KR101245818B1

KR101245818B1 - 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물

Info

Publication number: KR101245818B1
Application number: KR1020080129368A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 이정욱; 송효학; 김지만; 최솔
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2013-03-20
Also published as: KR20090066250A

Abstract

본 발명은 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 및/또는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 고가의 포도당 대신 저가의 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 기존에 수크로오스를 탄소원으로 이용할 수 없었던 미생물의 배양에서도 포도당을 비롯한 다른 탄소원들을 수크로오스로 대체하는 것이 가능하다.

만헤미아, 수크로오스, 수크로오스 포스포트랜스퍼라제, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈

Description

수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물{Recombinant Microorganism Having an Ability of Using Sucrose as a Carbon Source}

본 발명은 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 및/또는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

인류의 지속가능한 발전 (sustainable development)을 위하여 재생가능한 생물자원으로부터 유용한 물질들을 생산하기 위한 산업생명공학에 대한 높은 관심과 함께 이의 발전을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재까지의 미생물 발효를 통한 화학물질 생산은 포도당을 주원료 물질로 사용하여 이루어지고 있으나, 포도당의 높은 가격으로 인하여 원유를 주원료 물질로 사용하는 화학 합성법을 통한 생산 가격보다 발효를 통한 생산 가격이 높아 미생물 발효를 통한 화학물질 생산의 상용화에 어려움이 있다. 따라서, 고가의 포도당을 탄소원으로 이용하는 방법에서 탈피하여, 풍부한 생물자원으로부터 손쉽게 얻을 수 있는 다양한 종류의 가격이 저렴한 탄소원 발굴을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 예로서 목질계 가수생성물, 글리세롤, 유청, corn steep liquor 등 상대적으로 가격이 저렴한 원료물질 을 탄소원으로 사용하여 다양한 일차 대사산물들을 생산하기 위한 연구가 본 발명자들을 포함하여 많은 연구자들에 의하여 수행되어 왔다 (Samuelov et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 65:2260, 1999; Lee et al ., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 54:23, 2000; Lee et al ., Biotechnol . Bioeng ., 72:41, 2001; Lee et al ., Biotechnol. Lett ., 25:111, 2003; Lee et al ., Bioproc . Biosystems Eng ., 26:63, 2003). 하지만 현재까지 보고된 연구 결과들에 의하면, 포도당 대신에 상기의 원료물질들을 탄소원으로 사용하였을 경우에는 목적 대사 산물의 생산성 혹은 생산 수율이 포도당을 탄소원으로 사용한 경우보다 현저히 낮았으며, 이를 극복하기 위한 연구 개발이 절실히 요구된다.

설탕으로 널리 알려진 수크로오스는 글루코오스와 프락토오스로 이루어진 이당류의 하나로서, 광합성 능력을 보유한 모든 식물로부터 생산되는 자연계에 매우 풍부하게 존재하는 탄소원이다. 특히 사탕수수와 사탕무는 과량의 수크로오스를 함유하고 있으며, 현재 전 세계 수크로오스의 60% 이상이 사탕수수로부터 생산되고 있다. 무엇보다도 수크로오스는 사탕수수의 기계적인 압착으로 얻어진 추출액의 단순한 증발/농축 공정을 통하여 산업적으로 생산이 가능하여 생산가격이 매우 저렴하다. 쿠티나스 (Koutinas) 등은 2004년 미생물을 이용한 화학물질 생산에 사용가능한 다양한 원료 물질들의 가격을 포도당 함유량을 기준으로 계산하였으며, 포도당 함유량 1 킬로그램을 기준으로 수크로오스의 가격은 26.1 센트로서, 이는 소맥, 당밀, 그리고 포도당 가격에 대비하여 77%, 50%, 28.9%에 해당하는 매우 저렴한 가격이다 (Koutinas et al ., Ind . Crops and Products, 20:75, 2004).

International Sugar Agreement (ISA) daily price 보고서는 1994-1995년을 정점으로 수크로오스의 가격이 공급과잉으로 인하여 하향 안정세를 유지하고 있으며, 이러한 하락 추세는 지속될 것으로 전망하고 있다. 따라서, 수크로오스는 미생물 발효를 통한 다양한 화학물질 생산에 현재 사용되고 있는 고가의 포도당을 대체할 가장 유력한 탄소원으로 주목받고 있다. 특히, 옥수수 전분으로부터 주로 생산되고 있는 포도당의 경우에는 지속적인 옥수수 가격의 상승과 함께, 옥수수로부터의 전분 추출, 열적/화학적 전분 전처리, 효소 반응에 의한 포도당으로의 전환, 그리고 이의 정제 등 매우 복잡한 공정들을 거쳐서 생산되기 때문에 포도당 생산 단가를 수크로오스 수준으로 낮추는 것은 매우 힘들다는 것이 당업계에 종사하는 사람들에게는 널리 알려진 사실이다. 이러한 이유로 최근 미국에서의 옥수수 기반 바이오 에탄올 생산은 점차 하락하고 있으나 (Mae-Wan Ho, Science in Society, 33:40, 2007), 브라질의 사탕수수, 즉 수크로오스 기반 바이오 에탄올 생산 공정은 급격한 성장을 보이고 있다.

현재까지의 수크로오스를 탄소원으로 이용한 유용한 물질 생산에 관한 연구는 고농도 세포 배양을 통한 생분해성 고분자 (Lee et al ., Biotechnol . Lett ., 15:971, 1993; Lee et al ., Biotechnol . Techniques, 1:59, 1997), 구연산 (Forster et al., App . Microbiol . Biotechnol ., 75:1409, 2007), 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 (George et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 45:1160, 1983; Durre, Appl . Microbiol. Biotechnol ., 49:639, 1998), 이타코산 (Kautola et al ., Biotechnol. Lett ., 11:313, 1989), 잔탄검 (Letisse et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 55:417, 2001) 등을 중심으로 진행되어 왔다. 특히 국제 바이오 에너지 및 바이오 연료 시장을 분석하는 국제 에너지 에이전시 (International Energy Agency)의 2006년 바이오 에너지 태스크 40 (Bioenergy Task 40) 보고서는 브라질의 수크로오스를 포함하는 사탕수수로부터 바이오 에탄올 생산 공정을 친환경적이며 지속가능한 바이오 연료 생산의 훌륭한 모델로서 높게 평가하였다.

미생물 발효를 통한 화학물질 생산을 위한 원료물질로서 수크로오스는 가격이 저렴할 뿐 아니라, 수크로오스 자체가 과량의 목적 대사 산물을 함유하는 외부환경으로부터 세포막을 온전히 유지시켜주는 역할을 함으로써, 고농도의 목적 대사산물을 생산할 수 있는 우수한 기능을 가지고 있다. 킬리만 (Kilimann) 등은 (Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006)에 치명적인 온도에 수크로오스를 포함한 배양 배지와 이를 포함하지 않은 배양 배지에 미생물을 노출시킨 후, 이들의 생존력과 단백질의 2차 구조를 조사하였다. 연구 결과 수크로오스를 포함한 배양 배지에 노출된 미생물의 세포 내에 존재하는 단백질의 2차 구조는 매우 잘 보존되었으나, 수크로오스를 포함하지 않은 배양 배지에 노출된 미생물의 세포 내 단백질 구조는 매우 변성되었음을 확인하였다. 특히, 수크로오스를 포함하고 있는 배양 배지에 노출된 미생물의 생존율은 수크로오스를 포함하지 않은 배양 배지에 노출된 미생물의 생존율과 비교하여 월등히 높았다. 이는 유해한 외부환경에 대한 수크로오스의 미생물 보호기능을 직접적으로 증명하는 것이다.

