
195 200 205
ccc ctc ttt cca tca acg gaa aac atg atc ggg gaa aag cag ctg aag 672
Pro Leu Phe Pro Ser Thr Glu Asn Met Ile Gly Glu Lys Gln Leu Lys
210 215 220
aaa atg aag aag tct gcc tac ttg atc aac tgt gcc cgg ggc gaa tta 720
Lys Met Lys Lys Ser Ala Tyr Leu Ile Asn Cys Ala Arg Gly Glu Leu
225 230 235 240
gtc gac act gga gcc ttg atc aag gcc ttg cag gat ggc gaa atc gcc 768
Val Asp Thr Gly Ala Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala
245 250 255
ggt gcc ggc ctg gac act ttg gct ggg gaa tcc agc tac ttt ggc cac 816
Gly Ala Gly Leu Asp Thr Leu Ala Gly Glu Ser Ser Tyr Phe Gly His
260 265 270
act ggc ctg acg gac agc gaa atc cca gaa gac tac aag acc ctg gcc 864
Thr Gly Leu Thr Asp Ser Glu Ile Pro Glu Asp Tyr Lys Thr Leu Ala
275 280 285
aag atg cca aac gtt gtc att act ccg cac tca gcc ttc tac acg gaa 912
Lys Met Pro Asn Val Val Ile Thr Pro His Ser Ala Phe Tyr Thr Glu
290 295 300
act tcc atc cgc aac atg gtg cag atc tgc ttg act gac caa ttg acc 960
Thr Ser Ile Arg Asn Met Val Gln Ile Cys Leu Thr Asp Gln Leu Thr
305 310 315 320
atc gcc aag ggc ggc cgg cca aga agc atc gtt aac ctg taa 1002
Ile Ala Lys Gly Gly Arg Pro Arg Ser Ile Val Asn Leu
325 330
<210> 38
<211> 333
<212> PRT
<213> 德氏乳杆菌
<400> 38
Met Thr Lys Ile Ala Met Tyr Asn Val Ser Pro Ile Glu Val Pro Tyr
1 5 10 15
Ile Glu Asp Trp Ala Lys Lys Asn Asp Val Glu Ile Lys Thr Thr Asp
20 25 30
Gln Ala Leu Thr Ser Ala Thr Val Asp Leu Ala Glu Gly Cys Ser Ser
35 40 45
Val Ser Leu Lys Pro Leu Gly Pro Val Asp Glu Glu Val Val Tyr Gln
50 55 60
Lys Leu Ser Glu Tyr Gly Val Lys Cys Ile Gly Leu Arg Ile Val Gly
65 70 75 80
Phe Asn Thr Ile Asn Phe Asp Trp Thr Lys Lys Tyr Asn Leu Leu Val
85 90 95
Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Met Thr Val
100 105 110
Thr Gln Ala Met Tyr Leu Leu Arg Lys Ile Gly Glu Phe Arg Tyr Arg
115 120 125
Met Asp His Asp His Asp Phe Thr Trp Pro Ser Asn Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Glu Ile Tyr Asn Leu Thr Val Gly Leu Ile Gly Val Gly His Ile Gly
145 150 155 160
Ser Ala Val Ala Glu Ile Phe Ser Ala Met Gly Ala Lys Val Ile Ala
165 170 175
Tyr Asp Val Ala Tyr Asn Pro Glu Phe Glu Pro Phe Leu Thr Tyr Thr
180 185 190
Asp Phe Asp Thr Val Leu Lys Glu Ala Asp Ile Val Ser Leu His Thr
195 200 205
Pro Leu Phe Pro Ser Thr Glu Asn Met Ile Gly Glu Lys Gln Leu Lys
210 215 220
Lys Met Lys Lys Ser Ala Tyr Leu Ile Asn Cys Ala Arg Gly Glu Leu
225 230 235 240
Val Asp Thr Gly Ala Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala
245 250 255
Gly Ala Gly Leu Asp Thr Leu Ala Gly Glu Ser Ser Tyr Phe Gly His
260 265 270
Thr Gly Leu Thr Asp Ser Glu Ile Pro Glu Asp Tyr Lys Thr Leu Ala
275 280 285
Lys Met Pro Asn Val Val Ile Thr Pro His Ser Ala Phe Tyr Thr Glu
290 295 300
Thr Ser Ile Arg Asn Met Val Gln Ile Cys Leu Thr Asp Gln Leu Thr
305 310 315 320
Ile Ala Lys Gly Gly Arg Pro Arg Ser Ile Val Asn Leu
325 330
<210> 39
<211> 750
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(750)
<400> 39
atg aaa gga ttt att cat tcc atc gaa tca tgc ggc acc gtc gac ggg 48
Met Lys Gly Phe Ile His Ser Ile Glu Ser Cys Gly Thr Val Asp Gly
1 5 10 15
ccg ggc ctt cgc tat gtc atc ttt aca caa ggc tgt gtg ctg cgc tgc 96
Pro Gly Leu Arg Tyr Val Ile Phe Thr Gln Gly Cys Val Leu Arg Cys
20 25 30
caa tat tgc cat aac gcc gat acg tgg gaa att gga aaa gga aaa gaa 144
Gln Tyr Cys His Asn Ala Asp Thr Trp Glu Ile Gly Lys Gly Lys Glu
35 40 45
atg act gtg gaa gaa atc atc gat gac gtg aaa aca tac ttg ccg ttt 192
Met Thr Val Glu Glu Ile Ile Asp Asp Val Lys Thr Tyr Leu Pro Phe
50 55 60
atc aac gct tcc aat ggc gga att acc gtc agc ggc gga gag cct ttg 240
Ile Asn Ala Ser Asn Gly Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Pro Leu
65 70 75 80
tta caa atc gat ttt tta att gaa tta ttt aaa gca tgc aaa aaa ctg 288
Leu Gln Ile Asp Phe Leu Ile Glu Leu Phe Lys Ala Cys Lys Lys Leu
85 90 95
ggc att cat acc gcg atc gat tca tcg gga gga tgc tac acg acg gaa 336
Gly Ile His Thr Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Thr Glu
100 105 110
gca tcg ttc cag caa aaa tta aat gaa tta ctt tcc tat acc gat tta 384
