KR101794384B1

KR101794384B1 - 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 제조 방법

Info

Publication number: KR101794384B1
Application number: KR1020137002898A
Authority: KR
Inventors: 필립 소실리; 세드릭 부와사르
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2010-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2017-11-06
Also published as: CN103097514A; PT2591091E; KR20130041166A; BR112013000237A2; TW201213545A; CA2803070A1; US20130309737A1; TWI500768B; JP2013529924A; AR082114A1; US8900838B2; WO2012004247A1; JP5420798B2; EP2591091B1; BR112013000237B1; CA2803070C; CN103097514B; ES2490968T3; EP2591091A1

Abstract

본 발명은
- 4-히드록시-2-케토부티레이트를 2-케토산 데카르복실라제 활성을 갖는 효소로 탈카르복실화시키는 제1 단계, 및 수득한 3-히드록시프로피온알데히드를 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 갖는 효소로 환원시키는 제2 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산을 위한 2-단계 대사 경로, 및
- 미생물이 단일 탄소원으로 수크로스를 이용할 수 있도록 하는 유전자
를 포함하는, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 생물생산을 위해 유전자 변형된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 유전자 변형된 미생물을 배양하는 것 (여기서 배양은 수크로스의 공급원을 포함하는 적절한 배지에서 수행함), 및 생산되는 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 포함하는, 발효에 의한 1,3-프로판디올의 생물학적 제조를 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 수크로스의 공급원은 식물 바이오매스로부터 수득된다.

Description

수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 제조 방법 {METHOD FOR THE PREPARATION OF 1,3-PROPANEDIOL FROM SUCROSE}

본 발명은 1,3-프로판디올의 생물생산을 위해 유전자 변형된 미생물을 배양하는 것을 포함하며, 여기서 미생물은 탈카르복실화의 제1 단계 및 환원의 제2 단계를 포함하는 4-히드록시-2-케토부티레이트로부터의 1,3-프로판디올의 생산을 위한 2-단계 대사 경로를 포함하고, 단일 탄소원으로 수크로스를 이용할 수 있도록 변형된 것인, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 생물학적 제조를 위한 새로운 방법에 관한 것이다.

1,3-프로판디올을 생산하는 미생물의 배양에 의한 1,3-프로판디올의 발효적 생산은 당업계에 공지되어 있다. 비타민 B12-의존성 효소가 관련된 1,3-프로판디올의 생산 방법은 이미 기재되어 있으며, 이러한 방법은 생산 공정에 높은 비용이 들도록 한다.

탄소의 재생가능한 공급원으로부터 비타민 B12-비의존성 경로로 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 대안적 해결책이 계속 요구되고 있다. 또한, 이러한 생산에 필요한 에너지를 기반으로 생산될 산물의 전체적인 수율의 개선이 계속 요구되고 있다. 마지막으로, 산물의 단리 및 그의 마케팅 및 추가의 사용을 위한 불순물 및 부산물의 수준의 제어가 계속 요구되고 있다.

1,3-프로판디올은 주로 글리세롤 (특허 출원 PCT/EP2010/056078 참조)로부터 및 중간체 글리세롤을 통해 글루코스로부터 생산된다. 전세계 글리세롤 원액이 제한적이기 때문에, 다른 탄수화물 공급원을 찾을 필요가 있다.

발효 배지에 사용되는 탄소원은 일반적으로 대부분 식물로부터 유래된 탄수화물에 있다. 전분은 식물에서 가장 풍부한 저장 탄수화물이다.

생물공학적으로 생산된 범용 화학제품의 가격이 주로 원료의 가격 (즉, 발효 기질의 가격)과 관련되기 때문에, 정제당의 사용은 산업적 규모 생산을 위해 경제적으로 지속가능한 선택이 아니다. 높은 함량의 발효가능한 당을 유지하는 덜 비싼 기질이 요구된다. 이러한 점에서, 당 산업에서 나오는 수크로스는 우수한 선택에 해당한다.

수크로스는 당료 식물, 예컨대 사탕무, 사탕수수, 단수수, 사탕 단풍나무, 사탕 야자 또는 블루 아가베로부터 수득한다. 당 공정으로부터의 중간체, 산물 또는 부산물을 함유하는 다양한 수크로스 (원액즙, 묽은 또는 맑은 액즙, 진한 액즙, 수크로스 시럽, 순수 수크로스, 당밀)는 발효 공급원료로 사용될 수 있다.

미생물에서 수크로스의 흡수 및 이용을 위한 2가지 상이한 시스템이 특성화되었다.

첫번째 시스템은 수크로스가 공여자로서 포스포에놀피루베이트 (PEP)를 사용하여 흡수 및 인산화되어 세포내 수크로스-6-포스페이트를 생성하는 포스포에놀피루베이트 (PEP)-의존성 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템 (수크로스 PTS)을 기반으로 한다. 이어서, 수크로스-6-포스페이트는 인버타제에 의해 D-글루코스-6-포스페이트 및 D-프룩토스로 가수분해된다. D-프룩토스는 ATP-의존성 프룩토키나제에 의해 D-프룩토스-6-포스페이트로 추가로 인산화되고, 이어서 중앙 대사에 진입할 수 있다. 이러한 시스템은 여러 박테리아 종, 그람-양성 뿐만 아니라 그람-음성 종에서 설명되었다. 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 패밀리 중에서, 야생형 클레브시엘라(Klebsiella) 균주의 90% 초과, 에스케리키아(Escherichia) 균주의 50% 미만 및 살모넬라(Salmonella) 균주의 10% 미만이 수크로스 양성이다.

수크로스 PTS를 코딩하는 유전자 scrKYABR을 보유하는 접합성 플라스미드 pUR400은 살모넬라로부터 단리되었다 (문헌 [Schmid et al., 1982, Schmid et al., 1988]).

"비-PTS 시스템"으로 지칭되는 두번째 시스템은 이. 콜라이(E. coli) EC3132에서 보다 최근에 발견되었다 (문헌 [Bockmann et al., 1992]). 이 시스템에는 수크로스:양성자 공동수송 수송 시스템 (CscB), 프룩토키나제 (CscK), 인버타제 (CscA) 및 수크로스-특이적 리프레서 (CscR)를 코딩하는 유전자 cscBKAR가 관련된다.

에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K12 및 그의 유도체는 수크로스를 이용할 수 없다. 그러나, 이러한 능력은 2가지의 상기 기재된 시스템을 코딩하는 유전자의 전달에 의해 부여될 수 있다. 이는 이. 콜라이 K12에서 플라스미드 pUR400 (문헌 [Schmid et al., 1982]) 또는 이. 콜라이의 수크로스 음성 균주에서 cscBKAR 유전자를 보유하는 다양한 플라스미드 (pKJL101-1 포함) (문헌 [Jahreis et al., 2002])를 전달하여 입증되었다. 산업상 적용과 관련하여, 수크로스로부터의 트립토판 생산은 이. 콜라이 K12에서 입증되었고 (문헌 [Tsunekawa et al., 1992]), 수소 생산은 pUR400 플라스미드를 운반하는 이. 콜라이에서 나타났으며 (문헌 [Penfold and Macaskie, 2004]), 양쪽 시스템 PTS 및 비-PTS의 전달에 의한 다양한 아미노산의 생산은 특허 출원 EP1149911에서 보고되었다.

놀랍게도, 수크로스를 이용할 수 없는 이. 콜라이 균주에서 수크로스를 이용할 수 있도록 하는 유전자 변형, 및 1,3-프로판디올을 위한 특정 생합성 경로를 조합함으로써, 본 발명의 발명자들은 탄소의 재생가능한 공급원, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올 생산의 수율을 개선시킬 수 있었다.

발명의 일반적 설명

본 발명은

- 4-히드록시-2-케토부티레이트를 2-케토산 데카르복실라제 활성을 갖는 효소로 탈카르복실화시키는 제1 단계, 및 수득한 3-히드록시프로피온알데히드를 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 갖는 효소로 환원시키는 제2 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산을 위한 2-단계 대사 경로, 및

- 미생물이 단일 탄소원으로 수크로스를 이용할 수 있도록 하는 유전자

를 포함하는, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 생물생산을 위해 유전자 변형된 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 미생물은 2-케토산 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 및 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나의 유전자를 함유한다. 이러한 유전자는 외인성 또는 내인성일 수 있고, 염색체 또는 염색체외적으로 발현될 수 있다.

본 발명에 따른 미생물은 또한 단일 탄소원으로 수크로스를 이용할 수 있도록 유전자 변형된다.

발명의 상세한 설명

본원에 사용된 바와 같이 하기 용어는 특허청구범위 및 명세서의 해석에 사용될 수 있다.

용어 '수크로스'는 분자식 C₁₂H₂₂O₁₁을 갖는, α(1,2) 글리코시드 결합에 의해 연결된 글루코스 및 프룩토스의 디사카라이드를 지칭한다. 그의 계통 명칭은 α-D-글루코피라노실- (1↔2)-β-D-프룩토푸라노시드이다.

용어 "유전자 변형 미생물"은 본 발명의 미생물이 자연에서 발견되지 않고, 새로운 유전자 요소의 도입 또는 결실에 의해 변형된 것임을 의미한다. 이는 또한 지시된 돌연변이유발 및 특정 선택 압력 하의 진화의 조합에서 새로운 대사 경로의 개발 및 진화를 수행함으로써 형질전환될 수 있다 (예를 들어, WO 2004/076659 참조).

미생물은 외인성 유전자가 숙주 미생물에서 그의 발현을 허용하는 모든 요소와 함께 미생물에 도입된다면 이러한 유전자를 발현할 수 있다. 외인성 DNA로 미생물을 형질전환시키는 것은 당업자에게 일상적인 작업이다.

