ES2401339T3 - Materiales y métodos para producción eficiente de ácido láctico - Google Patents

Abstract

Cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende las siguientes modificaciones genéticas para la cepa de E. coli KO11 (ATCC 55124): a) inserción del gen casAB de Klebsiella oxytoca detrás del codón de terminación de lacY; b) integración del gen celY de Erwinia chrysanthemi en el gen frdA; c) inactivación o deleción de focA-Z. mobilis pdc-adhB-5 pflB; d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa; y e) inactivación o deleción del gen de acetato-quinasa (ackA).

Description

Materiales y métodos para producción eficiente de ácido láctico

Antecedentes de la invención

[0001] El ácido láctico se usa comúnmente como aditivo alimenticio para la conservación, el sabor y la acidez. El ácido láctico también se usa en la producción de plástico biodegradable, a saber, ácido poliláctico (PLA). El uso de PLA como alternativa renovable para productos a base de petróleo se está expandiendo rápidamente (Agrawal, 2003). Las propiedades físicas y el índice de degradación biológica del PLA se puede controlar mediante la manipulación de la proporción de los sustratos quirales, ácido láctico D y ácido láctico L (Narayanan et al., 2004). El mercado global del ácido láctico se estima que tiene un exceso de 100.000 toneladas al año y se espera que aumente sustancialmente en los próximos años según empiecen a funcionar nuevas instalaciones de PLA.

[0002] Por ejemplo, la demanda de lactato de etilo solvente biodegradable (un derivado del ácido láctico) está previsto que aumente sustancialmente en un futuro próximo. Se estima que los ésteres de lactato podrían potencialmente reemplazar hasta el 80% de los 3,8 millones de toneladas de solventes que se usan cada año en EEUU. Este solvente no es tóxico y tiene muchas aplicaciones útiles, incluyendo la fabricación electrónica, pinturas y recubrimientos, tejidos, limpiadores y desengrasantes, adhesivos, impresión y destintado.

[0003] Los métodos fermentativos para producir ácido láctico suelen preferirse a la síntesis química, que produce una mezcla de los isómeros D y L. Los productos de fermentaciones microbiológicas dependen del organismo usado. La fermentación microbiológica puede producir una mezcla de los dos isómeros o ácido láctico ópticamente puro en una forma esteroespecífica. La estereoespecificidad deseada del producto depende del uso al que esté destinado.

[0004] Las fermentaciones bacterianas con lactobacilos son comunes en la producción industrial de ácido láctico, pero estas fermentaciones raramente producen un producto ópticamente puro. Adicionalmente, la naturaleza fastidiosa de estas bacterias requiere que se añadan cantidades considerables de nutrientes adicionales al medio de crecimiento, lo que supone un coste adicional y hace más difícil la purificación. Por otra parte, los métodos de fermentación para producir ácido láctico son altamente ineficientes y debe mejorarse para asegurar la viabilidad económica de las expansiones de mercado mencionadas anteriormente.

[0005] La levadura no es capaz de producir niveles apreciables de ácido láctico, aunque se han descrito cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes que contienen el gen de ldh de Lactobacillus o de orígenes bovinos (patente WO 99/14335 y Adachi et al., 1998). A la vez que son capaces de producir hasta 2-4% (p/v) de ácido láctico, estas cepas muestran una productividad pobre y una parte significante de la glucosa se convierte en etanol.

[0006] El Rhizopus oryzae de hongo filamentoso (sinónimo de R. arrhizus) también se usa para la producción industrial de ácido láctico. El R. oryzae es capaz de convertir aeróbicamente glucosa, en un medio químicamente definido, en grandes cantidades de ácido L-(+)-láctico ópticamente puro. La investigación en la producción de ácido láctico mediante Rhizopus ha continuado principalmente por la facilidad de purificación del producto en un medio de crecimiento mínimo y la capacidad del hongo para utilizar ambos carbohidratos complejos y azúcares de pentosa (patente estadounidense Nº. 4.963.486). Esto permite que se utilice el hongo para la conversión de biomasa agrícola de bajo valor en ácido láctico. Desafortunadamente, la capacidad para modificar la producción de ácido láctico por modificación genética en el Rhizopus y otros hongos ha sido limitada.

[0007] Los biocatalizadores basados en la K-12 de Escherichia coli han sido creados genéticamente para la producción de D-(-)-lactato pero fueron incapaces de fermentar 10% de la glucosa o la sacarosa para complejarlas en el complejo o medio mínimo (Chang et al., 1999 Dien et al., 2001 Zhou et al., 2003 Zhu y Shimizu 2004).

[0008] Uno de los biocatalizadores de E. coli, SZ63 (pLOI3501), se desarrolló para fermentación de sacarosa mediante expresión funcional de los genes cscR' cscA' cscKB' de E. coli B en un plásmido (Shukla et al. 2004). Aunque fue capaz de fermentación eficaz del 5% de glucosa o sacarosa, este biocatalizador metabolizó concentraciones de azúcar más altas de forma incompleta y se requirió selección antibiótica continua para el mantenimiento del plásmido.

[0009] Otros biocatalizadores derivados de la cepa B de E. coli, tales como K011 (número de depósito ATCC 55124), tienen la capacidad nativa de fermentar sacarosa (Moniruzzaman et al., 1997). Como con la cepa SZ63, este biocatalizador metaboliza concentraciones de azúcar más altas de forma incompleta y se requiere selección antibiótica continua para el mantenimiento del plásmido.

[0010] Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de biocatalizadores de ácido láctico mejorados con aumento de los índices de fermentación, el título del producto y los rendimientos para reducir los costes asociados a la producción de base biológica de productos químicos (Arntzen et al., 1999 Chotani et al., 2000 Datta et al., 1995 Hofvendahl y Hahn-Hagerdal, 2000 y Ohara et al., 2001).

Breve resumen de la invención

[0011] La presente invención proporciona microorganismos nuevos útiles para la producción de ácido láctico. Adicionalmente, la presente invención proporciona constructos nuevos para su uso en la transformación de cualquiera de los numerosos organismos huésped, preferiblemente Escherichia coli, que expresan y/o suprimen genes determinados para producir ácido láctico cuando el organismo huésped se cultiva en un medio fermentable. Por consiguiente, los materiales y métodos de la presente invención pueden utilizarse para mejorar la producción del ácido láctico en organismos huésped, proporcionando de este modo un mayor suministro de ácido láctico para su uso en aplicaciones alimentarias e industriales.

[0012] En formas de realización determinadas, se construyen derivados del Escherichia coli etanologénico (también denominados en este caso E. coli) K011 para la producción de D-(-)-lactato. En otras formas de realización de la invención, E. coli se crea genéticamente conforme a la presente invención para la producción de L-(+)-lactato.

[0013] Conforme a la presente invención, los nuevos biocatalizadores basados en K011 de E. coli se preparan mediante deleción de los genes que codifican las vías rivales seguida de una selección basada en el crecimiento para mutantes con rendimiento mejorado para fermentar glucosa y/o sacarosa.

[0014] Los microbios creados genéticamente de la invención preferiblemente contienen genes nativos para la utilización de sacarosa. Ciertas cepas de E. coli creadas genéticamente de la invención pueden fermentar 10% de glucosa o sacarosa para producir más de 1 mol de D-(-)-lactato/1 de caldo de fermentación, con rendimientos basados en azúcar metabolizado que varía de aproximadamente 88% a aproximadamente 95%, dependiendo del caldo de fermentación. Otras cepas de E. coli creadas genéticamente de la invención pueden fermentar glucosa o sacarosa para producir L-(+)lactato.

[0015] Se desprenderán más ventajas de esta invención de la descripción siguiente.

Breve descripción de las figuras

[0016]

Las figuras 1A-1F ilustran gráficamente la diferencia de actividad entre una forma de realización de la invención y la cepa SZ63.

Las figuras 2A-2D ilustran el progreso de la producción de ácido láctico de varias formas de realización de la invención bajo condiciones de fermentación en el medio de sales minerales NBS.

Las figuras 3A-3B ilustran la capacidad de la betaína para aumentar la tolerancia al ácido y al azúcar durante la producción de ácido láctico mediante una forma de realización de la invención.

Las figuras 4A-4B ilustran la capacidad de una forma de realización de la invención para aclimatarse a los medios minerales.

Las figuras 5A-5G ilustran el progreso de la producción de ácido láctico por otra forma de realización de la invención bajo varias condiciones de fermentación.

Breve descripción de las secuencias

[0017] SEQ ID nº: 1 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de frdBC. SEQ ID nº: 2 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de frdBC. SEQ ID nº: 3 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de adhE. SEQ ID nº: 4 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de adhE. SEQ ID nº: 5 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de celY. SEQ ID nº: 6 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de celY. SEQ ID nº: 7 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de mgsA. SEQ ID nº: 8 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de mgsA. SEQ ID nº: 9 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para amplificación de FRT-cat-sacB. SEQ ID nº: 10 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para amplificación de FRT-cat-sacB. SEQ ID nº: 11 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para amplificación de cat-sacB con el sitio NheI 5'. SEQ ID nº: 12 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para amplificación de cat-sacB con el sitio NheI 5'. SEQ ID nº: 13 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para clonación de frdABCD. SEQ ID nº: 14 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para clonación de frdABCD. SEQ ID nº: 15 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para clonación de ackA.

SEQ ID nº: 16 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para clonación de ackA. SEQ ID nº: 17 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para clonación de lacZ-cynX. SEQ ID nº: 18 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para clonación de lacZ-cynX. SEQ ID nº: 19 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para clonación de mgsA. SEQ ID nº: 20 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para clonación de mgsA. SEQ ID nº: 21 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para clonación de focA-pflB. SEQ ID nº: 22 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para clonación de focA-pflB. SEQ ID nº: 23 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para clonación de adhE. SEQ ID nº: 24 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para clonación de adhE. SEQ ID nº: 25 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de frdBC. SEQ ID nº: 26 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de frdBC. SEQ ID nº: 27 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de ackA. SEQ ID nº: 28 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de ackA. SEQ ID nº: 29 es la secuencia de nucleótido para un cebador antisentido lacZ con el sitio NheI 5'. SEQ ID nº: 30 es la secuencia de nucleótido para un cebador cynX antisentido con el sitio NheI 5'. SEQ ID nº: 31 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de mgsA. SEQ ID nº: 32 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de mgsA. SEQ ID nº: 33 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de focA-pflB. SEQ ID nº: 34 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de focA-pflB. SEQ ID nº: 35 es la secuencia de nucleótidos para un cebador de sentido para deleción de adhE. SEQ ID nº: 36 es la secuencia de nucleótidos para un cebador antisentido para deleción de adhE.

SEQ ID nº: 37-46 representan la secuencia parcial de las regiones genéticas en las que se eliminaron las cicatrices FRT. Las secuencias parciales de las regiones 5' y 3' del gen(es) se muestran en negrita, la cursiva se utiliza para designar la cicatriz FRT y la región subrayada se eliminó en la cepa TG128.

Descripción detallada de la invención

[0018] La presente invención proporciona microorganismos nuevos que son capaces de producir ácido láctico cuando se cultivan en una variedad de condiciones de fermentación. La presente invención también proporciona métodos para crear tales microorganismos así como métodos para producir ácido láctico de forma estable y eficiente usando los nuevos microbios de la invención, de modo que se proporciona un rendimiento elevado de ácido láctico a partir de materias primas relativamente poco costosos tales como glucosa o sacarosa.

[0019] El término "ácido láctico" en esta solicitud se refiere a ácido 2-hidroxipropiónico ya sea en el ácido libre o en forma de sal. La forma de sal de ácido láctico se denomina "lactato" independientemente del agente de neutralización, es decir, carbonato cálcico o hidróxido amónico. En este caso, el ácido láctico puede referirse a cualquier forma estereoisomérica de ácido láctico (ácido L-(+)-láctico o ácido D-(-)-láctico). El término lactato puede referirse a cualquier forma estereoisomérica de lactato (L-(+)-lactato o D-(-)-lactato). La presente invención proporciona microbios que producen un único estereoisómero de ácido láctico o lactato. El estereoisómero de ácido láctico o estereoisómero de lactato que se produce conforme a algunos aspectos de esta invención es "quiralmente puro". La frase "quiralmente puro" indica que no hay contaminación detectable entre una forma estereoisomérica de ácido láctico o lactato y la otra forma estereoisomérica (la pureza quiral del estereoisómero específico es al menos mayor de (o mayor de o igual a) 99,9%). Los microorganismos genéticamente modificados descritos en la presente a los que se les ha eliminado o desactivado la ruta del metilglioxal (mgsA) son capaces de producir ácido D-(-)-láctico o ácido L-(+)-láctico "quiralmente puro".

[0020] Para ciertas formas de realización de la invención, ácido L-(+)-láctico se produce usando los microbios creados genéticamente de la invención. En otras formas de realización de la invención, ácido D-(-)-láctico se produce usando los microbios creados genéticamente de la invención.

[0021] En una forma de realización, la invención usa Escherichia coli (o E. coli) como biocatalizador para la conversión mejorada de glucosa y/o sacarosa en ácido láctico. Conforme a la presente invención, el metabolismo de un microorganismo se puede modificar por introducción y expresión de varios genes. Conforme a la presente invención, se pueden introducir varios plásmidos nuevos en el E. coli de modo que el microorganismo transformado pueda producir grandes cantidades de ácido láctico en varias condiciones de fermentación. El E. coli recombinante de la invención se modifica preferiblemente de modo que el ácido láctico se produzca de forma estable con rendimiento elevado cuando se cultiva en un medio que comprende glucosa y/o sacarosa.

[0022] Los huéspedes de E. coli que contienen los plásmidos de la presente invención se depositaron en el Agricultural Research Service Culture Collection, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 U.S.A. Los números de registro y fechas de depósito son los siguientes:

Cultivo

Número de acceso Fecha de depósito

SZ132

NRRL B-30861 3 de agosto de 2005

SZ186

NRRL B-30862 3 de agosto de 2005

SZ194

NRRL B-30863 3 de agosto de 2005

TG103

NRRL B-30864 9 de agosto de 2005

TG102

NRRL B-30921 5 de mayo de 2006

TG105

NRRL B-30922 5 de mayo de 2006

TG106

NRRL B-30923 5 de mayo de 2006

TG107

NRRL B-30924 5 de mayo de 2006

TG108

NRRL B-30925 5 de mayo de 2006

TG112

NRRL B-30926 5 de mayo de 2006

TG113

NRRL B-30927 5 de mayo de 2006

TG114

NRRL B-30928 5 de mayo de 2006

TG128

NRRL B-30962 25 de julio de 2006

TG129

NRRL B-30963 25 de julio de 2006

TG130

NRRL B-30964 25 de julio de 2006

[0023] Los cultivos en cuestión se han depositado bajo condiciones que garantizan que el acceso a los cultivos esté disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente para que alguien determinado por el Commissioner of Patents and Trademarks (Comisionado de Patentes y Marcas) tenga derecho a ello bajo 37 CFR 1.14 y 35 USC 122. Las depósitos están disponibles como exigen las leyes de patentes extranjeras en los países donde se han solicitado homólogas de la presente solicitud o su progenie. No obstante, se debe entender que la disponibilidad de los depósitos no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.

