ES2424240T3 - Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono - Google Patents

Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono Download PDF

Info

Publication number
ES2424240T3
ES2424240T3 ES08862527T ES08862527T ES2424240T3 ES 2424240 T3 ES2424240 T3 ES 2424240T3 ES 08862527 T ES08862527 T ES 08862527T ES 08862527 T ES08862527 T ES 08862527T ES 2424240 T3 ES2424240 T3 ES 2424240T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sucrose
gene
recombinant
coli
sacc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08862527T
Other languages
English (en)
Inventor
Sang Yup Lee
Jeong Wook Lee
Hyohak Song
Ji Mahn Kim
Sol Choi
Jin Hwan Park
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST filed Critical Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Application granted granted Critical
Publication of ES2424240T3 publication Critical patent/ES2424240T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01004—Fructokinase (2.7.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01069—Protein-Npi-phosphohistidine-sugar phosphotransferase (2.7.1.69), i.e. sucrose phosphotransferase system II
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

Un vector recombinante que contiene un gen (ptsG) que codifica una sacarosa fosfotransferasa y un gen sacCque codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa, en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO: 2.

Description

Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa y, más particularmente, a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa en el cual se introduce un gen que codifica sacarosa fosfotransferasa y/o un gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa, o a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa en el cual se introduce un gen que codifica βfructofuranosidasa, en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO. 2 y la sacarosa-6-fosfato hidrolasa es un gen sacC.
TÉCNICA DE ANTECEDENTES
Para el desarrollo sostenible del género humano, se están realizando activamente estudios para el desarrollo de la biotecnología industrial para la producción de compuestos útiles a partir de bio-fuentes renovables, junto con un gran interés en los mismos. La producción de sustancias químicas mediante fermentación microbiana se ha realizado hasta la fecha utilizando glucosa como materia prima principal. Sin embargo, la preparación de productos químicos mediante fermentación microbiana es difícil de comercializar, ya que la glucosa es cara y, por lo tanto, el precio de los compuestos químicos producidos por la fermentación microbiana es mayor que el de compuestos químicos producidos por métodos de síntesis química que utilizan aceite crudo como materia prima principal. Así, con el fin de desarrollar como una alternativa al método que utiliza glucosa cara como fuente de carbono, se están realizando activamente estudios sobre el descubrimiento de una diversidad de fuentes de carbono económicas que puedan ser fácilmente obtenidas a partir de bio-fuentes abundantes. Por ejemplo, estudios sobre la producción de diversos metabolitos primarios utilizando materias primas relativamente económicas tales como hidrolizados lignocelulósicos, glicerol, suero lácteo, líquidos de maceración de maíz o similares han sido realizado por muchos investigadores, incluidos los inventores de esta solicitud (Samuelov et al., Appl. Environ, Microbiol., 65:2260, 1999; Lec et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Bioproc. Biosystems Eng., 26:63, 2003). Sin embargo, de acuerdo con los resultados de los estudios reseñados hasta la fecha, en los casos en los que las materias primas fueron utilizadas como fuentes de carbono en lugar de glucosa, la productividad o el rendimiento productivo de metabolitos deseados era significativamente menor que cuando se utilizaba glucosa como una fuente de carbono. Así, para superar este inconveniente se requieren urgentemente una investigación y un desarrollo.
La sacarosa (comúnmente conocida como azúcar) es un disacárido que consiste en glucosa y fructosa, y es una fuente de carbono que es muy abundante en la naturaleza y se produce a partir de todas las plantas con capacidad de fotosíntesis. En particular, la caña de azúcar y la remolacha azucarera contienen grandes cantidades de sacarosa, y más del 60% de la sacarosa del mundo está siendo actualmente producida a partir de la caña de azúcar. Particularmente, la sacarosa se produce a un coste muy bajo, ya que se puede producir industrialmente a través de un simple proceso de evaporar/concentrar extractos obtenidos mediante prensado mecánico de cañas de azúcar. Koutinas et al. calcularon los precios de diversas materias primas utilizables para la producción microbiana de sustancias químicas sobre la base de los contenidos en glucosa en el año 2004 y, como resultado, el precio de sacarosa, basado en 1 kg del contenido en glucosa, era de 26,1 centavos (0,19 céntimos de €) que es un precio muy bajo, correspondiente al 77% del precio del trigo, al 50% del precio de la melaza y al 28,9% del precio de sacarosa (Koutinas et al., Ind. Crops and Products, 20:75, 2004).
Un informe sobre el precio diario del International Sugar Agreement (ISA) indica que el precio de la sacarosa se encuentra en una tendencia descendente estable después de alcanzar un pico en 1994-1995 debido a una excedencia de suministro, y que se espera que continúe la tendencia descendente. Por consiguiente, la sacarosa está recibiendo atención como la más potente fuente de carbono que sustituirá a la costosa glucosa que está siendo actualmente utilizada para producir diversos compuestos químicos a través de fermentación microbiana. Particularmente, es bien conocido para los expertos en la técnica que es muy difícil reducir el coste de producción de glucosa al nivel de la sacarosa, ya que la glucosa, la cual se produce principalmente a partir de almidón de maíz, se produce a través de procesos muy complicados que incluyen la extracción de almidón a partir de maíz, tratamiento previo térmico/químico de maíz, conversión de maíz en glucosa mediante reacciones enzimáticas y purificación de glucosa, y debido a que el precio del maíz está en continuo ascenso. Por estos motivos, la producción de bioetanol basada en maíz en los EE.UU. está disminuyendo gradualmente (Mae-Wan Ho, Science in Society, 33:40, 2007), pero la producción de bioetanol basada en la caña de azúcar (es decir, sacarosa) en Brasil
está creciendo rápidamente.
Hasta la fecha, se han realizado estudios sobre la producción de compuestos útiles utilizando sacarosa como una fuente de carbono con respecto a la producción de polímeros biodegradables (Lee et al., Biotechnol. Lett., 15:971, 1993; Lee et al., Biotechnol. Techniques, 1:59, 1997), ácido cítrico (Forster et al., App. Microbiol. Biotechnol., 75:1409, 2007), acetona, butanol, etanol e isopropanol (George et al., Appl. Environ. Microbiol., 45:1160, 1983; Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol., 49:639, 1998), ácido itacónico (Kautola et al., Biotechnol. Lett., 11:313, 1989), goma xantano (Letisse et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 55:417, 2001), etc., mediante cultivo celular a alta concentración. Particularmente, el informe (2006) de la Agencia Internacional de la Energía (IEA) Bioenergy Task 40, que analiza la bioenergía internacional y el comercio de biocombustible evaluaron que la producción de bioetanol a partir de caña de azúcar (incluida sacarosa) en Brasil es un modelo excelente de producción de biocombustible no contaminante y sostenible.
La sacarosa, como una materia prima para producir compuestos químicos a través de fermentación microbiana, es económica y puede actuar para proteger la membrana celular del entorno externo que contiene grandes cantidades de metabolitos deseados, produciendo así elevadas concentraciones de metabolitos deseados. Kilimann et al. expusieron microorganismos a un medio que contenía sacarosa y a un medio que no contenía sacarosa a temperaturas letales, y luego examinaron la viabilidad de los mismos y las estructuras secundarias de las proteínas (Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006). Los resultados del estudio revelaron que las estructuras secundarias de proteínas en las células de los microorganismos expuestos al medio que contenía sacarosa estaban muy bien conservadas, pero las estructuras de proteínas en las células de los microorganismos expuestos al medio que contenía sacarosa estaban altamente modificadas. Particularmente, la viabilidad de los microorganismos expuestos al medio que contenía sacarosa era significativamente mayor que la de los microorganismos expuestos al medio que no contenía sacarosa. Esto demuestra directamente la función de sacarosa de proteger microorganismos frente a un entorno externo perjudicial.
A pesar de que la sacarosa es una excelente materia prima que tiene las ventajas arriba descritas, incluido un bajo precio y una función de proteger a microorganismos frente a un entorno externo, todavía no ha sido reseñado ningún ejemplo que muestre la producción con éxito de compuestos químicos deseados utilizando sacarosa como fuente de carbono y la aplicación comercial real de los mismos. Esto se debe a que un gran número de microorganismos no tiene un mecanismo completo de transportar sacarosa a las células, degradando la sacarosa transportada y ligando los productos degradados a la glucolisis y, así, no pueden utilizar sacarosa como fuente de carbono. Incluso en el caso de microorganismos con un mecanismo capaz de utilizar sacarosa, éstos no pueden producir de manera eficaz metabolitos deseados, debido a que la tasa de ingestión y degradación de sacarosa como fuente de carbono es muy baja.
Jahreis et al. 2002 describe vectores recombinantes adecuados para uso en microorganismos que portan los genes cscA y cscB de E. coli que codifican, respectivamente, una sacarosa hidrolasa y una sacarosa permeasa. El documento WO2007/041269 describe también organismos recombinantes capaces de metabolizar sacarosa y de portar cscA y cscB de E. coli.
Con el fin de realizar la producción de diversos compuestos químicos a través de la fermentación microbiana de una manera industrialmente rentable, se requiere el uso de una materia prima económica tal como sacarosa según se describe arriba y, además de ello, la identificación de una enzima capaz de ingerir y degradar eficazmente sacarosa como fuente de carbono a una tasa elevada, y necesariamente se requieren la búsqueda y el desarrollo que permitan el uso de la enzima. Particularmente, a la vista del hecho de que el precio de materias primas para producir compuestos químicos a través de fermentación microbiana supone aproximadamente el 50% del precio de los productos finales, se requieren urgentemente la identificación de una enzima que permita el uso eficaz de sacarosa como una materia prima económica y el desarrollo de la aplicación de la enzima.
Se ha reseñado que la sacarosa puede utilizarse para producir diversos bioproductos, incluidos polímeros biodegradables, ácido cítrico, ácido itacónico, acetona, butanol, etanol, isopropanol y goma xantano, mediante cultivo de células a alta concentración. Sin embargo, raramente se han reseñado ejemplos que muestren la producción con éxito de compuestos químicos deseados a través de fermentación microbiana y la aplicación comercial real de los mismos.
Así, con el fin de que la producción de diversos compuestos químicos a través de fermentación microbiana como una tecnología no contaminante sea aplicada con éxito en la industria, se requiere el desarrollo de microorganismos capaces de ingerir y degradar eficazmente una fuente de carbono económica y abundante tal como sacarosa.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
5 En su sentido más amplio, la invención se refiere a la materia según se define en las reivindicaciones anejas.
Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar nuevos genes relacionados con el metabolismo de sacarosa que permitan utilizar la sacarosa como una fuente de carbono, y enzimas que son codificadas por los genes.
10 Otro objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en el cual se introduce el gen relacionado con el metabolismo de sacarosa, y un método para producir metabolitos, polímero biodegradable o proteínas recombinantes utilizando el microorganismo recombinante.
Con el fin de conseguir los objetos anteriores, la presente invención proporciona una sacarosa fosfotransferasa con
15 una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; un gen (ptsG) que codifica dicha sacarosa fosfotransferasa; y un vector recombinante que contiene dicho gen (ptsG) y un gen (sacC) que codifica una sacarosa-6-fosfato hidrolasa.
La presente invención proporciona también un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en que dicho gen se introduce en una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste en bacterias, levaduras
20 y hongos; y un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes, comprendiendo el método cultivar dicho microorganismo recombinante en un medio que contiene sacarosa como fuente de carbono.
La presente descripción proporciona también una β-fructofuranosidasa con actividad para hidrolizar el enlace β-D25 fructofuranósido para liberar fructosa; y un gen que codifica dicha β-fructofuranosidasa.
La presente invención proporciona también un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en que dicho gen se introduce en una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos; y un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes,
30 comprendiendo el método cultivar dicho microorganismo recombinante en un medio que contiene sacarosa como fuente de carbono.
Otras características y aspectos de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones adjuntas.