비록 상기에서 언급한 수크로오스의 저렴한 가격과 외부환경에 대한 미생물 보호기능이라는 원료물질로서 우수한 장점을 가지고 있음에도 불구하고, 실질적으로 수크로오스를 탄소원으로 사용하여 미생물 발효를 통한 목적화학물질 생산을 성공하여 실질적으로 상업화한 예가 보고된 바가 없다. 이는 다수의 미생물들이 수크로오스를 세포 내로 수송한 후 이를 분해하여 해당과정으로 연결시키는 메커니즘을 완전히 가지고 있지 않거나 혹은 불완전하게 가지고 있음으로 수크로오스를 탄소원으로 이용할 수 없기 때문이다. 비록 수크로오스를 이용할 수 있는 메커니즘을 가지고 있는 미생물의 경우에도 탄소원으로서 이를 섭취하고 분해하는 속도가 매우 느려서 목적 대사 산물을 효율적으로 생산할 수 없다.

미생물 발효를 통한 다양한 화학물질 생산이 산업적으로 경제성을 가지기 위해서는 상기에서 언급한 바와 같이 수크로오스와 같이 가격이 저렴한 원료물질의 사용이 요구되며, 나아가 수크로오스를 탄소원으로서 효율적으로 빠른 속도로 섭취하고 이를 분해할 수 있는 효소의 동정 및 이를 이용할 수 있는 연구 개발이 반드시 필요하다. 특히, 미생물 발효를 통한 화학물질 생산에 있어서 원료물질의 가격이 최종 생산 가격의 50% 가량을 차지한다는 사실을 고려할 때, 저렴한 원료물질인 수크로오스를 효율적으로 이용하게 하는 효소의 동정 및 이의 응용개발이 매우 시급하다.

한편, 본 발명자들은 한우의 반추위로부터 동정한 숙신산 생산 균주인 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E의 전체 유전 정보 및 대사 특성을 규명한 바 있다 (Hong et al ., Nature Biotechnol ., 22:1275, 2004).

이에, 본 발명자들은 상기 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)의 유전 정보를 바탕으로 수크로오스를 세포 내로 수송하고 이를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관여하는 효소인 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 (PtsG, MS0784), 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (SacC, MS0909) 및 프락토키나제 (RbsK, MS1233)를 각각 코딩하는 신규 유전자 ptsG, sacC, 및 rbsK를 찾아내고, 이를 수크로오스를 탄소원으로 이용할 수 없는 미생물에 도입한 결과, 수크로오스를 단일 탄소원으로 이용할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 있게 하는 신규 수크로오스 대사 관련 유전자 및 이에 의해 코딩되는 효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 수크로오스 대사 관련 유전자가 도입되어 있는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 수크로오스 포스포트랜스퍼라제와 이를 코딩하는 유전자 (ptsG) 및 상기 유전자와 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자 (sacC)를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자들이 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물, 생분해성 고분자 또는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 고가의 포도당 대신 저가의 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 기존에 수크로오스를 탄소원으로 이용할 수 없었던 미생물의 배양에서도 포도당을 비롯한 다른 탄소원들을 수크로오스로 대체하는 것이 가능하다. 본 발명에서는 가격이 저렴하면서 자연계에 풍부하게 존재하는 수크로오스를 탄소원으로 효율적으로 사용 가능하게 할 수 있는 새로운 효소군을 동정하고 개발함으로써 향후 미생물 발효를 통한 유용한 화학물질들의 제조나 의료용 재조합 단백질 생산에 있어, 수크로오스를 그 탄소원으로 보다 효율적이고 경제적으로 생산하는데 이용될 것이다. 특히, 수크로오스는 그 자체로서 세포 내의 단백질들을 안정화시키거나, 세포의 용해를 최대한 억제시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 고농도의 기초 화학물질 생산이나 고농도 세포 배양시에 더 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

본 발명에서는 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)의 유전 정보를 바탕으로 수크로오스를 세포 내로 수송하고 이를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관여하는 효소 [수크로오스 포스포트랜스퍼라제 (PtsG, MS0784), 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (SacC, MS0909) 및 프락토키나제 (RbsK, MS1233)]를 코딩하는 신규 유전자 (ptsG, sacC, 및 rbsK)를 찾아내고, 이들의 서열과 기능을 규명하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 수크로오스를 세포 내로 수송하고 이를 분 해하여 해당과정으로 연결하는데 관여하는 효소인 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 수크로오스 포스포트랜스퍼라제, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 프락토키나제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 수크로오스 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 (ptsG), 상기 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자 (sacC) 및 상기 프락토키나제를 코딩하는 유전자(rbsK)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 (PtsG)는 수크로오스를 수크로오스-6-포스페이트 형태로 전환시키면서 세포 안으로 수송하는 역할을 하고, 상기 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (SacC)는 수크로오스-6-포스페이트를 글루코오스-6-포스페이트 및 프락토오스로 전환시키는 활성을 가지며, 상기 프락토키나제 (RbsK)는 프락토오스를 프락토오스-6-포스페이트로 전환시키는 활성을 가진다.

본 발명에 있어서, 상기 ptsG는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 sacC는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 rbsK는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적으로 본 발명에서는 상기 ptsG 및/또는 sacC 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제작한 다음, 이를 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 대장균에 도입하여 재조합 대장균을 제작하고, 상기 제작된 재조합 대장균을 단일 탄소원으 로 수크로오스를 함유하는 배지에서 배양한 결과, 수크로오스 대사능을 갖는다는 것을 확인하였다.

이는 도 1에 나타난 바와 같이, 수크로오스가 상기 수크로오스 포스포트랜스퍼라제(PtsG)에 의해 수크로오스-6-포스페이트로 전환되면서 세포 안으로 이송되고, 세포 내로 이송된 수크로오스-6-포스페이트는 상기 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (SacC)에 의해 글루코오스-6-포스페이트 및 프락토오스로 전환된 다음, 프락토오스는 프락토키나제 (RbsK)에 의해 프락토오스-6-포스페이트로 전환되어 해당과정으로 연결되는 것으로 추정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 및/또는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물, 생분해성 고분자 또는 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 적당한 숙주세포에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열(control sequences)에 작동가능하도록 연결된 DNA 서열 및 기타 유전자 조작을 용이하게 하거나 단백질의 발현을 최적화하거나 또는 벡터의 복제에 필요한 서열들을 함유하는 DNA 작제물(DNA construct)을 말한다. 상기 조절 서열에는 전사를 조절하기 위한 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위해 선택적으로 부가된 오퍼레이터(operator), 적절한 mRNA 리보좀 결합부위 및 전사/번역의 종료를 조절하는 서열 들이 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 재조합 벡터는 하기의 실시예에서 사용된 pTrc99A 와 같은 재조합 벡터일 수 있으나, 본 벡터이외에 다른 공지의 벡터들도 적용가능하며, pKK223-3, pTac99A, pET series, pMAL series 와 같은 발현벡터 뿐만 아니라, pACYC, pBluescript SK-, pBR322, pGEM series, pMB1 등의 클로닝 벡터들에도 sacC 유전자를 포함하는 발현카세트를 삽입함으로서 적용가능하고, 그 외에도 본 발명이 속한 기술분야의 공지의 재조합 벡터(Sambrook J, Russell D, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab (CSHL) Press, New York, 2001)를 이용하는 것이 가능하다. 또한, 암피실린 저항 유전자 이외에도 공지된 다른 여러 저항 유전자를 포함하는 것 또한 본 발명에 적용가능하다.

