CN103981193A - 棉花bzr1基因鉴定及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一个棉纤维优势表达的基因GhBZR1的克隆与功能鉴定。GhBZR1基因全长1410bp，编码一个含有313氨基酸的蛋白质。该基因的mRNA在伸长发育时期的棉纤维细胞中大量积累，表明该基因为纤维优势表达基因。GhBZR1蛋白定位于细胞质和细胞核中，BL诱导后，该蛋白在细胞核中积累增加。GhBZR1能够与GhBIN2发生相互作用，并被后者磷酸化，从而促进该蛋白与14-3-3蛋白之间的相互作用。在拟南芥BR突变体bri1中过量表达GhBZR1，能够恢复其矮小的表型。利用RNAi干扰技术抑制棉花中的GhBZR1表达，转基因棉花植株胚珠及纤维发育受到明显影响，推测GhBZR1可能通过影响BR信号来调节棉纤维发育及纤维品质性状。
Description
技术领域
本发明涉及一个棉纤维优势表达的基因GhBZR1的克隆与功能鉴定。
背景技术
棉花是世界上最重要的天然纤维作物，我国是世界上最大的产棉国和棉花消费国，棉花生产在我国国民经济中占有十分重要的地位。棉纤维是棉花生产的主要产品，其产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益，因此提高棉纤维的产量和品质一直以来都是棉花育种的主要目标。然而由于棉花纤维的产量和品质之间存在负相关，严重阻碍棉花纤维产量和品质的同步改良。传统育种方法难以打破产量和品质的负相关，必须寻找新的途径以达到两者同步改良。
棉花纤维细胞是由胚珠外表皮分化而成的不分枝单细胞毛状突起，其发育由四个重叠但是可区分的发育阶段组成，分别是纤维起始、伸长、次生壁合成及脱水成熟。棉花纤维在这四个阶段中的发育情况决定了其产量和品质，纤维细胞的起始决定了最终纤维的数量，纤维细胞的伸长决定了成熟纤维的长度，次生壁合成决定了纤维的强度。因此，克隆棉花纤维发育相关基因并研究基因产物之间的关系，解析棉花纤维发育的分子机制，不仅具有重要的理论意义，而且对棉花纤维产量和品质改良具有重要的应用价值。
棉花纤维发育过程受激素水平的调控。油菜素内醋、生长素、赤霉素等激素都在纤维细胞起始和发育过程中起到至关重要的作用。研究证明，外施一定浓度的上述激素能够促进棉纤维细胞发育。虽然目前已经在棉花中分离鉴定了一些与激素信号相关的基因，但是这些基因在棉花激素信号传递途径中的功能及对棉花纤维发育影响的作用机制尚不清楚，一些关键的调控蛋白也有待克隆鉴定并阐明其功能。因此，研究棉花中激素信号的传递途径，特别是对棉花纤维发育的影响，分离鉴定相关重要调控因子，对于棉花纤维品质改良，具有重要意义。
油菜素内酯(BR)作为一种重要的植物激素，在植物的生长发育中发挥着重要的作用。BR信号在植物体内的转导是一个复杂的过程。在拟南芥中，BR信号由细胞膜受体蛋白BRI1接受(She et al.,2011；Hothorn et al.,2011)。当缺乏BR时，负调控因子BKI1结合BRI1，抑制其功能(Wang et al.,2006；Jaillais et al.,2011)；BIN2激酶磷酸化植物特异性的转录因子BES1和BZR1(Yin et al.,2005；He et al.,2005),抑制其DNA结合活性。14-3-3蛋白与磷酸化的BES1/BZR1相互作用，使其滞留在细胞质中。当有BR信号时，BR分子结合BRI1的胞外域，促进BRI1与BAK1相互作用，激活受体激酶活性，BRI1激酶促进BKI1磷酸化，同时BRI1与BKI1分离。14-3-3蛋白可以通过两个磷酸化位点的基序与磷酸化的BKI1相互作用。细胞质中BKI1与14-3-3结合，激活的BRI1和BAK1间接导致BIN2活性的抑制或BSU1的激活或者两种情况同时存在(Kim et al.,2011；Kim et al.,2009；Tang et al.,2008；Li et al.,2002)。同时，PP2A使得BES1/BZR1去磷酸化，促使BES1/BZR1在核中大量积累，BZR1结合BR合成基因的启动子,抑制BR合成基因的表达,从而降低BR的水平。非磷酸化状态的BES1也在核中积累,在核中激活BR诱导基因的表达(Tang et al.,2011)。