[0024] Además, estos depósitos de cultivo se almacenarán y se pondrán a disposición del público según lo establecido en el Tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, es decir, se almacenarán con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y sin contaminación durante un periodo de al menos cinco años después de la última solicitud de almacenamiento de una prueba de los depósitos y, en cualquier caso, durante un periodo de al menos 30 (treinta) años después de la fecha de depósito o durante la vida ejecutable de cualquier patente que pueda emitir la divulgación de los cultivos. El depositante reconoce el deber de reemplazar los depósitos si el depositario no pudiera proporcionar una muestra cuando se solicitara, debido a la condición de los depósitos. Toda restricción de la disponibilidad al público de los depósitos de cultivo objeto desaparecerá irrevocablemente por la concesión de una patente que los divulgue.

[0025] Una forma de realización de la presente invención proporciona una cepa B de E. coli ("SZ132"; nº de depósito: NRRL B-30861) que se crea genéticamente para mejorar el crecimiento celular y la producción de lactato en varios medios. En una forma de realización, la cepa SZ132 se puede construir para producir D-lactato (ácido láctico) mediante los siguientes pasos:

(a)

construcción de la cepa LY52 de E. coli K011 integrando los genes casAB de Klebsiella oxytoca (nº de depósito: ATCC 68564) para utilización de celobiosa detrás del codón de terminación de lacY e integrar el gen celY de Erwinia chysanthemi (nº de depósito: ATCC 55124) que codifica endoglucanasa en el gen frdA (Ohta et al., 1991 Moniruzzaman et al., 1997 Zhou e Ingram, 1999);

(b)

transducción consecutiva a LY52 de determinadas mutaciones en E. coli K-12 (cepa W3110), que se usaron para construir la cepa SZ63 (Zhou et al., 2003);

(c)

deleción de genes de Z. mobilis para producir etanol por transducción de P1 de la deleción ΔfocA-pflB de la cepa SZ31 (cepa W3110);

(d)

inactivación de la producción de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa por transducción de P1 de la mutación adhE de la cepa TC20 (Zhou et al., 2003);

(e)

deleción de la quinasa de acetato (ackA) usando la mutación de la cepa SZ61 (cepa W3110) (Zhou et al., 2003);

(f)

deleción de los genes antibióticos que se usaron para la selección por recombinasa FLP (Zhou et al., 2003); y

(g)

durante la deleción de los genes antibióticos del paso (f), deleción de un segmento interno de casAB (o deleción de un segmento interno del gen casAB después del paso de deleción de los genes antibióticos).

[0026] Las formas de realización relacionadas con la invención además incluyen la transformación de la cepa SZ132 para eliminar todos los genes foráneos. En una forma de realización, se eliminaron los genes celY de Klebsiella oxytoca y Erwinia chrysanthemi de la cepa SZ132 por recombinación homóloga usando ADN lineal; luego la recombinasa FLP se usó para eliminar los genes antibióticos usados durante la construcción de la cepa SZ132. La cepa resultante, SZ186 (nº de depósito: NRRL B-30862), contiene sólo los genes de E. coli nativos.

[0027] Otra forma de realización de la presente invención proporciona una cepa B de E. coli ("TG103" nº de depósito: NRRL B- 30864) que se crea genéticamente para mejorar el crecimiento celular y la producción del isómero L de ácido láctico en varios medios. En una forma de realización, la cepa TG103 se puede construir mediante los siguientes pasos:

(a)

crear genéticamente la cepa SZ186 utilizando métodos como los descritos en este caso;

(b)

someter a la cepa SZ186 a cultivo en serie para seleccionar crecimiento aumentado y/o producción de ácido láctico aumentada, donde las cepas seleccionadas son la cepa SZ194 (nº de depósito: NRRL B-30863);

(c)

integrar un gen de ácido láctico L heterólogo y un marcador de canamicina en el gen nativo 1dhA (D-lactatodeshidrogenasa) de SZ194 y eliminar la parte central de la región codificante para producir TG101;

(d)

eliminar los genes antibióticos por recombinasa FLP para producir TG102 (número de depósito: NRRL B30921); y

(e)

someter a la cepa TG102 a transferencia en serie durante varios días (tal como aproximadamente de 7 a 21 días, preferiblemente durante 13 días), con una dilución 1:100 de caldo de cultivo previamente inoculado cada día y seleccionar las cepas que demuestran crecimiento mejorado y/o producción de ácido láctico L aumentada, donde las cepas seleccionadas son TG103.

[0028] Según ciertas formas de realización de la presente invención, el crecimiento aumentado y la producción de ácido láctico aumentada están enlazadas. El proceso de coselección para cepas con crecimiento y producción de ácido láctico mejorados se denomina "evolución metabólica". Ciertas formas de realización de la invención también proporcionan la inactivación o la deleción de determinados genes en los organismos genéticamente modificados que proporciona esta solicitud. En un aspecto de la invención, los genes se eliminan para inactivar la actividad deseada. Las deleciones proporcionan estabilidad máxima porque no hay posibilidad de que una mutación inversa restablezca la función. Alternativamente, los genes se puede inactivar por inserción de secuencias de ácido nucleico que disgregan la función y/o la expresión del gen (p. ej., transducción de P1 u otros métodos conocidos en la técnica). La inactivación o la deleción de una o más secuencia de polinucleótidos particulares como se ha tratado aquí puede también denominarse "modificaciones" genéticas.

[0029] El vector usado para introducir genes específicos en un microorganismo huésped puede ser cualquier vector siempre que pueda replicarse en el microorganismo huésped. Los vectores de la presente invención puede ser operables como vectores de clonación o vectores de expresión en la célula huésped seleccionada. Los profesionales expertos en la técnica conocen numerosos vectores, y la selección de un vector y célula huésped apropiados es cuestión de elección. Los vectores pueden ser, por ejemplo, bacteriófagos, plásmidos, virus o híbridos de los mismos, tales como los descritos en Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1995; Miller, J.H., 1992; Sambrook y Russell, 2001. Además, los vectores de la invención pueden ser vectores de no fusión o vectores de fusión.

[0030] Dentro de cada vector específico, se pueden seleccionar varios sitios para insertar una secuencia de nucleótidos de interés. Estos sitios normalmente están designados por la enzima de restricción o endonucleasa que los corta. El vector se puede digerir con una enzima de restricción coincidente con la secuencia terminal del gen y las secuencias se pueden ligar. El ligamiento normalmente se logra usando una ligasa tal como T4 DNA ligasa.

[0031] El sitio particular elegido para la inserción del fragmento nucleótido seleccionado en el vector para formar un vector recombinante se determina por una variedad de factores. Estos incluyen tamaño y estructura del polipéptido que se va a expresar, susceptibilidad del polipéptido deseado para degradación enzimática por los componentes de la célula huésped y contaminación por sus proteínas, características de expresión tales como la ubicación de los codones de inicio y de parada y otros factores reconocidos por los expertos en la técnica. Ninguno de estos factores por sí solo controla absolutamente la elección del sitio de inserción para un polipéptido particular. Más bien, el sitio elegido refleja un equilibrio de estos factores y no todos los sitios pueden ser igualmente eficaces para una proteína dada.

[0032] En la práctica de esta invención se pueden emplear una variedad de sistemas de expresión vector-célula huésped. Las cepas de bacterias, tales como E. coli, son particularmente útiles para la producción de ácido láctico en la práctica de la invención. No obstante, la nueva invención descrita en la presente se puede aplicar con numerosos huéspedes que serían deseables para varios esquemas de producción de ácido láctico. Las cepas huésped pueden ser de origen bacteriano, fúngico o de levadura. Factores que se puede considerar en la elección de las cepas huésped incluyen rango de sustrato, vigor, tolerancia al azúcar, tolerancia a la sal, tolerancia a la temperatura, tolerancia al pH y tolerancia al lactato. La determinación del sistema más apropiado huésped-vector está en la habilidad del experto en la técnica.

[0033] Los métodos para deleción e integración cromosómica y los genes de resistencia antibiótica eliminables se han descrito previamente (Causey et al., 2004; Datsenko y Wanner, 2000; Martinez-Morales et al., 1999; Zhou et al., 2003). Cualquiera de ellos o combinación de tales métodos conocidos se puede emplear en la práctica de la presente invención.

[0034] Este promotor se puede usar como promotor para la expresión del gen(s) que se va a presentar en el microorganismo huésped (por ejemplo, los genes casAB de K. oxytoca o celY de E. chrysanthemi) cuando un promotor específico para el gen funciona en las células huésped. Alternativamente, también es posible enlazar un promotor foráneo a un ADN que codifica el gen para obtener la expresión bajo el control del promotor. Se puede usar como tal promotor, cuando se usa una Escherichia bacterium como huésped, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor tac, el promotor PR y el promotor PL de fago de lambda, el promotor tet, el promotor amyE, el promotor spac, etcétera. Además, también es posible usar un vector de expresión que contenga un promotor como pUC19, e insertar un fragmento de ADN, codificando por ejemplo casAB de K. oxytoca, en el vector de modo que el fragmento se pueda expresar bajo el control del promotor.

[0035] Los métodos para preparación de ADN cromosómico, PCR, preparación de ADN de plásmido, digestión y ligamiento de ADN, transformación, diseño y síntesis de oligonucleótidos usados como cebadores, etcétera, pueden ser métodos usuales bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos se describen en, por ejemplo, Sambrook,

J. et al. (1989), entre otros.

[0036] El ácido láctico se puede producir permitiendo que un microorganismo transformado, como se ha descrito anteriormente, convierta glucosa y/o sacarosa en ácido láctico y recolectando el ácido láctico producido. En un aspecto de la invención, el ácido láctico se puede producir a niveles mayores de 0,5M cuando los organismos transformados se cultivan en un medio de sales minerales, tal como el medio de sales mineral NBS.

[0037] Los vectores de la invención se pueden replicar de manera autónoma o integrar en el genoma del huésped. La integración ocurre típicamente por recombinación homóloga (por ejemplo, marcador seleccionable de arginina que se integra en el gen de arginina cromosómica) o en un sitio cromosómico no relacionado con ningún gen del vector. La integración puede ocurrir tanto por un evento único como por un evento de doble cruce. También es posible tener cualquier número de estos tipos de integración y de replicación ocurriendo en el mismo microorganismo construido.

[0038] En formas de realización determinadas, el cultivo de los microorganismos creados genéticamente de la invención se realiza bajo condiciones aeróbicas durante aproximadamente de 0,5 a 240 horas. La temperatura de cultivo se controla preferiblemente a aproximadamente de 25°C a 45°C y el pH se controla preferiblemente a 5-8 durante el cultivo. Las sustancias inorgánicas u orgánicas, acídicas o alcalinas, así como el gas de amoníaco o similares se pueden usar para ajustar el pH.

[0039] El microorganismo de la presente invención se puede obtener por transformación de una bacteria perteneciente a Escherichia para expresar determinadas enzimas útiles en la producción de ácido láctico. En una forma de realización preferida, una bacteria perteneciente a Escherichia que se puede usar en la presente invención es Escherichia coli.

[0040] En otras formas de realización de la invención, la bacteria que se puede usar en la presente invención incluye, entre otras, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citri, etcétera.

[0041] El ácido láctico se puede producir en una mezcla reactiva poniendo en contacto un cultivo que contiene microorganismos transformados preparado según la presente invención con sacarosa y/o glucosa. En otras formas de realización de la invención, se separan células y se recogen de un cultivo de microorganismos transformados; las células de microorganismos transformados procesadas se someten a tratamiento de acetona o liofilización; un extracto libre de células preparado a partir de tales células de microorganismos transformados o células procesadas; fracciones tales como fracciones de membrana divididas de tal extracto libre de célula o materiales inmovilizados se pueden producir mediante la inmovilización de células de microorganismos transformados, células procesadas, extractos y fracciones libres de células, cualquiera de los cuales, de forma independiente o combinada, entran en contacto con sacarosa y/o glucosa para producir ácido láctico. El microorganismo puede consistir en una especie de microorganismo,

o se puede usar como una mezcla arbitraria de dos o varios tipos de microorganismos.

[0042] Los parámetros de fermentación dependen del tipo de organismo huésped usado para producir la enzima recombinante. El medio de crecimiento puede ser mínimo/definido o completo/complejo. Las fuentes de carbono fermentables podrían incluir azúcares de hexosa y de pentosa, almidón, celulosa, xilano, oligosacáridos y combinaciones de los mismos. Una forma de medios de crecimiento que se puede usar conforme a la presente invención incluye caldo Luria-Bertani modificado (LB) (con 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco y 5 g de cloruro sódico por litro) como está descrito por Miller J.H. (1992). En otras formas de realización de la invención, los cultivos de las cepas construidas de la invención se pueden cultivar en el medio de sales minerales NBS (como se describe por Causey et al., 2004) y suplementar con 2% a 20% de azúcar (p/v) o bien 5% o 10% de azúcar (glucosa o sacarosa). Los microorganismos se puede cultivar en el medio de sales minerales NBS. El medio de sales minerales NBS comprende, consiste esencialmente en o consiste en los siguientes componentes (por litro): 3,5 g de KH2PO4; 5,0 g de K2HPO4; 3,5 g de (NH4)2HPO4; 0,25 g de MgSO4 ·7 H2O; 15 mg de CaCl2 ·2 H2O; 0,5 mg de tiamina; y 1 ml de caldo de metal traza, glucosa (p. ej., 2% en placas o 3% en el caldo) y 1,5% de agar (para placas). El caldo de metales traza se prepara en 0,1 M de HCl y comprende, consiste esencialmente en o consiste en (por litro): 1,6 g de FeCl3; 0,2 g de CoCl2 ·6 H2O; 0,1 g de CuCl2; 0,2 g de ZnCl2 ·4 H2O; 0,2 g de NaMoO4; 0,05 g de H3BO3. Se puede añadir ácido 4-Morfolinopropanosulfónico (0,1 M, pH 7,1) tanto a los líquidos como a los medios sólidos (esterilizado por filtro) cuando se necesita para el control del pH (y se incluye opcionalmente en el medio usado para fermentaciones de 10 litros). El medio mínimo se puede preparar también usando succinato (1 g·litro-1) como única fuente de carbono (sustrato no fermentable) y se puede agregar como suplemento al medio mínimo de glucosa cuando es necesario. En formas de realización determinadas, los antibióticos se puede incluir como necesarios para construir la cepa.

[0043] El crecimiento y la producción del lactato se puede realizar en fermentaciones de lote normales, fermentaciones alimentadas o fermentaciones continuas. En determinadas formas de realización, es deseable realizar fermentaciones con oxígeno reducido o condiciones anaeróbicas para ciertos huéspedes. En otras formas de realización, la producción de lactato se puede realizar con oxígeno; y, opcionalmente con el uso de fermentadores de elevación por aire o equivalentes.