외인성 유전자는 숙주 게놈에 통합될 수 있거나, 플라스미드 또는 벡터에 의해 염색체외적으로 발현될 수 있다. 다양한 유형의 플라스미드는 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 그의 복제 기점 및 세포 내에서의 그의 복제수에서 상이하다.

구체적 실시양태에서, 내인성 유전자는 또한 코딩 서열에 돌연변이를 도입하여 유전자 산물을 변형시키거나 또는 내인성 조절 요소에 더하여 또는 그 대신에 이종 서열을 도입하여 그의 발현 및/또는 활성을 조정하도록 변형될 수 있다. 내인성 유전자의 조정은 두 방식으로 진행될 수 있다: 한편으로는 유전자 산물의 활성의 상향조절 및/또는 증진, 또는 다른 한편으로는 내인성 유전자 산물의 활성의 하향조절 및/또는 저하.

유전자의 발현을 제어하는데 중요한 요소는 프로모터이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자는 유도가능할 수 있는 상이한 강도를 갖는 프로모터를 이용하여 발현될 수 있다. 이러한 프로모터는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 당업자는 가장 편리한 프로모터를 선택하는 방법을 알고 있으며, 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac 또는 람다 프로모터 cI가 널리 사용된다.

본 발명에 따르면, '2-케토산 데카르복실라제 활성을 갖는 효소'는 그의 기질이 2-케토산인, 데카르복실라제 활성을 갖는 효소를 지칭한다. 2-케토산 데카르복실라제 활성을 코딩하는 유전자, 예를 들어 다양한 종으로부터의 Pdc 유전자, 보다 특히 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 Pdc1, Pdc5, Pdc6, Aro10 및 Thi3 유전자, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 kivD 유전자; 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 pdc 유전자; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 Pdc2 및 Pdc3 유전자; 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)로부터의 Pdc1, Pdc2 및 Aro10 유전자; 및 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터의 pdc 유전자가 당업계에 널리 공지되어 있다. 에스케리키아 콜라이의 유전자 dxs에 의해 코딩되는 효소 뿐만 아니라 에스케리키아 콜라이로부터의 유전자 sucA에 의해 코딩되는 2-케토글루타레이트 데카르복실라제 복합체의 제1 서브유닛은 또한 2-케토산 데카르복실라제 활성을 보유한다. 상기 유전자 및 단백질의 기능적 상동체, 기능적 변이체 및 기능적 단편이 정의에 포함된다.

본 발명에 따르면, '히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 갖는 효소'는 그의 기질이 히드록시 알데히드인, 리덕타제 활성을 갖는 효소를 지칭한다. 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 코딩하는 유전자, 예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터의 yqhD, fucO, dkgA, dkgB 유전자 및 사카로미세스 세레비지아에로부터의 ADH1 및 ADH2 유전자가 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 유전자 및 단백질의 기능적 상동체, 기능적 변이체 및 기능적 단편이 정의에 포함된다.

용어 '단일 탄소원으로서 수크로스를 이용하는 것'은 미생물이 유일한 탄소원으로서 수크로스를 함유하는 배지에서 성장할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 본 발명에 따른 1,3-프로판디올의 생산 방법에서 배양 배지의 수크로스 공급원은 수크로스 뿐만 아니라 추가의 탄소원, 예컨대 헥소스 (예컨대, 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 모노사카라이드, 디사카라이드 (예컨대, 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 올리고사카라이드, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 그의 조합을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 구체적 실시양태에서, 미생물은 PTS 수크로스 이용 시스템 및/또는 비-PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함한다.

PTS 수크로스 이용 시스템은 포스포에놀피루베이트 (PEP)-의존성 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템 (수크로스-PTS)에 의한 수크로스의 수송을 기반으로 하는 수크로스 이용을 위한 시스템이다. 포스포트랜스퍼라제 시스템은 당 (예를 들어, 수크로스 또는 글루코스)의 수송을 포스페이트 공여자로서 PEP를 사용하여 당의 인산화와 커플링시킨다. 세포로의 수송 후에, 수크로스-포스페이트는 인버타제에 의해 글루코스-6-포스페이트 및 프룩토스로 절단된다. 이어서, 프룩토스는 프룩토키나제에 의해 프룩토스-6-포스페이트로 인산화된다. 이러한 PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 유전자는 조절 단백질에 의해 제어될 수 있다.

비-PTS 수크로스 이용 시스템은 포스포에놀피루베이트에 비의존성인 시스템에 의한 수크로스의 수송을 기반으로 하는 수크로스 이용을 위한 시스템이다. 세포로의 수송 후에, 수크로스는 인버타제에 의해 글루코스 및 프룩토스로 절단된다. 이어서, 프룩토스는 프룩토키나제에 의해 프룩토스-6-포스페이트로 인산화되고, 글루코스는 글루코키나제에 의해 글루코스-6-포스페이트로 인산화된다. 이러한 비-PTS 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 유전자는 조절 단백질에 의해 제어될 수 있다.

본 발명의 구체적 측면에서, 미생물은 하기 유전자를 자연적으로 발현하거나 또는 하기 유전자의 도입으로 변형된다: 살모넬라로부터의 scrKYABR (프룩토키나제를 코딩하는 scrK, 포린을 코딩하는 scrY, 단백질 IIBC를 코딩하는 scrA, 수크로스-6-P 인버타제를 코딩하는 scrB, 리프레서를 코딩하는 scrR). 상기 유전자 scrKYABR을 보유하는 접합성 플라스미드 pUR400을 사용하여 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 이러한 유전자는 조합하여 모두 함께 사용될 수 있거나 또는 이러한 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 특히, 유전자 scrR은 생략될 수 있다.

또 다른 본 발명의 구체적 측면에서, 미생물은 이. 콜라이 EC3132로부터의 유전자, 즉 수크로스:양성자 공동수송 수송 시스템 (cscB), 프룩토키나제 (cscK), 인버타제 (cscA) 및 수크로스-특이적 리프레서 (cscR)를 코딩하는 유전자 cscBKAR을 자연적으로 발현하거나 또는 상기 유전자의 도입으로 변형된다. 이러한 유전자는 조합하여 모두 함께 사용될 수 있거나 또는 이러한 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 특히, 유전자 cscR은 생략될 수 있다. 다른 유기체로부터의 상동 유전자가 또한 사용될 수 있다.

이러한 유전자의 명칭은 본 발명에 따른 보다 일반적인 의미를 갖고, 다른 미생물 내의 상응하는 유전자를 포함한다. 살모넬라 또는 이. 콜라이로부터의 유전자의 진뱅크 참조번호를 사용하여, 당업자는 살모넬라 또는 이. 콜라이 이외의 유기체 내의 등가 유전자를 결정할 수 있다.

상동 서열과 그의 상동성 백분율의 확인 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 특히 웹사이트 상에서 지시된 디폴트 파라미터로 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 사용될 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 수득한 서열은 이러한 웹사이트 상에서 지시된 디폴트 파라미터로 예를 들어 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)을 사용하여 이용(정렬)될 수 있다.

PFAM 데이터베이스 (정렬 및 은닉 마르코브 모델(hidden Markov model)의 단백질 패밀리 데이터베이스 http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)는 단백질 서열의 정렬의 큰 집합이다. 각각의 PFAM은 다중 정렬의 시각화, 단백질 도메인의 검증, 유기체 중에서의 분포의 평가, 다른 데이터베이스에 대한 접근의 획득 및 공지된 단백질 구조의 시각화를 가능하게 한다.

COG (단백질의 이종상동 군의 클러스터 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 14개의 주요 계통발생 라인을 나타내는 66개의 완전하게 서열분석된 단세포 게놈으로부터 유래된 단백질 서열을 비교하여 수득한다. 각각의 COG는 적어도 3가지 라인으로부터 정의되고, 이는 고대의 보존된 도메인의 확인을 가능하게 한다.

박테리아 균주에 DNA를 도입하기 위한 여러 기술이 현재 당업자에 의해 사용된다. 바람직한 기술은 당업자에게 널리 공지된 전기천공이다.

본 발명의 구체적 실시양태에 따르면, 미생물은 2-케토산 데카르복실라제 활성을 코딩하는 내인성 유전자를 포함한다. 상기 미생물은 바람직하게는 사카로미세스 세레비지아에 (유전자 Pdc1, Pdc5, Pdc6, Aro10, Thi3 포함); 락토코쿠스 락티스 (Kivd); 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Pdc); 피키아 스티피티스 (Pdc1, Pdc2, Aro10); 지모모나스 모빌리스 (Pdc); 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 2-케토산 데카르복실라제를 코딩하는 내인성 유전자의 발현은 상기 미생물에서 증진된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 미생물은 2-케토산 데카르복실라제를 코딩하는 내인성 유전자를 포함하지 않는다. 내인성 2-케토산 데카르복실라제가 결핍된 이러한 미생물은 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 선택된다. 이러한 미생물의 경우, 본 발명의 미생물은 2-케토산 데카르복실라제를 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 2-케토산 데카르복실라제 활성을 코딩하는 유전자는 다양한 종으로부터의 Pdc 유전자, 보다 특히 사카로미세스 세레비지아에로부터의 Pdc1, Pdc5, Pdc6, Aro10 및 Thi3 유전자, 락토코쿠스 락티스로부터의 kivD 유전자; 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 pdc 유전자; 아라비돕시스 탈리아나로부터의 Pdc2 및 Pdc3 유전자; 피키아 스티피티스로부터의 Pdc1, Pdc2 및 Aro10 유전자; 및 지모모나스 모빌리스로부터의 pdc 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이의 유전자 dxs에 의해 코딩되는 효소 뿐만 아니라, 에스케리키아 콜라이로부터 유전자 sucA에 의해 코딩되는 2-케토글루타레이트 데카르복실라제 복합체의 제1 서브유닛이 또한 2-케토산 데카르복실라제 활성을 보유한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 미생물은 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 코딩하는 내인성 유전자를 포함한다. 이는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 (yqhD, fucO, dkgA, dkgB); 사카로미세스 세레비지아에 (ADH1, ADH2); 및 알데히드 리덕타제 활성 또는 알콜 데히드로게나제 활성을 갖는 적어도 하나의 효소를 갖는 모든 유기체로부터 선택된다. 내인성 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 갖는 이러한 미생물은 추가로 히드록시 알데히드 리덕타제를 코딩하는 내인성 유전자의 발현을 증진시키도록 변형될 수 있다.