在BR通路中，BZR1是关键的转录因子，属于植物特异的BZR蛋白家族成员，在拟南芥中有5个同源蛋白，分别是BZR2/BES1，BZR3/BEH1，BEH2，BEH3，BEH4。水稻中克隆出4个BZR1蛋白，OsBZR1–4(Os07g39220，Os01g10610，Os06g35900和Os02g13900)，OsBZR1(Os07g39220)与拟南芥BZR1有53.39％同源性，BZR2/BES1有53.25％同源性。拟南芥BZR1和BZR2有88％的氨基酸同源性，蛋白中有25个可能的磷酸化位点，在应答BR信号时功能上有部分冗余(Wang et al.,2002；Yin et al.,2002：Li et al.，2007)。BZR1和BES1是BR通路中BR信号转导的关键转录因子，通过直接结合下游基因的启动子或与其它蛋白相互作用调控BR应答基因的表达。BES1受BR激活后，使其能结合存在于大量的BR应答基因启动子的E-Boxes(CANNTG)(Yin et al.,2005)。转录因子AtMYB30在BR信号通路中正调控BR应答基因，体内和体外实验已经证明BESI能同AtMYB30相互作用，促进下游靶基因的表达(Li et al.,2009)。BES1也能同参与核糖核酸聚合酶II(RNAPII)后招募和翻译伸长过程的IWS1蛋白发生相互作用(Li et al.,2010)。功能缺失iws1突变体下胚轴对BR不敏感，并且IWS1的缺失导致功能获得性突变体bes1-D表型受抑制，推测IWS1需要BES1调控的转录过程参与染色体修复(Li et al.,2010)。BZR1与BES1有88％的同源性(Wang et al.,2002)。BZR1能够结合BR元件(BRRE，CGTG(T/C)G),BZR1的N-端负调控参与BR生物合成基因表达，如CPD,DWF4,ROT3和BR6ox(He et al.,2005)。BES1对BR生物合成基因的表达反馈调节功能与BZR1相似(Vert andChory,2006；Yin et al.,2005)。Sun等报道了953个BR调控的BZR1靶基因，参与BR促进的细胞伸长，BR和其他激素的交叉通路，光信号通路等(Sun et al.，2010)。
转录因子BZR1和BZR2(BES1)在BR信号通路中起关键作用，影响植物的生长发育过程。在水稻中，利用RNAi干扰技术，抑制OsBZR1的表达，导致植物出现矮化，叶片直立，对BR敏感度降低等表型，而过量表达OsBZR1P206L，叶片弯曲度增加(Bai et al.,2007)。从乙烷基甲磺酸酯(EMS)诱变的突变体中分离出来的bes1-D和bzr1-1D突变体，是BES1/BZR1在231-250氨基酸有PEST基序突变得到，这个基序在调控BES1和BZR1的稳定性有重要的作用(Yin et al.,2002,2005)。bes1-D和bzr1-1D突变体能够恢复bri1和bin2-1D的表型。此外bzr1-1D对BR合成抑制剂BRZ不敏感，推测BES1和BZR1是BR信号的正调控因子(Yin et al.,2002；Wang et al.,2002)。因此，研究探讨棉纤维优势表达的BZR1转录因子在纤维品质性状形成中的调控作用，将能够使我们更好地了解棉花BZR1转录因子如何参与棉纤维内源BR激素的调控及其在棉纤维发育和品质性状形成过程中的功能，进而应用于棉纤维品质的遗传改良。
发明内容
本发明的目的在于提供一个新的棉纤维优势表达的BZR1基因(GhBZR1)，分析揭示该基因的生物学功能，探索其对纤维发育调控的分子机制，进而应用该基因改良棉纤维，创造棉花优良品种。
