JP2014525239A - 細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする変種スクロース輸送ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする、変種スクロース輸送ポリペプチドについて記載する。さらに、変種株またはこれらの変種スクロース輸送ポリペプチドを含んでなる組換え細菌、およびグリセロールおよびグリセロール由来生成物などを生産するための細菌の利用方法を提供する。
Description
本発明は、微生物学および分子生物学分野に関する。より具体的には、細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする変種スクロース輸送ポリペプチド、これらの変種スクロース輸送ポリペプチドを含んでなる変種株または組換え細菌、およびこのような細菌を利用して、グリセロールおよびグリセロール由来生成物などの生成物を生産する方法が提供される。
多くの商業的に有用な微生物は、それらの主要炭水化物源としてグルコースを使用する。しかしながら、商業的に望ましい生成物の生産のために開発された微生物によるグルコース使用の不都合は、グルコースの高コストである。微生物生産系のための炭水化物源としてのスクロース、およびスクロースとその他の糖類を含有する混合原材料の使用は、これらの物質が、通常、より低コストで容易に入手できることから、商業的により望ましいであろう。
生産微生物は、それが混合原材料中に存在する任意のスクロースを利用し得る場合に、より効率的に機能し得る。したがって生産微生物が、主要炭素源としてスクロースを効率的に利用する能力を有しない場合、それは効率的に機能し得ない。例えば細菌細胞は、典型的に、優先的な糖使用を示し、グルコースが最も優先される。糖類混合物を含有する人工培地では、典型的に、その他の糖類に先だってグルコースが完全に代謝される。その上多くの細菌には、スクロースを利用する能力が欠如している。例えば大腸菌(Escherichia coli)(E.coli)株の50%未満が、スクロースを利用する能力を有する。したがって生産微生物が、炭水化物源としてスクロースを利用できない場合、それがスクロースを利用し得るように、微生物を遺伝子改変することが望ましい。
スクロース利用遺伝子の組み込みによって、スクロースを利用するように遺伝子操作された組換え細菌が、報告されている。例えばLivshits et al.(米国特許第6,960,455号明細書)は、スクロース利用のための代謝経路をコードする遺伝子を含有する大腸菌(Escherichia coli)株を使用した、アミノ酸の生産を記載する。さらに、Olson et al.(Appl.Microbiol.Biotechnol.74:1031−1040,2007)は、炭素源としてスクロースを使用して、L−チロシンまたはL−フェニルアラニンを産生する、スクロース分解に関与する遺伝子を保有する大腸菌(Escherichia coli)株を記載する。さらにEliot et al.(米国特許出願公開第2011/0136190号明細書)は、グリセロールおよびグリセロール由来生成物を産生できる組換え細菌を記載する。
しかしながら、スクロースを利用する改善された能力を有する、細菌系統に対する必要性がある。さらに炭素源としてスクロースを使用して、グリセロールおよびグリセロール由来生成物を産生する、改善された能力を有する細菌系統に対する必要性がある。
一実施形態は、
(a)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
(b)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
(c)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(a)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する、変種スクロース輸送ポリペプチドを提供する。
(a)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
(b)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
(c)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(a)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する、変種スクロース輸送ポリペプチドを提供する。
別の実施形態は、細菌であって、そのゲノム中に、または少なくとも1つの組換え構築物上に、
(a)(i)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(A)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(B)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(C)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(D)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(E)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(F)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(G)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(H)位置61におけるロイシンからチロシンへ;
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
(ii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
(iii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(i)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(b)スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなり、
(a)および(b)は、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに前記細菌は、配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する細菌、
を提供する。
(a)(i)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(A)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(B)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(C)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(D)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(E)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(F)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(G)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(H)位置61におけるロイシンからチロシンへ;
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
(ii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
(iii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(i)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(b)スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなり、
(a)および(b)は、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに前記細菌は、配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する細菌、
を提供する。
別の実施形態は、
a)変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、本明細書で開示されるように、スクロース存在下で1,3−プロパンジオール、グリセロール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する、組換え細菌を培養するステップと、
b)生成されたグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、
スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法、を提供する。
a)変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、本明細書で開示されるように、スクロース存在下で1,3−プロパンジオール、グリセロール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する、組換え細菌を培養するステップと、
b)生成されたグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、
スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法、を提供する。
簡単な配列説明
以下の配列は、37C.F.R.1.8211.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列規則」)に準拠して、世界知的所有権機関(WIPO)基準ST.25(2009)およびEPOおよびPCT(規則5.2および49.5(a−bis)、および実施細則の第208節および付録C)の配列表要件に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、37C.F.R.§1.822に記載される規則に従う。
以下の配列は、37C.F.R.1.8211.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列規則」)に準拠して、世界知的所有権機関(WIPO)基準ST.25(2009)およびEPOおよびPCT(規則5.2および49.5(a−bis)、および実施細則の第208節および付録C)の配列表要件に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、37C.F.R.§1.822に記載される規則に従う。
配列番号45は、大腸菌(Escherichia coli)ATCC(登録商標)13281のcscAKB遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である。
配列番号80は、プラスミドpSYCO101のヌクレオチド配列である。
配列番号81は、プラスミドpSYCO103のヌクレオチド配列である。
配列番号82は、プラスミドpSYCO106のヌクレオチド配列である。
配列番号83は、プラスミドpSYCO109のヌクレオチド配列である。
配列番号84は、プラスミドpSYCO400/AGROのヌクレオチド配列である。
配列番号85〜102は、本明細書の実施例で使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号103は、プラスミドpBHR−cscBKAのヌクレオチド配列である。
配列番号104〜113は、比較例11〜13、15、17〜19、および21〜24に記載される、CscB変異株のアミノ酸配列である。
配列番号80は、プラスミドpSYCO101のヌクレオチド配列である。
配列番号81は、プラスミドpSYCO103のヌクレオチド配列である。
配列番号82は、プラスミドpSYCO106のヌクレオチド配列である。
配列番号83は、プラスミドpSYCO109のヌクレオチド配列である。
配列番号84は、プラスミドpSYCO400/AGROのヌクレオチド配列である。
配列番号85〜102は、本明細書の実施例で使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号103は、プラスミドpBHR−cscBKAのヌクレオチド配列である。
配列番号104〜113は、比較例11〜13、15、17〜19、および21〜24に記載される、CscB変異株のアミノ酸配列である。
本明細書に記載される各参考文献の開示は、参照によってその内容全体を援用する。
文脈上例外が明記されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲の用法では、単数形「a」、「an」、および「the」は、複数形への言及を含む。したがって例えば、「a cell(細胞)」への言及は、1つまたは複数の細胞、および当業者に知られているその同等物などを含む。
本開示の文脈では、いくつかの用語および略称が使用される。以下の定義が提供される。
「オープンリーディングフレーム」は、「ORF」と略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「PCR」と略記される。
「American Type Culture Collection」は、「ATCC」と略記される。
「組換えグリセロール産生細菌」という用語は、グリセロールおよび/またはグリセロール由来生成物を産生できるように遺伝子操作された細菌を指す。
「変種スクロース輸送ポリペプチド」という用語は、野生型スクロース輸送ポリペプチド配列と異なるアミノ酸配列を有する、スクロース輸送活性を有するポリペプチドを指す。変種スクロース輸送ポリペプチド配列の違いは、以下のいずれか1つであってもよい。(i)野生型配列の少なくとも1つの位置のアミノ酸置換、(ii)変種スクロース輸送ポリペプチド配列は、野生型配列から短縮されていてもよい、または(iii)変種スクロース輸送ポリペプチド配列は、野生型配列から短縮されていて、野生型配列の少なくとも1つの位置のアミノ酸置換を含有してもよい。
文脈上例外が明記されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲の用法では、単数形「a」、「an」、および「the」は、複数形への言及を含む。したがって例えば、「a cell(細胞)」への言及は、1つまたは複数の細胞、および当業者に知られているその同等物などを含む。
本開示の文脈では、いくつかの用語および略称が使用される。以下の定義が提供される。
「オープンリーディングフレーム」は、「ORF」と略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「PCR」と略記される。
「American Type Culture Collection」は、「ATCC」と略記される。
「組換えグリセロール産生細菌」という用語は、グリセロールおよび/またはグリセロール由来生成物を産生できるように遺伝子操作された細菌を指す。
「変種スクロース輸送ポリペプチド」という用語は、野生型スクロース輸送ポリペプチド配列と異なるアミノ酸配列を有する、スクロース輸送活性を有するポリペプチドを指す。変種スクロース輸送ポリペプチド配列の違いは、以下のいずれか1つであってもよい。(i)野生型配列の少なくとも1つの位置のアミノ酸置換、(ii)変種スクロース輸送ポリペプチド配列は、野生型配列から短縮されていてもよい、または(iii)変種スクロース輸送ポリペプチド配列は、野生型配列から短縮されていて、野生型配列の少なくとも1つの位置のアミノ酸置換を含有してもよい。
「スクロース輸送活性を有するポリペプチド」という用語は、微生物細胞中へのスクロース輸送を仲介できるポリペプチドを指す。
「フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド」という用語は、D−果糖+ATPから果糖−リン酸エステル+ADPへの変換を触媒する能力を有するポリペプチドを指す。フルクトキナーゼの典型例は、EC 2.7.1.4である。果糖をリン酸化するいくらかの能力を有する酵素は、この活性がそれらの優勢な活性か否かを問わず、フルクトキナーゼと称されてもよい。フルクトキナーゼと、フルクトキナーゼ活性を有するタンパク質とをコードする遺伝子に使用される略号としては、例えば「Frk」、「scrK」、「cscK」、「FK」、および「KHK」が挙げられる。フルクトキナーゼは、アグロバクテリウム・ツメフアシェンス(Agrobacterium tumefaciens)およびストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)中のscrK遺伝子によって;および特定の大腸菌(Escherichia coli)株中のcscK遺伝子によって、コードされる。
「フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド」という用語は、D−果糖+ATPから果糖−リン酸エステル+ADPへの変換を触媒する能力を有するポリペプチドを指す。フルクトキナーゼの典型例は、EC 2.7.1.4である。果糖をリン酸化するいくらかの能力を有する酵素は、この活性がそれらの優勢な活性か否かを問わず、フルクトキナーゼと称されてもよい。フルクトキナーゼと、フルクトキナーゼ活性を有するタンパク質とをコードする遺伝子に使用される略号としては、例えば「Frk」、「scrK」、「cscK」、「FK」、および「KHK」が挙げられる。フルクトキナーゼは、アグロバクテリウム・ツメフアシェンス(Agrobacterium tumefaciens)およびストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)中のscrK遺伝子によって;および特定の大腸菌(Escherichia coli)株中のcscK遺伝子によって、コードされる。
「スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド」という用語は、スクロースの加水分解を触媒して、グルコースおよび果糖を生成する能力を有するポリペプチドを指す。このようなポリペプチドは、「インベルターゼ」または「β−フルクトフラノシダーゼ」と称されることが多い。これらの酵素の典型例は、EC 3.2.1.26である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の例は、大腸菌(E.coli)EC3132株(Jahreis et al.、前出)またはATCC(登録商標)13281(Olson et al.、前出)に見られるcscA遺伝子、ビフィドバクテリウム・ラクティス(Bifidobacterium lactis)DSM 10140T株のbfrA遺伝子、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のSUC2遺伝子(Carlson and Botstein,Cell 28:145,1982)である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドはまた、スクロースリン酸ヒドロラーゼ活性も有してもよい。このようなペプチドの一例は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)中のscrBによってコードされる(Engels et al.,FEMS Microbiol Lett.289:80−89,2008)。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドはまた、スクロースホスホリラーゼ活性も有してもよい。このような酵素の典型例は、EC 2.4.1.7である。スクロースヒドロラーゼ活性を有するスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子の例は、特にロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)DSM 20193(Goedl et al.,Journal of Biotechnology 129:77−86,2007)、およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)DSM 20083(van den Broek et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.65:219−227,2004)に見られる。
「グリセロール誘導体」および「グリセロール由来生成物」という用語は、本明細書において同義的に使用され、グリセロールから、またはグリセロールを含む経路中で、合成される化合物を指す。このような生成物の例としては、3−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサール、1,2−プロパンジオール、および1,3−プロパンジオールが挙げられる。
「微生物生成物」という用語は、微生物で生成された、すなわち微生物が物質を代謝した結果である生成物を指す。生成物は、微生物によって天然に産生されてもよく、または微生物は生成物を産生するように遺伝子操作されてもよい。
「ホスホエノールピルビン酸−糖ホスホトランスフェラーゼ系」、「PTS系」、および「PTS」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ホスホエノールピルビン酸依存性糖取り込み系を指す。
「リン酸運搬タンパク質HPr」および「PtsH」という用語は、大腸菌(E.coli)中のptsHによってコードされるリン酸運搬タンパク質を指す。「ホスホエノールピルビン酸−タンパク質ホスホトランスフェラーゼ」および「PtsI」という用語は、大腸菌(E.coli)中のptsIによってコードされるホスホトランスフェラーゼであるEC 2.7.3.9を指す。「グルコース特異的IIA成分」および「Crr」という用語は、大腸菌(E.coli)中のcrrによってコードされる、EC 2.7.1.69と命名される酵素を指す。PtsH、PtsI、およびCrrは、PTS系を構成する。
「微生物生成物」という用語は、微生物で生成された、すなわち微生物が物質を代謝した結果である生成物を指す。生成物は、微生物によって天然に産生されてもよく、または微生物は生成物を産生するように遺伝子操作されてもよい。
「ホスホエノールピルビン酸−糖ホスホトランスフェラーゼ系」、「PTS系」、および「PTS」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ホスホエノールピルビン酸依存性糖取り込み系を指す。
「リン酸運搬タンパク質HPr」および「PtsH」という用語は、大腸菌(E.coli)中のptsHによってコードされるリン酸運搬タンパク質を指す。「ホスホエノールピルビン酸−タンパク質ホスホトランスフェラーゼ」および「PtsI」という用語は、大腸菌(E.coli)中のptsIによってコードされるホスホトランスフェラーゼであるEC 2.7.3.9を指す。「グルコース特異的IIA成分」および「Crr」という用語は、大腸菌(E.coli)中のcrrによってコードされる、EC 2.7.1.69と命名される酵素を指す。PtsH、PtsI、およびCrrは、PTS系を構成する。
「PTSマイナス」という用語は、その天然状態でPTS系を含有しない微生物、またはPTS遺伝子不活性化を通じて、その中でPTS系が不活性化されている微生物を指す。
「グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「G3PDH」という用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)からグリセロール3−リン酸(G3P)への変換を触媒する酵素活性に関与するポリペプチドを指す。生体内G3PDHは、NADまたはNADP依存性であってもよい。補助因子特異的グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼに特に言及する場合、「NAD依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「NADP依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」という用語が使用される。一般的に、NAD依存性およびNADP依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼは、(例えばgpsAによってコードされる酵素によって)NADおよびNADPを区別なく使用できるので、NAD依存性およびNADP依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼという用語は、同義的に使用される。NAD依存性酵素(EC 1.1.1.8)は、例えば本明細書でDAR1とも称されるGPD1(コード配列は配列番号1に記載され;コードされたタンパク質配列は配列番号2に記載される)、またはGPD2(コード配列は配列番号3に記載され;コードされたタンパク質配列は配列番号4に記載される)、またはGPD3をはじめとする、数種の遺伝子によってコードされる。NADP依存性酵素(EC 1.1.1.94)は、例えばgpsAによってコードされる。
「グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「G3PDH」という用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)からグリセロール3−リン酸(G3P)への変換を触媒する酵素活性に関与するポリペプチドを指す。生体内G3PDHは、NADまたはNADP依存性であってもよい。補助因子特異的グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼに特に言及する場合、「NAD依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「NADP依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」という用語が使用される。一般的に、NAD依存性およびNADP依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼは、(例えばgpsAによってコードされる酵素によって)NADおよびNADPを区別なく使用できるので、NAD依存性およびNADP依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼという用語は、同義的に使用される。NAD依存性酵素(EC 1.1.1.8)は、例えば本明細書でDAR1とも称されるGPD1(コード配列は配列番号1に記載され;コードされたタンパク質配列は配列番号2に記載される)、またはGPD2(コード配列は配列番号3に記載され;コードされたタンパク質配列は配列番号4に記載される)、またはGPD3をはじめとする、数種の遺伝子によってコードされる。NADP依存性酵素(EC 1.1.1.94)は、例えばgpsAによってコードされる。
「グリセロール3−ホスファターゼ」、「sn−グリセロール3−ホスファターゼ」、「D,L−グリセロールホスファターゼ」、および「G3Pホスファターゼ」という用語は、グリセロール3−リン酸と水から、グリセロールと無機リン酸への変換を触媒できる酵素活性を有する、ポリペプチドを指す。G3Pホスファターゼは、例えばGPP1(コード配列は配列番号5に記載され;コードされたタンパク質配列は配列番号6に記載される)、またはGPP2(コード配列は配列番号7に記載され;コードされたタンパク質配列は配列番号8に記載される)によってコードされる。
「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」という用語は、グリセロール分子からその生成物である3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3−HPA)への変換を触媒できる酵素活性を有する、ポリペプチドを指す。
「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」という用語は、グリセロール分子からその生成物である3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3−HPA)への変換を触媒できる酵素活性を有する、ポリペプチドを指す。
本発明の目的では、デヒドラターゼ酵素は、それぞれ好ましい基質がグリセロールおよび1,2−プロパンジオールである、グリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)およびジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)を含む。デヒドラターゼ酵素の遺伝子は、特にクレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、クロストリジウム・パステリアヌム(Clostridium pasteurianum)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、およびラクトバチルス・ロイテリー(Lactobacillus reuteri)中で同定されている。いずれの場合にも、デヒドラターゼは、大型または「α」サブユニット、中型または「β」サブユニット、および小型または「γ」サブユニットの3つのサブユニットから構成される。遺伝子は、例えばDaniel et al.(FEMS Microbiol.Rev.22,553(1999))およびToraya and Mori(J.Biol.Chem.274,3372(1999))にも記載される。グリセロールデヒドラターゼの大型または「α」(アルファ)サブユニットをコードする遺伝子としては、dhaB1(コード配列は配列番号9に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号10に記載される)、gldA、およびdhaBが挙げられ;中型または「β」(ベータ)サブユニットをコードする遺伝子としては、dhaB2(コード配列は配列番号11に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号12に記載される)、gldB、およびdhaCが挙げられ;小型または「γ」(ガンマ)サブユニットをコードする遺伝子としては、dhaB3(コード配列は配列番号13に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号14に記載される)、gldC、およびdhaEが挙げられる。ジオールデヒドラターゼの大型または「α」サブユニットをコードするその他の遺伝子としては、pduCおよびpddAが挙げられ;中型または「β」サブユニットをコードするその他の遺伝子としては、pduDおよびpddBが挙げられ;小型または「γ」サブユニットをコードするその他の遺伝子としては、pduEおよびpddCが挙げられる。
グリセロールおよびジオールデヒドラターゼは、グリセロールおよびその他の基質によって、作用機序に基づいた自殺不活性化を被る(Daniel et al.,FEMS Microbiol.Rev.22,553(1999))。「デヒドラターゼ再活性化因子」という用語は、デヒドラターゼ活性の再活性化に関与するタンパク質を指す。「デヒドラターゼ再活性化活性」、「デヒドラターゼ活性の再活性化」、および「デヒドラターゼ活性の再生」という用語は同義的に使用されて、反応触媒作用ができないデヒドラターゼを反応触媒作用ができるものに変換する現象、またはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象、または生体内におけるデヒドラターゼ酵素の有効半減期を延長する現象を指す。デヒドラターゼ再活性化因子に関与する2つのタンパク質が同定されている(例えば米国特許第6,013,494号明細書およびその中の参考文献;Daniel et al.、前出;Toraya and Mori,J.Biol.Chem.274,3372(1999);およびTobimatsu et al.,J.Bacteriol.181,4110(1999)を参照されたい)。タンパク質の1つをコードする遺伝子としては、例えばorfZ、dhaB4、gdrA、pduG、およびddrAが挙げられる。2つのタンパク質の2つめをコードする遺伝子としては、例えばorfX、orf2b、gdrB、pduH、およびddrBが挙げられる。
「1,3−プロパンジオール酸化還元酵素」、「1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」、および「DhaT」という用語は本明細書において同義的に使用され、3−HPAと1,3−プロパンジオールの相互変換を触媒できる酵素活性を有するポリペプチドを指すが、ただしこのような活性をコードする遺伝子は、その自然的(すなわち野生型)状況で、物理的にまたは転写的にデヒドラターゼ酵素に連結することが認められ、例えばクレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)のdhaTの場合のように、遺伝子はdhaレギュロン中に見られる。1,3−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子としては、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、およびクロストリジウム・パステリアヌム(Clostridium pasteurianum)のdhaTが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの遺伝子のそれぞれは、III型アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属するポリペプチドをコードするが、それは保存的鉄結合モチーフを呈示して、3−HPAと1,3−プロパンジオールのNAD+/NADH連鎖相互変換に対する選択性を有する(Johnson and Lin,J.Bacteriol.169,2050(1987);Daniel et al.,J.Bacteriol.177,2151(1995);およびLeurs et al.,FEMS Microbiol.Lett.154,337(1997))。同様の物理的特性の酵素が、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)およびラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)から単離されている(Veiga da Dunha and Foster,Appl.Environ.Microbiol.58,2005(1992))。
「dhaレギュロン」という用語は、デヒドラターゼ活性、再活性化活性、および1,3−プロパンジオール酸化還元酵素をはじめとするが、これに限定されるものではない、様々な生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、一連の関連ポリヌクレオチドまたはオープンリーディングフレームを指す。典型的にdhaレギュロンは、米国特許第7,371,558号明細書に記載されるように、オープンリーディングフレームdhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3、およびorfZを含んでなる。
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」および「Ald」という用語は、アルデヒドからカルボン酸への変換を触媒するポリペプチドを指す。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、NAD、NADP、FAD、またはPQQなどの酸化還元補助因子を使用してもよい。アルデヒドデヒドロゲナーゼの典型例は、EC 1.2.1.3(NAD依存性);EC 1.2.1.4(NADP依存性);EC 1.2.99.3(PQQ依存性);またはEC 1.2.99.7(FAD依存性)である。NADP依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの一例は、大腸菌(E.coli)遺伝子aldB(コード配列は配列番号15に記載される)によってコードされるAldB(配列番号16)である。NAD依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例としては、大腸菌(E.coli)遺伝子aldA(コード配列は配列番号17に記載される)によってコードされるAldA(配列番号18);および大腸菌(E.coli)遺伝子aldH(コード配列は配列番号19に記載される)によってコードされるAldH(配列番号20)が挙げられる。
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」および「Ald」という用語は、アルデヒドからカルボン酸への変換を触媒するポリペプチドを指す。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、NAD、NADP、FAD、またはPQQなどの酸化還元補助因子を使用してもよい。アルデヒドデヒドロゲナーゼの典型例は、EC 1.2.1.3(NAD依存性);EC 1.2.1.4(NADP依存性);EC 1.2.99.3(PQQ依存性);またはEC 1.2.99.7(FAD依存性)である。NADP依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの一例は、大腸菌(E.coli)遺伝子aldB(コード配列は配列番号15に記載される)によってコードされるAldB(配列番号16)である。NAD依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの例としては、大腸菌(E.coli)遺伝子aldA(コード配列は配列番号17に記載される)によってコードされるAldA(配列番号18);および大腸菌(E.coli)遺伝子aldH(コード配列は配列番号19に記載される)によってコードされるAldH(配列番号20)が挙げられる。
「グルコキナーゼ」および「Glk」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、D−グルコース+ATPからグルコース6−リン酸エステル+ADPへの変換を触媒するタンパク質を指す。グルコキナーゼの典型例は、EC 2.7.1.2である。グルコキナーゼは、大腸菌(E.coli)中のglkによってコードされる。
「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」および「Ppc」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ホスホエノールピルビン酸+H2O+CO2からホスフェート+オキザロ酢酸への変換を触媒する、タンパク質を指す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの典型例は、EC 4.1.1.31である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌(E.coli)中のppcによってコードされる。
「グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「GapA」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、グリセルアルデヒド−3−リン酸+ホスフェート+NAD+から3−ホスホ−D−グリセロイル−ホスフェート+NADH+H+への変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼの典型例は、EC 1.2.1.12である。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌(E.coli)中のgapAによってコードされる。
「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」および「Ppc」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ホスホエノールピルビン酸+H2O+CO2からホスフェート+オキザロ酢酸への変換を触媒する、タンパク質を指す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの典型例は、EC 4.1.1.31である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌(E.coli)中のppcによってコードされる。
「グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「GapA」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、グリセルアルデヒド−3−リン酸+ホスフェート+NAD+から3−ホスホ−D−グリセロイル−ホスフェート+NADH+H+への変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼの典型例は、EC 1.2.1.12である。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌(E.coli)中のgapAによってコードされる。
「好気性呼吸制御タンパク質」および「ArcA」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、包括的調節タンパク質を指す。好気性呼吸制御タンパク質は、大腸菌(E.coli)中のarcAによってコードされる。
「メチルグリオキサールシンターゼ」および「MgsA」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ジヒドロキシアセトンリン酸からメチルグリオキサール+ホスフェートへの変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。メチルグリオキサールシンターゼの典型例は、EC 4.2.3.3である。メチルグリオキサールシンターゼは、大腸菌(E.coli)中のmgsAによってコードされる。
「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ」および「Edd」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、6−ホスホ−グルコン酸塩から2−ケト−3−デオキシ−6−ホスホ−グルコン酸塩+H2Oへの変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。ホスホグルコン酸デヒドラターゼの典型例は、EC 4.2.1.12である。ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、大腸菌(E.coli)中のeddによってコードされる。
「メチルグリオキサールシンターゼ」および「MgsA」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、ジヒドロキシアセトンリン酸からメチルグリオキサール+ホスフェートへの変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。メチルグリオキサールシンターゼの典型例は、EC 4.2.3.3である。メチルグリオキサールシンターゼは、大腸菌(E.coli)中のmgsAによってコードされる。
「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ」および「Edd」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、6−ホスホ−グルコン酸塩から2−ケト−3−デオキシ−6−ホスホ−グルコン酸塩+H2Oへの変換を触媒できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。ホスホグルコン酸デヒドラターゼの典型例は、EC 4.2.1.12である。ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、大腸菌(E.coli)中のeddによってコードされる。
「YciK」という用語は、大腸菌(E.coli)中のcob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるbtuRと翻訳共役するyciKによってコードされる、推定上の酵素を指す。
「cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ」という用語は、デオキシアデノシル部分をATPから還元コリノイドへ転移できる酵素を指す。cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼの典型例は、EC 2.5.1.17である。cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼは、大腸菌(E.coli)中の遺伝子「btuR」、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)中の「cobA」、およびシュードモナス・デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)中の「cobO」によってコードされる。
「cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ」という用語は、デオキシアデノシル部分をATPから還元コリノイドへ転移できる酵素を指す。cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼの典型例は、EC 2.5.1.17である。cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼは、大腸菌(E.coli)中の遺伝子「btuR」、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)中の「cobA」、およびシュードモナス・デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)中の「cobO」によってコードされる。
「ガラクトース−プロトン共輸送体」および「GalP」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、糖およびプロトンをぺリプラズムから細胞質へ輸送できる酵素活性を有する、タンパク質を指す。D−グルコースが、GalPの好ましい基質である。ガラクトース−プロトン共輸送体は、大腸菌(Escherichia coli)中のgalPによってコードされる(コード配列は配列番号21に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号22に記載される)。
「非特異的触媒活性」という用語は、3−HPAと1,3−プロパンジオールとの相互変換を触媒できる酵素活性を有するポリペプチドを指し、1,3−プロパンジオール酸化還元酵素を明確に除外する。典型的にこれらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。このような酵素は、FADまたはFMNなどのフラビン類をはじめとするが、これに限定されるものではない、NAD+/NADH以外の補助因子を利用してもよい。非特異的アルコールデヒドロゲナーゼ(yqhD)の遺伝子は、例えば大腸菌(E.coli)K−12株中で内因性にコードされて、機能的に発現されることが認められる。
