CN117568290B - 一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白、基因和应用及方法 - Google Patents

一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白、基因和应用及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7‑DR蛋白、基因和应用及方法。本发明提供了一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7‑DR蛋白，所述Dp7‑DR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后仍能够参与合成薯蓣皂苷的衍生的氨基酸序列。实施例结果表明：从山药中克隆的Dp7‑DR基因转入拟南芥，拟南芥植株中薯蓣皂苷含量升高。本发明的山药Dp7‑DR基因可以促进薯蓣皂苷的合成，Dp7‑DR基因在影响植物薯蓣皂苷合成方面具有十分重要的作用。

Description

一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白、基因和应用及方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白、基因和应用及方法。
背景技术
山药是薯蓣科薯蓣属(Dioscorea)植物，是全世界范围普遍种植的粮、菜、饲及食品加工原料兼用的多用途作物。山药包含600多种，我国约有50种，其中以薯蓣种(D.polystachya Turczaninow)普遍栽培。山药是著名的药食同源作物，其块茎营养丰富、活性物质含量高、增产潜力大，是支撑乡村振兴、产业兴旺的优选作物，对提升农业质量效益和竞争力，具有重大意义。
山药块茎的主要药用成分为薯蓣皂苷。薯蓣皂苷是一种典型的天然皂苷类化合物，不仅可作为合成甾体激素的重要原料，还可作为抗肿瘤、抗高血脂、抗炎等药物的原料，其上游产物薯蓣皂苷元在药物工业中具有“药用黄金”的称号，具有广阔的应用前景。然而，薯蓣皂苷的生物合成途径较为复杂，一般分为2,3-氧化鲨烯的合成、胆固醇的合成、薯蓣皂苷元的合成和薯蓣皂苷的合成四个阶段。7-脱氢胆固醇还原酶(7-dehydrocholesterolreductase,7-DR)是将7-脱氢胆固醇转化成胆固醇的关键酶，但山药中7-脱氢胆固醇还原酶基因Dp7-DR及其编码蛋白Dp7-DR的功能鲜有报道。
我国早期关于薯蓣皂苷的研究主要在提取工艺、化学合成和药理作用等方面，与生物体中薯蓣皂苷合成机理相关的研究较少，仅依靠从天然植物中提取的薯蓣皂苷无法满足需求量。且薯蓣属作物遗传背景复杂，薯蓣皂苷合成路径中的多数基因尚未被分离，其合成途径以及调控机制尚未完全解析。因此，解析山药薯蓣皂苷的生物合成途径，寻求新的方法以利于调节薯蓣皂苷的生物合成，同时对山药优质栽培与产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的提供一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白，调控植物中的薯蓣皂苷合成。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白，所述Dp7-DR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后仍能够参与合成薯蓣皂苷的衍生的氨基酸序列。
本发明提供了编码上述技术方案所述的Dp7-DR蛋白的基因，所述基因为如下(1)～(4)中任一所述的DNA分子：
(1)编码区包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA分子；
(2)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且能够编码权利要求1所述的Dp7-DR蛋白的DNA分子；
(4)能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交，且能够编码权利要求1所述的Dp7-DR蛋白的DNA分子。
本发明提供了一种表达Dp7-DR基因的重组载体，插入上述技术方案所述基因。
优选的，所述重组载体的原始载体包括植物表达载体。