在最近的研究中，我们利用酵母双杂交技术，从棉花纤维中筛选得到200多个Gh14-3-3蛋白的靶蛋白。其中有一个基因编码的蛋白序列与拟南芥BZR1蛋白具有76％的同源性，因此将该基因命名为GhBZR1。通过DNA和蛋白质序列分析，利用棉花纤维细胞的转录本(总RNA)，分离获得GhBZR1全长cDNA序列，如SEQ.ID.No.1所示。该基因序列编码的蛋白质氨基酸序列如见SEQ.ID.No.2所示。GhBZR1基因含有942bp开放阅读框，编码313个氨基酸，分子量为34KDa。GhBZR1蛋白具有N-端DNA-结合区域，有22个可能的BIN2磷酸化位点(S/TXXXS/T，X为任意氨基酸，S为丝氨酸，T为苏氨酸)，PEST区域(该区域脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸富集)，和一个可能的14-3-3蛋白结合位点(第156–168位氨基酸)(RXXXpSXP，X为任意氨基酸，R为精氨酸，pS为磷酸化的丝氨酸，P为脯氨酸)，以及C端区域。而且，系统进化分析表明，GhBZR1与拟南芥BZR1(NP_565099)、BEH3(NP_193624)和BEH4(NP_565187)处于同一进化分支。利用荧光定量PCR技术对该基因在棉花不同组织和棉纤维不同发育阶段的表达谱进行了分析，结果表明GhBZR1基因在开花10天后的棉纤维中表达量最高，而在棉花其它组织中表达水平较低(图1)。进一步研究表明，GhBZR1蛋白定位于细胞核和细胞质中。当用1μM BL(一种BR激素)处理10分钟后，GhBZR1蛋白从细胞质转移到细胞核中(图2)。
利用酵母双杂交和Pull-down实验验证了GhBZR1与GhBIN2蛋白的相互作用。结果显示，GhBZR1与GhBIN2结合后形成的二倍体酵母细胞能够在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长，而且酵母裂解实验显示为蓝色，说明在酵母系统中，GhBZR1能与GhBIN2发生相互作用(图3A)。pull-down实验证明，His-GhBIN2蛋白与MBP蛋白(对照)孵育纯化后没有检测到信号。相反，His-GhBIN2蛋白与MBP-BZR1蛋白孵育后，用MBP抗体进行检测，同Input一样，能够检测到结合蛋白信号(图3B)。以上结果说明，GhBIN2蛋白与GhBZR1蛋白在体外能发生相互作用。
用GhBIN2对MBP-GhBZR1蛋白进行体外磷酸化，然后与GST-Gh14-3-3L蛋白孵育，经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后，能够被检测出GhBZR1蛋白信号。而在没有GhBIN2蛋白的条件中，不能检测出GhBZR1蛋白信号(图4A)。而且，双分子荧光互补实验表明，YNE-Gh14-3-3L与YCE-GhBZR1质粒共转化的洋葱表皮细胞中，能够在细胞质观察到YFP荧光(图4B-D)。以上实验结果表明，GhBZR1蛋白能够与Gh14-3-3L蛋白发生相互作用，而且，这种相互作用依赖于GhBIN2对GhBZR1的磷酸化。
为了研究GhBZR1在BR通路中的功能，分别构建了GhBZR1过量表达载体和GhBZR1PL过量表达载体(将GhBZR1蛋白中第216位氨基酸P突变为L)，转化拟南芥，获得转基因拟南芥植株。黑暗条件下，拟南芥bri1突变体下胚轴较野生型下胚轴短，而且，该突变体对BL不敏感，用BL和Brz处理，都没有明显的变化。在bri突变体中表达GhBZR1PL可以部分恢复该突变体表型。拟南芥bri1突变体表现为莲座叶变小，bzr1-D为叶片圆形并且卷曲，而表达GhBZR1PL的bri突变体叶片变大，与GhBZR1过量表达和GhBZRPL过量表达转基因拟南芥叶片相似，也与野生型叶片相似(图5)。
将GhBZR1RNAi载体转化棉花，获得转基因棉花植株。提取GhBZR1RNAi转基因棉花开花10天后的纤维RNA，反转录成cDNA，检测在转基因棉花中GhBZR1基因表达水平。结果表明，转基因棉花纤维中GhBZR1表达水平都有不同程度的下调，其中L1中GhBZR1表达水平较低(图6A)。观察其植株的生长情况，发现转基因植株比野生型矮小一些(图6B-D)。对开花当天胚珠进行徒手切片，发现胚珠表面的纤维细胞突起明显减少，细胞伸长迟缓(图6E-F)。这说明抑制GhBZR1基因表达严重影响棉花纤维细胞起始分化和伸长发育。因此，推测该基因可能通过参与棉纤维的BR信号通路而调控棉纤维细胞起始和伸长发育过程，影响棉纤维产量和品质。