「非特異的触媒活性」という用語は、3−HPAと1,3−プロパンジオールとの相互変換を触媒できる酵素活性を有するポリペプチドを指し、1,3−プロパンジオール酸化還元酵素を明確に除外する。典型的にこれらの酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼである。このような酵素は、FADまたはFMNなどのフラビン類をはじめとするが、これに限定されるものではない、NAD+/NADH以外の補助因子を利用してもよい。非特異的アルコールデヒドロゲナーゼ(yqhD)の遺伝子は、例えば大腸菌(E.coli)K−12株中で内因性にコードされて、機能的に発現されることが認められる。
「1.6 long GIプロモーター」、「1.20 short/long GIプロモーター」、および「1.5 long GIプロモーター」という用語は、米国特許第7,132,527号明細書に記載されるように、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)グルコースイソメラーゼ遺伝子のプロモーターを含有する、ポリヌクレオチドまたは断片を指す。これらのプロモーター断片は、野生型ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)グルコースイソメラーゼ遺伝子プロモーターとの比較で、それらの活性を低下させる変異を含む。
「機能」および「酵素機能」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、それ自体が反応によって消費されることなく、特定の化学反応が起きる速度を変化させる酵素の触媒活性を指す。このような活性は、生成物または基質のいずれかの生成が適切な条件下で達成されてもよい、平衡にある反応に適用されてもよいものと理解される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
「炭素基質」および「炭素源」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、本明細書で開示される組換え細菌によって代謝され得る炭素源を指し、具体的には炭素供給源はスクロースを含んでなる。炭素源は、単糖類、その他の二糖類、オリゴ糖類;または多糖類をさらに含んでなってもよい。
「宿主細胞」および「宿主細菌」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、これらの遺伝子を発現して、活性遺伝子生成物を産生できる細菌を指す。
「生産微生物」という用語は、本明細書の用法では、1,3−プロパンジオール、グリセロール、3−ヒドロキシプロピオン酸、多価不飽和脂肪酸などの特定の生成物を生産するのに使用される組換え微生物をはじめとするが、これに限定されるものではない、微生物を指す。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
「炭素基質」および「炭素源」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、本明細書で開示される組換え細菌によって代謝され得る炭素源を指し、具体的には炭素供給源はスクロースを含んでなる。炭素源は、単糖類、その他の二糖類、オリゴ糖類;または多糖類をさらに含んでなってもよい。
「宿主細胞」および「宿主細菌」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、これらの遺伝子を発現して、活性遺伝子生成物を産生できる細菌を指す。
「生産微生物」という用語は、本明細書の用法では、1,3−プロパンジオール、グリセロール、3−ヒドロキシプロピオン酸、多価不飽和脂肪酸などの特定の生成物を生産するのに使用される組換え微生物をはじめとするが、これに限定されるものではない、微生物を指す。
本明細書の用法では、「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または二本鎖ポリマーをはじめとする、ポリヌクレオチドを意味する。核酸としてはまた、断片および改変ヌクレオチドも挙げられる。したがって「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有していてもよい、単鎖または二本鎖RNAまたはDNAポリマーを指す。ヌクレオチド(通常それらの5’−一リン酸の形態で見られる)は、次のようなそれらの一文字名によって言及される。「A」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸(それぞれRNAまたはDNA)、「C」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「G」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「U」はウリジル酸、「T」はデオキシチミジル酸、「R」はプリン(AまたはG)、「Y」はピリミジン(CまたはT)、「K」はGまたはT、「H」はAまたはCまたはT、「I」はイノシン、および「N」は任意のヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有していてもよく、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーであってもよい。DNAポリマーの形態のポリヌクレオチドは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、またはそれらの混合物の1つまたは複数のセグメントを含んでなってもよい。
「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する(5’非コード配列)および後続の(3’非コード配列)制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
「天然ヌクレオチド配列」および「野生型ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、常態で宿主微生物中に見られるヌクレオチド配列を指す。
「非天然ヌクレオチド配列」という用語は、常態では宿主微生物中に見られないヌクレオチド配列を指す。
「天然ポリペプチド」および「野生型ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、常態で宿主微生物中に見られるポリペプチドを指す。
「非天然ポリペプチド」という用語は、常態では宿主微生物中に見られないポリペプチドを指す。
「コードする」および「コーディング」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、それによって遺伝子が、転写および翻訳機構を通じてアミノ酸配列を生成する過程を指す。
「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。
「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する(5’非コード配列)および後続の(3’非コード配列)制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
「天然ヌクレオチド配列」および「野生型ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、常態で宿主微生物中に見られるヌクレオチド配列を指す。
「非天然ヌクレオチド配列」という用語は、常態では宿主微生物中に見られないヌクレオチド配列を指す。
「天然ポリペプチド」および「野生型ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、常態で宿主微生物中に見られるポリペプチドを指す。
「非天然ポリペプチド」という用語は、常態では宿主微生物中に見られないポリペプチドを指す。
「コードする」および「コーディング」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、それによって遺伝子が、転写および翻訳機構を通じてアミノ酸配列を生成する過程を指す。
「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。
「適切な制御配列」とは、コード配列の上流(5’非コード配列)、配列中、または下流(3’非コード配列)に位置して、転写、RNAプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、5’非翻訳リーダー配列(例えば転写開始部位と翻訳開始コドンの間)、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子生成物の発現に要する、コード配列に先行する(5’非コード配列)および後続の(3’非コード配列)制御配列とを含んでなる、DNA断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に1)プロモーター配列;2)コード配列(すなわちORF);および3)真核生物中では通常ポリアデニル化部位を含有する、3’非翻訳範囲(例えばターミネーター)から構成される。発現カセットは通常はベクター内に含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。細菌、酵母、および真菌をはじめとする異なる生物は、各宿主に対して正しい制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを用いて形質転換し得る。
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子生成物の発現に要する、コード配列に先行する(5’非コード配列)および後続の(3’非コード配列)制御配列とを含んでなる、DNA断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に1)プロモーター配列;2)コード配列(すなわちORF);および3)真核生物中では通常ポリアデニル化部位を含有する、3’非翻訳範囲(例えばターミネーター)から構成される。発現カセットは通常はベクター内に含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。細菌、酵母、および真菌をはじめとする異なる生物は、各宿主に対して正しい制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを用いて形質転換し得る。
「形質転換」(トランスフォーメーション)とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。核酸断片によって形質転換された宿主生物は、「組換え」または「形質転換」生物、または「形質転換体」と称される。「安定した形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされる、核および細胞小器官ゲノムの双方をはじめとする、宿主生物のゲノム中への核酸断片の移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組み込みなしのまたは安定遺伝形質なしの遺伝子発現がもたらされる、宿主生物の核、またはDNA含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
「機能的に同等である部分断片」および「機能的同等部分断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、断片または部分断片が活性酵素をコードするか否かを問わず、その中で、遺伝子発現を変化させまたは一定の表現型を生じる能力が保持される、単離核酸断片の一部または部分配列を指す。キメラ遺伝子は、それが活性酵素をコードするか否かを問わず、核酸断片またはその部分断片をプロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向で連結することによる抑制で使用するために、デザインし得る。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される、一連のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変化し得るのに対し、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示唆する。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される、一連のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変化し得るのに対し、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示唆する。
「実質的に同様」および「実質的に相当する」という用語は、本明細書において同義的に使用される。それらは、その中の1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介する、または一定の表現型を生じる、核酸断片の能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未改変断片と比較して、結果として生じる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、1つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の改変を指す。したがって当業者は、本発明が特定の例示的な配列を包含するのにとどまらないことを理解するであろう。さらに当業者は、本発明に包含される実質的に同様の核酸配列がまた、(例えば0.5×SSC(標準クエン酸ナトリウム)、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、60℃などの中程度にストリンジェントな条件下において)本明細書で例示される配列とハイブリダイズする、または本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等な本明細書で開示されるヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする、それらの能力によって規定されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物の相同的な配列などの中程度に類似した断片から、近縁関係にある生物の機能酵素を複製する遺伝子などの類似性の高い断片までをスクリーニングするために、調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、非標的核酸配列に対するハイブリダイゼーションよりも検出可能により大きな程度(例えば背景の少なくとも2倍)での、指定された核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的排除への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、ヌクレオチド配列の1つの補体が、もう一方のヌクレオチド配列と、典型的に少なくとも約80%の配列同一性、または90%の配列同一性、最高100%までの配列同一性(すなわち完全に相補的)を有する、2つのヌクレオチド配列である。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、その下でプローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。プローブは典型的に、検出される核酸配列と相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。一般に、プローブは長さが約1000未満のヌクレオチドであり、長さが500未満のヌクレオチドであってもよい。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、その下でプローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。プローブは典型的に、検出される核酸配列と相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。一般に、プローブは長さが約1000未満のヌクレオチドであり、長さが500未満のヌクレオチドであってもよい。
ハイブリダイゼーション法については、十分定義されている。典型的にはプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される。これは適切な濃度および温度条件下で、無機または有機塩存在下において、プローブとサンプルを接触させることを伴う。カオトロピック剤が添加されてもよい。核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形式に適合できる。最も適切なものの1つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着しており、またはそれと共有結合している。
ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件のストリンジェンシーを調節することで、プローブと100%相補的な標的配列を同定し得る(相同プロービング)。代案としては、より低い程度の類似性が検出されるようにストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくらかのミスマッチを許容し得る(非相同プロービング)。
ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件のストリンジェンシーを調節することで、プローブと100%相補的な標的配列を同定し得る(相同プロービング)。代案としては、より低い程度の類似性が検出されるようにストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくらかのミスマッチを許容し得る(非相同プロービング)。
典型的に、ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3において、約1.5M未満のNaイオンの塩濃度が、典型的に約0.01〜1.0MのNaイオン濃度(またはその他の塩)、および温度が、短いプローブ(例えば10〜50個のヌクレオチド)では少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば50個を超えるヌクレオチド)では少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成できる。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、37℃で30〜35%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝溶液によるハイブリダイゼーションと、50〜55℃で1×〜2×SSC(20×SSC=3.0MのNaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム)中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、37℃で40〜45%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDS中のハイブリダイゼーションと、55〜60℃で0.5×〜1×SSC中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、37℃で50%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDS中のハイブリダイゼーションと、60〜65℃で0.1×SSC中の洗浄が挙げられる。
特異性は典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。DNA−DNAハイブリッドでは、熱融点(Tm)は、Meinkoth et al.,Anal.Biochem.138:267−284(1984)の方程式から近似し得る。Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)−0.61(%form)−500/L;式中、Mは一価のカチオンのモル濃度であり、%GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、%formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Lは塩基対中のハイブリッドの長さである。Tmは相補的標的配列の50%が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする、(規定のイオン強度およびpH下における)温度である。Tmは、1%のミスマッチにつき約1℃低下する;したがってTm、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように、調節し得る。例えば≧90%同一の配列を求める場合、Tmを10℃低下させ得る。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列およびその相補体のTmよりも約5℃低くなるように選択される。しかし極度にストリンジェントな条件は、Tmよりも1、2、3、または4℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得る;中程度にストリンジェントな条件は、Tmよりも6、7、8、9、または10℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得る;低ストリンジェンシー条件は、Tmよりも11、12、13、14、15、または20℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得る。数式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のTmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが、固有に記載されることを理解するであろう。所望のミスマッチ程度が、45℃(水溶液)または32℃(ホルムアミド溶液)未満のTmをもたらす場合、より高い温度を使用できるように、SSC濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,New York(1993);およびCurrent Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel et al.,Eds.,Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York(1995)にある。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件は、少なくとも10、30、60、90、120または240分間適用できる。
核酸またはポリペプチド配列の文脈で、「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大対応関係で配列比較すると同一である、2つの配列核酸中の塩基またはアミノ酸残基を指す。
したがって「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって2つの最適整列配列を比較することで判定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、2つの配列の最適アラインメントのために、(付加または欠失を含まない)参照配列との比較で、付加または欠失(すなわちギャップ)を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が起きる位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウィンドウ中の位置総数で除算し、結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。有用な配列同一性百分率の例としては、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、または50%〜100%の任意の整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの同一性は、本明細書に記載されるプログラムのいずれかを使用して判定し得る。
