JP5243546B2 - 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 - Google Patents

Description

本発明は、植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌に関する。

乳酸は、ポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある有用な物質である。乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸があり、現在工業生産されているポリ乳酸はＬ−乳酸ポリマーであるが、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。自然界には乳酸菌や糸状菌など乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、それらを用いた乳酸製造法には、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる微生物としてＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ等を、またＤ−乳酸を効率良く生産させる微生物としてＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物等を用いた方法が知られている。
但しいずれの用途においても、原料たる乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。

近年の研究の進展によって、Ｄ−乳酸を選択性高く高生産する微生物が発明されている（国際公開２００５／０３３３２４号パンフレット参照）。
また、安価な糖原料であるスクロースから高選択的にＤ−乳酸を生産する大腸菌も知られている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｈｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１８９１−１８９６（２００５）参照）。しかし、スクロースからＤ−乳酸を生産する大腸菌は生産性が低く、また、スクロースの資化に非常に時間がかかり、工業化において課題となっていた。
Ｌ−乳酸については、グルコースを原料としてＬ−乳酸を高い選択性で高生産する大腸菌は知られているものの（特開２００７−４９９９３号公報）、スクロースからＬ−乳酸を生産する大腸菌はなかった。

従来の知見によれば微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースＰＴＳ（Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System）とスクロース非ＰＴＳの２つに大別される（例えば、特開２００１−３４６５７８号公報）。スクロース非ＰＴＳを経由する場合、微生物はスクロースをそのままの形で取り込み、その後にグルコースとフルクトースに分解する。一方スクロースＰＴＳを経由する場合では、微生物はスクロースを取り込む際にスクロースをリン酸化し、スクロース−６−リン酸へと変換する。そして微生物内部でグルコース−６−リン酸とフルクトースに分解する。

即ちいずれのメカニズムを経由した場合でも、スクロース由来のフルクトースは、まずはリン酸化されない形で微生物内部に出現することとなる。そしてこのリン酸化されていないフルクトース（以下、非リン酸化フルクトースと呼ぶ）が解糖系へ取り込まれるためには、フルクトースがグルコースに異性化されるか、又はリン酸化される必要がある。しかし該微生物が大腸菌（一部のスクロースを資化できる大腸菌は除く）の場合、非リン酸化フルクトースをグルコースへ異性化する活性、フルクトースをリン酸化する活性はいずれも非常に低いことが文献で示唆されている（ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．１０５５−１０６２（２００５）；ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８（２６），ｐｐ．１５２５７−１５２５９（２００１）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８４（１９），ｐｐ．５３０７−５３１６（２００２）参照）ため、仮に大腸菌内部で非リン酸化フルクトースを出現させることに成功したとしても、別段の手段を講じない限り、当該大腸菌が非リン酸化フルクトースを資化することは期待できなかった。

スクロース非ＰＴＳはＣｓｃＢ（スクロースの取り込みを行う）、ＣｓｃＡ（微生物内部でスクロースの分解を行う）、ＣｓｃＫ（フルクトースのリン酸化を行う），ＣｓｃＲ（ＣｓｃＢ，Ａ，Ｋの発現を制御する）の４つの因子から構成されていることが知られている。上記Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｈｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１８９１−１８９６（２００５）には、これら４つの因子をＤ−乳酸生産大腸菌に導入し、スクロースからの対糖収率９３％、生産性＝９６．５ｇ／Ｌ／１２０時間を達成したと記載されている。しかしこの生産性は工業化の観点からは不十分なレベルであり、更なる生産性の向上が望まれた。

またＣａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．４１８−４２２（１９９９）は、大腸菌にｃｓｃＡのみを導入することでスクロースを原料にして大腸菌が増殖できるようになったことを開示している。しかしながら、肝心なスクロース由来のフルクトース資化については言及していない。スクロースを原料とした大腸菌による物質生産において重要なことの一つは、スクロース原料からの高収率の実現である。そのためにはスクロース由来グルコースのみならず、スクロース由来フルクトースも効率よく資化されることが必須条件となる。しかるにこの文献では、大腸菌にＣｓｃＡのみを導入し、スクロースが資化されることは示してはいるものの、スクロース由来フルクトースがどの程度資化されているかについては全くデータを開示してはいない。

ｃｓｃＡについては、ｃｓｃＡとｃｓｃＢとｃｓｃＫとｃｓｃＲの遺伝子群を導入することでホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に由来するアミノ酸、例えばトリプトファンの産生を更に向上することが知られている（例えば、特開２００７−４９９９３号公報）。

このように、スクロースから乳酸を生産する従来の方法では、いまだ生産性が低く、スクロースの資化に非常に時間がかかるため、安価で工業的に利用価値の高いスクロースを充分に利用して乳酸を工業的に生産する技術の向上に対する要請が依然として存在している。

本発明は、スクロースの資化をより短時間で行い、スクロースから乳酸をより効率よく生産するために有用な乳酸生産細菌及び乳酸生産方法を提供することを目的とする。

本発明は、乳酸生産細菌及び乳酸生産方法を提供する。即ち、本発明は、以下のとおりである。

［１］ スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）のみを有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系とフルクトースの代謝能力向上系とを備え、前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）活性の付与によるフルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化、又は、本来有しているＦｒｕＲ活性の不活化によるフルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化である、乳酸生産大腸菌。
［２］ 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む［１］記載の乳酸生産大腸菌。
［３］ 前記乳酸生産強化系が、Ｄ−乳酸又はＬ−乳酸を生成するためのＮＡＤＨ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む［１］又は［２］に記載の乳酸生産大腸菌。
［４］ 前記乳酸生産強化系が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、を含む［１］〜［３］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［５］ 前記乳酸生産強化系が、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、該大腸菌が本来有しているＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びＦＭＮ依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、を含む［１］〜［４］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［６］ 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する［１］〜［５］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［７］ 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリＯ１５７細菌に由来する［１］〜［６］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［８］ 前記フルクトース−１−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する請求項［１］〜［７］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［９］ 前記フルクトース−１−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来の蛋白質である［１］〜［８］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１０］ 大腸菌Ｋ１２由来株である［１］〜［９］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１１］ ［１］〜［１０］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。