[0044] El pH de la fermentación debería ser suficientemente alto para permitir el crecimiento y la producción de lactato mediante el huésped. El ajuste del pH del caldo de fermentación se puede realizar usando agentes neutralizantes tales como carbonato cálcico o hidróxidos. Alternativamente, el ácido láctico se puede eliminar continuamente durante la fermentación usando métodos tales como tecnología de membrana, electro-diálisis, extracción de solvente y resinas absorbentes. La selección y la incorporación de cualquiera de los métodos fermentativos anteriores es altamente dependiente de la cepa huésped y del proceso aguas abajo preferido.

[0045] Varias formas de realización no exclusivas de la presente invención incluyen:

1.

Una cepa de E. coli modificada genéticamente que comprende las siguientes modificaciones genéticas para la cepa de E. coli KO11 (ATCC 55124): a) inserción del gen casAB de Klebsiella oxytoca detrás del codón de terminación de lacY; b) integración del gen celY de Erwinia chrysanthemi en el gen frdA; c) inactivación o deleción del focA-Z. mobilis pdc-adhB-pflB; d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativo; y e) inactivación o deleción del gen de acetato-quinasa (ackA);

2.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además genes de resistencia antibiótica inactivados o eliminados;

3.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chrysanthemi se inactivan o eliminan en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción;

4.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 2, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chrysanthemi se inactivan o eliminan en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción;

5.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 2, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente;

6.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1 o forma de realización 3, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente;

7.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 4, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente;

8.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, donde los genes antibióticos se eliminan con recombinasa FLP;

9.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 7, donde dicha cepa de E. coli modificada genéticamente es SZ186 (NRRL B-30862):

10.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 5, donde dicha cepa de E. coli modificada genéticamente es SZ132 (NRRL B-30861);

11.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 1, 2, 3, 4 o 5, donde el gen mgsA de dicha cepa se inactiva o elimina de dicha cepa de E. coli genéticamente modificada;

12.

Una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la cepa de E. coli SZ194 (NRRL B30863) en la que el gen mgsA se ha inactivado o eliminado;

13.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente;

14.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 13, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es TG112 (NRRL B-30926), TG113 (NRRL B-30927) o TG114 (NRRL B-30928):

15.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 11 o 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además un gen ldhA inactivado o eliminado nativo y un gen heterólogo insertado de manera recombinante que codifica una lactato deshidrogenasa L-específica;

16.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 15, donde dicho gen heterólogo de lactato dehidrogenasa L-específica es un gen ldhL (por ejemplo, un gen ldhL obtenido de P. αcidilactici);

17.

La cepa de E. coli genéticamente modificada según la forma de realización 15 o forma de realización 16, donde dicha cepa se desarrolla metabólicamente;

18.

Una cepa de E. coli genéticamente modificada seleccionada de TG112 (NRRL B-30926), TG113 (NRRL B30927) o TG114 (NRRL B-30928), SZ194 (NRRL B-30863), SZ132 NRRL B-30861), SZ186 (NRRL B-30862), o TG103 (NRRL B- 30864);

19.

Un método de cultivo de una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la inoculación de un medio de cultivo con una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las formas de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y cultivo de dicha cepa de E. coli genéticamente modificada;

20.

Un método para producir D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico que comprende cultivo de una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las formas de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 bajo condiciones que permitan la producción de ácido D-(-)-láctico y opcionalmente neutralización del ácido D-(-)-láctico para formar D-(-)-lactato;

21.

El método según la forma de realización 20, donde dicha cepa o cepas de E. coli genéticamente modificadas se seleccionan de TG112 (NRRL B-30926), TG113 (NRRL B-30927), TG114 (NRRL B-30928) o SZ194 (NRRL B-30863);

22.

Un método para producir L-(+)-lactato o ácido L-(+)-láctico que comprende cultivo de una o más cepas de

E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las formas de realización 15, 16 o 17 bajo condiciones que permitan la producción de ácido L-(+)-láctico y opcionalmente neutralización del ácido L-(+)-láctico para formar L-(+)-lactato;

23.

El método según la forma de realización 22, donde dicha cepa o cepas genéticamente modificadas de E. coli son TG103 (NRRL B-30862), TG105 (NRRL B-30862), TG106 (NRRL B-30862), TG107 (NRRL B-30862), o TG108 (NRRL B-30862);

24.

El método según cualquiera de las formas de realización 19, 20, 21, 22 o 23, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se cultiva en un medio de sales minerales;

25.

El método según la forma de realización 24, donde el medio de sales minerales comprende entre 2% y 20% (p/v) de un azúcar;

26.

El método según la forma de realización 25, donde el medio de sales minerales contiene 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% o 20% (p/v) de un azúcar;

27.

El método según la forma de realización 25 o 26, donde el azúcar es glucosa o sacarosa o una combinación de glucosa y de sacarosa;

28.

El método según la forma de realización 20, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada como se establece en la forma de realización 11 se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de D-(-)-lactato

o ácido D-(-)-láctico quiralmente puro;

29.

El método según la forma de realización 22, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada como se establece en la forma de realización 15, 16 o 17 se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de L(+)-lactato o L- (+)-láctico ácido quiralmente puro;

30.

El método según la forma de realización 21, donde dicho método produce D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico quiralmente puro;

31.

El método según la forma de realización 23, donde dicho método produce L-(+)-lactato o ácido L-(+)-láctico quiralmente puro;

32.

El método según la forma de realización 28, 29, 30 o 31, que comprende además el paso de purificación del lactato quiralmente puro (L-(+)-lactato o D-(-)-lactato);

33.

El método según cualquiera de las formas de realización 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, donde el lactato (p. ej., el L-(+)-lactato o D-(-)-lactato) se produce en concentraciones de al menos 0,5M;

34.

El método según la forma de realización 33, donde el medio de cultivo es un medio de sales minerales químicamente definido tal como el medio de sales minerales NBS;

35.

El método según la forma de realización 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, donde el rendimiento del ácido láctico (ácido L-(+)-láctico o ácido D-(-)-láctico) es al menos de o superior a (o superior a

o igual a) 90%;

36.

El método según la forma de realización 35, donde el rendimiento es de al menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% o 99%;

37.

El método según la forma de realización 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36, donde no hay contaminación detectable de una forma estereoisomérica de ácido láctico o lactato con la otra forma estereoisomérica (p. ej., la pureza quiral del estereoisómero específico es de al menos, mayor de (o mayor de o igual a) 99,9%)); o

38.

Una composición que comprende una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las formas de realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y el medio.

[0046] A continuación se muestran los ejemplos que ilustran los procedimientos para la práctica de la invención. Estos ejemplos no deberían interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente son en volumen a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1

Preparación y análisis de las cepas de E. coli SZ132 y SZ 186

[0047] Las cepas de E. coli usadas en este ejemplo se enumeran en la Tabla 1. La cepa SZ63 es un derivado de E. coli K-12 (ATCC 27325). KO11 (ATCC 55124) es un derivado de E. coli B (ATCC 11303) que contiene los genes de producción de etanol de Zymomonas mobilis integrados en el gen pflB.

Tabla 1. Cepas de E. coli

Cepas DH5α S17-1 TC20 SZ31 SZ61 SZ63 NC3 KO11 LY52 SZ132 SZ186

Características relevantes ΔlαcZ M15 recA thi pro recA hsdR RP4-2-tet::Mu aphA::Tn7 λpir ΔαdhE::FRT-tet-FRT W3110, Δ(focA-pflB)::FRT-kan-FRT W3110, ΔackA::FRT-tet-FRT W3110, ΔfocA-pflB::FRT Δfrd ΔadhE::FRT ΔackA::FRT E. coli B/r, hsdR pflB::Z. mobilis pdc adhB cat, Δfrd KO11, frdA::K. oxytoca casAB, lacY::E. chrysanthemi celY LY52, Δ(focA-pdc-adhB-pflB) ΔadhE::FRT ΔackA::FRT, ΔcasA SZ132, ΔK. oxytoca casAB ΔE. chrysanthemi celY Fuentes Invitrogen Simon et al. 1983 Zhou et al. 2003 Zhou et al. 2003 Zhou et al. 2003 Zhou et al. 2003 Dien et al. 2001 Ohta et al. 1991 Este ejemplo Este ejemplo Este ejemplo

[0048] Se realizaron cultivos a 37°C en el caldo Luria-Bertani (LB) modificado (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco, 5 g de cloruro sódico) o en el medio de sales minerales NBS suplementado con 5% o 10% de azúcar (glucosa o sacarosa). Se incluyeron antibióticos según fue necesario para construcciones de cepas.

[0049] Se usaron métodos estándar para construcción de plásmidos. Los métodos para deleciones cromosómicas, integración y los genes de resistencia antibiótica eliminables se han descrito previamente. Se usaron las cepas de E. coli DH5α y S17-1 como huéspedes para la construcción de plásmidos. La cepa NC3 se usó como huésped intermedio para minimizar los problemas asociados a las enzimas de restricción durante la transducción de P1 desde las cepas K12 a las cepas B (Dien et al., 2001).

[0050] Se prepararon cultivos de siembra de la manera descrita previamente por Shukla et al. (2004) y Zhou et al., (2003) y se usaron para inocular pequeños recipientes de fermentación (350 ml de volumen de trabajo, 35°C, agitación a 150 r.p.m.). El caldo se mantuvo a pH 7,0 mediante la adición automática de 6 N de KOH. Los datos mostrados representan un promedio de 2 o varias réplicas. Las barras que denotan el error típico del medio se incluyen para promedios de 3 o más fermentaciones. La productividad máxima volumétrica para el lactato se estimó con respecto a la región más empinada de cada gráfico. No se incluyó ninguno de los antibióticos durante la producción de los cultivos de siembra o en los caldos de fermentación.

[0051] La masa celular se estimó por densidad óptica de medición a 550 nm (330 mg de célula seca p/L a 1,0 OD550nm). La producción de ácido orgánico total (principalmente lactato) se midió por consumo de base (KOH). Los productos acídicos se analizaron al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia. Se midió el etanol por cromatografía de gases.

Construcción de la cepa SZ132

[0052] La cepa LY52 se construyó a partir de KO11 mediante la integración de los genes casAB de Klebsiella oxytoca (Moniruzzaman et al. 1997) para utilización de celobiosa detrás del codón de terminación de lacY y la integración del gen celY de Erwinia chrysanthemi que codifica la endoglucanasa (Zhou e Ingram, 1999) en el gen frdA. Las mutaciones previamente caracterizadas en la K-12 de E. coli (cepa W3110) usada para construir SZ63 (Zhou et al., 2003) para la producción de lactato fueron consecutivamente transducidas a los genes LY52. Z. mobilis para la producción de etanol y fueron eliminadas por transducción de P1 de la deleción ΔfocA pflB de SZ31. La alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa se inactivó por transducción de P1 de la mutación adhE de TC20. Se eliminó la acetato quinasa (ackA) usando la mutación en SZ61. Los genes antibióticos usados para la selección se eliminaron por recombinasa FLP (Zhou et al., 2003). Durante la deleción de los genes antibióticos con recombinasa FLP, también se eliminó un segmento interno de casAB. El análisis de secuencias de casAB y del promotor reveló la presencia de regiones de ADN muy similares al sitio de reconocimiento para recombinasa FLP y se sospecha que son responsables de esta deleción.

[0053] La cepa resultante se aclimató a los medios mínimos por subcultivo consecutivo con un 1% de inóculo. Tanto el cultivo celular como la producción de lactato mejoró durante estas transferencias. El caldo de la última transferencia se estrió en el medio sólido para el aislamiento de los clones. Se seleccionó uno y se designó SZ132 (NRRL B-30861).

Construcción de la cepa SZ186

[0054] Se construyó otro derivado de SZ132 en el que se eliminaron todos los genes foráneos. Los genes casAB de K. oxytoca y celY de E. chrysanthemi se eliminaron por recombinación homóloga usando ADN lineal. Se usó la recombinasa FLP para eliminar los genes antibióticos usados durante las construcciones. La cepa resultante, SZ186 (NRRL B-30862), contiene sólo genes de E. coli nativos.

Análisis de la producción de ácido láctico

[0055] Las mutaciones genéticas análogas se construyeron en derivados de E. coli K-12 y E. coli B para producir SZ63 (Zhou et al., 2003) y SZ132, respectivamente. SZ132 fue superior a SZ63 en cuanto a crecimiento celular y producción de lactato (isómero D) (véase la figura 1A). En el medio rico, SZ132 completó la fermentación del 10% de glucosa en 48 h para producir más de 1 mol de lactato/L de caldo de fermentación, el doble que el proporcionado previamente para las cepas basadas en K-12 de E. coli. Las fermentaciones con SZ63 y 10% de glucosa se estancaron después de 72 h y se produjeron sólo 840 mmoles de lactato/L de caldo después de 120 h. En medios ricos, los rendimientos de lactato fueron más altos para SZ132 (95%) que para la cepa K-12 SZ63 (88%). La productividad máxima volumétrica para SZ132 fue de 75 mmoles/l h, 76% más alta que para SZ63 (Tabla 2).

Tabla 2. Resumen de fermentaciones de ácido láctico

Cepas de E. coli

Substrato Ácido láctico producido Co-productos producidos (mM)

Concentración (mM)

Concentración ajustada a la base (mM) Rendimiento (%) Succinato Acetato Etanol

SZ132

NBS 10% Glu 556,01 ± 0,54 614,09 ± 0,54 91 32,11 ± 1,49 13,95 ± 0,57 ≤ 1

SZ132

NBS 10% Glu + Betaína 792,23 ± 8,67 930,30 ± 8,67 86 78,92 ± 2,45 11,56 ± 0,75 ≤ 1

SZ132

NBS 10% Sac 556,88 ± 33,21 609,78 ± 33,21 92 2,79 ± 0,02 ≤ 1 ≤ 1

SZ132

NBS 10% Sac + Betaína 889,06 ± 157,53 1045,95 ± 157,53 88 38,00 ± 7,33 12,24 ± 3,72 ≤ 1

SZ186

NBS 10% Glu 600,41 ± 2,67 670,31 ± 2,94 99 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ186

NBS 10% Glu + Betaína 658,75 ± 21,37 744,39 ± 24,15 98 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ186

NBS 10% Sac 573,27 ± 21,98 635,76 ± 24,38 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ186

NBS 10% Glu + Betaína 638,41 ±33,59 718,06 ± 38,19 96 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194 (Nº depósito: NRRL B30863)

NBS 10% Glu + Betaína 717,60 + 51,51 823,85 + 65,48 96 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH 6,5 10% Glu + Betaína 607,52 + 6,17 676,77 + 6,87 92 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH 7,0 10% Glu + Betaína 714,06 + 7,38 813,35 + 9,61 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH 7,5 10%Glu + Betaína 913,16 + 25,73 1070,19 + 27,57 97 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

LB pH 8,0 10% Glu + Betaína 903,22 + 21,51 1060,38 + 25,26 96 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH 7,5 10% Gu + Betaína 864,31 + 4,93 1019,89 + 5,81 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH 7,5 12% Glu + Betaína 1012,18 + 27,41 1227,60 + 31,16 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH 7,5 14% Glu + Betaína 1001,08 + 9,48 1217,02 + 13,51 95 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

SZ194

NBS pH 7,5 6+3+3% Glu + Betaína 1003,65 + 12,74 1216,45 + 16,48 93 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1

[0056] En el medio de sales minerales NBS que contiene 5% de glucosa, el rendimiento celular y la productividad volumétrica para SZ132 fueron el doble que los de SZ63 (véase la figura 1B). La cepa SZ132 completó la fermentación del 5% de glucosa en 36 h, menos de 1/4 del tiempo requerido por SZ63. Bajo estas condiciones, el rendimiento celular

5 y la productividad volumétrica para fermentaciones con el medio de sales minerales NBS fueron sólo del 25-35% de aquellos con el medio rico y 10% de glucosa.