本发明提供了一种表达Dp7-DR基因的重组菌，包含如上述技术方案所述重组载体。
本发明提供了上述技术方案所述的Dp7-DR蛋白或上述技术方案所述基因或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的重组菌在提高植物薯蓣皂苷含量或培育薯蓣皂苷含量高的植物中的应用。
优选的，所述植物包括双子叶植物、单子叶植物、十字花科植物和拟南芥中的一种或几种。
本发明提供了一种培育薯蓣皂苷含量升高的植物的方法，在植物中过表达上述技术方案所述的基因。
优选的，在所述植物中过表达上述技术方案所述的基因的方式包括将上述技术方案所述重组载体转入农杆菌得到重组菌，将所述重组菌转染植物。
优选的，所述植物包括双子叶植物、单子叶植物、十字花科植物和拟南芥中的一种或几种。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白，所述Dp7-DR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后仍能够参与合成薯蓣皂苷的衍生的氨基酸序列。本发明所述Dp7-DR蛋白由基因Dp7-DR编码合成，7-脱氢胆固醇还原酶基因(即Dp7-DR基因)在调控植物薯蓣皂苷合成过程中发挥着的关键性作用，7-脱氢胆固醇还原酶基因编码形成的7-脱氢胆固醇还原酶(即7-DR)可以提高薯蓣皂苷的含量。实施例结果表明：从山药中克隆的Dp7-DR基因转入拟南芥，过表达Dp7-DR基因的拟南芥植株中薯蓣皂苷含量升高。可见，本发明所述山药Dp7-DR基因可以促进薯蓣皂苷的合成，Dp7-DR基因在影响植物薯蓣皂苷合成方面具有十分重要的作用。Dp7-DR蛋白或Dp7-DR基因在代谢调控等领域具有广阔的应用前景，可为进一步研究植物特异代谢物的生物合成、山药优质高产栽培和分子育种提供理论支撑，具有非常重要的经济效益和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1山药Dp7-DR基因的克隆；
图2为实施例2山药不同组织部位Dp7-DR基因的相对表达量和薯蓣皂苷的含量分析；其中a代表山药不同组织部位Dp7-DR基因的相对表达量，b代表山药不同组织部位薯蓣皂苷的含量；
图3为实施例3的Dp7-DR基因过表达载体部分原件示意图；
图4为实施例3的转基因拟南芥中Dp7-DR基因表达量鉴定结果；
图5为实施例3的样品中薯蓣皂苷的高效液相色谱图；其中a代表野生型拟南芥叶片中薯蓣皂苷高效液相色谱图，b代表转基因Dp7-DR基因过表达拟南芥叶片中薯蓣皂苷高效液相色谱图；
图6为实施例3的薯蓣皂苷的高效液相色谱标准曲线；
图7为实施例3的转基因Dp7-DR基因过表达拟南芥叶片中薯蓣皂苷含量分析。
具体实施方式
本发明提供了一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白，所述Dp7-DR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后仍能够参与合成薯蓣皂苷的衍生的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码上述技术方案所述Dp7-DR蛋白的基因，本发明所述基因优选为如下(1)～(4)中任一所述的DNA分子：
(1)编码区包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA分子；
(2)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且能够编码前述技术方案所述的Dp7-DR蛋白的DNA分子；
(4)能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交，且能够编码前述技术方案所述的Dp7-DR蛋白的DNA分子。
本发明利用正向引物(如SEQ ID NO:3所示)和反向引物(如SEQ ID NO:4所示)，以瑞昌山药cDNA为模板进行PCR扩增，得到编码Dp7-DR蛋白的基因Dp7-DR。
在本发明中，所述正向引物的核苷酸序列优选为5’-ATGGTGGAATCCAAGACGGTG-3’(如SEQ ID NO:3所示)，所述反向引物的核苷酸序列优选为5’-ATCCCCGGGATGATCCTGTAC-3’(如SEQ ID NO:4所示)。