Ala Ser Phe Gln Gln Lys Leu Asn Glu Leu Leu Ser Tyr Thr Asp Leu
115 120 125
att ttg ctt gat tta aaa cat atc gat gag aaa aaa cac cgg aaa ctg 432
Ile Leu Leu Asp Leu Lys His Ile Asp Glu Lys Lys His Arg Lys Leu
130 135 140
aca gga aaa acc aat aaa cat att tta caa ttt gct cag ttt tta tcc 480
Thr Gly Lys Thr Asn Lys His Ile Leu Gln Phe Ala Gln Phe Leu Ser
145 150 155 160
gaa aaa aac gtt cct gtt tgg atc cgg cat gtt ctc gtt cca acc atc 528
Glu Lys Asn Val Pro Val Trp Ile Arg His Val Leu Val Pro Thr Ile
165 170 175
aca gac gac ccg aat gac ttg cgc cgt ctc gcc gct ttt att cgc aca 576
Thr Asp Asp Pro Asn Asp Leu Arg Arg Leu Ala Ala Phe Ile Arg Thr
180 185 190
tta aag aat gtg aaa aaa att gaa att ctc cca tac cat aaa tta gga 624
Leu Lys Asn Val Lys Lys Ile Glu Ile Leu Pro Tyr His Lys Leu Gly
195 200 205
gta tac aaa tgg aaa gcg ctt gga tta aaa tac cct ttg gaa gga atc 672
Val Tyr Lys Trp Lys Ala Leu Gly Leu Lys Tyr Pro Leu Glu Gly Ile
210 215 220
gag cct cct tcg gaa gaa agc gta caa atg gca cag cga att ctt aac 720
Glu Pro Pro Ser Glu Glu Ser Val Gln Met Ala Gln Arg Ile Leu Asn
225 230 235 240
gga aca gaa gat aca gta tct ctt gcg taa 750
Gly Thr Glu Asp Thr Val Ser Leu Ala
245
<210> 40
<211> 249
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 40
Met Lys Gly Phe Ile His Ser Ile Glu Ser Cys Gly Thr Val Asp Gly
1 5 10 15
Pro Gly Leu Arg Tyr Val Ile Phe Thr Gln Gly Cys Val Leu Arg Cys
20 25 30
Gln Tyr Cys His Asn Ala Asp Thr Trp Glu Ile Gly Lys Gly Lys Glu
35 40 45
Met Thr Val Glu Glu Ile Ile Asp Asp Val Lys Thr Tyr Leu Pro Phe
50 55 60
Ile Asn Ala Ser Asn Gly Gly Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Pro Leu
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asp Phe Leu Ile Glu Leu Phe Lys Ala Cys Lys Lys Leu
85 90 95
Gly Ile His Thr Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Thr Glu
100 105 110
Ala Ser Phe Gln Gln Lys Leu Asn Glu Leu Leu Ser Tyr Thr Asp Leu
115 120 125
Ile Leu Leu Asp Leu Lys His Ile Asp Glu Lys Lys His Arg Lys Leu
130 135 140
Thr Gly Lys Thr Asn Lys His Ile Leu Gln Phe Ala Gln Phe Leu Ser
145 150 155 160
Glu Lys Asn Val Pro Val Trp Ile Arg His Val Leu Val Pro Thr Ile
165 170 175
Thr Asp Asp Pro Asn Asp Leu Arg Arg Leu Ala Ala Phe Ile Arg Thr
180 185 190
Leu Lys Asn Val Lys Lys Ile Glu Ile Leu Pro Tyr His Lys Leu Gly
195 200 205
Val Tyr Lys Trp Lys Ala Leu Gly Leu Lys Tyr Pro Leu Glu Gly Ile
210 215 220
Glu Pro Pro Ser Glu Glu Ser Val Gln Met Ala Gln Arg Ile Leu Asn
225 230 235 240
Gly Thr Glu Asp Thr Val Ser Leu Ala
245
<210> 41
<211> 2250
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2250)
<400> 41
atg aaa caa gcc act gtt gta ttg gac cct tgg cgc aat ttt aaa ggg 48
Met Lys Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Pro Trp Arg Asn Phe Lys Gly
1 5 10 15
tca aaa tgg aaa aaa tcg att gac gtc cgt gat ttt att tta aac aat 96
Ser Lys Trp Lys Lys Ser Ile Asp Val Arg Asp Phe Ile Leu Asn Asn
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gta acc gtt tac tac ggg gat gaa tca ttc cta gaa ggg cct aca gaa 144
Val Thr Val Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Phe Leu Glu Gly Pro Thr Glu
35 40 45
gca acg aaa aaa cta tgg gaa caa gtg atg gaa ttg tcg aaa caa gaa 192
Ala Thr Lys Lys Leu Trp Glu Gln Val Met Glu Leu Ser Lys Gln Glu
50 55 60
cgc gaa aaa ggc ggc gtc ctt gat atg gac aca tcg att gtt tcg acc 240
Arg Glu Lys Gly Gly Val Leu Asp Met Asp Thr Ser Ile Val Ser Thr
65 70 75 80
atc act tcc cac gga cca ggt tat tta aac aaa gac ttg gaa aaa atc 288
Ile Thr Ser His Gly Pro Gly Tyr Leu Asn Lys Asp Leu Glu Lys Ile
85 90 95
gta ggt ttt caa aca gat aaa ccg ttt aag cgt gca tta atg ccg ttt 336
Val Gly Phe Gln Thr Asp Lys Pro Phe Lys Arg Ala Leu Met Pro Phe
100 105 110
ggc ggc att cgc atg gcg caa caa tca tgc gaa gca tac ggt tac aaa 384
Gly Gly Ile Arg Met Ala Gln Gln Ser Cys Glu Ala Tyr Gly Tyr Lys
115 120 125
gta agc gac gaa gtg aaa aaa atc ttt acg gaa tac cgg aaa aca cac 432
Val Ser Asp Glu Val Lys Lys Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr His