本发明的优点：
1.提供了一个新的棉纤维优势表达的GhBZR1基因序列(cDNA序列)。该基因在棉纤维中高水平表达，表明该基因可能在控制棉纤维起始和伸长发育过程中起重要作用。
2.GhBZR1蛋白定位于细胞质和细胞核中。但BL诱导后，该蛋白转移和定位于细胞核中。GhBZR1能够被GhBIN2磷酸化，而磷酸化能够促进该蛋白与Gh14-3-3蛋白相互作用。
3.将GhBZR1蛋白第216位氨基酸P突变为L后，在拟南芥中过量表达，发现可以部分恢复拟南芥bri突变体表型，这表明GhBZR1参与BR信号通路。在棉花中抑制GhBZR1基因表达，与野生型相比，转基因棉花植株纤维细胞突起明显减少，纤维伸长迟缓，这表明GhBZR1基因可能通过参与棉纤维的BR信号通路而调控棉纤维细胞起始和伸长发育过程，影响棉纤维产量和品质。
附图说明
图1.荧光定量RT-PCR分析GhBZR1在棉花组织中的表达，图中：R：根；H：下胚轴；C：子叶；L：叶片；P：花瓣；A：花药；O：开花当天胚珠。3d：开花后3天纤维；6d：开花后6天纤维；9d：开花后9天纤维；10d：开花后10天纤维；12d：开花后12天纤维；15d：开花后15天纤维；18d：开花后18天纤维；20d：开花后20天纤维。
图2.GhBZR1蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位，图中(A–C)在烟草表皮细胞中检测GhBZR1蛋白亚细胞定位。A，烟草表皮细胞中GhBZR1-GFP信号；B，显微镜明视野下的烟草表皮细胞；C，图片A与图片B的重合照片；(D–F)1μM BL处理10分钟后，在烟草表皮细胞中检测GhBZR1蛋白亚细胞定位。D，烟草表皮细胞中GhBZR1-GFP信号；E，显微镜明视野下的烟草表皮细胞；F，图片D与图片E的重合照片。
图3.GhBZR1同GhBIN2蛋白的相互作用验证，图中：A，利用酵母双杂交系统验证GhBZR1与GhBIN2蛋白相互作用。pGADT7-GhBZR1转化酵母AH109与pGBKT7-GhBIN2转化酵母Y187接合生殖的子代二倍体在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长情况(左图)及LacZ报告基因的表达(右图)。B，利用pull-down实验分析验证GhBIN2与GhBZR1的相互作用。
图4.GhBIN2磷酸化GhBZR1促进其与Gh14-3-3s相互作用，图中：A，Gh14-3-3L与被GhBIN2磷酸化的GhBZR1相互作用。His-GhBIN2蛋白磷酸化MBP-BZR1蛋白及未磷酸化的MBP-BZR1蛋白与Gh14-3-3L进行pull-down分析。上图为GhBZR1抗体检测出的条带，p-GhBZR1表示的是磷酸化后的蛋白。下图为加入了GST-Gh14-3-3L蛋白。(B–D)双分子荧光互补(BiFC)实验分析蛋白相互作用。B，将构建YNE-Gh14-3-3L和YCE-GhBZR1载体质粒共同包埋于金粉中后，利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下检测荧光信号，证明Gh14-3-3L与GhBZR1蛋白能够在细胞内发生相互作用。C，显微镜明视野中的同一细胞；D，B和C照片的重叠。
图5.GhBZR1过量表达拟南芥植株表型分析，图中：A，野生型(左1)、BR相关突变体(左2)和GhBZR1过量表达拟南芥(左3–8)叶片；B，生长3周的野生型(左1)、BR相关突变体(左2)和GhBZR1过量表达拟南芥(左3–8)植株。C，WT，生长9周的野生型；bri1，bri1突变体；bri1/BPLO,GhBZR1PL过量表达拟南芥bri1；bzr1-1D，bzr1-1D突变体；BO1和BO2，两个GhBZR1过量表达转基因拟南芥株系；BPL2和BPL4，GhBZR1PL过量表达拟南芥两个株系。
