CN116732088B - 一种PpyBZR2基因在促进梨休眠芽萌发中的应用 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种PpyBZR2基因在促进梨休眠芽萌发中的应用，本发明通过兼并性引物将其克隆，利用病毒介导的转基因技术，将基因的超量表达载体转入梨芽中，发现过量表达（Overexpression,OE）PpyBZR2基因能够提高梨芽中赤霉素含量，促进梨芽在需冷量不足时萌发达到解除休眠条件，对梨树在南方高温地区栽培及南繁加速育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PpyBZR2基因在促进梨休眠芽萌发中的应用。
背景技术
芽休眠是多年生木本植物生长发育过程中一种对季节及环境相适应的生物学现象，植物休眠状态分为3种类型，即类休眠、内休眠及生态休眠。传统的休眠指的是内休眠，内休眠是由植物内部的生理因素所控制的，处于内休眠的芽，即使在有利的环境条件，且没有顶芽或叶片的限制也不能萌动，只有经过一定时间的低温积累（需冷量）才能解除，休眠芽萌发率达到50%即视为休眠解除。梨属蔷薇科梨属植物。在我国梨是继苹果、柑橘之后的第三大水果，我国是梨出口大国，近年来年均梨出口率大约占世界梨出口总量的20%。梨属于落叶果树，适生于温暖多湿地区，平坝、浅丘均可生长，对土壤要求不严，生长地方需要有足够的光线跟热量，其休眠期需要一定的低温积累，低温积累不足会导致萌芽、开花、坐果及枝叶生长的异常，严重影响树体的生产能。今年随着全球变暖，许多南方高温地区由于低温积累不足，导致梨树产能降低的现象常有发生。海南地处热带北部边缘，属热带季风气候，1月份低温最低仍达17.4 ~ 23.5 ℃，年平均气温23.1~27.0 ℃，年降雨量940.8~2388.2 mm，年日照时数为1827.6~2810.6 h，日照百分率为40~62%，光温条件充足，光合作用潜力高，素有“天然温室”之称。海南作为“天然温室”，是全国最大的南繁育种基地，如能将梨种植至海南，可加速梨育种进程。对于落叶果树梨来说，休眠特性显然成为了其南繁加速育种的一大限制点。
赤霉素（GAs）与芽的休眠解除有密切的关系，调控植物的众多生理过程，包括种子萌发、下胚轴伸长、叶子伸展、开花调控、种子及果实的发育等。研究发现GA4能够打破杨树休眠，促进其花芽萌发，同时外源GA4可以加速梅花芽休眠解除，这些结果表明，内源的赤霉素能促进植物打破休眠促进萌发。2,4-表油菜素内酯（EBR）见光不易分解，苹果中施用EBR增加了其内源GA3含量。
BRI1-EMS-SUPPRESSOR-1（BES1又名BZR2）转录因子是BRs生物合成途径的反馈调节基因。不同物种中BZR2的蛋白质序列均具有BES1_N 超家族结构域。BZR2转录因子基因家族较小，与其他家族已知蛋白质没有显著相似性的序列。作为BRs信号传导的中心组成部分，BZR2促进植物生长，参与调节光控制的叶开放、细胞分裂和分化等几个生物过程。BZR2是油菜素类固醇（BR）信号传导的关键转录因子，并且是许多信号级联的整合点。
棉花的BZR基因能够显著促进细胞伸长，同源过表达GhBZR基因，促进了棉花胚珠表面纤维细胞伸长，而GhBZR表达抑制的棉花植株胚珠表面纤维细胞伸长受到抑制，细胞发育滞后。这些结果表明，BZRs转录因子在植物的生长发育及抵御生物胁迫中起重要作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，公开了一种PpyBZR2基因在促进梨休眠芽萌发中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种PpyBZR2基因在促进梨休眠芽萌发中的应用， PpyBZR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。PpyBZR2基因在需冷量不足时能促进梨休眠芽萌发。
进一步地，具体为：在梨休眠芽中，利用病毒介导的瞬时转化对PpyBZR2基因进行超表达，促进休眠芽萌发。
进一步地，所述在梨休眠芽中，利用病毒介导的瞬时转化对PpyBZR2基因进行超表达具体为：
将含PpyBZR2基因过表达质粒的侵染液注射于含梨休眠芽的枝条中，使PpyBZR2基因超表达。
进一步地，所述PpyBZR2基因过表达质粒的载体为IL-60-BS病毒载体。
本发明通过植物基因工程技术，从梨芽中克隆出PpyBZR2基因完整编码区段，并验证了该基因的功能，发现在休眠梨芽低温积累不足时梨芽中瞬时过表达PpyBZR2可以促进GAs生物合成，从而促进低温积累不足时梨芽休眠解除，其萌芽率显著提高。研究探索PpyBZR2基因在梨休眠解除中的作用，并将其应用于南方高温地区梨树栽培以及梨的南繁育种，得到一种更简洁、更高效在低温积累不足时使梨芽能够正常休眠解除的方法，在休眠研究领域中具有现实意义。
附图说明
图1为梨芽的PCR扩增产物电泳图谱；
图2为对照组IL60-2和实验组PpyBZR2-OE梨芽的PpyBZR2基因表达量统计图；
图3为对照组IL60-2和实验组PpyBZR2-OE梨芽的萌芽率统计图；
图4为对照组IL60-2和实验组PpyBZR2-OE梨芽中GAs含量统计图；其中图4中的A为GA1含量统计图，图4中的B为GA3含量统计图，图4中的C为GA4含量统计图，图4中的D为GA7含量统计图，图4中的E为GA9含量统计图，图4中的F为GA24含量统计图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：梨PpyBZR2基因的克隆
一、梨芽RNA提取及反转录