在本发明中，以瑞昌山药cDNA为模板进行PCR扩增时的扩增体系优选以50μL计，包括：2μL正向引物(引物自身浓度10μM)，2μL反向引物(引物自身浓度10μM)，模板(瑞昌山药cDNA，模板自身浓度100ng/μL)2μL，Taq高保真酶(5U/μL)1μL，dNTP Mixture(自身浓度25mM)4μL，10×PCR缓冲液5μL，无菌ddH2O 34μL；所述PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明还提供了一种表达Dp7-DR基因的重组载体，插入上述技术方案所述基因。本发明所述重组载体的原始载体优选包括植物表达载体。在本发明实施例中，所述原始载体优选为pBI121。本发明所述表达Dp7-DR基因的重组载体将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列优选插入pBI121的XbaI和BamHI酶切位点间得到的载体；即SEQ ID NO:2的第1位5’端紧邻XbaI酶切位点，SEQ ID NO:2的最后1位3’端紧邻BamHI酶切位点，得到的载体。
本发明还提供了一种表达Dp7-DR基因的重组菌，包括如上述技术方案所述的重组载体。
本发明提供了上述技术方案所述的Dp7-DR蛋白或上述技术方案所述的基因或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的重组菌提高植物薯蓣皂苷含量或培育薯蓣皂苷含量高的植物中的应用。
本发明所述应用优选包括如下步骤：将编码所述Dp7-DR蛋白的基因转入植物，诱导基因Dp7-DR表达。
本发明所述植物优选包括双子叶植物、单子叶植物、十字花科植物和拟南芥中的一种或几种。在本发明实施例中，转基因拟南芥植株优选通过如下方法实现：将与山药薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR基因转化入拟南芥植株，得到诱导Dp7-DR基因表达的转基因拟南芥植株。本发明所述的转化植物细胞的方式优选包括农杆菌转化法，优选利用农杆菌介导植物遗传转化。本发明所述农杆菌转化法优选采用蘸花法，本发明对所述蘸花法的操作步骤没有特殊的限定，采用常规的方法即可。
本发明所述农杆菌株优选为根癌农杆菌GV3101。本发明所述Dp7-DR基因过表达转基因拟南芥植株优选利用PCR扩增和荧光定量PCR方法进行验证。
本发明所述PCR扩增参数已在上文论述，在此不再赘述。
本发明所述荧光定量PCR体系优选以20μL计，采用中国聚合美生物科技有限公司提供的荧光定量试剂(SYBER Green,with anti-Taq)进行，包括：0.2μL正向引物(引物自身浓度10μM)，0.2μL反向引物(引物自身浓度10μM)，100ng模板(瑞昌山药cDNA)，5μLqPCRGreen Master Mix，RNase free ddH2O补齐至20μL；所述荧光定量PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃复性20s，72℃延伸20s，共40个循环。
得到T0代转基因拟南芥植株，本发明优选收获T0代转基因拟南芥植株种子播种于含50mg/L的卡那霉素的MS培养基上，筛选移栽后得到T1代转基因拟南芥植株，T1代转基因拟南芥植株收获得到T1代转基因拟南芥种子；T1代转基因拟南芥种子播种于含50mg/L的卡那霉素的MS培养基上，筛选移栽后得到T2代转基因拟南芥植株，T2代转基因拟南芥植株收获得到T2代转基因拟南芥种子；T2代转基因拟南芥种子播种于含50mg/L的卡那霉素的MS培养基上，筛选移栽后得到T3代转基因拟南芥植株。相比于野生型拟南芥植株，T3代转基因拟南芥植株叶片中的薯蓣皂苷含量提高。本发明所述筛选优选利用含有50mg/L的卡那霉素的MS培养基。
本发明提供了一种培育薯蓣皂苷含量升高的植物的方法，在所述植物中过表达上述技术方案所述的基因，本发明在所述植物中过表达上述技术方案所述的基因优选包括将上述技术方案所述重组载体转入农杆菌得到重组菌，将所述重组菌转染植物。
在本发明中，所述植物包括双子叶植物、单子叶植物、十字花科植物和拟南芥中的一种或几种。
本发明提供的培育薯蓣皂苷含量升高的植物的方法可以提高未转基因前原始植物中Dp7-DR基因的相对表达量，转基因植物的薯蓣皂苷含量高于未转基因前原始植物的薯蓣皂苷含量。