130 135 140
aac caa ggt gtg ttt gac gtt tac acc gac gag atg aga tta gcg cgc 480
Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Asp Glu Met Arg Leu Ala Arg
145 150 155 160
aaa gca gga atc atc acc ggc ctt cct gat gcg tac gga cgc ggc cgt 528
Lys Ala Gly Ile Ile Thr Gly Leu Pro Asp Ala Tyr Gly Arg Gly Arg
165 170 175
atc atc ggc gac tat cgt cgc gtc gcg tta tac ggt gtc gat cgt ttg 576
Ile Ile Gly Asp Tyr Arg Arg Val Ala Leu Tyr Gly Val Asp Arg Leu
180 185 190
atc gaa gaa aaa caa aaa gat ttg aaa aac act ggc gca aga acg atg 624
Ile Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Lys Asn Thr Gly Ala Arg Thr Met
195 200 205
acc gaa gac att atc cgt ctt cgc gaa gaa att tca gag caa att cgc 672
Thr Glu Asp Ile Ile Arg Leu Arg Glu Glu Ile Ser Glu Gln Ile Arg
210 215 220
gca tta aac gag tta aaa caa atg gcg tta agc tat gga tat gat att 720
Ala Leu Asn Glu Leu Lys Gln Met Ala Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Ile
225 230 235 240
tcc aaa ccg gca cgg aac gca cat gaa gca ttc caa tgg ctc tat ttc 768
Ser Lys Pro Ala Arg Asn Ala His Glu Ala Phe Gln Trp Leu Tyr Phe
245 250 255
gct tat ctt gct gct att aaa gaa caa aac ggc gcg gcg atg agc tta 816
Ala Tyr Leu Ala Ala Ile Lys Glu Gln Asn Gly Ala Ala Met Ser Leu
260 265 270
ggg cgc gtt tcc acc ttc ttg gat att tat atc gag cgc gac ttt gca 864
Gly Arg Val Ser Thr Phe Leu Asp Ile Tyr Ile Glu Arg Asp Phe Ala
275 280 285
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Glu Gly Thr Leu Thr Glu Lys Glu Ala Gln Glu Leu Val Asp His Phe
290 295 300
gtg atg aaa ttg cgc ctt gtc aaa ttt gcc aga acg ccg gaa tat aac 960
Val Met Lys Leu Arg Leu Val Lys Phe Ala Arg Thr Pro Glu Tyr Asn
305 310 315 320
gaa ctg ttt agc gga gac ccg aca tgg gtt acc gaa tcg atc ggc gga 1008
Glu Leu Phe Ser Gly Asp Pro Thr Trp Val Thr Glu Ser Ile Gly Gly
325 330 335
att gcc att gat ggc cgt ccg tta gtg aca aag aac tcg ttc cgt ttc 1056
Ile Ala Ile Asp Gly Arg Pro Leu Val Thr Lys Asn Ser Phe Arg Phe
340 345 350
ctt cat acg tta gat aac tta gga cct gcg cca gag cca aac tta aca 1104
Leu His Thr Leu Asp Asn Leu Gly Pro Ala Pro Glu Pro Asn Leu Thr
355 360 365
gta ctt tgg tcg aaa caa ttg ccg gaa gca ttc aaa gag tat tgc gcg 1152
Val Leu Trp Ser Lys Gln Leu Pro Glu Ala Phe Lys Glu Tyr Cys Ala
370 375 380
aaa atg tcg atc aaa aca agc tcg att caa tat gaa aat gac gac tta 1200
Lys Met Ser Ile Lys Thr Ser Ser Ile Gln Tyr Glu Asn Asp Asp Leu
385 390 395 400
atg cgc gtc gaa ttt ggc gat gat tac gga att gct tgc tgc gta tca 1248
Met Arg Val Glu Phe Gly Asp Asp Tyr Gly Ile Ala Cys Cys Val Ser
405 410 415
gcg atg cga atc ggc aaa caa atg caa ttt ttc gga gcg cgc gcc aac 1296
Ala Met Arg Ile Gly Lys Gln Met Gln Phe Phe Gly Ala Arg Ala Asn
420 425 430
ctc gcc aaa gca ttg tta tat gcg att aac ggc ggc gtc gat gaa aaa 1344
Leu Ala Lys Ala Leu Leu Tyr Ala Ile Asn Gly Gly Val Asp Glu Lys
435 440 445
ttg aaa atc caa gtt ggc cct gaa ttt gcg ccg att acc tcc gaa tat 1392
Leu Lys Ile Gln Val Gly Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ser Glu Tyr
450 455 460
tta aat tat gat gaa gtg atg cat aaa ttc gat caa gtg ctt gaa tgg 1440
Leu Asn Tyr Asp Glu Val Met His Lys Phe Asp Gln Val Leu Glu Trp
465 470 475 480
ctt gcc gaa ctt tat att aac aca ctg aat gtc atc cat tac atg cac 1488
Leu Ala Glu Leu Tyr Ile Asn Thr Leu Asn Val Ile His Tyr Met His
485 490 495
gac aaa tat tgt tat gaa cgc att gaa atg gcg ctt cac gat act cac 1536
Asp Lys Tyr Cys Tyr Glu Arg Ile Glu Met Ala Leu His Asp Thr His
500 505 510
gtt tta cgc aca atg gcc act ggc att gcc gga ttg tca gtt gtc gtc 1584
Val Leu Arg Thr Met Ala Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ser Val Val Val
515 520 525
gat tcg tta agc gcg atc aaa tat gca aaa gtc aaa ccg atc cgc gat 1632
Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Val Lys Pro Ile Arg Asp
530 535 540
gaa aac ggc att gct gtt gat ttt gaa atg gaa ggc gac ttc ccg aaa 1680
Glu Asn Gly Ile Ala Val Asp Phe Glu Met Glu Gly Asp Phe Pro Lys
545 550 555 560
tac gga aat aac gat gat cgc gtc gac caa att gcc gtt gat tta gtc 1728
