CN105331618A - 一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，公开了一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因(JcSUT1,JcSUT3,JcSUT4)的克隆方法。克隆方法包括以下操作步骤：应用如SEQIDNO：1所示的引物F，如SEQIDNO：2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT1；应用如SEQIDNO：3所示的引物F，如SEQIDNO：4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3；应用如SEQIDNO：5所示的引物F，如SEQIDNO：6所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT4。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因(JcSUT1,JcSUT3,JcSUT4)的克隆方法。
背景技术
小桐子(Jatrophacurcas)又名麻疯树，为大戟科麻疯树属植物，是一种重要的生物能源树种。众所周知，绿色植物是通过光合作用合成有机物并以碳水化合物的形式运输到各个组织和器官从而完成其生长发育的整个生命过程。蔗糖作为其运输的主要形式在蔗糖转运蛋白的作用下从源组织转运到韧皮部中，然后沿着韧皮部长距离运输，最终卸载到植物的库细胞中。总而言之，蔗糖对植物生长和发育起着至关重要的作用。小桐子虽然属于高光效植物，但是其种实产量很低，特别是种子油含量参差不齐，这极大地限制了生物柴油产业化的应用。因此，克隆编码小桐子蔗糖转运蛋白的基因，对进一步阐明小桐子蔗糖运输过程和作用机制的以及产量性状的遗传改良具有重要的理论意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因(JcSUT1,JcSUT3,JcSUT4)的克隆方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，包括以下操作步骤：应用如SEQIDNO：1所示的引物F，如SEQIDNO：2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT1；应用如SEQIDNO：3所示的引物F，如SEQIDNO：4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3；应用如SEQIDNO：5所示的引物F，如SEQIDNO：6所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT4。
所述PCR的反应条件是：94℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸2min，将变性、退火和延伸三个步骤重复35个循环；循环结束后，68℃再延伸7min，4℃冷却10min；反应后加3μldNTPs、0.5μlTaq酶，72℃反应20min。
所述PCR的体系是：
所述cDNA第一链模板是按照以下方法合成：
(1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液：
5×IScriptreactionmix4μl
含1μgRNA的溶液xμl
IScriptreversetranscriptase1μl
Nuclease-freewater补齐至20μl；所述x≤15；
(2)将步骤(1)所得溶液吹打均匀，置于PCR中，以以下条件进行反转录扩增：25℃反转录引物和模板RNA退火结合5min，42℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA变性打开得到cDNA，然后4℃恒温保存。
所述RNA是按照以下提取方法得到：
(1)收集100mg冰冻的小桐子样品在离心管中，在组织解冻之前，加入500μl的BufferRCL和β-巯基乙醇的混合液，涡旋震荡30s，使样品充分混匀；所述BufferRCL和β-巯基乙醇的体积比为1：50；
(2)55℃金属浴1～3min；接着室温下以速度14000rpm离心5min；
(3)将上清液转移到含有gDNA过滤柱的2ml收集管中，并在室温下以速度14000rpm离心2min；
(4)加入相等体积的BufferRCB到下清液中，并通过移液器吸打混合液5～10次，使之充分混匀；
(5)将步骤(4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一个HiBindRNAMin的过滤柱的2ml收集管中，并在室温下以速度10000rpm离心1min；离心后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
(6)将步骤(4)中剩余混合液加入到过滤柱中，并在室温下以速度10000rpm离心1min；离心后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
(7)加入300μlRWCWashBuffer至过滤柱，在室温下以速度10000rpm离心1min；
(8)弃滤液，加入75μlDnasedigestion反应液至过滤柱中央滤膜上；所述Dnasedigestion是将OBIDnaseIDigestionBuffer73.5μl和RNase-freeDnaseI1.5μl颠倒混匀而成的混合液；
(9)室温下，静置15min；
(10)将过滤柱放置于干净的2ml收集管中，加入400μlRWCWashBuffer于室温下静置5min；然后在室温下以速度10000rpm离心1min；
(11)弃滤液，将过滤柱放回到收集管内，并加入500μlRNAWashBufferⅡ；然后在室温下以速度10000rpm离心1min；所述RNAWashBufferⅡ在使用前用48ml的无水乙醇稀释；
(12)重复步骤(11)操作一次，然后空转2min；
(13)将过滤柱转移至纯净的1.5ml离心管内，加入40μlDEPC水溶解RNA；
(14)室温下，静置5min；
(15)室温下，10000rpm离心1min，即可得到RNA，用核酸快速测定仪和琼脂糖凝胶电泳测浓度与纯度。
一种由权利要求1所述的克隆方法获得的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT1，所述的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT1的核苷酸基因序列如SEQIDNO：7所示。具体如下：Seq1[organism＝JatrophacurcasL][clone＝1590bp]sucerosetransporter1cDNA,completeCDS
