WO2020090017A1 - １，３－プロパンジオールの製造方法 - Google Patents

１，３－プロパンジオールの製造方法 Download PDF

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WO2020090017A1
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山本　啓介
享成 土坂
修平 中根
徹 中屋敷
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Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 株式会社
Ｎａｔｕｒａｌ Ｂｅａｕｔｙ株式会社
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    • C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)
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    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01001—Alanine dehydrogenase (1.4.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 1,3-propanediol.
  • bioresources which are renewable resources, as raw materials in place of petroleum resources, which are considered to be the cause of global warming. Therefore, for the purpose of producing chemical products from bio-derived raw materials such as sugars, research for producing chemical products used for industrial raw materials, fuels, feeds, food additives, etc. using microorganisms and their transformants. Is being actively practiced. For example, it has been reported that a transformant of yeast or Escherichia coli is used to produce an organic compound such as an alcohol or an amino acid from a saccharide (see US Pat. No. 9926577 and US Pat. No. 8647847).
  • the present invention aims to provide a novel method for producing organic compounds.
  • the production of chemical products using microorganisms is generally limited to microbial metabolites as the production target.
  • microbial metabolites even among microbial metabolites, there are many microbial metabolites that are difficult to produce due to lack of energy in the microbial metabolism system and imbalance of redox balance.
  • One effective approach to solve such a problem is to create a transformant.
  • the present inventors believe that it may take a long time to develop a bacterium capable of producing a target compound if the problem is solved only by this method.
  • various compounds other than microbial metabolites will be required to be produced from biological raw materials. Therefore, the present inventors examined the development of a new process that does not rely only on the production of transformants of microorganisms for the production of useful substances.
  • the inventors have found a production process for obtaining 1,3-propanediol by culturing a microorganism having a specific gene in the presence of formaldehyde, and completed the present invention.
  • genes (A) a first gene encoding an enzyme that catalyzes an aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde, The presence of saccharides and formaldehyde in a microorganism containing (b) a second gene encoding an enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid, and (c) a third gene encoding an enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde.
  • a method for producing 1,3-propanediol which comprises culturing below to produce 1,3-propanediol.
  • a method for producing 1,3-propanediol using a microorganism is provided.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a process in which a microorganism produces 1,3-propanediol.
  • the method for producing 1,3-propanediol is The following genes: (A) a first gene encoding an enzyme that catalyzes an aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde, The presence of saccharides and formaldehyde in a microorganism containing (b) a second gene encoding an enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid, and (c) a third gene encoding an enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde. Culturing under to produce 1,3-propanediol.
  • the above-mentioned microorganism containing the first, second and third genes is also referred to as "1,3-propanediol producing microorganism".
  • the 1,3-propanediol-producing microorganism may be a microorganism that naturally has the first, second and third genes, or may be obtained by transforming a host with the first, second and third genes.
  • the microorganism may be a microorganism.
  • a case where the 1,3-propanediol-producing microorganism is a transformant will be described as an example.
  • Transformant 1.1
  • Any host microorganism can be used as a host.
  • the host for example, yeast, bacteria, more specifically aerobic bacteria, more specifically coryneform bacteria, Escherichia coli, or Vibrio natriegens can be used.
  • the host is a coryneform bacterium.
  • Coryneform bacteria are a group of microorganisms defined in Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, Vol.8, 599 (1974), and are under normal aerobic conditions. There is no particular limitation as long as it proliferates. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus and the like. Among the coryneform bacteria, Corynebacterium is preferable.
  • Corynebacterium examples include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, and Corynebacterium alkano.
  • Riticom Corynebacterium alkanolyticum
  • Corynebacterium glutamicum is preferable because of its high productivity of 1,3-propanediol.
  • Suitable strains include ATCC13032 strain, ATCC13869 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 strain, ATCC13287 strain, ATCC13655 strain, ATCC13745 strain, ATCC13746 strain, ATCC13761 strain, ATCC14020 strain, ATCC31831 strain, MJ-233. (FERMBP-1497), MJ-233AB-41 (FERMBP-1498) and the like. Among them, ATCC13032 strain and ATCC13869 strain are preferable.
  • coryneforms such as Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium. Bacteria are also unified in corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) [Liebl, W. et al. , And Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Sysst Bacteriol. 41: 255-260. (1991), Komagata K. et al., Coryneform bacteria classification, fermentation and industry, 45: 944-963 (1987) ].
  • Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain of old classification Brevibacterium flavum MJ-233 strain (FERM BP-1497), MJ-233AB-41 strain (FERM BP-1498), etc. are also suitable Corynebacterium glutamicum. ..
  • Brevibacterium genus include Brevibacterium ammoniagenes (eg ATCC 6872 strain) and the like.
  • Arthrobacter examples include Arthrobacter globiformis (eg, ATCC8010 strain, ATCC4336 strain, ATCC21056 strain, ATCC31250 strain, ATCC31738 strain, ATCC35698 strain).
  • Mycobacterium bovis for example, ATCC19210 strain, ATCC27289 strain
  • Mycobacterium bovis for example, ATCC19210 strain, ATCC27289 strain
  • Micrococcus genus bacteria include Micrococcus freudenreichii (for example, No.239 strain (FERM P-13221)), Micrococcus leuteus (for example, No.240 strain (FERM P-13222)), and Micrococcus freudenreichii.
  • Micrococcus ureae for example, IAM1010 strain
  • Micrococcus roseus for example, IFO3764 strain
  • the first gene encodes "an enzyme that catalyzes the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde".
  • Enzyme that catalyzes the aldol reaction between pyruvic acid and aldehyde is an enzyme reaction containing purified protein, pyruvic acid (initial substrate concentration 1 mM) and aldehyde (initial substrate concentration 1 mM) as the enzyme reaction solution according to the measurement method described below.
  • the aldehyde in the "enzyme that catalyzes the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde” is, for example, formaldehyde.
  • the “enzyme that catalyzes the aldol reaction of pyruvic acid and an aldehyde” is, for example, aldolase.
  • the first gene may be a gene encoding an aldolase exemplified below.
  • Examples of the aldolase contained in (a1), (a2), (a3) and (a4) include eda protein.
  • the eda protein is from E. coli.
  • Examples of the aldolase contained in (a2) include dgoA protein.
  • the dgoA protein is from E. coli.
  • Examples of the aldolase contained in (a5) include yjhH protein.
  • the yjhH protein is from E. coli.
  • Examples of the aldolase contained in (a6) include yagE protein.
  • the yagE protein is from E. coli.
  • Examples of the aldolase contained in (a7) include nanA protein.
  • the nanA protein is from E. coli.
  • the aldolase contained in (a8) include mhpE protein.
  • the mhpE protein is from E. coli.
  • the aldolase contained in (a8) and (a10) include hpaI protein.
  • the hpaI protein is from E. coli.
  • the aldolase contained in (a8) and (a14) include bphI protein.
  • the bphI protein is from Burkholderia xenovorans.
  • the bphI gene may be introduced into the host in a state linked to the bphJ gene.
  • the aldolase contained in (a9) include phdJ protein.
  • the phdJ protein is derived from Nocardioides sp.
  • the aldolase contained in (a11) include garL protein.
  • the garL protein is from E. coli.
  • the aldolase contained in (a12) include rhmA protein.
  • the rhmA protein is from E. coli.
  • Examples of the aldolase contained in (a13) include galC protein.
  • the galC protein is from Pseudomonas putida.
  • the first gene may encode a class I aldolase or a class II aldolase.
  • class I aldolases include eda protein, yjhH protein, yagE protein, dgoA protein, nanA protein, mphE protein and phdJ protein.
  • class II aldolases include hpaI protein, garL protein, rhmA protein, galC protein and bphI protein.
  • the first gene is selected from the group consisting of: (1-1) A gene encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (that is, an hpaI protein derived from Escherichia coli), which protein catalyzes the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde, (1-2) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2, which encodes a protein having the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde Gene to (1-3) a gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (that is, a rhmA protein derived from Escherichia coli), which encodes a protein that catalyzes an aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde, (1-4) A protein consisting of an amino acid sequence in which
  • “1 or several” in the expression “1 or several amino acids are deleted, substituted, or added” means that the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein or the type of amino acid residue although different, it means preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, further preferably 1 to 15, further preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the above-mentioned deletion, substitution, or addition of one or several amino acids is, for example, a conservative mutation in which the function of the protein is normally maintained.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • a conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid and a Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • substitution considered as a conservative substitution, specifically, substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp substitution Substitution, Gly to Pro, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, Ile to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg substitution, Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala Substitution, Thr to Ser or Ala, Trp to Phe or Tyr, Tyr to His, Phe or Tr
  • a gene which encodes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 and having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde is , “80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, further preferably 98% or more, further preferably 99% based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may be a "gene encoding a protein having an amino acid sequence having the above homology, which encodes a protein having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde.”
  • a gene comprising a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 4, which encodes a protein having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde is , “80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, further preferably 98% or more, further preferably 99% based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It may be a "gene encoding a protein having an amino acid sequence having the above homology, which encodes a protein having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde.”
  • a gene comprising a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 6, which encodes a protein having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde is , “Amino acid having 80% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, further preferably 98% or more, further preferably 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. It may be a "gene encoding a protein having a sequence and having the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde".
  • the E. coli-derived hpaI protein UniprotKB accession number is, for example, Q47098
  • the E. coli-derived rhmA protein UniprotKB accession number is, for example, P76469
  • the E. coli-derived nanA protein UniprotLbP0abionionNumber is 4PbKB accession number.
  • the first gene is An hpaI gene derived from Escherichia coli, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, The rhmA gene derived from Escherichia coli, which consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or the nanA gene derived from E. coli, which consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are as follows.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are as follows.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 are as follows.
  • PSI-Blast or PHI-Blast can be used to perform an iterated search that detects positional relationships (Id.) Between molecules and relationships between molecules that share a common pattern.
  • BLAST Altschul et al.
  • Gapped BLAST the default parameters of each program can be used. See http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde is performed by, for example, performing the enzyme reaction in 100 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium chloride at 25 ° C. It can be calculated by measuring the initial production rate of the aldol compound produced from the aldehyde. The production rate of the aldol compound can be calculated, for example, from the time change of the concentration of the aldol compound itself.
  • the activity of forming 1 ⁇ mol of the aldol compound in 1 minute at 25 ° C. is defined as 1 unit.
  • a gene consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 and which encodes a protein having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde (hereinafter , HpaI gene variant) "can be selected from a DNA library of another species by PCR or hybridization using a primer or probe designed according to the information based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The gene thus selected encodes a protein having an activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde with high probability.
  • a gene that encodes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 4 and having an activity of catalyzing an aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde
  • the “gene variant)” can be selected from a DNA library of another species by a method similar to the above-mentioned method for selecting the hpaI gene variant.
  • a gene consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 6 and which encodes a protein having an activity to catalyze the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde (nanA
  • the “gene variant)” can be selected from a DNA library of another species by a method similar to the above-mentioned method for selecting the hpaI gene variant.
  • the second gene encodes “an enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid”. “An enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid” means that an enzyme reaction solution containing purified protein and ⁇ -keto acid (initial substrate concentration 1 mM) is used as the enzyme reaction solution according to the measurement method described below. An enzyme having an activity of 1 mU / mg protein or more when measured.
  • the second gene encodes, for example, an enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid obtained by the aldol reaction catalyzed by the protein encoded by the first gene.
  • the ⁇ -keto acid in the “enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid” is, for example, 4-hydroxy-2-oxobutyric acid.
  • the “enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid” is, for example, decarboxylase.
  • the second gene may be a gene encoding a decarboxylase exemplified below.
  • Examples of the decarboxylase contained in (b1) include pdc protein.
  • the pdc protein is from Zymomonas mobilis.
  • Examples of the decarboxylase contained in (b2) include mdlC protein.
  • the mdlC protein is from Pseudomonas putida.
  • Examples of the decarboxylase contained in (b3) include kivD protein.
  • the kivD protein is from Lactococcus lactis.
  • the second gene is selected from the group consisting of: (2-1) A gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (that is, mdlC protein derived from Pseudomonas putida), which encodes a protein that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid, and (2) -2) A gene comprising a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 8 and which encodes a protein having an activity of catalyzing the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid. .
  • a gene which encodes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 8 and having an activity of catalyzing the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid is , “80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, further preferably 98% or more, further preferably 99% based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. It may be a "gene encoding a protein having an amino acid sequence having the above-mentioned homology and having an activity of catalyzing the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid".
  • UniprotKB accession number of mdlC protein derived from Pseudomonas putida is, for example, P20906.
  • the second gene is the Pseudomonas putida-derived mdlC gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 are as follows.
  • the activity of catalyzing the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid is, for example, 100 mM potassium phosphate buffer containing 0.5 mM thiamine pyrophosphate, 1 mM magnesium chloride, 10 mM NADH and an excess amount of alcohol dehydrogenase (pH 6. It can be calculated by measuring the initial production rate of an alcohol compound produced by sequentially reducing the aldehyde compound produced from the raw material ⁇ -keto acid at 30 ° C. in 0). The production rate of the alcohol compound can be calculated, for example, from the change over time in the concentration of the alcohol compound itself.
  • the concentration of the alcohol compound can be measured, for example, by detecting the alcohol compound using high performance liquid chromatography and comparing it with a standard product having a known concentration.
  • the activity of decarboxylating 1 ⁇ mol of ⁇ -keto acid per minute at 30 ° C. is defined as 1 unit.
  • a gene (mdlC which encodes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 8 and having an activity of catalyzing the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid)
  • the “gene variant)” can be selected from a DNA library of another species by a method similar to the above-mentioned method for selecting the hpaI gene variant.
  • the third gene encodes “an enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde”.
  • “Enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde” means 10 mU / when measured by an enzyme reaction solution containing purified protein and aldehyde (initial substrate concentration 1 mM) An enzyme having an activity equal to or higher than mg protein.
  • the aldehyde in the "enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde” is specifically different from the aldehyde that is the substrate of the aldol reaction catalyzed by the enzyme encoded by the first gene.
  • the third gene encodes, for example, an enzyme that catalyzes the reduction reaction of the aldehyde obtained by the decarboxylation reaction catalyzed by the protein encoded by the second gene.
  • the aldehyde in the "enzyme which catalyzes the reduction reaction of aldehyde” is, for example, 3-hydroxypropionaldehyde.
  • the “enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde” is, for example, alcohol dehydrogenase.
  • the third gene may be, for example, a gene encoding 1,3-propanediol dehydrogenase (1,3-propanediol dehydrogenase, EC number 1.1.1.102).
  • 1,3-propanediol dehydrogenase examples include dhaT protein and lpo protein.
  • the dhaT protein is derived from Klebsiella pneumoniae.
  • the lpo protein is derived from Lactobacillus reuteri.
  • the third gene is selected from the group consisting of: (3-1) A gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (that is, dhaT protein derived from Klebsiella pneumoniae), which encodes a protein that catalyzes a reduction reaction of aldehyde, and (3-2) sequence A gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in No. 10, and which has an activity of catalyzing the reduction reaction of aldehyde.
  • SEQ ID NO: 10 that is, dhaT protein derived from Klebsiella pneumoniae
  • sequence A gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in No. 10, and which has an activity of catalyzing the reduction reaction of aldehyde.
  • a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 10 and having an activity of catalyzing the reduction reaction of aldehyde is defined as "SEQ ID NO: 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, further preferably 98% or more, more preferably 99% or more homology to the amino acid sequence of 10. It may be a "gene encoding a protein having an activity of catalyzing the reduction reaction of aldehyde", which is composed of an amino acid sequence having
  • Klebsiella pneumoniae-derived dhaT protein UniprotKB accession number is, for example, Q59477.
  • the third gene is the Klebsiella pneumoniae-derived dhaT gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 are as follows.
  • the activity of catalyzing the reduction reaction of aldehyde is performed, for example, by performing the enzyme reaction in 50 mM MES-NaOH buffer (pH 6.5) containing 0.2 mM NADH at 30 ° C. to reduce the raw material aldehyde to an alcohol compound. It can be calculated by measuring the initial consumption rate of NADH consumed during the operation. The initial consumption rate of NADH can be calculated, for example, by measuring the rate of decrease in absorbance at 340 nm derived from NADH in the enzyme reaction solution.