[0057] Ni la cepa SZ132 ni la SZ63 completaron la fermentación del 10% de glucosa en el medio de sales minerales NBS dentro de 144 h (véase la figura 1C). Los rendimientos de lactato para ambas cepas fueron superiores al 90%

10 basados en azúcar metabolizado. Con el medio de sales minerales NBS que contiene 10% de glucosa, el rendimiento celular (0,83 g/1), la producción de lactato (700 mmoles/l de caldo de fermentación) y la productividad volumétrica (11,2 mmoles lactato/l h) para SZ132 fueron de aproximadamente dos veces más altos que para SZ63. Con el medio de sales minerales NBS y 10% de glucosa, la productividad volumétrica para SZ132 fue menos del 20% de la observada en el medio rico.

15 [0058] La sacarosa se fermentó más lentamente que la glucosa en el medio rico y en el medio de sales minerales NBS. Estudios precedentes han mostrado que SZ63 (pLO13501) requirió 36 h para completar la fermentación del 5% de sacarosa en el medio rico pero que fue incapaz de completar la fermentación del 10% de sacarosa en este medio. SZ132 completó la fermentación del 10% de sacarosa en el medio rico en 120 h y produjo más de 1 mol de lactato/l de

20 caldo de fermentación (véase la figura 1D), casi dos veces más que el proporcionado previamente por SZ63 conteniendo el plásmido de sacarosa.

[0059] La productividad volumétrica para SZ132 en el medio de sales minerales NBS que contiene 10% de sacarosa (9,3 mmoles/l h) fue 1/3 de la observada en el medio rico con sacarosa, menos de 1/8 de la observada en el medio rico 25 conteniendo 10% de glucosa (Tabla 2). Aunque el 5% de sacarosa se fermentó hasta el final en el medio de sales minerales NBS en 72 h (véase la figura 1E), el 10% de sacarosa no se metabolizó completamente en este medio incluso

con tiempos de incubación extendidos. Basado en azúcar metabolizada, los rendimientos para sacarosa oscilaron de 86% a 93% en ambos medios.

[0060] Estos resultados demuestran que se pueden producir altos niveles de ácidos orgánicos a partir de glucosa y/o sacarosa por cepas modificadas de E. coli B. La productividad volumétrica máxima se estimó en 75 mmoles lactato/l h en el medio rico (LB), más de 3 veces superior a la del medio de sales minerales NBS. Quedan muchas oportunidades de mejora. Los tiempos de incubación requeridos para completar el metabolismo del 10% de sacarosa fueron 3 veces más largos que para el 10% glucosa en el medio complejo, más largos aún en el medio de sales minerales. Puede ser esencial reducir los tiempos de fermentación sin la costosa adición de nutrientes complejos. La identificación de los constituyentes que aumentan el crecimiento y la productividad podría reducir sustancialmente los costes asociados a la fermentación y ofrecer también una oportunidad para reducir los gastos asociados a la purificación de lactato y el tratamiento de desechos.

[0061] Las figuras 2-5 ilustran el progreso de la producción de ácido láctico (isómero D) mediante varias formas de realización, a saber SZ132; SZ186 y SZ194 (nº de depósito: NRRL B-30863) de la invención bajo varias condiciones de fermentación en el medio de sales minerales NBS.

Ejemplo 2

Preparación de la cepa SZ 194 de E. coli

[0062] Las cepas y los plásmidos usados en la preparación de la cepa SZ194 se recogen en la Tabla 3. Se realizaron cultivos a 37°C en el caldo de Luria modificado (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g extracto de levadura Difco, 5 g de cloruro sódico) (Miller, J.H. 1992 A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) o en el medio de sales minerales NBS (Causey, T.B. et al. 2004, "Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2235-2240) suplementados con 1 mM de betaína y 2% -14% (p/v) de azúcar (glucosa o sacarosa). Cuando fue necesario, se usó ampicilina (50 mg/L) y canamicina (50 mg/L) para construcciones de cepa.

Tabla 3. Cepas de E. coli y Plásmidos

Cepas SZ132 SZ136 SZ162 SZ186 SZ186

Características relevantes Δ(focA-Z. mobilis pdc-adhB-pflB) adhE::FRT Δack::FRTΔfrd, frdA:: E. chrysanthemi celY lacY::K. oxytoca casAB SZ132, seleccionada para crecimiento y fermentación rápidos en 10% de sacarosa SZ136, Δ frdBC::FRT Δ adhE::FRT SZ162, Δ casAB::FRT Δ celY::FRT SZ186, seleccionada para crecimiento y fermentación rápidos en 10% de glucosa Fuentes Zhou et al. (2005) Este ejemplo Este ejemplo Este ejemplo Este ejemplo

Plásmidos pKD46 pFT-A pLOI2511 pLOI3924

Características relevantes Bla γ β exo (recombinasa Red), replicón pSC101 condicional de temperatura Bla flp replicón pSC101 condicional de temperatura colE1, FRT-kan-FRT, bla colE1, bla kan lacY'-FRT-Kan-FRT-lacYA Fuentes Datsenko y Wanner (2000) Posfai et al. (1997)

[0063] Se usaron métodos estándar para amplificación de ADN, digestión enzimática, purificación y construcción plásmida (Miller et al., 1992; Sambrook y Russell, 2001). Los métodos para la deleción del gen cromosómico y la integración se han descrito previamente (Causey et al., 2004; Datsenko and Wanner, 2000; Martinez-Morales et al., 1999; Zhou et al., 2003a).

[0064] El plásmido pLOI3924 se construyó para facilitar la deleción de los genes casAB por clonación de los genes lacY y lacA usando ORFmers (Sigma-Genosis, The Woodlands, TX) e inserción del casete FRT-kan-FRT (digestión de SmaI) a partir de pLOI2511 entre el sitio N del carboxitérmino de lacY y el N-terminal ATG de lacA. El fragmento amplificado (ORFmer sentido para lacY; ORFmer antisentido para lacA) de este plásmido se usó para la integración cromosómica, eliminando los genes casAB. Los cebadores híbridos que se usaron para deleciones de gen adicionales y que contenían la secuencia correspondiente a aproximadamente 45 pares de bases del principio o del final del gen objetivo más 20

pares de bases de la secuencia de ADN correspondiente al casete de canamicina flanqueada por FRT se describen en la Tabla 4.

Tabla 4. Cebadores

Cebador

SEQ ID nº: Secuencia

cebador de sentido para deleción de frdBC

1

cebador de antisentido para deleción de frdBC

2

cebador de sentido para deleción de adhE

3

cebador de antisentido para deleción de adhE

4

cebador de sentido para deleción de celY

5

cebador de antisentido para deleción de celY

6

[0065] A menos que se especifique lo contrario, el medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) que contiene 1 mM de betaína y 10% de azúcar (glucosa o sacarosa) se usó en todas las fermentaciones (pH 7,0). Los cultivos de siembra se prepararon tal y como se ha descrito previamente (Zhou et al., 2003) y se usaron para inocular recipientes de fermentación de 500 ml (350 ml de volumen de trabajo, 35°C, 150 r.p.m. de agitación) a una densidad inicial de 33 mg cdw l-1. Donde está indicado, también se agregó betaína (1 mM). El pH del caldo se mantuvo agregando automáticamente 6 N de KOH. Se usó un total de 12% (p/v) de glucosa en las fermentaciones de flujo continuo (6% + 3% + 3%) de la siguiente manera: 308 ml de medio NBS conteniendo 21 gramos de glucosa. Después de 24 h y 48 h, se fue añadiendo poco a poco 21 ml de 50% de glucosa en cada vaso.

[0066] Las células de las fermentaciones controladas por pH se transfirieron en serie en varios tiempos (24 o 48 h) para facilitar la evolución metabólica a través de la selección basada en el crecimiento. Los cultivos secuencialmente transferidos se inocularon a una densidad inicial de 33 mg cdw l-1. A los clones aislados al final de las selecciones se les asignaron nuevas designaciones de cepa.

[0067] La masa celular se estimó por densidad óptica de medición a 550 nm usando un espectrofotómetro Bausch & Lomb Spectronic 70. La producción de ácido orgánico total (principalmente lactato) se estimó por consumo de base (KOH) para mantenimiento de pH. Los productos acídicos y la pureza quiral se analizaron al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alto rendimiento (Zhou et al., 2003a). Los datos trazados representan un promedio de 2

o más réplicas. Las barras que denotan la desviación típica se incluyen para promedios de 3 o más fermentaciones.

Análisis de la producción de ácido láctico

[0068] La betaína, un osmolite protector, fue altamente beneficiosa para el crecimiento celular y la producción de lactato por SZ132 en el medio de sales minerales que contenía altas concentraciones de azúcar, supuestamente debido a la insuficiente división de carbono en la biosíntesis de osmolites nativos tales como glutamato y trehalosa (Purvis et al., 2005). Las transferencias en serie de SZ132 se llevaron a cabo en el medio de sales minerales conteniendo 10% de sacarosa para seleccionar las cepas con rendimiento equivalente en ausencia de betaína. La producción de energía para el crecimiento en la cepa SZ132 depende del flujo glicolítico con lactato como ruta dominante para la oxidación NADH, proporcionando una selección basada en el crecimiento. El crecimiento y la producción de ácido (consumo de base) mejoró firmemente durante las transferencias en serie. En las transferencias finales, el 10% de sacarosa se fermentó hasta el final sin betaína añadida. Se aisló un clon de este cultivo y se denominó cepa SZ136. Esta cepa produjo el doble de rendimiento celular que la progenitora, SZ132, y títulos 3 veces más altos de lactato después de 96

h. No obstante, SZ136 también produjo niveles más altos de succinato y de etanol que SZ132 (Tabla 5), reduciendo el rendimiento de lactato (basado en azúcar metabolizado).

Tabla 5. Productos de fermentaciones de glucosa

Cepa

Condiciones a Lactato Coproductos (mmol l-1)

mmol l-1

Rendimiento (%) b Succinato Acetato Etanol

SZ132

NBS + betaína 930 ± 9 86 79 ± 2 12 ± 1 < 1

SZ136

NBS 739 67 126 8 115

SZ162

NBS 660 ± 27 96 < 1 < 1 < 1

SZ186

NBS 670 ± 3 99 < 1 < 1 < 1

SZ186

NBS + betaína 744 ± 24 98 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS + betaína 824 ± 65 96 < 1 < 1 < 1

SZ194

Caldo de Luria pH 6,5 677 ± 7 92 < 1 < 1 1

SZ194

Caldo de Luria pH 7,0 813 ± 10 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

Caldo de Luria pH 7,5 1070 ± 28 97 < 1 < 1 < 1

SZ194

Caldo de Luria pH 8,0 1060 ± 25 96 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS, pH 7,5 + betaína 1020 ± 6 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS pH7,5 12% glucosa + betaína 1228 ± 31 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS, pH 7,5 14% glucosa + betaína 1217 ± 14 95 < 1 < 1 < 1

SZ194

NBS, pH7,5 glucosa (6+3+3%) + betaína 1216 ± 17 93 < 1 < 1 < 1

a Medio de sales minerales NBS que contiene 10% de glucosa (pH 7,0) a menos que se especifique lo contrario. Donde se indique, también se añadió 1 mM de betaína. b Los rendimientos están basados en azúcar metabolizada asumiendo un rendimiento teórico máximo de 2 moles de lactato por mol de hexosa (igual conversión de peso).

[0069] Las mejoras en el crecimiento en SZ132 en 10% (p/v) de sacarosa parecen haber estado acompañadas de mutaciones que mejoraron el crecimiento pero que también restauraron parcialmente la función de los genes mutados para vías de co-producto. La mutación de fumarato reductasa en la cepa SZ132 está mal caracterizada y se obtuvo 5 originalmente como una deleción Tn5 (Ohta et al., 1991), seguida de inserción de celY entre frdA y frdB (Zhou et al., 2005). El gen de alcohol deshidrogenasa fue interrumpido por inserción de un marcador antibiótico con sitios FRT flanqueantes. Después se usó flipasa para eliminar el gen antibiótico sólo dejando una región FRT. La deleción adicional de las regiones codificantes para adhE y frdBC para producir SZ162 eliminó ambos co-productos pero también redujo el crecimiento y el título de lactato final debido a la utilización de azúcar incompleto (Tabla 5). También se hicieron 10 deleciones adicionales en esta cepa para eliminar genes foráneos que se habían integrado previamente para la utilización de celulosa (Zhou et al., 2005): casAB (gen transportador de celobiosa) de Klebsiella oxytoca y celY (endoglucanasa) de Erwinia chrysanthemi. La cepa resultante, SZ186, produjo niveles insignificantes de co-productos pero fue incapaz de utilizar completamente el 10% de azúcar en el medio de sales minerales con o sin betaína (Tabla 5). No obstante, las producciones basadas en azúcar metabolizado fueron altas (96%-99%) para ambas SZ162 y

15 SZ186.

[0070] Las deleciones en SZ136 que eliminaron las vías de co-producto (SZ186) también redujeron el rendimiento celular casi a la mitad, afectando negativamente a la división de carbono en la biosíntesis. La evolución metabólica se usó para coseleccionar un derivado de SZ186 con crecimiento y rendimiento de fermentación mejorados en presencia

20 de 1 mM de betaína y 10% de glucosa. El rendimiento celular y la producción de ácido orgánico aumentó al mismo tiempo durante las etapas de selección iniciales. Un único clon fue aislado del último enriquecimiento y se denominó SZ194 (NRRL B-30863).

[0071] La cepa SZ194 creció más rápidamente que la SZ186 y alcanzó un rendimiento celular más alto.

25 Concentraciones de lactato de hasta 900 mM fueron producidas por SZ194 en algunas fermentaciones, consistentemente más altas que las de SZ186 (Tabla 5). Ambas cepas produjeron lactato a partir de glucosa a casi rendimientos teóricos con co-productos mínimos. Con ambas cepas, no obstante, el azúcar quedó sin usar a pH 7,0 incluso después de prolongar la incubación. A pH 7,0, los 800-900 mM de lactato producido a partir del 10% (p/v) de glucosa está bien por encima de la concentración máxima de lactato necesaria para inhibir el crecimiento a pH 7,0 y

30 también puede inhibir el metabolismo de la glucosa adicional.