구체적 실시양태에서, 미생물은 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 코딩하는 유전자는 에스케리키아 콜라이로부터의 yqhD, fucO, dkgA, dkgB 유전자 및 사카로미세스 세레비지아에로부터의 ADH1 및 ADH2 유전자를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 미생물은 수크로스로부터의 4-히드록시-2-케토부티레이트의 개선된 생산을 위해 유전자 변형된다. 이러한 결과는 호모세린 트랜스아미나제 또는 호모세린 옥시다제의 발현을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 효소는 L-호모세린 (L-아스파르테이트로부터 수득됨)의 4-히드록시-2-케토부티레이트로의 전환을 허용한다. 호모세린 옥시다제의 발현을 증가시키는 것은 알. 오파쿠스(R. opacus)로부터의 L-아미노산 옥시다제를 코딩하는 유전자를 도입하고 과다발현시키거나 또는 상응하는 단백질의 활성을 증가시키는 돌연변이를 유전자에 도입함으로써 달성될 수 있다. 호모세린 트랜스아미나제의 발현 수준을 증가시키는 것은 이. 콜라이의 serC 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입하거나, 세포 내에서의 복제수를 증가시키거나 또는 상응하는 단백질의 활성을 증가시키는 돌연변이를 serC 유전자에 도입함으로써 달성될 수 있다.

1,3-프로판디올의 전체적 생합성 경로는 도 1에 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 미생물은 옥살로아세테이트 생합성 경로에 자극된 흐름을 제공하고, 이러한 결과는 ppc 유전자에 의해 코딩되는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제의 발현 수준을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 포스포에놀피루베이트 카르복실라제의 발현 수준을 증가시키는 것은 ppc 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입하거나, 세포 내에서의 복제수를 증가시키거나 또는 상응하는 단백질의 활성을 증가시키는 돌연변이를 ppc 유전자에 도입함으로써 달성될 수 있다. 옥살로아세테이트 풀의 증가는 또한 리조비움 에틀리(Rhizobium etli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰의 pyc 유전자에 의해 코딩되는 외인성 피루베이트 카르복실라제의 발현 수준을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 피루베이트 카르복실라제의 발현 수준을 증가시키는 것은 이러한 유전자를 염색체 또는 염색체외적으로 과다발현시킴으로써 달성될 수 있다. 구체적으로 혐기성 조건에서, 옥살로아세테이트 풀의 증가는 또한 pckA 유전자에 의해 코딩되는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 발현 수준을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 피루베이트 카르복실라제의 발현 수준을 증가시키는 것은 pckA 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입하거나, 세포 내에서의 복제수를 증가시키거나 또는 상응하는 단백질의 활성을 증가시키는 돌연변이를 pckA 유전자에 도입함으로써 달성될 수 있다. 중간체 산물 옥살로아세테이트의 이용가능성은 또한 각각 pckA 및/또는 sfcA 또는 maeB 유전자에 의해 코딩되는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 및/또는 말산 효소를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 감쇠시킴으로써 증가될 수 있다. 이는 이러한 유전자의 야생형 프로모터를 보다 낮은 강도의 프로모터로 대체하거나 또는 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소를 사용하여 대체함으로써 수행될 수 있다. 필요에 따라, 유전자의 완전한 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열의 결실에 의해 달성될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 미생물은 호모세린 생합성 경로에 자극된 흐름을 제공한다. 이는 각각 thrA / metL 및 asd 유전자에 의해 코딩되는 아스파르토키나제 및 호모세린 데히드로제나아제 및/또는 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로제나아제의 발현을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파르토키나제 및 호모세린 데히드로제나아제 및/또는 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로제나아제의 발현을 증가시키는 것은 thrA / metL 및/또는 asd 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입하거나, 세포 내에서의 복제수를 증가시키거나 또는 상응하는 단백질의 활성을 증가시키는 돌연변이를 thrA 및/또는 asd 유전자에 도입함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, 피드백 억제제 트레오닌 (피드백 탈감각화된 대립유전자)에 대한 민감도를 감소시키고, 이에 따라 트레오닌의 존재 하에 증가된 활성을 허용하는 돌연변이가 thrA 유전자에 도입될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 미생물은 1,3-프로판디올보다 다른 화합물로의 감쇠된 수준의 호모세린 전환을 제공하도록 변형된다. 이러한 결과는 (thrB 및 thrC에 의해 코딩되는) 호모세린 키나제 및 트레오닌 신타제, (metA에 의해 코딩되는) 호모세린 O-트랜스숙시닐라제와 같은 호모세린 소비성 효소의 수준을 감쇠시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 유전자는 천연 프로모터를 보다 약한 프로모터 또는 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소로 대체함으로써 감쇠될 수 있다. 필요에 따라, 유전자의 완전한 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열의 결실에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 박테리아는 3-히드록시프로피오네이트보다 다른 화합물로의 감쇠된 수준의 호모세린 전구체 전환을 제공하도록 변형되고; 이러한 결과는 (dapA에 의해 코딩되는) 디히드로디피콜리네이트 신타제의 수준을 감쇠시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 유전자의 감쇠는 천연 프로모터를 보다 낮은 강도의 프로모터 또는 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소로 대체함으로써 수행될 수 있다. 필요에 따라, 유전자의 완전한 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열의 결실에 의해 달성될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 이러한 특정한 실시양태에서 사용되는 박테리아에 관한 것이다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 미생물은 1,3-프로판디올 이외의 다른 화합물로의 감쇠된 수준의 3-히드록시프로피온알데히드 전환을 제공하도록 변형된다. 이는 (aldA, aldB, aldH에 의해 코딩되는) 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로제나아제와 같은 3-히드록시프로피온알데히드 소비성 효소의 수준을 감쇠시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 유전자는 천연 프로모터를 보다 약한 프로모터 또는 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 탈안정화시키는 요소로 대체함으로써 감쇠될 수 있다. 필요에 따라, 이러한 유전자의 완전한 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열의 결실에 의해 달성될 수 있다.

미생물을 형질전환시키는 모든 기술, 및 본 발명의 단백질의 생산을 증진시키는데 사용되는 조절 요소는 당업계에 공지되어 있고, 다양한 미생물에서 생합성 경로의 변형에 대한 출원인 소유의 특허 출원, 예를 들어 WO 2008/052973, WO 2008/052595, WO 2008/040387, WO 2007/144346, WO 2007/141316, WO 2007/077041, WO 2007/017710, WO 2006/082254, WO 2006/082252, WO 2005/111202, WO 2005/073364, WO 2005/047498, WO 2004/076659 (그의 내용이 본원에 참고로 포함됨)를 포함하는 문헌에서 이용가능하다.

이전에 기재된 바와 같이, 이러한 유전자의 명칭은 본 발명에 따른 보다 일반적 의미를 갖고, 다른 미생물 내의 상응하는 유전자를 포함한다.

본 발명에 따르면, 용어 "미생물"은 박테리아, 효모 또는 진균을 지칭한다. 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에, 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로부터 선택된다. 보다 우선적으로, 미생물은 에스케리키아, 클로스트리디움, 바실루스, 클레브시엘라, 판토에아(Pantoea), 살모넬라 또는 코리네박테리움의 종이다. 보다 더 우선적으로, 미생물은 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 또는 바실루스 서브틸리스 종이다.

본 발명은 또한

- 수크로스를 포함하는 적절한 배양 배지 상에서 본 발명에 따른 미생물을 배양하는 단계, 및

- 배양 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계

를 포함하는, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 발효적 생산을 위한 방법에 관한 것이다.

발효는 일반적으로 수크로스 및 필요에 따라 보조기질을 함유하는, 미생물에 적합한 적절한 배양 배지를 갖는 발효기에서 수행한다.

'적절한 배양 배지'는 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양소, 예컨대 탄소원 또는 탄소 기질, 질소원, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어 일인산칼륨 또는 이인산칼륨; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망가니즈 염; 뿐만 아니라 성장 인자, 예컨대 아미노산, 비타민, 성장 프로모터 등을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 지칭한다.

이. 콜라이에 대해 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)]에 정의된 바와 같은 배지와 동일한 또는 유사한 조성일 수 있다.

발효 공정을 위한 배양 조건은 당업자에 의해 용이하게 정의될 수 있다. 특히, 박테리아는 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효되고, 바람직하게는 클로스트리디아세아에는 약 35℃에서, 엔테로박테리아세아에는 약 37℃에서 발효된다.

본 발명에 따르면 용어 '배양하는', '배양', '성장' 및 '발효'는 단순한 탄소원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 박테리아의 성장을 나타내기 위해 교환가능하게 사용된다. 발효는 호기성, 미세호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행될 수 있는 고전적 과정이다.