  • the activity of reducing 1 ⁇ mol of aldehyde per minute at 30 ° C. is defined as 1 unit.
  • a gene (dhaT gene mutant) encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 10 and having an activity to catalyze the reduction reaction of aldehydes Can be selected from a DNA library of another species by a method similar to the above method for selecting hpaI gene variants.
  • the first, second and third genes can be incorporated into a suitable plasmid vector for transformation.
  • the plasmid vector a known plasmid vector can be used depending on the host.
  • the plasmid vector may contain a gene that controls the autonomous replication function in the host, or may contain a base sequence necessary for integration into the host chromosome.
  • the first, second, and third genes may be integrated into individual plasmid vectors or may be integrated into the same plasmid vector.
  • a transformant can be prepared using the obtained recombinant vector.
  • Transformation As a transformation method, a known method can be used without limitation. Such known methods include, for example, calcium chloride / rubidium chloride method, calcium phosphate method, DEAE-dextran mediated transfection, electric pulse method and the like.
  • the obtained transformant may be cultured immediately after transformation using a medium usually used for culturing the transformant.
  • the culture temperature may be any temperature as long as it is a temperature suitable for the growth of transformants.
  • the pH of the medium may be any pH as long as it is a pH suitable for the growth of transformants.
  • the pH of the medium can be adjusted by a known method.
  • the pH of the medium can be appropriately adjusted during the culturing, if necessary.
  • the culture time may be any time as long as it is a time sufficient for the transformant to grow.
  • each of the first, second, and third genes may be integrated into the host chromosome, or the recombinant vector may be used. May be present in the cytoplasm of the host.
  • the host may be a wild strain, a mutant strain thereof, or an artificial gene recombinant.
  • the host may be a gene-disrupted strain or a gene-deleted strain obtained by disrupting or deleting at least one of the following genes originally possessed by the wild-type coryneform bacterium.
  • lactate dehydrogenase eg ldhA gene
  • phosphoenolpyrvate carboxylase eg ppc
  • pyruvate carboxylase eg pyc
  • pyruvate dehydrogenase pyruvate dehydrogenase
  • poxB glutamate-pyruvate aminotransferase (eg alaA) gene
  • acetolactate synthase eg ilvB
  • N-succinate N-succinyldiaminopimelate aminotransferase eg, cg0931
  • S- (hydroxymethyl) mycothiol dehydrogenase eg, adhE
  • acetaldehyde dehydrogenase eg, ald
  • Construction of a gene-disrupted strain or a gene-deficient strain can be performed by a known method.
  • a 1,3-propanediol-producing microorganism (for example, the above-mentioned transformant) can be cultured in the presence of sugar and formaldehyde to produce 1,3-propanediol.
  • the "culturing in the presence of sugar and formaldehyde” can be performed by culturing in a culture medium containing sugar and formaldehyde.
  • "culturing in the presence of saccharide and formaldehyde” can be performed by culturing in a culture medium containing saccharide and formaldehyde.
  • culturing under aerobic conditions means culturing under conditions in which oxygen is supplied to the culture medium in an amount sufficient for the growth of transformants during the culturing period.
  • Culturing under aerobic conditions can be performed by a known method.
  • Culturing under aerobic conditions can be realized by supplying oxygen to the culture medium by, for example, aeration, stirring, shaking, or a combination thereof. More specifically, the culture under aerobic conditions can be realized by shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the proliferation culture and the subsequent production culture can be performed as follows, for example.
  • a container containing the culture solution used for the growth culture hereinafter, referred to as the growth culture solution
  • the transformant suspended in the growth culture solution is centrifuged to transform the culture.
  • the body can be precipitated.
  • the culture medium for growth is removed from the container, the separated transformant is suspended in a culture medium used for production culture (hereinafter, referred to as a culture medium for production), and production culture can be performed.
  • the growth culture and the subsequent production culture after the growth culture, saccharides and formaldehyde are added to the growth medium containing the transformant, and the aerobic condition is changed to the anaerobic condition or the microaerobic condition. By doing so, production culture can be performed without exchanging the culture solution. In this way, the growth culture and the production culture can be continuously performed.
  • culture means maintaining a transformant under specific controlled conditions suitable for growth of the transformant.
  • the transformant may or may not grow during the culture period. Therefore, the term “culture” can be referred to as "incubation”.
  • Culture medium for proliferation As the culture medium for proliferation, a medium usually used for culturing transformants, for example, a known medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like can be used.
  • the culture temperature in the growth culture may be any temperature as long as it is a temperature suitable for growing the transformant.
  • the pH of the culture medium for growth may be any pH as long as it is a pH suitable for the growth of transformants.
  • the pH of the culture medium for growth can be adjusted by a known method.
  • the culture time in the growth culture may be any time as long as it is a time sufficient for the transformant to grow.
  • culture medium for production As the culture medium for production, a culture medium containing saccharides, formaldehyde, and other necessary components can be used. As other necessary components, for example, inorganic salts, carbon sources other than sugars, or nitrogen sources can be used.
  • the concentration of each component in the culture medium described herein refers to the final concentration in the culture medium at the time when each component is added.
  • any saccharide can be used as long as it can be taken into the living body by the transformant and can be converted into pyruvic acid.
  • the saccharides monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose and galactose; disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose and trehalose; polysaccharides such as starch; molasses Etc. Of these, monosaccharides are preferable, and fructose and glucose are more preferable.
  • a saccharide containing glucose as a constituent monosaccharide specifically, a disaccharide such as sucrose, an oligosaccharide containing glucose as a constituent monosaccharide, and a polysaccharide containing glucose as a constituent monosaccharide are also preferable.
  • the saccharides may be used alone or in combination of two or more.
  • sugars are saccharified liquids obtained by saccharifying non-edible agricultural wastes such as rice straw, bagasse, and corn stover, and energy crops such as switchgrass, napiergrass, and miscanus with saccharifying enzymes.
  • the concentration of sugars in the production medium can be as high as possible within the range that does not interfere with the production of 1,3-propanediol.
  • the concentration of saccharides in the culture medium for production is preferably in the range of 0.1 to 40 (w / v)%, more preferably in the range of 1 to 20 (w / v)%. Further, additional saccharides can be added according to the decrease in saccharides accompanying the production of 1,3-propanediol.
  • the concentration of formaldehyde in the culture medium for production is preferably in the range of 0.001 to 10 (w / v)%, more preferably in the range of 0.01 to 1 (w / v)%. .. Further, additional formaldehyde can be added according to the decrease in formaldehyde accompanying the production of 1,3-propanediol.
  • inorganic salts can be added.
  • metal salts such as phosphates, sulfates, magnesium, potassium, manganese, iron and zinc can be used.
  • the inorganic salt one kind may be used, or two or more kinds may be mixed and used.
  • the concentration of the inorganic salt in the culture broth for production varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v)%.
  • carbon sources other than sugars can be added if necessary.
  • sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol, glycerol and glycerin
  • organic acids such as acetic acid, fermentation, lactic acid, fumaric acid, maleic acid and gluconic acid
  • carbonization such as normal paraffin Hydrogen or the like can be used.
  • a nitrogen source can be added.
  • inorganic or organic ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate; urea; aqueous ammonia; nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate can be used.
  • corn steep liquor; meat extract; yeast extract; soybean hydrolysate; protein hydrolysate such as peptone, NZ-amine or casein hydrolysate; nitrogen-containing organic compounds such as amino acids can also be used.
  • the nitrogen source one kind may be used, or two or more kinds may be mixed and used.
  • the concentration of the nitrogen source in the culture broth for production varies depending on the nitrogen compound used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v)%.
  • vitamins can be added if necessary.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • Specific production broth includes glucose, formaldehyde, ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, iron (II) sulfate and manganese (II) sulfate, and has a pH of 6.0.
  • a medium having a can be used.
  • the production culture medium a culture medium obtained by adding a saccharide and formaldehyde to a base culture medium having the same composition as the growth culture medium used in the growth culture can also be used. In addition, when a sufficient amount of saccharide is present in the above-mentioned base culture solution, the saccharide may not be added.
  • the culture temperature in the production culture may be any temperature as long as it is a temperature suitable for producing 1,3-propanediol.
  • the culture temperature in the production culture is preferably about 20 to 50 ° C, more preferably about 25 to 47 ° C. Within the above temperature range, 1,3-propanediol can be efficiently produced.
  • the pH of the culture medium for production may be any pH as long as it is a pH suitable for producing 1,3-propanediol.
  • the pH of the production medium is preferably maintained within the range of about 6-8.
  • the pH of the production culture solution can be adjusted using, for example, an aqueous potassium hydroxide solution. During production culture, the pH of the production culture solution can be appropriately adjusted as necessary.
  • the culture time in the production culture may be any time as long as it is a time sufficient for the transformant to produce 1,3-propanediol.
  • the culture time in the production culture is preferably about 3 hours to 7 days, more preferably about 1 to 3 days.
  • the production culture may be performed under aerobic conditions, and may be performed under anaerobic conditions or microaerobic conditions. This is because the above-mentioned transformant has a pathway for producing 1,3-propanediol that works under aerobic conditions, anaerobic conditions, or microaerobic conditions.
  • the route for producing 1,3-propanediol is described in the section “(3.) Actions and effects” below.
  • Production culture is preferably carried out under anaerobic or microaerobic conditions.
  • the transformant When the transformant is cultured under anaerobic or microaerobic conditions, the transformant does not substantially grow, and 1,3-propanediol can be produced more efficiently.
  • “Anaerobic conditions or microaerobic conditions” refer to conditions in which the dissolved oxygen concentration in the culture medium for production is within the range of 0 to 2 ppm, for example.
  • the "anaerobic condition or microaerobic condition” preferably refers to a condition in which the dissolved oxygen concentration in the production medium is within the range of 0 to 1 ppm, more preferably the dissolved oxygen in the production medium. It refers to the condition that the concentration is within the range of 0 to 0.5 ppm.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution can be measured using, for example, a dissolved oxygen meter.
  • anaerobic conditions is a technical term that refers to conditions under which there are no electron acceptors such as dissolved oxygen and oxides such as nitric acid.
  • these electron acceptors are not sufficient, or due to the nature of the electron acceptors, transformants do not grow, and the carbon source supplied correspondingly is 1,3-propanediol. If it is used for production and its production efficiency can be increased, it is not necessary to adopt the above strict conditions.
  • Anaerobic conditions and microaerobic conditions can be realized by, for example, not passing gas containing oxygen, because oxygen supplied from the gas-liquid interface becomes insufficient for the growth of transformants.
  • it can be realized by aerating an inert gas, specifically nitrogen gas, into the culture medium for production.
  • it can be realized by sealing the container used for production culture.
  • the production culture is preferably carried out in a state in which the transformant is suspended at high density in the culture medium for production. By culturing the transformant in such a state, 1,3-propanediol can be produced more efficiently.
  • the “state in which the transformant is suspended in the culture medium for production at a high density” means, for example, that the transformant is contained in the culture medium for production and the weight% of wet cells of the transformant is 1 to 50 (w. / V) indicates a state of being suspended so as to fall within the range of%.
  • the “state in which the transformant is suspended in the culture medium for production at a high density” is preferably such that the transformant is contained in the culture medium for production and the weight% of wet cells of the transformant is 3 to 30 ( w / v) It refers to the state of being suspended so as to be in the range of%.
  • the production culture is carried out under a condition of anaerobic or microaerobic conditions in which the transformant is suspended in the culture medium for production at a high density.
  • 1,3 propanediol is produced in the production medium.
  • -Propanediol is produced.
  • 1,3-propanediol can be recovered by recovering the production medium, 1,3-propanediol can be further separated and purified from the production medium by a known method. Examples of such known methods include a distillation method, a concentration method, an ion exchange resin method, an activated carbon adsorption elution method, a solvent extraction method, a crystallization method and the like.
  • substances such as 4-hydroxy-2-oxobutyric acid produced by the aldol reaction catalyzed by the enzyme encoded by the first gene can also be recovered from the culture medium for production.
  • FIG. 1 schematically shows a process in which a 1,3-propanediol-producing microorganism produces 1,3-propanediol.
  • the saccharide is glucose
  • the 1,3-propanediol-producing microorganism 1 takes in glucose 2 and formaldehyde 3.
  • Glucose 2 is then converted to pyruvate 4 through glycolysis.
  • pyruvic acid 4 and formaldehyde 3 are converted into 4-hydroxy-2-oxobutyric acid 5 by the “enzyme that catalyzes the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde” encoded by the first gene.
  • 4-hydroxy-2-oxobutyric acid 5 is converted into 3-hydroxypropionaldehyde 6 by the “enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid” encoded by the second gene.
  • 3-hydroxypropionaldehyde 6 is converted into 1,3-propanediol 7 by the “enzyme that catalyzes the reduction reaction of aldehyde” encoded by the third gene. As described above, 1,3-propanediol is produced.
  • 1,3-propanediol is a compound that can be used as a polymer raw material, a cosmetic material, and an antifreeze liquid.
  • the saccharides are saccharifying enzymes such as monosaccharides such as fructose or glucose; disaccharides such as sucrose; polysaccharides such as polysaccharides containing glucose as a constituent monosaccharide; or plants (eg non-edible agricultural waste or energy crops).
  • the first gene encodes a type I aldolase.
  • the first gene encodes a type II aldolase.
  • the first gene encodes an aldolase selected from the group consisting of: (A1) 2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase, (A2) 2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase, (A3) 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase, (A4) (4S) -4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase ((4S) -4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase), (A5) 2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase, (A6) 2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase, (A7) 3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase, (A8) 4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase, (A9) 4- (2-carboxyphenyl) -2-oxobut-3-enoate aldolase (4- (2-carboxyphenyl) -2-o
  • the first gene is eda protein, preferably eda protein derived from E. coli; dgoA protein, preferably dgoA protein derived from E. coli; yjhH protein, preferably yjhH protein derived from E. coli; yagE protein, preferably E. coli-derived yagE protein; nanA protein, preferably E. coli-derived nanA protein; mhpE protein, preferably E. coli-derived mhpE protein; hpaI protein, preferably E.
  • coli-derived hpaI protein bphI protein, preferably Burk BphI protein from Horderia xenovorans; phdJ protein, preferably phdJ protein from Nocardioides genus; garL protein, preferably , A galL protein derived from Escherichia coli; a rhmA protein, preferably a rhmA protein derived from Escherichia coli, and a galC protein, preferably a galC protein derived from Pseudomonas putida [1] to [17]. ] The method according to any one of 1.
  • the first gene is selected from the group consisting of nanA protein, preferably nanA protein derived from E. coli; hpaI protein, preferably hpaI protein derived from Escherichia coli; and rhmA protein, preferably rhmA protein derived from E. coli.
  • the first gene is selected from the group consisting of: (1-1) A gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which encodes a protein that catalyzes the aldol reaction of pyruvic acid and an aldehyde, (1-2) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2, which encodes a protein having the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde Gene to (1-3) a gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, which encodes a protein that catalyzes the aldol reaction of pyruvic acid and an aldehyde, (1-4) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 4, which encodes a protein having the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruv
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which 4 amino acids have been deleted, substituted or added, and which encodes a protein having an activity to catalyze the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde; The method according to any one of [1] to [19].
  • the first gene is selected from the group consisting of: An hpaI gene derived from Escherichia coli, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, An Escherichia coli-derived rhmA gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an E.
  • coli-derived nanA gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5; The method according to any one of [1] to [20].
  • the second gene encodes the enzyme that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid obtained by the aldol reaction.
  • the second gene encodes a decarboxylase.
  • the second gene encodes a decarboxylase selected from the group consisting of: (B1) pyruvate decarboxylase, (B2) benzoylformate decarboxylase, and (b3) indolepyruvate decarboxylase; The method according to any one of [1] to [23].
  • the second gene is derived from a pdc protein, preferably a pdc protein derived from Zymomonas mobilis; an mdlC protein, preferably an mdlC protein derived from Pseudomonas putida; a kivD protein, preferably a kivD protein derived from Lactococcus lactis.