图6.GhBZR1RNAi转基因棉花表型分析，图中：A，荧光定量RT-PCR分析GhBZR1基因在野生型和转基因棉花纤维中的表达(株系L1，L2和L3)；B，野生型(WT)和GhBZR1RNAi转基因棉花(株系L1)的植株生长发育；C，野生型(WT)和GhBZR1RNAi转基因棉花(L1)花器官比较；D，野生型(WT)和GhBZR1RNAi转基因棉花(L1)开花当天子房形态比较；E，开花当天的野生型胚珠横切片，显示开花当天的纤维细胞突起；F，开花当天的转基因棉花(L1)胚珠横切片，显示开花当天的纤维细胞突起。
具体实施方式
本发明通过以下附图和实施作进一步阐述，但不限制本发明的范围。
一个棉花BZR家族新基因GhBZR1全长序列的克隆鉴定和功能分析：
1.GhBZR1基因(cDNA)序列的分离鉴定
利用酵母双杂交技术，从棉花纤维中筛选得到200多个Gh14-3-3蛋白的靶蛋白，其中包括GhBZR1。通过DNA和蛋白质序列分析，利用棉花纤维细胞的转录本(总RNA)，分离获得GhBZR1全长cDNA序列，如SEQ.ID.No.1所示，该基因序列编码的蛋白质氨基酸序列如见SEQ.ID.No.2所示。
2.定量RT-PCR分析GhBZR1基因的表达
(1)棉花组织的总RNA提取(按Li XB,Cai L,Cheng NH,Liu JW,2002.Molecularcharacterization of the cotton GhTUB1gene that preferentially expressed in fiber.Plant Physiol.130:666-674进行)。
(2)实时荧光定量RT-PCR研究基因的表达(按照Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,Yang WC,2005.The Cotton ACTIN1gene is functionally expressed in fibers and participates in fiberelongation.Plant Cell17:859–875进行)。首先，将棉花不同组织(根、下胚轴、子叶、叶子、花瓣、花药、开花后0和10天胚珠、开花后3天纤维、6天纤维、9天纤维、12天纤维、15天纤维、18天纤维、20天纤维等)的总RNA(2μg/样)用M-MLV RNase H-Reverse Transcriptase(Promega)反转录成cDNA；然后，以cDNA为模板，用基因特异的引物(GhBZR1P1:5’-TGTGAAAGCGTGTTACAACAG-3’,P2:5’-ATCATTCTCTGCGGTTTTACC-3’；GhUBI1P1:5’-CTGAATCTTCGCTTTCACGTTATC-3’,P2:5’-GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC-3’)和Real-time PCR Master Mix(TOYOBO,Japan)进行定量PCR反应。棉花GhUBI1基因作为RT-PCR反应的内标，目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green荧光检测。每个基因的表达水平相对值按公式Y＝10△Ct/3.57×100％计算(其中△Ct＝CtGhUBI1–CtGhBZR1，3.57是利用GhUBI1制备的标准曲线y＝–0.28x+9.87中斜率的倒数，表示基因表达相差10倍的PCR循环数)。重复3次，统计分析实验结果，见图1，由图1可看出：GhBZR1基因在开花10天后的棉纤维中表达量最高，而在棉花其它组织中表达水平较低(图1)。
3.GhBZR1蛋白的细胞亚定位分析
构建pBI-GhBZR1:eGFP植物表达载体，将该载体通过电转化法转入LBA4404农杆菌中，再通过注射法转化烟草表皮细胞。将转化的烟草叶片培养48小时后，置于共聚焦显微镜下观察叶表皮细胞的GFP荧光，然后用1μM BL(一种BR激素)处理后，同样置于共聚焦显微镜下观察叶表皮细胞的GFP荧光，结果见图2。结果表明：荧光信号主要分布在烟草表皮细胞的细胞核和细胞质中。当用1μM BL处理后，GFP信号主要集中在细胞核中。