35 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra una vía a través de la cual se ingiere y degrada sacarosa, y los productos degradados se metabolizan a través de glucolisis cuando nuevas enzimas relacionadas con el 40 metabolismo (sacarosa fosfotransferasa, sacarosa-6-fosfato hidrolasa y fructoquinasa) derivadas de M. succiniciproducens MBEL55E, que permiten el metabolismo de sacarosa, se introducen en un microorganismo incapaz de metabolizar sacarosa. Las flechas gruesas (→): indican las vías metabólicas en las que están implicadas las nuevas enzimas relacionadas con el metabolismo de sacarosa introducidas, derivadas de M. succiniciproducens MBEL55E; y las flechas finas (→): indican las vías metabólicas originales del microorganismo
45 recombinante.
La FIG. 2 es un diagrama esquemático que muestra cuatro vías posibles de cómo una nueva β-fructofuranosidasa derivada de M. succiniciproducens MBEL55E, la cual permite el metabolismo de sacarosa, puede estar implicada en el metabolismo de sacarosa cuando la enzima se introduce en un microorganismo incapaz de metabolizar
50 sacarosa. Flechas gruesas (→): cuatro vías posibles metabólicas en las que estará implicada la nueva βfructofuranosidasa introducida, derivada de M. succiniciproducens MBEL55E; y las flechas finas (→): indican las vías metabólicas originales del microorganismo recombinante.
La FIG. 3 es un mapa de un vector recombinante pMSscrIIA que contiene genes (ptsG, sacC y rbsK) que codifican 55 sacarosa fosfotransferasa, sacarosa-6-fosfato hidrolasa y fructoquinasa.
La FIG. 4 es un diagrama gráfico que muestra el crecimiento de la cepa parental MBEL55E, una cepa MptsG recombinante y una cepa MsacC recombinante en medios de sacarosa (●: MBEL55E; ▲: MptsG; y Δ: MsacC).
La FIG. 5 es un mapa de corte y empalme del vector recombinante pTac15K.
La FIG. 6 es un mapa de corte y empalme del vector recombinante pTac15KsacC que contiene un gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa.
La FIG. 7 es un diagrama gráfico que muestra el crecimiento de pTac15K recombinante de E. coli W3110 en un medio M9 que contiene sacarosa (línea continua que incluye ●: concentración de sacarosa; y línea continua que incluye ♦: DO600).
La FIG. 8 es un diagrama gráfico que muestra el crecimiento de pTac15KsacC recombinante de E. coli W3110 de la invención, que tiene la capacidad de metabolizar sacarosa, en un medio M9 que contiene sacarosa (línea continua que incluye ●: concentración de sacarosa; y línea continua que incluye ♦: DO600; línea de trazos discontinuos que incluye ●: concentración de glucosa; línea continua que incluye ○: concentración de fructosa; y línea de trazos discontinuos que incluye ▼: concentración de ácido acético).
La FIG. 9 es un diagrama gráfico que muestra el crecimiento de pTac15KEWcscA de E. coli W3110 y pTac15KBSsacA de E. coli W3110 en medio M9 que contienen sacarosa (línea continua que incluye ●: pTac15KEWcscA de E. coli W3110; y línea continua que incluye ▲: pTac15KBSsacA de E. coli W3110).
La FIG. 10 es un diagrama gráfico que muestra el crecimiento y la producción de metabolitos de pTac15KsacC de
E. coli W3110 de la invención, capaz de metabolizar sacarosa, fermentada en condiciones anaerobias (línea continua que incluye ●: concentración de sacarosa; línea continua que incluye Δ: DO600; línea continua que incluye
▼: concentración de glucosa; línea continua que incluye ■: concentración de fructosa; línea discontinua que incluye ●: concentración de ácido succínico; línea discontinua que incluye !: concentración de ácido láctico, línea discontinua que incluye ■: concentración de ácido fórmico; línea discontinua que incluye ◊: concentración de ácido acético; y línea discontinua que incluye ▲: concentración de etanol).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y REALIZACIONES PREFERIDAS
La presente invención tiene como objetivo la producción de bioproductos utilizando sacarosa (comúnmente conocida como azúcar) en calidad de una fuente de carbono económica y abundante, particularmente el descubrimiento de un microorganismo capaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono o enzimas que permitan el uso de un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa, y tiene como objetivo utilizar las enzimas para producir bioproductos.
La sacarosa, que es un disacárido que consiste en glucosa y fructosa, es una fuente de carbono globalmente abundante. Se produce a partir de la mayoría de plantas con capacidad de fotosíntesis y, en particular, caña de azúcar y remolacha azucarera que son cultivos tropicales y cultivos subtropicales que contienen grandes cantidades de sacarosa. La sacarosa se puede producir industrialmente a través de un simple proceso de evaporar y concentrar un extracto obtenido al prensar mecánicamente caña de azúcar, y más del 60% de la sacarosa del mundo está siendo actualmente producida a partir de caña de azúcar. De acuerdo con el documento (publicado en 2004) de Koutinas et al., quienes calcularon los precios de diversas materias primas utilizables en la fermentación microbiana sobre la base del contenido en glucosa, el precio de la sacarosa, basado en 1 kg del contenido en glucosa es 26,1 centavos (0,19 céntimos de €), lo que corresponde a 1/4 del precio de la glucosa y a 1/2 a 2/3 de los precios de trigo y melaza (Koutinas et al., Ind. Crops and Products, 20:75, 2004). Además, con respecto al cambio en el precio de sacarosa publicado por la Organización Internacional del Azúcar para los últimos 15 años, el precio de la sacarosa cayó bruscamente hasta 6,27 centavos/libra (0,94 céntimos de €/kilo) en 1999 después de alcanzar un pico de 13,28 centavos/libra (1,99 céntimos de €/kilo) en 1995, aumentó de nuevo hasta 14,20 centavos/libra (1,06 céntimos de €/kilo) en marzo de 2008 y se mantuvo a un nivel de 12,44 centavos/libra (0,93 céntimos de €/kilo) el 7 de mayo de 2008, y se espera que el precio de la sacarosa se encuentre en una tendencia descendente debido a un excedente de suministro. Además de esta ventaja en términos de coste, la sacarosa es ventajosa debido a que puede ser suministrada de manera relativamente estable, e incluso en circunstancias de crisis de alimentos tales como la reciente crisis de los cereales, debido a que no se obtiene a partir de cereales.
Hasta la fecha, se ha reseñado que la sacarosa se puede utilizar para producir diversos bioproductos, incluidos polímeros biodegradables, ácido cítrico, ácido itacónico, acetona, butanol, etanol, isopropanol y goma xantano (Lee et al., Biotechnol. Lett., 15:971, 1993; Lee et al., Biotechnol Techniques, 1:59, 1997; Forster et al., App. Microbiol. Biotechnol., 75:1409, 2007; George et al., Appl. Environ. Microbiol., 45:1160, 1983; Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol., 49:639, 1998; Kautola et al., Biotechnol. Lett., 11:313, 1989; Letisse et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.,
55:417, 2001), mediante cultivo celular a alta concentración. Esto sugiere que una mejora en la utilidad de sacarosa puede tener una influencia directa sobre la producción eficaz de bioproductos.
Sin embargo, a pesar de varias ventajas de la sacarosa, incluidas ventajas como una materia prima, rara vez se ha reseñado una función para proteger proteínas frente a una modificación, y una función para proteger a células frente a entornos externos (Kilimann et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006) ejemplos que demuestran la producción con éxito de compuestos químicos deseados a través de fermentación microbiana utilizando sacarosa como una fuente de carbono y la aplicación comercial real de la misma. Un motivo de ello es que un gran número de microorganismos no puede producir eficazmente bioproductos deseados, debido a que los microorganismos no tienen un mecanismo capaz de metabolizar sacarosa o tienen una lenta tasa metabólica, incluso aunque tengan este mecanismo. Así, con el fin de la producción de diversos compuestos químicos a través de fermentación microbiana como una tecnología no contaminante a ser aplicada con éxito en la industria, se requiere el desarrollo de microorganismos capaces de ingerir y degradar eficazmente una fuente de carbono económica y abundante tal como sacarosa. Para este fin, se debe realizar la identificación de una enzima capaz de degradarse y metabolizarse a una tasa elevada y la utilización de la misma.
Hasta la fecha, por parte de varios investigadores se ha desarrollado un grupo de enzimas que permiten el uso de sacarosa. Ejemplos típicos incluyen la tecnología de Ajinomoto Co. en la que se introducen un PTS (sistema fosfotransferasa dependiente de fosfoenol-piruvato) derivado de E. coli y un sistema de transporte de sacarosa de no PTS, y se utilizan para producir aminoácidos. Esta tecnología se ha caracterizado debido a que se introduce un grupo de genes completo asociado con PTS o no PTS completando así una invención.
Sin embargo, en la presente invención, basada en la información genética de Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), se encontraron nuevos genes (ptsG, sacC y rbsK) que codifican enzimas [sacarosa fosfotransferasa (PtsG, MS0784), sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC, MS0909) y fructoquinasa (RbsK, MS1233)] que están implicadas en transportar sacarosa a las células, degradar la sacarosa transportada y ligar los productos degradados a glucolisis, y se identificaron las secuencias y funciones de los mismos.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a sacarosa fosfotransferasa que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sacarosa-6-fosfato hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y fructoquinasa que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, que son enzimas que están implicadas en transportar sacarosa a las células, degradar la sacarosa transportada y ligar los productos degradados a glucolisis. La presente invención se refiere también a un gen (ptsG) que codifica dicha sacarosa fosfotransferasa, un gen (sacC) que codifica dicha sacarosa-6-fosfato hidrolasa y un gen (rbsK) que codifica dicha fructoquinasa.
En la presente invención, la sacarosa fosfotransferasa (PtsG) actúa para transportar sacarosa a las células, al tiempo que convierte la sacarosa en sacarosa-6-fosfato, la sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC) tiene una actividad de convertir sacarosa-6-fosfato en glucosa-6-fosfato y fructosa, y la fructoquinasa (RbsK) tiene una actividad para convertir fructosa en fructosa-6-fosfato.
En la presente invención, el ptsG se representa por una secuencia de bases de SEQ ID NO: 2, el sacC se representa por una secuencia de bases de SEQ ID NO: 4 y rbsK se representa por una secuencia de bases de SEQ ID NO: 6.
Específicamente, en la presente invención se construyó un vector recombinante que contenía los genes ptsG y sacC, y luego se introdujo en E. coli incapaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono, y la E. coli recombinante construida se cultivó en un medio que contenía sacarosa como una única fuente de carbono. Como resultado, se encontró que la E. coli recombinante tenía la capacidad de metabolizar sacarosa.
Por consiguiente, tal como se muestra en la FIG. 1, se puede inferir que la sacarosa es transportada a las células por parte de la sacarosa fosfotransferasa (PtsG) al tiempo que se convierte en sacarosa-6-fosfato, la sacarosa-6fosfato transportada a las células se convierte en glucosa-6-fosfato y fructosa mediante la sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC), la fructosa se convierte en fructosa-6-fosfato mediante la fructoquinasa (RbsK) y el producto degradado se liga a la glucolisis.
Entretanto, los autores de la presente invención han demostrado que microorganismos que no son capaces de metabolizar sacarosa pueden metabolizar sacarosa mediante la introducción de sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC, MS0909), que es una β-fructofuranosidasa derivada de Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC
0769BP). Otros genes (cscA y sacA), que codifican β-fructofuranosidasa, representan ejemplos de producir diversos metabolitos utilizando la cepa microbiana. En otras palabras, en base a la información genética de Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), E. coli W y Bacillus subtilis, se descubrieron nuevos genes (sacC, cscA y sacA) que codifican β-fructofuranosidasa, que una enzima implicada en la degradación de sacarosa y en el ligamiento de los productos degradados a glucolisis, y se identificaron las secuencias y funciones de los mismos. El número EC (número de la Comisión Enzimática) proporcionado por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, es un esquema de clasificación numérica bien conocido para enzimas, basado en las reacciones químicas que éstas catalizan.