'호기성 조건'은 산소가, 기체를 액체 상 안으로 용해시킴으로써 배양물에 제공되는 것을 의미한다. 이는 헤드 스페이스에 함유된 산소를 액체 상으로 전달하기 위해 (1) 기체 (예를 들어, 공기)를 함유하는 산소를 액체 상에 살포하거나 또는 (2) 배양 배지를 함유하는 용기를 진탕시켜 달성될 수 있다. 혐기성 조건 대신에 호기성 조건 하의 발효의 이점은 전자 수용자로서의 산소의 존재가 세포 과정을 위한 ATP의 형태로 보다 많은 에너지를 생산하는 균주의 능력을 개선시킨다는 것이다. 따라서 균주는 그의 일반적 대사가 개선된다.

미세-호기성 조건은 낮은 백분율의 산소 (예를 들어, 0.1 내지 10％의 산소 (질소와 함께 100％가 완성됨)를 함유하는 기체의 혼합물이 사용됨)가 액체 상으로 용해된 배양 조건으로 정의된다.

혐기성 조건은 배양 배지에 산소가 제공되지 않은 배양 조건으로 정의된다. 절대 혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지에 살포하여 미량의 다른 기체를 제거함으로써 달성된다. 균주에 의한 ATP 생산을 개선하고 그의 대사를 개선하기 위해 니트레이트가 전자 수용자로 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적 측면에서, 수크로스는 바이오매스, 특히 식물 바이오매스로부터 수득한다. 전체 식물 또는 식물의 임의의 특정 부분을 사용하여 수크로스-함유 배지로 사용되는 원료를 제조할 수 있다. 제조는 수크로스-함유 식물 바이오매스로부터 수크로스를 추출하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 처리를 기반으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 수크로스-함유 배지는 사탕수수, 사탕무, 단수수, 사탕 단풍나무, 사탕 야자 및 블루 아가베로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 수득한다.

우선적으로, 수크로스-함유 배지는 사탕수수 또는 사탕무로부터 수득한다.

다양한 형태의 수크로스-함유 배지가 사용될 수 있다: 액즙, 농축 액즙, 시럽, 맑은 액즙, 당밀 또는 결정화된 수크로스. 바람직한 형태는 어떠한 처리도 없이 식물로부터 직접적으로 추출된 사탕수수로부터의 원액즙이다. 간략하게, 수확한 사탕수수는 액즙의 추출을 위한 분쇄 공정 전에 세정된다. 사탕수수의 구조는 부순 후에 분쇄하고, 동시에 수크로스를 물로 추출하여 원액즙을 얻는다. 이어서, 석회를 첨가하고 가열하여 원액즙을 정화시킬 수 있고, 맑은 액즙은 침전물로부터 분리한다. 농축 시럽은 증발에 의해 수득한다.

조 수크로스-함유 배지, 상기 언급된 바이오매스로부터 수득한 것은 수크로스-함유 배지 뿐만 아니라 미생물의 성장에 사용될 수 있는 다른 영양소를 함유하므로, 미생물의 성장을 위해 적절한 배지는 단독으로 수크로스-함유 배지를 이용하거나 (즉, 적절한 배지는 수크로스-함유 배지로 구성됨), 또는 인의 공급원 및/또는 질소의 공급원을 갖는 수크로스-함유 배지를 보충함으로써 설계될 수 있다.

우선적으로, 수크로스-함유 배지는 적어도 7%의 수크로스를 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, 회수된 1,3-프로판디올은 또한 정제된다. 배양 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것은 당업자에게 일상적인 작업이다. 회수 및 정제를 위한 방법은 하기 특허 출원에 개시된다: WO 2009/068110 및 WO 2010/037843.

본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 본 발명이 특히 예시된 방법에 제한되지 않으며, 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 특히, 실시예는 변형된 에스케리키아 콜라이 균주를 보여주지만, 이러한 변형은 동일한 패밀리의 다른 미생물 상에서 용이하게 수행될 수 있다.

에스케리키아 콜라이는 그람-음성, 로드-형, 비-포자 형성이며 전형적으로 길이가 1-5 μm인 구성원을 포함하는 엔테로박테리아세아에 패밀리에 속한다. 대부분의 구성원은 주변을 이동하는데 사용되는 편모를 갖지만, 몇몇 속은 비-이동성이다. 이러한 패밀리의 다수의 구성원은 인간 및 다른 동물의 장에서 발견되는 장내균의 정상적인 일부인 반면, 다른 것은 물 또는 토양에서 발견되거나, 다양한 상이한 동물 및 식물 상의 기생충이다. 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이)는 가장 중요한 모델 유기체 중 하나이지만, 본 발명자들은 또한 엔테로박테리아세아에 패밀리의 중요한 구성원을 언급할 수 있다: 클레브시엘라, 특히 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) 및 살모넬라.

도면

도 1. 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 생합성 경로.

실시예

실시예 1

글루코스 및 수크로스 상에서의 1,3-프로판디올 생산에 대한 최대 수율의 계산

1.1 - 시뮬레이션에 사용된 파라미터

시뮬레이션은 METEX 독점 소프트웨어 METOPT^TM을 사용하여 수행하였다. 중심 대사 네트워크, 모든 바이오매스 전구체에 대한 대사 경로 및 상기 기재된 바와 같은 특정 생산 경로를 포함하는 이. 콜라이의 단순화된 대사 네트워크를 이용하였다. 이. 콜라이에 대한 고전적 바이오매스 조성물을 이용하였다. 시뮬레이션은 글루코스 또는 수크로스 탄소원을 이용하여 수행하였다. 수크로스 이용을 위해, PTS 시스템 및 비-PTS 시스템을 둘 다 모델링하였다. 계산된 최대 수율에 대한 차이가 없으므로, 단지 수크로스 상에서의 하나의 수율을 보고하였다. 실제 최대 수율의 계산은 0.1h^-1의 성장률 및 5 mmol_ATP.g_DW ^-1.h^-1의 유지 에너지를 고려하여 수행하였다. 모든 시뮬레이션은 3 mmol.g_DW ^-1.h^-1의 글루코스의 특정 흡수율에서 수행하였다. 시뮬레이션은 호기성 조건 하에 수행하였다.

1.2 - 시뮬레이션 결과

실시예 2

에스케리키아 콜라이의 유전자 serC에 의해 코딩되는 L-호모세린 트랜스아미나제 활성의 입증

2.1 - SerC 특성화를 위한 균주: BL21 ( pPAL7 - ser C )의 구축

SerC 단백질을 특성화하기 위해, 상응하는 유전자를 발현 벡터 pPAL7 (바이오-라드(Bio-rad))로부터 발현시켰다.

이 목적을 위해, serC 유전자를 올리고뉴클레오티드 pPAL7-serC F 및 pPAL7-serC R을 이용하여 이. 콜라이 게놈으로부터 증폭시켰다. PCR 산물을 효소 HindIII 및 EcoRI를 이용하여 제한시키고, 동일한 제한 효소에 의해 제한된 벡터 pPAL7에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pPAL7-serC로 명명하였다.

pPAL7-serC F (서열 1):

(- 유전자 serC의 서열 (956876 - 956904)과 상동성인 영역 (볼드체의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- HindIII 제한 부위를 보유하는 영역 (밑줄 표시된 경우)

을 가짐)

pPAL7-serC R (서열 2):

(- 유전자 serC 영역의 서열 (957964 - 957937)과 상동성인 영역 (볼드체의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- EcoRI 제한 부위를 보유하는 영역 (밑줄 표시된 경우)

을 가짐)

이어서, pPAL7-serC 플라스미드를 적격 BL21 (DE3) 세포 (인비트로젠(Invitrogen))에 도입하였다.

2.2 - 단백질 SerC의 과다생산

단백질 SerC의 과다생산은 2.5 g/l 글루코스 및 100 mg/l의 암피실린이 보충된 LB 브로쓰 (문헌 [Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300])를 이용하여, 2 l 에를렌마이어 플라스크에서 수행하였다. 예비배양물을 2.5 g/l 글루코스 및 100 mg/l의 암피실린이 보충된 LB 브로쓰 50 ml를 채운 500 ml 에를렌마이어 플라스크에서 밤새 성장시켰다. 예비배양물을 사용하여 500 ml 배양물을 약 0.15의 OD_600nm으로 접종하였다. 배양물을 우선 OD_{600 nm}이 약 0.5가 될 때까지 37℃ 및 200 rpm에서 성장시킨 후에, 25℃ 및 200rpm으로 이동시키고, OD_{600 nm}이 0.6 - 0.8이 될 때까지 (약 1시간) 성장시키고, 이어서 500μM IPTG로 유도하였다. 배양물을 OD_{600 nm}이 대략 4가 될 때까지 25℃ 및 200 rpm에서 유지한 후에 중단시켰다. 세포를 4℃에서 5분 동안 7000 rpm에서 원심분리한 후에, -20℃에 저장하였다.

2.3 - 단백질 SerC의 정제

2.3.1 - 단계 1: 세포-무함유 추출물의 제조.

약 280 mg의 이. 콜라이 바이오매스를 45 ml의 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6) 및 프로테아제 억제제 칵테일에 현탁시켰다. 세포 현탁액 (원추형 튜브당 15 ml)을 30초 간격으로 30초씩 8사이클 동안 50 ml 원추형 튜브 내의 얼음 (반델린 소노플러스(Bandelin sonoplus), 70 W) 상에서 초음파처리하였다. 초음파처리 후, 세포를 5 mM MgCl2 및 1 UI/ml의 DNaseI과 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 잔해를 4℃에서 30분 동안 12000 g에서 원심분리에 의해 제거하였다.