[0072] Se exploraron dos factores como posible causa de la fermentación incompleta del 10% (p/v) de azúcar por SZ194: un defecto nutricional desconocido y la tolerancia al lactato. El reemplazo del medio de sales minerales conteniendo 1 mM de betaína con caldo de Luria (medio rico) a pH 7,0 tuvo poco efecto en el rendimiento de lactato (Tabla 5) o la producción de lactato (Tabla 6). Se evaluó la toxicidad del lactato comparando el efecto de pH en la fermentación (Tabla 5). La toxicidad de los ácidos débiles orgánicos tales como el lactato está relacionada, en parte, con la acción de desacoplamiento de la forma neutra conjugada (Warnecke et al., 2005), que a su vez es inversamente proporcional al pH. Una tendencia similar fue observada para la fermentación. En el caldo de Luria, los títulos de lactato final fueron mínimos a pH 6,5 y máximos a pH 7,5 y pH 8,0. Los cambios en el pH tuvieron menos efecto en el rendimiento celular. A pH 7,5, se fermentó el 10% (p/v) de glucosa hasta el final durante 72 h usando caldo de Luria.

Tabla 6. Comparación de productividad de lactato

Cepa

Condiciones de fermentación a Título de lactato (mmol l-1) Rendimiento celular (g l-1) Productividad volumétrica b (mmol l-1 h-1) Productividad específica b (mmol g-1 h-1) Productividad volumétrica b (g l-1 h-1)

SZ132

pH 7,0 930 2,07 24,6 11,9 2,21

SZ194

pH 7,0 824 1,73 18,5 10,7 1,67

SZ194

pH 7,5 1020 1,67 23,8 14,2 2,14

SZ194

Caldo de Luria, pH 7,5 sin adición de betaína 1070 1,75 24,7 14,1 2,22

a Sales minerales (NBS) que contienen 10% (p/v) de glucosa y 1 mM de betaína a menos que se especifique lo contrario. b Valores medios para el período de 24 h más productivo.

[0073] El beneficio de este aumento en el pH fue confirmado en el medio de sales minerales con 1 mM de betaína (Tabla 5). A pH 7,5, se fermentaron 10% y 12% (p/v) de glucosa hasta el final, produciendo más de 1 mol de lactato l-1 con sólo cantidades de rastro de co-productos (Figura 3A). Los rendimientos de producto de 0,95 g de lactato por g de glucosa representan el 95% del rendimiento teórico máximo basado en el azúcar total añadido a la fermentación. La adición de niveles más altos de azúcar no aumentó más los títulos de lactato finales. Se observaron títulos finales similares durante experimentos por lote alimentado y no aumentaron más cuando se añadió azúcar adicional. Los títulos de lactato finales de aproximadamente 1,0-1,2 M parecen representar un límite superior para la metabolización de azúcar a pH 7,5 por SZ 194 (Tabla 5).

[0074] Es interesante destacar que el pH 7,5, el pH óptimo para la fermentación, están muy cerca del proporcionado para el citoplasma de E. coli (Axe et al., 1995; Warnecke et al., 2005). Aunque no se han identificado genes transportadores de lactato en el E. coli, varios estudios han proporcionado evidencia de su presencia en E. coli y en bacterias de ácido láctico (Axe et al., 1995; Konings, 2002; Poolman, 2002). Se cree que estos transportadores son los simportadores lactato/H+, actividades que pueden aumentar en eficiencia con aumentos en el pH externo. Según al "modelo de reciclado de energía" (Michels et al., 1979), el flujo de salida mediado por portador de productos finales metabólicos tal como lactato puede llevar a la generación de un gradiente de protón electroquímico a través de la membrana y contribuir a la producción de ATP. El flujo de salida de lactato en bacterias de ácido láctico se estima que aporta el 30% de la energía celular total (van Maris et al., 2004). Dado que la SZ194 de E. coli y las bacterias de ácido láctico metabolizan glucosa por vías similares, es posible que el ATP adicional también se produzca por flujo de salida de lactato en el E. coli.

[0075] Se examinó la pureza quiral del lactato producido por SZ194 y se descubrió que es superior al 95% de D-lactato. Aunque es buena, esta pureza quiral es inferior a la de la cepa progenitora, SZ132 (99,5% de D-lactato) (Zhou et al., 2005). La fuente de esta impureza quiral se desconoce.

[0076] Según la presente invención, se pueden producir títulos de lactato por encima de 1 M mediante SZ194 de E. coli a pH 7,5 en el medio de sales minerales suplementado con 1 mM de betaína. En este medio, la productividad de lactato y el rendimiento celular para SZ194 fueron equivalentes a los del caldo de Luria (Tabla 6). El título de lactato final de 110 g l-1 y el rendimiento (0,95 g de lactato g de glucose-1) para la cepa SZ194 se comparan favorablemente con bacterias de ácido láctico tales como L. helveticus (Kyla-Nikkila et al., 2000) y L. delbrueckii (Demirci et al., 1992) y exceden el rendimiento de biocatalizadores creados genéticamente previamente en el medio rico o en sales minerales (Dien et al., 2001; Porro et al., 1999; Saitoh et al., 2005; van Maris et al., 2004b).

Ejemplo 3

Materiales y métodos

Cepas, plásmidos, medios y condiciones de crecimiento

[0077] Las cepas de E. coli, los plásmidos y los cebadores utilizados en este estudio aparecen en la Tabla 7. La cepa SZ194 se construyó previamente a partir de un derivado de E. coli B (ATCC 11303) y sirvió como punto de partida para las construcciones (véase Ejemplo 2 y Zhou et al., 2006). Durante las construcciones de cepas, se realizaron cultivos de manera aeróbica a 30°C, 37°C o 39°C en el caldo de Luria (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco y 5 g de cloruro sódico) (Miller 1992) con 2% (p/v) de glucosa o arabinosa. Se añadió ampicilina (50 mg/L), tetraciclina (12,5 o 6,25 mg/L) o canamicina (25 o 50 mg/L) según se fue necesitando. Para pruebas de fermentación, se cultivaron cepas sin antibióticos a 37°C en el medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) suplementado con 1 mM de betaína y 2-12% (p/v) de glucosa. Se agregó tampón MOPS (100 mM, pH 7,4) al medio sólido y líquido bajo condiciones sin control de pH (placas, tubos, matraces agitados).

Métodos genéticos

[0078] Se siguieron los protocolos del fabricante y los métodos estándar (Miller 1992, Sambrook y Russell 2001) para purificación de ADN (Qiagen), digestión de endonucleasa de restricción (New England Biolabs), amplificación de ADN (Stratagene e Invitrogen) y transformación. Los métodos para deleciones cromosómicas e integración se han descrito previamente (Causey et al., 2004, Zhou et. al, 2003, Datsenko y Wanner 2000, Martinez-Morales et al., 1999). Se usaron los cebadores híbridos (Tabla 7) que contienen secuencias homólogas de los 50 nucleótidos del principio o del final del gen mgsA (cursiva) más 20 nucleótidos correspondientes a la secuencia del casete de canamicina flanqueado por FRT (subrayado) de pKD4 para eliminar el gen nativo mgsA. El plásmido pLOI2398 se construyó previamente para facilitar la integración del ldhL de Pedioccoccus acidilactici en el gen ldhA cromosómico de E. coli (Zhou et al., 2003a).

Fermentaciones

0079] Se cultivó el preinóculo mediante la inoculación de una colonia en un matraz de 250-ml (100 ml de medio NBS con 2% (p/v) de glucosa y 100 mM de MOPS, pH 7,4). Después de 16 h (37°C, 120 r.p.m.), este preinóculo se diluyó en recipientes de fermentación de 500-ml que contenían 350 ml de medios NBS (5-12% de azúcar, con o sin 1 mM de betaína) para proporcionar 33 mg dcw 1 l-1. Después de 24-h (37°C, 150 r.p.m., pH controlado a 7,0), este cultivo se usó para proporcionar un inóculo de inicio de 33 mg dcw 1 l-1. Se proporciona la productividad volumétrica del periodo de 24 h más activo. La productividad específica se calculó como el cociente de productividad volumétrica dividido por la masa celular en 24 h.

Evolución metabólica

[0080] Las células de las fermentaciones controladas por pH se fueron transfiriendo en serie a intervalos de 24 o 48 h para facilitar la evolución metabólica aunque competitiva, basada en el crecimiento. En cada transferencia, se diluyeron los inóculos (1/100 a 1/350) en medios frescos precalentados. A los clones aislados de estas selecciones se les asignaron nuevas designaciones de cepa.

Análisis

[0081] La masa celular se estimó midiendo la densidad óptica a 550 nm usando un espectrofotómetro Bausch & Lomb Spectronic 70. La producción de ácido orgánico total, principalmente lactato, se estimó por consumo de KOH usado para mantener el pH 7,0. Los productos acídicos y la pureza quiral se analizaron al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia. Las estimaciones de ácido orgánico por consumo de base fueron sistemáticamente inferiores a las mediciones de lactato por HPLC, supuestamente debido al metabolismo mineral.

Resultados y discusión

Restauración de la pureza quiral para la producción de D-(-)-lactato

[0082] Se ha demostrado que la cepa SZ194 produce eficazmente D-(-)-lactato a partir de glucosa con una pureza quiral del 99% en el medio de sales minerales (Zhou et al., 2006). La betaína aumentó la productividad de lactato (título e índice) con altas concentraciones de azúcar pero también disminuyó la pureza quiral al 95% (Tabla 8). Hay diferentes fuentes posibles de L-(+)-lactato en E. coli. El L-(+)-lactato se puede producir a partir de lactaldehído, un intermedio en el catabolismo de ramnosa o fucosa (Badia et al., 1991), ambas ausentes en nuestros medios, y como un producto del baipás de metilglioxal de glucólisis. El baipás metilglioxal representa una ruta de derrame corta que se induce por acumulación de dihidroxiacetona-fosfato durante la glucólisis rápida, y por una limitación de fosfato para síntesis de ATP. La acumulación de dihidroxiacetona-fosfato y la limitación de fosfato podría ser exacerbada por índices altos de flujo glicolítico. Para probar esta hipótesis, el gen mgsA que codifica el primer paso implicado, metilglioxal sintasa, fue eliminado. La cepa resultante, TG112 (NRRL B-30926), produjo D-(-)-lactato quiralmente puro (Tablas 8 y 9). El crecimiento y la productividad inicial aumentaron por esta deleción en comparación con SZ194. Los rendimientos basados en los análisis HPLC fueron similares (Tabla 8).

[0083] Otras mejoras fueron seleccionadas en la TG112 por evolución metabólica durante 81 días de cultivo. Los cultivos fermentando se transfirieron en serie al medio de sales minerales que contenía 10% (p/v) de glucosa, 12% (p/v) de glucosa y 12% (p/v) de glucosa con 1 mM de betaína. Se aisló un clon el día 28 (TG 113 NRRL B-30927) y otro al final del enriquecimiento (TG114 NRRL B-30928). La productividad de D-(-)-lactato (índice, título y rendimiento) y el rendimiento celular mejoraron durante este proceso (Tabla 8 y Tabla 9). La fermentación con SZ114 se completó sustancialmente en 48 h en la mayoría de los experimentos, con un rendimiento final de 0,98 g de D-(-)-lactato g-1 de glucosa. Los inóculos altos proporcionaron una modesta mejora adicional en las productividades volumétricas y específicas. Los co-productos y las impurezas quirales estaban por debajo del nivel de detección (<0,1%) con estas cepas sin mgsA. La producción de D-(-)-lactato por TG 114 se compara favorablemente con otros biocatalizadores y ofrece alta productividad, título, rendimiento y pureza quiral con medios simples y condiciones de fermentación (Tabla 10).

Producción de L-(+)-lactato quiralmente puro

[0084] La cepa de D-(-)-lactato, SZ194, se recreó genéticamente para producir principalmente L-(+)-lactato por sustitución del gen nativo ldhA que codifica una deshidrogenasa de D-(-)-lactato con el gen ldhL de P. acidilactici que codifica la deshidrogenasa de L-(+)-lactato (Zhou et al., 2003a). La cepa resultante, TG102, produjo principalmente L(+)-lactato y se transfirió en serie al medio mínimo conteniendo 5% (p/v) de glucosa, 10% (p/v) de glucosa y 10% (p/v) de glucosa con 1 mM de betaína para seleccionar crecimiento y productividad mejorados. Después de 24 días, se seleccionó un clon y se denominó TG103. Aunque la productividad de lactato mejoró debido a un aumento en el flujo glicolítico (Tabla 9), el L-(+)-lactato fue contaminado con 5% D-(-)-lactato (Tabla 8). Ya que el baipás de metilglioxal tiene el potencial de producir ambas formas quirales de lactato, mgsA fue identificado como la fuente más probable de impureza quiral. Se restauró la pureza quiral absoluta después de eliminar el mgsA. La cepa resultante, TG105 (NRRL B-30922), sólo produjo L-(+)-lactato (Tabla 8). Hubo más mejoras mediante cultivo y productividad de coselección durante las transferencias en serie al medio de sales minerales conteniendo 10%-12% (p/v) de glucosa y 1 mM de betaína (dilución de inóculo de 1:100 a 1:350). TG106 (NRRL B-30923) y TG107 (NRRL B-30924) fueron aisladas como cepas intermedias después de 10 y 22 transferencias, respectivamente. La cepa TG108 (NRRL B-30925) fue aislada después de 99 días. Todas produjeron sólo L-(+)-lactato a altos rendimientos con niveles mínimos de co-productos (Tabla 8). Las productividades volumétricas en 12% (p/v) de glucosa y el rendimiento celular aumentaron durante la selección de la cepa aunque la productividad específica permaneció esencialmente constante (Tabla 9). Se observaron pequeños aumentos en la productividad volumétrica máxima (periodo de 24-h más activo) con inóculos más altos.

[0085] Se comparó la cepa TG108 con otros biocatalizadores para la producción de L-(+)-lactato (Tabla 10). El título y el rendimiento para esta cepa fueron más altos que los de los proporcionados para otros organismos. Otras ventajas incluyen condiciones y medios de fermentación simple y pureza quiral.

Conclusiones

[0086] Los títulos altos (>100 gl-1 en 48 h) de L-(+) y D-(-)-lactato quiralmente puros (> 99,9% pureza quiral) se pueden producir fácilmente por E. coli B recombinante en el medio de sales minerales suplementado con 1 mM de betaína. La deleción del baipás metilglioxal fue esencial para eliminar las impurezas en los enantiómeros D-(+) y L-(-) de lactato.

Ejemplo 4

Construcción de TG128 por deleción de todos los ADN foráneos de TG114

[0087] Para facilitar la aplicación comercial de las cepas de E. coli recombinantes para la producción de lactato, se construyó otro derivado de TG114 en el que todos los ADN extraños que se habían dejado atrás en el cromosoma durante la ingeniería genética precedente se eliminaron. Los ADN eliminados incluían regiones de cicatriz que contenían el sitio de reconocimiento de FRT para la flipasa (recombinasa) usado para eliminar los marcadores antibióticos, pequeños fragmentos de ADN de Zymomonas mobilis, parte del casAB de Klebsiella oxytoca y parte del celY de Erwinia chrysanthemi. Estos segmentos de ADN foráneo se eliminaron completamente dejando sólo el ADN cromosómico nativo en el que las regiones centrales de los genes seleccionados se han eliminado para mejorar la producción de lactato.