El nombre oficial de sacarosa-6-fosfato hidrolasa es β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) y tiene otros nombres, incluidos β-D-fructofuranósido fructohidrolasa, invertasa, sacarasa, glucosacarasa, β-h-fructosidasa, βfructosidasa, invertina, sacarasa, maxinvert L 1000, fructosilinvertasa, invertasa alcalina, invertasa ácida. A saber, sacarosa-6-fosfato hidrolasa y sacarasa tienen todas el nombre oficial β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26).
Dicha β-fructofuranosidasa cataliza la hidrólisis de residuos β-D-fructofuranósido no reductores terminales para dar β-D-fructofuranósido. Tiene el nombre oficial “sacarasa o invertasa” cuando cataliza la hidrólisis de sacarosa, y tiene el nombre oficial de “sacarosa-6-fosfato hidrolasa” cuando cataliza la hidrólisis de sacarosa-6-fosfato.
En Ejemplos de esta memoria, además de demostrar la capacidad metabolizante de sacarosa provocada por la introducción de sacarosa-6-fosfato hidrolasa (EC 3.2.1.26, SacC) derivada de Mannheimia, es decir, βfructofuranosidasa, se realizó un intento de demostrar que la introducción de β-fructofuranosidasa general en microorganismos imparte la capacidad metabolizante de sacarosa a los microorganismos. Como resultado, cuando cada una de la invertasa derivada de E. coli W (EC 3.2.1.26, CscA) y β-fructofuranosidasa derivada de Bacillus subtilis se introdujo en microorganismos incapaces de metabolizar sacarosa, se observó que los microorganismos a los que se había introducido β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) se desarrollaban metabolizando sacarosa.
Por consiguiente, la descripción se refiere a β-fructofuranosidasa con actividades de hidrolizar el enlace β-Dfructofuranósido para liberar fructosa, incluida una actividad de hidrolizar sacarosa para formar glucosa y fructosa y una actividad para hidrolizar sacarosa-6-fosfato para producir glucosa-6-fosfato y fructosa. También, la βfructofuranosidasa puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9.
Específicamente, en la presente invención, sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC) tiene una actividad de convertir sacarosa-6-fosfato en glucosa-6-fosfato y fructosa o una actividad para convertir sacarosa en glucosa y fructosa. También se utilizó β-fructofuranosidasa derivada de Mannheimia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y un gen (sacC) que codifica la misma se representa por una secuencia de bases de SEQ ID NO: 4.
En la presente descripción, invertasa, sacarasa y sacarosa hidrolasa (CscA), que son ejemplos de la βfructofuranosidasa, son enzimas que están implicadas en degradar sacarosa y en ligar los productos degradados a glucolisis, y estas enzimas tienen una actividad para convertir sacarosa-6-fosfato en glucosa-6-fosfato y fructosa, o una actividad para convertir sacarosa en glucosa y fructosa. Además, en los Ejemplos se ilustró la βfructofuranosidasa derivada de E. coli W y puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y un gen (cscA) que codifica la misma se representa preferiblemente por una secuencia de bases de SEQ ID NO: 8.
Sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacA), que es un ejemplo de la β-fructofuranosidasa, es una enzima que está implicada en la degradación de sacarosa y en ligar los productos degradados a glucolisis, y tiene una actividad para convertir sacarosa-6-fosfato en glucosa-6-fosfato y fructosa, y una actividad para convertir sacarosa en glucosa y fructosa. En los Ejemplos, se ilustró la β-fructofuranosidasa derivada de Bacillus subtilis, y puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y un gen (sacA) que codifica la misma se representa preferiblemente por una secuencia de bases de SEQ ID NO: 10 (sacA, BSU38040, sacarosa-6-fosfato hidrolasa).
Además de ello, cuando se comparó la secuencia de aminoácidos de la β-fructofuranosidasa derivada de Mannheimia, codificada por el gen sacC, con la secuencia de aminoácidos de enzimas investigadas a través de BLAST para proteínas, la invertasa codificada con cscA derivada de E. coli W tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de 28%, y sacarosa-6-fosfato hidrolasa (β-fructofuranosidasa) codificada por sacA derivada de Bacillus subtilis tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de 35%. También, las β-fructofuranosidasas derivadas de las dos cepas tienen todas el dominio conservado β-fructosidasa (COG1621) designado como “SacC”. Esto indica que cuando cualquier enzima que tenga una secuencia de aminoácidos algo diferente de la β
fructofuranosidasa derivada de Mannheimia codificada por el gen sacC, pero que contiene el dominio conservado de β-fructosidasa (COG1621) designado como “SacC” se introduce en microorganismos según se describe abajo, los microorganismos pueden crecer metabolizando sacarosa. Por lo tanto, a pesar de que la β-fructofuranosidasa ha sido ilustrada por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 7 ó 9, el alcance de la presente invención no está limitado a la misma. A saber, en el alcance de la presente invención pueden incluirse β-fructofuranosidasas en tanto que tengan una actividad para hidrolizar el enlace β-D-fructofuranósido para liberar fructosa. Por ejemplo, en el alcance de la presente invención también se pueden incluir secuencias de aminoácidos que tengan una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos 70%, 80% ó 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 7 ó 9.
De igual manera, el gen que codifica la β-fructofuranosidasa puede tener, por ejemplo, una secuencia de bases de SEQ ID NO: 4, 8 ó 10. ADN que comprende una mutación (sustitución, deleción, inserción o adición) en una o más bases en estas secuencias y tiene una identidad de secuencia de al menos 70% u 80%, preferiblemente 90%, y más preferiblemente 95% en comparación con la secuencia de bases de acuerdo con la presente invención.
La expresión “identidad de la secuencia”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una similitud de la secuencia entre dos polinucleótidos o dos moléculas de ácidos nucleicos. La identidad de la secuencia puede determinarse comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, en que el fragmento del polinucleótido o de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (p. ej. huecos o colgantes) en comparación con la secuencia de referencia (p. ej. una secuencia consenso) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje de identidad de las secuencias puede calcularse determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o residuo aminoácido idéntico en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de las secuencias. La identidad de las secuencias entre secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se puede medir utilizando el software de análisis de las secuencias, por ejemplo BLASTN o BLASTP.
En la presente invención, tal como se describe arriba, se sabe que la sacarosa, que es un disacárido que consiste en D-glucosa y D-fructosa, funciona para evitar la modificación de proteínas en células, estabilizar proteínas en células y minimizar la lisis de células provocada por el cambio en entornos externos. Así, sacarosa es muy útil en la producción de elevadas concentraciones de compuestos químicos de carácter básico o en un cultivo de células a alta concentración.
Tal como se muestra en la FIG. 2, cuando sacarosa-6-fosfato hidrolasa, que es una nueva β-fructofuranosidasa derivada de M. succiniciproducens MBEL55E, se introduce en microorganismos incapaces de metabolizar sacarosa, se piensa que la enzima introducida metaboliza sacarosa o sacarosa-6-fosfato a través de cuatro posibles vías.
La primera vía posible (Reacción I) es el caso en el que la sacarosa-6-fosfato hidrolasa degrada sacarosa para formar glucosa y fructosa en el espacio extracelular de células, y luego los productos degradados se introducen en células mediante enzimas que están implicadas en el transporte tal como la respectiva fosfotransferasa.
La segunda vía posible (Reacción II) es el caso en el que sacarosa-6-fosfato hidrolasa degrada sacarosa para formar glucosa y fructosa en el periplasma, y luego los productos degradados se introducen en células mediante enzimas que están implicadas en el transporte tal como la respectiva fosfotransferasa.
La tercera vía posible (Reacción III) es el caso en el que sacarosa se introduce en células mediante la enzima permeasa, distinta a la familia de las fosfotransferasas, y luego es degradada por la sacarosa-6-fosfato hidrolasa para formar glucosa y fructosa.
La cuarta vía posible (Reacción IV) es el caso en el que la sacarosa se convierte en sacarosa-6-fosfato mediante fosfato transferasa al tiempo que es introducida en células, y luego se convierte en fructosa y glucosa-6-fosfato por la sacarosa-6-fosfato hidrolasa introducida.
También, el gen sacC se deriva de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) que pertenece a la familia Pasteurellaceae, junto con Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC 55618). Particularmente, dicho M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) y A. succinogenes 130Z (ATCC 55618) tienen secuencias genómicas y fisiologías de las células similares. Se sabe que las secuencias genómicas de las dos cepas
microbianas son muy similares entre sí entre todas las secuencias genómicas descodificadas hasta la fecha (McKinlay et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 76:727, 2007). También, se sabe el gen sacC derivado de A. succinogenes 130Z tiene una homología muy elevada con uno derivado de M. succiniciproducens MBEL55E y es lo más similar al mismo. Así, resulta obvio para los expertos en la técnica que se pueden emplear de igual manera una enzima sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC, MS0909) derivada de M. succiniciproducens MBEL55E y un gen que codifica la misma, y una sacarosa-6-fosfato hidrolasa derivada de A. succinogenes 130Z (Asuc_1829) y un gen que codifica la misma.
Por consiguiente, todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en el que se introduce un gen que codifica sacarosa fosfotransferasa y/o sacarosa6-fosfato hidrolasa, y un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes, que comprende cultivar dicho microorganismo recombinante en un medio que contenga sacarosa como una fuente de carbono.
En la presente invención, el vector recombinante, que es un vector capaz de expresar una proteína en una célula hospedante adecuada, se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN operativamente enlazada a secuencias control capaces de controlar la expresión de una proteína junto con otras secuencias que facilitan la manipulación de genes, optimizan la expresión de proteínas o se requieren para la replicación del vector. Las secuencias control pueden incluir un promotor para regular la transcripción, un operador opcionalmente añadido para regular la transcripción, un sitio de unión al ribosoma de ARNm adecuado y/o secuencias que controlan la terminación de las transcripción/traducción.
Por ejemplo, el vector recombinante puede ser un vector recombinante tal como pTrc99A utilizado en los Ejemplos de la presente invención, pero además de este vector, se pueden utilizar en la presente invención otros vectores conocidos. También, una casete de expresión que contiene el gen sacC se puede insertar no sólo en vectores de expresión tales como pKK223-3, pTac99A, la serie pET o la serie pMAL, sino también en vectores de clonación tales como pACYC, pBluescript SK-, pBR322, la serie pGEM o pMB1, y vectores de expresión de este tipo se pueden utilizar en la presente invención. Además, es posible utilizar vectores recombinantes que se conocen en la técnica a la que pertenece la presente invención (Sambrook J y Russell D, Molecular Cloning: a laboratory manual 3ª ed., Cold Spring Harbor Lab (CSHL) Press, Nueva York, 2001). Además de ello, también se pueden utilizar en la presente invención vectores que contengan, además de un gen resistente a ampicilina, varios otros genes resistentes conocidos en la técnica.
Los genes arriba descritos se derivan de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) que pertenece a la familia Pasteurellaceae, junto con Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC 55618). Particularmente, las dos cepas, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) y A. succinogenes 130Z (ATCC 55618) tienen secuencias genómicas y fisiologías de las células muy similares. De acuerdo con el informe (2007) de McKinlay et al., se sabe que las secuencias genómicas de las dos cepas microbianas son lo más similares entre sí entre todas las secuencias genómicas descodificadas hasta la fecha (Appl. Microbiol. Biotechnol, 76:727, 2007). Así, resulta obvio para los expertos en la técnica que los genes anteriores se aplican también a genes derivados de A. succinogenes 130Z (ATCC 55618) junto con M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP).