4.酵母双杂交和pull-down技术验证GhBZR1与GhBIN2蛋白相互作用
(1)酵母双杂交:构建pGBKT7-GhBIN2载体和pGADT7-GhBZR1载体，分别转化酵母细胞Y187和AH109细胞。将检测得到的阳性酵母菌落进行小规模的酵母结合实验，将二倍体子代酵母细胞涂布在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp选择培养基上。如果在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上能够生长，表明GhBZR1与GhBIN2之间能够相互作用。否则，表明两者不能相互作用。同时，将酵母子代二倍体进行显色反应来检测LacZ报告基因表达来验证GhBZR1与GhBIN2蛋白之间的相互作用。具体的操作步骤如下：在培养皿中用5mL Z buffer/X-gal溶液浸湿透一张无菌滤纸，挑取新鲜培养的酵母单菌落至另一张无菌滤纸上，于液氮中冷冻15秒后，置于室温融化。小心将带酵母的滤纸放到浸湿的滤纸上，置于30℃培养箱中，8小时内菌落出现蓝色的为阳性，说明GhBZR1与GhBIN2蛋白之间具有相互作用。而不显蓝色的为阴性，说明二者之间不能相互作用。结果见图3A。
(2)pull-down:构建pET32a-GhBIN2和pMAL-GhBZR1载体，分别转化BL21感受态细胞，进行诱导表达蛋白。将表达出的His-GhBIN2蛋白和MBP蛋白与麦芽糖柱子一起冰上振荡孵育1h；同样，His-GhBIN2蛋白和MBP-GhBZR1蛋白也与麦芽糖柱子在相同条件下孵育。孵育完成后，用MBP蛋白纯化方法进行纯化，随后取上清20μL进行SDS-PAGE电泳分析，His-BIN2蛋白作为对照(Input)，完成后进行Western-blotting分析，将His抗体作为一抗，鼠抗作为二抗。结果见图3B。如果出现与对照(Input)一样大小的条带(蛋白信号)，说明GhBIN2与GhBZR1蛋白在体外能发生相互作用。否则，则说明两者不能相互作用。
结果显示，GhBZR1与GhBIN2结合后形成的二倍体酵母细胞能够在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长，而且酵母裂解实验显示为蓝色，说明在酵母系统中，GhBZR1能与GhBIN2发生相互作用(图3A)。pull-down实验证明，His-GhBIN2蛋白与MBP蛋白(对照)孵育纯化后没有检测到信号。相反，His-GhBIN2蛋白与MBP-BZR1蛋白孵育后，用MBP抗体进行检测，同Input一样，能够检测到结合蛋白信号(图3B)。以上结果说明，GhBIN2蛋白与GhBZR1蛋白在体外能发生相互作用。
5.GhBIN2磷酸化GhBZR1及其与Gh14-3-3蛋白相互作用分析
GhBZR1磷酸化分析：将His-GhBIN2蛋白纯化后，分别与MBP和MBP-GhBZR1在加入ATP的缓冲液中共同孵育2h(30℃)，用麦芽糖柱子纯化出GhBZR1蛋白。然后将纯化后的GhBZR1与GST-Gh14-3-3L蛋白冰上振荡孵育1h后，用GST柱子纯化，加入蛋白上样缓冲液后，进行SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析。用GhBZR1抗体作为一抗，兔抗作为二抗，对样品进行检测。如果与His-GhBIN2蛋白孵育进行体外磷酸化的MBP-GhBZR1，与GST-Gh14-3-3L孵育后经过谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化，能被GhBZR1抗体检测出信号，说明磷酸化的GhBZR1能与Gh14-3-3发生相互作用。而在没有His-GhBIN2蛋白加入的孵育条件中，MBP-GhBZR1或者MBP蛋白，与GST-Gh14-3-3L孵育后经过谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化，则用GhBZR1抗体不能检测出信号，说明其不能与Gh14-3-3发生相互作用。