또한, 상기의 유전자들은 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) 유래의 것이며, 상기 균주는 Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC 55618)와 함께 Pasteurellaceae과(family)에 속한다. 특히 상기 두 균주, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) 와 A. succinogenes 130Z (ATCC 55618)의 genome sequence 및 cell physiology가 매우 유사하다. McKinlay 등의 2007년 보고에 의하면, 상기 두 균주의 genome sequence는 이제까지 해독된 모든 genome sequence 가운데 가장 유사하다고 알려져 있다 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 76:727, 2007). 따라서, 상기 유전자들은 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)와 함께 A. succinogenes 130Z (ATCC 55618)에서 유래한 유전자에도 적용되는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백한 사실이다.

본 발명의 실시예에서는 상기 ptsG , sacC 및 rbsK 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 미생물을 형질전환시켜 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였지만, 상기 유전자들을, 이미 잘 알려진 공지의 방법으로, 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 미생물의 염색체에 삽입시켜, 염색체상에서 조작된(genome-engineered) 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물을 제작할 수도 있다. 아울러 본 발명의 실시예에서는 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 숙주 미생물로 특정 대장균만을 예시하였지만, 다른 대장균뿐만 아니라, 박테리아, 효모 및 곰팡이 등 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 숙주 미생물에 도입하더라도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

또한, 본 발명에서, 대사산물이란, 대사 과정을 통해 생성되는 중간 산물, 생성물을 총칭하는 것으로, 일차 대사산물과 이차 대사산물로 구분된다. 일 예로, 본 발명은 바이오 퓨얼, 일차이차 대사산물, 생분해성 고분자, 재조합 단백질 생산균주 제작시 재조합 또는 염색체상에 조작된 (genome-engineered) 등의 방식으로 수크로오스를 활용할 수 없는 미생물에 다양하게 적용가능 할 것이다. 예를 들어, 부탄올 (Atsumi et al ., Nature ., 451:7174, 2008), 에탄올 (Lindsay et al ., Appl. Microbiol . Biotechnol, 43:70, 1995), 젖산 (Zhou, Appl . Environ . Microbiol, 69:399 2003), 숙신산 및 사과산 (Jantama et al ., Biotechnol . Bioeng ., 99:1140, 2008), 아미노산(Park et al., PNAS, 104:7797, 2006; Lee et al ., Molecular Systems Biology, 3:1, 2007), 생분해성 고분자 (Ahn et al., Appl. Environl . Microbiol ., 66:3624, 2000; Park et al ., Biomacromolecules , 2:248, 2001; Park et al ., Biotechnol . Bioeng ., 74:81, 2001), 재조합 단백질 (Jeong et al ., Appl. Environl . Microbiol ., 65:3027, 1999; Han et al ., Appl. Environl. Microbiol ., 69:5772, 2003)등의 생산시에 지금까지는 포도당을 주 탄소원으로서 활용하여 그 목적 바이오 생산품을 생산하였으나, 본 발명을 상기의 공지의 균주에 도입하면, 수크로오스를 탄소원으로 활용하여, 목적하는 유용 바이오 생산품을 생산가능할 것이다. 이외에도 생분해성 고분자, 재조합 단백질의 생산에도 본 발명을 당업자는 용이하게 적용가능 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: ptsG , sacC 및 rbsK 유전자의 수크로오스 대사능 확인

1.1: ptsG , sacC 및 rbsK 유전자의 분리

본 발명에 따른 유전자(ptsG, sacC, rbsK)가 함께 수크로오스 대사에 관여하는지 알아보기 위하여, 먼저 상기 유전자들을 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)로부터 분리하였다.

먼저, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호: 7 및 8의 프라이머들을 사용한 PCR을 수행하여 ptsG (MS0784)의 DNA를 증폭하였다. 마찬가지로, 서열번호: 9 및 10과 서열번호: 11 및 12의 프라이머들을 사용한 PCR을 수행하여 각각 sacC (MS0909)와 rbsK (MS1233)의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호: 9과 12의 프라이머들을 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 상기 ptsG (MS0784), sacC (MS0909)와 rbsK (MS1233)는 각각 순서대로 수크로오스 포스포트랜스퍼라제, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈, 및 프락토키나제를 코딩하는 유전자이다.

서열번호: 7: 5'-GGAATTCATGCTCGTTTTAGCTAGAATTGG

서열번호: 8: 5'-TCCGAGCTCTTACTATTCTTTTGCGTTAGCTCTTG

서열번호: 9: 5'-ACCTGCGAGCTCTTTCACACAGGAAACAATTTTCATGCGGTCGTTTTTACCG

서열번호: 10: 5'-CAAATTTTGTTTGTCATATGCATGAAATCTGTTTCCTGTGTGAAATTACTATTTATATTCAATTTCTTTCGGATA

서열번호: 11: 5'-TATCCGAAAGAAATTGAATATAAATAGTAATTTCACACAGGAAACAGATTTCATGCATATGACAAACAAAATTTG

서열번호: 12: 5'-ACCTGCGGGTACCCTATTAGTTTGCTAAAAATTCCGCT

1.2: 재조합 벡터 pMSscrIIA 의 제작

맨하이미아 유래의 수크로오스 포스포트랜스퍼라제, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈, 및 프락토키나제를 각각 코딩하는 유전자, ptsG (MS0784), sacC (MS0909) 및 rbsK (MS1233)를 대장균에서 발현시키기 위하여 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

실시예 1.1에서 증폭된 sacC (MS0909) 및 rbsK (MS1233) 유전자를 포함하는 하나의 DNA 조각을 절단효소 SacI 과 KpnI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 pTrc99A(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)와 결합시켜 pTrc99AsacCrbsK를 제작하였다.

다음으로 실시예 1.1에서 수득된 ptsG (MS0784) DNA 조각을 EcoRI과 SacI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 발현벡터 pTrc99AsacCrbsK와 결합시켜 pTrc99AptsGsacCrbsK를 제작하고 이를 pMSscrIIA라고 명명하였다 (도 2).

1.3: Escherichia coli W3110 pMSscrIIA 및 W3110 pTrc99A 균주의 제작

수크로오스를 대사할 수 없는 것으로 알려진 E. coli K-12 균주의 substrain인 E. coli W3110을 모델 미생물로 하기의 실험을 진행하였다.

상기 E. coli W3110을 LB 고체배지에 도말하여, 8 시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 콜로니를 LB 액체배지 10 mL에 접종하여, 8 시간 배양하였다. 상기 배양액을 LB 액체배지 100 mL에 1 %(v/v) 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.

약 2 시간 후, OD₆₀₀가 0.30 ~ 0.35 정도가 되면, 얼음에 20 분간 방치하여 세포의 성장을 멈추게 한다. 4℃, 3,000 rpm, 15 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 RFI 용액 32 mL로 세포를 현탁하였다. 그리고 상기현탁액 을 4℃, 3,000 rpm, 15 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 이를 RFII 용액 8 mL로 세포를 재현탁한 후 얼음에 15분간 방치하였다. 최종적으로 상기 재현탁액을 100 ㎕ 씩 분주하여 -70℃에 보관하였다. RFI의 조성은 100 mM RbCl, 50mM MnCl₂-4H₂O, 0.1 M CH₃COOK, 10 mM CaCl₂ 및 15 %(w/v) glycerol로 구성되며 0.2 M acetate를 첨가하여 pH를 5.8로 맞추었다. RFII는 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 100 mM CaCl₂, 및 15% (w/v) glycerol로 구성되며, NaOH를 첨가함으로 인해 pH를 6.8로 맞추었다.