  • the second gene is selected from the group consisting of: (2-1) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and encoding a protein that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid, and (2-2) 1 or a number in SEQ ID NO: 8
  • a gene consisting of an amino acid sequence in which 4 amino acids have been deleted, substituted or added, and which has the activity of catalyzing the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid; The method according to any one of [1] to [26].
  • [28] The method according to any one of [1] to [27], wherein the second gene is a Pseudomonas putida-derived mdlC gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the third gene encodes the enzyme that catalyzes a reduction reaction of an aldehyde of a different kind from the aldehyde that is a substrate of the aldol reaction catalyzed by the enzyme encoded by the first gene [1] to The method according to any one of [28].
  • [30] The method according to any one of [1] to [29], wherein the third gene encodes the enzyme that catalyzes the reduction reaction of the aldehyde obtained by the decarboxylation reaction.
  • [31] The method according to any one of [1] to [30], wherein the third gene encodes alcohol dehydrogenase.
  • [32] The method according to any one of [1] to [31], wherein the third gene encodes 1,3-propanediol dehydrogenase.
  • the third gene is 1,3-propanediol selected from the group consisting of dhaT protein, preferably dhaT protein from Klebsiella pneumoniae; and lpo protein, preferably lpo protein from Lactobacillus reuteri.
  • the third gene is selected from the group consisting of: (3-1) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, which encodes a protein that catalyzes a reduction reaction of aldehyde, and (3-2) 1 or several amino acids in SEQ ID NO: 10.
  • the first gene is selected from the group consisting of: (1-1) A gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which encodes a protein that catalyzes the aldol reaction of pyruvic acid and an aldehyde, (1-2) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2, which encodes a protein having the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruvic acid and an aldehyde Gene to (1-3) a gene comprising a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, which encodes a protein that catalyzes the aldol reaction of pyruvic acid and an aldehyde, (1-4) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 4, which encodes a protein having the activity of catalyzing the aldol reaction between pyruv
  • the second gene is selected from the group consisting of: (2-1) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and encoding a protein that catalyzes the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid, and (2-2) 1 or a number in SEQ ID NO: 8 Gene consisting of an amino acid sequence in which 4 amino acids have been deleted, substituted or added, and which encodes a protein having an activity to catalyze the decarboxylation reaction of ⁇ -keto acid; and the third gene comprises: Selected from the group: (3-1) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, which encodes a protein that catalyzes a reduction reaction of aldehyde, and (3-2) 1 or several amino acids in S
  • the microorganism is an aerobic bacterium, preferably coryneform bacterium, more preferably Corynebacterium genus, more preferably Corynebacterium glutamicum [1] to [Corynebacterium glutamicum]. 36] The method according to any one of [36].
  • the microorganism is a lactate dehydrogenase gene, a phosphoenolpyrvate carboxylase gene, a pyruvate carboxylase gene, a pyruvate dehydrogenase gene, a glutamic acid- Pyruvate aminotransferase (glutamate-pyruvate aminotransferase) gene, acetolactate synthase gene, N-succinyldiaminopimelate aminotransferase gene, S- (hydroxymethyl) mycothiol dehydrogenase (S- (hydroxymethyl) ) mycothiol dehydrogenase) gene and at least one gene selected from the group consisting of acetaldehyde dehydrogenase gene
  • the method according to any one of [1] to [38], which is a defective strain of.
  • LB medium After 10 g of bactotryptone (manufactured by Difco), 5.0 g of yeast extract (manufactured by Difco), and 10 g of sodium chloride were dissolved in 1 L of water, and the pH was adjusted to 7.0 using a 5M aqueous sodium hydroxide solution, Liquid medium prepared by autoclave sterilization at 121 ° C. for 20 minutes.
  • Bactotryptone manufactured by Difco
  • yeast extract manufactured by Difco
  • sodium chloride 10 g and agar 15 g were dissolved and suspended in 1 L of water, and the pH was adjusted to 7.0 using a 5 M sodium hydroxide aqueous solution.
  • a solid medium prepared by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes, cooling to 50 ° C., dispensing to a Petri dish, and solidification by cooling.
  • BHIS medium Brain heart infusion (manufactured by Difco) 36 g and sorbitol 91 g were dissolved in 1 L of water, and the pH was adjusted to 7.0 with a 5 M aqueous sodium hydroxide solution, followed by autoclave sterilization at 121 ° C. for 20 minutes. Prepared liquid medium.
  • BHIS-GIT medium Brain heart infusion (manufactured by Difco) 36 g, glycine 8.0 g, isoniazid 1.3 g, Tween 80 3 mL, and sorbitol 91 g were dissolved in 1 L of water, and the pH was adjusted to 7.0 using a 5 M aqueous sodium hydroxide solution. Then, a liquid medium prepared by autoclave sterilization at 121 ° C. for 20 minutes.
  • TE buffer Trishydroxymethylaminomethane (1.2 g) and ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (0.37 g) were dissolved in 1 L of water and the pH was adjusted to 8 with 6M hydrochloric acid. A buffer solution prepared by autoclave sterilization at 121 ° C. for 20 minutes after adjusting to 0.
  • TG buffer A buffer solution prepared by dissolving 0.12 g of trishydroxymethylaminomethane and 10 g of glycerol in 1 L of water and adjusting the pH to 7.5 with 6M hydrochloric acid, followed by autoclave sterilization at 121 ° C. for 20 minutes. ..
  • BR buffer Potassium dihydrogen phosphate 0.50 g, dipotassium hydrogen phosphate 0.50 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.50 g, iron (II) sulfate heptahydrate 6.0 mg, manganese (II) sulfate monohydrate
  • a buffer obtained by dissolving 4.2 mg in 1.0 L of water and adjusting the pH to 7.0 with a 5 M aqueous potassium hydroxide solution.
  • DNA fragments were extracted and purified using NucleoSpin (registered trademark) Gel and PCR Clean-up (manufactured by Machray-Nagel) according to the instructions.
  • Plasmid extraction The plasmid was extracted and purified using NucleoSpin (registered trademark) Plasmid EasyPure (manufactured by Machray-Nagel) according to the instructions.
  • PCR PCR was performed according to the instruction using any of the following DNA polymerases and reagents attached thereto: PrimeSTAR (registered trademark) HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), PrimeSTAR (registered trademark) Max DNA Polymerase (Takara). Bios), Tks Gflex TM DNA Polymerase (Takara Bio).
  • Centrifugation was performed at 15,000 xg and 4 ° C for 5 minutes, and 500 ⁇ L of the aqueous layer was collected. To this, 300 ⁇ L of isopropanol was added, and the mixture was centrifuged at 15,000 ⁇ g and 4 ° C. for 5 minutes, and then the supernatant was removed. The genomic DNA obtained as a precipitate was washed by adding 500 ⁇ L of 70% ethanol, followed by centrifugation at 15000 ⁇ g and 4 ° C. for 5 minutes. This washing was repeated twice, and after drying at room temperature, the obtained genomic DNA was dissolved in 100 ⁇ L of TE buffer.
  • a glycerol stock of a Corynebacterium glutamicum ATCC13032-derived strain to be transformed was inoculated into A agar medium under aseptic conditions and cultured at 33 ° C.
  • the bacterial cells grown on the agar medium were inoculated into 10 mL of A medium and shake culture was performed at 33 ° C. to obtain a seed culture solution.
  • This seed culture was inoculated into 100 mL of BHIS medium prepared in a 500 mL flask so that the turbidity was 0.2.
  • the mixture was shaken at 33 ° C. and cultured until the turbidity reached 0.5 to 0.7.
  • This culture solution was centrifuged at 4 ° C. and 5500 ⁇ g for 20 minutes to remove the supernatant.
  • the collected cells were washed with 10 mL of TG buffer and centrifuged at 4500C and 5500 xg for 5 minutes to remove the supernatant. After this washing was carried out twice, it was washed with 10 mL of 10% glycerol aqueous solution and centrifuged at 4 ° C. and 5500 ⁇ g for 5 minutes to remove the supernatant.
  • the obtained bacterial cell pellet was suspended in 1 mL of 10% glycerol aqueous solution, dispensed 150 ⁇ L each into a sterilized 1.5 mL tube, frozen with liquid nitrogen, and stored as competent cells at ⁇ 80 ° C. .
  • the turbidity of the culture broth of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum was measured using Ultrospec 8000 (manufactured by GE Healthcare) at a wavelength of 610 nm.
  • Plasmid Construction (2-1) Gene Deletion Edition 2-1 (1) Construction of Plasmid for Gene Disruption Using pNIC28-Bsa4 (manufactured by Source BioScience) as a template, GEP007 (SEQ ID NO: 11) and GEP008 (SEQ ID NO: 12) A DNA fragment containing the sacB gene derived from Bacillus subtilis [Mol. Microbiol. , 6, 1195 (1992)] was amplified by the PCR method. This PCR product was treated with BamHI and PstI, subjected to agarose gel electrophoresis, and then a DNA fragment was extracted and purified.
  • plasmid pHSG299 (manufactured by Takara Bio Inc.) having a gene conferring resistance to kanamycin was treated with BamHI and PstI, and after agarose gel electrophoresis, a DNA fragment was extracted and purified. These two DNA fragments were ligated with each other using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the instructions, and a plasmid pGE015 was obtained.
  • PrimeSTAR registered trademark
  • pGE015 was prepared using pGE015 as a template and the DNAs of the nucleotide sequences shown in GEP808 (SEQ ID NO: 13) and GEP809 (SEQ ID NO: 14).
  • Mutagenesis and plasmid amplification were carried out using Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the instructions, and pGE209 was obtained.
  • ppc gene deletion strain Using pGE020, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was transformed by electroporation and kanamycin resistant on A medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin at 33 ° C. Selected strains. Next, the obtained kanamycin resistant strain was spread on Suc agar medium and cultured at 33 ° C. The grown colonies were further cultured in medium A, and a strain lacking the ppc gene was selected by colony PCR. This was named GES007.
  • pGE015 was treated with EcoRI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as when pGE020 was prepared was designated as pGE033.
  • pGE015 was treated with EcoRI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as that for preparing pGE020 was designated as pGE177.
  • pGE015 was treated with EcoRI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as when pGE020 was prepared was designated as pGE191.
  • pGE015 was treated with EcoRI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as when pGE020 was prepared was designated as pGE228.
  • pGE015 was treated with EcoRI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification.
  • a plasmid obtained by mixing these three DNA fragments and carrying out the same operation as when pGE020 was prepared was designated as pGE253.
  • pGE209 was treated with KpnI and BamHI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as when pGE020 was prepared was designated as pGE1171.
  • pGE209 was treated with KpnI and BamHI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification.
  • a plasmid obtained by mixing these three DNA fragments and carrying out the same operation as when pGE020 was prepared was designated as pGE1172.
  • a PCR product was obtained by the PCR method using the combination and the combination of the DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP437 (SEQ ID NO: 57) and GEP438 (SEQ ID NO: 58), which were subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. I went. These are DNA fragments containing the kanamycin resistance gene and the replication origin pUCori for Escherichia coli, respectively.
  • the Corynebacterium glutamicum NBRC12169 strain was obtained from the Biotechnology Center, National Institute of Technology and Evaluation, Institute of Product Evaluation Technology, cultured according to the attached instructions, and the cells were collected by centrifugation.
  • the bacterial cell pellet was washed with 1 mL of 10 mM Cyclohexylenedinitrilotetraacetic acid, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, centrifuged at 6,000 xg and 4 ° C for 5 minutes, and recovered again.
  • the cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of Buffer A1 containing 15 mg / mL lysozyme (supplied with NucleoSpin (registered trademark) Plasmid EasyPure manufactured by Machray-Nagel Co., Ltd.) and shaken at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the pCG1 plasmid was extracted and purified according to the instructions of NucleoSpin (registered trademark) Plasmid EasyPure.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP445 (SEQ ID NO: 59) and GEP446 (SEQ ID NO: 60), which was extracted after agarose gel electrophoresis. , Purified. This is a DNA fragment containing the replication origin pCG1ori for Corynebacterium.
  • the above three DNA fragments were mixed, and the DNA fragment binding reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions.
  • E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions.
  • the transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. This transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and the obtained culture suspension was used for plasmid extraction.
  • the plasmid thus obtained was designated as pGE403.
  • PCR products were obtained by the PCR method, and these were subjected to agarose gel electrophoresis. After that, extraction and purification were performed.
  • PCR product was obtained by a PCR method using pFLAG-CTC (manufactured by Sigma-Aldrich) as a template and using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP467 (SEQ ID NO: 63) and GEP468 (SEQ ID NO: 64), These were subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These are DNA fragments containing the ATCC13032 strain gapA promoter (PgapA) and E. coli ribosomal RNA transcription terminator (TrrnB), respectively.
  • PgapA ATCC13032 strain gapA promoter
  • TrrnB E. coli ribosomal RNA transcription terminator
  • pGE403 was treated with BamHI and EcoRV, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and a DNA fragment ligation reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions. Using the reaction product, E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions. The transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. This transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and the obtained culture suspension was used for plasmid extraction. The thus obtained plasmid was designated as pGE409.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP2268 (SEQ ID NO: 65) and GEP2269 (SEQ ID NO: 66). After gel electrophoresis, extraction and purification were performed. This is a DNA fragment containing the Escherichia coli BL21 (DE3) strain hpaI gene (Ec_hpaI). Further, pET-15b (manufactured by Novagen) was treated with NdeI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification.
  • coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions.
  • the transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. This transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and the obtained culture suspension was used for plasmid extraction.
  • a plasmid pGE1143 in which Ec_hpaI was subcloned into pGE409 was obtained.
  • PCR products were obtained by the PCR method, and these were extracted after agarose gel electrophoresis. , Purified. This is a DNA fragment containing PgapA-hpaI-TrrnB. Furthermore, pGE1171 was treated with XhoI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These two DNA fragments were mixed, and a DNA fragment ligation reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions.
  • In-Fusion registered trademark
  • E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions.
  • the transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. This transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and the obtained culture suspension was used for plasmid extraction.
  • the plasmid thus obtained was designated as pGE1185.
  • pGE1186 Plasmid for constructing ⁇ ald :: hpaI-substituted strain
  • pGE1143 a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP2639 (SEQ ID NO: 71) and GEP2640 (SEQ ID NO: 72) was used. Then, PCR products were obtained by the PCR method, and these were subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. This is a DNA fragment containing PgapA-hpaI-TrrnB.
  • pGE1172 was treated with XhoI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification.
  • a plasmid obtained by mixing these two DNA fragments and carrying out the same operation as in the case of creating pGE1185 was designated as pGE1186.
  • pGE1185 was used to transform GES1052 by the electroporation method, and a strain in which PgapA-hpaI-TrrnB was inserted at the position of the adhE gene was selected by the same operation as in the production of GES1052. This was named GES1063.
  • GES435 was transformed by electroporation using pGE1171, and the strain selected by the same operation as when GES007 was created was named GES1042. Furthermore, pGE1186 was used to transform GES1042 by the electroporation method, and a strain in which the ald gene was replaced with PgapA-hpaI-TrrnB was selected by the same operation as in the production of GES1052. This was named GES1053. Using pGE1185, GES1053 was transformed by the electroporation method, and a strain in which PgapA-hpaI-TrrnB was inserted at the position of the adhE gene was selected by the same operation as in the preparation of GES1052. This was named GES1064.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP2765 (SEQ ID NO: 73) and GEP2766 (SEQ ID NO: 74), and these were subjected to agarose gel electrophoresis. After that, extraction and purification were performed. This is a DNA fragment containing the Escherichia coli DH5 ⁇ strain rhmA gene (Ec_rhmA). Further, pGE409 was treated with NdeI and BamHI, subjected to agarose gel electrophoresis, and then extracted and purified.
  • pGE1218 was treated with XhoI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These two DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as when pGE1185 was prepared was designated as pGE1304.