一种由权利要求1所述的克隆方法获得的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT3，其特征在于：，所述的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT3的核苷酸基因序列如SEQIDNO：8所示。具体如下：Seq2[organism＝JatrophacurcasL][clone＝1848bp]sucerosetransporter3cDNA,completeCDS
一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT4，其特征在于：由权利要求1所述的克隆方法获得，所述的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT4的核苷酸基因序列如SEQIDNO：9所示。具体如下：Seq3[organism＝JatrophacurcasL][clone＝1503bp]sucerosetransporter4cDNA,completeCDS
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明设计的特异引物和特定的PCR扩增步骤能够有效的克隆出小桐子JcSUT1、JcSUT3、JcSUT4的CDS序列。
附图说明
图1是小桐子JcSUT1的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT1的cDNAPCR产物条带。
图2是小桐子JcSUT3的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT3的cDNAPCR产物条带。
图3是小桐子JcSUT4的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT4的cDNAPCR产物条带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1小桐子JcSUT1,JcSUT3,JcSUT4的cDNA克隆。
1、小桐子RNA提取方法：使用OMEGA公司生产的植物RNA提取试剂盒。
(1)收集100mg冰冻的小桐子样品在离心管中，在组织解冻之前，加入500μl的BufferRCL和β-巯基乙醇的混合液，涡旋震荡30s，使样品充分混匀；所述BufferRCL和β-巯基乙醇的体积比为1：50；
(2)55℃金属浴1～3min；接着室温下以速度14000rpm离心5min；
(3)将上清液转移到含有gDNA过滤柱的2ml收集管中，并在室温下以速度14000rpm离心2min；
(4)加入相等体积的BufferRCB到下清液中，并通过移液器吸打混合液5～10次，使之充分混匀；
(5)将步骤(4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一个HiBindRNAMin的过滤柱的2ml收集管中，并在室温下以速度10000rpm离心1min；离心后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
(6)将步骤(4)中剩余混合液加入到过滤柱中，并在室温下以速度10000rpm离心1min；离心后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
(7)加入300μlRWCWashBuffer至过滤柱，在室温下以速度10000rpm离心1min；
(8)弃滤液，加入75μlDnasedigestion反应液至过滤柱中央滤膜上；所述Dnasedigestion是将OBIDnaseIDigestionBuffer73.5μl和RNase-freeDnaseI1.5μl颠倒混匀而成的混合液；
(9)室温下，静置15min；
(10)将过滤柱放置于干净的2ml收集管中，加入400μlRWCWashBuffer于室温下静置5min；然后在室温下以速度10000rpm离心1min；
(11)弃滤液，将过滤柱放回到收集管内，并加入500μlRNAWashBufferⅡ；然后在室温下以速度10000rpm离心1min；所述RNAWashBufferⅡ在使用前用48ml的无水乙醇稀释；
(12)重复步骤(11)操作一次，然后空转2min；
(13)将过滤柱转移至纯净的1.5ml离心管内，加入40μlDEPC水溶解RNA；
(14)室温下，静置5min；
(15)室温下，10000rpm离心1min，即可得到RNA，用核酸快速测定仪和琼脂糖凝胶电泳测浓度与纯度。
2、使用伯乐公司的LandM-MLVRTKit(cDNA第一链的合成试剂盒)进行cDNA第一链的合成(RT-PCR)
(1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液：
5×IScriptreactionmix4μl
含1μgRNA的溶液xμl
IScriptreversetranscriptase1μl
Nuclease-freewater补齐至20μl；所述x≤15；
(2)将步骤(1)所得溶液吹打均匀，置于PCR中，以以下条件进行反转录扩增：25℃反转录引物和模板RNA退火结合5min，42℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA变性打开得到cDNA，然后4℃恒温保存。
3、JcSUT1、JcSUT3、JcSUT4cDNA的扩增：
根据诺禾致源公司提供的转录组序列，运用primer5.0设计JcSUTscDNA扩增引物，并在上海生物工程公司合成引物。应用如SEQIDNO：1所示的引物F，如SEQIDNO：2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT1；应用如SEQIDNO：3所示的引物F，如SEQIDNO：4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT2；应用如SEQIDNO：5所示的引物F，如SEQIDNO：6所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3。引物序列如表1所示：
表1引物序列列表
(1)在灭菌的0.2mL离心管加入下列试剂如下：