이렇게 준비된 E. coli W3110 균주에 실시예 1.2에서 제작된 발현벡터 pMSscrIIA 또는 대조군으로 pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)를 혼합한 다음, 42℃에서 90초간 열충격을 가함에 따라 형질전환을 수행하였다. 열 충격 후, LB 액체배지 0.8 mL를 가하여 37℃ 진탕 배양기에서 1 시간 동안 배양하였다.

배양액을 항생제 암피실린(최종농도 50 ㎍/L)를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12 시간 이상 배양하였다. 형성된 E. coli W3110 pMSscrIIA 및 E. coli W3110 pTrc99A 콜로니를, LB 액체 배지에 접종을 하여, 37℃에서 8 시간 이상 배양하였다. 벡터가 잘 도입이 되었는지 확인하기 위해 상기 배양된 균주로부터, GeneAll^R Plasmid SV (GeneAll Biotechnology, Korea)를 이용하여 벡터를 분리하고, 전기영동을 통해 확인하였다. E. coli W3110 pMSscrIIA 균주의 경우 하기 서열번호: 13~20까지의 프라이머들을 이용하여 솔젠트(Solgent, Korea)에 시퀀 싱(sequencing)을 의뢰하여 염기서열의 일치여부를 확인하였다.

서열번호: 13: 5'-GGAAACAGACCATGGAATTC

서열번호: 14: 5'-CCGCAAAAGATTTATTCGAAGAAG

서열번호: 15: 5'-CCTGGTTATATGATACTTTAGG

서열번호: 16: 5'-TAGTGCTGGGCGCAAGAGCTAACG

서열번호: 17: 5'-ACCAGTGGGCGATAAAATCG

서열번호: 18: 5'-TGATCAAGGTTTCGATTTCT

서열번호: 19: 5'-TTTTCCTGAATGACGGCGAA

서열번호: 20: 5'-CGATCTGCCGCAATTTCAAG

1.4: 재조합 대장균의 수크로오스 대사능 확인

실시예 1.3에서 제작된 고체배지상의 E. coli W3110 pMSscrIIA 균주와 E. coli W3110 pTrc99A의 콜로니를 5 g/L 수크로오스를 단일 탄소원으로서 포함한 10 mL의 M9 최소배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이를 다시 수크로오스를 포함한 100 mL의 M9 최소배지에 3 %(v/v) 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 이때, 항생제로 최종농도 50 μg/L의 암피실린을 첨가하였다. M9 최소배지는 33.9 g/L의 Na₂HPO₄, 15 g/L의 KH₂PO₄, 2.5 g/L의 NaCl, 5 g/L의 NH₄Cl, 및 0.36 g/L의 MgSO₄로 구성되었다. 배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀의 값으로 추정하였다. 배양 중 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리한 후, 상등액의 수크로오스의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, E. coli W3110 pTrc99A 균주의 경우 수크로오스를 단일 탄소원으로 포함한 M9 최소배지에서 전혀 생장할 수 없으나, E. coli W3110 pMSscrIIA 균주는 수크로오스를 우수한 성능으로 대사하는 능력을 보였다. E. coli W3110 pMSscrIIA 균주는 19시간 동안 약 2.2 g/L의 수크로오스를 대사하여, OD₆₀₀ 기준으로 3.12의 바이오매스의 증가를 보였으며, 0.67 g/L의 초산을 부가생성물로 생산하였다. 따라서 상기 ptsG, sacC 및 rbsK 유전자들을 모두 함유한 경우, 우수한 수크로오스 대사능을 나타내는 것으로 확인되었다.

Strain	Plasmid	Growth in M9 minimal medium + 5 g/L sucrose	Sucrose utilizing phenotype	Sucrose concentration (g/L)
Strain	Plasmid	Growth in M9 minimal medium + 5 g/L sucrose	Sucrose utilizing phenotype	0 h	19 h
E. coli W3110	pTrc99A	-	scr-	5.23	5.22
E. coli W3110	pMSscrIIA	+	scr+	6.73	4.53

상기에서 나타난 바와 같이 본 발명의 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 또는 이와 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 유전자를 도입하는 것만으로도, 수크로오스를 대사하는 능력을 갖춤은 물론 수크로오스를 탄소원으로 활용하여 대사산물의 하나로서 아세트산을 생산함을 보였다. 그러므로, 아세트산 이외에도 포름산, 젖산, 숙신산, 에탄올 등은 물론이고, 바이오 부탄올을 포함하는 바이오 연료 및 에너지, 그리고 생분해성 고분자, 재조합 단백질의 생산에도 본 발명을 당업자는 용이하게 적용 가능할 것이다.

실시예 2: pstG 유전자 및 sacC 유전자 각각의 수크로오스 대사능 확인

2.1: pstG 유전자 및 sacC 유전자의 수크로오스 대사능 확인을 위한 재조합 벡터 제작

본 발명에 따른 ptsG 및 sacC가 단독으로도 수크로오스 대사능에 관여하는지 확인하기 위하여, ptsG (MS0784) 결실을 위한 벡터(pSacHR06ptsG)와 sacC (MS0909) 결실을 위한 벡터 (pSacHR06sacC)의 제작하여 knock-out 실험을 하였다.

먼저, 수크로오스 포스포트랜스퍼라제 유전자(ptsG)를 상동성 재조합 방법으로 파괴하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호: 21과 22의 프라이머를 이용하여 왼쪽 homologous arm부분을 증폭하였고, 서열번호: 23과 24의 프라이머를 이용하여 같은 주형으로 오른쪽 homologous arm부분을 증폭하였고, 서열번호: 25와 26의 프라이머를 이용하여 pECmulox 벡터 (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett., 278:78, 2008)를 주형으로 항생제 마커와 변이 lox site를 포함한 부분의 DNA 단편을 증폭하였고, 이들 세 DNA 단편을 서열번호: 21과 24번 프라이머를 이용하여 overlapping PCR을 수행하였다.

서열번호: 21: 5'-ATATCTGCAGCCGGCATTAAATATTAGTCAAC

서열번호: 22: 5'-CGTTCTAACGGAGGTTGAAAACTGCCCTTT

서열번호: 23: 5'-GTCTCCCTATCACGCCGTTATTTTCATTATT

서열번호: 24: 5'-ATTAGTCGACACCATCCCCACGGAATACAT

서열번호: 25: 5'-TTTCAACCTCCGTTAGAACGCGGCTACAAT

서열번호: 26: 5'-TAACGGCGTGATAGGGAGACCGGCAGATCC

이렇게 증폭된 최종 DNA 단편은 제한효소 PstI 과 SalI으로 잘라, 같은 효소로 잘린 pSacHR06 벡터 (Park et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (PNAS), 104:7797, 2007)에 클로닝하여 pSacHR06ptsG를 제작하였다. 또한, 상기와 같은 방법으로 서열번호: 27부터 32까지의 프라이머들을 이용하여, pSacHR06sacC를 제작하였다.