本発明によれば、スクロースの資化をより短時間で行い、乳酸をより効率よく生産するために有用な乳酸生産細菌及び乳酸生産方法を提供することができる。

本発明の実施例１０にかかる各種乳酸生産細菌を用いて培養４８時間後に生成された乳酸の蓄積量を示すグラフである。

本発明の乳酸生産菌は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む１種以上の遺伝子（ただし、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせと、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせとを除く）を有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系を備えている乳酸生産大腸菌である。
本発明の乳酸生産方法は、上記乳酸生産細菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法である。

本発明の乳酸生産菌は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む１種以上の遺伝子（ただし、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせと、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせとを除く）を有し、且つ、乳酸生産強化系を備えているので、スクロース由来のフルクトースをリン酸化して菌体内に取り込むことができると共に、このフルクトースを、乳酸生産強化系を用いて乳酸へ変換する。スクロース資化能を持たない菌において、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうち、スクロース加水分解酵素を少なくとも含む１種以上の遺伝子を付与し、スクロースを炭素源として物質生産をさせた例はこれまで全く報告されていない。
本発明は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群を全てではなく不完全な状態で、即ち、スクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含む１種以上の遺伝子を、乳酸生産大腸菌に導入することによって、スクロース由来フルクトースが高効率に資化されること、更には従来よりも著しく生産性が高まることを見出したものである。この結果、植物に由来し、安価で工業的に価値の高いスクロースから、効率よく短時間で乳酸を得ることができる。

特に、本発明の乳酸生産細菌は、他の糖資源であるグルコースの有無にかかわらず、スクロースやその分解産物であるフルクトースを資化して、乳酸を生産することができるので、グルコースなどの他の糖基質の減少又は枯渇を待たずに乳酸を生産することができ、より効率的である。
一般に、大腸菌では通常グルコースの取り込みがフルクトースよりも優先され、グルコースの存在下ではフルクトースは充分に代謝されないことが知られている。また、糖代謝は生物にとって基本的な機能である。このため、フルクトース代謝経路のリン酸化活性又はフルクトース取り込み能力を強化することで、細菌の生育が阻害されず、またグルコースによる代謝抑制（カタボライトリプレッション）の影響を受けずに、効率よく乳酸の生産を行うことができたことは、驚くべきことである。

本発明におけるスクロース非ＰＴＳ遺伝子群とは、微生物のスクロース資化経路のうち非ＰＴＳ系に関与する遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、スクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）で構成される遺伝子群である。本発明では、このうちｃｓｃＡを少なくとも含む１種以上であればよく、例えば、ｃｓｃＡのみ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＢの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＢとｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＫとｃｓｃＲの組み合わせが挙げられる。なお、本発明では、導入されるスクロース非ＰＴＳ遺伝子群の遺伝子の組み合わせから、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせと、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせは除かれる。
なかでも、乳酸を更に効率よく生産するという観点から、ｃｓｃＡをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。

本発明におけるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
この酵素は、Ｋ１２株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、プロトン共輸送体、インベルターゼ、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非ＰＴＳ代謝経路の酵素の１つである（Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45,
pp418-422参照）。本発明においてこのＣｓｃＡを付与することにより、特にｃｓｃＡのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースを細胞膜上でグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースＰＴＳ及びフルクトースＰＴＳを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化を可能にすることができる。

本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。またｃｓｃＡには、ｃｓｃＡを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。

本発明の宿主細菌に導入されるリプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明の宿主細菌に導入されるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明の宿主細菌に導入されるスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明においてスクロース資化とは、スクロースを、そのまま、低分子化または高分子化して、好ましくは低分子化して、生体内に取り入れる能力、あるいは代謝的に別物質に変換する能力をいう。また、本発明において、資化とはスクロースをより低分子化する分解を含む。詳しくは、スクロースをＤ−グルコースとＤ−フルクトースに分解することを含む。
本発明におけるフルクトースの代謝能力が向上しているとは、フルクトースの菌体内への取り込みが増加している状態を指す。フルクトースの代謝能力向上系とは、フルクトースの代謝能力を向上させるための構造を意味する。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明の乳酸生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
本明細書中で示された数値範囲は、記載された数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

本発明における乳酸生産強化系とは、遺伝子組み換えにより導入又は改変された乳酸生産能力を向上させるための構造をいう。このような乳酸生産強化系は、対象となる大腸菌における本来の乳酸生産量を増加させるものであればいずれのものであってもよい。好ましくは、乳酸生産活性に関与する酵素活性の不活性化、低減化若しくは増強又はこれらの組み合わせを挙げることができる。これにより、上記のＣｓｃＡ活性と組み合わせて、本来はスクロース資化能を有しない大腸菌であっても、スクロースから乳酸を効果的に生産することができる。
なお、本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。

本発明における「不活化」とは、既存のいかなる測定系によっても、測定された当該酵素又は転写因子であるＦｒｕＲの活性が検出限界以下である状態を指す。ここでいうＦｒｕＲの活性とは、ＦｒｕＲによって制御される遺伝子の発現によって生じる蛋白質の量、又は蛋白質の機能を定量化したものを指す。
本発明における「低減化」とは、当該酵素又は転写因子であるＦｒｕＲをコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素又はＦｒｕＲの活性が低下している状態を指す。ここでいうＦｒｕＲの活性とは、ＦｒｕＲによって制御される遺伝子の発現によって生じる蛋白質の量、又は蛋白質の機能を定量化したものを指す。

本発明における乳酸生産強化系については、ピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）活性の不活化あるいは低減化、Ｄ−乳酸又はＬ−乳酸を生成するためのＮＡＤＨ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強、又はこれら双方を含むものであることが、副生物の低減及び乳酸生産量の増加の観点から好ましい（ピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）活性の不活化あるいは低減化についてはＷＯ２００５／０３３３２４参照。ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強についてはＹａｎｇらの文献（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｖｏｌ．１（２），ｐｐ１４１−１５２（１９９９）参照）。

本発明におけるピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．５４に分類され、ホルメートアセチルトランスフェラーゼとも呼ばれる酵素である。本酵素はピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。