  • pGE1302 ( ⁇ ald :: rhmA Substitution Strain Construction Plasmid)
  • pGE1258 a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP2639 (SEQ ID NO: 71) and GEP2640 (SEQ ID NO: 72) was used.
  • PCR products were obtained by the PCR method, and these were subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification.
  • pGE1221 was treated with XhoI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. This is a DNA fragment containing PgapA-rhmA-TrrnB. These two DNA fragments were mixed, and the plasmid obtained by the same operation as when pGE1185 was prepared was designated as pGE1302.
  • E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) was purchased, and this was inoculated into LB agar medium under aseptic conditions and cultured at 37 ° C. The bacterial cells grown on the agar medium were inoculated into 10 mL of LB medium to collect the grown bacterial cells, and genomic DNA was extracted.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP2722 (SEQ ID NO: 75) and GEP2723 (SEQ ID NO: 76), and these were subjected to agarose gel electrophoresis. After that, extraction and purification were performed. This is a DNA fragment containing the E. coli DH5 ⁇ strain nanA gene (Ec_nanA). Further, pGE409 was treated with NdeI and BamHI, subjected to agarose gel electrophoresis, and then extracted and purified. These two DNA fragments were mixed, and a plasmid pGE1226 in which Ec_nanA had been cloned into pGE409 was obtained by the same operation as in the preparation of pGE1143.
  • telomere sequences shown in GEP2637 (SEQ ID NO: 69) and GEP2638 (SEQ ID NO: 70) PCR products were obtained by the PCR method, and these were extracted after agarose gel electrophoresis. , Purified. This is a DNA fragment containing PgapA-nanA-TrrnB.
  • pGE1218 was treated with XhoI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification.
  • a plasmid obtained by mixing these two DNA fragments and carrying out the same operation as in the preparation of pGE1185 was designated as pGE1272.
  • pGE1273 ( ⁇ ald :: nanA Substituted Strain Construction Plasmid)
  • pGE1226 As a template, a combination of DNAs having the nucleotide sequences represented by GEP2639 (SEQ ID NO: 71) and GEP2640 (SEQ ID NO: 72) was used. Then, PCR products were obtained by the PCR method, and these were subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. Further, pGE1221 was treated with XhoI, which was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. This is a DNA fragment containing PgapA-nanA-TrrnB. A plasmid obtained by mixing these two DNA fragments and performing the same operation as in the case of preparing pGE1185 was designated as pGE1273.
  • GES1042 was transformed by the electroporation method, and a strain in which the ald gene had been replaced with PgapA-nanA-TrrnB was selected by the same procedure as in the production of GES1052. This was named GES1189. Further, pGE1272 was used to transform GES1189 by an electroporation method, and a strain in which PgapA-nanA-TrrnB was inserted at the position of the adhE gene was selected by the same operation as in the production of GES1052. This was named GES1233.
  • the Corynebacterium casei JCM12072 strain was obtained from the RIKEN BioResource Research Center, cultured according to the attached instructions, and the cells were collected by centrifugation.
  • the bacterial cell pellet was suspended in 1 mL of 10 mM Cyclohexylenedinitrilotetracetic acid, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer, centrifuged at 6,000 xg at 4 ° C for 5 minutes, and recovered again.
  • the bacterial cell pellet was suspended in 300 ⁇ L of Buffer A1 containing 15 mg / mL lysozyme (attached to NucleoSpin (registered trademark) Plasmid EasyPure manufactured by Machray-Nagel Co., Ltd.) and shaken at 37 ° C. for 2 hours. Then, the pCASE1 plasmid was extracted and purified according to the instructions of NucleoSpin (registered trademark) Plasmid EasyPure.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP443 (SEQ ID NO: 77) and GEP444 (SEQ ID NO: 78), which was extracted after agarose gel electrophoresis. , Purified. This is a DNA fragment containing the replication origin pCASE1ori for Corynebacterium.
  • the above three DNA fragments were mixed, and the DNA fragment binding reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions.
  • E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions.
  • the transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. This transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and the obtained culture suspension was used for plasmid extraction.
  • the plasmid thus obtained was designated as pGE402.
  • PCR product was obtained by the PCR method, which was then subjected to agarose gel electrophoresis. After that, extraction and purification were performed.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using pFLAG-CTC (manufactured by Sigma-Aldrich) as a template and using a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP467 (SEQ ID NO: 63) and GEP468 (SEQ ID NO: 64), This was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These are DNA fragments containing the ldhA promoter (PldhA) and the Escherichia coli ribosomal RNA transcription terminator (TrrnB) of the ATCC13032 strain, respectively.
  • pFLAG-CTC manufactured by Sigma-Aldrich
  • pGE402 was treated with BamHI and EcoRV, subjected to agarose gel electrophoresis, and then extracted and purified. These three DNA fragments were mixed, and a DNA fragment ligation reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions. Using the reaction product, E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions. The transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin. This transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin, and the obtained culture suspension was used for plasmid extraction. The thus obtained plasmid was designated as pGE411.
  • a PCR product was obtained by a PCR method using pHSG298 (manufactured by TAKARA BIO INC.) As a template and a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP437 (SEQ ID NO: 57) and GEP438 (SEQ ID NO: 58). -After gel electrophoresis, extraction and purification were performed. These are DNA fragments containing the spectinomycin resistance gene and the replication origin pUCori for Escherichia coli, respectively.
  • the above two DNA fragments and the DNA fragment containing pCASE1ori obtained at the time of creating pGE402 were mixed, and the DNA fragment binding reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions. .. Using the reaction product, E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions.
  • the transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml spectinomycin. This transformant was cultured in an LB medium containing 100 ⁇ g / ml spectinomycin, and the resulting culture suspension was used for plasmid extraction.
  • the plasmid thus obtained was designated as pGE619.
  • PCR product was obtained by the PCR method, which was then subjected to agarose gel electrophoresis. After that, extraction and purification were performed.
  • PCR product was obtained by PCR using pFLAG-CTC (manufactured by Sigma-Aldrich) as a template and a combination of DNAs having the nucleotide sequences shown in GEP467 (SEQ ID NO: 63) and GEP2897 (SEQ ID NO: 83), This was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These are DNA fragments containing the ldhA promoter (PldhA) and the Escherichia coli ribosomal RNA transcription terminator (TrrnB) of the ATCC13032 strain, respectively.
  • pFLAG-CTC manufactured by Sigma-Aldrich
  • pGE619 was treated with BamHI and EcoRV, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These three DNA fragments were mixed, and a DNA fragment ligation reaction was performed using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit according to the instructions. Using the reaction product, E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions. The transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml spectinomycin. This transformant was cultured in an LB medium containing 100 ⁇ g / ml spectinomycin, and the resulting culture suspension was used for plasmid extraction. The plasmid thus obtained was designated as pGE945-2.
  • telomere sequences shown in GEP2653 SEQ ID NO: 86
  • GEP2654 SEQ ID NO: 87
  • a PCR product was obtained by the PCR method, which was extracted after agarose gel electrophoresis. , Purified.
  • pGE409 was treated with NdeI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These two DNA fragments were mixed, and a plasmid pGE1197 in which Pp_mdlC was subcloned into pGE409 was obtained by the same operation as that used in the preparation of GES1185.
  • pET-15b manufactured by Novagen
  • NdeI agarose gel electrophoresis
  • the pGE1150 was treated with NdeI and BamHI, and the 1.2 kb DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. Furthermore, pGE945-2 was treated with NdeI and BamHI, and this was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification. These two DNA fragments were mixed, and the Ligation high Ver. 2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used as instructed to perform the DNA fragment binding reaction. Using the reaction product, E. E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed according to the instructions.
  • the transformant of interest was selected by culturing on LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml spectinomycin. This transformant was cultured in an LB medium containing 100 ⁇ g / ml spectinomycin, and the resulting culture suspension was used for plasmid extraction. Thus, a plasmid pGE1190 in which Kp_dhaT was subcloned into pGE945-2 was obtained.
  • GES1063 was transformed by electroporation using pGE1197 and pGE1190, and a kanamycin-spectinomycin resistant strain was selected on A agar medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml spectinomycin at 33 ° C. .. This was named GES1077.
  • GES1064 was transformed by electroporation using pGE1197 and pGE1190, and a kanamycin-spectinomycin resistant strain was selected on A agar medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml spectinomycin at 33 ° C. .. This was named GES1068.
  • GES1242 was transformed by electroporation using pGE1197 and pGE1190, and a kanamycin-spectinomycin resistant strain was selected on A agar medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml spectinomycin at 33 ° C. .. This was named GES1282.
  • Corynebacterium glutamicum GES1068 has been deposited at the Patent Microorganism Depositary Center, Institute for Product Evaluation Technology, 2-5-8 Kazusa Kamasa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818). (Date: September 13, 2018, accession number: NITE BP-02780) GES1223 was transformed by electroporation using pGE1197 and pGE1190, and a kanamycin / spectinomycin resistant strain was selected on A agar medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml spectinomycin at 33 ° C. .. This was named GES1253.
  • GES1233 was transformed by electroporation using pGE1197 and pGE1190, and a kanamycin-spectinomycin resistant strain was selected on A agar medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 100 ⁇ g / ml spectinomycin at 33 ° C. .. This was named GES1254.
  • Corynebacterium glutamicum GES1254 was deposited at the Patent Microorganism Depositary Center, Institute for Product Evaluation and Technology, Incorporated Administrative Agency, 2-5-8 Kazusa Kamasa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (Zip Code 292-0818). (Date: September 13, 2018, accession number: NITE BP-02781) 4.
  • This seed culture was inoculated into 500 mL of BA medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and 100 ⁇ g / mL spectinomycin prepared in a 2 L flask so that the turbidity was 0.1.
  • the plate was shaken at 33 ° C. and cultured overnight.
  • This main culture liquid was centrifuged at 4 ° C. and 5500 ⁇ g for 15 minutes to remove the supernatant.
  • the wet bacterial cells thus obtained were used in the following reaction.
  • bacterial cells having a gene encoding a class 2 aldolase different from GES1077, such as GES1282 also contained saccharides and It was found that by culturing in the presence of an aldehyde, pyruvic acid was produced from a saccharide, and the enzyme catalyzed the aldol reaction between this and the aldehyde to produce an aldol compound represented by HOB. ..
  • This seed culture was inoculated into 500 mL of BA medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and 100 ⁇ g / mL spectinomycin prepared in a 2 L flask so that the turbidity was 0.1.
  • the plate was shaken at 33 ° C. and cultured overnight.
  • This main culture liquid was centrifuged at 4 ° C. and 5500 ⁇ g for 15 minutes to remove the supernatant.
  • the wet bacterial cells thus obtained were used in the following reaction.
  • cells having a gene encoding a class 2 aldolase different from GES1077 and GES1068 such as GES1282 and capable of producing HOB when cultured in the presence of saccharides and formaldehyde further encode decarboxylase and alcohol dehydrogenase. It was found that when carrying the gene, HOB can be further converted into PDO to produce PDO.

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Abstract

１，３－プロパンジオールの製造方法は、以下の遺伝子：（ａ）ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、（ｂ）α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、１，３－プロパンジオールを生産することを含む。

Description

１，３－プロパンジオールの製造方法
　本発明は、１，３－プロパンジオールの製造方法に関する。
　現在、地球温暖化の元凶と考えられている石油資源に代わり、再生可能資源である生物資源を原料として用いて化成品を生産することが強く望まれている。そのため、糖類などの生物由来原料から化成品を生産することを目的として、微生物およびその形質転換体を用いて、工業原料、燃料、飼料、食品添加物などに用いる化成品を生産するための研究が盛んに行われている。例えば、酵母や大腸菌の形質転換体を使用して、糖類からアルコールやアミノ酸などの有機化合物を製造することが報告されている（米国特許第9926577号、米国特許第8647847号を参照）。
　本発明は、有機化合物を製造する新規方法を提供することを目的とする。
　微生物を用いた化成品の生産は、その生産対象として微生物代謝物に限定されることが一般的である。また、微生物代謝物であっても、微生物代謝系中のエネルギー不足や酸化還元バランスの不均衡によって、生産が困難な微生物代謝物も多く存在する。このような課題を解決するための一つの有効なアプローチとして、形質転換体を作成することが挙げられる。しかし、本発明者らは、この手法のみによって課題解決しようとすると、対象化合物を生産できる菌体の開発に多くの時間がかかる場合があると考えている。一方、今後、微生物代謝物以外の多様な化合物も生物由来原料から生産することが求められてくると考えている。そこで本発明者らは、有用な物質の生産については微生物の形質転換体作成のみに依存しない、新規なプロセス開発を検討した。
　本発明者らが鋭意検討した結果、特定の遺伝子を有する微生物をホルムアルデヒドの存在下で培養することにより、１，３－プロパンジオールが得られる生産プロセスを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明によると、
　以下の遺伝子：
　（ａ）ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
　（ｂ）α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
　（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、１，３－プロパンジオールを生産することを含む、１，３－プロパンジオールの製造方法が提供される。
　本発明によると、微生物を用いて１，３－プロパンジオールを製造する方法が提供される。
微生物が１，３－プロパンジオールを生産するプロセスを示す模式図。
　以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を詳説することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。
　１，３－プロパンジオールの製造方法は、
　以下の遺伝子：
　（ａ）ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
　（ｂ）α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
　（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、１，３－プロパンジオールを生産することを含む。