서열번호: 27: 5'-ATACACTGCAGTTATGCAATTTATCGCACCC

서열번호: 28: 5'-AATCTGCTCTGATGCGGTCGTGAAATGCTTCCA

서열번호: 29: 5'-CACAGAATCAGGACAAATGGCATTCAATGCTG

서열번호: 30: 5'-ATACTGTCGACTCAATGGCATATGCAGCG

서열번호: 31: 5'-AAGCATTTCACGACCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG

서열번호: 32: 5'-TTGAATGCCATTTGTCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC

2.2: M. succiniciproducens MptsG 및 M. succiniciproducens MsacC 균주의 제작

실시예 2.1에서 제작된 ptsG 유전자 제거용 교환벡터 pSacHR06ptsG와 sacC 유전자 제거용 교환벡터 pSacHR06sacC 각각을 이용하여, Kim et al. (FEMS Microbiol. Lett., 278:78, 2008)에 의해 보고된 방법으로 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)의 게놈에서 상기 유전자를 결실시켜 변이균주들인 M. succiniciproducens MptsG 및 M. succiniciproducens MsacC 균주를 제작하였다.

즉, M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)를 10 g/L의 포도당을 함유한 LB-포도당 고체배지에 도말하여 36 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜로니를 LB-포도당 액체배지 10 mL에 접종하여 12 시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB-포도당 액체배지 100 mL에 1% 접종하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.

약 4~5 시간 후, OD₆₀₀가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면 4℃, 4,500 rpm, 20 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 세포를 재현탁하였다. 그리고 4℃, 5,500 rpm, 20 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 이를 두 번 연속 실행한 후, 세포와 글리세롤 용액 부피비가 1:1이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 상기 수득된 세포 농축액과 상기 실시예 2.1에서 제작된 유전자 교환벡터 pSacHR06ptsG 또는 pSacHR06sacC 각각을 혼합한 다음, 2.5 kV, 25 μF, 400 ohms의 조건으로 electroporation을 수행함으로써, 상기 유전자교환벡터들을 배양된 M. succiniciproducens에 각각 도입시켰다. 전기충격 후, LB-포도당 액체배지 1 mL을 가하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양액을 항생제 클로람페니콜(최종농도 6.8 ㎍/L)을 함유한 LB-포도당 고체배지에 도말하여, 37℃에서 48 시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니중에서, 이중 교차(double crossover)만 일어난 것을 골라내기 위하여, 이것을 클로람페니콜(최종농도 6.8 ㎍/L)를 함유한 LB-수크로스(100 g/L의 수크로스를 함유한 LB 배지) 배지에 스트리킹 (streaking)한 다음, 24 시간 후에 형성된 콜로니를 같은 플레이트에 다시 스트리킹 (streaking) 하였다.

상기 플레이트에서 형성된 콜로니(변이균주)를 항생제가 함유된 LB-포도당 액체배지에서 배양하고, 배양된 균주로부터 Rochelle 등의 방법(Rochelle et al., FEMS Microbiol. Lett., 100:59, 1992)을 응용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동함으로써 ptsG 및 sacC의 결실여부를 각각의 변이 균주에서 확인하였다.

MptsG 균주에서 ptsG의 결실여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 서열번호: 33과 34번 프라이머를 이용한 PCR 과 서열번호: 21와 22번 프라이머를 이용한 PCR을 통해 확인하였고, MsacC 균주에서 sacC의 결실여부를 확인하기 위해, 서열번호: 35와 36번 프라이머와, 서열번호: 37와 38번 프라이머를 이용한 PCR을 통해 확인하였다.

서열번호: 33: 5'-CGGGGCGAAAGTGATTGAGA

서열번호: 34: 5'-AATTGCCGCCTGGGTATTGG

서열번호: 35: 5'-ACCTTTACTACCGCACTGCTGG

서열번호: 36: 5'-GCGGGAGTCAGTGAACAGGTAC

서열번호: 37: 5'-GATCTTGAGTCCGTAAAACAGGCTT

서열번호: 38: 5'-TTCCGCTCAAGCCATTGTAGTG

2.3: MptsG 균주, MsacC 균주 및 모 균주 ( MBEL55E ) 간의 생장 비교

상기 실시예 2.2에서 만들어진 재조합 MptsG, MsacC 균주를 BHI (Bacto^TM Brain Heart Infusion; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) 배양배지에서 8시간 가량 배양한 후 10 ml을 300 ml MH5S 배양 배지 (liter 당: 2.5g of yeast extract, 2.5g of polypeptone, 1g of NaCl, 8.7g of K₂HPO₄,10g of NaHCO₃,0.02g of CaCl₂2H₂O,0.2g of MgCl₂6H₂O and 10g of sucrose)에 접종한 후, 같은 조건에서 배양한 이들의 모 균주인 MBEL55E의 생장곡선과 비교하였다. 도 3은 OD₆₀₀으로 측정한 MBEL55E (●), MptsG (▲), 및 MsacC (△) 균주의 생장곡선이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 모균주 (MBEL55E)가 가지고 있던 수크로오스 배지상에서의 성장능력이 각각의 유전자를 제거함으로서 거의 대부분 사라지는 것으로 나타났으며, 이는 각각의 유전자가 수크로오스 배지 상에서 생장하는데 필수적임을 의미한다.

한편, 프락토키나제 (RbsK, MS1233)를 코딩하는 rbsK 유전자의 경우에는 상기와 같은 동일한 실험을 수행하였으나, growth가 느려지는 등 성장의 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 효소활성 측정결과에서도 모균주와 rbsK 제거균주간에 큰 차이 없이, 둘 모두 일반적인 프락토키나제의 활성에 비해 매우 낮은 수준으로, 즉 값을 무시할 수 있을 정도의 활성이 측정되었다. 이러한 근거로, rbsK 유전자는 프락토키나제를 코딩하지 않거나 프락토키나제를 코딩하는 경우에도 매우 약한 활성을 가지는 것으로 추정된다.

2.4: MptsG 및 MsacC 균주와 모균주의 해당 효소 활성 비교

수크로오스 PTS의 활성 측정을 위해 Jacobson et al . (J. Biol . Chem ., 254:249, 1979)과 Lodge et al . (Infect. Immun., 56:2594, 1988)에 의한 방법을 도입하였다.

먼저, 세포를 permeabilize 시키기 위하여, OD₆₀₀ 값이 1.2 근방의 세포배양액 1 mL을 TDM 버퍼(50 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT; pH 7.5)에 세척한 후, 같은 버퍼 1 mL에 재현탁한 후 10 toluene을 가하고 45초간 강하게 agitation하였다. 12,000×g 에서 원심분리 하여 다시 모은 cell들을 TDM 버퍼에서 2회 세척하였다. 이러한 과정을 한 번 더 반복하여, 최종적으로 TDM buffer 50㎕ 에 재현탁 함으로서, permeabilized cell을 준비하였다. PEP-의존적 수크로오스 인산화는 총 반응부피 100㎕ 에 25 mM Tris/HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 5 mM MgCl₂, 10 mM KF, 1μCi [U-¹⁴C] sucrose 에 5㎕의 permeabilize시킨 상기 세포 현탁액을 더한 상태에서, 1 mM PEP을 포함시키는 것과 시키지 않은 것 두 가지 반응의 차이를 측정하여 이루어졌다. 상기의 혼합액은 37 ℃에서 10 분간 반응하였고, 1 mL의 차가운 물을 가함으로서 반응을 중지시켰다. 최종 반응물은 여과장치 상의 DEAE filter disk (Whatman, DE81)를 통과시키고, 10배 부피의 차가운 물을 가하여 세척한 후, 공지의 방법으로 Beckman LS6500 liquid scintilation counter (Beckman, Ramsey, MN)를 이용하여, radioactivity를 측정하였다. 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈의 활성은 Martin et al. (Appl. Environ. Microbiol., 53:2388, 1987)에 의한 방법에 약간의 수정을 가하여 측정하였다. OD₆₀₀값이 1 근방의 세포배양액 20 mL을 상기의 수크로오스 PTS 활성측정시와 같은 방법으로 permeabilize 시키고, 최종적으로 1 mL의 TDM 버퍼에 재현탁하여 준비하였다. 총반응물의 부피는 300㎕ 로 50 mM sodium-potassium phosphate 버퍼 (pH 7.2), 5 mM MgCl₂, 4 mM sucrose, 0.8 mM NADP, 6.4 U 의 glucose-6-phosphate dehydrolase, 그리고 30㎕ 의 permeabilized cell을 더한 상태에서, 10 mM PEP를 포함시킨 것과 포함시키지 않은 것 두 가지 반응의 차이를 측정하였다.