En Ejemplos de la presente invención, un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono se transformó utilizando un vector recombinante que contenía los genes ptsG, sacC y rbsK, construyendo así un microorganismo recombinante con la capacidad de metabolizar sacarosa. Sin embargo, también se puede construir un microorganismo recombinante tratado mediante ingeniería del genoma, insertando los genes anteriores en el cromosoma de un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono de acuerdo con un método bien conocido en la técnica.
En la presente invención, se construyó un vector recombinante que contenía genes que codifican βfructofuranosidasa, incluido el gen sacC, y luego se introdujo en E. coli incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono, y el microorganismo recombinante construido se cultivó en un medio que contenía sacarosa como una única fuente de carbono. Como resultado, se encontró que el microorganismo recombinante tenía la capacidad de metabolizar sacarosa. Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a dicho vector recombinante, a un microorganismo recombinante transformado con el vector recombinante y capaz de metabolizar sacarosa, y un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes utilizando dicho microorganismo recombinante.
El vector recombinante puede ser un vector recombinante con un mapa de corte y empalme de la FIG. 5, pero
además del vector pTac15K mostrado en la FIG. 5, se pueden utilizar en la presente invención otros vectores conocidos. Además de ello, una casete de expresión que contiene genes que codifican β-fructofuranosidasa, incluido el gen sacC se puede insertar no sólo en pTrc99A, pTac99A o la serie pMAL, sino también en vectores de clonación tales como pACYC, pBluescript SK-, pBR322, la serie pGEM o pMB1, y los vectores recombinantes se pueden emplear en la presente invención. Además, es posible también utilizar vectores recombinantes que se conocen en la técnica a la que pertenece la presente invención (Sambrook J y Russell D, Molecular Cloning: a laboratory manual 3ª ed., Cold Spring Harbor Lab (CSHL) Press, Nueva York, 2001). Además de ello, también se pueden utilizar en la presente invención, vectores que contienen, además de un gen resistente a canamicina, varios otros genes resistentes conocidos en la técnica.
En Ejemplos, un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono se transformó utilizando un vector recombinante que contenía los genes sacC, cscA y sacA, construyendo así un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, Sin embargo, también se puede construir un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa insertando los genes anteriores en el cromosoma de un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono de acuerdo con un método conocido en la técnica. Además, en Ejemplos de la presente invención, únicamente se ilustró una cepa de E. coli específica como un microorganismo hospedante incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono, resultará obvio para los expertos en la técnica que se puede obtener el mismo resultado que en el caso de utilizar la cepa de E. coli anterior, incluso si los genes anteriores se introducen no sólo en otras cepas de E. coli, sino también en microorganismos hospedantes incapaces de utilizar sacarosa como una fuente de carbono, incluidos bacterias, levaduras y hongos.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término “metabolito” se refiere a una colección de compuestos intermedios y productos que se producen a través de procesos metabólicos. Los metabolitos se clasifican en metabolitos primarios y metabolitos secundarios. Por ejemplo, la presente invención se puede aplicar de diversas maneras a un microorganismo recombinante o tratado mediante ingeniería del genoma, incapaz de utilizar sacarosa con el fin de producir biocombustibles, metabolitos primarios y secundarios, polímeros biodegradables y proteínas recombinantes. Para la producción, por ejemplo, de butanol (Atsumi et al., Nature., 451:7174, 2008), etanol (Lindsay et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:70, 1995) y ácido láctico (Zhou, Appl. Environ. Microbiol, 69:399 2003) y ácido succínico y ácido málico (Jantama et al., Biotechnol, Bioeng., 99:1140, 2008), aminoácidos (Park et al. PNAS, 104:7797, 2006; Lee et al., Molecular Systems Biology, 3:1, 2007), polímeros biodegradables (Ahn et al., Appl. Environl. Microbiol., 66:3624, 2000; Park et al., Biomacromolecules, 2:248, 2001; Park et al., Biotechnol. Bioeng., 74:81, 2001), proteínas recombinantes (Jeong et al., Appl. Environl. Microbiol., 65:3027; 1999; Han et al., Appl. Environl. Microbiol., 69:5772, 2003), la glucosa ha sido utilizada como una fuente de carbono principal en la técnica anterior para producir los bioproductos deseados; sin embargo, cuando los genes de la presente invención se introducen en las cepas microbianas conocidas, los bioproductos deseados se pueden producir utilizando sacarosa como una fuente de carbono.
Además, una persona experta en la técnica también puede emplear fácilmente la presente invención para producir polímeros biodegradables y proteínas recombinantes. En Ejemplos de la presente invención, la producción de metabolitos tales como treonina se ilustró a modo de ejemplo, pero resultará obvio para una persona experta en la técnica que la presente invención también se puede emplear fácilmente para la producción de polímeros biodegradables, proteínas recombinantes y similares.
Ejemplos
En lo que sigue, la presente invención se describirá con mayor detalle haciendo referencia a ejemplos. Ha de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son únicamente para fines ilustrativos y no han de considerarse que limitan el alcance de la presente invención.
Particularmente, en Ejemplos que figuran a continuación, una cepa de E. coli específica se ilustró como una cepa hospedante incapaz de metabolizar sacarosa con el fin de expresar los genes de la presente invención, pero resultará obvio para una persona experta en la técnica que, incluso si se utilizan otras cepas de E. coli o microorganismos de otras especies, se pueden producir metabolitos, incluida sacarosa, introduciendo los genes de la presente invención, que están implicados en el metabolismo de sacarosa, en los microorganismos y cultivando los microorganismo recombinantes.
Ejemplo 1: Examen de la capacidad de los genes ptsG, sacC y rbsK de metabolizar sacarosa
1.1: Aislamiento de los genes ptsG, sacC y rbsK
Con el fin de examinar si los genes (ptsG, sacC y rbsK) de acuerdo con la presente invención están implicados juntos en el metabolismo de sacarosa, se aislaron los genes a partir de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 5 0769BP).
Primero, el ADN de ptsG (MS0784) se amplificó mediante PCR utilizando el ADN genómico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) como un molde con cebadores de SEQ ID NOS: 11 y 12. De igual manera, los ADNs de sacC (MS0909) y rbsK (MS1233) se amplificaron mediante PCR utilizando un conjunto de
10 cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 14, y un conjunto de cebadores de SEQ ID NOS: 15 y 16, respectivamente, y se llevó a cabo una PCR solapante utilizando una mezcla de los fragmentos de ADN como un molde con cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 16. Los ptsG (MS0784), sacC (MS0909) y rbsK (MS1233) son genes que codifican sacarosa fosfotransferasa, sacarosa-6-fosfato hidrolasa y fructoquinasa, respectivamente.
1.2: Construcción del vector recombinante pMSscrIIA
Con el fin de expresar los genes derivados de Mannheimia, ptsG (MS0784), sacC (MS0909) y rbsK (MS1233) que
20 codifican sacarosa fosfotransferasa, sacarosa-6-fosfato hidrolasa y fructoquinasa, respectivamente, se construyó en E. coli un vector de expresión de la siguiente manera.
Un fragmento de ADN que contiene los genes sacC (MS0909) y rbsK (MS1233) amplificado en el Ejemplo 1.1 se digirió con las enzimas de restricción SacI y KpnI y se ligó en pTrc99A (Pharmacia, Biotech., Uppsala, Suecia)
25 digerido con las mismas enzimas de restricción, construyendo así pTrc99AsacCrbsK.
Después, el fragmento de ADN de ptsG (MS0784) obtenido en el Ejemplo 1.1, se digirió con EcoRI y SacI y se ligó en un vector de expresión pTrc99AsacCrbsK digerido con las mismas enzimas de restricción, construyendo así pTrc99AptsGsacCrbsK. El vector construido se denominó “pMSscrIIA” (FIG. 3).
1.1: Construcción de las cepas de Escherichia coli W3110 pMSscrIIA y W3110 pTrc99A
Se llevó a cabo el siguiente experimento utilizando como un microorganismo modelo E. coli W3100 que es una subcepa de E. coli K-12 conocida por ser incapaz de metabolizar sacarosa.
E. coli W3110 se extendió en placas en medio sólido LB y se cultivó a 37ºC durante 8 horas, y la colonia se inoculó en 10 ml de medio líquido LB y se cultivó durante 8 horas. El caldo de cultivo se inoculó en 100 mL de medio líquido LB a razón de 1% (v/v) y se cultivó en una incubadora con agitación a 37ºC.
40 Después de aproximadamente 2 horas, cuando el cultivo alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,30-0,35, éste se dejó reposar en hielo durante 20 minutos para detener el crecimiento de las células. El caldo de cultivo se centrifugó a 4ºC a 3.000 rpm durante 15 minutos para recoger las células, y luego las células se suspendieron en 32 ml de disolución RFI a 4ºC. La suspensión se centrifugó a 4ºC a 3.000 rpm durante 15 minutos para recoger las células. Las células se re-suspendieron en 8 ml de disolución RFII, y luego se dejaron reposar en hielo durante 15
45 minutos. Finalmente, la re-suspensión se dispensó en una cantidad de 100 μl/pocillo y se almacenó a -70ºC. La composición de la composición de RFI consistía en RbCl 100 mM, MnCl2·4H2O 50 mM, CH3COOK 0,1 M, CaCl2
10 mM y glicerol al 15% (p/v) y se ajustó a pH 5,8 mediante la adición de acetato 0,2 M. La disolución de RFII consistía en MOPS 10 mM, RbCl 10 mM, CaCl2 100 mM y glicerol al 15% (p/v) y se ajustó a pH de 6,8 mediante la adición de NaOH.
El vector de expresión pMSscrIIA construido en el Ejemplo 1.2 o pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, Suecia) como testigo, se añadió a la cepa E. coli W3110, y luego la cepa se sometió a una transformación por choque térmico a 42ºC durante 90 segundos, transformando así la cepa. Después de la transformación por choque térmico, se añadieron 0,8 ml de medio líquido LB a la cepa, y la cepa se cultivó en una incubadora con agitación a 37ºC durante 1 hora.
El caldo de cultivo se extendió en placas en un medio LB sólido que contenía antibiótico ampicilina (concentración final: 50 μg/L) y se cultivó a 37ºC durante 12 horas o más. Las colonias de E. coli W3110 pMSscrIIA y de E. coli W3110 pTrc99A formadas se inocularon en medio LB líquido y se cultivaron a 37ºC durante 8 horas o más. Con el fin de confirmar si el vector se introducía con éxito, el vector se aisló a partir de la cepa cultivada utilizando el plásmido SV GeneAllR (GeneAll Biotechnology, Corea) y se sometió a electroforesis. La cepa de E. coli W3110 pMSscrIIA se secuenció en Solgent Co. (Corea) utilizando los cebadores SEQ ID NOS: 17 a 24, examinando así si las secuencias base de la cepa eran consistentes con las secuencias base de los genes.
1.4: Examen de la capacidad de E. coli recombinante de metabolizar sacarosa
Las colonias de E. coli W3110 pMSscrIIA y E. coli W3110 pTrc99A en medio sólido, construidas en el Ejemplo 1.3, se inocularon en un medio mínimo M9 que contenía 5 g/L de sacarosa como una única fuente de carbono y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Después, el caldo de cultivo se inoculó en 100 ml de un medio mínimo M9 que contenía sacarosa al 3% (v/v) y luego se cultivó a 37ºC. A ello, en calidad de antibiótico, se añadió ampicilina hasta una concentración final de 50 μg/L. El medio mínimo M9 consistía en 33,9 g/L de Na2HPO4, 15 g/L de KH2PO4, 2,5 g/L de NaCl, 5 g/L de NH4Cl y 0,36 g/L de MgSO4. La concentración de células en el medio de cultivo se midió como DO600 utilizando un espectrofotómetro. Durante el período de cultivo, se recogió periódicamente una muestra, la muestra recogida se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos y después la concentración de sacarosa en el sobrenadante se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Como resultado, tal como se muestra en la Tabla 1, la cepa de E. coli W3110 pTrc99A no podía crecer en el medio mínimo M9 que contenía sacarosa como única fuente de carbono, pero la cepa de E. coli W3110 pMSscrIIA mostraba una capacidad excelente de metabolizar sacarosa. La cepa de E. coli W3110 pMSscrIIA metabolizaba aproximadamente 2,2 g/L de sacarosa durante 19 horas, indicando un incremento en la biomasa de 3,12 basado en la DO600, y producía 0,67 g/L de ácido acético como subproducto. Así, se confirmó que, cuando un microorganismo contiene todos los genes ptsG, sacC y rbsK, éste muestra una excelente capacidad de metabolizar sacarosa.