本発明におけるＮＡＤＨ依存性乳酸デヒドロゲナーゼには、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）とＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｄｈ２）が挙げられる。ＬｄｈＡとは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＤ−乳酸とＮＡＤを生成するエシェリヒア・コリ由来の酵素を指す。Ｌｄｈ２とは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＬ−乳酸とＮＡＤを生成する酵素を指し、例えばビフィドバクテリウム・ロングム由来の酵素を例示することができる。
本発明において乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強とは、ＬｄｈＡ又はＬｄｈ２をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意にＬｄｈＡ又はＬｄｈ２をコードする遺伝子より生産される酵素の活性が増加した状態を指す。

なお、乳酸にはＤ−乳酸及びＬ−乳酸の光学異性体があるため、いずれか一方の光学異性体の生産量を高めるために、ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ又はＮＡＤＨ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性の強化を含む系を、本発明では特に「Ｄ−乳酸生産強化系」又は「Ｌ−乳酸生産強化系」と称する場合がある。従って、目的とする乳酸の種類によって適宜、乳酸生産強化系の種類を選択することができる。

特に、Ｄ−乳酸をより迅速に生成するためには、Ｄ−乳酸生産強化系は該大腸菌が本来有しているＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｌｄ）活性の不活化あるいは低減化を更に含むものであってもよい。更に好ましくは、Ｄ−乳酸生産強化系は、該大腸菌が本来有しているＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｌｄ）活性の不活化あるいは低減化と、ピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）活性の不活化あるいは低減化及びＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強の少なくとも一方、との双方を備えることができ、Ｄｌｄ活性の不活性化あるいは低減と、Ｐｆｌ活性の不活性化あるいは低減と、エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）活性の増強とのいずれも備えたものであることが最も好ましい。

またＬ−乳酸をより迅速に生成するためには、Ｌ−乳酸生産強化系は、該大腸菌が本来有しているＦＭＮ依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｌｄＤ）活性又はＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）活性の不活化あるいは低減化を更に含むものであってもよく、好ましくは、ＬｌｄＤ活性とＬｄｈＡ活性が同時に不活化あるいは低減化されているとよい。更に好ましくは、ｐｆｌ活性、ｌｌｄ活性及びｌｄｈＡ活性の少なくとも１つの活性が不活化あるいは低減化され、且つＮＡＤＨ依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されているとよい。最も好ましくは、Ｐｆｌ活性及びＬｌｄＤ活性及びＬｄｈＡ活性のいずれもが不活化あるいは低減化され、且つビフィドバクテリウム由来ＮＡＤＨ依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されているとよい。

本発明におけるＦＭＮ依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｌｄＤ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．２．３に分類される酵素である。本酵素はＬ−乳酸からピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。

本発明においてＬｄｈＡ活性が増強され、かつＰｆｌ活性が不活化あるいは低減化された細菌の例として、ＷＯ２００５／０３３３２４号に記載のＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡを例示できる。

本発明におけるＬｄｈＡ活性又はＬｄｈ２を増強する方策の一つとして、ＬｄｈＡ又はＬｄｈ２をコードする遺伝子を、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、それを所望の細菌へ導入する方法が有効である。その場合の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に細菌内、好ましくはエシェリヒア・コリ内で機能する強力なプロモーターで、且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指し、具体的にはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）プロモーターが例示できる。このようにして得られた細菌は、通気条件下でＤ−乳酸又はＬ−乳酸を生産させる時にｌｄｈＡ又はｌｄｈ２の発現が増強されていないものと比較してＤ−乳酸又はＬ−乳酸の蓄積量が向上し、不純物のピルビン酸濃度が減少すると共にＤ−乳酸又はＬ−乳酸の光学純度を向上させることが可能となる。

本発明におけるＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｌｄ）とは、Ｄ−乳酸から、補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。
本発明におけるＤｌｄ活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＰｆｌ活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＬｄｈＡ活性が増強されていることを特徴とする微生物として、ＷＯ２００５／０３３３２４号に記載のエシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８）株が例示できる。

本発明における解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターで、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７−４４０に記されている。

本発明におけるＬｄｈＡをコードする遺伝子がゲノム上において、解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ｌｄｈＡを発現し、Ｐｆｌ活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＤｌｄ活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする微生物としては、ＷＯ２００５／０３３３２４号に記載のエシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８）株を例示することができる。
エシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４株は、ｌｄｈＡ遺伝子をゲノム上においてＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結することで発現させており、また遺伝子破壊によりＰｆｌＢ、Ｄｌｄが不活化している。該菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８の寄託番号で、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、平成１６年３月１９日より寄託されている。

本発明の乳酸生産細菌は、フルクトース代謝能力向上系を更に備えていることが、乳酸生産効率の観点から好ましい。このようなフルクトース代謝能力向上系としては、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化あるいはフルクトース取り込み能力の強化によるものを挙げることができる。このとき、フルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化がフルクトース−１−リン酸キナーゼ活性の付与であり、フルクトース取り込み能力の強化がＦｒｕＲ活性の低減に由来するものであることが、乳酸生産効率の観点から更に好ましい。

本発明における能力の「付与」又は「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものを含む。

本発明におけるリン酸化能力の「強化」とは、リン酸化酵素の活性が向上して、リン酸化された基質の量、又は当該リン酸化された基質から派生する代謝物の量が、有意に増加した状態を指す。
本発明におけるフルクトース取り込み能力の強化とは、ＦｒｕＲが制御する酵素活性が、ＦｒｕＲをコードする遺伝子の遺伝子組み換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも、有意に当該酵素活性が低下している状態を指す。
本発明における酵素の活性は、既存の測定系のいずれによって測定された活性であってもよい。

本発明におけるフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．７．１．５６に分類され、ホスホフルクトキナーゼ１とも呼ばれる酵素である。細菌類、例えば大腸菌においてグルコース存在下でのフルクトース取り込みが一般に抑制されるのに対して、ＦｒｕＫの発現強化がグルコースの存在下にもかかわらず、フルクトースの取り込みを促進し、Ｄ−乳酸生産細菌においてＤ−乳酸の生産性の向上に寄与するという知見はこれまでに全くみられていない。また、上記ＣｓｃＡによってスクロースからできたフルクトースが細胞内に取り込まれてフルクトース−１−リン酸に代謝された後、一連のフルクトース代謝系におけるｆｒｕＫの発現強化のみで乳酸の生産性が向上することも予想外であった。