したがって「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって2つの最適整列配列を比較することで判定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、2つの配列の最適アラインメントのために、(付加または欠失を含まない)参照配列との比較で、付加または欠失(すなわちギャップ)を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が起きる位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウィンドウ中の位置総数で除算し、結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。有用な配列同一性百分率の例としては、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、または50%〜100%の任意の整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの同一性は、本明細書に記載されるプログラムのいずれかを使用して判定し得る。
配列アラインメントおよび%同一性または類似性の計算は、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイート(DNASTAR Inc.,Madison,WI)のMegAlign(商標)プログラムをはじめとするが、これに限定されるものではない、相同配列を検出するようにデザインされた多様な比較方法を使用して、判定されてもよい。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメータの任意の組を意味する。
「アラインメントのClustal V法」は、Clustal Vとラベルされるアラインメント法(Higgins and Sharp,CABIOS.5:151−153(1989);Higgins,D.G.et al.,Comput.Appl.Biosci.8:189−191(1992)によって記載される)に相当し、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイート(DNASTAR Inc.,Madison,WI)のMegAlign(商標)プログラムにある。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、GAP PENALTY=10およびGAP LENGTH PENALTY=10に相当する。Clustal V法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の%同一性の計算のデフォルトパラメータは、KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5である。核酸では、これらのパラメータは、KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、およびDIAGONALS SAVED=4である。Clustal Vプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「%同一性」を得ることが可能である。
「アラインメントのClustal V法」は、Clustal Vとラベルされるアラインメント法(Higgins and Sharp,CABIOS.5:151−153(1989);Higgins,D.G.et al.,Comput.Appl.Biosci.8:189−191(1992)によって記載される)に相当し、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイート(DNASTAR Inc.,Madison,WI)のMegAlign(商標)プログラムにある。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、GAP PENALTY=10およびGAP LENGTH PENALTY=10に相当する。Clustal V法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の%同一性の計算のデフォルトパラメータは、KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5である。核酸では、これらのパラメータは、KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、およびDIAGONALS SAVED=4である。Clustal Vプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「%同一性」を得ることが可能である。
「アラインメントのClustal W法」は、Clustal Wとラベルされるアラインメント法(Higgins and Sharp、前出;Higgins,D.G. et al.、前出、によって記載される)に相当し、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイート(DNASTAR Inc.,Madison,WI)のMegAlign(商標)v6.1プログラムにある。多重アラインメントのためのデフォルトパラメータは、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs(%)=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet Series、DNA Weight Matrix=IUBに相当する。Clustal Wプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「%同一性」を得ることが可能である。
「アラインメントのBLASTN法」は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)によって提供される、デフォルトパラメータを使用して、ヌクレオチド配列を比較するアルゴリズムである。
「アラインメントのBLASTN法」は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)によって提供される、デフォルトパラメータを使用して、ヌクレオチド配列を比較するアルゴリズムである。
その他の種からの同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。%同一性の有用な例としては、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、または50%〜100%の任意の整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。確かに、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%などの50%〜100%の任意の整数アミノ酸同一性が、本発明について記載するのに有用であってもよい。またこの単離されたヌクレオチド断片の任意の全長または部分的補体も興味深い。
したがって本発明は、本明細書で開示される特定の例示的なヌクレオチド配列包含するだけにとどまらない。例えば遺伝コードの縮重を反映する遺伝子配列の改変が、検討される。また、所与の部位に化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされたタンパク質の機能特性に影響しない、遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野で周知である。本明細書における考察では、置換は、以下の5群の1つ内の交換として定義される。
1.小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2.負に帯電した極性残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3.正に帯電した極性残基:His、Arg、Lys;
4.大型脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);および
5.大型芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。
1.小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2.負に帯電した極性残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3.正に帯電した極性残基:His、Arg、Lys;
4.大型脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);および
5.大型芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。
したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、別のより疎水性の低い残基(グリシンなど)をコードするコドンで置換されてもよく、またはより疎水性の高い残留物(バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど)をコードするコドンで置換されてもよい。同様に、1つの負に帯電した残基の別の負に帯電した残基による置換(アスパラギン酸によるグルタミン酸置換など)をもたらす変化、または1つの正に帯電した残基の別の正に帯電した残基による置換(アルギニンによるリジン置換など)もまた、機能的に同等の生成物を生じることが予期され得る。多くの場合、タンパク質分子のN末端とC末端部分の改変をもたらすヌクレオチドの変化もまた、タンパク質活性を変化させることは予期されない。
提案された改変のそれぞれは、十分に当該技術分野の通例の技能範囲内であり、コードされた生成物の生物学的活性保持の判定についても同様である。さらに当業者は、本発明に包含される実質的に同様の配列が、上で定義されるようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。
提案された改変のそれぞれは、十分に当該技術分野の通例の技能範囲内であり、コードされた生成物の生物学的活性保持の判定についても同様である。さらに当業者は、本発明に包含される実質的に同様の配列が、上で定義されるようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。
本発明の好ましい実質的に同様の核酸断片は、そのヌクレオチド配列が、本明細書で報告される核酸断片のヌクレオチド配列と少なくとも70%同一の核酸断片である。より望ましい核酸断片は、本明細書で報告される核酸断片のヌクレオチド配列と、少なくとも90%同一である。最も望ましいのは、本明細書で報告される核酸断片のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一の核酸断片である。
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価、またはBLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.,215:403−410(1993))などのアルゴリズムを使用したコンピュータによる自動配列比較と同定のいずれかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子と相同的であると推定的に同定するためには、10個以上の隣接するアミノ酸または30個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法(例えばサザンハイブリダイゼーション)および単離法(例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション)において、20〜30個の隣接ヌクレオチドを含んでなる、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。これに加えて、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、12〜15個の塩基の短鎖オリゴヌクレオチドをPCR中で増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を構成する核酸断片を明確に同定および/または分離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定のタンパク質をコードする、完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、開示される配列の全部または実質的部分を使用できる。
「相補的」という用語は、配列比較すると逆平行方向にワトソン・クリック塩基対合できる、2つのヌクレオチド塩基配列間の関係について記述する。例えばDNAに関して、アデノシンはチミンと塩基対合でき、シトシンはグアニンと塩基対合できる。したがって本発明は、添付の配列表および明細書で報告される完全配列に相補的な単離核酸分子、ならびに実質的に同様の核酸配列を利用してもよい。
「単離された」という用語は、それが天然に結合している少なくとも1つの成分から取り出された、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列を指す。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性RNAの発現を制御できるDNA配列を指す。プロモーター配列は、隣接する要素と、より遠位の上流要素とからなり、後者の要素はエンハンサーと称されることが多い。したがって「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るDNA配列であり、プロモーターの内在的要素であってもよく、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を向上させるために挿入された、異種要素であってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成DNAセグメントを含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子発現を方向付けてもよいことを理解する。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、いくらかの変動があるDNA断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
「単離された」という用語は、それが天然に結合している少なくとも1つの成分から取り出された、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列を指す。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性RNAの発現を制御できるDNA配列を指す。プロモーター配列は、隣接する要素と、より遠位の上流要素とからなり、後者の要素はエンハンサーと称されることが多い。したがって「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るDNA配列であり、プロモーターの内在的要素であってもよく、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を向上させるために挿入された、異種要素であってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成DNAセグメントを含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子発現を方向付けてもよいことを理解する。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、いくらかの変動があるDNA断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
「3’非コード配列」、「転写ターミネーター」、および「終止配列」は、本明細書において同義的に使用されて、ポリアデニル化認識配列や、mRNAプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードするその他の配列をはじめとする、コード配列下流に位置するDNA配列を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する(すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある)。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合し得る。別の例では、本発明の相補的RNA領域は、標的mRNAの5’側または標的mRNAの3’側と、または標的mRNA中で、直接または間接的のいずれかで、作動可能に連結し得て、または第1の相補領域は標的mRNAの5’側であり、その補体は3’側である。
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する(すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある)。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合し得る。別の例では、本発明の相補的RNA領域は、標的mRNAの5’側または標的mRNAの3’側と、または標的mRNA中で、直接または間接的のいずれかで、作動可能に連結し得て、または第1の相補領域は標的mRNAの5’側であり、その補体は3’側である。
本明細書で使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989)により詳細に記載される。形質転換方法は当業者に良く知られており、後述する。
「PCR」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特定のDNA断片を合成する技術であり、一連の反復サイクルからなる(Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT)。典型的に、二本鎖DNAは熱変性されて、標的断片の3’境界に相補的な2本のプライマーが低温でアニールされて、次に中間温度で伸長される。これらの3つの連続ステップの1組が、「サイクル」と称される。
「PCR」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特定のDNA断片を合成する技術であり、一連の反復サイクルからなる(Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT)。典型的に、二本鎖DNAは熱変性されて、標的断片の3’境界に相補的な2本のプライマーが低温でアニールされて、次に中間温度で伸長される。これらの3つの連続ステップの1組が、「サイクル」と称される。
「プラスミド」または「ベクター」は染色体外要素であり、それは細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖DNA断片の形態である。このような要素は、いずれかの起源に由来する、単鎖または二本鎖DNAまたはRNAの、直線または環状、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が連結し、または組換えされて、細胞中に発現カセットを導入できるユニークな構造になっている。
「遺伝的に改変された」という用語は、遺伝子操作、形質転換および/または変異によって、遺伝物質を変化させる過程を指す。
「組換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ別々の2つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。「組換え」は、異種核酸の導入によって改変された細菌細胞またはベクターへの、またはそのように改変された細胞に由来する細胞への言及もまた含むが、故意の人間の介入なしに起きるような天然事象(例えば自然突然変異、自然形質転換、自然形質導入、自然遺伝子転位)による細胞またはベクターの改変は包含しない。
「変種細菌」という用語は、自然突然変異、自然形質転換、自然形質導入、または自然遺伝子転位を受けている;または変異誘発によって改変されている、野生型細菌を指す。
「遺伝的に改変された」という用語は、遺伝子操作、形質転換および/または変異によって、遺伝物質を変化させる過程を指す。
「組換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ別々の2つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。「組換え」は、異種核酸の導入によって改変された細菌細胞またはベクターへの、またはそのように改変された細胞に由来する細胞への言及もまた含むが、故意の人間の介入なしに起きるような天然事象(例えば自然突然変異、自然形質転換、自然形質導入、自然遺伝子転位)による細胞またはベクターの改変は包含しない。
「変種細菌」という用語は、自然突然変異、自然形質転換、自然形質導入、または自然遺伝子転位を受けている;または変異誘発によって改変されている、野生型細菌を指す。
「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えDNA構築物」という用語は、本明細書において同義的に使用される。組換え構築物は、例えば自然界では一緒に見られない調節およびコード配列などの核酸断片の人工的組み合わせを含んでなる。例えば組換え構築物は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。このような構築物は、単独で使用されてもよく、またはベクターと併せて使用されてもよい。ベクターが使用される場合、当業者に良く知られているように、ベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターを使用し得る。当業者は、本発明の単離核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するために、ベクター上に存在しなくてはならない遺伝要素を十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルとパターンをもたらしてもよく(Jones et al.,EMBO J.4:2411−2418(1985);De Almeida et al.,Mol.Gen.Genetics 218:78−86(1989))、したがって所望の発現レベルとパターンを提示する系統を得るために、複数事象をスクリーニングする必要があってもよいことを認識する。このようなスクリーニングは特に、DNAのサザン分析、mRNA発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロット分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
「発現」という用語は、本明細書での用法では、機能性最終生成物(例えば[前駆または成熟いずれかの]mRNAまたはタンパク質)の産生を指す。
「発現」という用語は、本明細書での用法では、機能性最終生成物(例えば[前駆または成熟いずれかの]mRNAまたはタンパク質)の産生を指す。