Tabla 1 Tal como se describe antes, cuando el gen sacarosa fosfotransferasa o una combinación del gen fosfotransferasa sacarosa con el gen sacarosa-6-fosfato hidrolasa se introdujo en el microorganismo incapaz de metabolizar sacarosa, el microorganismo tenía la capacidad de metabolizar sacarosa y, además, producía ácido acético como
medio mínimo M9 + 5 g/L de sacarosa
utiliza el fenotipo 0 h 19 h
E. coli W3110
pTrc99A - scr 5,23 5,22
E. coli W3110
pMSscrIIA + scr+ 6,73 4,53
5 un metabolito utilizando sacarosa como una fuente de carbono.
Por consiguiente, cualquier persona experta en la técnica también puede emplear fácilmente la presente invención para la producción, además de ácido acético, de ácido láctico, ácido succínico, etanol, biocombustible y biobutanol con contenido en bioenergía, polímeros biodegradables y proteínas recombinantes.
Ejemplo 2: Examen de la capacidad de cada uno de los genes pstG y sacC de metabolizar sacarosa
2.1: Construcción del vector recombinante para examinar la capacidad del gen pstG y del gen sacC de metabolizar sacarosa
15 Con el fin de examinar si los genes ptsG y sacC de la presente invención están implicados por sí solos en la capacidad de metabolizar sacarosa, se construyeron un vector (pSacHR06ptsG) para la deleción de ptsG (MS0784) y un vector (pSacHR06sacC) para la deleción de sacC (MS0909) y se sometieron a un experimento de inactivación.
20 Primero, con el fin de interrumpir el gen sacarosa fosfotransferasa (ptsG) mediante recombinación homóloga, se construyó un vector de intercambio de genes de la siguiente manera. La región del brazo homólogo de la izquierda se amplificó utilizando el ADN genómico de Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) en calidad de un molde con cebadores de SEQ ID NOS: 25 y 26; y la región del brazo homólogo de la derecha se amplificó
25 utilizando los cebadores de SEQ ID NOS: 27 y 28; un fragmento de ADN que contenía un marcador antibiótico y un sitio lox mutante se amplificó utilizando un vector pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett., 278:78, 2008) en calidad de un molde con cebadores de SEQ ID NOS: 29 y 30. Estos tres fragmentos de ADN se amplificaron mediante PCR solapante utilizando los cebadores de SEQ ID NOS: 25 y 28.
El fragmento de ADN final, así amplificado, se digirió con las enzimas de restricción PstI y SalI y se clonó en el vector pSacHR06 (Park et al., PNAS, 104:7797, 2007) digerido con las mismas enzimas, construyendo así pSacHR06ptsG. Además, pSacHR06sacC se construyó de la misma manera que la antes descrita utilizando los
35 cebadores de SEQ ID NOS: 31 a 36.
2.2: Construcción de cepas M. succiniciproducens MptsG y M. succiniciproducens MsacC
Utilizando cada uno del vector de intercambio pSacHR06ptsG para la deleción del gen ptsG y el vector de intercambio pSacHR06sacC para la deleción del gen sacC, construidos en el Ejemplo 2.1, los genes se suprimieron del genoma de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) de acuerdo con el método reseñado por Kim et al. (FEMS Microbiol. Lett., 278:78, 2008), construyendo así las cepas mutantes M. succiniciproducens MptsG y M. succiniciproducens MsacC.
Específicamente, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) se extendió en un medio de LB-glucosa sólido que contenía 10 g/L de glucosa y se cultivó a 37ºC durante 36 horas. Después, la colonia se inoculó en 10 ml de medio líquido de LB-glucosa y se cultivó durante 12 horas. El cultivo de células suficientemente desarrollado se inoculó en 100 ml de medio de LB-glucosa líquido al 1% (v/v) y se cultivó en una incubadora con agitación a 200 rpm a 37ºC.
Cuando el caldo de cultivo alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,3-0,4 después de aproximadamente 4-5 horas, se centrifugó a 4ºC a 4.500 rpm durante 20 minutos para recoger las células, y luego las células se resuspendieron en 200 ml de disolución de glicerol al 10% a 4ºC. La re-suspensión se centrifugó a 4ºC a 5.500 rpm durante 20 minutos para recoger las células. El proceso de re-suspensión se repitió dos veces al tiempo que se reducía hasta la mitad la disolución de glicerol, y luego las células se re-suspendieron en disolución de glicerol a una relación en volumen de 1:1 para obtener un concentrado de células. El concentrado de células se mezcló con cada uno de los vectores de intercambio de genes pSacHR06ptsG o pSacHR06sacC construidos en el Ejemplo 2.1, y luego se sometió a electroporación en las condiciones de 2,5 kV, 25 μF y 400 ohmios, introduciendo así cada uno de los genes en la M. succiniciproducens cultivada. Después de la electroporación, el 1 ml de medio de LB-glucosa líquido se añadió a la cepa y luego la cepa se cultivó en una incubadora con agitación a 200 rpm a 37ºC durante 1 hora. El caldo de cultivo se extendió en un medio de LB-glucosa sólido que contenía antibiótico cloranfenicol (concentración final: 6,8 μg/L) y se cultivó a 37ºC durante 48 horas o más. Con el fin de seleccionar una colonia en la que sólo se produjera un sobrecruzamiento doble, las colonias formadas se estriaron en medio LB-sacarosa (medio LB que contenía 100 g/L de sacarosa) que contenía cloranfenicol (concentración final: 6,8 μg/L). Después de 24 horas, las colonias formadas se estriaron de nuevo sobre la misma placa.
La colonia (mutante) formada sobre la placa se cultivó en medio de LB-glucosa líquido que contenía un antibiótico, y un ADN genómico se aisló de la cepa cultivada por el método descrito en Rochelle et al. (FEMS Microbiol. Lett., 100:59, 1992). La PCR se realizó utilizando el ADN genómico mutante aislado en calidad de un molde, y el producto de la PCR se sometió a electroforesis para confirmar la deleción de ptsG y sacC en cada una de las cepas mutantes.
Con el fin de confirmar la deleción de ptsG en la cepa MptsG, se realizaron PCRs utilizando un conjunto de cebadores de SEQ ID NOS: 37 y 38 y un conjunto de cebadores de SEQ ID NOS: 39 y 40, respectivamente. Con el fin de confirmar la deleción de sacC en la cepa MsacC, se realizaron PCRs utilizando un conjunto de cebadores de SEQ ID NOS: 39 y 40 y un conjunto de cebadores de SEQ ID NOS: 41 y 42, respectivamente.
2.3: Comparación del crecimiento entre la cepa MptsG, la cepa MsaC y la cepa parental (MBEL55E)
Cada una de las cepas MptsG y MsaC recombinantes construidas en el Ejemplo 2.2 se cultivó en BHI (infusión cerebro-corazón Bacto™; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) durante aproximadamente 8 horas, y 10 ml del caldo de cultivo se inocularon en 300 ml de medio de cultivo MH5S (por cada litro: 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de polipeptona, 1 g de NaCl, 8,7 g de K2HPO4, 10 g de NaHCO3, 0,02 g de CaCl2·2H2O, 0,2 g de MgCl2·6H2O y 10 g de sacarosa), y las curvas de crecimiento de las cepas se compararon con la curva de crecimiento de la cepa parental MBEL55E cultivada en las mismas condiciones. La FIG. 4 es un conjunto de curvas de crecimiento de las cepas MBEL55E (●), MptsG (▲) y MsaC (Δ), medidas como DO600. Tal como se muestra en la FIG. 4, la capacidad de crecimiento de la cepa parental (MBEL55E) en el medio de sacarosa desaparecía sustancialmente cuando se suprimieron de la cepa cada uno de los genes. Esto indica que cada uno de los genes es esencial para el crecimiento de la cepa en el medio de sacarosa.
Mientras tanto, el gen rbsK que codifica fructoquinasa (RbsK, MS1233) se sometió al mismo experimento que el descrito anteriormente, y no se observó cambio alguno en el crecimiento tal como una disminución en la tasa de crecimiento. También, en resultados de medición para la actividad enzimática, la cepa parental y la cepa a la que se ha suprimido rbsK no mostraron grandes diferencias en la actividad enzimática entre ellas y tenían niveles de actividad enzimática que eran muy inferiores a los de la fructoquinasa general. A saber, las dos cepas mostraron actividades enzimáticas despreciables. En base a estos resultados, se infiere que el gen rbsK no codifica frutoquinasa o tiene una actividad muy débil, incluso a pesar de que codifique fructoquinasa.
2.4: Comparación de actividades enzimáticas de las cepas MptsG y MsacC y la cepa parental
Para medir la actividad enzimática de PTS de sacarosa, se utilizaron los métodos de Jacobson et al. (J. Biol. Chem., 254:249, 1979) y Lodge et al. (Infect. Immun., 56:2594, 1988).
Primero, con el fin de permeabilizar células, 1 ml del caldo de cultivo de células a un valor DO600 de aproximadamente 1,2 se lavó con tampón TDM (Tris/HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM; pH 7,5) y se resuspendió en 1 ml del mismo tampón, a ello se añadieron 0,01 ml de tolueno, y la disolución de células se agitó intensamente durante 45 segundos. La disolución de células agitada se centrifugó a 12.000 x g, y las células recogidas se lavaron dos veces con tampón TDM. Este proceso se repitió una vez más, y las células resultantes se re-suspendieron en 50 μl de tampón TDM, preparando así células permeabilizadas. Se realizó una fosforilación de sacarosa dependiente de PEP añadiendo 5 μl de la suspensión de células permeabilizada a 100 μl de una mezcla de reacción que contiene Tris/HCl 25 mM (pH 8,0), DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, KF 10 mM y 1 μCi de [U14C]sacarosa, y midiendo la diferencia en la reacción entre la mezcla que contiene PEP 1 mM y la mezcla que no contiene PEP. Se dejó que la mezcla reaccionara a 37ºC durante 10 minutos y a ello se añadió 1 mL de agua fría para detener la reacción. El producto de reacción final se hizo pasar a través de un disco de filtro de DEAE (Whatman, DE81) en un sistema de filtro y se lavó con un volumen décuplo de agua fría y luego se midió la radiactividad del mismo de acuerdo con un método conocido utilizando el contador de centelleo líquido Beckman LS6500 (Beckman, Ramsey, MN). La actividad de sacarosa-6-fosfato hidrolasa se midió por la misma modificación del método de Martin et al. (Appl. Environ. Microbiol., 53:2388, 1987). 20 ml del cultivo de células a un valor DO600 de aproximadamente 1 se permeabilizaron de la misma manera que en la medición de la actividad PTS de sacarosa y, finalmente, se re-suspendieron en 1 mL de tampón TDM, preparando así células permeabilizadas. Se realizó una fosforilación de sacarosa dependiente de PEP añadiendo 30 μl de las células permeabilizadas a 300 μl de una mezcla de reacción que contiene tampón fosfato de sodio-potasio 50 mM (pH 7,2), MgCl2 5 mM, sacarosa 4 mM, NADP 0,8 mM y 6,4 U de glucosa-6-fosfato deshidrolasa, y midiendo la diferencia en la reacción entre la mezcla que contiene PEP 10 mM y la mezcla que no contiene PEP.