本発明の宿主細菌に導入されるフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア属菌（Escherichia）、シュードモナス属菌（Pseudomonas）、アエロバクター属菌（Aerobacter）、クロストリジウム属菌（Clostridium）に由来するもの、特にエシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明におけるＦｒｕＲは、微生物がフルクトースをリン酸化して細胞内へ取り込む系であるフルクトースＰＴＳ経路を構成する遺伝子群、即ちフルクトースオペロンの発現を制御している。大腸菌の場合であれば、具体的にはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の８８０２８〜８９０３２に記載されている配列を有する遺伝子を挙げることができる。ＦｒｕＲ遺伝子を破壊すると、フルクトースへのリン酸供与体であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の合成活性が抑制されることが知られており、結果としてフルクトースは菌体内に取り込まれないことになると一般には予想される（Microbiology Reviews, Sept.,
pp.543-594 (1993) 参照）。従って、ｆｒｕＲの発現の低減がフルクトースの取り込みを促進することがあるということは全く予想外のことであり、Ｄ−乳酸生産細菌においてＤ−乳酸の生産性の向上に寄与するという知見も全く新規なものである。

本発明において発現が低減されるＦｒｕＲの遺伝子としては、宿主細菌が本来保有するものであればよく、宿主細菌が本来有するＦｒｕＲをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて組み込まれた合成ＤＮＡ配列としてもよい。

より好ましくは、スクロース加水分解酵素及びフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）がいずれも、エシェリヒア・コリＯ１５７又はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来の各蛋白質をコードする遺伝子の導入により得られたものとすることができる。これらの細菌由来の遺伝子とすることにより、確実に機能発現させることができる。

本発明において酵素の活性を付与した細菌とは、菌体外から菌体内へ何らかの方法によって該酵素活性が与えられた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内に導入する等の方法を用いて作出することができる。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。

本発明において酵素の活性が低減された細菌とは、上記の活性を付与した細菌と同様に、菌体外から菌体内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を破壊すること（遺伝子破壊）により作出することができる。

本発明における遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊の結果、その遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。

遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊）が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１，１２１９−１２２１（１９８５）やＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，１５１１−１５１９（１９９５）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７，６６４０−６６４５（２０００）に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。

本発明において大腸菌とは、本来植物由来原料から乳酸を生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料から乳酸を生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。

ここで上記の各遺伝子を導入する大腸菌としては、通常の乳酸生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。より好ましくは、乳酸生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よく乳酸を生産させることができる。特に、本発明よれば、本来はスクロース資化能を備えていない大腸菌にスクロース資化能を付与し、スクロースから効率よく乳酸を生産することができる。このような、スクロース資化能を本来は備えていない大腸菌としては、Ｋ１２株、Ｂ株、Ｃ株及びその由来株等を挙げることができる。

このような乳酸生産細菌としては、例えば国際公開２００５／０３３３２４号パンフレットに記載されているピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）活性が不活性化あるいは低減化され、且つエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ-乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）活性が増強された大腸菌、あるいは、これらの特性に加えて更にＦＡＤ依存性Ｄ-乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｌｄ）活性が不活性化された大腸菌、又は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）活性が不活化または低減されている大腸菌であって、Ｐｆｌ活性が不活化または低減されている、且つ／またはＤｌｄ活性が不活化または低減された大腸菌などを挙げることができる。

本発明において各種遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターであることが好ましく、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
また各種遺伝子を不活性化させるための手段としては、この目的で通常用いられる手段であれば特に制限されずに用いることができ、例えば相同組換え等による遺伝子破壊を挙げることができる。

本発明の乳酸生産方法は、上記乳酸生産細菌を用いてスクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産させることを含むものであり、即ち、上記乳酸生産細菌と、スクロースを含む植物由来原料とを接触させる工程と、接触により得られた乳酸を回収する回収工程とを含むものである。

上記乳酸生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、スクロースを含む植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花又は種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。

このような植物由来原料に包含される炭素源には、スクロースの他に、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物やセルロース加水分解物など又はこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。

本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。

接触工程における乳酸生産細菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地で乳酸生産細菌を培養することにより行われる。

植物由来原料と乳酸生産細菌との接触密度は、乳酸生産細菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、細菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。

また培地中の乳酸生産細菌の含有量としては、細菌の種類及び活性によって異なるが一般に、初発の菌濃度を培養液に対して０．１質量％〜３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。

乳酸生産菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた培地であれば特に制限はない。

炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機体窒素源、及び蛋白質加水分解物等の有機体窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。

有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。

好ましくは、２種以上のアミノ酸が添加された培地を挙げることができる。このような培地を用いることによって、より効率よく乳酸を生産することができる。２種以上のアミノ酸が添加された培地とは、天然に存在する各種アミノ酸の中から少なくとも２種以上を含有する培地を意味し、酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカーなどの天然物や天然物抽出物の加水分解物を含有する培地も含む。より好ましい結果を得るためには酵母エキス、ペプトン、ホエー、廃糖蜜及びコーンスティープリカーより選ばれる少なくとも１種類、もしくはそれらの混合物が０．５質量％から２０質量％含む培地が好ましく、２質量％から１５質量％ではさらに好ましい。特にコーンスティープリカー添加は大きな効果が得られ、このとき硫酸アンモニウムなどの塩は添加しないほうがむしろよい結果となる場合がある。培地は通常液体培地である。

培養条件としては作成された菌体、培養装置により変動するが、一般に、培養温度は２０℃から４０℃、より好ましくは２５℃から３５℃で培養することが好ましく、ｐＨはＮａＯＨ、ＮＨ_３等で４〜９、好ましくは６．０〜７．２、より好ましくは６．５〜６．９で調整し、培養することが好ましい。培養時間は特に限定されないが、菌体が十分に増殖し、且つ乳酸が生成するに必要な時間である。

培養に際しては通常は温度、ｐＨ、通気条件、攪拌速度を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本発明の培養に際しては培養槽を使用することに限定されない。培養槽を用いて培養する場合には、必要により、予め前培養として種培養を行い、これを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。