Cepas, plásmidos, medios y condiciones de crecimiento

[0088] Las cepas de E. coli, los plásmidos y los cebadores usados en este estudio se encuentran en la Tabla 11. La cepa TG114 se construyó anteriormente a partir de un derivado de E. coli B (ATCC 11303) y sirvió como punto de partida para las construcciones (Grabar et al., 2006). Durante las construcciones de cepas, se realizaron cultivos de forma aeróbica a 30°C, 37°C o 39°C en el caldo de Luria (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco y 5 g de cloruro sódico) (Miller 1992) conteniendo 2% (p/v) de glucosa o arabinosa o 10% de sacarosa. Se añadió ampicilina (50 mg/L), clorotetraciclina (10 mg/L) o cloranfenicol (40 mg/L) según fue necesario.

[0089] Los cultivos se mantuvieron en placas conteniendo el medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) suplementado con 2% (p/v) de glucosa. Se añadió un tampón MOPS (100 mM, pH 7,4) al medio sólido y líquido bajo condiciones sin control de pH (placas, tubos, matraces agitados). Para pruebas de fermentación, se cultivaron cepas sin antibióticos a 37°C en el medio de sales minerales AM1 (por litro: 2,63 g de (NH4)2HPO4, 0,87 g de NH4H2PO4, 0,37 g de MgSO4 ·7H2O, 2,4 mg de FeCl3, 0,3 mg de CoCl2 ·6H2O, 0,15 mg de CuCl2, 0,3 mg de ZnCl2·4H2O, 0,3 mg de NaMoO4, 0,075 mg de H3BO3, 0,075 mg de MnCl2.4H2O2, 1 mM de betaína y 120 g/L de glucosa).

Métodos genéticos

[0090] Se siguieron los protocolos del fabricante y los métodos estándar (Miller 1992, Sambrook y Russell 2001) para clonar genes (Invitrogen), purificación de ADN (Qiagen), digestión de endonucleasa de restricción (New England Biolabs), amplificación de DNA (Stratagene e Invitrogen) y transformación. Los métodos para deleciones cromosómicas e integración se han descrito previamente (Causey et al., 2004, Zhou et. al, 2003, Datsenko y Wanner 2000, Martinez-Morales et al., 1999). Una descripción de los plásmidos y los cebadores usados se encuentra en la Tabla 11.

Construcciones plásmidas

[0091] El plásmido pLO1441 se generó mediante cebadores de diseño que se amplificaron dentro del operón frdABCD de gDNA de E. coli B, 'frdA frdB frdC y frdD', y ligamiento posterior en el vector de clonación de Invitrogen, pCR2.1-TOPO (Tabla 11). Los plásmidos pLOI4412, pLOI4413, pLOI4415 y pLOI4416 fueron construidos mediante un método similar para clonar los genes nativos de interés, ackA, adhE, focA-plfB y mgsA, respectivamente.

[0092] Los plásmidos que codifican las inactivaciones del gen continuo se generaron usando cebadores de antisentido. Los cebadores de antisentido con grupos de fosfato 5' se diseñaron para amplificar el plásmido entero menos la región del gen que se va a omitir. Por ejemplo, pLOI4417 se generó mediante la realización de una PCR en pLOI4411 1 con un cebador que anillaba el final 3' de offrdA, extendiéndose aguas arriba, y un cebador que anillaba dentro de frdC, extendiéndose aguas abajo. El producto PCR resultante de 4.263 pares de bases se trató con enzima de restricción DpnI para asimilar el plásmido nativo pLOI4411. Los productos de PCR digeridos se autoligaron posteriormente para generar el nuevo plásmido, pLOI4417. Los plásmidos pLO14418, pLOI4419, pLOI4421 y pLOI4422 se generaron de forma similar usando los grupos de cebadores de la Tabla 11. Estos plásmidos sirvieron como un molde de PCR para amplificar el ADN lineal que contenía la deleción deseada y fueron desprovistos de toda secuencia heteróloga. Este ADN lineal se usó para reemplazar regiones de cicatriz FRT, ADN heterólogo y sacB por recombinación homóloga (evento de doble cruce). De esta manera, se hicieron deleciones continuas de genes seleccionados en el cromosoma.

Deleción de cicatriz FRT y ADN heterólogo de TG114

[0093] Las cicatrices objetivo de reconocimiento de FLP (FRT) de ~85 pares de bases dejadas atrás por el método de deleción de un único paso de Datsenko y Wanner (2000) se eliminaron mediante un método de dos pasos. Primero, los sitios FRT fueron individualmente elegidos por un casete circular FRT-cat-sacB que dio como resultado una única integración de cruce de este casete en una cicatriz FRT del cromosoma (FRT-cat-sacB-FRT). El ADN circular que contiene el casete cat-sacB-FRT se construyó de la siguiente manera: 1) Amplificación por PCR del casete FRT-catsacB usando el plásmido pLOI4151 como molde. El casete amplificado incluyó los sitios PstI flanqueantes; 2) Digestión con PstI seguida de autoligamiento para producir círculos cerrados incapaces de replicación autónoma. Este ADN circular se usó para la integración. La expresión del gen cat confirió resistencia al cloranfenicol y permitió la selección directa de células conteniendo la integración.

[0094] En el segundo paso, el gen sacB permitió una selección directa de células en las que la región de ADN que contiene el sacB se ha eliminado por recombinación homóloga (evento de doble cruce). Las células que expresan SacB en presencia de 10% de sacarosa (Ausubel et al., 2005; Lee et al., 2001) fueron matadas y lisadas por la producción intracelular de polisacárido. Con este método, las recombinantes en las que se había insertado ADN para reemplazar sacB se pudieron seleccionar de grandes poblaciones. En este ejemplo, la integración de un fragmento de ADN lineal vía un evento de cruce doble dio como resultado una cepa mutada limpia que contiene sólo ADN nativo o ADN nativo con deleciones, carente de todo ADN heterólogo. La secuencia de ADN nativa o la secuencia nativa que contiene una deleción génica deseada se usó en este segundo paso para eliminar completamente las regiones de cicatriz FRT y todo el ADN heterólogo de la cepa TG 114.

[0095] Tras la electroporación con el fragmento de ADN lineal, las células se incubaron con agitación a 37°C durante 4 horas en 1 mL de medio SOC. Después de las 4 horas de cultivo, las células se incubaron durante 16-20 horas en 50 mL de LB sin sal (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco) suplementado con 10% (p/v) de sacarosa. Luego las células fueron batidas en placas de LB agar sin sal suplementadas con 5% de sacarosa. La mayoría de las células que mantuvieron el FRT-cat-sacB no eran viables después de períodos prolongados en presencia de sacarosa. Las células viables que formaban colonias fueron desprovistas de sacB y de las regiones de cicatriz.

[0096] Este método se usó consecutivamente para eliminar las 5 cicatrices FRT presentes en TG114 y para restaurar el operón lac. Los cebadores, plásmidos y cepas usados en este proceso se resumen en la Tabla 11. Los genes casAB integrados en el lacA también se eliminaron y sustituyeron con la secuencia de tipo salvaje en esta región usando una modificación de este método de dos pasos. Los fragmentos de celY de Erwinia chrysanthemi (y ADN de Z. mobilis) integrados en frdA se eliminaron durante la construcción de la deleción de frdBC uniforme. La cepa resultante, TG128, está desprovista de cicatrices FRT y sólo contiene secuencias de ADN nativo con regiones eliminadas en los genes indicados en la Tabla 11. Se muestra una comparación de la secuencia original de la región de las deleciones de gen para TG 114 y TG128 (Tabla 12).

Restauración del operón lac nativo

[0097] TG 114 contenía segmentos de ADN heterólogo (fragmentos de ADN de Zymononas mobilis, casAB de Klebsiella oxytoca y parte de celY de Erwinia chrysanthemi) de construcciones previas en la región lacY, lacA (Grabar et al., 2006). Estos se eliminaron de TG120 para producir TG122 y están ausentes en derivados posteriores de TG122. Los cebadores para esta construcción se enumeran en la Tabla 11. Para realizar esto, la región nativa de lacZ' a cynX se amplificó de E. coli B y se clonó en pCR2.1-TOPO para producir pLOI3956. Para facilitar la selección de recombinantes, la región central de pLOI3956 (lacZ'-lacA') se sustituyó con un casete que contenía los genes cat y sacB de la siguiente manera. Con pLOI3956 como molde, se usaron cebadores de antisentido con unos sitios NheI para amplificar lacZ', pCR2.1 y cynX (omitiendo parte de IacZ', lacY, lacA y parte de cinX'). Se usó un segundo conjunto de cebadores con sitios NheI para amplificar un casete de cat-sacB a partir del plásmido pEL04 (originalmente conocido como pK04, Ausubel et al., 2005 y Lee et al., 2001). Después de la digestión con NheI, estos productos PCR fueron ligados para producir pLOI3957, un derivado de pCR2.1 que contiene lacZ'-sacB-cat-cynX'. Usando el plásmido pLOI3957 como molde, la región lacZ'-sacB-cat-cynX' fue amplificada por PCR e integrada en TG120 con selección para resistencia de cloranfenicol para producir TG121. Usando pLOI3956 como molde, la región de tipo salvaje lacZ'-lacY-lacA-cynX' fue amplificada por PCR e integrada en TG121. Los integrantes que contenían la secuencia nativa del operón lacZYA fueron seleccionados por la ausencia de función de sacB durante el crecimiento en presencia de sacarosa. Un de estos se denominó TG122. La cepa TG122 fue una cepa intermedia durante la construcción de TG128.

Fermentaciones

[0098] Se cultivó preinóculo mediante la inoculación de una colonia en un matraz de 250 ml que contenía 100 ml de medio NBS (Causey et al., 2004) con 2% (p/v) de glucosa y 100 mM de MOPS (pH 7,4). Después de 16 h (37°C, 120 r.p.m.), este preinóculo fue diluido en recipientes de fermentación de 500 ml que contenían 350 ml de medio de sales minerales AF1 (12% de azúcar) para proporcionar 33 mg dcw/L. Después de 24 h (37°C, 150 r.p.m., pH controlado a 7,0), el cultivo resultante fue usado para proporcionar inóculo de inicio de 33 mg dcw/L e incubado bajo las mismas condiciones durante 96 h. Se retiraron muestras para análisis. Análisis

[0099] La masa celular se estimó por medición de la densidad óptica a 550 nm usando un espectrofotómetro Bausch & Lomb Spectronic 70. La producción de ácido orgánico total, principalmente lactato, fue estimada por consumo de KOH usado para mantener el pH 7,0. Los productos acídicos y la pureza quiral fueron analizados al final de la fermentación por cromatografía en fase líquida de alta eficacia. Las estimaciones de ácido orgánico por consumo de base fueron consistentemente inferiores a las mediciones de lactato por HPLC, supuestamente debido al metabolismo mineral.

Fermentación de glucosa por TG128

[0100] La cepa TG114 fue sometida a manipulación genética intensiva para eliminar las cicatrices FRT y otro ADN extraño. El organismo resultante, la cepa TG128, sólo contenía secuencia de ADN de tipo salvaje nativo y deleciones uniformes de genes para eliminar los productos de fermentación indeseada. El rendimiento de fermentación de esta cepa fue esencialmente equivalente al de TG114, rendimientos de lactato de 96-98% del rendimiento máximo teórico (Tabla 13).

Selección de mutantes termotolerantes para producción de lactato por evolución metabólica

[0101] Se usó la evolución metabólica para seleccionar cepas capaces de producir lactato eficaz a temperaturas elevadas. Las células de fermentaciones controladas por pH se transfirieron en serie a intervalos de 24 h para facilitar la evolución metabólica aunque competitiva, selección basada en el crecimiento. En cada transferencia, se diluyeron inóculos (1/100 a 1/350) en medios frescos precalentados. La temperatura de incubación se aumentó por una fracción de un grado según el crecimiento permitió el aislamiento de cepas termotolerantes. La cepa TG128 fermenta óptimamente a 37°C. Se obtuvieron mutantes por el aumento progresivo de la temperatura de incubación durante transferencias sucesivas. Con este método, se seleccionaron cepas nuevas de TG128 que son ahora capaces de fermentación eficaz a 39°C (cepa TG129; NRRL B-30963) y 43°C (cepa TG130; NRRL B-30964). Los rendimientos para ambas cepas termotolerantes a temperatura elevada fueron equivalentes a los de TG 114 a 37°C (Tabla 13).

Fermentación de glucosa por TG128

[0102] La cepa TG114 fue sometida a manipulación genética intensiva para eliminar las cicatrices FRT y otro ADN extraño. El organismo resultante, la cepa TG128, sólo contiene secuencia de ADN de tipo salvaje, nativo y deleciones uniformes de genes para eliminar productos de fermentación indeseada. El rendimiento de fermentación de esta cepa fue esencialmente equivalente al de TG 114, rendimientos de lactato de 96-98% del rendimiento máximo teórico (Tabla 13).

5 Selección de mutantes termotolerantes para producción de lactato

[0103] La evolución metabólica se usó para seleccionar cepas capaces de producción de lactato eficaz a temperaturas elevadas. Las transferencias en serie a fermentadores en los que la temperatura se aumentó por una fracción de un grado permitieron el aislamiento de TG129 que fermenta óptimamente a 39°C y TG130 que fermenta óptimamente a

10 43°C. Los rendimientos para ambas a temperatura elevada fueron equivalentes a los de TG114 a 37°C (Tabla 13).