本发明通过实验证明过表达山药Dp7-DR基因能增加拟南芥中薯蓣皂苷的含量，表明7-脱氢胆固醇还原酶基因Dp7-DR基因在调控植物薯蓣皂苷合成过程中发挥着的关键性作用。本发明不仅可应用于特异代谢物的生物合成，还为山药优质高产栽培和分子育种提供了理论支撑，具有非常重要的经济效益和社会效益。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，在以下实施例中，除非特殊说明，均为常规方法，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1 Dp7-DR蛋白及其编码基因的获得
从瑞昌山药中发现一种7-脱氢胆固醇还原酶，将其命名为Dp7-DR蛋白，如序列表的序列1(SEQ ID NO:1)所示。将编码Dp7-DR蛋白的基因命名Dp7-DR基因，如序列表的序列2(SEQ ID NO:2)所示。
1.混合瑞昌山药的根、茎、叶、果实，得到混合物，采用TaKaRa公司提供的植物RNA提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit)提取混合物的RNA。
2.cDNA合成方法。以步骤1的RNA为模板，采用TaKaRa公司提供的反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)反转录得到第一链cDNA。
3.以步骤2得到的cDNA为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR扩增，其中正向引物：5’-ATGGTGGAATCCAAGACGGTG-3’(SEQ ID NO:3)；反向引物：5’-ATCCCCGGGATGATCCTGTAC-3’(SEQ ID NO:4)；PCR扩增反应体系见表1。PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
表1 PCR扩增反应体系
组分 体系
ddH2O 34μL
10×PCR缓冲液 5μL
dNTP Mixture(25mM) 4μL
Taq高保真酶(5U/μL) 1μL
正向引物(10μM) 2μL
反向引物(10μM) 2μL
模板(cDNA，浓度为100ng/μL) 2μL
Total 50μL
4.步骤3得到的PCR产物共1305bp，具体克隆结果如图1所示。将PCR产物送去测序，该PCR产物具有序列表中如SEQ ID NO:2所示的核苷酸，该核苷酸的基因的开放阅读框为序列1第1～1305位；该基因命名为Dp7-DR；该基因编码的蛋白命名为Dp7-DR，该蛋白的氨基酸序列为序列表中如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：MVESKTVHSALITYTSMISLLSLCPPFVILLWYTMVHADGSVMQTFEYLKQNGLEGLKTIWPAPSLIAWKIIAVFGAFEAFLQLALPGKRFEGPVSPTGHVPVYKANGLQAYAVTLITYLGLWWFGIFNPAIVYDHLGEIYSALVTGSLVFCVFLYIKGHLAPSSSDSGSSGNVIIDFYWGMELYPRIGKHFDIKVFTNCRFGMMSWAVLALTYCIKQYEQNGRVADSMLVNTALMLVYITKFFWWESGYWCTMDIAHDRAGFYICWGCLVWVPSIYTSPGMYLVNHPVNLGTQLALSILAAGLLCIYINYDCDRQRQEFRRTNGKCKIWGKAPSKIVASYKTTKGETKTSLLLTSGWWGLARHFHYVPEISAAFFWTVPALFSHFLPYFYVIFLTILLFDRAKRDDDRCSSKYGKYWKMYCDRVPYRIIPGIY。
SEQ ID NO:2：5’-ATGGTGGAATCCAAGACGGTGCACTCGGCCCTCATCACTTACACGTCCATGATATCCCTCCTCTCCCTCTGCCCCCCTTTCGTCATCCTTCTATGGTATACAATGGTTCATGCTGATGGTTCTGTTATGCAAACGTTTGAGTATCTTAAGCAAAATGGTCTAGAGGGCCTCAAAACCATCTGGCCAGCACCATCTCTCATTGCATGGAAAATCATTGCTGTTTTTGGTGCATTTGAAGCTTTTCTTCAGCTCGCATTGCCTGGTAAAAGGTTTGAAGGCCCGGTTTCTCCTACAGGACATGTACCTGTTTATAAGGCCAATGGTCTGCAAGCTTACGCAGTAACACTGATAACTTACCTTGGTCTCTGGTGGTTTGGGATATTCAACCCCGCTATTGTGTATGACCATCTTGGAGAAATCTATTCAGCCCTTGTAACAGGAAGCCTTGTCTTCTGTGTCTTCTTGTATATAAAGGGGCATTTGGCACCTTCATCTTCTGATTCTGGGTCCTCTGGGAATGTGATTATTGACTTCTATTGGGGAATGGAATTATATCCCCGAATTGGTAAACATTTTGATATCAAAGTTTTCACAAACTGCCGCTTTGGTATGATGTCTTGGGCAGTTTTGGCTTTAACATATTGCATCAAACAGTATGAACAGAATGGTCGAGTTGCTGATTCAATGCTTGTGAATACTGCATTGATGCTTGTGTATATTACCAAGTTCTTTTGGTGGGAATCTGGATATTGGTGCACAATGGATATTGCTCATGATAGAGCTGGATTCTATATTTGCTGGGGATGCTTGGTATGGGTTCCATCAATCTATACATCTCCTGGGATGTACCTTGTTAACCATCCTGTGAATCTCGGTACCCAGCTTGCACTTTCAATACTAGCTGCTGGACTCTTGTGCATATATATCAACTATGACTGTGATAGGCAAAGACAAGAGTTCCGTAGAACAAATGGAAAGTGTAAAATTTGGGGGAAAGCTCCGTCGAAGATAGTGGCCTCTTATAAAACAACAAAAGGGGAGACGAAAACTAGCCTTCTTCTTACTTCAGGCTGGTGGGGTTTAGCTCGTCATTTCCATTACGTACCAGAAATATCAGCCGCGTTCTTCTGGACAGTGCCAGCACTTTTCAGCCATTTCCTGCCATATTTCTATGTGATCTTTCTCACCATTCTCCTTTTCGACCGTGCAAAAAGGGATGATGATAGGTGCTCTTCCAAGTATGGGAAATATTGGAAGATGTACTGTGACAGAGTGCCGTACAGGATCATCCCGGGGATCTACTGA-3’。
实施例2、Dp7-DR基因时空表达分析
取瑞昌山药的块茎皮(Tuber Peel)，提取块茎皮的总RNA，反转录合成块茎皮第一链cDNA；
取瑞昌山药的块茎的肉(TuberFlesh)，提取块茎的肉的总RNA，反转录合成块茎的肉第一链cDNA；
取瑞昌山药的茎(Stem)，提取茎的总RNA，反转录合成茎的第一链cDNA；
取瑞昌山药的叶片(Leaf)，提取叶片的总RNA，反转录合成叶片的第一链cDNA；
瑞昌山药的块茎皮第一链cDNA、块茎的肉第一链cDNA、茎第一链cDNA和叶片第一链cDNA作为模版进行荧光定量PCR检测时独立进行。分别以瑞昌山药的块茎皮第一链cDNA、块茎的肉第一链cDNA、茎的第一链cDNA、叶片的第一链cDNA为模版，以Actin基因为内参基因，采用荧光定量PCR的方法检测基因的表达情况。
荧光定量PCR扩增体系优选以20μL计，采用中国聚合美生物科技有限公司提供的荧光定量试剂(SYBER Green,with anti-Taq)进行，包括：0.2μL正向引物(引物自身浓度10μM)，0.2μL反向引物(引物自身浓度10μM)，cDNA模板100ng(根据cDNA模板的质量浓度和所需质量确定cDNA模板的添加体积)，5μLqPCRGreen Master Mix，RNasefree ddH2O补齐至20μL。
所述荧光定量PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃复性20s，72℃延伸20s，共40个循环。
荧光定量PCR检测时采用YDp7-DR-F和引物YDp7-DR-R组成的引物对检测Dp7-DR基因的表达，采用引物ACTIN-F和引物ACTIN-R组成的引物对检测Actin基因的表达。
YDp7-DR-F：5’-TACCTTGGTCTCTGGTGGTTTGG-3’(SEQ ID NO:5)；
YDp7-DR-R：5’-ATAATCACATTCCCAGAGGACCCA-3’(SEQ ID NO:6)；
ACTIN-F：5’-GAGCAAGGAAATCACAGCAC-3’(SEQ ID NO:7)；
ACTIN-R：5’-TCAGGGAAGCCAAGATAGAG-3’(SEQ ID NO:8)。