本発明で得られた微生物を培養して乳酸を生産させる際には、通気を全く行わなくともよいが、より好ましい結果を得るためには通気を行った方がよい。ここで言う通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。

液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより溶存酸素濃度が変化するために乳酸の生産性および乳酸以外の有機酸量などを指標に次のように最適条件を求めることができる。例えばＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、５００ｇの培養液を使用した際、空気を常圧で０．００５Ｌ／分〜０．５Ｌ／分、撹拌速度５０ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、より好ましくは、常圧で０．０５Ｌ／分〜０．２５Ｌ／分、撹拌速度１００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。この条件は通気撹拌条件が温度３０℃の水を対象とした場合常圧で酸素移動速度係数ｋ_Ｌａが１／ｈ以上４００／ｈ以下となる条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件である。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。

回収工程では、この接触によって得られた乳酸を回収するものであり、一般に、上記培養により得られた培養物から乳酸を回収することにより行われる。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。

培養物から乳酸を回収する方法は、例えば培養液からならば通常知られた方法が利用でき、例えば、菌体を遠心分離などで除去した後、酸性化した後直接蒸留する方法、ラクチドを形成させて蒸留する方法、アルコールと触媒を加えエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に抽出する方法、イオン交換カラムで分離する方法、電気透析により濃縮分離する方法などやそれらを組み合わせた方法が採用できる。また、本発明の方法により生産された菌体は、乳酸の生産に適した酵素群を生産していることから、これを利用してさらに乳酸を生産し、回収することも培養物から乳酸を回収する方法の一部とみなされる。

以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」及び「部」は質量基準である。

［実施例１］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ｄｌｄ遺伝子欠失株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下ｄｌｄと略すことがある）の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ１００３８）。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧ（配列番号１）、ＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ（配列番号２）、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号３）及びＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣ（配列番号４）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と配列番号２のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｄｌｄ−Ｌ断片と呼ぶことがある）を増幅し、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｄｌｄ−Ｒ断片と呼ぶことがある）を増幅した。得られたｄｌｄ−Ｌ断片、ｄｌｄ−Ｒ断片をそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ、ＰｓｔＩとＸｂａＩで消化した。このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（Hashimoto-Gotoh, T., et.al., Gene, Vol.241(1), pp185-191 (2000)）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。得られたプラスミドをｐＴＨΔｄｌｄと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

［実施例２］
実施例１で得られたプラスミドｐＴＨΔｄｌｄをＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。

次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈（１０^−２〜１０^−６程度）し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｄｌｄを含む約２．０ｋｂ断片を増幅させ、ｄｌｄ遺伝子領域が欠失している株を選抜し、以上を満足するクローンをｄｌｄ欠失株とし、得られた株をＭＧ１６５５Δｄｌｄ株と命名した。

［実施例３］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｐｆｌＢ、ｄｌｄ遺伝子欠失株作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０８０３５）。ｐｆｌＢ遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧ（配列番号５）、ＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＣＧ（配列番号６）ＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＧ（配列番号７）ＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ（配列番号８）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号６のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｐｆｌＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）を増幅し、配列番号７と配列番号８のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｐｆｌＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｆｌＢ−Ｌ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで、ｐｆｌＢ−Ｒ断片をＳｐｈＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ｐｆｌＢ遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、ｐＴＨΔｐｆｌと命名した。

得られたプラスミドｐＴＨΔｐｆｌを、実施例２で得られたＭＧ１６５５Δｄｌｄ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
得られたクローンから、実施例２と同様の方法に従ってｐｆｌ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５Δｄｌｄ株を得、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株と命名した。

［実施例４］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｍｄｈ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ２４７７７）。ｍｄｈ遺伝子（９３９ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号９）、ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号１０）、ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧ（配列番号１１）及びＡＡＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＡＣ（配列番号１２）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２の組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約８００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１，０００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｍｄｈ−Ｌ断片をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで、ｍｄｈ−Ｒ断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＫｐｎＩ及びＸｂａＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ｍｄｈをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをｐＴＨΔｍｄｈと命名した。

プラスミドｐＴＨΔｍｄｈを実施例３で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、実施例２と同様の方法に従って、ｍｄｈ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株と命名した。

［実施例５］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのａｓｐＡ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０４０６６）。ａｓｐＡ遺伝子（１，４８２ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧ（配列番号１３）、ＣＧＡＡＣＡＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＧＧ（配列番号１４）、ＴＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＡＣＣＣＧＡＧ（配列番号１５）及びＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１６）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１５と配列番号１６の組み合わせで、上記プライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約９１０ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１，１００ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ａｓｐＡ−Ｌ断片とａｓｐＡ−Ｒ断片の両者ともにＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）で末端を平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にて５´末端をリン酸化した。また、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を、ＳｍａＩ消化後、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸化処理を行った。上記のリン酸化した２種類の断片と、脱リン酸化したプラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ａｓｐＡ遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得て、このプラスミドをｐＴＨΔａｓｐと命名した。

プラスミドｐＴＨΔａｓｐを実施例４で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株に形質転換し、最終的にａｓｐＡ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株を得、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株と命名した。本株を得る詳細な方法は、本発明の実施例２に記載された方法に準じた。

［実施例６］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株のゲノム上ｌｄｈＡプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換＞
エシェリヒア・コリのｌｄｈＡ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ３６９２８）。グリセルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号１７）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号１８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）を取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴ（配列番号１９）、及びＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＣ（配列番号２０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）遺伝子フラグメントを得た。上記の２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｌｄｈＡを回収した。

さらにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｌｄｈＡ遺伝子５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号２１）とＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号２２）を用いて、エシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のグリセルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号２３）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｌｄｈＡ遺伝子の配列情報に基づいて作製されたＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＣＣ（配列番号２４）を用いて、先に作製したプラスミドｐＧＡＰｌｄｈＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子の開始コドン近傍領域からなる約８５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。

上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化し、このフラグメントを、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡと命名した。

得られたプラスミドｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡを、実施例５で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、さらにクロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子を含む約８００ｂｐ断片を増幅させ、ｌｄｈＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。