「導入」という用語は、核酸(例えば発現構築物)またはタンパク質を細胞中に提供することを意味する。導入は、真核生物または原核細胞中への核酸の組み込みへの言及を含み、核酸は細胞ゲノムに組み込まれてもよく、細胞への核酸またはタンパク質の一過性の提供への言及を含む。導入は、安定したまたは一過性の形質転換法、ならびに有性交配への言及を含む。したがって核酸断片(例えば組換え構築物/発現構築物)を細胞中に挿入する文脈において、「導入」は、「形質移入(トランスフェクション)」または「形質転換(トランスフォーメーション)」または「形質導入(トランスダクション)」を意味し、核酸断片の真核生物または原核細胞への組み込みへの言及を含み、核酸断片は、細胞ゲノム(例えば染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアDNA)に組み込まれて、自律性レプリコンに変換されてもよく、または一過性に発現されてもよい(例えば形質移入mRNA)。
「相同的」という用語は、類似した触媒機能がある、共通の進化上の起源のタンパク質またはポリペプチドを指す。本発明は、組換え技術を通じて相同的なタンパク質を産生する細菌を含んでもよい。
「相同的」という用語は、類似した触媒機能がある、共通の進化上の起源のタンパク質またはポリペプチドを指す。本発明は、組換え技術を通じて相同的なタンパク質を産生する細菌を含んでもよい。
本明細書では、細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする、変種スクロース輸送ポリペプチドが開示される。スクロース輸送ポリペプチドは、微生物細胞中へのスクロース輸送を仲介できるポリペプチドである。様々なスクロース輸送ポリペプチドが、当該技術分野で公知である。本明細書で開示されるスクロース輸送ポリペプチドは、大腸菌(E.coli)ATCC(登録商標)13281の野生型スクロース輸送ポリペプチドCscB(配列番号24に記載され、ヌクレオチドコード配列は配列番号23に記載される)の変種である。これらの変種スクロース輸送ポリペプチドは、本明細書の実施例1〜7に記載されるように、スクロース上でより迅速な増殖を呈示する変種大腸菌(E.coli)株から単離され、または本明細書の実施例10〜26に記載されるように、飽和変異誘発によって同定された。
一実施形態では、変種スクロース輸送ポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;
(viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有する、アミノ酸配列を有する。
(i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;
(viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有する、アミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、変種スクロース輸送ポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有する、アミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、変種スクロース輸送ポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有して、上に列挙した少なくとも1つのアミノ酸変化を有する、アミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、変種スクロース輸送ポリペプチドは、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、および配列番号44からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、変種スクロース輸送ポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有して、上に列挙した少なくとも1つのアミノ酸変化を有する、アミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、変種スクロース輸送ポリペプチドは、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、および配列番号44からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本明細書では、それらのゲノム中に、または少なくとも1つの組換え構築物上に、上述したような変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含んでなる細菌もまた開示される。細菌は、変種または組換え細菌であってもよい。ヌクレオチド配列は、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結する。これらの細菌は、配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する、野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度で、スクロースを代謝する。
変種細菌は、上述したように、変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、それらのゲノム中のスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の実施例1で記載されるように、大腸菌(E.coli)ATCC(登録商標)13281のcscAKB遺伝子クラスター(配列番号45)などのスクロース遺伝子クラスターを含有する野生型細菌系統を最小スクロース培地上で培養して、より迅速に増殖する株を選択することで単離されてもよい。さらにこのような変種細菌は、例えば本明細書の実施例10〜26に記載される飽和変異誘発を使用して、大腸菌(E.coli)ATCC(登録商標)13281のcscAKB遺伝子クラスター(配列番号45)などのスクロース遺伝子クラスターを含有する細菌系統の変異誘発によって作成されてもよい。
上述したような変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含んでなる組換え細菌は、下述するような当該技術分野で公知の方法を使用して、ゲノム中または少なくとも1つの組換え構築物上のいずれかで、ヌクレオチド配列を適切な宿主細菌に導入することで、構築されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、スクロースを代謝して、グリセロールおよび/またはグリセロール由来生成物を産生できる。
上述したような変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含んでなる組換え細菌は、下述するような当該技術分野で公知の方法を使用して、ゲノム中または少なくとも1つの組換え構築物上のいずれかで、ヌクレオチド配列を適切な宿主細菌に導入することで、構築されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、スクロースを代謝して、グリセロールおよび/またはグリセロール由来生成物を産生できる。
本明細書で開示される組換え細菌の構築で使用される適切な宿主細菌としては、エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、バチルス属(Bacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、乳酸桿菌属(Lactobacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、グルコノバクター(Gluconobacter)、サイトロバクター属(Citrobacter)、エンテロバクター属(Enterobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、アエロバクター(Aerobacter)、メチロバクター(Methylobacter)、サルモネラ属(Salmonella)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、およびシュードモナス属(Pseudomonas)の生物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、宿主細菌は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、サイトロバクター属(Citrobacter)、およびアエロバクター属(Aerobacter)から選択される。
別の実施形態では、宿主細菌は大腸菌(Escherichia coli)である。
いくつかの実施形態では、宿主細菌はPTSマイナスである。これらの実施形態では、宿主細菌はその天然状態においてPTSマイナスであり、または下述するようにPTS遺伝子の不活性化を通じてPTSマイナスにされてもよい。
生産微生物中では、糖類輸送と、輸送された糖類リン酸化のためのホスホエノールピルビン酸(PEP)の使用とを連結解除することが、時に望ましい。
別の実施形態では、宿主細菌は大腸菌(Escherichia coli)である。
いくつかの実施形態では、宿主細菌はPTSマイナスである。これらの実施形態では、宿主細菌はその天然状態においてPTSマイナスであり、または下述するようにPTS遺伝子の不活性化を通じてPTSマイナスにされてもよい。
生産微生物中では、糖類輸送と、輸送された糖類リン酸化のためのホスホエノールピルビン酸(PEP)の使用とを連結解除することが、時に望ましい。
「下方制御」という用語は、野生型タンパク質の活性と比較した、活性タンパク質の活性の低下または無効化を指す。PTSは、このタイプの輸送に必要とされるタンパク質をコードする、内在性遺伝子の1つまたは複数の発現を下方制御することで、不活性化されてもよい(「PTSマイナス」生物がもたらされる)。下方制御は、これらの遺伝子の1つまたは複数が、その遺伝子の部分内の挿入、欠失、または標的変異に関して「中断」を有する場合に典型的に起きて、中断は、遺伝子がゲノムから欠失して、タンパク質が翻訳されない完全遺伝子ノックアウト、またはタンパク質が挿入、欠失、アミノ酸置換またはその他の標的変異を有するような翻訳のいずれかをもたらす。タンパク質中の中断位置は、例えばタンパク質のN末端部分内、またはタンパク質のC末端部分内であってもよい。中断されたタンパク質は、中断されていないタンパク質と比較して損なわれた活性を有し、非機能性であり得る。タンパク質の発現低下または欠如をもたらす下方制御はまた、制御配列、転写、および翻訳因子および/または情報伝達経路の操作を通じて、またはセンス、アンチセンスまたはRNAi技術などの使用によってもたらし得る。
本明細書で開示される組換え細菌は、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、スクロースの加水分解を触媒して、果糖とグルコースを生成する能力を有する。スクロースヒドロラーゼ活性有するポリペプチドは既知であり、遺伝子cscA(コード配列は配列番号46に記載される)によってコードされる大腸菌(E.coli)野生型株EC3132のCscA(配列番号47に記載される)、遺伝子cscA(コード配列は配列番号48に記載される)によってコードされる大腸菌(E.coli)ATCC(登録商標)13821(配列番号49に記載される)のCscA;遺伝子bfrA(コード配列は配列番号50に記載される)によってコードされるビフィドバクテリウム・ラクティス(Bifidobacterium lactis)DSM 10140T株のBfrA(配列番号51に記載される);遺伝子SUC2(コード配列は配列番号52に記載される)によってコードされるサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のSuc2p(配列番号53に記載される);遺伝子scrB(コード配列は配列番号54に記載される)によってコードされるコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のScrB(配列番号55に記載される);コードする遺伝子のコード配列が配列番号56に記載される、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)DSM 20193のスクロースホスホリラーゼ(配列番号57に記載される);および遺伝子sucP(コード配列は配列番号59に記載される)によってコードされる、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)DSM 20083のスクロースホスホリラーゼ(配列番号58に記載される)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、EC 3.2.1.26またはEC 2.4.1.7に分類される。
別の実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、または配列番号59に記載のアミノ酸配列と、少なくとも95%の配列同一性を有する。
別の実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号49に記載されるアミノ酸配列に相当する。
別の実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、または配列番号59に記載のアミノ酸配列と、少なくとも95%の配列同一性を有する。
別の実施形態では、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号49に記載されるアミノ酸配列に相当する。
本明細書で開示される組換え細菌はまた、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなってもよい。フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドとしては、フルクトキナーゼ(EC 2.7.1.4と命名される)および果糖リン酸化活性を有する様々なヘキソースキナーゼ(EC 2.7.1.3およびEC 2.7.1.1)が挙げられる。果糖リン酸化活性は、ヘキソキナーゼおよびケトヘキソキナーゼによって呈示されてもよい。本明細書で開示される組換え細菌を構築するのに使用されてもよい、多様な微生物のポリペプチドをコードする代表的な遺伝子を表1に列挙する。当業者は、果糖をリン酸化できるタンパク質(表1に列挙される遺伝子によってコードされるものなど)と実質的に同様のタンパク質もまた、使用されてもよいことを理解するであろう。
一実施形態では、フルクトキナーゼ活性有するポリペプチドは、EC 2.7.1.4、EC 2.7.1.3、またはEC 2.7.1.1に分類される。
別の実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、または配列番号75に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
別の実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号65に記載される配列に相当する。
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、およびフルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドを有する、ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列を使用して、同一またはその他の微生物種から、相同的なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離してもよい。例えば遺伝子の相同体は、公的に利用できる核酸配列データベースを検索するBLASTNなどの配列分析ソフトウェアを使用して、特定されてもよい。さらに配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーション法と、核酸増幅技術(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Mullis et al.、米国特許第4,683,202号明細書;リガーゼ連鎖反応(LCR)、Tabor,S.et al.,Proc.Acad.Sci.USA 82,1074,1985);または鎖置換増幅(SDA)、Walker,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392,(1992))の様々な使用によって例示される、DNAおよびRNA増幅法とが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、相同体を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いてもよい。
別の実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、または配列番号75に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する。
別の実施形態では、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号65に記載される配列に相当する。
スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、およびフルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドを有する、ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列を使用して、同一またはその他の微生物種から、相同的なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離してもよい。例えば遺伝子の相同体は、公的に利用できる核酸配列データベースを検索するBLASTNなどの配列分析ソフトウェアを使用して、特定されてもよい。さらに配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーション法と、核酸増幅技術(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Mullis et al.、米国特許第4,683,202号明細書;リガーゼ連鎖反応(LCR)、Tabor,S.et al.,Proc.Acad.Sci.USA 82,1074,1985);または鎖置換増幅(SDA)、Walker,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392,(1992))の様々な使用によって例示される、DNAおよびRNA増幅法とが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、相同体を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いてもよい。
当業者は、その他の供給源から単離された、これらのポリペプチドをコードする遺伝子もまた、本明細書で開示される組換え細菌で使用されてもよいことを理解するであろう。さらにコドン縮重のために、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に多様性を与えてもよく、実質的に同様のタンパク質を生じるアミノ酸の置換、欠失または付加が、コードされたタンパク質に含まれてもよい。
変種スクロース輸送ポリペプチド、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の実施例で記載されるように、PCR(例えば米国特許第4,683,202号明細書を参照されたい)、および所望の配列に結合するようにデザインされたプライマーを使用して単離してもよい。縮重プライマーまたは異種プローブハイブリダイゼーションなどを使用する、その他の遺伝子単離法が当業者に良く知られている。ヌクレオチド配列はまた、化学的に合成されてもよく、またはDNA2.0 Inc.(Menlo Park,CA)などの供給業者から購入され得る。
変種スクロース輸送ポリペプチド、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチド、およびスクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書の実施例で記載されるように、PCR(例えば米国特許第4,683,202号明細書を参照されたい)、および所望の配列に結合するようにデザインされたプライマーを使用して単離してもよい。縮重プライマーまたは異種プローブハイブリダイゼーションなどを使用する、その他の遺伝子単離法が当業者に良く知られている。ヌクレオチド配列はまた、化学的に合成されてもよく、またはDNA2.0 Inc.(Menlo Park,CA)などの供給業者から購入され得る。
ポリペプチドの発現は、当業者に知られている多数の方法の1つの使用によって、影響を受けることもある。例えば上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1つのマルチコピープラスミド上で、または宿主ゲノム中へのコード配列の1つまたは複数のコピーの組み込みによって、細菌に導入されてもよい。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、(例えば別々のプラスミド上で)別々に、または(例えば単一プラスミド上で)任意の組み合わせで、宿主細菌に導入されてもよい。宿主細菌が、ポリヌクレオチドの1つをコードする遺伝子を含有する場合、残りのヌクレオチド配列のみを細菌に導入すればよい。例えば宿主細菌が、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する場合、細菌が最適スクロース利用をできるようにするには、スクロース輸送体活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のみを導入すればよい。プラスミド上またはゲノム中のいずれかである導入コード領域は、少なくとも1つの高度に活性のプロモーターから発現されてもよい。組み込まれたコード領域は、それ自身のプロモーターを有するキメラ遺伝子の一部として導入され、またはそれはゲノムに内在性の高度に活性のプロモーターに隣接して、または高度に発現されたオペロン中に、組み込まれてもよい。適切なプロモーターとしては、CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、およびlac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、およびtrc(大腸菌(Escherichia coli)中での発現に有用)ならびにバチルス属(Bacillus)中での発現に有用なamy、apr、nprプロモーター、および様々なファージプロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。プロモーターはまた、Payne et al.(米国特許第7,132,527号明細書)に記載されるように、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)グルコースイソメラーゼプロモーターまたはその変種であってもよい。
