CN111206037B - 甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的鉴定及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6序列的鉴定及应用，涉及一个既能提高油菜产量又能提高油菜种子含油量的叶绿体脂肪酸转运蛋白基因。BnFAX6基因包含3个外显子和2个内含子，编码一个含有119个氨基酸的蛋白质。BnFAX6基因在油菜油脂合成关键时期的种子中优势表达。与野生型相比，过量表达BnFAX6转基因油菜种子含油量显著提高，这表明BnFAX6在油菜种子油脂合成过程中起重要作用。35S启动子驱动的BnFAX6过量表达转基因油菜与野生型相比还表现出植株高度变矮，侧枝增多，产量大幅度提高的表型。综上所述，本发明提供了一个在油菜高产高含油量育种中具有重要应用价值的功能基因。

Description

甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的鉴定及应用
技术领域：
本发明涉及一个既能提高油菜产量又能提高种子含油量的脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的克隆与功能鉴定。
背景技术：
油菜是我国四大油料作物之一。菜籽油不仅是食用油的主要来源，还是解决全球能源短缺的重要原料作物。随着世界人口的递增，人们对食用油和生物柴油的需求量日益剧增。菜籽油是我国食用植物油的第一大来源，虽然我国油菜种植面积和总产量均占世界的30％左右，但由于人口众多，每年的油菜籽进口量依然巨大。因此，提高油菜产量和种子含油量一直是油菜产业发展的研究方向和育种目标。
植物的分枝数是影响其植株结构和产量的重要因子。植物在生长过程中，其顶芽往往优先生长，而侧芽常受到抑制，我们称之为“顶端优势”。目前关于顶端优势现象产生的原因，还没有肯定意见，其主要包括“生长素抑制学说”，“营养学说”和“营养调运”三大观点。生长素抑制学说指出，植物顶端优势是由于顶芽合成的生长素向下运输过程中抑制了侧芽的产生，随后进一步发现其可能是通过影响侧芽中细胞分裂素的浓度而造成的。营养学说认为，由于顶芽细胞生长迅速，代谢旺盛，因而优先享用由根部和叶片运来的营养物质，使侧芽得不到充足的养分，从而生长受到抑制。营养调运学说则认为顶端分生组织的细胞生长活跃，代谢旺盛，合成大量激素，促使营养物质向顶芽调运，使侧芽得不到足够的营养物质而受到抑制。总之，植物地上株型是个复制的生物学现象，受多种因素调控，而营养物质通过改变资源分配，深刻地影响着地上株型。当植物光照充足，碳源大量积累，往往会产生更多侧枝而使产量提高。脂质作为重要的能源物质和膜组成成分以及信号分子，与植物地上株型有着密切关联。
提高油菜种子中油脂含量往往比提高其产量更有价值。油菜种子中油脂合成是一个复杂的生物学过程，涉及多个细胞器的酶促反应。糖酵解和丙酮酸代谢产物乙酰辅酶A在质体中合成脂肪酸，合成的脂肪酸需要转运出叶绿体，在细胞质中形成脂酰辅酶A，然后运输到内质网中，与甘油骨架一起合成三酰甘油，然后与油体蛋白共同组成油体。目前，在提高种子含油量的研究中，主要采取“推”和“拉”的手段。所谓的“推”是指增强碳源向脂肪酸的流动，从而提高含油量；而“拉”则是通过增加三酰甘油的组装速度，使得含油量增加。但是，处于叶绿体膜上控制脂肪酸流动的“阀门”却鲜有报道。
植物中FAX蛋白属于Tmemb_14蛋白亚家族，具有典型的跨膜结构域。在哺乳动物中，与FAX同源的蛋白定位于线粒体膜上，其生物学功能未知。虽然在拟南芥中已有报道FAX1增加叶绿体中合成的脂肪酸向外运输的速率，从而增加种子中油脂的积累，但是该类蛋白在油菜种子中的功能，以及其对油菜株型的影响尚不清楚。
发明内容：
本发明的目的在于提供一个新的油脂合成相关的脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6，对该基因进行克隆鉴定和功能分析，进而应用该基因提高油菜产量和含油量，创造油菜优良品种。
为获得油脂合成相关的脂肪酸转运蛋白基因，我们利用已报道的拟南芥脂肪酸转运基因AtFAX1(AT3G57280.1)和AtFAX6(AT3G20510.1)，通过生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组数据库中鉴定了12个脂肪酸转运相关的基因。对这12个脂肪酸转运蛋白基因的表达谱进行分析，发现BnFAX6基因在种子中优势表达。随后，我们克隆了该基因全长DNA序列，如SEQ ID No.1所示，全长3297bp，包含5’-上游启动子区(1–2000bp)、3个外显子(2001–2199bp，2839–2926bp，3047–3119bp)、2个内含子(2200-2838bp,2927-3046bp)和3’-UTR区(3120–3297bp)。