Se midieron las actividades de las cepas mutantes de las que se eliminaron los genes ptsG y sacC y la actividad de la cepa parental, y los resultados de la medición se muestran en la Tabla 2 que figura a continuación. Los resultados revelan que la enzima PTS de sacarosa, codificada por MS0784 (ptsG), tiene actividad PTS, y que la enzima sacarosa-6-fosfato hidrolasa, codificada por MS0909 (sacC), tiene funciones glucolíticas en células.
Tabla 2
Enzimas
Cepas Medio de cultivoa Actividad específica de la enzima (mU/mg)b Actividad relativa (%)c
Sacarosa
MBEL55E MH5S* 3,7 100,0
fosfotransferasa
BHI 1,4 37,8
MptsG
BHI 0,098 2,6
Sacarosa-6-fosfato
MBEL55E MH5S* 18,3 100,0
hidrolasa
BHI 20,4 111,5
MsacC
BHI 1,7 9,3
aBHI, infusion cerebro-corazón BactoTM (Becton, Dickinson and Company, Spark, MD);
10 la composición del medio MH5S contiene: por litro, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de polipeptona, 1 g de NaCl, 8,7 g de K2HPO4, 10 g de NaHCO3, 0,02 g de CaCl2·2H2O, 0,2 g de MgCl2·6H2O y 10 g de sacarosa.bLa actividad de sacarosa fosfotransferasa se expresó en una unidad de mU/mg convertida a partir de cpm (recuentos por minuto) medida a través de un contador de centelleo líquido. cLa actividad relativa se determinó calculando los valores restantes hasta 100% para el caldo de cultivo indicado
15 por el símbolo *.
Ejemplo 3: Aislamiento de nuevos genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo de sacarosa
Genes que codifican β-fructofuranosidasa, incluido sacC, de los que se confirmó que tenían la capacidad de 20 metabolizar sacarosa sobre la base de los resultados del Ejemplo 2, se aislaron de cada una de Mannheimia, E. coli y Bacillus subtilis de la siguiente manera.
3.1: Aislamiento del gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa derivada de Mannheimia
25 Primeramente, el ADN del gen sacC (MS0909) se amplificó mediante PCR utilizando el ADN genómico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) en calidad de molde con cebadores de SEQ ID NOS: 43 y 44. El gen sacC (MS0909) es un gen (SEQ ID NO: 4) que codifica β-fructofuranosidasa (sacarosa-6-fosfato hidrolasa).
3.2: Aislamiento del gen que codifica invertasa derivada de E. coli
El ADN del gen cscA se amplificó mediante PCR utilizando el ADN genómico de E. coli W en calidad de un molde con cebadores de SEQ ID NOS: 45 y 46. El cscA es un gen (SEQ ID NO: 8) que codifica β-fructofuranosidasa 35 (invertasa).
3.3: Aislamiento del gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa derivada de Bacillus subtilis
El ADN del gen sacA se amplificó mediante PCR utilizando el ADN genómico de Bacillus subtilis en calidad de un molde con cebadores de SEQ ID NOS: 47 y 48. El sacA es un gen (SEQ ID NO: 10) que codifica βfructofuranosidasa (sacarosa-6-fosfato hidrolasa).
Ejemplo 4: Construcción de vectores recombinantes
5 4.1: Preparación de pTac15K
Se construyó un vector pTac15K insertando el promotor trc y las regiones de terminador de la transcripción pKK223-3 (Pharmacia Biotech., Uppsala, Suecia) en pACYC177 (NEB, Beverly, MA, EE.UU.). pTac15K es un vector de expresión para la expresión constitutiva y tiene una estructura mostrada en un mapa de corte y empalme
10 de la FIG. 5.
4.2: Construcción de pTac15KsacC
Con el fin de expresar el gen sacC (MS0909) que codifica β-fructofuranosidasa (sacarosa-6-fosfato hidrolasa) 15 derivada de Mannheimia en E. coli, se construyó un vector de expresión de la siguiente manera.
De acuerdo con un método de ingeniería molecular conocido, el fragmento de PCR que contiene el gen sacC (MS0909), amplificado en el Ejemplo 3.1, se digirió con EcoRI y SacI y se ligó en pTac15K digerido con las mismas enzimas, construyendo así pTac15KsacC (FIG. 6). El vector construido se secuenció en Solgent Co.
20 (Corea) utilizando los cebadores de SEQ ID NOS: 49 a 52, examinando así si la secuencia base del gen introducido en el vector era consistente con la del gen sacC (MS0909).
4.3: Construcción del vector recombinante pTac15KEWcscA
25 De acuerdo con un método de ingeniería molecular conocido, el fragmento de ADN obtenido en el Ejemplo 3.2 se digirió con EcoRI y SacI y se ligó en pTac15K digerido con las mismas enzimas, construyendo así pTac15KEWcscA.
30 4.4: Construcción del vector recombinante pTac15KBSsacA
De acuerdo con un método de ingeniería molecular conocido, el fragmento de ADN obtenido en el Ejemplo 3.3 se digirió con EcoRI y SacI y se ligó en pTac15K digerido con las mismas enzimas, construyendo así pTac15KBSsacA.
Ejemplo 5: Construcción de cepas recombinantes
5.1: Construcción de la cepa de Escherichia coli W3110 pTac15KsacC
40 Se llevó a cabo el siguiente experimento utilizando como un microorganismo modelo E. coli W3110 que es una subcepa de E. coli K-12 que se sabe que es incapaz de metabolizar sacarosa. La cepa E. coli W3110 se extendió en placas en medio LB sólido y se cultivó a 37ºC durante 8 horas y luego la colonia se inoculó en 10 ml de medio LB líquido y se cultivó durante 8 horas. El caldo de cultivo se inoculó en 100 ml de medio LB líquido al 1% (v/v) y se cultivó en una incubadora con agitación a 37ºC.
45 Cuando el caldo de cultivo alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,30-0,35 después de aproximadamente 2 horas, se dejó reposar en hielo durante 20 minutos para detener el crecimiento de las células. El caldo de cultivo se centrifugó a 4ºC a 3.000 rpm durante 15 minutos para recoger las células y luego las células se suspendieron en 32 ml de disolución RFI a 4ºC. La suspensión de células se centrifugó a 4ºC a 3.000 rpm durante 15 minutos
para recoger las células. Las células recogidas se re-suspendieron en 8 ml de disolución RFII y luego se dejaron reposar en hielo durante 15 minutos. Finalmente, la re-suspensión se dispensó en una cantidad de 100 μl/pocillo y se almacenó a -70ºC. La composición de la disolución RFI consistía en RbCl 100 mM, MnCl2·4H2O 50 mM, CH3COOK 0,1 M, CaCl2 10 mM y glicerol al 15% (p/v) y se ajustó hasta un pH de 5,8 mediante la adición de acetato 0,2 M. La disolución de RFII consistía en MOPS 10 mM, RbCl 10 mM, CaCl2 100 mM y glicerol al 15% (p/v) y se ajustó a un pH de 6,8 mediante la adición de NaOH.
El vector de expresión construido en el Ejemplo 2.2 o pTac15K (Pharmacia Biotech., Uppsala, Suecia) en calidad de un testigo se añadió a la cepa E. coli W3110, y luego la cepa se sometió a transformación por choque térmico a 42ºC durante 90 segundos, transformando así la cepa. Después de la transformación por choque térmico, se añadieron 0,8 ml de medio LB líquido a la cepa y luego la cepa se cultivó en una incubadora con agitación a 37ºC durante 1 hora.
El caldo de cultivo se extendió en placa en un medio LB sólido que contenía antibiótico canamicina (concentración final: 50 μg/L) y se cultivó a 37ºC durante 12 horas o más. Las colonias de E. coli W3110 pTac15K y E. coli W3110 pTac15KsacC se inocularon en medio LB líquido y se cultivaron a 37ºC durante 8 horas o más. Con el fin de confirmar si el vector se introducía con éxito en la cepa, el vector se aisló de la cepa cultivada utilizando el plásmido SV de GeneAllR (GeneAll Biotechnology, Corea), y se sometió a electroforesis.
5.2: Construcción de las cepas de E. coli W3110 pTac15KEWcscA y E. coli W3110 pTac15KBSsacA
De acuerdo con el mismo método que el descrito en el Ejemplo 5.1, E. coli W3110, que es una subcepa de E. coli K-12 que se sabe que es incapaz de metabolizar sacarosa, se transformó utilizando cada uno de los vectores pTac15KEWcscA y pTac15KBSsacA construidos en los Ejemplos 4.3 y 4.4, y se confirmó mediante electroforesis si el vector se introdujo con éxito.
Ejemplo 6: Examen de la capacidad metabolizante de sacarosa y del cremiento de E. coli recombinante
Cada una de las colonias de E. coli W3110 pTac15KsacC y E. coli W3110 pTac15K en medio sólido, construidas en el Ejemplo 5.1, se inoculó en 10 ml de medio LB y se cultivó a 37ºC durante 8 horas. Después, las células se inocularon en 100 ml de un medio mínimo M9 (que contenía 10 g/L de sacarosa) al 5% (v/v) y se cultivaron a 37ºC. A esto se añadió, en calidad de antibiótico canamicina hasta una concentración final de 50 μg/L. El medio LB consistía en 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl y 5 g/L de extracto de levadura, y el medio mínimo M9 consistía en 33,9 g/L de Na2HPO4, 15 g/L de KH2PO4, 2,5 g/L de NaCl, 5 g/L de NH4Cl y 0,36 g/L de MgSO4. La concentración de células en el caldo de cultivo se midió como DO600 utilizando un espectrofotómetro. Durante el período de cultivo se recogió periódicamente una muestra, y la muestra recogida se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos. Después, las concentraciones de sacarosa y metabolitos en el sobrenadante se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Como resultado, tal como se muestra en las FIGS. 7 y 8 y en la Tabla 3, la cepa de E. coli W3110 pTac15K no podía crecer en el medio mínimo M9 que contenía sacarosa como única fuente de carbono, pero la cepa E. coli W3110 pTac15KsacC mostró una capacidad excelente de metabolizar sacarosa. La cepa de E. coli W3110 pTac15KsacC metabolizó 11,08 g/L de sacarosa durante 17 horas y mostró un incremento en la biomasa de 3,71 basado en la DO600. Este aumento en la biomasa corresponde a una cantidad de biomasa de aproximadamente 1,37 g/L a la vista del factor de conversión (1 DO600 = 0,37 g/L DCW) de DO600 y el peso de la célula en seco (DCW (siglas inglesas), g/L) de E. coli convencional. Además, se podía observar que se produjeron 1,42 g/L de ácido acético, quedaban 2,01 g/L de glucosa y 4,51 g/L de fructosa, y los dos sacáridos se consumieron gradualmente con el paso del tiempo.
Tabla 3
Cepas
Plásmidos Crecimiento en Sacarosa que Concentración de sacarosa (g/L)
medio mínimo M9 + 10 g/L de sacarosa
utiliza el fenotipo 0 h 19 h
E. coli W3110
pTAC15K - scr 11,00 11,12
E. coli W3110
pTAC15KsacC + scr+ 11,08 0,00
En la curva de crecimiento de la cepa W3110 pTac15K (FIG. 7) se piensa que un ligero incremento en la DO a las 8 horas después de la inoculación puede ser atribuible a los componentes del medio en los que se inoculó a razón de 5% (v/v). Los resultados del análisis LC de la cepa W3110 pTac15K indicaron que la cepa ni degradaba sacarosa ni crecía utilizando sacarosa como única fuente de carbono.