结果如表1和图2所示。结果表明，Dp7-DR基因在山药块茎的皮中相对表达量较高，其他部位较低。
表1山药不同组织部位Dp7-DR基因的相对表达量与薯蓣皂苷的含量
组织部位 Dp7-DR基因相对表达量 薯蓣皂苷含量(mg/g)
块茎皮(Tuber Peel) 5.832±0.254a 4.616±0.212a
块茎肉(Tuber Flesh) 2.590±0.224bc 3.088±0.200b
叶片(Stem) 1.675±0.107bc 0.216±0.002cd
茎(Stem) 1.000±0.030c 0.105±0.002d
注：不同字母代表差异显著，P＜0.05。
实施例3、Dp7-DR基因的功能研究
MS固体培养基组成为：MS培养基4.43g，蔗糖30g，植物凝胶2.5g，补水至1L，调pH5.7～5.8；MS培养基购买自北京西美杰科技有限公司，货号：M519。
一、转Dp7-DR基因拟南芥的构建
1、重组载体
过表达Dp7-DR基因的重组载体pBI121-Dp7-DR的具体构建过程为：
将SEQ ID NO:2所示的Dp7-DR基因的核苷酸序列插入植物表达载体pBI121的XbaI和BamHI酶切位点间，即SEQ ID NO:2的第1位5’端紧邻XbaI酶切位点，SEQ ID NO:2的最后1位3’端紧邻BamHI酶切位点，得到重组载体。
重组载体pBI121-Dp7-DR部分原件示意图如图3所示。
2、重组农杆菌
将上述1得到的重组载体pBI121-Dp7-DR采用冻融法导入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌GV3101/pBI121-Dp7-DR。
3、农杆菌介导的拟南芥转化及转基因植株的鉴定
将上述重组农杆菌GV3101/pBI121-Dp7-DR利用蘸花法转化野生型拟南芥Col-0(Arabidopsis thaliana)。具体的：
拟南芥转化采用蘸花法进行(参考文献Steven J.Clough,Andrew F.Bent.Floraldip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.[J].The Plant Journal,1998,16(6):735-743)，将过夜培养的重组农杆菌菌液，在5000rpm下离心5min，弃去上清后，用侵染液(质量浓度0.1％MS培养基粉剂，质量浓度5％蔗糖，质量浓度0.05％MES和质量浓度0.02％Silwet L-77)重悬沉淀，调整OD600值为0.6～0.8，把将要开花的花蕾浸泡在农杆菌浸染液中10s，25～28℃暗培养24h后，转移至正常条件下培养。转化的植株开花结果后，收集T0代转Dp7-DR基因拟南芥种子。
提取野生型植株和T0代转Dp7-DR基因拟南芥叶片DNA，用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的参数同实施例1，根据琼脂糖凝胶电泳检测结果得到Dp7-DR基因长度为1305bp的阳性T0代转Dp7-DR基因拟南芥。
提取野生型植株和DNA检测为阳性的T0代转Dp7-DR基因拟南芥叶片的RNA，进行荧光定量PCR分析，荧光定量PCR扩增的参数同实施例2，分析不同单株的表达情况。Dp7-DR基因为山药中基因，将该基因在拟南芥植株中异源表达，拟南芥野生型对照植株中没有Dp7-DR基因的表达，Dp7-DR基因表达检测结果如图4所示。选取表达量最高的七株，分别编号为OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5、OE-6、OE-7，单株收取种子，为T0代转Dp7-DR基因拟南芥种子。将T0代转Dp7-DR基因拟南芥种子分别进行表面消毒后，播种在含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，将能够正常生长的拟南芥植株进行移栽，得到T1代转Dp7-DR基因拟南芥植株，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系。
二、功能检测