2.3.2 - 단계 2: 친화도 정제

단백질을 제조업체가 추천한 프로토콜에 따라 프로피니티(Profinity) 칼럼(바이오라드(BIORAD), 바이오-스케일 미니 프로피니티 정밀 카트리지 5 ml) 상에서 친화도에 의해 조 세포-추출물로부터 정제하였다. 조 추출물을 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6)으로 평형화된 5 ml 프로피니티 정밀 카트리지 상에 로딩하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 동일한 완충제로 세척하고, 실온에서 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6), 100 mM 플루오라이드와 30분 인큐베이션하였다. 단백질을 2 칼럼 부피의 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6)으로 칼럼으로부터 용리하였다. 수지에 단단하게 결합된 남아있는 태그 및 정제된 단백질을 방출시켰다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 100 mM 트리스 HCl, 150 mM NaCl 및 10% 글리세롤 (pH 8)에 대해 투석하였다.

단백질 농도는 브래드포드 단백질 검정을 이용하여 측정하였다.

2.4 - L-호모세린 트랜스아미나제 검정

L-호모세린 트랜스아미나제 활성은 커플링된 효소적 검정을 이용하여 30℃에서 측정하였다. L-호모세린 트랜스아미나제 활성 검정은 1 ml의 전체 부피로 420 mM 인산칼륨 완충제 (pH 8.2), 2 mM 아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오티드, 3 mM L-호모세린, 소 간으로부터의 20 유닛/ml 글루탐산 데히드로게나제, 중화된 1 mM 알파-케토글루타르산 및 약 50 μg의 조 추출물을 사용하여 수행하였다. 아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오티드의 소비는 분광광도계 상에서 375 nm에서 모니터링하였다. 기질 (L-호모세린)이 결핍된 대조 검정에서 검출된 활성을 기질을 사용하는 검정에서 검출된 활성으로부터 감하였다. L-호모세린 트랜스아미나제 활성의 유닛은 30℃에서 분당 1 μmol의 L-호모세린의 트랜스아민화를 촉매하는데 필요한 효소의 양이다. (엡실론 375 nm = 6100 M-1 cm-1)

2.5 - 정제된 효소의 활성

실시예 3

락토코쿠스 락티스의 유전자 kivD에 의해 코딩되는 4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 활성의 입증

3.1 - KivD 특성화를 위한 균주: BL21 (pPAL7-kivDll)의 구축

KivD 단백질을 특성화하기 위해, 상응하는 유전자를 발현 벡터 pPAL7(바이오-라드)로부터 발현시켰다.

이 목적을 위해, kivD 유전자를 올리고뉴클레오티드 pPAL7-kivDll F 및 pPAL7-kivDll R을 사용하여 락토코쿠스 락티스 게놈으로부터 증폭시켰다. PCR 산물을 효소 HindIII 및 EcoRI를 사용하여 제한시키고, 동일한 제한 효소에 의해 제한된 벡터 pPAL7에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pPAL7-kivDll로 명명하였다.

pPAL7-kivDll F (서열 3):

(- 락토코쿠스 락티스 kivD 유전자의 합성 유전자의 서열에 상동성인 영역 (이탤릭체의 경우),

- 정제를 바람직하게 하는 짧은 N-말단 아미노산 확장을 함유하는 태그-무함유 단백질을 생성하는데 필요한 뉴클레오티드를 보유하는 영역 (볼드체의 경우),

- HindIII 제한 부위를 보유하는 영역 (밑줄 표시된 경우)

을 가짐)

pPAL7-kivDll R (서열 4):

- EcoRI 제한 부위를 보유하는 영역 (밑줄 표시된 경우)

을 가짐)

이어서, pPAL7-kivDll 플라스미드를 균주 BL21 (DE3) 적격 세포 (인비트로젠)에 도입하였다.

3.2 - 단백질 KivD 의 과다생산

단백질 kivD의 과다생산은 실시예 # 2.2와 동일한 프로토콜을 적용하여 수행하였다.

3.3 - 단백질 KivD의 정제

3.3.1 - 단계 1: 세포-무함유 추출물의 제조.

약 188 mg의 이. 콜라이 바이오매스를 30 ml의 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6) 및 프로테아제 억제제 칵테일에 현탁시켰다. 세포 현탁액 (원추형 튜브당 15 ml)을 30초 간격으로 30초씩 8사이클 동안 50 ml 원추형 튜브 내의 얼음 (반델린 소노플러스, 70 W) 상에서 초음파처리하였다. 초음파처리 후에, 세포를 5 mM MgCl2 및 1 UI/ml의 DNaseI과 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 잔해를 4℃에서 30분 동안 12000 g에서 원심분리에 의해 제거하였다.

3.3.2 - 단계 2: 친화도 정제

단백질을 제조업체가 추천한 프로토콜에 따라 프로피니티 칼럼 (바이오라드, 바이오-스케일 미니 프로피니티 정밀 카트리지 5 ml) 상에서 친화도에 의해 조 세포-추출물로부터 정제하였다. 조 추출물을 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6)으로 평형화된 5 ml 프로피니티 정밀 카트리지 상에 로딩하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 동일한 완충제로 세척하고, 4℃에서 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6), 100 mM 플루오라이드와 밤새 인큐베이션하였다. 단백질을 2 칼럼 부피의 100 mM 인산칼륨 (pH 7.6)으로 칼럼으로부터 용리하였다. 수지에 단단하게 결합된 남아있는 태그 및 정제된 단백질을 방출시켰다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 100 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl 및 10% 글리세롤 (pH 8)에 대해 투석하였다.

3.4 - 4-히드록시-2- 케토부티레이트 데카르복실라제 검정

3.4.1 - 4-히드록시-2-케토부티르산의 화학적 합성

4-히드록시-2-케토부티르산의 화학적 합성은 하기 문헌에 기재되어 있다:

R S Lane; EE Dekker; (1969). 2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8 (7), 2958-2966.

3.4.2 - 4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 검정

4-히드록시-2-케토부티레이트의 탈카르복실화는 커플링된 효소적 검정을 이용하여 30℃에서 측정하였다. 4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 활성 검정은 1 ml의 전체 부피로 50 mM 인산칼륨 완충제 (pH 6), 0.2 mM NADH, 1 mM MgSO4, 0.5 mM 티아민 디포스페이트, 사카로미세스 세레비지아에로부터의 72 유닛/ml 알콜 데히드로게나제, 중화된 10 mM 4-히드록시-2-케토부티르산 및 약 40 μg의 정제된 단백질을 사용하여 수행하였다. NADH의 소비는 분광광도계 상에서 340 nm에서 모니터링하였다. 기질이 결핍된 대조 검정에서 검출된 활성을 기질을 사용하는 검정에서 검출된 활성으로부터 감하였다. 4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 활성의 유닛은 30℃에서 분당 1 μmol의 4-히드록시-2-케토부티르산의 탈카르복실화를 촉매하는데 필요한 효소의 양이다. (엡실론 340 nm = 6290 M-1 cm-1).

3.5 - 정제된 효소의 활성

실시예 4

에스케리키아 콜라이의 유전자 yqhD에 의해 코딩되는 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제 활성의 입증

4.1 - YqhD 특성화를 위한 균주: MG1655 Δ yqhD :: Km ( pTRC99A - yqhD )의 구축

4.1.1 - 균주 MG1655 ΔyqhD::Km의 구축

yghD 유전자를 결실시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관련된 대부분 유전자를 결실시키는 동안 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 허용한다. 이 목적을 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

ΔyqhDF (서열 5)

(- yqhD 영역의 서열 (3153377 내지 3153456)에 상동성인 영역 (소문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자의 경우) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)

을 가짐),

ΔyqhDR (서열 6)

(- yqhD 영역의 서열 (3154540 내지 3154460)과 상동성인 영역 (대문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

을 가짐).

올리고뉴클레오티드 ΔyqhDF 및 ΔyqhDR을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다. 이어서, 수득한 PCR 산물을 균주 MG1655 (pKD46)에 전기천공에 의해 도입하였다. 이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하고, 내성 카세트의 삽입을 하기 정의된 올리고뉴클레오티드 yqhDF 및 yqhDR을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔyqhD::Km으로 지칭하였다.

yqhDF (서열 7): ggcgtctcgccatacaacaaacgcacatcgggc (3153068 내지 3153100의 서열에 상동성임).

yqhDR (서열 8): gggctttgccgacaccttcttcgttcttg (3154825 내지 3154797의 서열에 상동성임).

4.1.2 - 플라스미드 pTRC99A-yqhD의 구축

YqhD 단백질을 특성화하기 위해, 상응하는 단백질을 벡터 pTRC99A (아머샴(Amersham))로부터 발현시켰다.

이 목적을 위해, yqhD 유전자를 올리고뉴클레오티드 yqhD F pTRC99A F 및 yqhD R pTRC99A R을 사용하여 이. 콜라이 게놈으로부터 증폭시켰다. PCR 산물을 효소 HindIII 및 BspHI를 사용하여 제한시키고, NcoI-HindIII 제한 효소에 의해 제한된 벡터 pTRC99A에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pTRC99A-yqhD로 명명하였다.

yqhD F pTRC99A F (서열 9):

(- 유전자 yqhD의 서열 (3153377 내지 3153408)에 상동성인 영역 (밑줄 표시된 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- BspHI 제한 부위 (볼드체의 경우)

를 가짐)

yqhD R pTRC99A R (서열 10):

(- 유전자 yqhD의 서열 (3154540 내지 3154483)에 상동성인 영역 (밑줄 표시된 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- HindIII 제한 부위 (볼드체의 경우)

를 가짐)

이어서, pTRC99A-yqhD 플라스미드를 균주 MG1655 ΔyqhD::Km에 도입하였다.