其编码区含有360个碱基，编码119个氨基酸，如SEQ ID No.2所示，分子量为12.54kD。BnFAX6蛋白含有四个跨膜结构域，一个脂肪酸结合位点。荧光定量RT-PCR分析结果显示，BnFAX6在油菜不同组织中都有表达，在油脂合成关键时期的种子中优势表达(图1)。对两个亲缘关系很近但含油量不同的甘蓝型油菜品种的种子不同发育时期BnFAX6表达进行了比较分析，发现该基因在高含油量品种中的表达量显著高于低含油量品种(图1)，推测BnFAX6可能在油菜种子油脂合成过程中发挥重要功能。
为探究BnFAX6在油菜发育过程中的生物学功能，我们构建了35S启动子驱动的BnFAX6过量表达载体，转化甘蓝型油菜Westar品种，获得转基因油菜植株。对BnFAX6过量表达转基因油菜在DNA水平和转录水平进行了鉴定，得到多个稳定遗传的转基因油菜株系(图2)。BnFAX6过量表达转基因油菜植株高度较野生型显著降低，分蘖数显著增加，种子总产量显著上升(图2)。而且，BnFAX6过量表达转基因油菜种子含油量较野生型显著提高。上述结果表明，BnFAX6基因一方面影响油菜株型而提高产量，另一方面影响油菜种子油脂合成而提高含油量。
对除去顶端优势后的油菜侧芽中BnFAX6及侧芽生长关键负调控因子BnBRC1的表达进行分析，结果表明，与处于休眠状态的侧芽相比，除去顶端优势解除休眠后的侧芽中，BnFAX6的表达量逐渐升高，而BnBRC1的表达量逐渐下降(图3)。而且，与野生型相比，BnFAX6过量表达转基因油菜侧芽中BnBRC1表达水平也显著下调(图3)。这说明BnFAX6参与油菜侧芽起始和生长过程的调控。
我们分析了35S启动子驱动的BnFAX6过量表达转基因油菜侧芽中糖酵解、脂肪酸合成和三酰甘油组装三个过程中的关键酶基因的表达情况，结果表明，与野生型相比，蔗糖运输和分解相关基因BnSUC1、BnSUS1和BnSUS3，糖酵解相关基因BnHXK1、BnPGK和BnFPA以及脂肪酸合成相关基因BnACCA2、BnMCAT和BnKAS在BnFAX6过量表达转基因油菜开花后25天的种子中表达量均明显上调，而BnGPAT、BnDGAT和BnFAE等三酰甘油组装和脂肪酸修饰相关基因的表达量没有明显变化(图4)。上述实验结果表明，过量表达BnFAX6上调侧芽中蔗糖运输和分解相关基因以及脂肪酸合成相关基因的表达，而不影响后续脂肪酸修饰和三酰甘油组装相关酶基因的表达，从而提高油脂的积累，促进侧芽生长发育。
为进一步鉴定BnFAX6油菜种子油脂合成过程中的功能，我们构建了油菜种子特异性表达的BnNapinA启动子驱动的BnFAX6过量表达载体，转化甘蓝型油菜Westar品种，获得BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜植株。在DNA水平和转录水平对转基因植株进行了鉴定，得到多个稳定遗传的转基因油菜株系(图5)。对BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜成熟种子含油量进行分析发现，BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜种子含油量较野生型显著提高(图5)。而且，与野生型相比，转基因油菜种子油脂中豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)和油酸(18:1)等低饱和度脂肪酸所占比例提高，而棕榈油酸(16:1)和(18:3)等所占比例下降(图5)。
分析了BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜开花后25天的种子中糖酵解、脂肪酸合成和三酰甘油组装三个过程中的相关基因表达情况。结果表明，与野生型相比，蔗糖运输和分解相关基因BnSUC1、BnSUS1和BnSUS3，糖酵解相关基BnHXK1、BnPGK和BnFPA以及脂肪酸合成相关基因BnACCA2、BnMCAT和BnKAS在过量表达转基因油菜25DAP种子中的表达量均明显上调，而BnGPAT、BnDGAT和BnFAE等三酰甘油组装和脂肪酸修饰相关基因的表达量没有明显变化(图6)。上述实验结果表明，过量表达BnFAX6上调种子中蔗糖运输和分解相关基因以及脂肪酸合成相关基因的表达来提高种子油脂的积累。
综上所述，BnFAX6在油菜侧芽和种子中通过促进碳向脂肪酸的流动，进而促进侧芽生长发育而提高油菜产量，增加种子油脂积累而提高种子含油量。
本发明的优点：
1.提供了一个新的影响油菜株型和种子发育相关的BnFAX6基因全长DNA序列。该基因在油菜腋芽和开花后25天的种子中高水平表达，表明该基因可能在油菜侧芽生长发育和种子油脂合成积累过程中发挥重要作用。
2.油菜去顶后，侧芽中BnFAX6基因的转录水平显著上调，说明其参与到侧芽起始过程。与野生型相比，35S:BnFAX6过量表达转基因油菜侧芽中，调控侧芽起始的关键负调控因子表达水平显著上调，而蔗糖运输和分解代谢、糖酵解以及脂合成代谢相关基因表达显著上调。与野生型相比，35S:BnFAX6过量表达转基因油菜株型发生明显变化：株高变矮，侧枝增多，单株产量显著提高，种子含油量也提高。这说明增强BnFAX6基因表达能够促进碳向脂代谢流动，从而促进侧芽生长发育。