각각의 ptsG 및 sacC 유전자가 제거된 변이균주와 그 모균주와의 활성을 측정한 결과, 아래 표 2와 같은 결과를 얻을 수 있었고, 이 결과로 볼 때, MS0784(ptsG)가 코딩하는 수크로오스 PTS 효소가 PTS활성을 가짐을 의미하고, MS0909(sacC)가 코딩하는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 효소가 각각 세포내에서 해당 기능을 가지는 것임을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 수크로오스를 대사가능하게 하는 M. succiniciproducens MBEL55E 유래의 신규 수크로오스 대사관련 효소, 수크로오스 포스포트랜스퍼라제, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 및 프락토키나제를 수크로오스를 대사할 수 없는 미생물에 도입했을 때, 수크로오스가 섭취되고 분해되어 해당과정을 통해 대사되는 경로를 나타내는 모식도이다. 굵은 화살표 (→): 도입한 M. succiniciproducens MBEL55E 유래의 신규 수크로오스 대사관련 효소들에 의해 관장되는 대사경로들을 나타냄, 가는 화살표 (→): 재조합 미생물이 원래 가지고 있는 해당과정의 대사경로를 나타냄.

도 2는 수크로오스 포스포트랜스퍼라제, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 및 프락토키나제를 코딩하는 유전자들(ptsG, sacC, rbsK)을 함유하는 재조합 벡터 pMSscrIIA의 유전자 지도이다.

도 3은 모균주 MBEL55E, 재조합 MptsG, 재조합 MsacC 균주의 수크로오스 배지상에서의 성장을 나타낸 그래프이다 (●: MBEL55E, ▲: MptsG, 및 △:MsacC).