4.2 - 단백질 YqhD의 과다생산

단백질 YqhD를 2.5 g/l 글루코스 및 50 mg/l의 암피실린 및 50mg/l의 카나마이신을 갖는 500 ml LB 배지를 포함하는 2 l 배플 에를렌마이어 플라스크에서 호기성 조건 하에 37℃에서 과다생산하였다. 플라스크를 궤도 진탕기 상에서 200 rpm에서 교반하였다. 550 nm에서 측정된 광학 밀도가 0.5 유닛에 도달하였을 때, 플라스크를 25℃에서 인큐베이션하였다. 광학 밀도가 1.2 유닛에 도달하였을 때, YqhD 단백질의 생산을 500 μM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 유도하였다. 배양물이 3.5 유닛 초과의 광학 밀도에 도달하였을 때 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 사용 전에 -20℃에 저장하였다.

4.3 - 단백질 YqhD의 정제

4.3.1 - 단계 1: 세포-무함유 추출물의 제조.

400 mg의 이. 콜라이 바이오매스를 70 ml의 50 mM Hepes (pH 7.5) 및 프로테아제 억제제 칵테일에 현탁시켰다. 세포를 30초 간격으로 30초씩 8사이클 동안 로세트 셀(Rosett cell) RZ3 내의 얼음 (브렌슨 소니파이어, 70 W) 상에서 초음파처리하였다. 초음파처리 후에, 세포를 1 mM MgCl2 및 1 UI/ml의 DNaseI과 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 잔해를 4℃에서 30분 동안 12000 g에서 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 조 추출물로 유지하였다.

4.3.2 - 단계 2: 황산암모늄 침전

조 추출물을 50% 황산암모늄의 농도에서 침전시키고, 고체 황산암모늄 (300 g/l)을 얼음 상에서 조 추출물에 첨가하였다. 4℃에서 인큐베이션하고 15분 후에, 혼합물을 4℃에서 15분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 침전물을 50 ml의 50 mM Hepes (pH 7.5), 1 M 황산암모늄에 용해시켰다.

4.3.3 - 단계 3: 소수성 크로마토그래피.

Akta 정제기 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여, 이전 단계로부터의 단백질 추출물을 동일한 완충제로 평형화된 5 ml HiTrap 페닐HP 칼럼(지이 헬쓰케어)에 로딩하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 동일한 완충제로 세척하였다. 단백질을 2 단계 구배 (1 M 내지 0.5 M 황산암모늄 10 칼럼 부피의 구배 및 0.5 M 내지 0 M 황산암모늄 20 칼럼 부피의 구배)로 용리하였다. 용리 후에, 칼럼을 10 칼럼 부피의 50 mM Hepes (pH 7.5)로 세척하였다. 칼럼의 유량은 2.5 ml/분이었고 2.5 ml 분획을 수집하였다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 50 mM Hepes (pH 7.5)에서 투석하고, 1.14 μg/μl의 농도로 농축시켰다.

4.4 - 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제 활성 검정

3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제 활성을 340 nm의 파장에서 및 37℃의 일정한 온도에서 분광광도계로 NADPH 산화의 초기 속도를 측정함으로써 검정하였다. 3-히드록시프로피온알데히드를 기질로 사용하는 반응 혼합물을 1ml의 최종 부피로 20 mM Hepes (pH 7.5), 0.1 mM 황산아연, 0.2 mM NADPH, 6 μg의 정제된 효소에서 수행하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후에 10 mM의 최종 농도에서 기질 3-히드록시프로피온알데히드를 첨가하여 반응을 개시하였다. 블랭크 반응물은 정제된 효소를 제외하고 반응 혼합물의 모든 성분을 함유하였다. 효소 활성의 1 유닛은 37℃에서 분당 1 μmol 기질을 소비하는 효소의 양으로 정의하였다. 특정 효소 활성은 단백질 mg당 유닛으로 표현하였다.

4.5 - 정제된 효소의 활성

실시예 5

증가된 1,3-프로판디올 경로 흐름을 갖고, 4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 코딩 유전자, 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제 코딩 유전자 및 L-호모세린 트랜스아미나제 코딩 유전자를 발현하는 균주: MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07) (pME101-thrA*1-serC)의 구축

5.1 - 균주 MG1655 Δ pykF 의 구축

pykF 유전자를 결실시키기 위해, 문헌 [Datsenko and Wanner (2000, PNAS, 97: 6640-6645)]에 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관련된 대부분 유전자를 결실시키는 동안 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 허용한다. 이 목적을 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

ΔpykFF (서열 11)

(- pykF 영역의 서열 (1753689-1753766)에 상동성인 영역 (소문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자의 경우)

을 가짐),

ΔpykFR (서열 12)

(- pykF 영역의 서열 (1755129-1755051)에 상동성인 영역 (대문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

을 가짐).

올리고뉴클레오티드 ΔpykFF 및 ΔpykFR을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다. 이어서, 수득한 PCR 산물을 균주 MG1655 (pKD46)에 전기천공에 의해 도입하였다. 이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하고, 내성 카세트의 삽입을 하기 정의된 올리고뉴클레오티드 pykFF 및 pykFR을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔpykF::Km으로 지칭하였다

pykFF (서열 13): gcgtaaccttttccctggaacg (1753371 내지 1753392의 서열에 상동성임).

pykFR (서열 14): gcgttgctggagcaacctgccagc (1755518 내지 1755495의 서열에 상동성임).

이어서, 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 이어서, 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 레콤비나제를 운반하는 플라스미드 pCP20을 전기천공에 의해 재조합 부위에 도입하였다. 42℃에서 일련의 배양 후에, 카나마이신 내성 카세트의 손실을 이전에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 (pykFF / pykFR)를 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 Δp y kF로 지칭하였다

5.2 - 균주 MG1655 ΔpykF ΔmetA의 구축

metA 유전자를 결실시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관련된 대부분 유전자를 결실시키는 동안 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 허용한다. 이 목적을 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

ΔmetAF (서열 15):

(- metA 영역의 서열 (4212310-4212389)에 상동성인 영역 (소문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

을 가짐),

ΔmetAR (서열 16):

(- metA 영역의 서열 (4213229-4213150)에 상동성인 영역 (대문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

을 가짐).

올리고뉴클레오티드 ΔmetAF 및 ΔmetAR을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다. 이어서, 수득한 PCR 산물을 균주 MG 1655 (pKD46)에 전기천공에 의해 도입하였다. 이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하고, 내성 카세트의 삽입을 하기 정의된 올리고뉴클레오티드 metAF 및 metAR을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔmetA::Km으로 지칭하였다.

metAF (서열 17): tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (4212203 내지 4212232의 서열에 상동성임).

metAR (서열 18): ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt (4213301 내지 4213272의 서열에 상동성임).

ΔmetA::Km을 전달하기 위해, 파지 P1 형질도입의 방법을 사용하였다. 균주 MG1655 ΔmetA::Km의 파지 용해물의 제제를 균주 MG1655 ΔpykF로의 형질도입에 사용하였다.

이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하고, ΔmetA::Km을 이전에 정의된 올리고뉴클레오티드 metF / metAR을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔpykF ΔmetA::Km으로 지칭하였다.

카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 이어서, 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 레콤비나제를 운반하는 플라스미드 pCP20을 전기천공에 의해 재조합 부위에 도입하였다. 42℃에서 일련의 배양 후에, 카나마이신 내성 카세트의 손실을 이전에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 (pykFF / pykFR, 및 metF / metAR)를 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔpykF ΔmetA로 지칭하였다.

5.3 - 균주 MG1655 Δ pykF Δ metA Δ thrLABC 의 구축

thrLABC 오페론을 결실시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관련된 대부분 유전자를 결실시키는 동안 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 허용한다. 이 목적을 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

DthrLABF (서열 19):

(- thrLABC 영역의 서열 (22-86)에 상동성인 영역 (소문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- T7 파지로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열에 대한 영역 (볼드체의 밑줄 표시된 소문자의 경우) (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.]),

- 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자의 경우) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)

을 가짐),

DthrLABCR (서열 20):

(- thrLABC 영역의 서열 (5106-5021)에 상동성인 영역 (대문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- BamHI - SfoI - SmaI 제한 부위의 부가의 위한 영역 (이탤릭체 대문자의 경우)

- 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (볼드체 대문자의 경우)

을 가짐).

올리고뉴클레오티드 DthrBF 및 DthrCR을 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시켰다. 이어서, 수득한 PCR 산물을 균주 MG1655 (pKD46)에 전기천공에 의해 도입하였다. 이어서, 클로람페니콜 내성 형질전환체를 선택하고, 내성 카세트의 삽입을 하기 정의된 올리고뉴클레오티드 thrLF 및 thrCR을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔthrLABC::Cm으로 지칭하였다.

thrLF (서열 21): GCCATGCCGCGCTGGTGTTTGGTCGCG (4639281 내지 4639307의 서열에 상동성임).

thrCR (서열 22): GCGACCAGAACCAGGGAAAGTGCG (5283 내지 5260의 서열에 상동성임).

ΔthrLABC::Cm을 전달하기 위해, 파지 P1 형질도입의 방법을 사용하였다. 균주 MG1655 ΔthrLABC::Cm의 파지 용해물의 제제를 균주 MG1655 ΔpykF ΔmetA로의 형질도입에 사용하였다. 이어서, 클로람페니콜 내성 형질전환체를 선택하고, Δt hrLABC::Cm을 이전에 정의된 올리고뉴클레오티드 thrLF 및 thrCR을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC::Cm으로 지칭하였다.