Además de ello, las cepas recombinantes de E. coli W3110 pTac15KEWcscA y E. coli W3110 pTac15KBSsacA transformadas en el Ejemplo 5.2 se cultivaron utilizando sacarosa como una única fuente de carbono de la misma manera que en el caso de la cepa de E. coli W3110 pTac15KsacC. Como resultado, tal como se muestra en la FIG. 9, las cepas mostraron una excelente capacidad de crecer. También, en el caso de E. coli W3110 pTac15KEWcscA, la sacarosa disminuyó de 7,77 g/L en la fase inicial a 1,82 g/L al cabo de 48 horas, y en el caso de la cepa de E. coli W3110 pTac15KBSsacA, la sacarosa disminuyó de 8,49 g/L en la fase inicial a 7,98 g/L al cabo de 48 horas. Esto sugiere que estas cepas pueden crecer metabolizando sacarosa.
Ejemplo 7: Producción de metabolitos en E. coli recombinante utilizando sacarosa como fuente de carbono
Tal como se describe arriba, cuando la sacarosa-6-fosfato hidrolasa derivada de M. succiniciproducens se introdujo en el microorganismo incapaz de crecer utilizando sacarosa como una fuente de carbono, el microorganismo podía crecer utilizando sacarosa como única fuente de carbono. A saber, cuando un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbón se trata de modo que pueda cultivarse en un medio mínimo utilizando sacarosa como una única fuente de carbono, los sistemas existentes para producir diversos bioproductos (p. ej. metabolitos primarios y secundarios, proteínas recombinantes y polímeros biodegradables) se pueden aplicar a la presente invención.
Por consiguiente, este Ejemplo muestra la producción de diversos metabolitos utilizando sacarosa en condiciones anaerobias.
La cepa de E. coli W3110 pTac15KsacC, construida en el Ejemplo 5.1, se inoculó en 10 ml de medio LB y se cultivó a 37ºC durante 8 horas, y después el caldo de cultivo se inoculó en 200 mL de medio LB y se cultivó a 37ºC durante 8 horas. Luego, el caldo de cultivo se inoculó en un fermentador de 2,5 L de volumen (New Brunswick System, BioFlo 3000). Un medio de cultivo en el fermentador consistía en medio mínimo R/2 que contenía 20 g/L de sacarosa, y CO2 al 100% se introdujo en el fermentador a una velocidad de 0,5 vvm bajo condiciones operativas de pH 6,8, 37ºC y 200 rpm. En calidad de un antibiótico se añadió canamicina hasta una concentración final de 50 μg/L. El medio R/2 consistía en 6,75 g/L de KH2PO4, 2 g/L de (NH4)2HPO4, 0,85 g/L de C6H8O7·H2O, 0,7 g/L de MgSO4·7H2O y 5 ml/L de disolución de metales traza (10 g/L de FeSO4·7H2O, 2 g/L de CaCl2, 2,2 g/L de ZnSO4·7H2O, 0,54 g/L de MnSO4·5H2O, 1 g/L de CuSO4·5H2O, 0,1 g/L de NH4Mo7O24·7H2O, 0,02 g/L de Na2B4O7·10H2O y 5 mL de HCl). La concentración de células en el caldo de cultivo se midió como DO600 utilizando un espectrofotómetro, y durante el período de cultivó se recogió periódicamente una muestra, la muestra recogida se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos y después se analizaron las concentraciones de sacarosa y metabolitos en el sobrenadante mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Tal como se muestra en la FIG. 10 y la Tabla 4, se podían producir con éxito ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido succínico y etanol. En las condiciones anaerobias arriba descritas durante 52,5 horas, se consumieron por completo 22,13 g/L de sacarosa y sacáridos derivados de la misma y, como resultado, se produjeron 4,49 g/L de ácido acético, 3,74 g/L de ácido fórmico, 4,19 g/L de ácido láctico, 5,10 g/L de ácido succínico y 2,66 g/L de etanol a rendimientos de 0,20, 0,17, 0,19, 0,23 y 0,12 g/g de sacarosa, y la suma total de estos rendimientos era 0,91 g/g de sacarosa, lo cual se aproximaba significativamente al valor teórico. También la DO600 a las 52,5 horas después del comienzo del cultivo era 2,7, que correspondía a un DCW de 0,999 a la vista del factor de conversión arriba descrito. El rendimiento específico calculado que indica el rendimiento por peso de cepa se muestra en la Tabla 4 que figura a continuación. Los resultados de la Tabla 4 indican que, cuando la sacarosa-6-fosfato hidrolasa se introduce sola, se pueden producir con éxito diversos metabolitos a un alto
rendimiento y a un elevado rendimiento específico utilizando sacarosa. Tabla 4
Sacarosa y productos
Conc. inicial Conc. final Renidmiento (g/g de sacarosa) Rendimiento específico (g/g de DCW)
Sacarosa
22,13 0 - -
Ácido acético
0 4,49 0,20 4,49
Ácido fórmico
0 3,74 0,17 3,74
Ácido láctico
0 4,19 0,19 4,19
Ácido succínico
0 5,10 0,23 5,11
Etanol
0 2,66 0,12 2,66
Total
22,13 20,18 0,91 20,19
Ejemplo 8: Aplicación a bioproductos útiles tratados metabólicamente mediante ingeniería a través de aplicaciones a una cepa productora de treonina
Se llevó a cabo el siguiente experimento utilizando una cepa productora de treonina con el fin de ilustrar que cuando los genes de la presente invención se introducen en una cepa de E. coli tratada mediante ingeniería en el genoma o recombinante, la cepa puede producir también bioproductos utilizando sacarosa en lugar de otras fuentes de carbono existentes. Específicamente, se llevó a cabo el siguiente experimento utilizando, como modelo, TH28C pBRThrABCR3 tratado mediante ingeniería en el genoma y recombinante (Lee et al., Molecular Systems Biology, 3:149, 2007) metabólicamente modificado, basado en E. coli W3110.
De acuerdo con el mismo método que el descrito en el Ejemplo 5, la cepa TH28C pBRThrABCR3 se transformó con el plásmido pTac15KsacC construido en el Ejemplo 4, construyendo así TH28C pBRThrABCR3 pTac15KsacC.
La cepa TH28C pBRThrABCR3 pTAC15KsacC10 construida se inoculó en 10 mL de medio LB y se cultivó a 31ºC durante 12 horas, y el caldo de cultivo se inoculó en 50 mL de medio LB y se cultivó a 31ºC durante 12 horas. Luego, el caldo de cultivo se inoculó en un fermentador de 2,5 L de volumen (New Brunswick System, BioFlo 3000). El medio de cultivo contenido en el fermentador consistía en medio TPM2 que contenía 20 g/L de sacarosa, y se mantuvo a un nivel de saturación del aire de más del 40% suministrando aire con una concentración de oxígeno disuelto de 1 vvm bajo condiciones de pH de 6,5 y temperatura de 31ºC e incrementando automáticamente el número de revoluciones (rpm) hasta 1000. En calidad de antibióticos se añadieron cloranfenicol, canamicina y ampicilina hasta concentraciones finales de 30 μg/L, 40 μg/L y 50 μg/L, respectivamente. El medio TMP2 consistía en 2 g/L de extracto de levadura, 2 g/L de MgSO4·7H2O, 2 g/L de KH2PO4, 10 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/L de L-metionina, 0,2 g/L de L-lisina, 0,05 g/L de L-isoleucina y 10 ml/L de disolución de metales traza (10 g/L de FeSO4·7H2O, 2 g/L de CaCl2, 2,2 g/L de ZnSO4·7H2O, 0,54 g/L de MnSO4·5H2O, 1 g/L de CuSO4·5H2O, 0,1 g/L de NH4Mo7O24·7H2O, 0,02 g/L de Na2B4O7·10H2O y 5 mL de HCl). La concentración de células en el caldo de cultivo se midió como DO600 utilizando un espectrofotómetro, y la muestra periódicamente recogida se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos y después se analizaron las concentraciones de sacarosa y metabolitos en el sobrenadante mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Para el análisis de aminoácidos, 5 ml del caldo de cultivo se sometieron a procesos de centrifugación y filtración, y luego se separaron en Science Lab Center Co. (Daejeon, Corea), utilizando una columna de separación de cationes (LCA K06/Na 1,6150 mm; Sykam GmbH, Eresing, Alemania). Después, la muestra separada se analizó utilizando el analizador de aminoácidos Sykam S433.
Como resultado, tal como se muestra en la Tabla 5 que figura a continuación, se pudieron producir con éxito, utilizando sacarosa, 4,7 g/L de treonina.
Tabla 5
Valor inicial
Valor final (después de 15 h de cultivo)
DO600
0,4 18,0
Sacarosa
23,7 g/L 0 g/L
Treonina
0 g/L 4,7 g/L
Tal como se describe arriba, cuando el gen β-fructofuranosidasa de la presente invención se introdujo en un microorganismo incapaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono, el microorganismo había tenido la capacidad de metabolizar sacarosa y, además, podía producir diversos metabolitos, incluido ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido succínico y etanol, utilizando sacarosa como una fuente de carbono. Además de ello, cuando el gen de la presente invención se introdujo en la cepa metabólicamente modificada de la misma manera, se podía producir con éxito un metabolito deseado (treonina en este Ejemplo). Además, cualquier persona experta en la técnica también puede emplear fácilmente la presente invención para producir polímeros biodegradables,
5 proteínas recombinantes y similares.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Tal como se describe antes en detalle, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante capaz
10 de utilizar sacarosa económica como una fuente de carbono en lugar de glucosa cara. También, en un proceso de cultivar microorganismos que han sido incapaces de utilizar sacarosa como una fuente de carbono, la sacarosa puede ser sustituida por otras fuentes de carbono, incluida glucosa. En la presente invención, se identificó y desarrolló un grupo de nuevas enzimas que permiten el uso eficaz de sacarosa, que es económica y abundante en la naturaleza. Enzimas de este tipo se utilizarán para la producción más eficaz y económica de compuestos
15 químicos útiles o proteínas recombinantes médicas a través de la fermentación microbiana utilizando sacarosa como una fuente de carbono. Particularmente debido a que se sabe que la sacarosa funciona para prevenir la modificación de proteínas en células, estabilizar proteínas en células y minimizar la lisis de células es muy útil en la producción de elevadas concentraciones de compuestos químicos de carácter básico o en cultivo de células a alta concentración.