双分子荧光互补(BiFC)分析：构建YNE-Gh14-3-3L与YCE-GhBZR1载体，通过BiFC实验，YNE-Gh14-3-3L与YCE-GhBZR1质粒共同包埋于金粉中后，利用基因枪轰击洋葱表皮细胞。将洋葱表皮培养48小时后，在共聚焦显微镜下检测洋葱表皮细胞的荧光信号。如果有荧光信号出现，说明Gh14-3-3L蛋白能够与GhBZR1蛋白在细胞内发生相互作用。
结果表明：用GhBIN2对MBP-GhBZR1蛋白进行体外磷酸化，然后与GST-Gh14-3-3L蛋白孵育，经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后，能够被检测出GhBZR1蛋白信号。而在没有GhBIN2蛋白的条件中，不能检测出GhBZR1蛋白信号(图4A)。而且，双分子荧光互补实验表明，YNE-Gh14-3-3L与YCE-GhBZR1质粒共转化的洋葱表皮细胞中，能够在细胞质观察到YFP荧光(图4B-D)。以上实验结果表明，GhBZR1蛋白能够与Gh14-3-3L蛋白发生相互作用，而且，这种相互作用依赖于GhBIN2对GhBZR1的磷酸化。
6.GhBZR1过量表达的转基因拟南芥表型分析
构建35S启动子驱动的pBI-GhBZR1和pBI-GhBZR1PL过量表达载体(GhBZR1PL是将GhBZR1蛋白中第216位氨基酸P突变为L)，分别转化拟南芥，获得转基因植株。提取拟南芥植株的基因组DNA，用PCR技术检测鉴定阳性的转基因植株。在mRNA水平上检测GhBZR1和GhBZR1PL在过量表达拟南芥植株中的表达水平，具体方法为分别提取了GhBZR1和GhBZR1PL过量表达的转基因拟南芥RNA，逆转录为cDNA，以拟南芥的Actin2为内参，进行定量表达分析。然后，分析拟南芥转基因株系的表型。结果表明：黑暗条件下，拟南芥bri1突变体下胚轴较野生型下胚轴短，而且，该突变体对油菜素内酯(BL)不敏感，用BL和Brz(一种BL的抑制剂)处理，都没有明显的变化。在bril突变体中表达GhBZR1PL可以部分恢复该突变体表型。拟南芥bri1突变体表现为莲座叶变小，bzr1-D为叶片圆形并且卷曲，而表达GhBZR1PL的bril突变体叶片变大，与野生型叶片相似(图5)。
7.GhBZR1RNA干扰(RNAi)转基因棉花表型分析
构建35S启动子驱动的pBI-GhBZR1RNAi载体，转化农杆菌LBA4404。利用农杆菌浸染棉花下胚轴外植体，共培养2天后，将下胚轴转移到选择培养基上培养，诱导并筛选到转化愈伤组织。将该愈伤组织经过8–10个月的继代培养后，诱导分化出胚性愈伤组织和体细胞胚，体细胞胚进而萌发再生为转基因棉花幼苗。将棉花幼苗移栽至土中，生长发育至开花结实。提取棉花基因组DNA，利用PCR技术检测鉴定转基因棉花植株。提取开花10天后的棉花纤维细胞RNA，利用定量RT-PCR技术分析转基因棉花中GhBZR1基因表达水平。然后，对转基因棉花株系进行表型分析。
结果表明，转基因棉花纤维中GhBZR1表达水平都有不同程度的下调，其中转基因株系L1中GhBZR1表达水平较低(图6A)。观察其植株的生长情况，发现转基因植株比野生型矮小一些(图6B-D)。对开花当天胚珠进行徒手切片，发现胚珠表面的纤维细胞突起明显减少，细胞伸长迟缓(图6E-F)。这说明利用RNAi技术抑制GhBZR1表达，转基因棉花植株生长较为迟缓，而且，胚珠发育受阻，即抑制GhBZR1基因表达严重影响棉花纤维细胞起始分化和伸长发育。因此，推测该基因可能通过参与棉纤维的BR信号通路而调控棉纤维细胞起始和伸长发育过程，影响棉纤维产量和品质。
Claims (2)
1.棉花GhBZR1基因的cDNA序列如下：
基因编码区为第1位至第942位碱基。
2.权利要求1所述的棉花GhBZR1基因编码的蛋白质序列如下：
GhBZR1基因编码313个氨基酸。
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