一実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、グリセロールを産生できる。炭水化物または糖類を使用した、グリセロール調製の生物学的過程は、酵母およびいくつかの細菌、その他の真菌、および藻類中で知られている。細菌および酵母のどちらも、解糖中の果糖−1,6−ビスホスフェート経路を通じて、グルコースまたはその他の炭水化物を変換することで、グリセロールを産生する。本明細書で開示されるグリセロールを生産する方法では、グリセロールを天然で産生する宿主細菌が使用されてもよい。これに加えて、グリセロールおよびグリセロール誘導体を生産するために、細菌を遺伝子操作してもよい。多様な基質からのグリセロール生成能力は、米国特許第7,005,291号明細書に記載されるように、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)および/またはグリセロール−3−ホスファターゼの酵素活性発現を通じて提供されてもよい。宿主細菌中の酵素活性発現のために使用されてもよいタンパク質をコードする遺伝子は、米国特許第7,005,291号明細書に記載される。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の適切な例としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGPD1(コード配列は配列番号1に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号2に記載される)、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGPD2(コード配列は配列番号3に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号4に記載される)が挙げられるが、これに限定されるものではない。グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の適切な例としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGPP1(コード配列は配列番号5に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号6に記載される)、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGPP2(コード配列は配列番号7に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号8に記載される)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
グリセロールの生成増大は、標的内在性遺伝子の発現低下を通じて達成されてもよい。米国特許第7,005,291号明細書に記載されるように、グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性をコードする内在性遺伝子の下方制御は、グリセロール生成をさらに高める。炭素からグリセロールへのチャネリング増大は、米国特許第7,371,558号明細書に記載されるように、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子発現の低下によって達成されてもよい。下方制御は、例えばPTS系遺伝子を下方制御する上述の方法など、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して達成されてもよい。
グリセロールは、有用生成物の微生物生産のための基質を提供する。このような生成物、すなわちグリセロール誘導体の例としては、3−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサール、1,2−プロパンジオール、および1,3−プロパンジオールが挙げられるが、これに限定されるものではない。
グリセロールは、有用生成物の微生物生産のための基質を提供する。このような生成物、すなわちグリセロール誘導体の例としては、3−ヒドロキシプロピオン酸、メチルグリオキサール、1,2−プロパンジオール、および1,3−プロパンジオールが挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、1,3−プロパンジオールを産生できる。グリセロール誘導体1,3−プロパンジオールは、ポリエステル繊維生産、およびポリウレタンと環状化合物の製造における可能な効用を有するモノマーである。1,3−プロパンジオールは、米国特許第5,686,276号明細書に記載されるように、グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の炭素基質の生物変換により、単一微生物によって産生され得る。この生物変換では、上述したように、グリセロールが炭素基質から生成される。グリセロールは、宿主細菌によってコードされ得る、または組換えによって宿主に導入され得る、デヒドラターゼ酵素によって、中間体3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。デヒドラターゼは、グリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)、ジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)またはこの変換を触媒できる任意のその他の酵素であり得る。グリセロールデヒドラターゼの「α」(アルファ)、「β」(ベータ)、および「γ」(ガンマ)サブユニットをコードする遺伝子の適切な例としては、それぞれクレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)のdhaB1(コード配列は配列番号9に記載される)、dhaB2(コード配列は配列番号11に記載される)、およびdhaB3(コード配列は配列番号13に記載される)が挙げられるが、これに限定されるものではない。3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから1,3−プロパンジオール(propandeiol)へのさらなる変換は、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.202)またはその他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る。1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の適切な例は、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)のdhaT(コード配列は配列番号76に記載され、コードされたタンパク質配列は配列番号77に記載される)である。
細菌を組換え遺伝子操作して、グリセロールおよびグリセロール誘導体1,3−プロパンジオールのより効率的な生成を提供し得る。例えば米国特許第7,005,291号明細書は、グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの内在性活性の片方または双方を中断しながら、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセロール−3−リン酸ホスファターゼの片方または双方の外来性活性を発現することから得られる利点がある、形質転換微生物と、グリセロールおよび1,3−プロパンジオールの生産方法とを開示する。
米国特許第6,013,494号明細書は、外来性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−3−リン酸ホスファターゼ、デヒドラターゼ、および1,3−プロパンジオール酸化還元酵素(例えばdhaT)を含んでなる単一微生物を使用して、1,3−プロパンジオールを生産する方法を記載する。米国特許第6,136,576号明細書は、デヒドラターゼおよびタンパク質X(後にデヒドラターゼ再活性化因子ペプチドと同定された)をさらに含んでなる組換え微生物を含んでなる、1,3−プロパンジオールを生産する方法を開示する。
米国特許第6,514,733号明細書は、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに変換する、(dhaTによってコードされる1,3−プロパンジオール酸化還元酵素と区別される)非特異的触媒活性のおかげで、力価(1リットルあたりのグラム生成物)の顕著な増大が得られる、工程の改善を記載する。さらに米国特許第7,132,527号明細書は、1,3−プロパンジオールの生産に有用なベクターおよびプラスミドを開示する。
米国特許第6,013,494号明細書は、外来性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−3−リン酸ホスファターゼ、デヒドラターゼ、および1,3−プロパンジオール酸化還元酵素(例えばdhaT)を含んでなる単一微生物を使用して、1,3−プロパンジオールを生産する方法を記載する。米国特許第6,136,576号明細書は、デヒドラターゼおよびタンパク質X(後にデヒドラターゼ再活性化因子ペプチドと同定された)をさらに含んでなる組換え微生物を含んでなる、1,3−プロパンジオールを生産する方法を開示する。
米国特許第6,514,733号明細書は、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを1,3−プロパンジオールに変換する、(dhaTによってコードされる1,3−プロパンジオール酸化還元酵素と区別される)非特異的触媒活性のおかげで、力価(1リットルあたりのグラム生成物)の顕著な増大が得られる、工程の改善を記載する。さらに米国特許第7,132,527号明細書は、1,3−プロパンジオールの生産に有用なベクターおよびプラスミドを開示する。
1,3−プロパンジオールの生成増大は、米国特許第7,371,558号明細書に記載されるように、いくつかの標的遺伝子発現の下方制御、およびその他の標的遺伝子の発現の上方制御をはじめとする宿主細菌のさらなる改変によって達成されてもよい。PTSマイナス宿主中におけるグルコースの炭素源としての利用のために、グルコキナーゼ活性の発現を増大させてもよい。
その発現の増大または上方制御が、1,3−プロパンジオール生成を増大させる追加的な遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる。
・典型的にEC 4.1.1.31として特徴付けられる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
・典型的にEC 2.5.1.17として特徴付けられる、cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ
・3−HPAと1,3−プロパンジオールの相互変換を触媒するのに十分な非特異的触媒活性、1,3−プロパンジオール酸化還元酵素は明確に除外され、典型的にこれらの酵素はアルコールデヒドロゲナーゼである。
その発現の増大または上方制御が、1,3−プロパンジオール生成を増大させる追加的な遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる。
・典型的にEC 4.1.1.31として特徴付けられる、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
・典型的にEC 2.5.1.17として特徴付けられる、cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ
・3−HPAと1,3−プロパンジオールの相互変換を触媒するのに十分な非特異的触媒活性、1,3−プロパンジオール酸化還元酵素は明確に除外され、典型的にこれらの酵素はアルコールデヒドロゲナーゼである。
その発現の低下または下方制御が、1,3−プロパンジオール生成を増大させる遺伝子としては、
・好気性呼吸制御タンパク質
・メチルグリオキサールシンターゼ
・酢酸キナーゼ
・ホスホトランスアセチラーゼ
・アルデヒドデヒドロゲナーゼA
・アルデヒドデヒドロゲナーゼB
・トリオースリン酸イソメラーゼ
・ホスホグルコン酸デヒドラターゼ
をコードする遺伝子が挙げられる。
・好気性呼吸制御タンパク質
・メチルグリオキサールシンターゼ
・酢酸キナーゼ
・ホスホトランスアセチラーゼ
・アルデヒドデヒドロゲナーゼA
・アルデヒドデヒドロゲナーゼB
・トリオースリン酸イソメラーゼ
・ホスホグルコン酸デヒドラターゼ
をコードする遺伝子が挙げられる。
別の実施形態では、本明細書で開示される組換え細菌は、3−ヒドロキシプロピオン酸を産生できる。3−ヒドロキシプロピオン酸は、特殊合成のための効用を有して、例えば脱水によりアクリル酸、酸化によりマロン酸、アルコールとのエステル化反応によりエステル、および還元により1,3−プロパンジオールなど、既知の化学産業技術によって商業的に重要な中間体に変換され得る。3−ヒドロキシプロピオン酸は、所有者が共通の同時係属米国特許出願公開第2011/0144377号明細書に記載されるように、単一微生物によって発酵性炭素源から生物学的に生成されてもよい。1つの代表的な生合成経路中では、1,3−プロパンジオールの生成について上述したように、炭素基質が3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって3−ヒドロキシプロピオン酸に変換される。アルデヒドデヒドロゲナーゼの適切な例としては、大腸菌(E.coli)遺伝子aldB(コード配列は配列番号15に記載される)によってコードされるAldB(配列番号16);大腸菌(E.coli)遺伝子aldA(コード配列は配列番号17に記載される)によってコードされるAldA(配列番号18);および大腸菌(E.coli)遺伝子aldH(コード配列は配列番号19に記載される(asset forth))によってコードされるAldH(配列番号20)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
組換え細菌による1,3−プロパンジオール生成を改善する上述の改変の多くはまた、3−ヒドロキシプロピオン酸生成も改善し得る。例えばグリセロールキナーゼの除去は、G3Pホスファターゼの作用によってG3Pから生成されるグリセロールが、ATPを消費してG3Pに再変換されるのを妨げる。またグリセロールデヒドロゲナーゼ(例えばgldA)の除去は、NAD依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってDHAPから生成されるグリセロールが、ジヒドロキシアセトンに変換されるのを妨げる。変異は、酵素活性の活性を損ないまたは改善するように、構造遺伝子を対象とし得て、または酵素活性の発現レベルを調節するように、プロモーター領域およびリボソーム結合部位をはじめとする調節遺伝子を対象とし得る。
上方制御または下方制御は、当業者に知られている多様な方法によって達成されてもよい。遺伝子の上方制御または下方制御は、例えば対応する(または非改変)野生型遺伝子によってコードされるタンパク質の活性などの対照の活性レベルと比較した、遺伝子によってコードされるタンパク質に由来する細胞中に存在する活性のレベル変化を指すことが、良く理解されている。
上方制御または下方制御は、当業者に知られている多様な方法によって達成されてもよい。遺伝子の上方制御または下方制御は、例えば対応する(または非改変)野生型遺伝子によってコードされるタンパク質の活性などの対照の活性レベルと比較した、遺伝子によってコードされるタンパク質に由来する細胞中に存在する活性のレベル変化を指すことが、良く理解されている。
酵素経路に関与する特定の遺伝子を上方制御して、それらのコードされた機能の活性を増大させてもよい。例えばpBR322などのマルチコピープラスミド上で、選択された遺伝子の追加的なコピーが、宿主細胞に導入されてもよい。このような遺伝子はまた、それらのコードされた機能の活性増大をもたらす、適切な制御配列と共に染色体に組み込まれてもよい。標的遺伝子は、非天然プロモーターまたは改変天然プロモーターの制御下にあるように改変されてもよい。内在性プロモーターは、変異、欠失、および/または置換によって生体内で改変され得る。
代案としては、それは所与の活性レベルに対する特定の遺伝子発現の低下、または排除に有用であってもよい。遺伝子を下方制御(中断)する方法は、当業者に知られている。
代案としては、それは所与の活性レベルに対する特定の遺伝子発現の低下、または排除に有用であってもよい。遺伝子を下方制御(中断)する方法は、当業者に知られている。
下方制御は、コード領域および/または調節(プロモーター)領域の欠失、挿入、または改変によって実施し得る。特定の下方制御は、ランダム変異と、それに続くスクリーニングまたは選択によって、または遺伝子配列が既知の場合は、当業者に知られている分子生物学的方法による直接介入によって、得られてもよい。下方制御をもたらす、特に有用でありながら排他的でない方法は、プロモーター強度を変化させることである。
さらに遺伝子発現の下方制御を使用して、対象タンパク質の発現を阻止し、または非機能性タンパク質発現をもたらしてもよい。これは、例えば1)コード領域および/または調節(プロモーター)領域を欠失させる、2)外来性核酸配列をコード領域および/調節(プロモーター)領域に挿入する、および3)(例えばDNA塩基対を変化させることで)コード領域および/または調節(プロモーター)領域を改変することで、達成されてもよい。特定の中断は、ランダム変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって得られてもよく、または遺伝子配列が既知の場合は、特定の中断は、当業者に知られている(know to)分子生物学的方法を使用する直接介入によって得られてもよい。特に有用な方法は、大量のコード領域および/または調節(プロモーター)領域の欠失である。
組換えタンパク質発現を改変する方法は当業者に知られており、Baneyx,Curr.Opin.Biotechnol.(1999)10:411;Ross,et al.,J.Bacteriol.(1998)180:5375;deHaseth,et al.,J.Bacteriol.(1998)180:3019;Smolke and Keasling,Biotechnol.Bioeng.(2002)80:762;Swartz,Curr.Opin.Biotech.(2001)12:195;およびMa,et al.,J.Bacteriol.(2002)184:5733である程度考察される。
さらに遺伝子発現の下方制御を使用して、対象タンパク質の発現を阻止し、または非機能性タンパク質発現をもたらしてもよい。これは、例えば1)コード領域および/または調節(プロモーター)領域を欠失させる、2)外来性核酸配列をコード領域および/調節(プロモーター)領域に挿入する、および3)(例えばDNA塩基対を変化させることで)コード領域および/または調節(プロモーター)領域を改変することで、達成されてもよい。特定の中断は、ランダム変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって得られてもよく、または遺伝子配列が既知の場合は、特定の中断は、当業者に知られている(know to)分子生物学的方法を使用する直接介入によって得られてもよい。特に有用な方法は、大量のコード領域および/または調節(プロモーター)領域の欠失である。
組換えタンパク質発現を改変する方法は当業者に知られており、Baneyx,Curr.Opin.Biotechnol.(1999)10:411;Ross,et al.,J.Bacteriol.(1998)180:5375;deHaseth,et al.,J.Bacteriol.(1998)180:3019;Smolke and Keasling,Biotechnol.Bioeng.(2002)80:762;Swartz,Curr.Opin.Biotech.(2001)12:195;およびMa,et al.,J.Bacteriol.(2002)184:5733である程度考察される。
上述したような、グリセロールおよびグリセロール誘導体をはじめとする微生物生成物の産生において、スクロースを代謝するための遺伝子発現に必要な変化を含有する組換え細菌は、そのいくつかが本明細書の実施例で例示される、当該技術分野で周知の技術を使用して構築されてもよい。
本明細書で開示される組換え細菌の構築は、適切な宿主微生物中でのグリセロールおよびその誘導体の生成において、スクロース利用能力をもたらす、コード領域のクローニング、形質転換、および発現に適する、多様なベクターおよび形質転換および発現カセットを使用して、達成されてもよい。適切なベクターは、用いられる細菌に適合するものである。適切なベクターは、例えば細菌、ウイルス(バクテリオファージT7、またはM−13由来ファージなど)、コスミド、酵母または植物由来であり得る。このようなベクターを得て使用するためのプロトコルは、当業者に知られている(Sambrook et al.、前出)。
所望の宿主細菌中で本発明のコード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域、またはプロモーターは多数あり、当業者に良く知られている。発現を駆動できる実質的にいずれのプロモーターも、本明細書での使用に適する。例えば上に列挙したプロモーターのいずれかを使用してもよい。
終結制御領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。終結部位は不要であってもよい;しかしそれが含まれることが最も望ましい。
当該ポリペプチドの効果的な発現のために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現が適切なメッセンジャーRNAの形成をもたらすように、開始コドンを通じて、選択された発現調節領域と作動可能に連結する。
本明細書で開示される組換え細菌の構築は、適切な宿主微生物中でのグリセロールおよびその誘導体の生成において、スクロース利用能力をもたらす、コード領域のクローニング、形質転換、および発現に適する、多様なベクターおよび形質転換および発現カセットを使用して、達成されてもよい。適切なベクターは、用いられる細菌に適合するものである。適切なベクターは、例えば細菌、ウイルス(バクテリオファージT7、またはM−13由来ファージなど)、コスミド、酵母または植物由来であり得る。このようなベクターを得て使用するためのプロトコルは、当業者に知られている(Sambrook et al.、前出)。
所望の宿主細菌中で本発明のコード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域、またはプロモーターは多数あり、当業者に良く知られている。発現を駆動できる実質的にいずれのプロモーターも、本明細書での使用に適する。例えば上に列挙したプロモーターのいずれかを使用してもよい。
終結制御領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。終結部位は不要であってもよい;しかしそれが含まれることが最も望ましい。
当該ポリペプチドの効果的な発現のために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現が適切なメッセンジャーRNAの形成をもたらすように、開始コドンを通じて、選択された発現調節領域と作動可能に連結する。
特に有用なのは、米国特許第7,371,558号明細書に記載されるベクターpSYCO101、pSYCO103、pSYCO106、およびpSYCO109、および米国特許第7,524,660号明細書に記載されるpSYCO400/AGROである。これらのベクターの必須要素は、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)から単離されたdhaレギュロンに由来する。各ベクターは、オープンリーディングフレームdhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaX(コード配列は配列番号78に記載され;コードされたポリペプチド配列は配列番号79に記載される)、3つの別個のオペロン中に配列されたorfX、DAR1、およびGPP2を含有する。pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106、pSYCO109、およびpSYCO400/AGROのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、および配列番号84に記載される。ベクター間の違いは、下のチャートに図示される[接頭辞「p−」はプロモーターを示し;各「()」内に入っているオープンリーディングフレームは、オペロンの構成を表す]:
pSYCO101(配列番号80):
p−trc(Dar1_GPP2)もう一方の2つの経路オペロンと比較して逆方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO101(配列番号80):