　以下の説明において、第１、第２および第３遺伝子を含む上記微生物を、「１，３－プロパンジオール生産微生物」とも呼ぶ。１，３－プロパンジオール生産微生物は、第１、第２および第３遺伝子を生来的に有する微生物であってもよいし、宿主を第１、第２および第３遺伝子で形質転換することによって得られる微生物であってもよい。以下、１，３－プロパンジオール生産微生物が形質転換体である場合を例として説明する。
　（１．）形質転換体
　（１．１）宿主
　宿主としては、任意の微生物を使用することができる。宿主としては、例えば、酵母、細菌、より具体的には、好気性細菌、より具体的には、コリネ型細菌、大腸菌、またはビブリオ　ナトリエゲンス（Vibrio natriegens）を使用することができる。好ましくは、宿主はコリネ型細菌である。
　コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム　エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム　アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム　ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム　アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、１，３－プロパンジオールの生産性が高い点で、コリネバクテリウム　グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
　なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム　フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム　ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム　ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム　リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
　旧分類のブレビバクテリウム　ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム　フラバムのMJ-233株（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41株（FERM BP-1498）なども好適なコリネバクテリウム　グルタミカムである。
　ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム　アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
　アースロバクター属菌としては、アースロバクター　グロビフォルミス（Arthrobacterglobiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
　マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム　ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
　マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス　フロイデンライヒ（Micrococcusfreudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス　ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス　ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス　ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
　次に、宿主に導入される第１、第２および第３遺伝子について説明する。
　（１．２）第１遺伝子
　第１遺伝子は、「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」をコードする。「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質、ピルビン酸（初期基質濃度　1mM）およびアルデヒド（初期基質濃度　1mM）含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１０mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、例えば、ホルムアルデヒドである。「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」は、例えば、アルドラーゼである。
　第１遺伝子は、以下に例示するアルドラーゼをコードする遺伝子であってもよい。
　（ａ１）２－デヒドロ－３－デオキシ－ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase、ＥＣ番号：４．１．２．１４）、
　（ａ２）２－デヒドロ－３－デオキシ－６－ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５５）、
　（ａ３）４－ヒドロキシ－２－オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase、ＥＣ番号：４．１．３．１６）、
　（ａ４）（４Ｓ）－４－ヒドロキシル－２－オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．４２）、
　（ａ５）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．２８）、
　（ａ６）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５１）、
　（ａ７）３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．２３）、
　（ａ８）４－ヒドロキシル－２－オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．３９）、
　（ａ９）４－（２－カルボキシフェニル）－２－オキソブ－３－エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．３４）、
　（ａ１０）４－ヒドロキシ－２－オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５２）、
　（ａ１１）２－デヒドロ－３－デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．２０）、
　（ａ１２）２－ケト－３－デオキシ－Ｌ－ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase、ＥＣ番号４．１．２．５３）、
　（ａ１３）４－ヒドロキシル－４－メチル－２－オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．１７）、および
　（ａ１４）４－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase、ＥＣ番号４．１．３．４３）。
　（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）および（ａ４）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｅｄａタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｅｄａタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ２）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｄｇｏＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｄｇｏＡタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ５）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｙｊｈＨタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｙｊｈＨタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ６）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｙａｇＥタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｙａｇＥタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ７）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｎａｎＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｎａｎＡタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ８）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｍｈｐＥタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｍｈｐＥタンパク質は、大腸菌由来である。なお、第１遺伝子がｍｈｐＥ遺伝子である場合、ｍｈｐＥ遺伝子は、ｍｈｐＦ遺伝子と連結した状態で宿主に導入されてもよい。
　（ａ８）および（ａ１０）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｈｐａＩタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｈｐａＩタンパク質は大腸菌由来である。
　（ａ８）および（ａ１４）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｂｐｈＩタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｂｐｈＩタンパク質は、バークホルデリア　ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）由来である。なお、第１遺伝子がｂｐｈＩ遺伝子である場合、ｂｐｈＩ遺伝子は、ｂｐｈＪ遺伝子と連結した状態で宿主に導入されてもよい。
　（ａ９）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｐｈｄＪタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｐｈｄＪタンパク質は、ノカルディオイデス属菌（Nocardioides sp.）由来である。
　（ａ１１）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｇａｒＬタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｇａｒＬタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ１２）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｒｈｍＡタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｒｈｍＡタンパク質は、大腸菌由来である。
　（ａ１３）に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、ｇａｌＣタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｇａｌＣタンパク質は、シュードモナス　プチダ（Pseudomonas putida）由来である。
　第１遺伝子は、クラスＩのアルドラーゼをコードしてもよく、クラスＩＩのアルドラーゼをコードしてもよい。
　クラスＩのアルドラーゼとして、例えば、ｅｄａタンパク質、ｙｊｈＨタンパク質、ｙａｇＥタンパク質、ｄｇｏＡタンパク質、ｎａｎＡタンパク質、ｍｐｈＥタンパク質およびｐｈｄＪタンパク質が挙げられる。
　クラスＩＩのアルドラーゼとして、例えば、ｈｐａＩタンパク質、ｇａｒＬタンパク質、ｒｈｍＡタンパク質、ｇａｌＣタンパク質およびｂｐｈＩタンパク質が挙げられる。
　好ましくは、第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
　　（１－１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質）であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質）であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質）であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（１－６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
　本明細書において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加された」という表現における「１又は数個」は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、好ましくは１～６０個、より好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個を意味する。
　上記の１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加は、例えば、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の欠失、置換、若しくは付加には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　「配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
　「配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
　「配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
　大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは、例えばＱ４７０９８であり、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは、例えばＰ７６４６９であり、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは、例えばＰ０Ａ６Ｌ４である。
　より好ましくは、第１遺伝子は、
　配列番号１に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｈｐａＩ遺伝子、
　配列番号３に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｒｈｍＡ遺伝子、または
　配列番号５に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｎａｎＡ遺伝子
である。
　配列番号１に記載の塩基配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　配列番号３に記載の塩基配列と配列番号４に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　配列番号５に記載の塩基配列と配列番号６に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　アミノ酸配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol.,183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
　ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を２ｍＭの塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．０）中で２５℃にて行い、原料のピルビン酸とアルデヒドから生成するアルドール化合物の初期生成速度を測定することで算出できる。アルドール化合物の生成速度は、例えば、アルドール化合物自体の濃度の時間変化から算出できる。アルドール化合物の濃度の測定は、例えば、酵素反応液と１３０ｍＭのＯ－ベンジルヒドロキシアミン塩酸塩溶液（ピリジン：メタノール：水＝３３：１５：２）の溶液を１：５で混和することで反応を止め、その際アルドール化合物から生成するＯ－ベンジルオキシム誘導体を高速液体クロマトグラフィーを用いて検出し、濃度が既知の標品と比較することで可能である。ここでは、２５℃で１分間に１μｍｏｌのアルドール化合物が形成される活性を１ユニットとする。
　「配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、ｈｐａＩ遺伝子変異体という）」は、例えば、配列番号２の塩基配列に基づく情報に従い設計したプライマーまたはプローブを用いたＰＣＲまたはハイブリダイゼーションにより、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。このように選択した遺伝子は、高確率でピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードしている。
　「配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｒｈｍＡ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
　「配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｎａｎＡ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
　（１．３）第２遺伝子
　第２遺伝子は、「α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」をコードする。「α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびα－ケト酸（初期基質濃度　1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。第２遺伝子は、例えば、第１遺伝子がコードするタンパク質が触媒するアルドール反応により得られたα－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする。「α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」におけるα－ケト酸は、例えば、４－ヒドロキシ－２－オキソ酪酸である。「α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」は、例えば、脱炭酸酵素である。
　第２遺伝子は、以下に例示する脱炭酸酵素をコードする遺伝子であってもよい。
　（ｂ１）ピルベートデカルボキシラーゼ（pyruvate decarboxylase、ＥＣ番号４．１．１．１）、
　（ｂ２）ベンゾイルフォルメートデカルボキシラーゼ（benzoylformate decarboxylase、ＥＣ番号４．１．１．７）、および
　（ｂ３）インドールピルベートデカルボキシラーゼ（indolepyruvate decarboxylase、ＥＣ番号４．１．１．７４）。
　（ｂ１）に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、ｐｄｃタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｐｄｃタンパク質は、ザイモモナス　モビリス（Zymomonas mobilis）由来である。　
　（ｂ２）に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、ｍｄｌＣタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｍｄｌＣタンパク質は、シュードモナス　プチダ（Pseudomonas putida）由来である。　
　（ｂ３）に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、ｋｉｖＤタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｋｉｖＤタンパク質は、ラクトコッカス　ラクティス（Lactococcus lactis）由来である。
　好ましくは、第２遺伝子は以下からなる群より選択される：
　　（２－１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、シュードモナス　プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質）であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（２－２）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
　「配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
　シュードモナス　プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは、例えばＰ２０９０６である。
　より好ましくは、第２遺伝子は、配列番号７に記載の塩基配列からなる、シュードモナス　プチダ由来のｍｄｌＣ遺伝子である。
　配列番号７に記載の塩基配列と配列番号８に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を０．５ｍＭチアミンピロリン酸、１ｍＭ　塩化マグネシウム、１０ｍＭ　ＮＡＤＨ、過剰量のアルコールデヒドロゲナーゼを含有する１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で３０℃にて行い、原料のα－ケト酸から生成するアルデヒド化合物が逐次的に還元されて生じるアルコール化合物の初期生成速度を測定することで算出できる。アルコール化合物の生成速度は、例えば、アルコール化合物自体の濃度の時間変化から算出できる。アルコール化合物の濃度の測定は、例えば、当該アルコール化合物を高速液体クロマトグラフィーを用いて検出し、濃度が既知の標品とそれを比較することで可能である。ここでは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのα－ケト酸が脱炭酸される活性を１ユニットとする。
　「配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｍｄｌＣ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
　（１．４）第３遺伝子
　第３遺伝子は、「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」をコードする。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびアルデヒド（初期基質濃度　1mM）を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、１０mU/ｍｇ protein以上の活性を有する酵素をいう。なお、「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、具体的には、第１遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応の基質であるアルデヒドとは種類が異なる。第３遺伝子は、例えば、第２遺伝子がコードするタンパク質が触媒する脱炭酸反応により得られたアルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、例えば、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドである。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼである。
　第３遺伝子は、例えば、１，３－プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（1,3-propanediol dehydrogenase、ＥＣ番号１．１．１．２０２）をコードする遺伝子であってもよい。
　１，３－プロパンジオールデヒドロゲナーゼとしては、例えば、ｄｈａＴタンパク質またはｌｐｏタンパク質が挙げられる。好ましくは、ｄｈａＴタンパク質は、クレブシエラ　ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来である。また、好ましくは、ｌｐｏタンパク質は、ラクトバチルス　ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来である。
　好ましくは、第３遺伝子は以下からなる群より選択される：
　　（３－１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、クレブシエラ　ニューモニエ由来のｄｈａＴタンパク質）であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（３－２）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
　「配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」は、「配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」であってもよい。
　クレブシエラ　ニューモニエ由来のｄｈａＴタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒは、例えばＱ５９４７７である。
　より好ましくは、第３遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列からなる、クレブシエラ　ニューモニエ由来のｄｈａＴ遺伝子である。
　配列番号９に記載の塩基配列と配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　アルデヒドの還元反応を触媒する活性は、例えば、当該酵素反応を０．２ｍＭ　ＮＡＤＨを含有する５０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中で３０℃にて行い、原料のアルデヒドがアルコール化合物へ還元される際に消費されるＮＡＤＨの初期消費速度を測定することで算出できる。ＮＡＤＨの初期消費速度は、例えば、酵素反応液中のＮＡＤＨに由来する３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定することで算出できる。ここでは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのアルデヒドが還元される活性を１ユニットとする。
　「配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ｄｈａＴ遺伝子変異体）」は、ｈｐａＩ遺伝子変異体を選択する上記方法と同様の方法により、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができる。
　（１．５）形質転換のための組換えベクターの構築
　第１、第２、および第３遺伝子は、形質転換のために、適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
　プラスミドベクターとしては、宿主に応じて、公知のプラスミドベクターを使用することができる。プラスミドベクターとしては、宿主内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであってもよいし、宿主の染色体への組み込みに必要な塩基配列を含むものであってもよい。
　第１、第２および第３遺伝子は、各々個別のプラスミドベクターに組み込んでもよいし、あるいは同一のプラスミドベクターに組み込んでもよい。得られた組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
　（１．６）形質転換
　形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などが挙げられる。
　得られた形質転換体は、形質転換後速やかに、形質転換体の培養に通常使用される培地を用いて培養してもよい。
　培養温度は、形質転換体の増殖に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。培地のｐＨは、形質転換体の増殖に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。培地のｐＨの調整は、公知の方法によって行うことができる。培養中も必要に応じて培地のｐＨは、適宜調整することができる。培養時間は、形質転換体が増殖するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。
　なお、上述のとおりに組換えベクターを用いて形質転換体を作製した場合、第１、第２、および第３遺伝子の各々は、宿主の染色体に組み込まれてもよいし、あるいは、組換えベクターの形態で宿主の細胞質内に存在していてもよい。
　（１．７）宿主染色体遺伝子の破壊または欠失
　宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、野生株のコリネ型細菌が本来有する下記遺伝子の少なくとも一つを破壊または欠失させることにより得られた遺伝子破壊株または遺伝子欠失株であることが好ましい：ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase、例えばｌｄｈＡ）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase、例えばｐｐｃ）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase、例えばｐｙｃ）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase、 例えばｐｏｘＢ）遺伝子、グルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase、例えばａｌａＡ）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase、例えばｉｌｖＢ）遺伝子、Ｎ－スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase、例えばｃｇ０９３１）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase、例えばａｄｈＥ）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase、例えばａｌｄ）遺伝子。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより、１，３－プロパンジオールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
　遺伝子破壊株または遺伝子欠損株の構築は、公知の方法によって行うことができる。
　（２．）培養工程
　１，３－プロパンジオール生産微生物（例えば、上述した形質転換体）を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、１，３－プロパンジオールを生産することができる。「糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養すること」は、糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養すること」は、糖類およびホルムアルデヒドを添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
　糖類およびホルムアルデヒドの存在下での培養に先立ち、上述した形質転換体を好気的条件下で培養して増殖させることが好ましい。この好気的条件下での培養を、以下増殖培養と呼び、糖類およびホルムアルデヒドの存在下での培養を、以下生産培養と呼ぶ。具体的には、例えば、好気的条件下での培養とは、培養期間中に酸素が形質転換体の増殖に十分な量で培養液に供給されている条件下で培養することである。好気的条件下での培養は、公知の方法によって行うことができる。好気的条件下での培養は、例えば、通気、攪拌、振とう、またはこれらの組み合わせにより、培養液に酸素を供給することで実現できる。より具体的には、好気的条件下での培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養によって実現できる。