3.与野生型相比，BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜种子中含油量显著提高，种子油脂中14:0、16:0、18:0和18:1等低饱和度脂肪酸含量提高，而16:1和18:3等脂肪酸含量比例下降。与野生型相比，糖分解代谢和脂合成代谢相关基因表达水平在BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因植株开花后25天的油菜种子中也显著上调，这进一步证明增强BnFAX6基因表达能够促进碳向脂代谢流动，从而促进种子中油脂合成并影响其脂肪酸组成。
本发明通过以下附图和实施作进一步阐述，但不限制本发明的范围。
附图说明：
图1.荧光定量RT-PCR分析BnFAX6在油菜组织和种子发育过程中的表达，其中：A图：荧光定量RT-PCR分析BnFAX6在油菜各组织中的表达。Sepal：萼片；C：子叶；H：下胚轴；Seed：种子；Root：根；A：花药；S：柱头；SL：茎生叶；PW:荚果皮；Stem：茎；BL：基生叶；P：花瓣；AB：腋芽。
B图：荧光定量RT-PCR分析BnFAX6在油菜种子发育过程中的表达。LFA：低油品种；HFA：高油品种；15DAP–45DPA：开花后15–45天的油菜种子。
图2.35S:BnFAX6转基因油菜表型分析，其中：
A图：荧光定量RT-PCR分析BnFAX6基因在野生型(WT)和35S:BnFAX6转基因油菜株系(L1–L21)发育生长30天后的叶片中的表达，相对值为目标基因在转基因株系与野生型中表达量的比值。
B图：野生型和35S:BnFAX6过量表达转基因油菜株系(L1、L2、L6)生长发育6个月后的株型。
C图：野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和35S:BnFAX6过量表达转基因油菜株系(L1、L2、L6)植株成熟后的单株株高(n＝12)、单株总分蘖数(n＝12)、单株有效分蘖数(n＝12)、单株总荚果数(n＝12)、荚果粒数(n＝20)、种子千粒重(n＝12)和种子含油量(n＝12)等农艺性状统计分析。*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
图3.荧光定量RT-PCR分析BnFAX6以及与之相关的BnBRC1基因在油菜侧芽生长过程中的表达，其中：A图：荧光定量RT-PCR分析BnFAX6和BnBRC1在生长发育2个月后的野生型油菜去顶前(CK)和去顶后6、12和24小时后的腋芽中的表达。字母a、b、c用来表示单因素方差分析(q检验，n＝6，P<0.05)结果，字母不同表示存在显著性差异；ck表示去顶前的腋芽；6h,12h,24h表示去顶6、12和24小时后的腋芽。
B图：荧光定量RT-PCR分析BnFAX6和BnBRC1在生长发育2个月后的野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和35S:BnFAX6过量表达转基因油菜株系(L1、L2、L6)侧芽中的表达。相对值为目标基因在转基因油菜株系与野生型中表达量的比值。n＝3，误差线代表标准误差，*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
图4.35S:BnFAX6转基因油菜侧芽中糖代谢和脂代谢相关基因表达分析，其中：
A图：荧光定量RT-PCR分析蔗糖运输和分解相关基因BnSUC1、BnSUS1和BnSUS3在生长发育2个月的野生型油菜(WT)、无效转基因株系(CK)和35S:BnFAX6转基因油菜株系(L1、L2、L6)侧芽中的表达。
B图：荧光定量RT-PCR分析糖酵解相关基因BnHKX1、BnPGK和BnFPA在生长发育2个月的野生型油菜(WT)、无效转基因株系(CK)和35S:BnFAX6转基因油菜株系(L1、L2、L6)侧芽中的表达。
C图：荧光定量RT-PCR分析脂肪酸合成相关基因BnACCA2、BnMCAT和BnKAS在生长发育2个月的野生型油菜(WT)、无效转基因株系(CK)和35S:BnFAX6转基因油菜株系(L1、L2、L6)侧芽中的表达。D，三酰甘油组装和脂肪酸延伸相关BnGPAT、BnDGAT和BnFAE基因在生长发育2个月的野生型油菜(WT)、无效转基因株系(CK)和35S:BnFAX6转基因油菜株系(L1、L2、L6)侧芽中的表达。
相对值为目标基因在转基因油菜株系与野生型中表达量的比值。n＝3，误差线代表标准误差，*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
图5.BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜种子含油量和脂肪酸组分分析，其中：