Tabla 7. Cepas de E. coli, plásmidos y cebadores usados en este estudio

Plásmido o Cepa Características relevantes Fuentes

Cepas SZ 194 (NRRL B-30863) pflB frd adhE ackA Zhou et al. (2006) TG 102 (NRRL B-30921) SZ194, ΔldhA::ldhL-FRT Este estudio TG 103 (NRRL B-30864) Mutante de TG 102 con crecimiento mejorado y actividad ldhL Este estudio TG105 (NRRL B-30922) TG 103, ΔmgsA::FRT Este estudio TG 106 (NRRL B-30923), TG107 (NRRL B-30924) y TG 108 (NRRL B-30925) Mutantes de TG 105 con crecimiento mejorado y actividad ldhL Este estudio TG112 (NRRL B-30926) SZ194, ΔmgsA::FRT Este estudio TG 113 (NRRL B-30927) y TG 114 (NRRL B-30928) Mutantes de TG 112 con crecimiento mejorado y actividad ldhA Este estudio

Plásmidos pKD46 bla γβ exo (recombinasa Red), replicón pSC101 condicional de temperatura Datsenko y Wanner (2000) pFT-A bla flp replicón pSC 101 condicional de temperatura Posfai et al. (1997) pKD4 bla kan; R6K ori; casete FRT-kan-FRT Datsenko y Wanner (2000)

PLOI2398 kan; ldhA'-ldhL-FRT-tet-FRT-'ldhA; R6K ori Zhou et al. (2003)

Cebadores Cebador sentido para deleción de mgsA Atgtacattatggaactgacgactcgcactttacctgcgcgg aaacatatgtgtaggctggagctgcttc (SEQ ID nº: 7) Este estudio Cebador antisentido para deleción de mgsA Ttacttcagacggtccgcgagataacgctgataatcgggga tcagaatatcatatgaatatcctccttag (SEQ ID nº: 8) Este estudio

Tabla 8. Productos de fermentaciones de glucosa

Cepa

Condiciones a Lactato Co-productos (mmol l-1)

mmol l-1

Rendimiento (%) b Pureza quiral (%) Succinato Acetato Etanol

SZ194

NBS, pH 7,5 +betaína 1228 ± 31 95 95 < 1 < 1 < 1

TG102

NBS 5% de glucosa 555 ± 6 99 99,5 < 1 < 1 < 1

TG102

NBS 10% de glucosa 697 ± 13 96 99,5 < 1 < 1 < 1

TG102

NBS 10% de glucosa + betaína 1025 ± 18 94 95 < 1 < 1 < 1

TG103

NBS 10% de glucosa + betaína 1080 ± 15 95 95 < 1 < 1 < 1

TG105

NBS + betaína 969 ± 20 95 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG106

NBS + betaína 1055 ± 19 95 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG107

NBS + betaína 1135 ± 18 96 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG108

NBS + betaína 1287 ± 15 98 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG112

NBS 10% de glucosa + betaína 926 ± 13 95 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG113

NBS + betaína 1068 ± 32 95 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG114

NBS + betaína 1314 ± 48 98 >99,9 < 1 < 1 < 1

a Medio de sales minerales NBS que contiene 12% (p/v) de glucosa (pH 7,0) a menos que se especifique lo contrario. Donde se indique, también se añadió 1 mM de betaína. Las cepas en negrita producen D-(-)-lactato. Las cepas subrayadas producen L-(+)-lactato. b Los rendimientos se basan en azúcar metabolizado asumiendo un rendimiento teórico máximo de 2 moles de lactato por mol de hexosa (igual conversión de peso).

Tabla 9. Productividad de lactato por E. coli B genéticamente modificada

Cepa a

Título de lactato (mmol l-1) Rendimiento celular (g l-1) Productividad volumétrica f (mmol l-1h-1) Productividad específica f (mmol g-1 h-1) Productividad volumétrica f (g-1 h-1)

SZ194 b

1228 1,70 23,3 13,7 2,10

TG103 e

1083 2.12 30,1 14,2 2,71

TG105 e

969 1,84 21,1 11,5 1,90

TG106

1055 1,98 24,1 12,1 2,17

TG107

1135 2,21 26,7 12,1 2,40

TG108

1287 2,29 26,2 11,4 2,29

TG108 c

1273 2,15 26,4 12,3 2,37

TG108 d

1268 2,36 30,0 12.7 2,70

TG112 e

926 1,84 20,4 11,1 1,84

TG113

1068 1,90 21,3 11,2 1,92

TG114

1314 2,31 32,2 13,9 2.88

TG114 c

1204 2,05 33,9 16,6 3,05

TG114 d

1202 2,16 36,1 16,7 3,25

a Sales minerales (NBS) que contienen 12% (p/v) de glucosa, 1 mM de betaína, controlado a pH 7,0 (a menos que se especifique lo contrario). Las cepas en negrita producen D-(-)-lactato. Las cepas subrayadas producen L-(+)-lactato. b pH controlado a 7,5. c 5% de inóculo. d 10% de inóculo. e 10% de glucosa. f Valores calculados según el promedio para el periodo de 24 h más productivo.

Tabla 10. Producción de lactato quiral a partir de glucosa por bacterias, levaduras y hongos

Organismos

Medios, substrato y condiciones de proceso Lactato (gl-1) Rendimiento (%) Productividad volumétrica (gl-1 h-1) Isómero y pureza Referencia

E. coli TG114

sales, 1mM de lote de betaína, glucosa, 120 g l-1 118 98 2,88 D-(-) >99,9% Este estudio

E. coli JP203

medio rico (LB) dos pasos, glucosa lote alimentada, 115 g l-1 62 54 1,09 D-(-) No proporcionado Chang et al. 1999

Lactobacillus delbrueckii mutante DP3

extracto de levadura, glucosa lote alimentada, 210 g l-1 117 56 6,5 D-(-) No proporcionado Demirci et al. 1992

Kluyveromyces marxianus CD590

medio rico (YPD), glucosa microaeróbica, 100 g l-1 81 81 1,5 D-(-) 99 % Rajgarhia et al. 2004

E. coli TG 108

sales, 1mM lote de betaína, glucosa, 120 g l-1 116 98 2,3 L-(+) >99,9% Este estudio

E. coli JP204 (pLS65)

medio rico (LB), dos pasos, glucosa lote alimentada, 155 g l-1 47 30 0,7 L-(+) No proporcionado Chang et al. 1999

E. coli FBR11 (pVALDH1)

medio rico (LB), lote simple, glucosa, 100 g l-1 73 73 2,3 L-(+) No proporcionado Dien et al. 2001

Kluyveromyces lactis BM3-12D (pLAZ10)

extracto de levadura y lote alimentado de vitaminas, glucosa de aireación, 110 g l1 60 55 No proporcionad o L-(+) No proporcionado Bianchi et al. 2001

Kluyveromyces lactis PMI/C1 (pEPL2)

extracto de levadura y licor de maceración de maíz, lote alimentado con aireación, glucosa, 200 g l-1 109 55 No proporcionad o L-(+) No proporcionado Porro et al. 1999

Saccharomyces cerevisiae RWB850- 2

suplementado con vitamina, dos pasos glucosa, 18 g l-1 12 67 No proporcionad o L-(+) No proporcionado Van Maris et al. 2004b

Saccharomyces cerevisiae OC2T T165R

extracto de levadura, azúcar de jugo de caña, 200 g l-1 122 61 No proporcionad o L-(+) 99,9% Saitoh et al. 2005

Saccharomyces

suplemento de 61 82 No L-(+) No Liu et al. 2005

cerevisiae RWB876

vitamina, lote simple glucosa, 74 g l-1 proporcionad o proporcionado

Lactabacillus

extracto de levadura, 75 92 3,2 L-(+) Not Kyla-Nikkilaet

helveticus GRL89

lote simple lactosa, 81 g l-1 reported al. 2000

Lactabacillus sp.

extracto de levadura, 103 79 No L-(+) 100% Eddington et al.

NRRL B-30574

lote simple glucosa, 130 g l-1 proporcionad o 2004

Rhizopus oryzae ADM 34.31

urea y medio rico, lote de elevación por aire glucosa 120 g l-1 109 89 1,3 L-(+) No proporcionado Liaw 2003

Tabla 11. Cepas de E. coli, plásmidos y cebadores usados en este estudio

Plásmido o cepa

Características relevantes Fuentes

TG114 (NRRL B-30928)

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA:: FRT, frdA::E. chrysanthemi celY,ΔfrdBC::FRT, lacA:K. oxytoca cas AB,ΔmgsA::FRT Grabar, et al. 2006

TG117

TG114, ΔfrdBC::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG118

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, Δack4:: FRT, ΔfrdBC, lacA:K. oxytoca cas AB,ΔmgsA::FRT Este estudio

TG119

TG 118, ΔackA::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG120

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA, ΔfrdBC, lacA:K. oxytoca cas AB, ΔmgsA::FRT Este estudio

TG121

TG 120, ΔlacZ-cynX (lacZ'-sacB-cat-cynX') Este estudio

TG122

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA, ΔfrdBC, ΔmgsA::FRT Este estudio

TG123

TG122, ΔmgsA::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG124

ΔfocA-pflB::FRT, ΔadhE::FRT, ΔackA,ΔfrdBC, ΔmgsA Este estudio

TG125

TG124, ΔfocA-pflB:FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG126

ΔfocA-pflB, ΔadhE::FRT, ΔackA,ΔfrdBC, ΔmgsA Este estudio

TG127

TG126, ΔadhE::FRT-cat-sacB-FRT Este estudio

TG128 (NRRL B-30962)

ΔfocA-pflB, ΔadhE, ΔackA, ΔfrdBC, ΔmgsA Este estudio

TG129 (NRRL B-30963)

TG128, crecimiento mejorado a 39°C Este estudio

TG130 (NRRL B-30964)

TG129, crecimiento mejorado a 43°C Este estudio

Plásmidos

pKD46

bla γβ exo (recombinasa Red), replicón pSC101 condicional de temperatura Datsenko y Wanner (2000)

pFT-A

bla flp replicón pSC101 condicional de temperatura Posfai et al. (1997)

pELO4

cat sacB Lee et al. (2001); Ausubel et al. (2005)

pLOI4151

FRT cat sacB Este estudio

PLOI3956

'lacZ' lacY lacA cynX' TOPO clonado Este estudio

PLO13957

'lacZ'sacB cat cynX' Este estudio

pLOI4411

'frdA.frdB.frdCfrdD'TOPO clonado Este estudio

pLOI4412

'ackA' TOPO clonado Este estudio

pLOI4413 pLOI4415

ychE' adhE ychG' TOPO clonado focA-pflB TOPO clonado Este estudio Este estudio

pLOI4416

'yccT mgsA 'helD TOPO clonado Este estudio

pLOI4417

pLOI4411, ΔfrdBC Este estudio

pLOI4418

pLOI4412, ΔackA Este estudio

pLOI4419

pLOI4413, ΔadhE Este estudio

pLOI4421

pLOI4415, Δ/ocA-pflB Este estudio

pLOI4422

pLOI4416, ΔmgsA Este estudio

Cebadores

Cebador de sentido para amplificación de FRT-cat-sacB

tgtgctgcaaggcgattaag (SEQ ID Nº: 9) Este estudio

Cebador de antisentido para amplificación de FRT-cat-sacB

ttcgatcacggcacgatcat (SEQ ID Nº: 10) Este estudio

Cebador de sentido para amplificación de cat- sacB con sitio NheI 5'

ttagctagcatgtgacggaag (SEQ ID Nº: 11) Este estudio

Cebador de antisentido para amplificación de cat-sacB con sitio NheI 5'

ccgctagcatcaaagggaaaa (SEQ ID Nº: 12) Este estudio

Cebador de sentido para clonación de frdABCD

ctggagtacagcgacgtgaagat (SEQ ID Nº: 13) Este estudio

Cebador de antisentido para clonación de frdABCD

cagaacgcgctcgtagctca (SEQ ID Nº: 14) Este estudio

Cebador de sentido para clonación de ackA

gaactgcggtagttcttcactg (SEQ ID Nº: 15) Este estudio

Cebador de antisentido para clonación de ackA

gcgtcttgcgcgataaccag (SEQ ID NO:16) Este estudio

Cebador de sentido para clonación de lacZ cynX

gaagtgaccagcgaatacct (SEQ ID Nº: 17) Este estudio

Cebador de antisentido para clonación de lacZ cynX

ggtgatgccttcggtgatta (SEQ ID Nº: 18) Este estudio

Cebador de sentido para clonación de mgsA

gctattccaccgcagtctca (SEQ ID Nº: 19) Este estudio

Cebador de antisentido para clonación de mgsA

ttatggaagaggcgctactgc (SEQ ID Nº: 20) Este estudio

Cebador de sentido para clonación de focA-pflA

agatcgccagccgctgcaat (SEQ ID Nº: 21) Este estudio

Cebador de antisentido para clonación de focA-pflB

aaccgttggtgtccagacag (SEQ ID Nº: 22) Este estudio

Cebador de sentido para clonación de adhE

ccgctgtctgataactggtc (SEQ ID Nº: 23) Este estudio

Cebador de antisentido para clonación de adhE

gcataagcggatggtcactg (SEQ ID Nº: 24) Este estudio

Cebador de sentido para deleción de frdBC

P-gtggttgccaccatcgtaat (SEQ ID Nº: 25) Este estudio

Cebador de antisentido para deleción de frdBC

P-cgccttctccttcttattgg (SEQ ID Nº: 26) Este estudio

Cebador de sentido para deleción de ackA

P-ctggacgctgttgtattcactg (SEQ ID Nº: 27) Este estudio

Cebador de antisentido para deleción de ackA

P-gttgagcgcttcgctgtgag (SEQ ID Nº: 28) Este estudio

Cebador antisentido lacZ con sitio Nhel 5'

acgctagctctgacaatggca (SEQ ID Nº: 29) Este estudio

Cebador antisentido cynX con sitio Nhel 5'

acgctagcattgccgctgata (SEQ ID Nº: 30) Este estudio

Cebador de sentido para deleción de mgsA

P-agcgttatctcgcggaccgt (SEQ ID Nº: 31) Este estudio

Cebador de antisentido para deleción de mgsA

P-aagtgcgagtcgtcagttcc (SEQ ID Nº: 32) Este estudio

Cebador de sentido para deleción de focA-pflB

P-gcagcaggacgttattactc (SEQ ID Nº: 33) Este estudio

Cebador de antisentido para deleción de focA-pflB

P-gcctacattgcgtaggctatt (SEQ ID Nº: 34) Este estudio

Cebador de sentido para deleción de adhE

P-gctgctccggctaaagctga (SEQ ID Nº: 35) Este estudio

Cebador de antisentido para deleción de adhE

P-acgctctacgagtgcgttaag (SEQ ID Nº: 36) Este estudio

Tabla 12. Secuencia parcial de región de deleciones

Cepa/ gen

Secuencia parcial a ADN foráneo (pb)

TG114 frdABC

322

TG128 frdABC

GCCAATAAGAAGGAGAAGGCG-GTGGTTGCCACCATCGTAATCCTGTT c (SEQ ID Nº: 38) 0

TG114 ackA

94

TG128 ackA

CTCACAGCGAAGCGCTCAA-CTGGACGCTGTTGTATTC (SEQ ID Nº: 40) 0

TG114 mgsA

85

TG128 mgsA

ATGGAACTGACGACTCGCACTT-AGCGTTATCTCGCGGACCGTCTGA (SEQ ID Nº: 42) 0

TG114 focA-pflB

85

TG128 focA-pflB

ATAGCCTACGCAATGTAGGC-GCAGCAGGACGTTAT (SEQ ID Nº: 44) 0

TG114 adhE

84

TG128 adhE

AACGCACTCGTAGAGCGT-GCTGCTCCGGCTAAAGCT (SEQ ID Nº: 46) 0

a En negrita se muestran secuencias parciales de las regiones 5' y 3' del/los gen/es, en cursiva está la cicatriz FRT y subrayada la región borrada de la cepa TG128. b Esta region también contenía secuencia parcial del promotor de Z. mobilis así como secuencia parcial del gen celY de E.chrysanthemi (subrayado). c El guión indica la región de deleción.