将T3代转Dp7-DR基因拟南芥植株叶片用甲醇超声提取薯蓣皂苷，具体提取与检测方法参照(Putao Wang,Nan Shan,Asjad Ali,Jingyu Sun,Sha Luo,Yao X iao,ShenglinWang,Rui Hu,Yingjin Huang,Qinghong Zhou.Comprehensive evaluat ion offunctional components,biological activities,and minerals of yam species(Dioscorea polystachya and D.alata)from China).[J].LWT-Food Science and Technology,2022,168:113964)。
甲醇超声提取薯蓣皂苷具体方法为：将OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5、OE-6、OE-7的T3代转Dp7-DR基因拟南芥植株叶片均匀混合，称取混合叶片0.1g，加入1mL甲醇，在温度为40℃的条件下超声提取30min，超声提取所得物在5000×g条件下离心10min后得上清液，上清液经0.22μm膜过滤，过滤所得物转移到色谱样瓶中。
采用高效液相色谱法(Agilent 2100系统)测定OE过滤所得物中的薯蓣皂苷含量。高效液相色谱法采用Agilent Extend C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈和超纯水，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。以流动相乙腈：超纯水(54:46，v/v)为分离相，在210nm波长处进行检测。通过绘制峰面积与目标化合物相对浓度的关系来构建校准曲线。高效液相色谱图见图5，图5中的薯蓣皂苷峰图已标出，其余峰均为杂峰。标准曲线见图6和表2。标准曲线为y＝3043.5x+16641，R2＝0.9997，x代表薯蓣皂苷的相对浓度，y代表峰面积。
表2薯蓣皂苷标准曲线
x薯蓣皂苷的相对浓度(mg/mL) 3.125 6.25 12.5 25 100
y峰面积 23977 38569 52785 94121 320763
以野生型拟南芥(WT)为对照，与野生型拟南芥相比，过表达Dp7-DR基因的T3代拟南芥植株叶片中薯蓣皂苷含量显著升高，结果如表3和图7所示。
表3过表达Dp7-DR基因的T3代拟南芥植株叶片的薯蓣皂苷含量(mg/g)
株系 薯蓣皂苷含量(mg/g)
WT 2.345±0.085a
OE 6.313±0.132b
注：不同字母代表差异显著，P＜0.05。
综上所述，过表达山药Dp7-DR基因能增加拟南芥中薯蓣皂苷的含量，表明7-脱氢胆固醇还原酶基因Dp7-DR在调控植物薯蓣皂苷合成过程中发挥着的关键性作用。本发明不仅可应用于特异代谢物的生物合成，还为山药优质高产栽培和分子育种提供了理论支撑，具有非常重要的经济效益和社会效益。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种与薯蓣皂苷合成相关的Dp7-DR蛋白，其特征在于，所述Dp7-DR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的Dp7-DR蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种表达Dp7-DR基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求2所述基因。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体包括植物表达载体。
5.一种表达Dp7-DR基因的重组菌，其特征在于，包含如权利要求3所述重组载体。
6.权利要求1所述的Dp7-DR蛋白或权利要求2所述基因或权利要求3或4所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌在提高植物薯蓣皂苷含量中的应用，所述植物为薯蓣科薯蓣属植物。
7.一种培育薯蓣皂苷含量升高的植物的方法，其特征在于，在植物中过表达权利要求2所述的基因，所述植物为薯蓣科薯蓣属植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述薯蓣科薯蓣属植物中过表达权利要求2所述的基因的方式包括将权利要求3所述重组载体转入农杆菌得到重组菌，将所述重组菌转染植物。
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