클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서, 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 레콤비나제를 운반하는 플라스미드 pCP20을 전기천공에 의해 재조합 부위에 도입하였다. 42℃에서 일련의 배양 후에, 클로람페니콜 내성 카세트의 손실을 이전에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 (pykFF / pykFR, metAF / metAR, 및 thrLF / thrCR)를 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC로 지칭하였다.

5.4 - 에스케리키아 콜라이의 L-호모세린 트랜스아미나제 serC의 과다발현을 위한 플라스미드: pME101-thrA*1-serC 플라스미드의 구축

serC 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 유전자를 그의 적절한 프로모터를 이용하여 이전에 기재된 pME101-thrA*1 (PCT_WO2008707041)로부터 발현시켰다.

이 목적을 위해, serC 유전자를 올리고뉴클레오티드 serC F 및 serC R을 사용하여 이. 콜라이 게놈으로부터 증폭시켰다. PCR 산물은 효소 XbaI 및 SmaI를 사용하여 제한시키고, 동일한 제한 효소에 의해 제한된 벡터 pME101-thrA*1에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pME101-thrA*1-serC로 명명하였다.

serC F (서열 23):

(- 유전자 serC의 서열 (956619 - 956644)에 상동성인 영역 (대문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- XbaI 부위를 보유하는 영역 (볼드체 대문자의 경우)

을 가짐)

serC R (서열 24):

(- 유전자 serC 영역의 서열 (958028 - 958004)에 상동성인 영역 (대문자의 경우) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- HindIII 부위를 보유하는 영역 (볼드체 대문자의 경우)

을 가짐).

PCR 증폭된 단편을 제한 효소 XbaI 및 HindIII로 절단하고, 벡터 pME101-thrA*1의 XbaI - HindIII 부위에 클로닝하여 벡터 pME101-thrA*1-serC를 제공하였다.

5.5 - 에스케리키아 콜라이의 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제 yqhD 유전자 및 락토코쿠스 락티스의 4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 kivD 유전자의 과다발현을 위한 플라스미드: pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07 플라스미드의 구축

pME101-yqhD-kivDll-TT07 플라스미드를 우선 구축하였다. BsrBI 및 BglII에 의해 제한된 pME101-kivDll-TT07 벡터 (PCT/2009/067994)로부터의 kivDll 유전자를 SnaBI 및 BglII에 의해 제한된 pME101VB01-yqhD 벡터 (이전에 PCT/2007/000509에 기재됨)에 클로닝하고, 생성된 플라스미드를 pME101-yqhD-kivDll-TT07로 명명하였다.

이어서, yqhD 및 kivDll 유전자를 올리고뉴클레오티드 Ptrc01-RBS01-yqhD pBBR F 및 kivD pBBR R을 사용하여 pME101-yqhD-kivDll-TT07 플라스미드로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 산물을 제한 효소 SpeI 및 SmaI으로 소화시키고, 동일한 효소에 의해 제한된 벡터 pBBR1MCS5 (문헌 [M. E. Kovach, (1995), Gene 166:175-176])에 클로닝하여, pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07 벡터를 제공하였다.

Ptrc01-RBS01-yqhD pBBR F (서열 25)

- SpeI 제한 부위의 부가를 위한 영역 (볼드체 대문자의 경우)

- 구성적 Ptrc 프로모터 서열의 부가를 위한 영역 (볼드체 소문자의 경우)

- BamHI 제한 부위의 부가를 위한 영역 (이탤릭체 대문자의 경우)

- 리보솜 결합 부위 서열의 부가를 위한 영역 (밑줄 표시된 소문자의 경우)

- MG1655 yqhD 유전자의 서열 (3153377-3153402)에 상동성인 영역 (이탤릭체 소문자의 경우) (http://www.ecogene.org/)

kivD pBBR R (서열 26)

- SmaI 제한 부위의 부가를 위한 영역 (볼드체의 이탤릭체 대문자의 경우)

- T7 파지로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열에 대한 영역 (밑줄 표시된 대문자의 경우) (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.]),

- SnaBI - EcoRI - PacI 제한 부위의 부가를 위한 영역 (볼드체 대문자의 경우)

- 합성 kivD 유전자의 말단에 상동성인 영역 (이탤릭체 대문자의 경우)

균주 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC (pME101-thrA*1-serC) (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07)의 XX 구축.

이어서, pME101-thrA*1-serC 및 pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07 플라스미드를 균주 MG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC에 도입하였다.

실시예 6

4-히드록시-2-케토부티레이트 데카르복실라제 코딩 유전자 및 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제 코딩 유전자를 발현하는 수크로스 상에서의 증가된 1,3-프로판디올 경로 흐름, 및 수크로스 비-PTS 수송 시스템을 갖는 균주: MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07) (pME101-thrA*1-serC) (pKJL101-1)의 구축

pKJL101-1 플라스미드는 다른 문헌에도 기재되어 있다 (문헌 [Jahreis, K. et al. 2002. Adaptation of sucrose metabolism in the Escherichia coli wild-type strain EC3132. J. Bact. P5307-5316]).

pME101-thrA*1-serC, pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07 및 pKJL101-1 플라스미드를 균주 MG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC에 도입하였다.

실시예 7

1,3-프로판디올 생산을 위한 배양

균주의 성능을 4.5 mM 트레오닌, 5mM 메티오닌, 10 g/l MOPS 및 10 g/l 수크로스 또는 글루코스가 보충되고 pH 6.8로 조정된 변형된 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128])를 사용하는 500 ml 배플 에를렌마이어 플라스크 배양에서 평가하였다. 스펙티노마이신 및/또는 겐타마이신은 필요한 경우에 50 mg/l의 농도에서 첨가하고/거나, 클로람페니콜은 필요한 경우에 60 mg/l의 농도에서 첨가하였다. 100 μM IPTG는 또한 존재하는 경우에 발현 벡터 pME101의 도입을 위해 첨가하였다. 24시간 동안 배양된 예비배양물을 사용하여 50 ml 배양물을 약 0.1의 OD_600nm으로 접종하였다. 배양물을 배양 배지 중의 수크로스가 소모될 때까지 37℃ 및 200 rpm에서 성장시켰다. 이 시점에서, 남아있는 당 및 주요 산물을 분리를 위해 바이오라드 HPX 97H 칼럼을 사용하고 검출을 위해 굴절계를 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 1,3-프로판디올의 생산을 LC/MS/MS에 의해 결정하였다.

다양한 균주의 성능은 하기 표에 제시된다.

히드록시 케토산 데카르복실라제 및 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제를 발현하는 다양한 균주의 PDO 산물을 탄소원으로서 글루코스 또는 수크로스와 배양하였다; nd: 검출되지 않음; * 야생형 이. 콜라이 MG1655는 수크로스 탄소원 단독 상에서 성장하지 않음.

상기 표에서 볼 수 있는 바와 같이 히드록시 케토산 데카르복실라제 및 3-히드록시프로피온알데히드 리덕타제를 발현하는 균주는 L-호모세린의 생산을 위한 흐름이 pykF의 결실 및 thrA *1의 과다발현을 통해 증가되고, L-호모세린의 형질전환이 metA 및 thrABC의 결실에 의해 감소되고, L-호모세린의 4-히드록시-2-케토부티레이트로의 형질전환이 serC의 과다발현에 의해 촉매된다면 수크로스로부터 PDO를 생산한다. 본 발명자들의 지식 범위 내에서, 야생형 이. 콜라이에서 임의의 탄소원 상에서의 PDO 생산이 입증되지 않았으며, 이는 상기 변형이 이. 콜라이 야생형 PDO 비-생산자 균주를 PDO 생산자 균주로 전환시켰음을 입증한다.

실시예 8

균주: MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* Δc s cR::Km (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07) (pME101-thrA*1-serC)의 구축

실시예 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 수크로스 상에서의 PDO 생산 균주 (수크로스 수송 시스템을 pKJL101.1과 통합함)는 참조 균주보다 적게 PDO를 생산하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 이것이 균주에 함유된 3가지 상이한 벡터로 인한 안정성 문제를 입증하는 것으로 여겼다. 따라서, 본 발명자들은 보다 안정한 균주를 수득하기 위해 염색체 상에 수크로스 수송 시스템을 도입하기로 결정하였다.

8.1 균주 MG1655 ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*::Cm의 구축

단일 탄소원으로서의 수크로스 상에서 성장할 수 있는 균주를 구축하기 위해, csc 유전자를 균주 LJM115로부터의 P1 파지 용해물과 함께 균주 MG1655에 형질도입하였다 (문헌 [Jahreis K., Bentler L., Bockmann J., Hans S., Meyer A., Siepelmeyer J., Lengeler J.W. J. Bact. 2002. 184(19):5307-5316]).

클로람페니콜 내성 재조합체를 선택하고, csc 유전자의 존재를 프라이머 Opg 0590_yfdC seq (서열 27) 및 Opg 1242_dsdX-dsdA seq (서열 28)를 사용하는 PCR에 의해 검증하였다. 검증 및 선택된 균주를 MG1655 ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*::Cm으로 지칭하였다.