　生産培養に先立って増殖培養を行う場合、増殖培養とその後の生産培養は、例えば、以下のとおり行うことができる。増殖培養の後、先ず、増殖培養で使用した培養液（以下、増殖用培養液と呼ぶ）と増殖用培養液中に懸濁された形質転換体とを含む容器を遠心分離機にかけて、形質転換体を沈殿させることができる。その後、増殖用培養液を容器から除去し、分離された形質転換体を、生産培養で使用する培養液（以下、生産用培養液と呼ぶ）に懸濁し、生産培養を行うことができる。
　あるいは、増殖培養とその後の生産培養は、増殖培養の後、形質転換体を含有する増殖用培養液に糖類およびホルムアルデヒドを添加し、好気的条件を嫌気的条件または微好気的条件に変更することにより、培養液の交換を行うことなく生産培養を行うことができる。このように、増殖培養と生産培養とを連続的に行うこともできる。
　本明細書において、「培養」の用語は、形質転換体を、形質転換体の生育に適した特定の管理された条件の下で維持することを意味する。培養期間中に、形質転換体は増殖してもよいし、増殖しなくてもよい。したがって、「培養」の用語は、「インキュベーション」と言い換えることもできる。
　（２．１）増殖用培養液
　増殖用培養液は、形質転換体の培養に通常使用される培地、例えば、炭素源、窒素源および無機塩類等を含有する公知の培地を用いることができる。
　増殖培養における培養温度は、形質転換体の増殖に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。増殖用培養液のｐＨは、形質転換体の増殖に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。増殖用培養液のｐＨの調整は、公知の方法によって行うことができる。増殖培養における培養時間は、形質転換体が増殖するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。
　（２．２）生産用培養液
　生産用培養液としては、糖類、ホルムアルデヒド、及びその他必要な成分を含有する培養液を用いることができる。その他必要な成分として、例えば、無機塩類、糖類以外の炭素源、又は窒素源を用いることができる。本明細書に記載される、培養液中の各成分の濃度は、各成分が添加された時点における培養液中の最終濃度を指す。
　糖類としては、形質転換体が、生体内に取り込むことができ、かつピルビン酸へと変換することができる糖類であれば任意の糖類を使用することができる。具体的には、糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等が挙げられる。中でも、単糖が好ましく、フルクトースおよびグルコースがより好ましい。また、構成単糖としてグルコースを含む糖類、具体的には、スクロース等の二糖、構成単糖としてグルコースを含むオリゴ糖、構成単糖としてグルコースを含む多糖も好ましい。糖類は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。また、糖類は、稲わら、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化することにより得られた糖化液（これは、グルコースや、キシロース等の複数の糖類を含む）の形で添加することもできる。
　生産用培養液における糖類の濃度は、１，３－プロパンジオールの生産を阻害しない範囲で可能な限り高くすることができる。生産用培養液における糖類の濃度は、０．１～４０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることが好ましく、１～２０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることがより好ましい。また、１，３－プロパンジオールの生産に伴う糖類の減少に応じて、糖類の追加添加を行うことができる。
　生産用培養液におけるホルムアルデヒドの濃度は、０．００１～１０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることが好ましく、０．０１～１（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることがより好ましい。また、１，３－プロパンジオールの生産に伴うホルムアルデヒドの減少に応じて、ホルムアルデヒドの追加添加を行うことができる。
　さらに、必要に応じて、無機塩類を添加することもできる。無機塩類としては、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩を用いることができる。具体的には、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等を用いることができる。無機塩は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。生産用培養液中の無機塩類の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（ｗ／ｖ）％とすることができる。
　さらに、必要に応じて、糖類以外の炭素源を添加することもできる。糖類以外の炭素源としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；ノルマルパラフィンのような炭化水素等を用いることができる。
　さらに、必要に応じて、窒素源を添加することもできる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機のアンモニウム塩；尿素；アンモニア水；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩等を使用できる。また、コーンスティープリカー；肉エキス；酵母エキス；大豆加水分解物；ペプトン、NZ－アミンまたはカゼイン分解物等の蛋白質加水分解物；アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。生産用培養液中の窒素源の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（ｗ／ｖ）％とすることができる。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　具体的な生産用培養液としては、グルコース、ホルムアルデヒド、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）および硫酸マンガン（ＩＩ）を含み、６．０のｐＨを有する培地を用いることができる。　
　また、生産用培養液としては、増殖培養で用いた増殖用培養液と同じ組成のベース培養液に、糖類とホルムアルデヒドとを添加して得られる培養液を用いることもできる。なお、上述のベース培養液中に十分な量で糖類が存在する場合、糖類を添加しなくてもよい。
　（２．３）生産培養の条件
　生産培養における培養温度は、１，３－プロパンジオールの生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約２０～５０℃が好ましく、約２５～４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く１，３－プロパンジオールを製造できる。生産用培養液のｐＨは、１，３－プロパンジオールの生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。生産用培養液のｐＨは、約６～８の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のｐＨの調整は、例えば、水酸化カリウム水溶液を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のｐＨは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体が１，３－プロパンジオールを生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約３時間～７日間が好ましく、約１～３日間がより好ましい。
　生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、１，３－プロパンジオールを生産する経路を有しているためである。１，３－プロパンジオールを生産する経路は、後述の「（３．）作用および効果」の欄で述べる。
　＜嫌気的条件または微好気的条件＞
　生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
　形質転換体を嫌気的条件下または微好気的条件下で培養すると、形質転換体は実質的に増殖せず、一層効率的に１，３－プロパンジオールを生産することができる。
　「嫌気的条件または微好気的条件」は、例えば、生産用培養液中の溶存酸素濃度が０～２ｐｐｍの範囲内にある条件を指す。「嫌気的条件または微好気的条件」は、好ましくは、生産用培養液中の溶存酸素濃度が０～１ｐｐｍの範囲内にある条件を指し、より好ましくは、生産用培養液中の溶存酸素濃度が０～０．５ｐｐｍの範囲内にある条件を指す。培養液中の溶存酸素濃度は、例えば、溶存酸素計を用いて測定することができる。
　「嫌気的条件」は、厳密にいうと、溶存酸素、および、硝酸などの酸化物といった電子受容体が存在しない条件を指す技術用語である。一方、生産培養の好ましい条件としては、これら電子受容体が十分でない、もしくはその電子受容体の性質上、形質転換体が増殖せず、その分供給される炭素源が１，３－プロパンジオールの生産に利用され、その生産効率を高めることができれば、上記の厳密な条件を採用する必要はない。すなわち、生産培養の好ましい条件としては、形質転換体の増殖を抑制し、１，３－プロパンジオールの生産効率を高めることができれば、生産用培養液中に、溶存酸素、および、硝酸などの酸化物といった電子受容体が存在していてもよい。したがって、本明細書で使用される「嫌気的条件または微好気的条件」という表現は、このような状態も含む。
　嫌気的条件および微好気的条件は、例えば、酸素を含む気体を通気しないことによって、気液の界面から供給される酸素が形質転換体の増殖には不十分となり、実現することができる。または、生産用培養液中に不活性ガス、具体的には窒素ガスを通気することにより実現することができる。または、生産培養に用いられる容器を密閉することにより実現することができる。
　＜高密度条件＞
　生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的に１，３－プロパンジオールを生産することができる。
　「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、例えば、形質転換体を生産用培養液中に、形質転換体の湿菌体重量％が１～５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態を指す。「形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に、形質転換体の湿菌体重量％が３～３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態を指す。
　生産培養は、嫌気的条件または微好気的条件の下で、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われることがより好ましい。
　（２．４）１，３－プロパンジオールの回収
　上述のとおり、第１、第２および第３遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中に１，３－プロパンジオールが生産される。生産用培養液を回収することにより１，３－プロパンジオールを回収できるが、さらに、公知の方法で１，３－プロパンジオールを生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、濃縮法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法、晶析法等が挙げられる。
　なお、生産用培養液からは、第１遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応によって生じた４－ヒドロキシ－２－オキソ酪酸等の物質を回収することもできる。
　（３．）作用および効果
　１，３－プロパンジオール生産微生物が１，３－プロパンジオールを生産するプロセスを模式的に図１に示す。図１に示すプロセスにおいては、糖類がグルコースである場合を例として説明する。
　図１に示すように、先ず、１，３－プロパンジオール生産微生物１は、グルコース２及びホルムアルデヒド３を取り込む。次に、グルコース２は、解糖系を通じてピルビン酸４に変換される。次に、ピルビン酸４とホルムアルデヒド３とは、第１遺伝子がコードする「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」によって４－ヒドロキシ－２－オキソ酪酸５に変換される。次に、４－ヒドロキシ－２－オキソ酪酸５は、第２遺伝子がコードする「α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」によって３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド６に変換される。次に、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド６は、第３遺伝子がコードする「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」によって１，３－プロパンジオール７に変換される。以上のようにして、１，３－プロパンジオールが生産される。
　上記で説明した方法は、上述のとおり、特定の遺伝子を有する微生物をホルムアルデヒドの存在下で培養することにより、１，３－プロパンジオールが得られる生産プロセスを見出し、本発明を完成するに至った。一般的に、ホルムアルデヒドは微生物の生育にとって有害であるので、これが存在する下で有用な化合物が得られたことは驚きであった。なお、１，３－プロパンジオールは、ポリマー原料、化粧品材料、不凍液として利用できる化合物である。
（４．）好ましい実施形態
　以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
　［１］ 　以下の遺伝子：
　　（ａ）ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
　　（ｂ）α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
　　（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、１，３－プロパンジオールを生産することを含む、１，３－プロパンジオールの製造方法。
　［２］　前記培養が、前記糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［１］に記載の方法。
　［３］　前記培養液は、前記糖類およびホルムアルデヒドを添加した培養液である［２］に記載の方法。
　［４］　前記糖類は、前記培養液中で０．１～４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１～２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［３］に記載の方法。
　［５］　ホルムアルデヒドは、前記培養液中で０．００１～１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０１～１（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［３］または［４］に記載の方法。
　［６］　前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［１］～［５］の何れか１に記載の方法。
　［７］　前記糖類は、グルコースである［１］～［６］に記載の方法。
　［８］　前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる［１］～［７］の何れか１に記載の方法。
　［９］　前記培養が、前記糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［８］に記載の方法。
　［１０］　前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が０～２ｐｐｍの範囲内にあり、好ましくは０～１ｐｐｍの範囲内にあり、より好ましくは０～０．５ｐｐｍの範囲内にある条件である［９］に記載の方法。
　［１１］　前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［１］～［１０］の何れか１に記載の方法。
　［１２］　前記培養が、前記糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる［１１］に記載の方法。
　［１３］　前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が１～５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量％が３～３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態である［１２］に記載の方法。
　［１４］　前記第１遺伝子は、アルドラーゼをコードする［１］～［１３］の何れか１に記載の方法。
　［１５］　前記第１遺伝子は、タイプＩのアルドラーゼをコードする［１］～［１４］の何れか１に記載の方法。
　［１６］　前記第１遺伝子は、タイプＩＩのアルドラーゼをコードする［１］～［１４］の何れか１に記載の方法。
　［１７］　前記第１遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする：
　　（ａ１）２－デヒドロ－３－デオキシ－ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase）、
　　（ａ２）２－デヒドロ－３－デオキシ－６－ホスホグルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase）、
　　（ａ３）４－ヒドロキシ－２－オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase）、
　　（ａ４）（４Ｓ）－４－ヒドロキシル－２－オキソグルタレートアルドラーゼ（(4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase）、
　　（ａ５）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－ペントネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase）、
　　（ａ６）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－グルコネートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase）、
　　（ａ７）３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソネートアルドラーゼ（3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase）、
　　（ａ８）４－ヒドロキシル－２－オキソバレレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase）、
　　（ａ９）４－（２－カルボキシフェニル）－２－オキソブ－３－エノエートアルドラーゼ（4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase）、
　　（ａ１０）４－ヒドロキシ－２－オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase）、
　　（ａ１１）２－デヒドロ－３－デオキシグルカレートアルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase）、
　　（ａ１２）２－ケト－３－デオキシ－Ｌ－ラムノネートアルドラーゼ（2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase）、
　　（ａ１３）４－ヒドロキシル－４－メチル－２－オキソグルタレートアルドラーゼ（4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase）、および
　　（ａ１４）４－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノネートアルドラーゼ（4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase）；
　［１］～［１６］の何れか１に記載の方法。
　［１８］　前記第１遺伝子は、ｅｄａタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｅｄａタンパク質；ｄｇｏＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｄｇｏＡタンパク質；ｙｊｈＨタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙｊｈＨタンパク質；ｙａｇＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｙａｇＥタンパク質；ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｍｈｐＥタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｍｈｐＥタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；ｂｐｈＩタンパク質、好ましくは、バークホルデリア　ゼノボランス由来のｂｐｈＩタンパク質；ｐｈｄＪタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のｐｈｄＪタンパク質；ｇａｒＬタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｇａｒＬタンパク質；ｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；およびｇａｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス　プチダ由来のｇａｌＣタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［１］～［１７］の何れか１に記載の方法。
　［１９］　前記第１遺伝子は、ｎａｎＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｎａｎＡタンパク質；ｈｐａＩタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｈｐａＩタンパク質；およびｒｈｍＡタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のｒｈｍＡタンパク質；からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする［１］～［１８］の何れか１に記載の方法。
　［２０］　前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
　　（１－１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（１－６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
　［１］～［１９］の何れか１に記載の方法。
　［２１］　前記第１遺伝子は以下からなる群より選択される：
　配列番号１に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｈｐａＩ遺伝子、
　配列番号３に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｒｈｍＡ遺伝子、および
　配列番号５に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のｎａｎＡ遺伝子；
　［１］～［２０］の何れか１に記載の方法。
　［２２］　前記第２遺伝子は、前記アルドール反応により得られたα－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する前記酵素をコードする［１］～［２１］の何れか１に記載の方法。
　［２３］　前記第２遺伝子は、脱炭酸酵素をコードする［１］～［２２］の何れか１に記載の方法。
　［２４］　前記第２遺伝子は、以下からなる群より選択される脱炭酸酵素をコードする：
　　（ｂ１）ピルベートデカルボキシラーゼ（pyruvate decarboxylase）、
　　（ｂ２）ベンゾイルフォルメートデカルボキシラーゼ（benzoylformate decarboxylase）、および
　　（ｂ３）インドールピルベートデカルボキシラーゼ（indolepyruvate decarboxylase）；
　［１］～［２３］の何れか１に記載の方法。
　［２５］　前記第２遺伝子は、ｐｄｃタンパク質、好ましくは、ザイモモナス　モビリス由来のｐｄｃタンパク質；ｍｄｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス　プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質；ｋｉｖＤタンパク質、好ましくは、ラクトコッカス　ラクティス由来のｋｉｖＤタンパク質；からなる群より選択される脱炭酸酵素をコードする［１］～［２４］の何れか１に記載の方法。
　［２６］　前記第２遺伝子は、ｍｄｌＣタンパク質、好ましくは、シュードモナス　プチダ由来のｍｄｌＣタンパク質をコードする［１］～［２５］の何れか１に記載の方法。
　［２７］　前記第２遺伝子は以下からなる群より選択される：
　　（２－１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（２－２）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
　［１］～［２６］の何れか１に記載の方法。
　［２８］　前記第２遺伝子は、配列番号７に記載の塩基配列からなる、シュードモナス　プチダ由来のｍｄｌＣ遺伝子である［１］～［２７］の何れか１に記載の方法。
　［２９］　前記第３遺伝子は、前記第１遺伝子がコードする前記酵素が触媒する前記アルドール反応の基質であるアルデヒドとは種類が異なるアルデヒドの還元反応を触媒する前記酵素をコードする［１］～［２８］の何れか１に記載の方法。
　［３０］　前記第３遺伝子は、前記脱炭酸反応により得られたアルデヒドの還元反応を触媒する前記酵素をコードする［１］～［２９］の何れか１に記載の方法。
　［３１］　前記第３遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする［１］～［３０］の何れか１に記載の方法。
　［３２］　前記第３遺伝子は、１，３－プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（1,3-propanediol dehydrogenase）をコードする［１］～［３１］の何れか１に記載の方法。
　［３３］　前記第３遺伝子は、ｄｈａＴタンパク質、好ましくは、クレブシエラ　ニューモニエ由来のｄｈａＴタンパク質；およびｌｐｏタンパク質、好ましくは、ラクトバチルス　ロイテリ由来のｌｐｏタンパク質；からなる群より選択される１，３－プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする［１］～［３２］の何れか１に記載の方法。
　［３４］　前記第３遺伝子は以下からなる群より選択される：
　　（３－１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（３－２）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
　［１］～［３３］の何れか１に記載の方法。
　［３５］　前記第３遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列からなる、クレブシエラ　ニューモニエ由来のｄｈａＴ遺伝子である［１］～［３４］の何れか１に記載の方法。
　［３６］　前記第１遺伝子は以下からなる群より選択され：
　　（１－１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
　　（１－５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（１－６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
　前記第２遺伝子は以下からなる群より選択され：
　　（２－１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（２－２）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
　前記第３遺伝子は以下からなる群より選択される： 
　　（３－１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
　　（３－２）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
　［１］～［３５］の何れか１に記載の方法。
　［３７］　前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくは、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［１］～［３６］の何れか１に記載の方法。
　［３８］　前記微生物は、前記第１遺伝子、前記第２遺伝子および前記第３遺伝子によって形質転換された微生物である［１］～［３７］の何れか１に記載の方法。
　［３９］　前記微生物は、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（pyruvate dehydrogenase）遺伝子、グルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（glutamate-pyruvate aminotransferase）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase）遺伝子、Ｎ－スクシニルジアミノピメレート（N-succinyldiaminopimelate aminotransferase）遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ（S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase）遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetaldehyde dehydrogenase）遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である［１］～［３８］の何れか１に記載の方法。
　［４０］　前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む［１］～［３９］の何れか１に記載の方法。
　［４１］　生産された１，３－プロパンジオールを回収することを更に含む［１］～［４０］の何れか１に記載の方法。
　１．材料および方法
　（１－１）培地
　試薬は特に指示がなければ富士フィルム和光純薬株式会社より購入した。
　（Ａ培地）
　尿素２．０ｇ、硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２．０ｇ、カサミノ酸 ビタミンアッセイ（ディフコ社製）７．０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、Ｄ（＋）－ビオチン０．２０ｍｇ、塩酸チアミン０．２０ｍｇを０．９２Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８０ｍＬを加えることにより調製された液体培地。
　（Ａ寒天培地）
　尿素２．０ｇ、硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２．０ｇ、カサミノ酸 ビタミンアッセイ（ディフコ社製）７．０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、Ｄ（＋）－ビオチン０．２０ｍｇ、塩酸チアミン０．２０ｍｇ、寒天１５ｇを０．９２Ｌの水に溶解、懸濁し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８０ｍＬを加え、ペトリ皿に分注後、冷却固化することで調製された固体培地。