［実施例７］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のｆｒｕＲ遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、ｆｒｕＲ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の８８０２８〜８９０３２に記載されている。

ｆｒｕＲ遺伝子（１００５ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＡＡＣＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧ（配列番号２５）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号２６）、ＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣ（配列番号２７）及びＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号２８）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２７と配列番号２８の組み合わせで上記プライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約９５０ｂｐ（以下ｆｒｕＲ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約８８０ｂｐ（以下ｆｒｕＲ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｆｒｕＲ−Ｌ断片をＰｓｔＩ及びＸｂａＩで、ｆｒｕＲ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ｆｒｕＲ遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをｐＴＨΔｆｒｕＲと命名した。

プラスミドｐＴＨΔｆｒｕＲを実施例６で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、実施例２と同様の方法に従って、ｆｒｕＲ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。

［実施例８］
＜エシェリヒア・コリＯ１５７由来スクロース加水分解酵素（インベルターゼ）遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリＯ１５７のインベルターゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、インベルターゼをコードする遺伝子（ｃｓｃＡ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３〜３２７５８１６に記載されている。上記遺伝子がコードする蛋白質のＮ末端側には、アミノ酸一文字表記でＭＴＱＳＲＬＨＡＡ（配列番号３５）で表記される、疎水性が高くシグナルペプチダーゼで切断されるアミノ酸配列と同様な配列が存在する。上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。

ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号２９）、及びＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号３０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。

インベルターゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）をテンプレートに用いて、ＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号３１）、及びＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号３２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩで消化することで約１．４ｋｂｐのインベルターゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを回収した。

このプラスミドｐＧＡＰ-ｃｓｃＡを実施例７で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｃｓｃＡ株を得た。
また実施例６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｃｓｃＡ株を得た。

［実施例９］
＜エシェリヒア・コリＯ１５７由来インベルターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来フルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のフルクトース−１−リン酸キナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、フルクトース−１−リン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｆｒｕＫ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ
Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２２６０３８７〜２２５９４４９に記載されている。

フルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣ（配列番号３３）、及びＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧ（配列番号３４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩで消化することで約１.０ｋｂｐのフルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと実施例８で作成したプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫを回収した。

このプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫを実施例６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を得た。

［実施例１０］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｃｓｃＡ株によるＤ−乳酸生産＞
前培養としてＬＢ Ｂｒｏｔｈ、Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌを入れた５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコ３本に、実施例８で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｃｓｃＡ株（以下、「ｆｒｕＲ破壊株」又は「ΔｆｒｕＲ株」）、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株（以下、「ｃｓｃＡ株」）、実施例９で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株（以下、「ｆｒｕＫ強化株」又は「＋ｆｒｕＫ株」）を各々植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。その後、３台の１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に、表１に示す培地４７５ｇを入れたものに、別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。

培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．４（２４％ ＮａＯＨで調整）で４８時間行った。培養終了後、得られた培養液中の乳酸の濃度を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーを用い、以下の設定にて定量した。測定の結果を表２及び図１に示した。
カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化工社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．１）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器
測定波長：２８０ｎｍ

ｃｓｃＡを含む４種の非ＰＴＳスクロース資化経路の遺伝子（ｃｓｃＡ、ｃｓｃＲ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＢ）を大腸菌に導入してスクロースから乳酸を生産させた公知例（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２７，１８９１−１８９６（２００５））では、９６．５ｇの乳酸を生産させるために１２０時間の培養時間を要している。これに対して本発明の上記乳酸生産大腸菌（ｃｓｃＡ、ｆｒｕＫ強化株、ｆｒｕＲ破壊株）はいずれも、ほぼ同量以上の乳酸を僅か４８時間の培養で生産しており、スクロースの資化を、一部のスクロース非ＰＴＳ遺伝子群の活性、特にｃｓｃＡのみを導入することによって乳酸生産時間を大幅に短縮できることを実証した。

特に、ｃｓｃＡに対してｆｒｕＫ遺伝子を導入することによって、スクロースを原料としたＤ−乳酸の生産性が約１．２倍、ｆｒｕＲ遺伝子を破壊することによってＤ−乳酸の生産性が約１．１倍向上することが明らかとなった。
このとき、全ての株において培養開始時に投入されたスクロースは完全になくなっていた。また、ｆｒｕＫ遺伝子を導入またはｆｒｕＲ遺伝子を破壊することによって、スクロースの分解によって得られるフルクトースが、遺伝子の導入または破壊のない株に比べて早く資化されることが明らかとなった。

［比較例１］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＢＲｇａｐＰ株によるＤ−乳酸生産＞
実施例１０と同様に、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＢＲｇａｐＰ株のＤ−乳酸生産を調べた。本菌株は、導入したプラスミドにｃｓｃＡ遺伝子が含まれていないだけで、基本的にＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株と同等である。培地組成も実施例１０と同じであるが、スクロースはフィルターろ過滅菌をして用いた。４８時間培養後の培養液中のＤ−乳酸濃度は、０ｇ／Ｌだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトースの濃度も０ｇ／Ｌだった。
この結果より、ｃｓｃＡ遺伝子を欠失するとスクロースを資化して乳酸を生産できないことが確認された。

［実施例１１］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株による廃糖蜜からのＤ−乳酸生産＞
実施例１０と同様に、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株の廃糖蜜からのＤ−乳酸生産を調べた。
下記の表３に示す培地４７５ｇ入れたものに、実施例１０で得られたものと同様の前培養したフラスコ内容物全量（２５ｍｌ）を植菌した。

培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．４（２４％ ＮａＯＨで調整）で４８時間行った。
４８時間培養後の培養液中のＤ−乳酸濃度は、９６．４７ｇ／Ｌだった。この時、培養液中のグルコースとフルクトース、スクロースの濃度は０ｇ／Ｌだった。
この結果より、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料として乳酸を生産できることが確認された。

［実施例１２］
＜ビフィドバクテリウム由来ｌｄｈ２遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ-ｌｄｈ２株の構築＞
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ２）はＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３３５８５に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の５５５〜１５１７に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。

ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号２９）、及びＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号３０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。

Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＡＴＣＣ １５７０７）をテンプレートに用いて、ＡＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣ（配列番号３６）、及びＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧ（配列番号３７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ｌｄｈ２を回収した。

このプラスミドｐＧＡＰ-ｌｄｈ２を実施例３で作成したｐＴＨΔｐｆｌを用い、実施例２と同様な手法でｐｆｌ遺伝子を欠失させたＭＧ１６５５株（ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株と呼ぶ）のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ-ｌｄｈ２株を得た。

［実施例１３］
＜ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株によるＬ−乳酸生産＞
実施例１０と同様に、実施例１２で得られたＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株のグルコースからのＬ−乳酸生産を調べた。
下記の表４に示す培地４７５ｇ入れたものに、実施例１０で得られたものと同様に前培養したフラスコ内容物２５ｍｌを植菌した。

培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（２４％ ＮａＯＨで調整）で１８時間行った。
１８時間培養後の培養液中のＬ−乳酸濃度は、９７．０２ｇ／Ｌだった。
この結果より、ビフィドバクテリウム由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いて、グルコースからＬ−乳酸を生産できることを確認した。

［実施例１４］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｌｄｈ２株の構築＞
実施例１２で作成したｐＧＡＰ-ｌｄｈ２プラスミドを実施例６で構築したＤ−乳酸生産株に導入した形質転換体を作成した。具体的には以下のように行った。
プラスミドｐＧＡＰ-ｌｄｈ２を実施例６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換した。アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｌｄｈ２株を得た。

［実施例１５］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株によるＬ−乳酸生産＞
実施例１３と同様に、実施例１４で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株のグルコースからのＬ−乳酸生産を調べた。
培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（２４％ ＮａＯＨで調整）で１８時間行った。
１８時間培養後の培養液中のＬ−乳酸濃度は、１１６．８４ｇ／Ｌだった。
この結果より、Ｄ−乳酸生産用大腸菌株を用いて、グルコースを原料としてＬ−乳酸を生産できることを確認した。Ｌ−乳酸が生産されたことは、Ｆ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、Ｌ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定することで確認した。

［実施例１６］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株の構築＞
実施例６で用いたＤ−乳酸生産用大腸菌株（ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株）のｌｄｈＡ遺伝子をｌｄｈ２遺伝子に置き換え、更にＬ−乳酸の分解を触媒する酵素の遺伝子ｌｌｄＤを破壊して、Ｌ−乳酸生産用大腸菌株を構築した。更にｆｒｕＲ遺伝子を破壊し、Ｌ−乳酸生産用大腸菌ｆｒｕＲ破壊株を構築した。具体的には、以下のようにして行った。

（ｌｄｈＡ遺伝子破壊株の作成）
ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡのｌｄｈＡ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号２１）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号２２）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣ（配列番号３８）及びＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＡＡＣＣ（配列番号３９）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。これらのプライマーを用い、実施例１と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドｐＴＨΔｌｄｈＡを構築した。更に、ｐＴＨΔｌｄｈＡをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例２と同様な手法を用いてｌｄｈＡ欠失株を選択した。得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株と命名した。

（ｄｌｄ遺伝子復帰株の作成）
大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧ（配列番号４０）、ＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣ（配列番号４１）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。これらのプライマーを用い、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで切断した。さらにプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで切断し、上記ｄｌｄ断片と混合した後、リガーゼで結合し、プラスミドｐＴＨＤＬＤを構築した。更に、ｐＴＨＤＬＤをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例２と同様な手法を用いてｄｌｄ復帰株を選択した。得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株と命名した。

（ｌｌｄＤ遺伝子破壊株の作成）
ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡのｌｌｄＤ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＡＴＣＴ（配列番号４２）、ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＧＧ（配列番号４３）、ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＴＧＧ（配列番号４４）及びＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＧ（配列番号４５）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。これらのプライマーを用い、実施例１と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドｐＴＨΔｌｌｄＤを構築した。更に、ｐＴＨΔｌｌｄＤをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株コンピテントセルに形質転換し、実施例２と同様な手法を用いてｌｌｄＤ欠失株を選択した。得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株と命名した。

（ｌｄｈ２遺伝子ゲノム挿入株の作成）
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＬ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ２）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３３５８５に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の５５５〜１５１７に記載されている。
Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ２）を取得する為にビフィドバクテリウム・ロンガム（ＡＴＣＣ１５７０７）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣ（配列番号４６）、ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧ（配列番号４７）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで切断した。

ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号４８）、ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧ（配列番号４９）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで切断した。

上記で得られたｐＴＨΔｌｄｈＡをＸｂａＩで切断したプラスミド、上記で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム由来ｌｄｈ２のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片、及び大腸菌由来ＧＡＰＤＨプロモーターのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＴＨΔｌｄｈＡ：：ＧＡＰＬＤＨ２を回収した。得られたプラスミドをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株に形質転換し、実施例２と同様の方法を用いてｌｄｈ２ゲノム挿入株をｌｄｈ２をＰＣＲで増幅することにより選択した。
得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株と命名した。

（ｆｒｕＲ遺伝子破壊株の作成）
実施例７で作成したプラスミドｐＴＨΔｆｒｕＲをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株に形質転換し、実施例２と同様の方法に従って、ｆｒｕＲ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株と命名した。

［実施例１７］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株の構築＞
実施例１６で構築したＬ−乳酸生産用大腸菌株とＬ−乳酸生産用大腸菌ｆｒｕＲ破壊株のそれぞれに、スクロース加水分解酵素（インベルターゼ）遺伝子発現ベクターを導入し、スクロースからＬ−乳酸を生産する大腸菌株を構築した。具体的には以下のようにして行った。

実施例８で構築したプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを実施例１６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株とＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで各々３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株とＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株を得た。

［実施例１８］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株の構築＞
実施例１６で構築したＬ−乳酸生産用大腸菌株に、スクロース加水分解酵素（インベルターゼ）及びフルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターを導入し、Ｌ−乳酸生産大腸菌ｆｒｕＫ強化株を構築した。具体的には以下のようにして行った。

実施例９で構築したプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫを実施例１６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を得た。

［実施例１９］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株によるＬ−乳酸生産＞
ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株の廃糖蜜からのＬ−乳酸生産を調べた。