Tyr Gly Asn Asn Asp Asp Arg Val Asp Gln Ile Ala Val Asp Leu Val
565 570 575
gaa cgt ttt atg acg aaa ttg aaa aaa cat aaa aca tat cgc gat tcg 1776
Glu Arg Phe Met Thr Lys Leu Lys Lys His Lys Thr Tyr Arg Asp Ser
580 585 590
aaa cat acg cta tct att tta aca att acg tct aac gtt gta tac ggg 1824
Lys His Thr Leu Ser Ile Leu Thr Ile Thr Ser Asn Val Val Tyr Gly
595 600 605
aaa aag acc gga aat aca cca gat ggc cgc cgc gct ggc gaa ccg ttt 1872
Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg Arg Ala Gly Glu Pro Phe
610 615 620
gcc cca gga gca aac ccg ttg cac ggc cgt gac acg aaa gga gcg ctc 1920
Ala Pro Gly Ala Asn Pro Leu His Gly Arg Asp Thr Lys Gly Ala Leu
625 630 635 640
gct tcg cta agc tct gtc gcg aaa tta cca tat gaa cat gca tta gat 1968
Ala Ser Leu Ser Ser Val Ala Lys Leu Pro Tyr Glu His Ala Leu Asp
645 650 655
ggc att tcg aat acg ttc tcg atc gtg ccg aaa gcg tta gga aaa gag 2016
Gly Ile Ser Asn Thr Phe Ser Ile Val Pro Lys Ala Leu Gly Lys Glu
660 665 670
gaa gga gac cgt gtc cgc aac ctt gtc gcc gtt tta gac gga tac atg 2064
Glu Gly Asp Arg Val Arg Asn Leu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Met
675 680 685
gaa aaa ggc ggg cat cat ctc aac att aac gtg ttg aac cgc gaa aca 2112
Glu Lys Gly Gly His His Leu Asn Ile Asn Val Leu Asn Arg Glu Thr
690 695 700
ttg tta gat gcg atg gaa cat cca gaa aaa tat ccg caa tta acg att 2160
Leu Leu Asp Ala Met Glu His Pro Glu Lys Tyr Pro Gln Leu Thr Ile
705 710 715 720
cgc gtt tct gga tat gcc gtc aac ttc ata aaa tta acg cgc gaa caa 2208
Arg Val Ser Gly Tyr Ala Val Asn Phe Ile Lys Leu Thr Arg Glu Gln
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caa atc gat gtc att aac cgc acg ttc cac gaa acg atg taa 2250
Gln Ile Asp Val Ile Asn Arg Thr Phe His Glu Thr Met
740 745
<210> 42
<211> 749
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 42
Met Lys Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Pro Trp Arg Asn Phe Lys Gly
1 5 10 15
Ser Lys Trp Lys Lys Ser Ile Asp Val Arg Asp Phe Ile Leu Asn Asn
20 25 30
Val Thr Val Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Phe Leu Glu Gly Pro Thr Glu
35 40 45
Ala Thr Lys Lys Leu Trp Glu Gln Val Met Glu Leu Ser Lys Gln Glu
50 55 60
Arg Glu Lys Gly Gly Val Leu Asp Met Asp Thr Ser Ile Val Ser Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser His Gly Pro Gly Tyr Leu Asn Lys Asp Leu Glu Lys Ile
85 90 95
Val Gly Phe Gln Thr Asp Lys Pro Phe Lys Arg Ala Leu Met Pro Phe
100 105 110
Gly Gly Ile Arg Met Ala Gln Gln Ser Cys Glu Ala Tyr Gly Tyr Lys
115 120 125
Val Ser Asp Glu Val Lys Lys Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr His
130 135 140
Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Asp Glu Met Arg Leu Ala Arg
145 150 155 160
Lys Ala Gly Ile Ile Thr Gly Leu Pro Asp Ala Tyr Gly Arg Gly Arg
165 170 175
Ile Ile Gly Asp Tyr Arg Arg Val Ala Leu Tyr Gly Val Asp Arg Leu
180 185 190
Ile Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Lys Asn Thr Gly Ala Arg Thr Met
195 200 205
Thr Glu Asp Ile Ile Arg Leu Arg Glu Glu Ile Ser Glu Gln Ile Arg
210 215 220
Ala Leu Asn Glu Leu Lys Gln Met Ala Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Ile
225 230 235 240
Ser Lys Pro Ala Arg Asn Ala His Glu Ala Phe Gln Trp Leu Tyr Phe
245 250 255
Ala Tyr Leu Ala Ala Ile Lys Glu Gln Asn Gly Ala Ala Met Ser Leu
260 265 270
Gly Arg Val Ser Thr Phe Leu Asp Ile Tyr Ile Glu Arg Asp Phe Ala
275 280 285
Glu Gly Thr Leu Thr Glu Lys Glu Ala Gln Glu Leu Val Asp His Phe
290 295 300
Val Met Lys Leu Arg Leu Val Lys Phe Ala Arg Thr Pro Glu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Leu Phe Ser Gly Asp Pro Thr Trp Val Thr Glu Ser Ile Gly Gly
325 330 335
Ile Ala Ile Asp Gly Arg Pro Leu Val Thr Lys Asn Ser Phe Arg Phe
340 345 350
Leu His Thr Leu Asp Asn Leu Gly Pro Ala Pro Glu Pro Asn Leu Thr
355 360 365
Val Leu Trp Ser Lys Gln Leu Pro Glu Ala Phe Lys Glu Tyr Cys Ala
370 375 380
Lys Met Ser Ile Lys Thr Ser Ser Ile Gln Tyr Glu Asn Asp Asp Leu
385 390 395 400
Met Arg Val Glu Phe Gly Asp Asp Tyr Gly Ile Ala Cys Cys Val Ser
405 410 415
