JP2014525239A5 - - Google Patents

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Description

本発明は、バッチ、流加または連続法を使用して実施されてもよく、任意の公知の発酵様式が適切であることが考察される。さらにホールセル触媒として、細胞を基質上に固定化し、1,3−プロパンジオールなどのグリセロールおよびグリセロール誘導体生成のための発酵条件に曝露してもよいことが、検討される。
一実施形態では、スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法が提供される。方法は、上述したように、スクロース存在下で組換え細菌を培養するステップを含んでなり、生成されたグリセロール、1,3−プロパンジオール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップを含んでなってもよい。生成物は、当該技術分野で公知の方法を使用して回収されてもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に、上述したように固形物を除去するように処理された発酵培地から、蒸留、液-液抽出、または膜ベース分離などの方法を使用して、生成物を単離してもよい。例えば生物学的に生成された1,3−プロパンジオールを精製する方法が、米国特許第7,919,658号明細書に記載される。
本発明のいくつかの具体的実施態様を以下に例示する。
(1)(a)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
(b)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
(c)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(a)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する、変種スクロース輸送ポリペプチド。
(2)ゲノム中、または、少なくとも1つの組換え構築物上に、
(a)(i)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
(A)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
(B)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
(C)位置162におけるグリシンからシステインへ;
(D)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
(E)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
(F)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
(G)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
(H)位置61におけるロイシンからチロシンへ
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または、
(ii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または、
(iii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(i)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(b)スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなる細菌であって、
(a)および(b)が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する前記細菌。
(3)ポリペプチドが、EC 3.2.1.26またはEC 2.4.1.7に分類されるスクロースヒドロラーゼ活性を有する、(2)に記載の細菌。
(4)ゲノム中または少なくとも1つの組換え構築物上に、フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる、(2)に記載の細菌。
(5)フルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドが、EC 2.7.1.4、EC 2.7.1.3、またはEC 2.7.1.1に分類される、(4)に記載の細菌。
(6)エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、サイトロバクター属(Citrobacter)、およびアエロバクター属(Aerobacter)からなる群から選択される、(2)に記載の細菌。
(7)大腸菌(Escherichia coli)である、(6)に記載の細菌。
(8)1,3−プロパンジオール、グリセロール、および/または3−ヒドロキシプロピオン酸を産生する組換え細菌である、(2)に記載の細菌。
(9)a)スクロース存在下で、(8)に記載の組換え細菌を培養するステップと;
b)前記産生されたグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
とを含んでなる、スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法。

Claims (3)

  1. (a)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
    (i)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
    (ii)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
    (iii)位置162におけるグリシンからシステインへ;
    (iv)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
    (v)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
    (vi)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
    (vii)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
    (viii)位置61におけるロイシンからチロシンへ
    からなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または
    (b)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または
    (c)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(a)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
    を有する、変種スクロース輸送ポリペプチド。
  2. ゲノム中、または、少なくとも1つの組換え構築物上に、
    (a)(i)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号24に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、
    (A)位置61におけるロイシンからプロリンへ;
    (B)位置159におけるフェニルアラニンからロイシンへ;
    (C)位置162におけるグリシンからシステインへ;
    (D)位置169におけるプロリンからヒスチジンへ;
    (E)位置61におけるロイシンからトリプトファンへ;
    (F)位置61におけるロイシンからヒスチジンへ;
    (G)位置61におけるロイシンからフェニルアラニンへ;および
    (H)位置61におけるロイシンからチロシンへ
    からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列;または、
    (ii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有するアミノ酸配列;または、
    (iii)アラインメントのClustal W法に基づいて、配列番号44に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、N末端から402〜407アミノ酸長を有し、(i)の少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列、
    を有する変種スクロース輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
    (b)スクロースヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    を含んでなる細菌であって、
    (a)および(b)が、それぞれ同一または異なるプロモーターと作動可能に連結し、さらに配列番号24に記載のアミノ酸配列を有する野生型スクロース輸送ポリペプチドを含有する細菌よりもさらに大きな速度でスクロースを代謝する前記細菌。
  3. a)スクロース存在下で、請求項2に記載の組換え細菌を培養するステップと;
    b)前記産生されたグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を回収するステップ、
    とを含んでなる、スクロースからグリセロール、1,3−プロパンジオールおよび/または3−ヒドロキシプロピオン酸を生産する方法。
JP2014526229A 2011-08-16 2012-08-16 細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする変種スクロース輸送ポリペプチド Abandoned JP2014525239A (ja)

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