A图：荧光定量RT-PCR分析BnFAX6基因在野生型(WT)和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜株系(L1–L13)开花后25天的种子中的表达。相对值为目标基因在转基因油菜株系与野生型中表达量的比值(n＝3)。
B图：野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜株系(L2、L3和L8)成熟种子含油量分析(n＝12)。
C图：野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜株系(L2、L3和L8)成熟种子脂肪酸组分分析(n＝3)。
误差线代表标准误差，*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
图6.BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜侧芽中糖代谢和脂代谢相关基因表达分析，其中：A图：荧光定量RT-PCR分析蔗糖运输和分解相关基因BnSUC1、BnSUS1和BnSUS3在野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜株系(L2、L3和L8)开花后25天的种子中的表达。
B图：荧光定量RT-PCR分析糖酵解相关基因BnHKX1、BnPGK和BnFPA在野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜株系(L2、L3和L8)开花后25天的种子中的表达。
C图：荧光定量RT-PCR分析脂肪酸合成相关基因BnACCA2、BnMCAT和BnKAS在野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜株系(L2、L3和L8)开花后25天的种子中的表达。
D图：荧光定量RT-PCR分析三酰甘油组装和脂肪酸延伸相关BnGPAT，BnDGAT，BnFAE基因在野生型(WT)、无效转基因株系(CK)和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜株系(L2、L3和L8)开花后25天的种子中的表达。
相对值为目标基因在转基因油菜株系与野生型中表达量的比值。n＝3，误差线代表标准误差，*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
具体实施方式：
一个甘蓝型油菜脂肪酸转运基因BnFAX6全长序列的克隆鉴定和功能分析：
1.BnFAX6基因的分离鉴定
我们在甘蓝型油菜基因组数据库中利用已报道的拟南芥脂肪酸转运基因AtFAX1(AT3G57280.1)和AtFAX6(AT3G20510.1)通过生物信息学分析筛查(Blast)获得12个脂肪酸转运相关基因。对这些基因的表达谱进行分析，发现编号为BnaCnng46150D的基因(命名为BnFAX6)在油菜种子中优势表达。按照甘蓝型油菜基因组数据库中所提供的信息，设计引物(BnFAX6Up:ATGCATGATTTCTGCTTCACAATAC、BnFAX6Down：TCATTCAGCTTTTGATGGG)，以油菜叶片总DNA为模板，采用PCR技术扩增获得该基因的DNA全长序列以及编码区序列，DNA全长序列如SEQ ID No.1所示。
2.定量RT-PCR分析BnFAX6基因的表达
利用RNA提取试剂盒(Qiagin)提取纯化油菜不同组织(萼片、子叶、下胚轴、种子、根、花药、柱头、茎生叶、荚果皮、茎、基生叶、花瓣、去顶前腋芽、以及去顶后6、12和24小时的腋芽)总RNA，在逆转录酶(M-MLV RNase H-Reverse Transcriptase,Promega)的催化作用下反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用基因特异的引物(BnFAX6 RTP1:ACAAGATCGCTACTGGTGGT和BnFAX6 RTP2：CATGAAGACACACACAAGACCA)和Real-time PCRMaster Mix(TOYOBO,Japan)进行定量PCR反应。实时荧光定量RT-PCR研究基因的表达按照文献Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,Yang WC,2005.The Cotton ACTIN1 gene isfunctionally expressed in fibers and participates in fiber elongation.PlantCell 17:859–875中所提供的方法进行。油菜BnACTIN2基因(基因序列号:BnaC05g14140D)作为RT-PCR反应的内标，目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green荧光检测，计算目标基因的表达水平相对值。所有实验均重复3次，统计分析实验结果。