前培養として、表５に示す前培養培地５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに、実施例１７及び実施例１８で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株及びＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を各々植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。その後、下記の表６に示す培地４７５ｇを入れたものに、前培養したフラスコ内容物２５ｍｌを各々植菌し、実施例１０と同様に培養実験を行った。

培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度３５０ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（２４％ ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。
２４時間培養後の培養液中のＬ−乳酸濃度は、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株（ｃｓｃＡ）が７５．１２ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株（ｆｒｕＲ破壊株）が８３．７９ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株（ｆｒｕＫ強化株）が８４．３２ｇ／Ｌだった。
これにより、本発明の乳酸生産大腸菌を用いて、廃糖蜜を原料としてＬ−乳酸を生産できることが確認された。また、乳酸生産大腸菌のｆｒｕＲ遺伝子を破壊することによりＬ−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。更に、乳酸生産大腸菌のｆｒｕＫ遺伝子を強化することによってもＬ−乳酸の生産性が向上することが明らかになった。

［実施例２０］
＜エシェリヒア・コリＯ１５７由来インベルターゼ遺伝子、ザイモモナス菌由来グルコース輸送促進蛋白質（ｇｌｆ）遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリのＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するため、ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ （配列番号５０）の塩基配列を有するプライマーを合成した。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号２９との組み合わせによりＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅した。配列番号２９のプライマーはその５´末端側にＮｄｅＩ認識部位を、配列番号５０のプライマーはその５´末端側から順にＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ認識部位を有している。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のＤＮＡフラグメントと、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した大腸菌用クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをｐＧＡＰと命名した。
このプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを実施例６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を得た。

エシェリヒア・コリＯ１５７株が有するインベルターゼ遺伝子（ｃｓｃＡ）の塩基配列はすでに報告されている。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３−３２７５８１６に記載されている。ｃｓｃＡ遺伝子を取得するために、ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣ（配列番号５１）およびＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ （配列番号５２）の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ作製した。配列番号５１のプライマーはその５´末端側から順にＢａｍＨＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号５２のプライマーはその５´末端側にＳａｌＩ認識部位を有している。上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）をテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで約１．４ｋｂｐのインベルターゼ遺伝子（ｃｓｃＡ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを回収して、インベルターゼ遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクターを構築した。

Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ ２９１９１）が有する糖輸送酵素グルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ６０６１５）。ｇｌｆ遺伝子を取得するために、ＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴＣＡＧＧ （配列番号５３）およびＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡ（配列番号５４）の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ作製した。配列番号５３のプライマーはその５´末端側から順にＳａｌＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号５４のプライマーはその５´末端側にＰｓｔＩ認識部位を有している。上記２種のプライマーとともに、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとして通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化することで約１．４ｋｂｐの糖輸送酵素グルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを回収して、インベルターゼ（ｃｓｃＡ）遺伝子及びグルコース輸送促進蛋白質（ｇｌｆ）遺伝子発現ベクターを構築した。

＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株によるＤ−乳酸生産＞
前培養としてＬＢ Ｂｒｏｔｈ、Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）３ｍｌを入れた試験管に、上記記載のＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで９時間攪拌培養を行った。
その後、１０ｇのＣａＣＯ３（純正化学１級）を予め加え滅菌した１００ｍｌバッフル付き三角フラスコ４本に表７に示す培地２０ｍｌそれぞれ加えたものに、前培養液を各々１００マイクロリットル植菌し、３５℃、９０ｒｐｍ、培養時間４８時間で攪拌培養を行った。コントロールとして実施例１０に記載のｃｓｃＡＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株を用いて同様の培養を行い、培養終了後、実施例１０に記載の方法により、得られた培養液中の乳酸濃度を定量した。
４８時間後の培養液中のＤ−乳酸濃度は、ｃｓｃＡが４８．９ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株が９．３ｇ／Ｌだった。
この結果より、ｃｓｃＡと同様に糖代謝系に関連する遺伝子であるグルコース輸送促進蛋白質遺伝子（ｇｌｆ）を利用して糖の取り込みを強化しても、乳酸生産性の向上効果はみられないことが分かった。

２００８年９月１６日に出願の日本国出願番号第２００８−２３７１７７号、２００９年２月１３日に出願の日本国出願番号第２００９−３２０４３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (11)

1. スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）のみを有し、且つ、遺伝子組換えによる乳酸生産強化系とフルクトースの代謝能力向上系とを備え、前記フルクトースの代謝能力向上系が、フルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）活性の付与によるフルクトース代謝経路におけるリン酸化能力の強化、又は、本来有しているＦｒｕＲ活性の不活化によるフルクトース代謝経路におけるフルクトース取り込み能力の強化である、乳酸生産大腸菌。
2. 前記乳酸生産強化系が、ピルベートホルメートリアーゼ活性の不活化あるいは低減化を含む請求項１記載の乳酸生産大腸菌。
3. 前記乳酸生産強化系が、Ｄ−乳酸又はＬ−乳酸を生成するためのＮＡＤＨ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強を含む請求項１又は請求項２記載の乳酸生産大腸菌。
4. 前記乳酸生産強化系が、
   Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、
   該大腸菌が本来有しているＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の不活化あるいは低減化と、
   を含む請求項１〜請求項３のいずれか一項記載の乳酸生産大腸菌。
5. 前記乳酸生産強化系が、
   Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増強と、
   該大腸菌が本来有しているＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性及びＦＭＮ依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくともどちらか一方の不活化あるいは低減化と、
   を含む請求項１〜請求項４のいずれか一項記載の乳酸生産大腸菌。
6. 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来する請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
7. 前記スクロース加水分解酵素遺伝子が、エシェリヒア・コリＯ１５７細菌に由来する請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
8. 前記フルクトース−１−リン酸キナーゼが、エシェリヒア属細菌に由来する請求項１〜請求項７のいずれか一項記載の乳酸生産大腸菌。
9. 前記フルクトース−１−リン酸キナーゼがエシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来の蛋白質である請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌。
10. 大腸菌Ｋ１２由来株である請求項１〜請求項９のいずれか一項記載の乳酸生産大腸菌。
11. 請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の乳酸生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料から乳酸を生産することを含む乳酸生産方法。