20 A pesar de que la presente invención se ha descrito en detalle con referencia a características específicas, resultará evidente para los expertos en la técnica que esta descripción sólo es para una realización preferida y no limita el alcance de la presente invención. Así, el alcance sustancial de la presente invención quedará definido por las reivindicaciones anejas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110>
KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
5
<120> Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono
<130>
21522EP
10
<140> <141> EP 08 862 527.2
<150> <151>
KR 10-2007-0133239
15
<150> <151> KR 10-2008-0106133
<160>
52
20
<170> PatentIn version 3.2
25
<210> <211> <212> <213> 1 492 PRT Mannheimia succiniproducens MBEL55E
<200> <223>
Sacarosa fosfotransferasa (PtsG)
30
<400> 1
5
<210> <211> <212> <213> 2 1479 ADN Mannheimia succiniproducens MBEL55E
10
<200> <223> Gen que codifica sacarosa fosfotransferasa (ptsG)
<400>
2
5
<210> <211> <212> <213> 3 502 PRT Mannheimia succiniproducens MBEL55E
10
<200> <223> <400> Sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC) 3
5
<210> <211> <212> <213> 4 1509 ADN Mannheimia succiniproducens MBEL55E
<200> <223>
Gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacC)
10
<400> 4
5
<210> <211> <212> <213> 5 310 PRT Mannheimia succiniproducens MBEL55E
10
<200> <223> <400> Fructoquinasa (RbaK) 5
5
<210> <211> <212> <213> <200> <223> 6 933 ADN Mannheimia succiniproducens MBEL55E Gen que codifica fructoquinasa (rbsK)
<400>
6
<211>
477
<212>
PRT
<213>
E. coli W
15
<200>
<223>
Sacarosa hidrolasa (CscA)
5
<210> <211> <212> <213> 8 1434 ADN E. coli W
10
<200> <223> <400> Gen que codifica sacarosa hidrolasa (CscA) 8
5
<210> <211> <212> <213> 9 480 PRT Bacillus subtilis
10
<200> <223> <400> Sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacA) 9
5
<210> <211> <212> <213> 10 1443 ADN Bacillus subtilis
10
<200> <223> <400> Gen que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa (SacA) 10
5
<210> <211> <212> <213> 11 30 ADN cebador
10
<400> 11
<210>
12
<211>
35
<212>
ADN
15
<213> cebador
<400>
12
<400>
18
<400>
31
5
<210> <211> <212> <213> 13 52 ADN cebador
10
<400> 13
15
<210> <211> <212> <213> 14 75 ADN cebador
<400>
14
25
<210> <211> <212> <213> 15 75 ADN cebador
<400>
15
30
<210>
16
<211>
38
<212>
ADN
<213>
cebador
35
<400>
16
40
<210> <211> <212> <213> 17 20 ADN cebador
45
<400> 17
<210>
18
50
<211> 24
<212>
ADN
<213>
cebador
5
<210> <211> <212> <213> 19 22 ADN cebador
10
<400> 19
15
<210> <211> <212> <213> 20 24 ADN cebador
20
<400>
20
25
<210> <211> <212> <213> 21 20 ADN cebador
<400>
21
35
<210> <211> <212> <213> 22 20 ADN cebador
<400>
22
40
<210>
23
<211>
20
<212>
ADN
<213>
cebador
45
<400>
23
50
<210> <211> <212> <213> 24 20 ADN cebador
55
<400> 24
<210>
25
<211>
32
<212>
ADN
<213>
cebador
5
<400>
25
10
<210> <211> <212> <213> 26 30 ADN cebador
15
<400> 26
20
<210> <211> <212> <213> 27 31 ADN cebador
<400>
27
30
<210> <211> <212> <213> 28 30 ADN cebador
<400>
28
35
<210>
29
<211>
30
<212>
ADN
<213>
cebador
40
<400>
29
45
<210> <211> <212> <213> 30 30 ADN cebador
50
<400> 30
<210>
31
55
<211> 31
<212>
ADN
<213>
cebador
5
<210> <211> <212> <213> 32 33 ADN cebador
10
<400> 32
15
<210> <211> <212> <213> 33 32 ADN cebador
20
<400> 33
25
<210> <211> <212> <213> 34 29 ADN cebador
<400>
34
35
<210> <211> <212> <213> 35 40 ADN cebador
<400>
35
40
<210>
36
<211>
41
<212>
ADN
<213>
cebador
45
<400>
36
50
<210> <211> <212> <213> 37 20 ADN cebador
55
<400> 37
5
<210> <211> <212> <213> 38 20 ADN cebador
<400>
38
10
<210>
39
<211>
22
<212>
ADN
<213>
cebador
15
<400>
39
20
<210> <211> <212> <213> 40 22 ADN cebador
25
<400> 40
30
<210> <211> <212> <213> 41 25 ADN cebador
<400>
41
40
<210> <211> <212> <213> 42 22 ADN cebador
<400>
42
45
<210>
43
<211>
33
<212>
ADN
<213>
cebador
50
<400>
43
55
<210> 44
<211>
34
<212>
ADN
41
<213> cebador
<400> 44
10
<210> <211> <212> <213> 45 32 ADN cebador
<400>
45
15
<210>
46
<211>
35
<212>
ADN
<213>
cebador
20
<400>
46
25
<210> <211> <212> <213> 47 34 ADN cebador
30
<400> 47
35
<210> <211> <212> <213> 48 39 ADN cebador
40
<400> 48
45
<210> <211> <212> <213> 49 20 ADN cebador
<400>
49
55
<210> <211> <212> <213> 50 20 ADN cebador
<400>
50
5
<210> <211> <212> <213> 51 20 ADN cebador
<400>
51
15
<210> <211> <212> <213> 52 20 ADN cebador
<400>
52

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Un vector recombinante que contiene un gen (ptsG) que codifica una sacarosa fosfotransferasa y un gen sacC que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa, en donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO: 2. 5 2.- El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen sacC tiene la SEQ ID NO: 4.
  2. 3.- Un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en que el vector recombinante de la reivindicación 1 se introduce en una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste en bacterias,
    10 levaduras y hongos.
  3. 4.- Un microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa, en el que un gen (ptsG) que codifica una sacarosa fosfotransferasa y un gen (sacC) que codifica sacarosa-6-fosfato hidrolasa se introducen en un ADN cromosómico de una célula hospedante seleccionada del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos, en
    15 donde el gen ptsG tiene la SEQ ID NO: 2.
  4. 5.- El microorganismo recombinante capaz de metabolizar sacarosa de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el gen sacC tiene la SEQ ID NO: 4.
    20 6.- Un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes, comprendiendo el método cultivar el microorganismo recombinante de la reivindicación 3 en un medio que contiene sacarosa como una fuente de carbono.
  5. 7.- Un método para producir metabolitos, polímeros biodegradables o proteínas recombinantes, comprendiendo el
    25 método cultivar el microorganismo recombinante de la reivindicación 4 en un medio que contiene sacarosa como una fuente de carbono.
ES08862527T 2007-12-18 2008-12-18 Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono Active ES2424240T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20070133239 2007-12-18
KR20070133239 2007-12-18
KR20080106113 2008-10-28
KR20080106113 2008-10-28
PCT/KR2008/007533 WO2009078687A2 (en) 2007-12-18 2008-12-18 Recombinant microorganism having an ability of using sucrose as a carbon source

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2424240T3 true ES2424240T3 (es) 2013-09-30

Family

ID=40796042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08862527T Active ES2424240T3 (es) 2007-12-18 2008-12-18 Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20110269183A1 (es)
EP (1) EP2227541B1 (es)
JP (1) JP2011505869A (es)
CN (1) CN101970648A (es)
AU (1) AU2008339217A1 (es)
BR (1) BRPI0819509A2 (es)
ES (1) ES2424240T3 (es)
WO (1) WO2009078687A2 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102333859B (zh) 2008-09-16 2015-04-22 三井化学株式会社 由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌
JP5254353B2 (ja) 2008-11-05 2013-08-07 三井化学株式会社 ２−デオキシ−シロ−イノソース（ｄｏｉ）生産細菌及びこれを用いた２−デオキシ−シロ−イノソース（ｄｏｉ）生産方法
SG179183A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Mitsui Chemicals Inc Isopropyl alcohol-producing bacterium and method for producing isopropyl alcohol
DE102010029973A1 (de) * 2010-06-11 2011-12-15 Evonik Degussa Gmbh Mikrobiologische Herstellung von C4-Körpern aus Saccharose und Kohlendioxid
CN103025874A (zh) * 2010-07-12 2013-04-03 根特大学 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物
US8129170B1 (en) 2010-12-06 2012-03-06 E.I. Du Pont De Nemours And Company Recombinant bacteria having the ability to metabolize sucrose
US8222000B2 (en) 2010-12-06 2012-07-17 E I Du Pont De Nemours And Company Recombinant bacteria having the ability to metabolize sucrose
ES2686301T3 (es) * 2010-12-13 2018-10-17 Myriant Corporation Método de producción de ácido succínico y otros productos químicos utilizando una materia prima que contiene sacarosa
AR086790A1 (es) 2011-06-29 2014-01-22 Metabolic Explorer Sa Un microorganismo para la produccion de metionina con importacion de glucosa mejorada
US8673602B2 (en) 2011-08-16 2014-03-18 E I Du Pont De Nemours And Company Recombinant bacteria having improved sucrose utilization
US8629243B2 (en) 2011-08-16 2014-01-14 E I Du Pont De Nemours And Company Variant sucrose transporter polypeptides that enable faster sucrose utilization in bacteria
US8686114B2 (en) 2012-03-05 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Variant sucrose transporter polypeptides
US9017961B2 (en) 2012-03-05 2015-04-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Recombinant bacteria comprising novel sucrose transporters
KR20140102393A (ko) * 2013-02-13 2014-08-22 씨제이제일제당 (주) L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
WO2016030373A1 (en) * 2014-08-28 2016-03-03 Basf Se Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose
KR101774431B1 (ko) 2016-01-28 2017-09-05 한국과학기술원 자일로즈로부터 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체의 제조방법
JPWO2018008646A1 (ja) * 2016-07-06 2019-04-25 国立大学法人名古屋大学 Ｇｃｓ１改変植物種子のスクロース含有破砕液
CA3062384A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-22 Basf Se Process for producing an organic compound
KR102187682B1 (ko) 2018-06-08 2020-12-07 한국과학기술원 타입 iii 폴리케타이드 합성 효소 기반 신규 말로닐-코에이 바이오센서 및 그 용도
CN109330590B (zh) * 2018-12-07 2022-05-27 南方科技大学 一种用于表皮信号采集的表皮电极及其应用
WO2022243311A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Dsm Ip Assets B.V. Microbial strain expressing an invertase/sucrose hydrolase
CN117321071A (zh) * 2021-05-17 2023-12-29 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 表达转化酶/蔗糖水解酶的微生物菌株
CN117074699B (zh) * 2023-10-17 2024-01-12 中国农业大学 一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9297028B2 (en) * 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols

Also Published As

Publication number Publication date
AU2008339217A1 (en) 2009-06-25
CN101970648A (zh) 2011-02-09
EP2227541A2 (en) 2010-09-15
BRPI0819509A2 (pt) 2014-10-14
US20130078673A1 (en) 2013-03-28
EP2227541A4 (en) 2012-05-16
WO2009078687A2 (en) 2009-06-25
EP2227541B1 (en) 2013-06-19
US20110269183A1 (en) 2011-11-03
JP2011505869A (ja) 2011-03-03
WO2009078687A3 (en) 2009-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2424240T3 (es) Microorganismo recombinante con capacidad de utilizar sacarosa como fuente de carbono
US10975400B2 (en) 5-aminolevulinic acid high-yield bacterial strain, preparation method and use thereof
EP2054502B2 (en) Novel engineered microorganism producing homo-succinic acid and method for preparing succinic acid using the same
EP2591091B1 (en) Method for the preparation of 1,3-propanediol from sucrose
EP2990483A1 (en) Psicose epimerase mutant and method for preparing psicose by using same
KR20220139351A (ko) 엑토인의 개선된 생산을 위한 변형된 미생물 및 방법
JP2017534268A (ja) 有用産物の生産のための改変微生物および方法
EP2904104B1 (en) Recombinant microorganisms for producing organic acids
EP2297329B1 (en) Method of l-lysine production
EP3363908B1 (en) O-acetylhomoserine sulfhydrylase variant and method for producing l-methionine using same
KR101725454B1 (ko) 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법
JP6026494B2 (ja) １，２−プロパンジオールの発酵製造のための基質としてのスクロースの使用
CN106222101B (zh) 高温下高效利用菊芋一步生产高纯果糖的耐高温菌株及应用
WO2016030373A1 (en) Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose
KR100556099B1 (ko) 루멘 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
KR101707627B1 (ko) 유기산을 생산하는 신규한 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산의 제조방법
ES2538078T3 (es) Bacteria productora de alcohol isopropílico y método para producir alcohol isopropílico
KR101219685B1 (ko) 고정화 효소 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈와 엔도-1,5-알파-엘-아라비난에이즈 함유 생물반응기에서 엘-아라비노스의 제조 방법
KR101237857B1 (ko) 신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법
KR101245818B1 (ko) 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물
KR101254401B1 (ko) 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 잔탄을 대량 생산하는 방법
BR112017000940B1 (pt) Célula bacteriana termofílica geneticamente engenheirada, grampositiva anaeróbica facultativa, produtora de (s)-lático e pertencente a espécie geobacillus thermoglucosidans, bem como processo para produção de ácido (s)-lático enantiomérico puro
KR20100047100A (ko) 베타-프룩토퓨라노시다제가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물