Ala Met Arg Ile Gly Lys Gln Met Gln Phe Phe Gly Ala Arg Ala Asn
420 425 430
Leu Ala Lys Ala Leu Leu Tyr Ala Ile Asn Gly Gly Val Asp Glu Lys
435 440 445
Leu Lys Ile Gln Val Gly Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ser Glu Tyr
450 455 460
Leu Asn Tyr Asp Glu Val Met His Lys Phe Asp Gln Val Leu Glu Trp
465 470 475 480
Leu Ala Glu Leu Tyr Ile Asn Thr Leu Asn Val Ile His Tyr Met His
485 490 495
Asp Lys Tyr Cys Tyr Glu Arg Ile Glu Met Ala Leu His Asp Thr His
500 505 510
Val Leu Arg Thr Met Ala Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ser Val Val Val
515 520 525
Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Val Lys Pro Ile Arg Asp
530 535 540
Glu Asn Gly Ile Ala Val Asp Phe Glu Met Glu Gly Asp Phe Pro Lys
545 550 555 560
Tyr Gly Asn Asn Asp Asp Arg Val Asp Gln Ile Ala Val Asp Leu Val
565 570 575
Glu Arg Phe Met Thr Lys Leu Lys Lys His Lys Thr Tyr Arg Asp Ser
580 585 590
Lys His Thr Leu Ser Ile Leu Thr Ile Thr Ser Asn Val Val Tyr Gly
595 600 605
Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg Arg Ala Gly Glu Pro Phe
610 615 620
Ala Pro Gly Ala Asn Pro Leu His Gly Arg Asp Thr Lys Gly Ala Leu
625 630 635 640
Ala Ser Leu Ser Ser Val Ala Lys Leu Pro Tyr Glu His Ala Leu Asp
645 650 655
Gly Ile Ser Asn Thr Phe Ser Ile Val Pro Lys Ala Leu Gly Lys Glu
660 665 670
Glu Gly Asp Arg Val Arg Asn Leu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Met
675 680 685
Glu Lys Gly Gly His His Leu Asn Ile Asn Val Leu Asn Arg Glu Thr
690 695 700
Leu Leu Asp Ala Met Glu His Pro Glu Lys Tyr Pro Gln Leu Thr Ile
705 710 715 720
Arg Val Ser Gly Tyr Ala Val Asn Phe Ile Lys Leu Thr Arg Glu Gln
725 730 735
Gln Ile Asp Val Ile Asn Arg Thr Phe His Glu Thr Met
740 745
<210> 43
<211> 2604
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2604)
<400> 43
atg gct gtg gag gag aga gtc gtc gat aaa aaa atc gaa gta gca aaa 48
Met Ala Val Glu Glu Arg Val Val Asp Lys Lys Ile Glu Val Ala Lys
1 5 10 15
atg att gat gag ctt gtc gct aat gca cag aaa gcg ttg gaa caa att 96
Met Ile Asp Glu Leu Val Ala Asn Ala Gln Lys Ala Leu Glu Gln Ile
20 25 30
cgc gct tac gat caa gaa acg atc gat cat atc gtg aaa gaa atg gcg 144
Arg Ala Tyr Asp Gln Glu Thr Ile Asp His Ile Val Lys Glu Met Ala
35 40 45
tta gcc ggg ctc gac aag cat atg gca tta gcc aag ctt gca gta gaa 192
Leu Ala Gly Leu Asp Lys His Met Ala Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu
50 55 60
gaa aca aaa cgc ggt gta tat gaa gat aaa atc ata aaa aac ctt ttt 240
Glu Thr Lys Arg Gly Val Tyr Glu Asp Lys Ile Ile Lys Asn Leu Phe
65 70 75 80
gcg aca gaa tat ata tac cac aat att aag tat gat aaa aca gtc ggg 288
Ala Thr Glu Tyr Ile Tyr His Asn Ile Lys Tyr Asp Lys Thr Val Gly
85 90 95
att att cat gaa aat ccg cat gaa gaa att atc gaa att gct gag cct 336
Ile Ile His Glu Asn Pro His Glu Glu Ile Ile Glu Ile Ala Glu Pro
100 105 110
gtt ggt gtt att gct ggg att acg cca gtg aca aac ccg aca tcg aca 384
Val Gly Val Ile Ala Gly Ile Thr Pro Val Thr Asn Pro Thr Ser Thr
115 120 125
acg atg ttt aaa gcg tta atc tcg ata aaa aca cgc aac ccg att att 432
Thr Met Phe Lys Ala Leu Ile Ser Ile Lys Thr Arg Asn Pro Ile Ile
130 135 140
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Phe Ala Phe His Pro Ser Ala Gln Arg Cys Ser Ser Glu Ala Ala Arg
145 150 155 160
gtg ctg cgc gat gcg gcg gtc cgg gca ggg gct cca gaa cat tgc att 528
Val Leu Arg Asp Ala Ala Val Arg Ala Gly Ala Pro Glu His Cys Ile
165 170 175
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Gln Trp Ile Glu Thr Pro Ser Leu Asp Ala Thr Asn Gln Leu Met His
180 185 190
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His Pro Gly Val Ser Leu Ile Leu Ala Thr Gly Gly Ala Gly Met Val
195 200 205
aaa gca gcg tac agc tct gga aaa cca gct ttg ggc gtc gga cct ggc 672
Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Leu Gly Val Gly Pro Gly
210 215 220
aat gtg cct tgc tat att gaa aaa acg gca aac ata aaa cgg gcg gta 720
Asn Val Pro Cys Tyr Ile Glu Lys Thr Ala Asn Ile Lys Arg Ala Val
225 230 235 240
aat gac tta att tta tcg aaa acg ttt gat aac ggc atg att tgc gct 768