荧光定量RT-PCR分析结果显示，BnFAX6在油菜不同组织中都有表达，在油脂合成关键时期的种子和腋芽中优势表达(图1)，并且在去除顶芽后BnFAX6在腋芽中的表达水平逐渐上升(图3)。对两个亲缘关系很近但含油量不同的甘蓝型油菜品种的种子不同发育时期BnFAX6表达进行了比较分析，发现该基因在高含油量品种中的表达量显著高于低含油量品种(图1)，推测BnFAX6可能在油菜种子油脂合成过程中发挥重要功能。
3.35S:BnFAX6过量表达转基因油菜表型分析
提取开花25天后的油菜种子总RNA，反转录合成cDNA。按照BnFAX6编码区序列设计引物，为合成的cDNA模板，采用PCR技术扩增获得该基因的编码区(ORF)全长序列，构建到含有35S启动子的PMD表达载体上，得到过量表达载体PMD-BnFAX6，转化农杆菌GV3101。利用农杆菌浸染油菜下胚轴外植体，共培养2-3天后，将下胚轴转移到选择培养基上培养，诱导并筛选到转化愈伤组织。将该愈伤组织移到分化培养基上诱导出苗，然后将幼苗移到生根培养基生根，得到完整的转基因油菜幼苗。将油菜幼苗移栽至土中，生长发育至开花结实。提取油菜基因组DNA，利用PCR技术检测鉴定转基因油菜植株。提取各转基因油菜开花后25天的种子RNA，利用RT-PCR技术分析目标基因表达情况。
(1)实时荧光定量RT-PCR研究基因的表达:按照Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,Yang WC,2005.The Cotton ACTIN1 gene is functionally expressed in fibers andparticipates in fiber elongation.Plant Cell 17:859–875进行。提取生长30天的叶片RNA，逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，用基因特异的引物(BnFAX6 RTP1和BnFAX6 RTP2)和Real-time PCR Master Mix(TOYOBO,Japan)进行定量PCR反应。以BnACTIN2做为内参，分析BnFAX6在野生型(WT)及转基因油菜植株株系中的表达情况。所有实验均重复3次，统计分析实验结果。
(2)株型及农艺性状统计分析:野生型油菜(WT)和三个株系的35S:BnFAX6过量表达转基因油菜(L1、L2和L6)生长6个月后，观察记录植株表型。成熟的油菜用来统计各农艺性状，包括单株株高、单株总分蘖数、单株有效分蘖数和单株总荚果数等，所有实验数据都为12株油菜植株的平均值和标准差。此外，荚果粒数为12株油菜(每株油菜取主花序五个荚果)的平均值，种子千粒重和种子含油量为12株油菜(每株油菜用主花序种子进行测定)的平均值，种子含油量用索氏抽提法进行测定。误差线代表标准误差，*表示转基因株系与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因株系与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
上述结果表明：对BnFAX6过量表达转基因油菜在DNA水平和转录水平进行了鉴定，得到多个稳定遗传的转基因油菜株系(图2)。BnFAX6过量表达转基因油菜植株高度较野生型显著降低，分蘖数显著增加，种子总产量显著上升(图2)。而且，BnFAX6过量表达转基因油菜种子含油量较野生型显著提高。上述结果表明，BnFAX6基因一方面影响油菜株型而提高产量，另一方面影响油菜种子油脂合成而提高含油量。
4.35S:BnFAX6和BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜侧芽中侧芽起始关键负调控因子、糖分解和脂合成相关基因表达分析
用定量RT-PCR技术分析目标基因表达，按照Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,YangWC,2005.The Cotton ACTIN1 gene is functionally expressed in fibers andparticipates in fiber elongation.Plant Cell 17:859–875所描述的方法进行。提取野生型(WT)及35S:BnFAX6和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜播种后两个月的植株侧芽中的总RNA，以BnACTIN2(BnaC05g14140D)为内参，进行实时定量RT-PCR分析，测定侧芽起始关键负调控因子、糖分解和脂合成相关基因的表达。所有重复均3次，统计分析实验结果。误差线代表标准误差，*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