p−trc(Dar1_GPP2)もう一方の2つの経路オペロンと比較して逆方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO103(配列番号81):
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.5 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.5 long GI(orfY_orfX_orfW)。
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.5 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.5 long GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO106(配列番号82):
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX_orfW)。
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO109(配列番号83):
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX)。
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX)。
pSYCO400/AGRO(配列番号84):
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX)。
p−1.20 short/long GI(scrK)経路オペロンと比較して逆方向。
p−trc(Dar1_GPP2)他の2つの経路オペロンと比較して同一方向、
p−1.6 long GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6 long GI(orfY_orfX)。
p−1.20 short/long GI(scrK)経路オペロンと比較して逆方向。
適切な発現カセットが構築されたら、それらを使用して適切な宿主細菌を形質転換する。コード領域を含有するカセットの宿主細菌への導入は、(例えばカルシウム透過処理細胞、または電気穿孔を使用した)形質転換により、または組換えファージウイルスを使用した形質移入により、既知の手順によって達成されてもよい(Sambrook et al.、前出)。発現カセットは、宿主細胞中の安定したプラスミド上で維持されてもよい。これに加えて、発現カセットは、当業者に良く知られているベクターおよび方法を使用して、相同的またはランダム組換えを通じて、宿主細菌のゲノムに組み込まれてもよい。発現カセットのゲノム組み込みのために、部位特異的組換え系もまた使用してもよい。
例示される細胞の他に、グリセロールおよび/またはその誘導体をはじめとする、微生物産物の生成を高めるように特にデザインされた、単一または複数の変異を有する細胞もまた使用してもよい。常態では炭素原材料を非生産的経路に転用し、または顕著な異化代謝産物抑制を示す細胞を変異させてこれらの表現型の欠陥を回避してもよい。
例示される細胞の他に、グリセロールおよび/またはその誘導体をはじめとする、微生物産物の生成を高めるように特にデザインされた、単一または複数の変異を有する細胞もまた使用してもよい。常態では炭素原材料を非生産的経路に転用し、または顕著な異化代謝産物抑制を示す細胞を変異させてこれらの表現型の欠陥を回避してもよい。
変種株を作り出す方法は技術分野で一般的であり、よく知られている。いくつかの方法の概要が、米国特許第7,371,558号明細書に報告される。照射または化学薬剤を使用して変種株を作り出す特定の方法は、当該技術分野の文献で十分に立証されている。例えばThomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.、またはDeshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.36,227(1992)を参照されたい。
変異誘発が起きた後、所望の表現型を有する変種株は、多様な方法によって選択されてもよい。ランダムスクリーニングは、所望の産物または中間体を産生する能力について、変異誘発細胞を選択する場合に、最も一般的である。代案としては、変種株の選択的単離は、耐性コロニーのみが成長し得る選択培地上で、変異誘発集団を培養することで実施し得る。変種株選択法は高度に発達しており、工業微生物学技術分野で周知である。例えば、Brock、前出;DeMancilha et al.,Food Chem.14,313(1984)を参照されたい。
変異誘発が起きた後、所望の表現型を有する変種株は、多様な方法によって選択されてもよい。ランダムスクリーニングは、所望の産物または中間体を産生する能力について、変異誘発細胞を選択する場合に、最も一般的である。代案としては、変種株の選択的単離は、耐性コロニーのみが成長し得る選択培地上で、変異誘発集団を培養することで実施し得る。変種株選択法は高度に発達しており、工業微生物学技術分野で周知である。例えば、Brock、前出;DeMancilha et al.,Food Chem.14,313(1984)を参照されたい。
本発明の発酵培地は、炭素基質としてスクロースを含んでなる。グルコースおよび果糖などのその他の炭素基質もまた、存在してもよい。
炭素基質に加えて、適切な発酵培地は、例えば培養物増殖と、グリセロールおよびその誘導体、例えば1,3−プロパンジオールの生成に必要な酵素経路促進とに適する、当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液およびその他の成分を含有する。1,3−プロパンジオールの生産では、Co(II)塩および/またはビタミンB12またはその前駆体に、特に注意が払われた。
アデノシル−コバラミン(補酵素B12)は、デヒドラターゼ活性の重要な補助因子である。補酵素B12の合成は原核生物中に見られ、例えばエシェリキア・ブラタエ(Escherichia blattae)、クレブシエラ(Klebsiella)種、シトロバクター(Citrobacter)種、およびクロストリジウム(Clostridium)種などのそのいくつかが、化合物を新規合成できる一方で、その他は部分反応ができる。例えば大腸菌(E.coli)は、コリン環構造を作れないが、コビナミドからコリノイドへの変換を触媒でき、5’−デオキシアデノシル基を導入できる。したがってビタミンB12などの補酵素B12前駆体が、大腸菌(E.coli)発酵中に提供されなくてはならないことは、当該技術分野で公知である。ビタミンB12は、大腸菌(E.coli)発酵に、継続的に定速で、または細胞集団の発生と一致するように段階的に添加してもよく、または単回または複数回ボーラスで添加されてもよい。
本明細書に記載される形質転換大腸菌(E.coli)にはビタミンB12が添加されるが、ビタミンB12を新規生合成できるその他の細菌も適切な産生細胞であり、これらの細菌へのビタミンB12添加は不要であることが検討される。
炭素基質に加えて、適切な発酵培地は、例えば培養物増殖と、グリセロールおよびその誘導体、例えば1,3−プロパンジオールの生成に必要な酵素経路促進とに適する、当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液およびその他の成分を含有する。1,3−プロパンジオールの生産では、Co(II)塩および/またはビタミンB12またはその前駆体に、特に注意が払われた。
アデノシル−コバラミン(補酵素B12)は、デヒドラターゼ活性の重要な補助因子である。補酵素B12の合成は原核生物中に見られ、例えばエシェリキア・ブラタエ(Escherichia blattae)、クレブシエラ(Klebsiella)種、シトロバクター(Citrobacter)種、およびクロストリジウム(Clostridium)種などのそのいくつかが、化合物を新規合成できる一方で、その他は部分反応ができる。例えば大腸菌(E.coli)は、コリン環構造を作れないが、コビナミドからコリノイドへの変換を触媒でき、5’−デオキシアデノシル基を導入できる。したがってビタミンB12などの補酵素B12前駆体が、大腸菌(E.coli)発酵中に提供されなくてはならないことは、当該技術分野で公知である。ビタミンB12は、大腸菌(E.coli)発酵に、継続的に定速で、または細胞集団の発生と一致するように段階的に添加してもよく、または単回または複数回ボーラスで添加されてもよい。
本明細書に記載される形質転換大腸菌(E.coli)にはビタミンB12が添加されるが、ビタミンB12を新規生合成できるその他の細菌も適切な産生細胞であり、これらの細菌へのビタミンB12添加は不要であることが検討される。
典型的には、細菌細胞はスクロースを含有する適切な培地中で25〜40℃で培養される。本明細書で使用される適切な増殖培地の例は、ルリア・ベルターニ(LB)ブロス、サブローデキストロース(SD)ブロスまたは酵母培地(YM)ブロスなど、一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、特定の細菌の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学当業者に知られている。例えば環状アデノシン2’:3’−一リン酸など、異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている作用薬の使用もまた、反応培地中に組み込まれてもよい。同様に、1,3−プロパンジオール生成の増強をもたらす、酵素機能を調節することが知られている作用薬(例えばメチルビオロゲン)の使用も、1,3−プロパンジオール産生株の遺伝子操作と併用して、またはその代案として使用されてもよい。
発酵に適したpH範囲はpH5.0〜pH9.0であり、pH6.0〜pH8.0が初期条件として典型的である。
発酵に適したpH範囲はpH5.0〜pH9.0であり、pH6.0〜pH8.0が初期条件として典型的である。
反応は、組換細菌の要件に応じて、好気性、無酸素、または嫌気性条件下で実施されてもよい。流加発酵は、例えば限定的または過剰な炭素基質などの炭素供給と共に、実施されてもよい。
バッチ発酵が一般に使用される方法である。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、そこでは培養液の組成が発酵の初めに設定され、発酵プロセス中に人為的変更を受けない。したがって発酵プロセス開始時に培養液に所望の細菌を接種して、システムには何も添加せずに発酵させる。しかし典型的に、「バッチ」発酵は、炭素源添加に関してバッチであり、pHおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、発酵を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に増殖速度が減退または停止する静止期へ減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。一般に対数期にある細胞が、最終生成物または中間体産生の大部分を担う。
バッチ発酵が一般に使用される方法である。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、そこでは培養液の組成が発酵の初めに設定され、発酵プロセス中に人為的変更を受けない。したがって発酵プロセス開始時に培養液に所望の細菌を接種して、システムには何も添加せずに発酵させる。しかし典型的に、「バッチ」発酵は、炭素源添加に関してバッチであり、pHおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、発酵を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に増殖速度が減退または停止する静止期へ減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。一般に対数期にある細胞が、最終生成物または中間体産生の大部分を担う。
標準バッチ系の変法が流加系である。流加発酵工程もまた本明細書で使用するのに適し、発酵が進行するにつれて、基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を含んでなる。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基材を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチ系中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、pH、溶存酸素、およびCO2のような排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は前出のBrockに見出し得る。
連続発酵は、バイオリアクターに規定発酵培地が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、処理のために取り出される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数成長期にある一定の高密度に培養を維持する。
連続発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす、1つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば1つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減する。その他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって培地の抜き取りに起因する細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度と平衡状態になくてはならない。連続発酵工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに生成物生成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のBrockに詳述される。
連続発酵は、バイオリアクターに規定発酵培地が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、処理のために取り出される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数成長期にある一定の高密度に培養を維持する。
連続発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす、1つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば1つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減する。その他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって培地の抜き取りに起因する細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度と平衡状態になくてはならない。連続発酵工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに生成物生成速度を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のBrockに詳述される。
本発明は、バッチ、流加または連続法を使用して実施されてもよく、任意の公知の発酵様式が適切であることが考察される。さらにホールセル触媒として、細胞を基質上に固定化し、1,3−プロパンジオールなどのグリセロールおよびグリセロール誘導体生成のための発酵条件に曝露してもよいことが、検討される。
一実施形態では、スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法が提供される。方法は、上述したように、スクロース存在下で組換え細菌を培養するステップを含んでなり、生成されたグリセロール、1,3−プロパンジオール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップを含んでなってもよい。生成物は、当該技術分野で公知の方法を使用して回収されてもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に、上述したように固形物を除去するように処理された発酵培地から、蒸留、液-液抽出、または膜ベース分離などの方法を使用して、生成物を単離してもよい。例えば生物学的に生成された1,3−プロパンジオールを精製する方法が、米国特許第7,919,658号明細書に記載される。
一実施形態では、スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法が提供される。方法は、上述したように、スクロース存在下で組換え細菌を培養するステップを含んでなり、生成されたグリセロール、1,3−プロパンジオール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップを含んでなってもよい。生成物は、当該技術分野で公知の方法を使用して回収されてもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に、上述したように固形物を除去するように処理された発酵培地から、蒸留、液-液抽出、または膜ベース分離などの方法を使用して、生成物を単離してもよい。例えば生物学的に生成された1,3−プロパンジオールを精製する方法が、米国特許第7,919,658号明細書に記載される。
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と改変を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
一般方法
本明細書で使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Sambrook,J.and Russell,D.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001);およびSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984);およびAusubel,F.M.et.al.,Short Protocols in Molecular Biology,5th Ed.Current Protocols,John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.,2002に記載される。
本明細書で使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Sambrook,J.and Russell,D.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001);およびSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984);およびAusubel,F.M.et.al.,Short Protocols in Molecular Biology,5th Ed.Current Protocols,John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.,2002に記載される。
微生物培養の維持および増殖に適した材料と方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips,Eds.),American Society for Microbiology:Washington,D.C.(1994));またはManual of Industrial Microbiology and Biotechnology,3rd Edition(Richard H.Baltz,Julian E.Davies,and Arnold L.Demain Eds.),ASM Press,Washington,DC,2010に記載され得る。細菌細胞の増殖および維持に関して記載される、全ての試薬、制限酵素および材料は、Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)、New England Biolabs(Beverly,MA)、またはSigma Chemical Company(St.Louis,MO)から得られてもよい。
略称の意味は、次の通り。「sec」は秒を意味し、「min」は分を意味し、「h」は時間を意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモルを意味し、「g」はグラムを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、「bp」は塩基対を意味し、「kbp」はキロベース対合を意味し、「rpm」は毎分回転数を意味し、「ATCC」はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関を意味し、「OD」は光学濃度を意味し、「g」は重力定数を意味し、「HPLC」は高速液体クロマトグラフィーを意味する。
実施例1
より迅速なスクロース利用を示す変種大腸菌(E.coli)株の単離
本実施例は、より迅速なスクロース利用を示した変種大腸菌(E.coli)株の単離を記載する。これらの変種株は、自然発生的に、またはスクロース遺伝子クラスターを増幅する際のPCR誤差のために生じた。
より迅速なスクロース利用を示す変種大腸菌(E.coli)株の単離
本実施例は、より迅速なスクロース利用を示した変種大腸菌(E.coli)株の単離を記載する。これらの変種株は、自然発生的に、またはスクロース遺伝子クラスターを増幅する際のPCR誤差のために生じた。
大腸菌(E.coli)ATCC(登録商標)13281のcscAKB遺伝子クラスター(配列番号45)をPDO産生株TTab pSYCO400/AGROに導入して、スクロースのPDO生成を可能にした。PTSマイナス株である大腸菌(E.coli)TTab pSYCO400/AGRO株は、次のように構築した。米国特許第7,371,558号明細書(実施例17)に記載されるTT aldA株のaldB遺伝子の欠失によって、TTab株を作り出した。簡単に述べると、最初にpKD3プラスミドのFRT−CmR−FRTカセットで、大腸菌(E.coli)MG1655株中のaldBコード領域の1.5kbpを置換して、aldB欠失を作成した(Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640−6645,2000)。テンプレートとしてpKD3を使用し、配列番号99と配列番号100のプライマー対によって、置換カセットを増幅した。プライマー配列番号99は、aldBの5’末端に対する80bpの相同性と、pKD3に対する20bpの相同性を含有する。プライマー配列番号100は、aldBの3’末端に対する80bpの相同性と、pKD3に対する20bpの相同性を含有する。PCR産物をゲル精製して、MG1655/pKD46コンピテント細胞に電気穿孔した(米国特許第7,371,558号明細書)。組換え株は、12.5mg/Lのクロラムフェニコールを添加したLB(ルリア・ベルターニ)プレート上で選択した。配列番号101および配列番号102のプライマー対を使用して、aldB遺伝子の欠失をPCRによって確認した。野生型株が1.5kbpのPCR産物を与えた一方で、組換え株は特徴的な1.1kbpのPCR産物を与えた。P1溶解産物を調製して使用し、変異をTT aldA株に移して、TT aldAΔaldB::Cm株を形成した。配列番号101および配列番号102のプライマー対でのゲノムPCRによって、クロラムフェニコール耐性クローンをチェックして、変異が存在することを確実にした。FLPリコンビナーゼ(Datsenko and Wanner、前出)を使用してクロラムフェニコール耐性マーカーを除去し、TTabを作成した。次に米国特許第7,524,660号明細書(実施例4)に記載されるpSYCO400/AGRO(配列番号84に記載される)によって、TTab株を形質転換し、TTab pSYCO400/AGRO株を作り出した。