　（ＢＡ培地）
　尿素２．０ｇ、硫酸アンモニウム７．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２．０ｇ、カサミノ酸 ビタミンアッセイ（ディフコ社製）７．０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇ、Ｄ（＋）－ビオチン０．２０ｍｇ、塩酸チアミン０．２０ｍｇ、４－モルホリノプロパンスルホン酸２１ｇを０．９２Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８０ｍＬを加えることにより調製された液体培地。
　（ＬＢ培地）
　バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５．０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
　（ＬＢ寒天培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５．０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇを１Ｌの水に溶解、懸濁し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃まで冷却した後に、ペトリ皿に分注し、冷却固化することで調製された固体培地。
　（Ｓｕｃ寒天培地）
　バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５．０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇを０．５Ｌの水に溶解、懸濁し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した。これを１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌し、５０℃まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの２０％（ｗ／ｖ）のスクロース水溶液０．５Ｌを加え、ペトリ皿に分注後、冷却固化することで調製された固体培地。
　（ＢＨＩＳ培地）
　ブレインハートインフュージョン（ディフコ社製）３６ｇ、ソルビトール９１ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
　（ＢＨＩＳ－ＧＩＴ培地）
　ブレインハートインフュージョン（ディフコ社製）３６ｇ、グリシン８．０ｇ、イソニアジド１．３ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０　３ｍＬ、ソルビトール９１ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
　（１－２）バッファーおよび試薬
　（ＴＥバッファー）
　トリスヒドロキシメチルアミノメタン１．２ｇ、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸二ナトリウム塩二水和物０．３７ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを６Ｍ塩酸を用いて８．０に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された緩衝液。
　（ＴＧバッファー）
　トリスヒドロキシメチルアミノメタン０．１２ｇ、グリセロール１０ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨを６Ｍ塩酸を用いて７．５に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された緩衝液。
　（１０％グリセロール水溶液）
　グリセロール１００ｇを１Ｌの水に溶解した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌することで調製された水溶液。
　（ＢＲバッファー）
　リン酸二水素カリウム０．５０ｇ、リン酸水素二カリウム０．５０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５０ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物６．０ｍｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）一水和物４．２ｍｇを１．０Ｌの水に溶解し、ｐＨを５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いて７．０に調整することでえられた緩衝液。
　（１－３）分析条件の定義および実験方法
　（アガロース・ゲル電気泳動後のＤＮＡ断片の抽出、精製）
　ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（マッハライ・ナーゲル社製）をその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の抽出、精製を行った。
　（プラスミド抽出）
　ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）をその指示書通りに用いてプラスミドの抽出、精製を行った。
　（ＰＣＲ法）
　以下のいずれかのＤＮＡポリメラーゼおよびそれに付属する試薬を用いて、その指示書に従いＰＣＲを行った：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔｋｓ　ＧｆｌｅｘＴＭ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）。
　（有機酸分析用液体クロマトグラフィー）
　島津製作所製の以下の機器より構成される有機酸分析システムを用いた。システムコントローラ：ＣＢＭ－２０Ａ、送液ユニット：ＬＣ－２０ＡＢ、オンライン脱気ユニット：ＤＧＵ－２０Ａ３Ｒ、オートインジェクタ：ＳＩＬ－２０ＡＣ、カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＣ、フォトダイオードアレイ検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ。
　分析条件は以下の通りである。
ガードカラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＯＡｐａｋ－Ｐ（東ソー社製）
分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＯＡｐａｋ－Ａ（東ソー社製）
カラムオーブン温度：４０℃
移動相：０．７５ｍＭ硫酸
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
　（糖分析用液体クロマトグラフィー）
　島津製作所製の以下の機器より構成される糖分析システムを用いた。システムコントローラ：ＣＢＭ－２０Ａ、送液ユニット：ＬＣ－２０ＡＢ、オンライン脱気ユニット：ＤＧＵ－２０Ａ３Ｒ、オートインジェクタ：ＳＩＬ－２０ＡＣ、カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＣ、屈折率検出器：ＲＩＤ－１０Ａ。
　分析条件は以下の通りである。
前処理：脱塩カートリッジ（バイオラッド社製）
分析カラム：アミネックス　ＨＰＸ－８７Ｐ（バイオラッド社製）
カラムオーブン温度：８５℃
移動相：水
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ。
　（ゲノムＤＮＡ抽出）
　入手元の指示書通りに液体培養した微生物を遠心分離により回収し、－８０℃で凍結した。菌体ペレットを室温で解凍し、１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム水溶液５３７μＬを加えて３７℃で１時間振盪した。次に０．５Ｍ　ＥＤＴＡ水溶液３０μＬ、１０％ＳＤＳ水溶液３０μＬ、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ水溶液３μＬを加えて、３７℃で１時間振盪した。その後さらに５Ｍ塩化ナトリウム水溶液１００μＬと１０％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液（０．７Ｍ塩化ナトリウム中）８０μＬを加えて、６５℃で１０分間加熱した。室温まで冷却した後、クロロホルム－イソアミルアルコール（２４：１）７８０μＬ加えて、穏やかに混和した。１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、水層を６００μＬ回収した。これにフェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール（２５：２４：１）６００μＬを加えて、穏やかに混和した。１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、水層を５００μＬ回収した。これにイソプロパノール３００μＬを加えて、１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離した後、上清を取り除いた。沈殿物として得られたゲノムＤＮＡを７０％エタノール５００μＬを加えて洗浄し、１５０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離した。この洗浄を２度繰り返し、室温にて乾燥させた後、得られたゲノムＤＮＡをＴＥバッファー１００μＬに溶解した。
　（コリネバクテリウム　グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来株を形質転換するための電気穿孔法）
　形質転換を行うコリネバクテリウム　グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来株のグリセロールストックをＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．２となるように５００ｍＬフラスコ中に用意された１００ｍＬのＢＨＩＳ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い濁度が０．５～０．７になるまで培養した。この培養液を４℃、５５００ｘｇにて２０分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。回収した菌体を１０ｍＬのＴＧバッファーで洗浄し、４℃、５５００ｘｇにて５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。この洗浄を２度行った後、１０ｍＬの１０％グリセロール水溶液で洗浄し、４℃、５５００ｘｇにて５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。得られた菌体ペレットを１ｍＬの１０％グリセロール水溶液に懸濁させ、１５０μＬずつ滅菌済みの１．５ｍＬチューブに分注後、液体窒素を用いて凍結し、コンピテントセルとして－８０℃で保存した。
　ゲノムＤＮＡ上の遺伝子欠失および遺伝子置換の場合：１５０μＬのコンピテントセルを氷上にて融解し、５００ｎｇのプラスミドを加えた。これを滅菌済み０．２ｃｍギャップ　エレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）に移し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＸｃｅｌｌＴＭ　エレクトロポレーションシステム（バイオラッド社製）を用いて、２５μＦ、２００Ω、２５００Ｖにて電気穿孔を行った。菌体懸濁液を１ｍＬのＢＨＩＳ培地で希釈し、４６℃で６分間インキュベーションした後、３３℃にて１時間インキュベーションを行った。この菌体懸濁液を適切な抗生物質を含むＡ寒天培地に接種し、目的の形質転換体を選択した。
　遺伝子過剰発現用プラスミドを導入する場合：５０μＬのコンピテントセルを氷上にて融解し、２００ｎｇのプラスミドを加えた。これを滅菌済み０．２ｃｍギャップ　エレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）に移し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＸｃｅｌｌＴＭ　エレクトロポレーションシステム（バイオラッド社製）を用いて、２５μＦ、２００Ω、２５００Ｖにて電気穿孔を行った。菌体懸濁液を１ｍＬのＢＨＩＳ培地で希釈し、４６℃で６分間インキュベーションした後、３３℃にて１時間インキュベーションを行った。この菌体懸濁液を適切な抗生物質を含むＡ寒天培地に接種し、目的の形質転換体を選択した。
　（コロニーＰＣＲ）
　目的のＤＮＡ配列を増幅できるプライマーの組み合わせを用いてＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）の指示書通りに鋳型ＤＮＡ以外の試薬を混合した。これに寒天培地に生じた菌株のコロニーを少量懸濁させ、これに内在するＤＮＡを鋳型とし、指示書通りにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳動により分析し、目的のプラスミドを保持していること、または、ゲノム上の該当するＤＮＡ配列が欠失または置換していることを確認した。
　（濁度測定）
　大腸菌およびコリネバクテリウム　グルタミカムの培養液の濁度は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ　８０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて６１０ｎｍの波長で測定を行った。
　（１－４）プライマーＤＮＡ、菌体およびプラスミドの詳細
　プライマーＤＮＡ、菌体およびプラスミドの詳細は、以下の表１１～表３１に記載した。
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　２．プラスミド構築
　（２－１）遺伝子欠失編
　２－１－（１）遺伝子破壊用プラスミドの構築
　ｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４（Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ００７（配列番号１１）とＧＥＰ００８（配列番号１２）で示される塩基配列のＤＮＡを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６，　１１９５（１９９２）〕をＰＣＲ法により増幅した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、アガロース・ゲル電気泳動後に、ＤＮＡ断片の抽出、精製を行った。また、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ社製）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、アガロース・ゲル電気泳動後に、ＤＮＡ断片の抽出、精製を行った。これら２つのＤＮＡ断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜　Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ　＞（タカラバイオ社製）をその指示書通りに用いて連結し、プラスミドｐＧＥ０１５を得た。
　ｐＧＥ０１５がｓａｃＢ上に有するＫｐｎＩ認識部位を削除することを目的として、ｐＧＥ０１５を鋳型としてＧＥＰ８０８（配列番号１３）およびＧＥＰ８０９（配列番号１４）で示される塩基配列のＤＮＡを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに用いて、変異導入およびプラスミドの増幅を行い、ｐＧＥ２０９を得た。
　２－１－（２）ｐｐｃ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　コリネバクテリウム　グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターからＮＢＲＣ１２１６８株として入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ１３２（配列番号１５）とＧＥＰ１３３（配列番号１６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ１３４（配列番号１７）とＧＥＰ１３５（配列番号１８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ０２０とした。
　２－１－（３）ｐｐｃ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ０２０を用い、電気穿孔法によりコリネバクテリウム　グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＡ培地上でカナマイシン耐性株を選択した。次に、得られたカナマイシン耐性株をＳｕｃ寒天培地上に塗布し、３３℃で培養した。生育したコロニーをさらにＡ培地で培養し、コロニーＰＣＲによりｐｐｃ遺伝子が欠失している株を選択した。これをＧＥＳ００７と命名した。
　２－１－（４）ｌｄｈＡ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ１６９（配列番号１９）とＧＥＰ１７０（配列番号２０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２１５（配列番号２１）とＧＥＰ２１６（配列番号２２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ０３３とした。
　２－１－（５）ｌｄｈＡ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ０３３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ００７を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ０４８と命名した。
　２－１－（６）ｐｙｃ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ６１５（配列番号２３）とＧＥＰ６１６（配列番号２４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ６１７（配列番号２５）とＧＥＰ６１８（配列番号２６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１７７とした。
　２－１－（７）ｐｙｃ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ１７７を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ０４８を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ３８５と命名した。
　２－１－（８）ｐｏｘＢ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４０６（配列番号２７）とＧＥＰ４０７（配列番号２８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ６９８（配列番号２９）とＧＥＰ４０９（配列番号３０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１９１とした。
　２－１－（９）ｐｏｘＢ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ１９１を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ３８５を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ３８８と命名した。
　２－１－（１０）ａｌａＡ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ８１０と（配列番号３１）ＧＥＰ８１１（配列番号３２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ８１２（配列番号３３）とＧＥＰ８１３（配列番号３４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ２１０とした。
　２－１－（１１）ａｌａＡ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ２１０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ３８８を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ３９３と命名した。
　２－１－（１２）ｉｌｖＢ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ９５６（配列番号３５）とＧＥＰ９５７（配列番号３６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ９５８（配列番号３７）とＧＥＰ９５９（配列番号３８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ２２８とした。
　２－１－（１３）ｉｌｖＢ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ２２８を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ３９３を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ４０５と命名した。
　２－１－（１４）ｃｇ０９３１遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ１１３２（配列番号３９）とＧＥＰ１１３３（配列番号４０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ１１３４（配列番号４１）とＧＥＰ１１３５（配列番号４２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ０１５をＥｃｏＲＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ２５３とした。
　２－１－（１５）ｃｇ０９３１遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ２５３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ４０５を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ４３５と命名した。
　２－１－（１６）ａｄｈＥ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６０６（配列番号４３）とＧＥＰ２６０７（配列番号４４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６０８（配列番号４５）とＧＥＰ２６０９（配列番号４６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１１７１とした。
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６８８（配列番号４７）とＧＥＰ２６０７（配列番号４４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６０８（配列番号４５）とＧＥＰ２６８９（配列番号４８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２１８とした。
　２－１－（１７）ａｄｈＥ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ１１７１を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ０４８を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１０４１と命名した。
　２－１－（１８）ａｌｄ遺伝子破壊株作成用プラスミドの構築
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６１０（配列番号４９）とＧＥＰ２６１１（配列番号５０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６１２（配列番号５１）とＧＥＰ２６１３（配列番号５２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１１７２とした。
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２６９２（配列番号５３）とＧＥＰ２６１１（配列番号５０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ２６１２（配列番号５１）とＧＥＰ２６９３（配列番号５４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法により２種類のＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ０２０作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２２１とした。
　２－１－（１９）ａｌｄ遺伝子欠失株の作成
　ｐＧＥ１１７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１０７０と命名した。
　（２－２）遺伝子置換編
　２－２－（１）ｐＧＥ４０９の構築
　ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３３（配列番号５５）とＧＥＰ４３４（配列番号５６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ４３７（配列番号５７）とＧＥＰ４３８（配列番号５８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
　コリネバクテリウム　グルタミカムＮＢＲＣ１２１６９株を独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。菌体ペレットを１ｍＬの１０ｍＭ　Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｅｎｅｄｉｎｉｔｒｉｌｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０）緩衝液で洗浄し、６，０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、再度回収した。菌体ペレットを１５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む３００　μＬのＢｕｆｆｅｒ　Ａ１（マッハライ・ナーゲル社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅに付属）に懸濁させ、３７℃にて２時間振盪させた。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅの指示書に従って、ｐＣＧ１プラスミドの抽出および精製を行った。これを鋳型とし、ＧＥＰ４４５（配列番号５９）とＧＥＰ４４６（配列番号６０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはコリネバクテリウム用複製起点ｐＣＧ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
　以上の３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４０３とした。
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４７２（配列番号６１）とＧＥＰ４７８（配列番号６２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＦＬＡＧ－ＣＴＣ（シグマ・アルドリッチ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４６７（配列番号６３）とＧＥＰ４６８（配列番号６４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれＡＴＣＣ１３０３２株のｇａｐＡプロモーター（ＰｇａｐＡ）および大腸菌リボソームＲＮＡ転写ターミネーター（ＴｒｒｎＢ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０３をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４０９とした。
　２－２－（２）ｐＧＥ１１８５（ΔａｄｈＥ：：ｈｐａＩ置換株作成用プラスミド）の構築
　ＥＣＯＳＴＭ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社製）を購入し、これをＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＬＢ培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２２６８（配列番号６５）とＧＥＰ２２６９（配列番号６６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株ｈｐａＩ遺伝子（Ｅｃ＿ｈｐａＩ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ－１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＥｃ＿ｈｐａＩがｐＥＴ－１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１０３１を得た。
　ｐＧＥ１０３１を鋳型とし、ＧＥＰ２５１９（配列番号６７）とＧＥＰ２５１８（配列番号６８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＥｃ＿ｈｐａＩがｐＧＥ４０９へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１４３を得た。
　ｐＧＥ１１４３を鋳型とし、ＧＥＰ２６３７（配列番号６９）とＧＥＰ２６３８（配列番号７０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ－ｈｐａＩ－ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１１７１をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ１１８５とした。
　２－２－（３）ｐＧＥ１１８６（Δａｌｄ：：ｈｐａＩ置換株作成用プラスミド）の構築
　ｐＧＥ１１４３を鋳型とし、ＧＥＰ２６３９（配列番号７１）とＧＥＰ２６４０（配列番号７２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ－ｈｐａＩ－ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１１７２をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１１８６とした。
　２－２－（４）ΔａｄｈＥ：：ｈｐａＩ　Δａｌｄ：：ｈｐａＩ置換株の作成
　ｐＧＥ１１８６を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＡ培地上でカナマイシン耐性株を選択した。次に、得られたカナマイシン耐性株をＳｕｃ寒天培地上に塗布し、３３℃で培養した。生育したコロニーをさらにＡ培地で培養し、コロニーＰＣＲによりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ－ｈｐａＩ－ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１０５２と命名した。さらに、ｐＧＥ１１８５を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０５２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ－ｈｐａＩ－ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１０６３と命名した。