Tabla 13. Productos de fermentaciones de glucosa

Cepa

Condiciones a Lactato Co-productos (mmol l-1)

mmol l-1

Rendimiento (%)b Pureza quiral (%) Succinato Acetato Etanol

TG114

FMS, 37°C 1314 ± 48 98 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG128

FMS, 37°C 1157 ± 37 96 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG128

FMS, 39°C 865 ± 12 95 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG128

FMS, 43°C >99,9 < 1 < 1 < 1

TG129

FMS, 39°C 1063 ± 26 96 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG129

FMS, 43°C 934 ± 18 94 >99,9 < 1 < 1 < 1

TG130

FMS, 43°C 1149 ± 49 97 >99,9 < 1 1 < 1

a Sales minerales (NBS) que contienen 12% (p/v) de glucosa, 1 mM de betaína, controlado a pH 7,0. b Rendimiento basado en azúcar metabolizado asumiendo un rendimiento teórico máximo de 2 moles de lactato por mol de hexosa (igual conversión de peso).

[0104] Se debe entender que los ejemplos y formas de realización descritas en este caso son sólo con fines ilustrativos y a los expertos en la técnica se les ocurrirán modificaciones o cambios a la luz de los mismos.

Referencias

[0105]

Patente de EEUU Nº: 4.963.486 Solicitud de patente publicada en EEUU Nº: 20040005677 Solicitud de patente publicada en EEUU Nº: 20030003553 Solicitud de patente publicada en EEUU Nº: 20050112737 Solicitud de patente publicada en EEUU Nº: 20040029256 WO 99/14335 Adachi et al. (1998) "Modification of metabolic pathways of Saccharomyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and deletion of pyruvate decarboxylase genes for the lactic acid fermentation at low pH value" J. Ferment. Bioeng. 86:284-289. Agrawal, A.K. (2003) "Advances in the production of poly(lactic acid) fibers. A review." J. Macromolec. Science-Polymer Rev., 4:479-503. Amtzen, C.E., Dale, B.E. (1999) Biobased industrial products, priorities for research and commercialization, National Academy Press, Washington, D.C. Ausubel, F.M. et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Klingston, D.D. Moore, J.G. Deidman, J.A. Smith and K. Struhl (eds.) (2005) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y. Axe, D.D. and J.E. Bailey (1995) "Transport of lactate and acetate through the energized cytoplasmic membrane of Escherichia coli" Biotechnol. Bioeng. 47:8-19. Badia, J., Gimenez, R., Baldoma, L., Barnes, E., Fessner, W.D., Aguilar, J. (1991) "L-lyxose metabolism employs the Lrhamnose pathway in mutant-cells of Escherichia coli-adapted to grow on xylose" J. Bacteriol. 173:5144-5150. Bianchi, M.M., Brambilla, L., Protani, F., Liu, C., Lievense, Porro, D. (2001) "Efficient homolactic fermentation by Kluveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with heterologous LDH gene" Appl. Environ. Microbiol. 67:5621-5625. Causey, T.B. et al. (2004) "Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2235-2240. Chang, D.E. et al. (1999) "Homofermentative production of D-(-) or L-(+) lactate in metabolically engineered Echerichia coli RR1" Appl Environ Microbiol 65:1384-1389. Chotani, G. et al. (2000) "The commercial production of chemicals using pathway engineering" Biochim. Biophys. Acta 1543:434-455. Datsenko, K.A., Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645. Datta, R. et al. (1995) "Technological and economic potential of poly (lactic acid) and lactic acid derivatives" FEMS Microbiol. Rev. 16:221-231. Demirci, A. and A.L. Pometto (1992) "Enhanced production of D-(-)-lactic acid by mutants of Lactobacillus delbrueckii ATCC9649" J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 11:23-28.

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Listado de secuencias

[0106]

<110> Zhou, Shengde Ingram, Lonnie O'Neal Shanmugam, Keelnatham T. Yomano, Lorraine Grabar, Tammy B. Moore, Jonathan C.

<120> Materiales y métodos para producción eficiente de ácido láctico

<130> UF-457C2XC1

<150> US 60/706.887

<151> 2005-08-10

<150> US 60/761.576

<151> 2006-01-24

<150> US 60/799.619

<151> 2006-05-11

<160> 46

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de frdBC

<400> 1

<210> 2

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de frdBC

<400> 2

<210> 3

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de adhE

<400> 3 <210> 4

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de adhE

<400> 4

<210> 5

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de celY

<400> 5

<210> 6

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de celY

<400> 6

<210> 7

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de mgsA

<400> 7

<210> 8

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de mgsA

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para amplificación de FRT-cat-sacB

<400> 9 tgtgctgcaa ggcgattaag 20

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para amplificación de FRT-cat-sacB

<400> 10 ttcgatcacg gcacgatcat 20

<210> 11

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para amplificación de cat-sacS con sitio NheI 5'

<400> 11 ttagctagca tgtgacggaa g 21

<210> 12

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para amplificación de cat-sacS con sitio NheI 5'

<400> 12 ccgctagcat caaagggaaa a 21

<210> 13

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para clonación de frdABCD

<400> 13 ctggagtaca gcgacgtgaa gat 23

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador antisentido para clonación de frdABCD

<400> 14 cagaacgcgc tcgtagctca 20

<210> 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para clonación de ackA

<400> 15 gaactgcggt agttcttcac tg 22

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para clonación de ackA

<400> 16 gcgtcttgcg cgataaccag 20

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para clonación de lacZ-cynX

<400> 17 gaagtgacca gcgaatacct 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para clonación de lacZ-cynX

<400> 18 ggtgatgcct tcggtgatta 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de sentido para clonación de mgsA

<400> 19 gctattccac cgcagtctca 20

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador antisentido para clonación de mgsA

<400> 20 ttatggaaga ggcgctactg c 21

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para clonación de focA-pflB

<400> 21 agatcgccag ccgctgcaat 20

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para clonación de focA-pflB

<400> 22 aaccgttggt gtccagacag 20

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para clonación de adhE

<400> 23 ccgctgtctg ataactggtc 20

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para clonación de adhE

<400> 24 gcataagcgg atggtcactg 20

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de frdBC

<400> 25 gtggttgcca ccatcgtaat 20

<210> 26

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador antisentido para deleción de frdBC

<400> 26 cgccttctcc ttcttattgg 20

<210> 27

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de ackA

<400> 27 ctggacgctg ttgtattcac tg 22

<210> 28

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de ackA

<400> 28 gttgagcgct tcgctgtgag 20

<210> 29

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> antisentido lacZ con sitio NheI 5'

<400> 29 acgctagctc tgacaatggc a 21

<210> 30

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> antisentido cynX con sitio NheI 5'

<400> 30 acgctagcat tgccgctgat a 21

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de mgsA

<400> 31 agcgttatct cgcggaccgt 20

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador antisentido para deleción de mgsA

<400> 32 aagtgcgagt cgtcagttcc 20

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de focA-pflB

<400> 33 gcagcaggac gttattactc 20

<210> 34

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de focA-pflB

<400> 34 gcctacattg cgtaggctat t 21

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de sentido para deleción de adhE

<400> 35 gctgctccgg ctaaagctga 20

<210> 36

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador antisentido para deleción de adhE

<400> 36 acgctctacg agtgcgttaa g 21

<210> 37

<211> 375

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (1)..(375)

<223> secuencia parcial de genoma del microorganismo antes de la deleción de la cicatriz FRT

<400> 37

<210> 38

<211> 47

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (21)..(22)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo después de la deleción de la cicatriz FRT; sitio de escisión entre los nucleótidos 21 y 22

<400> 38 gccaataaga aggagaaggc ggtggttgcc accatcgtaa tcctgtt 47

<210> 39

<211> 900

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (1)..(900)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo antes de la deleción de la cicatriz FRT

<400> 39

<210> 40

<211> 37

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (19)..(20)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo después de la deleción de la cicatriz FRT; sitio de escisión entre los nucleótidos 19 y 20

<400> 40 ctcacagcga agcgctcaac tggacgctgt tgtattc 37

<210> 41

<211> 170

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (1)..(170)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo antes de la deleción de la cicatriz FRT

<400> 41

<210> 42

<211> 46

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (22)..(23)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo después de la deleción de la cicatriz FRT; sitio de escisión entre los nucleótidos 22 y 23

<400> 42 atggaactga cgactcgcac ttagcgttat ctcgcggacc gtctga 46

<210> 43

<211> 418

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (1)..(418)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo antes de la deleción de la cicatriz FRT

<400> 43

<210> 44

<211> 35

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (20)..(21)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo después de la deleción de la cicatriz FRT; sitio de escisión entre nucleótidos 20 y 21

<400> 44 atagcctacg caatgtaggc gcagcaggac gttat 35

<210> 45

<211> 120

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (1)..(120)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo antes de la deleción de la cicatriz FRT

<400> 45

<210> 46

<211> 36

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> características diversas

<222> (18)..(19)

<223> secuencia parcial del genoma del microorganismo después de la deleción de la cicatriz FRT; sitio de escisión entre los nucleótidos 18 y 19

<400> 46 aacgcactcg tagagcgtgc tgctccggct aaagct 36

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende las siguientes modificaciones genéticas para la cepa de E. coli KO11 (ATCC 55124): a) inserción del gen casAB de Klebsiella oxytoca detrás del codón de terminación de lacY; b) integración del gen celY de Erwinia chrysanthemi en el gen frdA; c) inactivación o deleción de focA-Z. mobilis pdc-adhBpflB; d) inactivación o deleción del gen de alcohol deshidrogenasa de E. coli nativa; y e) inactivación o deleción del gen de acetato-quinasa (ackA).

2. 2.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además genes de resistencia antibiótica inactivados o eliminados.

3. 3.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chrysanthemi se inactivan o eliminan en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción.

4. 4.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 2, donde el gen casAB de Klebsiella oxytoca y el gen celY de Erwinia chrysanthemi se inactivan o eliminan en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada después de la inserción.

5. 5.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 2, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

6. 6.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 3, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

7. 7.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 4, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

8. 8.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, donde los genes antibióticos se eliminan con recombinasa FLP.

9. 9.

   Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 7, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es SZ186 (NRRL B-30862).

10. 10.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 5, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es SZ132 (NRRL B-30861).

11. 11.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5, donde el gen mgsA de dicha cepa se inactiva o elimina en dicha cepa de E. coli genéticamente modificada.

12. 12.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la cepa de E. coli SZ194 (NRRL B30863) en la que el gen mgsA se ha inactivado o eliminado.

13. 13.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

14. 14.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 13, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada es TG112 (NRRL B-30926), TG113 (NRRL B-30927) o TG114 (NRRL B-30928).

15. 15.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 11 o 12, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada comprende además un gen nativo ldhA inactivado o eliminado y un gen heterólogo insertado recombinante que codifica una lactato deshidrogenasa L-específica.

16. 16.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 15, donde dicho gen de lactato dehidrogenasa Lespecífica heterólogo es un gen ldhL (por ejemplo, un gen ldhL obtenido de P. acidilactici).

17. 17.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, donde dicha cepa se desarrolla metabólicamente para crecimiento y producción de ácido láctico mejorados.

18. 18.

    Cepa de E. coli genéticamente modificada seleccionada del grupo que consiste en: SZ132 (NRRL B-30861); SZ186 (NRRL B- 30862); SZ194 (NRRL B-30863); TG103 (NRRL B-30864); TG102 (NRRL B-30921); TG105 (NRRL B-30922); TG106 (NRRL B-30923); TG107 (NRRL B-30924); TG108 (NRRL B-30925); TG112 (NRRL B-30926); TG113 (NRRL B30927); TG114 (NRRL B-30928); TG128 (NRRL B-30962); TG129 (NRRL B-30963); y TG130 (NRRL B-30964).

19. 19.

    Método de cultivo o de desarrollo de una cepa de E. coli genéticamente modificada que comprende la inoculación de un medio de cultivo con una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y cultivo de dicha cepa de E. coli genéticamente modificada.

20. 20.

    Método para producir D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico que comprende el cultivo de una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 bajo condiciones que permitan la producción de ácido D-(-)-láctico y opcionalmente neutralizar el ácido D-(-)-láctico para formar D-(-)-lactato.

21. 21.

    Método según la reivindicación 20, donde dicha cepa o cepas de E. coli genéticamente modificadas se seleccionan de TG112 (NRRL B-30926), TG113 (NRRL B-30927), TG114 (NRRL B-30928) o SZ194 (NRRL B-30863).

22. 22.

    Método para producir L-(+)-lactato o ácido L-(+)-láctico que comprende el cultivo de una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17 bajo condiciones que permitan la producción de ácido L-(+)-láctico y opcionalmente neutralizar el ácido L-(+)-láctico para formar L-(+)-lactato.

23. 23.

    Método según la reivindicación 22, donde dicha cepa o cepas de E. coli genéticamente modificadas son TG103 (NRRL B- 30864), TG105 (NRRL B-30922), TG106 (NRRL B-30923), TG107 (NRRL B-30924), o TG108 (NRRL B30925).

24. 24.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 19, 20, 21, 22 o 23, donde dicha cepa de E. coli genéticamente modificada se cultiva en uno o más medios de sales minerales.

25. 25.

    Método según la reivindicación 24, donde el medio de sales minerales comprende entre 2% y 20% (p/v) de un azúcar.

26. 26.

    Método según la reivindicación 25, donde el medio de sales minerales contiene 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% o 20% (p/v) de un azúcar.

27. 27.

    Método según la reivindicación 25 o 26, donde el azúcar es glucosa o sacarosa o una combinación de glucosa y sacarosa.

28. 28.

    Método según la reivindicación 20, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 11 se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico quiralmente puro.

29. 29.

    Método según la reivindicación 22, donde una cepa de E. coli genéticamente modificada según la reivindicación 15, 16 o 17 se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de L-(+)-lactato o ácido L-(+)-láctico quiralmente puro.

30. 30.

    Método según la reivindicación 21, donde dicho método produce D-(-)-lactato o ácido D-(-)-láctico quiralmente puro.

31. 31.

    Método según la reivindicación 23, donde dicho método produce L-(+)-lactato o ácido L-(+)-láctico quiralmente puro.

32. 32.

    Método según la reivindicación 28, 29, 30 o 31, que comprende además el paso de purificación del lactato quiralmente puro.

33. 33.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, donde el lactato se produce a concentraciones de al menos 0,5M.

34. 34.

    Método según la reivindicación 33, donde el medio de cultivo es un medio de sales minerales químicamente definido

    o medio de sales minerales NBS.

35. 35.

    Método según la reivindicación 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, donde el rendimiento de ácido láctico es de al menos 90%.

36. 36.

    Método según la reivindicación 36, donde el rendimiento es de al menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% o 99%.

37. 37.

    Método según la reivindicación 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36, donde no hay contaminación detectable de una forma estereoisomérica de ácido láctico o lactato con la otra forma estereoisomérica o la pureza quiral del estereoisómero específico es de al menos 99,9%.

38. 38.

    Composición que comprende una o más cepas de E. coli genéticamente modificadas según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 y medio de crecimiento.