引用された参考文献に記載されるように、TTab株は、
glpK、gldA、ptsHI、crr、edd、arcA、mgsA、qor、ackA、pta、aldA、およびaldB遺伝子の欠失;
galP、glk、btuR、ppc、およびyqhD遺伝子の上方制御;および
gapA遺伝子の下方制御
の改変を含有する、大腸菌(E.coli)株FM5(ATCC(登録商標)No.53911)の誘導株である。
glpK、gldA、ptsHI、crr、edd、arcA、mgsA、qor、ackA、pta、aldA、およびaldB遺伝子の欠失;
galP、glk、btuR、ppc、およびyqhD遺伝子の上方制御;および
gapA遺伝子の下方制御
の改変を含有する、大腸菌(E.coli)株FM5(ATCC(登録商標)No.53911)の誘導株である。
プラスミドpSYCO400/AGROは、グリセロール生成経路(DAR1およびGPP2)をコードする遺伝子、およびグリセロールデヒドラターゼと付随する再活性化因子(dhaB123、dhaX、orfX、orfY)をコードする遺伝子、ならびにフルクトキナーゼ(scrK)をコードする遺伝子を含有する。
cscAKB遺伝子クラスター(配列番号45)は、λ Red法によってTTab pSYCO400/AGRO中のaldH位置に組み込んだ。aldH遺伝子の側面に位置する配列を含有する、aldH cscAプライマー(配列番号85)およびaldH cscBプライマー(配列番号86)を使用して、米国特許出願公開第2011/0136190A1号明細書の実施例1に記載されるように構築したプラスミドpBHR−cscBKA(配列番号103)から、cscAKB遺伝子クラスターを増幅した。PstI消化によって直線化されたプラスミドpBHR−cscBKAをPCRテンプレートとして使用した。PCR反応では、高忠実度PfuUltra(登録商標)II Fusion HS DNAポリメラーゼ(Stratagene;La Jolla、CA)を使用した。以下のサイクル条件を使用して、PCRを実施した。95℃で2分間;95℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で4分間の35サイクル;次に72℃で7分間。得られたPCR産物は4℃で保存した。PCR産物は、λ PCR精製キット(Qiagen,Valencia,CA)によって精製した。λ red組換え手順に続いて、λリコンビナーゼをコードするpKD46プラスミド(Redリコンビナーゼプラスミド、GenBank受入番号AY048746)を含有するTTab pSYCO400/AGRO株に、PCR産物を電気穿孔した(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L.,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,6640−6645)。10g/Lスクロースおよび100μg/mLスペクチノマイシンを含有するMOPS最小プレート上に、形質転換混合物を播種した。MOPS最小プレートは、1×MOPS緩衝液(Technova,Hollister,CA)、1.32mMのKH2PO4(Technova)、50μg/Lウラシル、および1.5g/LのBacto寒天を含有した。プレートを37℃で2〜3日間培養した。最小スクロースプレート上で成長したコロニーを選択して、スクロース液体培地中で増殖し、Bioscreen Cグロースチャンバー(Bioscreen,Helsinki,Finland)を使用して調べた。Bioscreen増殖アッセイでは、最初に、Costar 96ウェルU底マイクロタイタープレート(Corning Inc.,Corning,NY)内で、100μg/mLスペクチノマイシンを含有する150μLのLA培地(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、0.05%塩化ナトリウム)中で、コロニーを培養した。マイクロタイタープレートを37℃で一晩振盪しながら培養した。Bioscreenハニカムプレート内の2.5g/Lスクロースおよび100μg/mLスペクチノマイシンを含有するMOPS最少培地中で、新鮮な一夜培養物を1:100に希釈した。ビタミンB12を0.1mg/Lの濃度で培地に添加した。製造会社の使用説明書に従って、ハニカムプレートをBioscreen C装置に入れた。プレートを常に振盪しながら33℃で培養して、ODを15分毎に記録した。ほとんどの単離株は、2.5g/Lスクロース中で緩慢に増殖したが、少数はより迅速に増殖した。これらのより迅速に増殖する変種株をさらなる分析のために選択した。
実施例2〜7
変種スクロース輸送体遺伝子の同定
これらの実施例は、変種スクロース輸送体遺伝子の同定を説明する。これらのスクロース輸送体変種株は、より迅速なスクロース利用を可能にした。
変種スクロース輸送体遺伝子の同定
これらの実施例は、変種スクロース輸送体遺伝子の同定を説明する。これらのスクロース輸送体変種株は、より迅速なスクロース利用を可能にした。
実施例1に記載されるより迅速に増殖する大腸菌(E.coli)変種株中のスクロース遺伝子クラスターをPCRによって増幅し、これらの株中の全遺伝子クラスター配列をDNA配列決定によって判定した。表3に示されるように、全てcscB遺伝子中の単一塩基対変化を含有する、6つの変種株を同定した。変種株の4つは、単一アミノ酸置換を有し、変種株の2つはC末端にトランケーションを有した。変種株のいずれもcscA遺伝子にアミノ酸置換を有さず、1つの変種株のみがcscK遺伝子にアミノ酸置換を有した。
表3 PDO産生株中のスクロース輸送体変異
aヌクレオチド変化を示すのに使用された命名法は次のとおり。最初の文字は野生型ヌクレオチド記号であり、数はその位置であり、続く文字は変異株ヌクレオチドの記号である。
bアミノ酸置換を示すのに使用された命名法は次のとおり。最初の文字は、野生型アミノ酸の一文字記号であり、数はその位置であり、続く文字は変異株中のアミノ酸の一文字記号である。
cPDO3217は、cscK遺伝子中にG93W変異も有した。
bアミノ酸置換を示すのに使用された命名法は次のとおり。最初の文字は、野生型アミノ酸の一文字記号であり、数はその位置であり、続く文字は変異株中のアミノ酸の一文字記号である。
cPDO3217は、cscK遺伝子中にG93W変異も有した。
スクロース含有培地中における、変種スクロース輸送体を含有する大腸菌(E.coli)株の増殖速度は、Bioscreen C装置を使用して判定した。100μg/mLスペクチノマイシンを含有する3mLのLA培地中で、大腸菌(E.coli)変種株を37℃で16時間培養した。Bioscreenアッセイでは、Bioscreenハニカムプレート内の2.5g/L、5g/Lまたは10g/Lスクロースおよび100μg/mLスペクチノマイシンを含有するMOPS最少培地中で、新鮮一晩培養物を1:100に希釈した。ビタミンB12を0.1mg/Lの濃度で培地に添加した。各サンプル毎に、4つの複製を作成した。培地ブランクウェルもまた含めた。製造会社の使用説明書に従って、ハニカムプレートをBioscreen C装置に入れた。プレートを常に振盪しながら33℃で培養して、ODを15分毎に記録した。野生型スクロース遺伝子クラスターを含有する大腸菌(E.coli)株を同一様式で培養し、対照として供した。以下の手順を使用して、本明細書でμmaxと称される最大増殖速度を推定した。最初に、非ブランクウェル内のOD値から、ブランクウェル内の平均化OD値を減じて背景を除去した。次に非直線回帰を使用して、指数曲線へのデータ点適合によって、8データ点(2時間の増殖をカバーする)からなるスライドウィンドウを使用して、増殖速度パラメータを推定した。各スライドウィンドウ内で、適合が良好な場合(すなわちR2>0.95)に限り、推定増殖速度を記録した。全ての記録された増殖比率からの最大値をμmaxと見なした。4つの複製の平均値μmaxおよび標準偏差を表4に示す。
表4の結果から分かるように、変種大腸菌(E.coli)株は、スクロース上で対照株よりもさらに迅速に増殖した。
実施例8
スクロース上で培養された変種大腸菌(E.coli)株によるPDOおよびグリセロール産生
本実施例は、スクロース上で培養した際の実施例1に記載される大腸菌(E.coli)変種株による、PDOおよびグリセロールの産生を記載する。変種株は、野生型スクロース遺伝子クラスターを含有する対照株と比較して、PDOおよびグリセロール生成のモル収率増大を示した。
スクロース上で培養された変種大腸菌(E.coli)株によるPDOおよびグリセロール産生
本実施例は、スクロース上で培養した際の実施例1に記載される大腸菌(E.coli)変種株による、PDOおよびグリセロールの産生を記載する。変種株は、野生型スクロース遺伝子クラスターを含有する対照株と比較して、PDOおよびグリセロール生成のモル収率増大を示した。
PDOおよびグリセロール生成のモル収率を振盪フラスコ試験で判定した。100ng/mLビタミンB12および100μg/mLスペクチノマイシンを付加した、10g/Lスクロースを含有する12.5mLのMOPS培地に、大腸菌(E.coli)変種株の新鮮一晩培養物を0.01の初期ODで接種した。細胞を250rpmで振盪しながら、33℃で44時間培養した。培養物を遠心分離して、上清を0.22μm Spin−X遠心管フィルター(Corning Inc.,Corning,NY)に添加して、10,000gで1分間遠心分離した。別個の(separated)Waters TCM加熱チャンバー内で85℃に加熱した、Aminex HPX−87C HPLC炭水化物分析カラム(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA,カタログ番号125−0095)を用いて、Waters Alliance 2690 HPLC装置(Waters Corp.,Milford,MA)を使用して、濾液をHPLCによって分析した。分析カラムの前に、Bio−Rad carbo−Cマイクロガードカラム(Bio−Rad、カタログ番号125−0128)を使用した。移動相は、0.05mMのCaO(Sigma、#208159)、0.5mMのMES(Sigma、#M3671)、0.05mMのHNO3(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ、カタログ番号NX0409)、pH5.3から構成された。流速は0.5mL/分であった。典型的に、PDOおよびグリセロールの滞留時間は、それぞれ17.5分および19.3分であった。スクロース、グルコース、および果糖の滞留時間は、それぞれ10.3分、12.5分、および15.9分であった。Bioscreenアッセイで観察されたより迅速な増殖速度と一致して、変種大腸菌(E.coli)株はまた、振盪フラスコ内でより迅速なスクロース消費も示した。これに加えて、表5に示されるように、変種大腸菌(E.coli)株は、いずれも野生型対照よりも、PDOおよびグリセロール生成のより高いモル収率(すなわちスクロースのモルあたりのPDOおよびグリセロールのモル)を示した。
実施例9
変種スクロース輸送体遺伝子を含有する組換え細菌
本実施例は、変種スクロース輸送体遺伝子を含有する組換え細菌の構築を記載する。組換え細菌は、野生型対照株よりもさらに迅速にスクロースを利用する能力を有する。
変種スクロース輸送体遺伝子を含有する組換え細菌
本実施例は、変種スクロース輸送体遺伝子を含有する組換え細菌の構築を記載する。組換え細菌は、野生型対照株よりもさらに迅速にスクロースを利用する能力を有する。
変異cscB遺伝子を含有するスクロース遺伝子クラスターは、実施例1に記載される条件を使用して、配列決定済みの変種株からPCRによって増幅された。実施例1に記載されるように、pKD46プラスミドを含有する親宿主である大腸菌(E.coli)FM5株(ATCC(登録商標)No.53911)に、PCR産物を形質転換した。10g/Lスクロースを含有するMOPS最小プレート上の培養によって、変種クラスターを含有する組み込み体を選択した。コロニーを画線塗抹して、pKD46を回復した組み込み体を純化した。各株から代表的なコロニーを選択した。aldH遺伝子におけるスクロース遺伝子クラスター組み込みは、プライマーaldH_check_up(配列番号87)およびプライマーaldH_check_dn(配列番号88)を使用して、PCRによって確認された。各株中のオリジナルのcscB変異は、スクロース遺伝子クラスターを含有するPCR産物の列決定によって確認された。いかなる追加的な変異も見られなかった。スクロース上で培養されたFM5由来株の増殖速度は、実施例2〜7に記載されるようにBioscreenアッセイを使用して判定した。結果(すなわち3つの複製の平均値および標準偏差)を表6に示す。
表6の結果から分かるように、変種スクロース輸送体遺伝子を含有する大腸菌(E.coli)株は、より低いスクロースレベルで、野生型株よりもさらに迅速に増殖した。
実施例10〜26
飽和変異誘発による変種スクロース輸送ポリペプチドの同定
これらの実施例は、染色体上のCscBタンパク質の残基61における飽和変異誘発による、変種スクロース輸送体の同定を記載する。これまで同定された自然突然変異からのL61P変異に加えて、残基61におけるいくつかのその他のアミノ酸変化もまた、低スクロース濃度でのより迅速なスクロース利用を可能にする。
飽和変異誘発による変種スクロース輸送ポリペプチドの同定
これらの実施例は、染色体上のCscBタンパク質の残基61における飽和変異誘発による、変種スクロース輸送体の同定を記載する。これまで同定された自然突然変異からのL61P変異に加えて、残基61におけるいくつかのその他のアミノ酸変化もまた、低スクロース濃度でのより迅速なスクロース利用を可能にする。
染色体上で直接、飽和変異誘発を実施するために、大腸菌(E.coli)FM5株中でcscA+K+B−(kanR)株を構築した。出発PDO3085株は、FM5中のyihP遺伝子に組み込まれた、野生型cscAKB遺伝子クラスターを含有した。yihP遺伝子におけるスクロースクラスター組み込みは、yihP cscAプライマー(配列番号89)およびyihP cscBプライマー(配列番号90)を使用したこと以外は、実施例3に記載されるようにして達成された。次にカナマイシン耐性カセットで置換することで、PDO3085中のクラスター中のcscB遺伝子を部分的に欠失させた。カナマイシン耐性カセットは、cscB61 up kanプライマー(配列番号91)およびcscB353 down kanプライマー(配列番号92)を使用して、pKD4テンプレートプラスミドから増幅された(Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640−6645,2000)。PCR反応では、高忠実度PfuUltra(登録商標)II Fusion HS DNAポリメラーゼ(Stratagene;La Jolla,CA)を使用した。以下のサイクル条件を使用して、PCRを実施した。95℃で2分間;95℃で20秒間、60℃で20秒間、および72℃で1.5分間を30サイクル;次に72℃で3分間。得られたPCR産物は4℃で保存した。PCR産物は、QIAquickPCR精製キット(Qiagen)によって精製した。λ red組換え手順に続いて、λリコンビナーゼをコードするpKD46プラスミドを含有するPDO3085株に、PCR産物を電気穿孔した。25μg/mLカナマイシンを含有するLBプレート上に、形質転換混合物を播種した。MOPS+10g/Lスクロースプレート上でカナマイシン耐性コロニーをチェックして、それらがスクロース上で増殖できないことを確認した。CscBの残基61と353の間へのカナマイシン耐性カセットの挿入は、cscB5’プライマー(配列番号93)およびcscB3’プライマー(配列番号94)を使用して、PCRによって確認された。PDO3513と命名されたこのFM5 yihP:cscA+K+B−(Δ61−353、kanR)株を飽和変異誘発のための宿主株として使用した。
位置61に変異原性残基を含有するoligoは、位置61のNNK(N=任意のヌクレオチド;K=GまたはT)として、Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)によって合成された。プライマーとして61 NNK top2 oligos(配列番号95)およびQ353 down2 oligo(配列番号96)を使用し、テンプレートとしてPDO3085を使用して、内部cscB断片(61〜353個の残基)を増幅した。PCR条件は、TaqDNAポリメラーゼを含有するAccuStart Super Mix(Quanta Biosciences,Inc.Gaithersburg,MD)を使用したこと以外は、本実施例で上に記載されるものと同様であった。Zymo DNA Cleanキット(Zymo Research Corp.,Irvine,CA)を使用してPCR産物を精製し、λ Redプロトコルに続いて、pKD46を含有するPDO3513に形質転換した。2.5g/Lスクロースおよび5g/Lテトラサイクリンを含有するMOPSプレート上に、形質転換混合物を播種した(FM5細胞はテトラサイクリン耐性を示す)。プレートを37℃で約2日間培養した。合計96個の単離コロニーを選択し、96ディープウェルプレート内で、10g/Lスクロースおよび5g/Lテトラサイクリン添加MOPS培地上で、37℃で一晩培養した。PCRによって、細胞が全て、yihP遺伝子位置にスクロース遺伝子クラスターを有することを確認した。各単離株をLBプレート上に画線塗抹して、96ウェルPCRプレート内で、各単離株から単一コロニーを水に再懸濁した。GenomiPhi配列決定(GE Health Care,Piscataway,NJ)のために細胞懸濁液を使用し、位置61をカバーするプライマーcscB5−119−F(配列番号97)およびGC−cscB_F1(配列番号98)を使用して、cscB変異を同定した。GenomiPhiによって、合計78個の単離株(約81%)が成功裏に配列決定された。配列決定された単離株中で、16個の異なるアミノ酸残基がコドン61で同定された(表7)。引き続いて、スクロース上で高い増殖速度を呈示した各アミノ酸変異体の少なくとも1つの典型例から、cscB遺伝子の完全長を配列決定して、もしあれば、遺伝子の他の箇所に現れたその他の変異をチェックした。これらの単離株はpKD46もまた回復し、スクロース培地における増殖のBioscreenアッセイで使用された。
NNK飽和変異誘発から得られた96個のコロニーの内7個は、位置61に野生型残基ロイシンを有したが、アミノ酸は、野生型cscB遺伝子中のオリジナルCTAとは異なるコドン(CTGまたはTTG)によってコードされた。これらの変種株は、Bioscreenアッセイにおいて、スクロース上で元の野生型対照と同様に増殖した。15個のL61P変種株もまた単離され、既出の実施例に記載されるオリジナル単離株(CCA)とは異なるコドン(CCGまたはCCT)によってコードされた。これらのL61P変種株は、全て、オリジナルL61P変種株と同様に、スクロース上でより迅速な増殖速度を示した。L61P変種株に加えて、L61WおよびL61Fもまた、スクロース上で、野生型対照よりもはるかにより迅速な増殖を示した。L61H、およびL61Y変種株は、スクロース上で、野生型対照よりもわずかにより迅速な増殖を示した。変種株L61A、L61E、L61G、L61Kは、スクロース上で野生型対照と同様の増殖速度を示した。変種株L61D、L61Q、L61S、L61T、およびL61Vは、スクロース上で、野生型対照よりもはるかにより緩慢な増殖を示した。変種株L61Iの2つの分離株は、スクロース上でかなり異なる増殖を示した;1つは野生型と同様の増殖を有し、1つは野生型よりもはるかにより迅速な増殖を有した。どちらの単離株も配列決定されて、コドン61におけるATT以外のその他の変異をcscB遺伝子中に含有しないことが分かった。他の箇所の別の自然突然変異が、2つのL61I単離株に異なる増殖表現型を引き起こした可能性がある。
Claims (9)
- (a)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
(b)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
(c)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(a)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する、変種スクロース輸送ポリペプチド。 - ゲノム中、または、少なくとも1つの組換え構築物上に、
(a)(i)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(A)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(B)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(C)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(D)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(E)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(F)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(G)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(H)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または、
(ii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または、
(iii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(i)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(b)スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなる細菌であって、
(a)および(b)が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する前記細菌。 - ポリペプチドが、EC 3.2.1.26またはEC 2.4.1.7に分類されるスクロースヒドロラーゼ活性を有する、請求項2に記載の細菌。
- ゲノム中または少なくとも1つの組換え構築物上に、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項2に記載の細菌。
- フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドが、EC 2.7.1.4、EC 2.7.1.3、またはEC 2.7.1.1に分類される、請求項4に記載の細菌。
- エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、サイトロバクター属(Citrobacter)、およびアエロバクター属(Aerobacter)からなる群から選択される、請求項2に記載の細菌。
- 大腸菌(Escherichia coli)である、請求項6に記載の細菌。
- 1,3−プロパンジオール、グリセロール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を産生する組換え細菌である、請求項2に記載の細菌。
- a)スクロース存在下で、請求項8に記載の組換え細菌を培養するステップと;
b)前記産生されたグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法。
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