<110> KAIST <120> RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING AN ABILITY OF USING SUCROSE AS A CARBON SOURCE <150> KR10-2007-0133239 <151> 2007-12-18 <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 492 <212> PRT <213> PtsG <400> 1 Met Leu Val Leu Ala Arg Ile Gly Glu Asn Phe Cys Leu Ile Tyr Lys 1 5 10 15 Arg Gly Val Ala Met Asn Tyr Pro Lys Ile Ala Gln Gln Val Ile Glu 20 25 30 Lys Leu Gly Gly Lys Glu Asn Ile Ala Asn Leu Ala His Cys Ala Thr 35 40 45 Arg Leu Arg Leu Thr Met Asn Asp Glu Ser Lys Ile Asp Lys Gln Ala 50 55 60 Ile Glu Asp Ile Glu Gly Val Lys Gly Gln Phe Ser Thr Ser Gly Gln 65 70 75 80 Tyr Gln Ile Ile Phe Gly Ser Gly Thr Val Asn Lys Val Tyr Ala Glu 85 90 95 Met Asn Thr Ile Met Asn Gly Ser Pro Ser Ala Asp Ser Thr Gly Glu 100 105 110 Ser Gln Gln Ala Lys Gly Pro Gln Gln Gly Leu Ile Gln Arg Leu Ile 115 120 125 Lys Gly Leu Ala Asp Ile Phe Val Pro Ile Ile Pro Ala Ile Val Ala 130 135 140 Gly Gly Leu Leu Met Gly Ile Asn Asn Val Phe Thr Ala Lys Asp Leu 145 150 155 160 Phe Glu Glu Gly Arg Thr Leu Leu Asp Leu Tyr Pro Gln Tyr Lys Asp 165 170 175 Leu Ala Asp Leu Ile Asn Thr Phe Ala Asn Ala Pro Phe Val Phe Leu 180 185 190 Pro Val Leu Leu Gly Phe Ser Ala Thr Arg Lys Phe Gly Gly Asn Pro 195 200 205 Phe Leu Gly Ala Thr Leu Gly Met Leu Leu Val His Pro Ala Leu Thr 210 215 220 Asn Ala Tyr Gly Tyr Ala Glu Ala Leu Ala Gly Gly Asn Leu Gln Leu 225 230 235 240 Trp Asn Ile Phe Gly Leu Glu Ile Glu Lys Val Gly Tyr Gln Gly Thr 245 250 255 Val Ile Pro Val Leu Ile Ala Ala Trp Val Leu Ala Thr Leu Glu Lys 260 265 270 Phe Leu Val Lys Val Val Pro Ser Val Leu Asn Asn Leu Val Thr Pro 275 280 285 Leu Phe Ser Leu Phe Ile Thr Gly Phe Leu Ala Phe Thr Val Ile Gly 290 295 300 Pro Phe Gly Arg Glu Ala Gly Glu Phe Leu Ser Gln Gly Leu Thr Trp 305 310 315 320 Leu Tyr Asp Thr Leu Gly Phe Ile Gly Gly Gly Val Phe Gly Ala Leu 325 330 335 Tyr Ala Pro Ile Val Ile Thr Gly Met His Gln Thr Phe Ile Ala Ile 340 345 350 Glu Thr Gln Leu Leu Ala Ser Thr Ala Ala Thr Phe Ile Phe Pro Ile 355 360 365 Ala Ala Met Ser Asn Ile Ala Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Ala 370 375 380 Val Leu Asn Lys Asp Ala Lys Thr Arg Gly Leu Ala Leu Pro Ser Gly 385 390 395 400 Ile Ser Ala Leu Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Met Phe Gly Val Asn 405 410 415 Leu Arg Phe Arg Tyr Pro Phe Tyr Ala Ala Met Leu Gly Ala Gly Ser 420 425 430 Ala Ala Ala Phe Ile Ala Phe Phe Asn Val Lys Ala Thr Ala Leu Gly 435 440 445 Ala Ala Gly Leu Ile Gly Ile Ala Ser Ile Arg Ala Gly Asp Trp Gly 450 455 460 Met Tyr Ser Val Gly Met Val Ile Ser Phe Cys Val Ala Phe Ala Ala 465 470 475 480 Ala Leu Val Leu Gly Ala Arg Ala Asn Ala Lys Glu 485 490 <210> 2 <211> 1479 <212> DNA <213> ptsG <400> 2 ttgctcgttt tagctagaat tggcgaaaat ttttgcttaa tttataaacg aggagtcgct 60 atgaactacc ctaaaattgc ccaacaggtt atcgaaaaac ttggcggaaa agaaaatatc 120 gctaatcttg cgcattgtgc aacgcgtttg cgcttgacaa tgaatgacga aagtaaaatc 180 gacaaacagg ccattgaaga tatcgagggc gtaaaagggc agttttcaac ctccggtcaa 240 taccaaatta ttttcggttc aggtacggtg aataaagttt acgccgaaat gaataccatt 300 atgaacggtt cgccgtcggc ggattccacc ggggaaagtc aacaggcgaa agggccgcag 360 caaggtttga ttcaacgatt aattaaaggt ctggctgata ttttcgttcc cattattccg 420 gctattgtcg ccggcggttt gttaatgggg attaataatg tctttaccgc aaaagattta 480 ttcgaagaag ggaggacatt actcgacctt tatccgcaat acaaagattt agcggattta 540 attaatacct ttgctaacgc gccttttgtg tttctgcccg tattgttagg tttctcggca 600 accagaaaat tcggtggcaa tccgttctta ggagcgacat taggtatgtt gctcgttcac 660 cccgctttaa ccaatgctta cggttatgcg gaagcgttag ccggcggcaa tcttcaatta 720 tggaatattt tcgggctaga gattgaaaaa gtcggttatc aaggtacggt tattcccgtt 780 ttaattgccg cctgggtatt ggcgacttta gaaaaattct tagtgaaagt agtgccttcc 840 gtattaaata atttagtcac gccgttattt tcattattta tcaccggttt tttggctttc 900 accgtaatcg gacctttcgg tcgtgaagcg ggggaatttt taagtcaggg tttaacctgg 960 ttatatgata ctttaggttt tatcggcggc ggcgtgttcg gcgcattata cgcacctatc 1020 gtgattaccg gtatgcacca aacctttatc gccattgaaa cgcaattgct ggcaagcact 1080 gcggcaactt ttatcttccc gattgccgcc atgtcgaata ttgcgcaggg tgccgcttgt 1140 ttagccgttg ccgtgttaaa taaagatgcc aaaacccgag gtctggcgtt gccttccggt 1200 atttccgcat tattagggat taccgaacct gccatgttcg gggtgaattt gcgcttccgt 1260 tatccgttct atgcggctat gttaggtgcc ggttccgccg cggcgtttat cgcgttcttc 1320 aatgttaaag ccactgcgct tggcgcggcg ggcttaatcg gtatcgcatc aattcgtgcc 1380 ggcgactggg gaatgtattc cgtggggatg gtaatttcgt tttgtgtggc tttcgctgcg 1440 gcattagtgc tgggcgcaag agctaacgca aaagaatag 1479 <210> 3 <211> 502 <212> PRT <213> SacC <400> 3 Met Arg Ser Phe Leu Pro His Phe Ser Leu Phe Tyr Phe His Gln Gly 1 5 10 15 Ile Met Met Ile Ile Phe Asn Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Ile Leu Ala 20 25 30 Ala Glu Gln Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Ser Glu Val Glu Lys Asp 35 40 45 Arg Asp Phe Arg Pro Tyr Tyr His Leu Ala Pro Ser Thr Gly Leu Leu 50 55 60 Asn Asp Pro Asn Gly Leu Val Phe Asp Gly Glu Lys Phe His Leu Phe 65 70 75 80 Tyr Gln Trp Phe Pro Phe Asp Ala Ile His Gly Met Lys His Trp Lys 85 90 95 His Phe Thr Thr Glu Asp Phe His Ile Tyr Thr Glu Ala Asp Pro Leu 100 105 110 Ile Pro Cys Glu Leu Phe Glu Ser His Gly Cys Tyr Ser Gly Gly Ala 115 120 125 Leu Pro Val Gly Asp Lys Ile Ala Ala Phe Tyr Thr Gly Asn Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Ala Asp Asn Gln Arg Val Pro Phe Gln Asn Leu Ala Ile Phe 145 150 155 160 Asp Arg Thr Gly Lys Leu Leu Ser Lys Arg Pro Leu Ile Glu Asn Ala 165 170 175 Pro Lys Gly Tyr Thr Glu His Val Arg Asp Pro Lys Pro Tyr Phe Thr 180 185 190 Lys Glu Gly Lys Ile Arg Phe Ile Cys Gly Ala Gln Arg Glu Asp Leu 195 200 205 Thr Gly Thr Ala Ile Ile Phe Glu Met Asp Asn Leu Asp Asp Glu Pro 210 215 220 Arg Leu Leu Gly Glu Leu Ser Leu Pro Ala Phe Asp Asn Gln Lys Val 225 230 235 240 Phe Met Trp Glu Cys Pro Asp Leu Leu Lys Val Gly Asp Asn Asp Ile 245 250 255 Phe Ile Trp Ser Pro Gln Gly Lys Arg Arg Glu Ala Arg Arg Phe Gln 260 265 270 Asn Asn Phe His Ala Val Tyr Ala Val Gly Lys Leu Asp Asp Arg Thr 275 280 285 Phe Asn Ala Ala His Ile Ala Glu Leu Asp Gln Gly Phe Asp Phe Tyr 290 295 300 Ala Pro Gln Thr Phe Ala Gly Leu Glu Asn Gln Lys His Ala Val Met 305 310 315 320 Phe Gly Trp Cys Gly Met Pro Asp Leu Thr Tyr Pro Thr Asp Lys Tyr 325 330 335 Lys Trp His Ser Met Leu Thr Leu Pro Arg Glu Ile Thr Leu Gln Gly 340 345 350 Asn Arg Leu Val Gln Arg Pro Ile Lys Glu Ile Tyr Gln Asn Leu Thr 355 360 365 Ala Leu Ser Gln Ile Ser Leu Gln Gln Gln Ala Glu Ile Gln Asp Leu 370 375 380 Asp Arg Ala Tyr Ile Lys Phe Asp Ala Glu Asn Thr Ala Phe Asn Ile 385 390 395 400 Arg Phe Phe Ala Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Ser Leu Ser Tyr Asp 405 