Asn Asp Leu Ile Leu Ser Lys Thr Phe Asp Asn Gly Met Ile Cys Ala
245 250 255
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Ser Glu Gln Ala Val Ile Ile Asp Lys Glu Ile Tyr Glu Gln Val Lys
260 265 270
aaa gaa atg ata gaa aac cat tgt tat ttc tta aat gaa gaa gaa aag 864
Lys Glu Met Ile Glu Asn His Cys Tyr Phe Leu Asn Glu Glu Glu Lys
275 280 285
aaa aaa gta gaa aaa ctc gtt atc aat gaa aat aca tgc gcc gtc aac 912
Lys Lys Val Glu Lys Leu Val Ile Asn Glu Asn Thr Cys Ala Val Asn
290 295 300
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Pro Asp Ile Val Gly Lys Pro Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Met Ala Gly
305 310 315 320
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Ile Ala Val Pro Glu Asp Thr Lys Ile Leu Val Ala Glu Leu Lys Gly
325 330 335
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Val Gly Pro Lys Tyr Pro Leu Ser Arg Glu Lys Leu Ser Pro Val Leu
340 345 350
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Ala Cys Tyr Lys Val Asn Ser Thr Glu Glu Gly Phe Lys Arg Cys Glu
355 360 365
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Glu Met Leu Glu Phe Gly Gly Leu Gly His Ser Ala Val Ile His Ser
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gat aat caa aac gtg gtt acc gaa ttt ggc aaa cgg atg aaa gcg gga 1200
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tac aat gcg tac att ccg tca tta acg ctg gga tgc ggc aca ttt ggc 1296
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Pro Lys Ile Tyr Phe Glu Lys Asn Ala Val Gln Tyr Leu Ala Lys Met
465 470 475 480
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ctc gga tat gtc gat aaa gtg ctg tat tac ttg cgc aga cgc ccg gat 1536
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tat gtg cat agt gaa att ttc tcc gaa gta gag cca gat cct tca att 1584
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gtg att atc gcg ctt gga ggc ggc tcg cca atg gat gcg gca aaa gcg 1680
Val Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ala
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atg tgg ctc ttt tac gag cat ccg aca gcg gat ttc aac gca tta aaa 1728
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caa aaa ttt tta gat att cga aaa cgc gtt tat aaa tat cca aaa ctg 1776
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Gly Gln Lys Ala Lys Phe Val Ala Ile Pro Thr Thr Ser Gly Thr Gly
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<210> 44
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<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
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<220>
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<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 48
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290 295 300
Thr Val Leu Lys Asp Ile Leu Ser Arg Tyr Phe Asp Asp Val Lys
305 310 315
<210> 49
<211> 975
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(975)
<400> 49
gtg agc agt gat tta ttt tcg aca tta aaa gaa aaa ata gcg gga aaa 48
Val Ser Ser Asp Leu Phe Ser Thr Leu Lys Glu Lys Ile Ala Gly Lys
1 5 10 15
caa cgg aaa atc gtg ttt ccg gaa ggg ctt gat gag cgt att tta aca 96
Gln Arg Lys Ile Val Phe Pro Glu Gly Leu Asp Glu Arg Ile Leu Thr
20 25 30
gcg gta agc cgt ctg gcg aac gag caa atc gtc acg ccg att gtc att 144
Ala Val Ser Arg Leu Ala Asn Glu Gln Ile Val Thr Pro Ile Val Ile
35 40 45
ggc aat gaa gaa gcg gtt aag caa aaa gca agc gag ctt ggg ctg acg 192
Gly Asn Glu Glu Ala Val Lys Gln Lys Ala Ser Glu Leu Gly Leu Thr
50 55 60
ctt ccg aat gtc gaa atc att gat ccg cat cag tac ggg gaa atg gac 240
Leu Pro Asn Val Glu Ile Ile Asp Pro His Gln Tyr Gly Glu Met Asp
65 70 75 80
aag ctt gtt gcg gca ttt gtc gaa cgc cgc aaa ggg aaa gtg acg gaa 288
Lys Leu Val Ala Ala Phe Val Glu Arg Arg Lys Gly Lys Val Thr Glu
85 90 95
gaa gcg gcg cgg aag ctg ctt ctt gac gaa aat tat ttt ggc acc atg 336
Glu Ala Ala Arg Lys Leu Leu Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Gly Thr Met
100 105 110
ctt gtg tac atg gat aag gcg cat ggg ctt gtc agc ggc gcg gcg cat 384