1、植物组织总RNA采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根）提取，步骤包括：
(1)匀浆：取100 mg‘砀山酥梨’梨芽在液氮中迅速研磨成粉末，加入500 μL SL（含5 %的β-巯基乙醇），立即涡旋震荡剧烈混匀；
(2) 将步骤（1）混匀后的溶液于12000 rpm离心2 min；
(3)将步骤（2）离心后的上清液转移至装有收集管的CS滤柱上，然后12000 rpm离心2 min，将收集管中的上清液转移至新的RNase-Free的离心管中，尽量避免吸头吸入收集管中的沉淀及细胞碎片；
(4) 继续在RNase-Free离心管中缓慢加入0.4倍体积的无水乙醇，混匀后，将得到的溶液和步骤（3）离心后的沉淀一起转入CR3吸附柱中，然后12000 rpm离心15 s，丢弃收集管内废液，将CR3吸附柱放回收集管中；
(5)向CR3吸附柱中加入RW1去蛋白液350 μL，然后12000 rpm离心15 s，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回收集管中；
(6)配制DNaseI工作液：取DNaseI储存液10 μL放入新的离心管（RNase-Free）中，加入RDD溶液70 μL，缓缓混匀；
(7)向CR3吸附柱中央加入DNaseI工作液80 μL，室温放置15 min；
(8)继续向CR3吸附柱中加入去蛋白液RW 1350 μL，然后12000 rpm离心15 s，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回至收集管中；
(9)向CR3吸附柱中加入漂洗液RW（含乙醇）500 μL，然后12000 rpm离心15 s，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回收集管中；
(10)重复步骤9，然后12000 rpm离心2 min，取新的RNase-Free离心管，将CR3吸附柱放入其中，悬空滴加30-50 μL ddH2O（RNase-Free）至吸附膜的中间，室温放置2 min后12000 rpm离心1 min，离心所得即为提取的RNA溶液。
2、反转录获得cDNA
使用宝日医生物技术有限公司（北京，Takara中国）的PrimeScript™ II 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行合成反转录cDNA第一条链，步骤如下：
(1)在Microtube管中配制如表1所示的反应体系，使RNA变性；
表1 反应体系
(2)轻轻混匀，65 ℃孵育5 min之后迅速冰浴；
(3)在上述Microtube管中配制如表2所示的反转录反应液，总量为20 µL；
表2 反转录反应液
(4)将上述反转录反应液缓慢混匀按下列条件进行反转录反应：42℃反应30 min，然后在95℃加热5 min（酶失活），后立即冰浴。
二、cDNA全长序列获得
使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的Phusion DNA 聚合酶对PpyBZR2基因进行PCR扩增，引物序列如下：
PpyBZR2-F：gcagaatctgaattcgtcgacATGACAGGCGGTGGTTCATC，SEQ ID NO.3；
PpyBZR2-R：cacgtgtggtctagagctagcATGGTTCTTCCCATTGCCAA，SEQ ID NO.4；
反应体系及步骤如下：
(1)在冰上配制如表3所示的反应液：
表3 反应液
(2)PCR反应条件为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸1min；变性、退火及延伸共进行34个循环；最后72℃终延伸10 min；
(3)1%琼脂糖凝胶用于PCR结果的凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示，获得了一个948 bp的PpyBZR2序列。
(4)琼脂糖凝胶电泳产物回收，采用天根生化科技（北京）有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行琼脂糖凝胶电泳产物的回收，操作步骤按说明书进行，获得梨PpyBZR2基因。
实施例2：梨PpyBZR2基因在梨芽的瞬时过量表达
一、PpyBZR2基因的病毒表达载体的构建
为研究PpyBZR2基因的功能，将包含有PpyBZR2基因编码区在内的共948bp片段正确插入IL-60-BS病毒载体上。
使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的FastDigest内切酶Sal І和Nhe I酶切IL-60-BS病毒载体质粒（各800 ng），酶切反应体系如表4所示。
表4 酶切反应体系
37 ℃酶切20 min，对酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察后切胶回收。
采用ClonExpress II一步克隆试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司）将胶回收产物与表达载体于37℃连接30 min，连接反应体系如表5所示。
表5 连接反应体系