(2)PCR反应条件是：94℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸2min，将变性、退火和延伸三个步骤重复35个循环；循环结束后，68℃再延伸7min，4℃冷却10min；反应后加3μldNTPs、0.5μlTaq酶，72℃反应20min。
(3)PCR反应的产物电泳结果：
如图1所示，其中1、2均为JcSUT1的cDNAPCR产物条带。
如图2所示，其中1、2均为JcSUT3的cDNAPCR产物条带。
如图3所示，其中1、2均为JcSUT4的cDNAPCR产物条带。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于包括以下操作步骤：应用如SEQIDNO：1所示的引物F，如SEQIDNO：2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT1；应用如SEQIDNO：3所示的引物F，如SEQIDNO：4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3；应用如SEQIDNO：5所示的引物F，如SEQIDNO：6所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT4。
2.根据权利要求1所述的一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR的反应条件是：94℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸2min，将变性、退火和延伸三个步骤重复35个循环；循环结束后，68℃再延伸7min，4℃冷却10min；反应后加3μldNTPs、0.5μlTaq酶，72℃反应20min。
3.根据权利要求1所述的一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR的体系是：
4.根据权利要求3所述的一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于：所述cDNA第一链模板是按照以下方法合成：
(1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液：
5×IScriptreactionmix4μl
含1μgRNA的溶液xμl
IScriptreversetranscriptase1μl
Nuclease-freewater补齐至20μl；所述x≤15；
(2)将步骤(1)所得溶液吹打均匀，置于PCR中，以以下条件进行反转录扩增：25℃反转录引物和模板RNA退火结合5min，42℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA变性打开得到cDNA，然后4℃恒温保存。
5.根据权利要求4所述的一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于：所述RNA是按照以下提取方法得到：
(1)收集100mg冰冻的小桐子样品在离心管中，在组织解冻之前，加入500μl的BufferRCL和β-巯基乙醇的混合液，涡旋震荡30s，使样品充分混匀；所述BufferRCL和β-巯基乙醇的体积比为1：50；
(2)55℃金属浴1～3min；接着室温下以速度14000rpm离心5min；
(3)将上清液转移到含有gDNA过滤柱的2ml收集管中，并在室温下以速度14000rpm离心2min；
(4)加入相等体积的BufferRCB到下清液中，并通过移液器吸打混合液5～10次，使之充分混匀；
(5)将步骤(4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一个HiBind RNAMin的过滤柱的2ml收集管中，并在室温下以速度10000rpm离心1min；离心后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
(6)将步骤(4)中剩余混合液加入到过滤柱中，并在室温下以速度10000rpm离心1min；离心后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
(7)加入300μlRWCWashBuffer至过滤柱，在室温下以速度10000rpm离心1min；
(8)弃滤液，加入75μlDnasedigestion反应液至过滤柱中央滤膜上；所述Dnasedigestion是将OBIDnaseIDigestionBuffer73.5μl和RNase-freeDnaseI1.5μl颠倒混匀而成的混合液；
(9)室温下，静置15min；
(10)将过滤柱放置于干净的2ml收集管中，加入400μlRWCWashBuffer于室温下静置5min；然后在室温下以速度10000rpm离心1min；
(11)弃滤液，将过滤柱放回到收集管内，并加入500μlRNAWashBufferⅡ；然后在室温下以速度10000rpm离心1min；所述RNAWashBufferⅡ在使用前用48ml的无水乙醇稀释；
(12)重复步骤(11)操作一次，然后空转2min；
(13)将过滤柱转移至纯净的1.5ml离心管内，加入40μlDEPC水溶解RNA；
(14)室温下，静置5min；
(15)室温下，10000rpm离心1min，即可得到RNA，用核酸快速测定仪和琼脂糖凝胶电泳测浓度与纯度。
6.一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT1，其特征在于：由权利要求1所述的克隆方法获得，所述的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT1的核苷酸基因序列如SEQIDNO：7所示。
7.一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT3，其特征在于：由权利要求1所述的克隆方法获得，所述的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT3的核苷酸基因序列如SEQIDNO：8所示。
8.一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT4，其特征在于：由权利要求1所述的克隆方法获得，所述的小桐子蔗糖转运蛋白同源基因JcSUT4的核苷酸基因序列如SEQIDNO：9所示。
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