Leu Val Tyr Met Asp Lys Ala His Gly Leu Val Ser Gly Ala Ala His
115 120 125
tcg acg gct gat acg gtg cgg cct gcg ttg caa att ata aaa acg aaa 432
Ser Thr Ala Asp Thr Val Arg Pro Ala Leu Gln Ile Ile Lys Thr Lys
130 135 140
caa ggc gtc cgc aaa acg tca gga gta ttc att atg gtg cgc ggt gat 480
Gln Gly Val Arg Lys Thr Ser Gly Val Phe Ile Met Val Arg Gly Asp
145 150 155 160
gaa aag tac gtg ttt gcc gat tgc gcg atc aac att gcc ccg gac agc 528
Glu Lys Tyr Val Phe Ala Asp Cys Ala Ile Asn Ile Ala Pro Asp Ser
165 170 175
caa gat ttg gcg gaa atc gct gtc gaa agc gcc aac acg gca aaa atg 576
Gln Asp Leu Ala Glu Ile Ala Val Glu Ser Ala Asn Thr Ala Lys Met
180 185 190
ttc gac att gag ccg cgc gtg gcg atg ttg agc ttt tcg aca aaa gga 624
Phe Asp Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Phe Ser Thr Lys Gly
195 200 205
tca gcg aaa tcg cca gaa acg gaa aaa gtc gtc gaa gcg gtg cgg ctt 672
Ser Ala Lys Ser Pro Glu Thr Glu Lys Val Val Glu Ala Val Arg Leu
210 215 220
gcg aaa gaa atg gcg cct gac tta gtg ctg gac ggt gag ttt cag ttc 720
Ala Lys Glu Met Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp Gly Glu Phe Gln Phe
225 230 235 240
gac gcg gcg ttt gtt ccg tct gtc gcg aaa aag aaa gcg cca gat tcc 768
Asp Ala Ala Phe Val Pro Ser Val Ala Lys Lys Lys Ala Pro Asp Ser
245 250 255
gtc att caa gga gac gcg aac gta ttt att ttc cca agc ctt gaa gcg 816
Val Ile Gln Gly Asp Ala Asn Val Phe Ile Phe Pro Ser Leu Glu Ala
260 265 270
gga aat atc ggc tat aaa atc gcc cag cgt ctc ggc aac ttt gaa gcg 864
Gly Asn Ile Gly Tyr Lys Ile Ala Gln Arg Leu Gly Asn Phe Glu Ala
275 280 285
gtc ggc ccg att ttg caa gga ctc aat aag cct gtg aac gac ctg tca 912
Val Gly Pro Ile Leu Gln Gly Leu Asn Lys Pro Val Asn Asp Leu Ser
290 295 300
cgc ggt tgc aat gcg gaa gat gtg tac aag ctg acg ctt ata act gcg 960
Arg Gly Cys Asn Ala Glu Asp Val Tyr Lys Leu Thr Leu Ile Thr Ala
305 310 315 320
gcg caa tcg cta taa 975
Ala Gln Ser Leu
<210> 50
<211> 324
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 50
Val Ser Ser Asp Leu Phe Ser Thr Leu Lys Glu Lys Ile Ala Gly Lys
1 5 10 15
Gln Arg Lys Ile Val Phe Pro Glu Gly Leu Asp Glu Arg Ile Leu Thr
20 25 30
Ala Val Ser Arg Leu Ala Asn Glu Gln Ile Val Thr Pro Ile Val Ile
35 40 45
Gly Asn Glu Glu Ala Val Lys Gln Lys Ala Ser Glu Leu Gly Leu Thr
50 55 60
Leu Pro Asn Val Glu Ile Ile Asp Pro His Gln Tyr Gly Glu Met Asp
65 70 75 80
Lys Leu Val Ala Ala Phe Val Glu Arg Arg Lys Gly Lys Val Thr Glu
85 90 95
Glu Ala Ala Arg Lys Leu Leu Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Gly Thr Met
100 105 110
Leu Val Tyr Met Asp Lys Ala His Gly Leu Val Ser Gly Ala Ala His
115 120 125
Ser Thr Ala Asp Thr Val Arg Pro Ala Leu Gln Ile Ile Lys Thr Lys
130 135 140
Gln Gly Val Arg Lys Thr Ser Gly Val Phe Ile Met Val Arg Gly Asp
145 150 155 160
Glu Lys Tyr Val Phe Ala Asp Cys Ala Ile Asn Ile Ala Pro Asp Ser
165 170 175
Gln Asp Leu Ala Glu Ile Ala Val Glu Ser Ala Asn Thr Ala Lys Met
180 185 190
Phe Asp Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Phe Ser Thr Lys Gly
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Pro Glu Thr Glu Lys Val Val Glu Ala Val Arg Leu
210 215 220
Ala Lys Glu Met Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp Gly Glu Phe Gln Phe
225 230 235 240
Asp Ala Ala Phe Val Pro Ser Val Ala Lys Lys Lys Ala Pro Asp Ser
245 250 255
Val Ile Gln Gly Asp Ala Asn Val Phe Ile Phe Pro Ser Leu Glu Ala
260 265 270
Gly Asn Ile Gly Tyr Lys Ile Ala Gln Arg Leu Gly Asn Phe Glu Ala
275 280 285
Val Gly Pro Ile Leu Gln Gly Leu Asn Lys Pro Val Asn Asp Leu Ser
290 295 300
Arg Gly Cys Asn Ala Glu Asp Val Tyr Lys Leu Thr Leu Ile Thr Ala
305 310 315 320
Ala Gln Ser Leu
<210> 51
<211> 750
<212> DNA
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(750)
<400> 51
atg gat gtc gat gtc aag cga gat cag acg ctg tta aaa gat cat gag 48
Met Asp Val Asp Val Lys Arg Asp Gln Thr Leu Leu Lys Asp His Glu
1 5 10 15
atg aaa aag ctt att cgc cgc agc caa gag ggg gac caa cag gcg cgc 96
Met Lys Lys Leu Ile Arg Arg Ser Gln Glu Gly Asp Gln Gln Ala Arg
20 25 30