将连接后的产物转化DH5α菌，菌落PCR筛选阳性单克隆菌落，PCR反应条件为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸1 min；变性、退火及延伸共进行34个循环；72℃终延伸10 min；于杭州尚亚生物技术有限公司进行测序，将测序正确阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒即PpyBZR2-OE表达载体。
测序结果表明，PpyBZR2基因的开放阅读框有948 bp（如SEQ ID NO.1所示），编码316个氨基酸（如SEQ ID NO.2所示）。
将PpyBZR2-OE表达载体及IL-60-BS空载体扩大培养提取质粒，-20 ℃保存备用。
二、PpyBZR2过量表达梨芽的获得
于10月1日未进入休眠砀山梨种植园取花芽饱满的‘砀山酥梨’枝条，于10℃低温积累720 h使枝条有一定的低温积累量。将备用质粒使用侵染液稀释至终浓度为5 ng·μl-1。使用1 ml注射器将质粒注射待侵染的花芽饱满‘砀山酥梨’枝条，将注射枝条插培于吸满水的花泥上，15℃暗培养3 天。侵染3天后，取30颗芽用于提取RNA进行检测。其中，转入空载体质粒的为对照组IL60-2，转入PpyBZR2-OE表达载体质粒的为实验组PpyBZR2-OE，每组包含8根枝条，每组不少于30颗芽，各三个重复，在25℃（16 h白天）/21℃（8 h黑夜），相对湿度70 ± 5%持续培养20 天统计萌芽率。
提取对照组IL60-2和实验组PpyBZR2-OE梨芽总RNA，使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，利用宝生物TB Green™ Fast qPCR Mix染料，检测PpyBZR2基因的表达水平，反应体系及实验步骤如下：
在冰上配制PCR反应液，如表6所示。
表6 PCR反应液
在CFX96定量PCR仪上采用两步法进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性30 s，然后95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环，最后进行溶解曲线的绘制；采用2-ΔΔCT方法计算基因的表达量，结果如图2所示，瞬时侵染梨芽后发现实验组PpyBZR2-OE梨芽的PpyBZR2基因的表达量显著高于对照组IL60-2。
三、瞬时超表达梨芽萌芽率分析
统计瞬时表达梨芽的萌芽率，如图3所示，瞬时侵染梨芽后发现实验组PpyBZR2-OE梨芽的萌芽率显著高于对照组IL60-2。
四、赤霉素含量测定
（1）激素提取：将对照组IL60-2和实验组PpyBZR2-OE梨芽样品于液氮中研磨至粉碎，准确称量约1 g新鲜植物样品；向粉末中加入10 mL异丙醇/盐酸提取缓冲液，4℃震荡30min；再加入20mL二氯甲烷，4℃震荡30 min；随后4℃，13000 r·min-1离心5 min，取下层有机相；避光，以氮气吹干有机相，以400 µL甲醇（含0.1vol%甲酸）溶解；过0.22 μm滤膜，进HPLC-MS/MS检测。
（2）标准溶液配制：以甲醇（含0.1vol%甲酸）为溶剂配制梯度为0.1 ng·mL-1，0.2ng·mL-1，0.5 ng·mL-1，2 ng·mL-1，5 ng·mL-1，20 ng·mL-1，50 ng·mL-1，200 ng·mL-1的GA1、GA3、GA4、GA7、GA9和GA24标准溶液。在实际绘制标曲方程时去掉线性不好的点。
（3）液相条件：色谱柱：poroshell 120SB-C18反相色谱柱（2.1×150, 2.7 μm）；柱温：30℃；流动相：A：B=（甲醇/0.1vol%甲酸）：（水/0.1vol%甲酸）；洗脱梯度：0-1 min，A=20%；1-9 min，A递增至80%；9-10 min，A=80%；10-10.1 min，A递减至20%；10.1-15 min，A=20%；进样体积：2 µL。
（4）质谱条件：气帘气：15 psi；喷雾电压：4500 V；雾化气压力：65 psi；辅助气压力：70 psi；雾化温度：400℃。
结果如图4所示，实验组PpyBZR2-OE梨芽中赤霉素GAs含量明显高于对照组IL60-2，特别是GA4和GA9，表明PpyBZR2基因在梨芽休眠解除过程中起到正调控的作用。
综上，从梨中分离到了PpyBZR2基因，通过梨芽中转基因功能验证分析发现，PpyBZR2在促进梨芽萌发和梨芽休眠解除方面具有显著效果，提高了需冷量对梨芽萌发的限制，对于低温影响梨休眠解除和创造梨南繁育种条件具有重要意义。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种PpyBZR2基因在促进梨休眠芽萌发中的应用，其特征在于，在梨休眠芽中，对PpyBZR2基因进行超表达，PpyBZR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体为：在梨休眠芽中，利用病毒介导的瞬时转化对PpyBZR2基因进行超表达，促进休眠芽萌发。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述在梨休眠芽中，利用病毒介导的瞬时转化对PpyBZR2基因进行超表达具体为：
将含PpyBZR2基因过表达质粒的侵染液注射于含梨休眠芽的枝条中，使PpyBZR2基因超表达。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PpyBZR2基因过表达质粒的载体为IL-60-BS病毒载体。
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