410 415 Gly Glu Leu Val Cys Leu Asp Arg Ser Gln Thr Glu Glu Thr Glu Trp 420 425 430 Met Lys Lys Phe Ala Ser Gln Arg Tyr Cys Glu Ile Lys Asn Leu Arg 435 440 445 Gln Val Glu Ile Phe Phe Asp Arg Ser Ile Ile Glu Ile Phe Leu Asn 450 455 460 Asp Gly Glu Lys Ala Leu Thr Ser Arg Phe Phe Ile Ala Asn Arg Gln 465 470 475 480 Asn Ser Val Lys Thr Asp Arg Thr Leu Arg Leu Asn Val Gly Tyr Pro 485 490 495 Lys Glu Ile Glu Tyr Lys 500 <210> 4 <211> 1509 <212> DNA <213> sacC <400> 4 gtgcggtcgt ttttaccgca cttttcttta ttttattttc accaaggtat aatgatgatt 60 atatttaata acggtaaata taaaagcatt ttggcggccg aacagggcga gcttgaacga 120 attaaaagcg aggtagaaaa agatcgggat tttcgcccct actaccatct cgcgccatct 180 acaggcttac taaacgatcc caacggtttg gtttttgacg gcgaaaaatt tcatctgttc 240 tatcaatggt tcccgtttga tgccattcac ggcatgaaac actggaagca tttcacgacc 300 gaggattttc atatctatac cgaagccgat ccgcttatcc cttgcgaact ttttgaaagt 360 cacggttgtt attccggcgg cgccttacca gtgggcgata aaatcgccgc attttatacc 420 ggtaacacaa gacgcgctgc ggataaccaa cgggttccct ttcaaaattt agcgattttt 480 gaccgcaccg gtaaacttct cagtaaacgc ccattaattg aaaatgcacc gaaaggctac 540 accgaacacg ttcgtgatcc gaaaccttac ttcacaaaag aaggaaaaat ccgttttatt 600 tgcggcgcac aacgtgaaga tttaaccggc accgccatta tttttgaaat ggataatctt 660 gatgatgagc cgcgcttatt aggcgaattg tctctccccg cttttgataa tcaaaaggtg 720 tttatgtggg aatgcccgga tttattgaaa gtcggcgata acgatatttt catctggtct 780 ccgcaaggca aacggcgcga agcccgccgg ttccaaaata attttcatgc ggtctatgcc 840 gtaggaaaat tggatgatcg gacatttaat gccgctcata ttgccgaact tgatcaaggt 900 ttcgatttct atgcgccgca aacttttgcc ggcctggaaa atcaaaagca tgccgttatg 960 ttcggttggt gcggtatgcc ggatttgacc tacccgacgg ataaatacaa atggcattca 1020 atgctgactc tcccgcggga aattacattg caaggcaata ggcttgttca gcgcccgata 1080 aaagaaattt atcaaaattt gaccgcactt tcgcaaattt ccctgcaaca gcaagcggaa 1140 attcaggatt tagatcgagc ctatattaaa tttgacgcgg aaaacacagc gtttaatatc 1200 cgcttttttg ccaacgaaca aggacaaacg ctctcgcttt cttatgacgg agaacttgtt 1260 tgtctggatc gttcgcaaac ggaagaaacg gaatggatga aaaaatttgc tagtcagcgt 1320 tattgtgaaa taaagaatct gcgacaagtg gaaattttct ttgaccgctc aattattgag 1380 attttcctga atgacggcga aaaagccctg acttcgagat tctttattgc gaaccgccaa 1440 aattccgtca aaaccgaccg cactttgcgg ttaaacgtcg gttatccgaa agaaattgaa 1500 tataaatag 1509 <210> 5 <211> 310 <212> PRT <213> RbsK <400> 5 Met His Met Thr Asn Lys Ile Trp Val Leu Gly Asp Ala Val Val Asp 1 5 10 15 Leu Ile Pro Asp Gly Asp Asn His Tyr Leu Arg Cys Ala Gly Gly Ala 20 25 30 Pro Ala Asn Val Ala Val Gly Val Ala Arg Leu Gly Val Pro Ser Ala 35 40 45 Phe Ile Gly Arg Val Gly Lys Asp Pro Leu Gly Glu Phe Met Arg Asp 50 55 60 Thr Leu Asn Gln Glu Asn Val Asn Thr Asp Tyr Met Leu Leu Asp Pro 65 70 75 80 Lys Gln Arg Thr Ser Thr Val Val Val Gly Leu Thr Asp Gly Glu Arg 85 90 95 Ser Phe Thr Phe Met Val Asn Pro Ser Ala Asp Gln Phe Leu Gln Ile 100 105 110 Ser Asp Leu Pro Gln Phe Gln Ala Gly Asp Trp Leu His Cys Cys Ser 115 120 125 Ile Ala Leu Ile Asn Glu Pro Thr Arg Ser Ala Thr Phe Thr Ala Met 130 135 140 Lys Asn Ile Arg Ala Ala Gly Gly Lys Val Ser Phe Asp Pro Asn Leu 145 150 155 160 Arg Glu Ser Leu Trp Lys Ser Gln Asp Glu Met Ile Asp Val Val Met 165 170 175 Glu Ala Val Ser Leu Ala Asp Val Leu Lys Phe Ser Glu Glu Glu Leu 180 185 190 Thr Leu Leu Thr His Thr Asp Ser Leu Glu Lys Ser Phe Glu Lys Ile 195 200 205 Thr Ala Leu Tyr Pro Asp Lys Leu Ile Ile Val Thr Leu Gly Lys Glu 210 215 220 Gly Ala Leu Tyr His Leu His Gly Lys Lys Glu Val Val Ala Gly Lys 225 230 235 240 Ala Leu Lys Pro Val Asp Thr Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Ser 245 250 255 Gly Leu Leu Ala Gly Leu Ser Gln Thr Glu Asn Trp Gln Gln Pro Glu 260 265 270 Gln Leu Val Thr Ile Ile Arg Gln Ala Asn Ala Ser Gly Ala Leu Ala 275 280 285 Thr Thr Ala Lys Gly Ala Met Ser Ala Leu Pro Asn Gln Gln Gln Leu 290 295 300 Ala Glu Phe Leu Ala Asn 305 310 <210> 6 <211> 933 <212> DNA <213> rbsK <400> 6 atgcatatga caaacaaaat ttgggtatta ggcgatgccg tggtggattt aattcctgac 60 ggagacaacc attatttgcg ttgcgcaggc ggcgcaccgg ctaatgtggc ggtcggcgtt 120 gcccgtttag gtgtgcctag cgcatttatc ggccgtgtag gtaaagatcc gttaggggaa 180 tttatgcgcg atacgctgaa tcaggaaaat gtaaacaccg attatatgtt gttagatcct 240 aaacaacgta cttcgacggt ggtggttgga ttaactgacg gcgaacgtag ttttaccttt 300 atggtgaatc caagtgcgga tcaattttta caaatttccg atctgccgca atttcaagcc 360 ggagactggt tgcactgctg ctctatcgcc ttaatcaatg aaccgacccg cagcgctact 420 ttcacggcaa tgaaaaatat ccgtgcggcc ggcggtaaag tatctttcga tccgaattta 480 cgcgaaagct tatggaaatc ccaggatgaa atgatcgatg tggtgatgga agcggtaagc 540 cttgccgacg tattgaaatt ttcagaagaa gaattaacgc tgttaaccca taccgacagc 600 ctggaaaaat cttttgaaaa aatcaccgca ctttatcccg ataaattgat tattgtcact 660 ttagggaaag aaggtgcgct ctatcatctg cacggtaaaa aagaggtggt tgcagggaaa 720 gcgctgaaac cggtagatac caccggggcc ggcgacgctt ttgtcagcgg gttattagcc 780 ggattatcac aaacggaaaa ctggcagcaa cctgaacaac tcgttactat tattcgccag 840 gccaacgcca gcggcgcgct tgccacaacg gcaaaaggcg ctatgtcggc attaccgaat 900 cagcaacaat tagcggaatt tttagcaaac taa 933 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 7 ggaattcatg ctcgttttag ctagaattgg 30 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 8 tccgagctct tactattctt ttgcgttagc tcttg 35 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> primer <400> 9 acctgcgagc tctttcacac aggaaacaat tttcatgcgg tcgtttttac cg 52 <210> 10 <211> 75 <212> DNA <213> primer <400> 10 caaattttgt ttgtcatatg catgaaatct gtttcctgtg tgaaattact atttatattc 60 aatttctttc ggata 75 <210> 11 <211> 75 <212> DNA <213> primer <400> 11 tatccgaaag aaattgaata taaatagtaa tttcacacag gaaacagatt tcatgcatat 60 gacaaacaaa atttg 75 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> primer <400> 12 acctgcgggt accctattag tttgctaaaa attccgct 38 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 13 ggaaacagac 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Claims

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박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 수크로오스 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(ptsG) 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자(sacC)를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물.
박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포의 염색체 DNA에 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 수크로오스 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(ptsG) 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자(sacC)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물.
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제7항 또는 제8항의 재조합 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물의 제조방법.
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