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35 40 45
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Arg Phe Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Pro Asp Asp Leu Phe Gln Ile Gly
50 55 60
tgc atc ggc ttg ctt aaa tct gtt gat aag ttt gat ttg tcg tat gac 240
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65 70 75 80
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85 90 95
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Arg Phe Ile Arg Asp Asp Gly Thr Val Lys Val Ser Arg Ser Leu Lys
100 105 110
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Glu Thr Gly Asn Lys Ile Arg Lys Ala Arg Asp Glu Leu Ser Lys Lys
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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Ala Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Leu Asp Glu Arg Glu Arg Leu Ile
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Leu Gln Gln Ile Lys Glu Arg Met Asp Gly
245 250
<210> 52
<211> 250
<212> PRT
<213> 热葡糖苷酶土芽孢杆菌
<400> 52
Met Asp Val Asp Val Lys Arg Asp Gln Thr Leu Leu Lys Asp His Glu
1 5 10 15
Met Lys Lys Leu Ile Arg Arg Ser Gln Glu Gly Asp Gln Gln Ala Arg
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Cys Ile Gly Leu Leu Lys Ser Val Asp Lys Phe Asp Leu Ser Tyr Asp
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Glu Thr Gly Asn Lys Ile Arg Lys Ala Arg Asp Glu Leu Ser Lys Lys
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Ser Ile His Glu Thr Val Tyr Glu Asn Asp Gly Asp Pro Ile Thr Leu
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Leu Asp Gln Ile Ala Asp Ala Asp Glu Ala Ser Trp Phe Asp Lys Ile
180 185 190
Ala Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Leu Asp Glu Arg Glu Arg Leu Ile
195 200 205
Val Tyr Leu Arg Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gln Ser Glu Val Ala Ser
210 215 220
Arg Leu Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Ser Arg Leu Glu Lys Lys Ile
225 230 235 240
Leu Gln Gln Ile Lys Glu Arg Met Asp Gly
245 250
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 53
ctgcaagctt tggcagacaa cggcatcac 29
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 54
ttgcgtaacc gaagaccttg cctgagtcc 29
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 55
cctcgagcgg caaacagagc tttaaaacca ggc 33
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 56
gggtctagag ccgcttcgtt ttccaactga tgc 33
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 57
tctttcgctt ccagggctgt tc 22
<210> 58
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的引物
<400> 58
gcgcggagct cgtcgacctg actttgaata caacaaggtg aac 43

Claims (20)

1.一种兼性厌氧的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含：
a)内源性(S)-乳酸脱氢酶基因的失活或缺失；
b)(R)-乳酸脱氢酶基因的引入；
c)内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因的失活或缺失。
2.权利要求1所述的细胞，其中内源性甲基乙二醛合成酶基因mgsA也被失活或缺失。
3.权利要求1或2所述的细胞，其中所述(R)-乳酸脱氢酶是来自德氏乳杆菌的编码SEQID NO：38的氨基酸序列或具有至少90％同一性的氨基酸序列的hdhD基因。
4.权利要求1或2所述的细胞，其中所述(R)-乳酸脱氢酶是来自德氏乳杆菌的编码SEQID NO：36的氨基酸序列或具有至少90％同一性的氨基酸序列的ldhA基因。
5.权利要求3所述的细胞，其中所述hdhD基因编码SEQ ID NO：38的氨基酸序列。
6.权利要求4所述的细胞，其中所述ldhA基因编码SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
7.权利要求1-6所述的细胞，其中内源性磷酸转乙酰酶基因(pta)也被失活或缺失。
8.权利要求1-7所述的细胞，其是由于内源性孢子生成基因的失活或缺失而产生的孢子生成缺陷型衍生体。
9.权利要求8所述的细胞，其中所述孢子生成基因是sigF。
10.权利要求1-9所述的细胞，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因通过内源性丙酮酸甲酸裂解酶/醇脱氢酶基因座pflBA-adhE的失活或缺失而失活。
11.权利要求1-10所述的细胞，其产生具有至少98％，更优选至少99％、99.5％、99.8％或99.9％的对映体纯度的(R)-乳酸。
12.权利要求1-11所述的细菌细胞，其中所述基因通过同源重组进行修饰。
13.权利要求1-12所述的细胞，其是革兰氏阳性细菌细胞。
14.权利要求13所述的细胞，其属于土芽孢杆菌属。
15.权利要求14所述的细胞，其中土芽孢杆菌属物种是Geobacillusthermoglucosidans。
16.一种生产对映体纯的(R)-乳酸的方法，所述方法包括使用合适的可发酵的含碳原料培养权利要求1-15所述的嗜热细菌细胞，以及分离(R)-乳酸。
17.权利要求16所述的方法，其中所述含碳原料包括木糖、葡萄糖或蔗糖。
18.权利要求16或17所述的方法，其中所述培养在50℃至70℃的温度进行。
19.权利要求16至18中任一项所述的方法，其中基于副产物的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，形成不超过15％(w/w)的副产物，特别是或不超过10％(w/w)或不超过5％、4％、3％或2％(w/w)。
20.权利要求16至19中任一项所述的方法，其中基于甲酸、乙醇或乙酸的总重量相对于所产生的乳酸的总重量，所形成的甲酸、乙醇和乙酸中的至少一种的量不超过5％(w/w)，特别是不超过2％、1％、0.25％或0.1％(w/w)。
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