Opg 0590_yfdC seq (서열 27): GTGCGGCAAAGATTGTGGTG (2463948 내지 2463967의 서열에 상동성임)

Opg 1242_dsdX-dsdA seq (서열 28): GCCAGTTTTTCTGCGTGTGCC (2477624 내지 2477604의 서열에 상동성임)

8.2 균주 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* Δ cscR :: Km 의 구축

cscR 유전자를 결실시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관련된 대부분 유전자를 결실시키는 동안 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 허용한다. 이 목적을 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

Odi 0195_cscR::Cm F (서열 29)

- cscR 유전자의 말단에 상동성인 영역 (볼드체 대문자의 경우),

- 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (밑줄 표시된 대문자의 경우) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)

Odi 0196_cscR::Cm R (서열 30)

- cscR 유전자의 시작부에 상동성인 영역 (볼드체 대문자의 경우),

올리고뉴클레오티드 Odi 0195_cscR::Cm F 및 Odi 0196_cscR::Cm R을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다. 이어서, 수득한 PCR 산물을 균주 MG1655 ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR*::Cm에 전기천공에 의해 도입하였다. 이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하고, 내성 카세트의 삽입을 상기 기재된 올리고뉴클레오티드 Opg 1242_dsdX-dsdA seq (서열 28) 및 하기 정의된 Opg 0511_csc8 (서열 31)을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km으로 지칭하였다.

Opg 0511_csc8 (서열 31): CGATACATCATCCGTGGAAG (cscA 유전자의 서열에 상동성임)

ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km 염색체 변형을 전달하기 위해, 파지 P1 형질도입의 방법을 사용하였다. 균주 MG1655 ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km의 파지 용해물의 제제를 5.3에 기재된 균주 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC로의 형질도입에 사용하였다.

이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하고, ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km을 이전에 정의된 올리고뉴클레오티드 Opg 1242_dsdX-dsdA seq / Opg 0511_csc8을 사용하는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km으로 지칭하였다.

8.3 균주 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07) ( pME101 - thrA *1- serC )의 구축

pME101-thrA*1-serC 및 pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07 플라스미드 (5.4 및 5.5에 기재됨)를 최종적으로 균주 MG1655 ΔmetA ΔpykF ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km에 도입하였다. 생성된 균주를 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07) (pME101-thrA*1-serC)으로 지칭하였다.

실시예 9

수크로스 상에서의 새로운 생산 균주의 배양

균주 1: 실시예 5.5에 기재된 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC (pME101-thrA*1-serC) (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07);

균주 2: 실시예 8.3에 기재된 MG1655 ΔpykF ΔmetA ΔthrLABC ΔRN/yfdC-dsdX::cscB*(Q353H)KAR* ΔcscR::Km (pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS01*2-yqhD-kivDll-TT07) (pME101-thrA*1-serC).

생산 균주는 4.5 mM 트레오닌, 5 mM 메티오닌 및 10 g.L^-1 MOPS가 보충되고 pH 6.8로 조정된 변형된 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128])를 사용하여 소형 에를렌마이어 플라스크에서 평가하였다. 균주 1의 경우에 글루코스를 10 g.L^-1의 농도에서 첨가하고, 균주 2의 경우에 수크로스를 10 g.L^-1의 농도에서 첨가하였다.

5 mL 예비배양물을 혼합 배지 (2.5 g.L^-1 글루코스 또는 수크로스 및 상기 기재된 90 % 최소 배지를 갖는 10 % LB 배지 (시그마(Sigma) 25 %)) 중에서 6.5시간 동안 37℃에서 성장시켰다. 이를 사용하여 50 mL 배양물을 0.1의 OD₆₀₀으로 최소 배지 중에 접종하였다. 또한, IPTG (100 μM)를 발현 벡터 pME101의 도입을 위해 첨가하였다. 필요한 경우에, 항생제를 카나마이신 및 스펙티노마이신의 경우에 50 mg.L^-1의 농도에서 및 겐타마이신의 경우에 10 mg.L^-1의 농도에서 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물이 7 내지 9의 OD₆₀₀에 도달하였을 때, 세포외 대사물을 굴절계 검출 (유기 산 및 수크로스)에 의해 HPLC를 사용하여 분석하였다. 1,3-프로판디올의 생산은 LC/MS/MS에 의해 결정하였다. 균주 2의 경우에 4회 반복하였다.

[표 2]

상기 표에 나타난 바와 같이, 탄소원으로서의 수크로스로부터의 PDO 생산은 탄소원으로서의 글루코스로부터와 동일한 범위이다.

참고문헌 (본문에서 인용한 순서에 따름)

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> Method for the preparation of 1,3-propanediol from sucrose <130> 358570 D28689 <140> PCT/EP2011/061285 <141> 2011-07-05 <150> EP10305729.5 <151> 2010-07-05 <150> US61/361,455 <151> 2010-07-05 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 cccaagcttt gatggctcaa atcttcaatt ttagttctgg 40 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 ggaattctta accgtgacgg cgttcgaact caacc 35 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 cccaagcttt gacttctatg tataccgtgg gtgattatc 39 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 ggaattctta gcttttattc tgttcggcga acag 34 <210> 5 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60 ggtttacgcg aacaaattcc gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 6 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 ttagcgggcg gcttcgtata tacggcggct gacatccaac gtaatgtcat gattttcgcc 60 cagttgggtc atgccgtgct ccatatgaat atcctcctta g 101 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 ggcgtctcgc catacaacaa acgcacatcg ggc 33 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 gggctttgcc gacaccttct tcgttcttg 29 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 cgatgcacgt catgaacaac tttaatctgc acaccccaac ccg 43 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 ggcgtaaaaa gcttagcggg cggcttcgta tatacggcgg ctgacatcca acgtaatgtc 60 gtgattttcg 70 <210> 11 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc 60 atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg 98 <210> 12 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 ggacgtgaac agatgcggtg ttagtagtgc cgctcggtac cagtgcacca gaaaccataa 60 ctacaacgtc acctttgtgc atatgaatat cctccttag 99 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 gcgtaacctt ttccctggaa cg 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 gcgttgctgg agcaacctgc cagc 24 <210> 15 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 ttcgtgtgcc ggacgagcta cccgccgtca atttcttgcg tgaagaaaac gtctttgtga 60 tgacaacttc tcgtgcgtct tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtg atctggtaga cgtaatagtt 60 gagccagttg gtaaacagta catatgaata tcctccttag 100 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 tcaccttcaa catgcaggct cgacattggc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 ataaaaaagg cacccgaagg tgcctgaggt 30 <210> 19 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 19 cgggcaatat gtctctgtgt ggattaaaaa aagagtgtct gatagcagct tctgaactgg 60 ttaccttcct ggctcacctt cgggtgggcc tttctggtat actgtaggct ggagctgctt 120 cg 122 <210> 20 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 ccctgtcatt tttctccata atttcttcat aaaaaagccg ggctgcataa aagcaaaccc 60 ggcctgattg agataatgaa tagattcccg ggggaggcgc ccgcggatcc catatgaata 120 tcctccttag 130 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 gccatgccgc gctggtgttt ggtcgcg 27 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 gcgaccagaa ccagggaaag tgcg 24 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 23 tgctctagag tccgcgctgt gcaaatccag aatgg 35 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 cccaagctta actctctaca acagaaataa aaac 34 <210> 25 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 25 agaactagtg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aagtcgacgg 60 atcctaagga ggttataaat gaacaacttt aatctgcaca cccc 104 <210> 26 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 26 gagcccgggg cagaaaggcc cacccgaagg tgagccagtg tgatacgtag aattcttaat 60 taagttagct tttattctgt tcggcg 86 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 gtgcggcaaa gattgtggtg 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 28 gccagttttt ctgcgtgtgc c 21 <210> 29 <211> 100 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 29 ggtggaacaa cggatcaaca gcgggcaagg gatccgcgtc actcttcccc cttcacgacc 60 ttcaataata tgcaatgcag tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 30 <211> 100 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 30 atggcttcat taaaggatgt cgcacgcctg gcgggagtgt cgatgatgac agtctcccgg 60 gtgatgcata atgcagaatc catatgaata tcctccttag 100 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 31 cgatacatca tccgtggaag 20

Claims

- 4-히드록시-2-케토부티레이트를 발현이 증진된 내인성 유전자 또는 이종 유전자에 의해 코딩되는 2-케토산 데카르복실라제 활성을 갖는 효소로 탈카르복실화시키는 제1 단계, 및 제1 단계에서 탈카르복실화시켜 수득한 3-히드록시프로피온알데히드를 히드록시 알데히드 리덕타제 활성을 갖는 효소로 환원시키는 제2 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올의 생산을 위한 2-단계 대사 경로, 및
- 미생물이 단일 탄소원으로 수크로스를 이용할 수 있도록 하는, PTS 수크로스 이용 시스템 또는 비-PTS 수크로스 이용 시스템 또는 둘 모두를 코딩하는 기능적 유전자
를 포함하는, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 생물생산을 위해 유전자 변형된 미생물.
제1항에 있어서, 유전자 scrKYABR 또는 scrKYAB의 도입으로 변형된 미생물.
제2항에 있어서, 유전자 scrKYABR 또는 scrKYAB가 살모넬라(Salmonella)로부터인 미생물.
제1항에 있어서, 유전자 cscBKAR 또는 cscBKA의 도입으로 변형된 미생물.
제4항에 있어서, 유전자 cscBKAR 또는 cscBKA가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터인 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수크로스로부터의 4-히드록시-2-케토부티레이트의 생산이 미생물에서 개선되는 것인 미생물.
제6항에 있어서, 호모세린 트랜스아미나제 또는 호모세린 옥시다제의 발현이 증가되는 것인 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물.
제8항에 있어서, 상기 박테리아가 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)로부터 선택되는 것인 미생물.
제9항에 있어서, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜라이인 미생물.
- 수크로스를 포함하는 적절한 배양 배지 상에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
를 포함하는, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 발효적 생산을 위한 방법.
- 수크로스를 포함하는 적절한 배양 배지 상에서 제6항에 따른 미생물을 배양하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계
를 포함하는, 수크로스로부터의 1,3-프로판디올의 발효적 생산을 위한 방법.
제11항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이인 방법.
제11항에 있어서, 1,3-프로판디올을 추가로 정제하는 방법.