　ｐＧＥ１１７１を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ４３５を形質転換し、ＧＥＳ００７作成時と同様な操作により選択した株をＧＥＳ１０４２と命名した。さらに、ｐＧＥ１１８６を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ－ｈｐａＩ－ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１０５３と命名した。ｐＧＥ１１８５を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０５３を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ－ｈｐａＩ－ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１０６４と命名した。
　２－２－（５）ｐＧＥ１３０４（ΔａｄｈＥ：：ｒｈｍＡ置換株作成用プラスミド）の構築
　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を購入し、これをＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＬＢ培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７６５（配列番号７３）とＧＥＰ２７６６（配列番号７４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌ＤＨ５α株ｒｈｍＡ遺伝子（Ｅｃ＿ｒｈｍＡ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１４３作成時と同様な操作によりＥｃ＿ｒｈｍＡがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２５８を得た。
　ｐＧＥ１２５８を鋳型とし、ＧＥＰ２６３７（配列番号６９）とＧＥＰ２６３８（配列番号７０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ－ｒｈｍＡ－ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１２１８をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１３０４とした。
　２－２－（６）ｐＧＥ１３０２（Δａｌｄ：：ｒｈｍＡ置換株作成用プラスミド）の構築
　ｐＧＥ１２５８を鋳型とし、ＧＥＰ２６３９（配列番号７１）とＧＥＰ２６４０（配列番号７２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ１２２１をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ－ｒｈｍＡ－ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１３０２とした。
　２－２－（７）ΔａｄｈＥ：：ｒｈｍＡ　Δａｌｄ：：ｒｈｍＡ置換株の作成
　ｐＧＥ１３０２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ－ｒｈｍＡ－ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１２１５と命名した。さらに、ｐＧＥ１３０４を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２１５を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ－ｒｈｍＡ－ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２４２と命名した。
　２－２－（８）ｐＧＥ１２７２（ΔａｄｈＥ：：ｎａｎＡ置換株作成用プラスミド）の構築
　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を購入し、これをＬＢ寒天培地に無菌条件下で接種し、３７℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を１０ｍＬのＬＢ培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２７２２（配列番号７５）とＧＥＰ２７２３（配列番号７６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌ＤＨ５α株ｎａｎＡ遺伝子（Ｅｃ＿ｎａｎＡ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１４３作成時と同様な操作によりＥｃ＿ｎａｎＡがｐＧＥ４０９へとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１２２６を得た。
　ｐＧＥ１２２６を鋳型とし、ＧＥＰ２６３７（配列番号６９）とＧＥＰ２６３８（配列番号７０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ－ｎａｎＡ－ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ１２１８をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２７２とした。
　２－２－（９）ｐＧＥ１２７３（Δａｌｄ：：ｎａｎＡ置換株作成用プラスミド）の構築
　ｐＧＥ１２２６を鋳型とし、ＧＥＰ２６３９（配列番号７１）とＧＥＰ２６４０（配列番号７２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ１２２１をＸｈｏＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはＰｇａｐＡ－ｎａｎＡ－ＴｒｒｎＢを含むＤＮＡ断片である。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１８５作成時と同様な操作により得られたプラスミドをｐＧＥ１２７３とした。
　２－２－（１０）ΔａｄｈＥ：：ｎａｎＡ　Δａｌｄ：：ｎａｎＡ置換株の作成
　ｐＧＥ１２７３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４１を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ－ｎａｎＡ－ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１１８８と命名した。さらに、ｐＧＥ１２７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１１８８を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ－ｎａｎＡ－ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２２３と命名した。
　ｐＧＥ１２７３を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０４２を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｌｄ遺伝子がＰｇａｐＡ－ｎａｎＡ－ＴｒｒｎＢに置換している株を選択した。これをＧＥＳ１１８９と命名した。さらに、ｐＧＥ１２７２を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１１８９を形質転換し、ＧＥＳ１０５２作成時と同様な操作によりａｄｈＥ遺伝子の位置にＰｇａｐＡ－ｎａｎＡ－ＴｒｒｎＢが挿入した株を選択した。これをＧＥＳ１２３３と命名した。
　（２－３）過剰発現用プラスミド編
　２－３－（１）ｐＧＥ４１１の構築
　ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３３（配列番号５５）とＧＥＰ４３４（配列番号５６）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせ、およびＧＥＰ４３７（配列番号５７）とＧＥＰ４３８（配列番号５８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
　コリネバクテリウム　カゼイＪＣＭ１２０７２株を理化学研究所バイオリソース研究センターから入手し、添付の指示書通りに培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。菌体ペレットを１ｍＬの１０ｍＭ　Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｅｎｅｄｉｎｉｔｒｉｌｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０）緩衝液に懸濁させ、６，０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心分離して、再度回収した。菌体ペレットを１５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む３００　μＬのＢｕｆｆｅｒ　Ａ１（マッハライ・ナーゲル社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅに付属する）に懸濁させ、３７℃にて２時間振盪させた。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅの指示書に従って、ｐＣＡＳＥ１プラスミドの抽出および精製を行った。これを鋳型とし、ＧＥＰ４４３（配列番号７７）とＧＥＰ４４４（配列番号７８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはコリネバクテリウム用複製起点ｐＣＡＳＥ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
　以上の３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４０２とした。
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４７４（配列番号７９）とＧＥＰ４７７（配列番号８０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＦＬＡＧ－ＣＴＣ（シグマ・アルドリッチ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４６７（配列番号６３）とＧＥＰ４６８（配列番号６４）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれＡＴＣＣ１３０３２株のｌｄｈＡプロモーター（ＰｌｄｈＡ）および大腸菌リボソームＲＮＡ転写ターミネーター（ＴｒｒｎＢ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ４０２をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ４１１とした。
　２－３－（２）ｐＧＥ９４５－２の構築
　ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３５（配列番号８１）とＧＥＰ４３６（配列番号８２）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４３７（配列番号５７）とＧＥＰ４３８（配列番号５８）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれスペクチノマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片である。
　以上の２つのＤＮＡ断片、および、ｐＧＥ４０２の作成時に得たｐＣＡＳＥ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ６１９とした。
　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ４７４（配列番号７９）とＧＥＰ４７７（配列番号８０）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、ｐＦＬＡＧ－ＣＴＣ（シグマ・アルドリッチ社製）を鋳型とし、ＧＥＰ４６７（配列番号６３）とＧＥＰ２８９７（配列番号８３）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれＡＴＣＣ１３０３２株のｌｄｈＡプロモーター（ＰｌｄｈＡ）および大腸菌リボソームＲＮＡ転写ターミネーター（ＴｒｒｎＢ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＧＥ６１９をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの３つのＤＮＡ断片を混和し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔをその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうして得られたプラスミドをｐＧＥ９４５－２とした。
　２－３－（３）Ｐｐ＿ｍｄｌＣ過剰発現用プラスミドの構築
　シュードモナス　プチダＮＢＲＣ１４１６４株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＮＢＲＣ１４１６４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＥＰ２５５０（配列番号８４）とＧＥＰ２５５１（配列番号８５）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはシュードモナス　プチダＮＢＲＣ１４１６４株ｍｄｌＣ遺伝子（Ｐｐ＿ｍｄｌＣ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ－１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１０３１作成時と同様な操作によりＰｐ＿ｍｄｌＣがｐＥＴ－１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１６１を得た。
　ｐＧＥ１１６１を鋳型とし、ＧＥＰ２６５３（配列番号８６）とＧＥＰ２６５４（配列番号８７）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ４０９をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ＧＥＳ１１８５作成時と同様な操作によりＰｐ＿ｍｄｌＣがｐＧＥ４０９へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１９７を得た。
　２－３－（４）Ｋｐ＿ｄｈａＴ過剰発現用プラスミドの構築
　クレブシエラ　ニューモニエ由来の遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＬＣ４１２９０２）を含むプラスミドｐＨＡ１２－ｄｈａＢＴを広島大学田島誉久博士より供与を頂いた。これを鋳型とし、ＧＥＰ２５２９（配列番号８８）とＧＥＰ２５３０（配列番号８９）で示される塩基配列のＤＮＡの組み合わせを用いて、ＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはクレブシエラ　ニューモニエｄｈａＴ遺伝子（Ｋｐ＿ｄｈａＴ）を含むＤＮＡ断片である。さらに、ｐＥＴ－１５ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、ｐＧＥ１１６１作成時と同様な操作によりＫｐ＿ｄｈａＴがｐＥＴ－１５ｂへとクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１５０を得た。
　ｐＧＥ１１５０をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、１．２ｋｂのＤＮＡ断片をアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、ｐＧＥ９４５－２をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの２つのＤＮＡ断片を混和し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡社製）をその指示書通りに用いてＤＮＡ断片の結合反応を行った。反応産物を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてＫｐ＿ｄｈａＴがｐＧＥ９４５－２へとサブクローニングされたプラスミドｐＧＥ１１９０を得た。
　３．菌体構築
　（３－１）Ｐｐ＿ｍｄｌＣおよびＫｐ＿ｄｈａＴ過剰発現プラスミド導入株の作成
　ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０７０を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２０６と命名した。
　ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６３を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをＧＥＳ１０７７と命名した。
　ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１０６４を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをＧＥＳ１０６８と命名した。
　ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２４２を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２８２と命名した。
　コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）　ＧＥＳ１０６８は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７８０）
　ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２２３を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２５３と命名した。
　ｐＧＥ１１９７とｐＧＥ１１９０を用い、電気穿孔法によりＧＥＳ１２３３を形質転換し、３３℃にて２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＡ寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをＧＥＳ１２５４と命名した。
　コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）　ＧＥＳ１２５４は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託した（寄託日：２０１８年９月１３日、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７８１）
　４．物質生産実験
　（４－１）４－ヒドロキシ－２－オキソ酪酸（ＨＯＢ）の生産
　４－１－（１）ＧＥＳ１０７７の培養
　ＧＥＳ１０７７のグリセロールストックをカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＢＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．１となるように２Ｌフラスコ中に用意されたカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む５００ｍＬのＢＡ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を４℃、５５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－１－（２）ＧＥＳ１０７７を用いたＨＯＢの生産
　前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および１．２Ｍのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ５０ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢが０．６５ｍＭ生成していた。
　４－１－（３）比較例１
　前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液を５０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
　４－１－（４）比較例２
　ＧＥＳ１２０６について、前記４－１－（１）および４－１－（２）と同様の実験を行った。反応３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
　４－１－（２）、４－１－（３）、４－１－（４）の結果から、ＧＥＳ１０７７のようなクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体は、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
　４－１－（５）ＧＥＳ１２８２の培養
　ＧＥＳ１２８２のグリセロールストックから４－１－（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－１－（６）ＧＥＳ１２８２を用いたＨＯＢの生産
　前記の通り調製された湿菌体を４－１－（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢが０．３６ｍＭ生成していた。
　４－１－（７）比較例１
　前記の通り調製された湿菌体を４－１－（３）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
　４－１－（６）、４－１－（７）、４－１－（４）の結果から、ＧＥＳ１２８２のようなＧＥＳ１０７７とは異なるクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体も、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
　４－１－（８）ＧＥＳ１２５３の培養
　ＧＥＳ１２５３のグリセロールストックから４－１－（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－１－（９）ＧＥＳ１２５３を用いたＨＯＢの生産
　前記の通り調製された湿菌体を４－１－（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢが０．３４ｍＭ生成していた。
　４－１－（１０）比較例１
　前記の通り調製された湿菌体を４－１－（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢは検出されなかった。
　４－１－（９）、４－１－（１０）、４－１－（４）の結果から、ＧＥＳ１２５３のようなクラス１アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体は、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
　４－１－（１１）ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４の培養
　ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４のグリセロールストックから４－１－（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－１－（１２）ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４を用いたＨＯＢの生産
　前記の通り調製された湿菌体を４－１－（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＨＯＢがＧＥＳ１０６８を用いた反応では１．２ｍＭ、ＧＥＳ１２５４を用いた反応では０．４２ｍＭ生成していた。
　４－１－（１２）の結果から、ＧＥＳ１０６８およびＧＥＳ１２５４のようなＧＥＳ１０７７およびＧＥＳ１２５３とは異なる遺伝子型の微生物であっても、クラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体であれば、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、ＨＯＢに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
　（４－２）１，３－プロパンジオール（ＰＤＯ）の生産
　４－２－（１）ＧＥＳ１０７７、ＧＥＳ１０６８の培養
　ＧＥＳ１０７７、ＧＥＳ１０６８のグリセロールストックをカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に無菌条件下で接種し、３３℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む１０ｍＬのＢＡ培地に接種し、３３℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が０．１となるように２Ｌフラスコ中に用意されたカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびスペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含む５００ｍＬのＢＡ培地に接種した。３３℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を４℃、５５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－２－（２）ＧＥＳ１０７７、ＧＥＳ１０６８を用いたＰＤＯの生産
　前記の通り調製された湿菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるようにＢＲバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に５０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液および１．２Ｍのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ５０ｍＭ、４０ｍＭとなるように加え、１．０Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に維持しながら３３℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。３時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＰＤＯがＧＥＳ１０７７を用いた反応では７．４ｍＭ、ＧＥＳ１０６８を用いた反応では１１．４ｍＭ生成していた。
　以上の結果から、ＧＥＳ１０７７およびＧＥＳ１０６８のようなクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体が、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、ＨＯＢがさらにＰＤＯへと変換され、ＰＤＯを製造できることがわかった。
　４－２－（３）ＧＥＳ１２８２の培養
　ＧＥＳ１２８２のグリセロールストックから４－２－（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－２－（４）ＧＥＳ１２８２を用いたＰＤＯの生産
　前記の通り調製された湿菌体を４－２－（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。６時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＰＤＯが１１．４ｍＭ生成していた。
　以上の結果から、ＧＥＳ１２８２のようなＧＥＳ１０７７やＧＥＳ１０６８とは異なるクラス２アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体も、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、ＨＯＢがさらにＰＤＯへと変換され、ＰＤＯを製造できることがわかった。
　４－２－（５）ＧＥＳ１２５３、ＧＥＳ１２５４の培養
　ＧＥＳ１２５３、ＧＥＳ１２５４のグリセロールストックから４－２－（１）と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
　４－２－（６）ＧＥＳ１２５３、ＧＥＳ１２５４を用いたＰＤＯの生産
　前記の通り調製された湿菌体を４－２－（２）と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。６時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ＰＤＯがＧＥＳ１２５３を用いた反応では４．１ｍＭ、ＧＥＳ１２５４を用いた反応では５．８ｍＭ生成していた。
　以上の結果から、ＧＥＳ１２５３およびＧＥＳ１２５４のようなクラス１アルドラーゼをコードする遺伝子を持ち、糖類およびホルムアルデヒド存在下に培養するとＨＯＢを生産できる菌体が、さらにデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有する場合、ＨＯＢがさらにＰＤＯへと変換され、ＰＤＯを製造できることがわかった。
参考資料
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035

Claims (6)

  1. 　以下の遺伝子：
    　（ａ）ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第１遺伝子、
    　（ｂ）α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第２遺伝子、および
    　（ｃ）アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第３遺伝子
    を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、１，３－プロパンジオールを生産することを含む、１，３－プロパンジオールの製造方法。
  2. 　前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる請求項１に記載の１，３－プロパンジオールの製造方法。
  3. 　前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる請求項１または２に記載の１，３－プロパンジオールの製造方法。
  4. 　前記微生物が、好気性細菌である請求項１～３の何れか１項に記載の１，３－プロパンジオールの製造方法。
  5. 　前記好気性細菌が、コリネ型細菌である請求項４に記載の１，３－プロパンジオールの製造方法。
  6. 　前記第１遺伝子は以下からなる群より選択され：
    　　（１－１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
    　　（１－２）配列番号２において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
    　　（１－３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
    　　（１－４）配列番号４において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
    　　（１－５）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
    　　（１－６）配列番号６において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
    　前記第２遺伝子は以下からなる群より選択され：
    　　（２－１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
    　　（２－２）配列番号８において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α－ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；および
    　前記第３遺伝子は以下からなる群より選択される： 
    　　（３－１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
    　　（３－２）配列番号１０において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
    　請求項１～５の何れか１項に記載の１，３－プロパンジオールの製造方法。
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