实验结果表明，与野生型相比，侧芽起始关键负调控因子BnBRC1在BnFAX6过量表达转基因油菜腋芽中的表达量明显下调(图3)，蔗糖运输和分解相关基因BnSUC1、BnSUS1和BnSUS3，糖酵解相关基因BnHXK1、BnPGK和BnFPA以及脂肪酸合成相关基因BnACCA2、BnMCAT和BnKAS在BnFAX6过量表达转基因油菜开花后25天的种子和侧芽中的表达量均明显上调，而BnGPAT、BnDGAT和BnFAE等三酰甘油组装和脂肪酸修饰相关基因的表达量没有明显变化(图4和图6)。上述实验结果表明，一方面，过量表达BnFAX6上调侧芽中蔗糖运输和分解相关基因以及脂肪酸合成相关基因的表达，而不影响后续脂肪酸修饰和三酰甘油组装相关酶基因的表达，从而提高油脂的积累，促进侧芽生长发育；另一方面，过量表达BnFAX6促进碳源向油脂合成的种子中流动，使得种子中含油量增加。
5.BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜表型分析
参照Tan HL,Yang XH,Zhang FX,Zheng X,Qu CM,Mu JY,Fu FY,Li JN,Guan RZ,Zhang HS,Wang GD,Zuo JR.2011.Enhanced seed oil Production in canola byconditional expression of Brassica napus LEAFY COTYLEDON1 and LEC1-LIKE indeveloping seed.Plant Physiology.156:1577–1588.中的BnNapinA启动子序列设计引物，以油菜基因组DNA扩增得到BnNapinA启动子，与BnFAX6基因编码区(ORF)序列以及NOS终止子一起构建到PC1300表达载体上，利用农杆菌介导的DNA转移转化油菜，获得BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜。提取油菜基因组DNA，利用PCR技术检测鉴定转基因油菜植株。提取野生型(WT)及BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜植株开花后25天的种子总RNA，按照文献Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,Yang WC,2005.The Cotton ACTIN1 geneis functionally expressed in fibers and participates in fiberelongation.Plant Cell 17:859–875中所提供的RT-PCR方法，以BnACTIN2(BnaC05g14140D)做为内参，分析BnFAX6在野生型及转基因油菜株系中的目标基因表达情况。对成熟野生型和BnNapinApro:BnFAX6转基因油菜单株株高、单株总分蘖数、单株有效分蘖数、单株总荚果数、荚果粒数、种子千粒重和种子含油量进行测定(方法如上述)。提取种子总脂肪酸后，通过气相色谱法测定各种脂肪酸所占含量比例，分析脂肪酸组分。所有实验均重复3次，统计分析实验结果。误差线代表标准误差，*表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.05存在显著差异，**表示转基因与野生型在t-test检验中P值<0.01存在极显著差异。
在DNA水平和转录水平对转基因植株进行了鉴定，得到多个稳定遗传的转基因油菜株系(图5)。对BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜成熟种子含油量进行分析发现，BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜种子含油量较野生型显著提高(图5)。而且，与野生型相比，转基因油菜种子中质体从头合成的豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)和油酸(18:1)等脂肪酸所占比例提高，而脂肪酸运出质体后进一步加工得到的棕榈油酸(16:1)和(18:3)等脂肪酸所占比例下降(图5)。上述结果表明BnFAX6可能涉及到质体中合成的脂肪酸的转运。
序列表
＜110＞ 华中师范大学
＜120＞ 甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的鉴定及应用
＜160＞ 3
＜210＞ 1
＜211＞ 3297bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 油菜 (Brassica napus L.)
＜400＞ 1
agataaaaac aattcacctc ggaagatttg agaatgagag ttgaattaca cattttatta 60
taataattca atttaataaa taaaatcctt tgagaataca tggtcagtgt gcaatataag 120
taaatacttt gataatagat tttatgaaga aaaacttgaa aaatccataa accaataacc 180
acatattata agggattggc aaaatcagta tttttcaaaa aaaaattgaa taacacaaga 240
cttttattga ctttgtaaaa ttctgaatct aataacacta gattttaaca taattttgaa 300
aagtcttgat tgaataacac tagaatcatt taaaaatata aatctttata actctttaca 360
aataaataat ccaataacac tccgttagac ttgtcaaaga atttaaatgg cgccacttct 420
caaataataa tccttttcaa ccaaattttc atcttcatcc gcaacaacaa gacttaacac 480
tttcacacaa acaattcatc taactacata ctatgcgaat cgcggacaca ccactagtaa 540
gaaaatacta aagactcacg aagaactcca ctttggtaac gaggaaaatt gatgttctat 600
gaacatctca ctagcttatc atctattgat tagggttgaa tccttataaa tattatttta 660
ttgcaaatgg ttccttgtct atttgtgatc aagaattcag tttatgcttt gcataaacca 720
ttcagatcca gagtcaaagg attcaagctt aaagaattgt cagatactcc aagcttcggt 780
gaataattgg aaaagcatac cagctgaacc cccttcacgg aaacataatc ccccacaagt 840
ctgtgaattc acttcaaagg attttgatac cattgagctt gcactttccc cacatgacca 900
agtgcaagga taatgagaag gaagtgtcta tgtaactatt ccagctataa atttggtgga 960
ttgataagct tctatctgtt gattatgcta tttgattgag ctctatgctg aatggattaa 1020
tactaaaatt tcatttccct ttccccactg aatctgaaag catctctcat gtggcattat 1080
ccatgttttg ataatgtttt tctccatact tctagaattt caaatgtttt tcaccaaatg 1140
ttttaaatgt catgttgaca acaaacaata aaatgaaatt ctagaagtac gagtaagaag 1200
acttggtttt gctaatgtag acaacatggt ctcaatactc tgtaattact gtgcaagata 1260
aatataaatt atttatttat atttctcttt tggtttgaaa gaatgccaat gataaagctc 1320
atatggcgtt tgctaaaatg aaaaagaatc atagtgttgt tgttgtgtgt ttcagattaa 1380
tgaagtttat actaaatttt gatctaaata tagctatgac taataaaaaa aatccaaaag 1440
ttgtagagat tggagcttta gaagcacagg tcattgatat tagatttgtc aatgatttga 1500
tgttaatggt tctgacacat tacatttaga aatttgatgt caatgggtgt tattgatagt 1560
gatagtagat gctgtgtaaa gtctcattta tttctatagc actaaattca cagtaatcaa 1620
gttttaataa aaatttcaaa atcacagttc ttgaaataac atacagctgt acaaatactt 1680
tgtagagcaa aaattcagag caattttatg gagcttccta taaaatttta tttttaaagc 1740
aataaaatct aaaatcacaa caaaaaattt ataattctgt aataattttc tttgtgaaaa 1800
gagagagtat aatttatttt ctcgaaacga tcgctgacaa aaacaaagac ggacttcttc 1860
cacgcgctcg ccactcacac caaactcatt acaaaactct atcgtcctcc tccttttcat 1920
tacaaaacat tgtcttcatc ccaagtttct tcttctactt tccggaaaaa caggaattca 1980
caaaacccaa tatcgagaaa atgcatgatt tctgcttcac aataccctat gggatgctcc 2040
taatcggcgg tggattcatc gggtacatga agaaaggaag catcacatct ttcgccggag 2100
gtgcagtcgc tggcttgtta ctcattctcg ctggatatct cagtctcaaa gctttcgaga 2160
tgaagaaaaa ttcttccatc gctgttgttc ttcagacagg tcttgttttc atattctctt 2220
ttgttcacgt ctttctcagg tttaagatga ttttatgttt agaaagattt cgaatttcga 2280
ctttgcatca tatggttccg ttatgtcttg atcgatatgg tatagagatg actttttatt 2340
tcactgacct gtcaattgag taaaggaacg tttttttctt tctatggttc actgtttgga 2400
tcggatcaag aacttgggtt tagttataga ctctagctat gatatgaagg ttcgggaact 2460
taattagacc actaagatct ggatctgaac aaataatttt atctgatgat ctgattggtg 2520
tgatgactga taatcaaaga tgaaaaagcc aacattttgt tgtgtttgga tctttaggtt 2580
acttgtattg ggtttgctag tttcttaaaa ttctagtgtc tctcttaaaa acaagatgat 2640
gtgtgttaag tgcaactaac ccaagggtgt tgtcatactt gagttgtaac atgttgtact 2700
tgagtaggtt cctgatttta actagtcttc ttaccatcct tcaagaacgt ttcaaacaag 2760
ctcacataag ctgttttcat tttgctattt cagtgtctga aactcattta aatgttcctt 2820
tttttttttt gtatacagta atctcagctg ctctcacact agtcatggga cagcgttact 2880
tgctcactca aaaggttatg ccggctggtc ttgttgctgg catcaggtaa acattttctc 2940
tttttttctc atttcctttc tgtgaaatat ctggcttctc tatttatcat tagagtttct 3000
actccatttg actttttaac attagagaaa catatctgta ttgcagtgct ctcatgacct 3060
gtttttacgt atacaagatc gctactggtg gtaataaaat cccatcaaaa gctgaatgat 3120
agttatgcaa ttctgctttt atggtggatg catatgatac tctcctttgt tgatttgaaa 3180
tcttttgtgt gtttctgaga ttattttgta ttagttgcag aagttcctat ggtcttgtgt 3240
gtgtcttcat gtcttgagat tagtttcttg taatcatgtt tttgttaatt acaaatt 3297
＜210＞ 2
＜211＞ 360
＜212＞ DNA
＜213＞ 油菜 (Brassica napus L.)
atgcatgatt tctgcttcac aataccctat gggatgctcc taatcggcgg tggattcatc 60
gggtacatga agaaaggaag catcacatct ttcgccggag gtgcagtcgc tggcttgtta 120
ctcattctcg ctggatatct cagtctcaaa gctttcgaga tgaagaaaaa ttcttccatc 180
gctgttgttc ttcagacagt aatctcagct gctctcacac tagtcatggg acagcgttac 240
ttgctcactc aaaaggttat gccggctggt cttgttgctg gcatcagtgc tctcatgacc 300
tgtttttacg tatacaagat cgctactggt ggtaataaaa tcccatcaaa agctgaatga 360
＜210＞ 3
＜211＞ 119
＜212＞ PRT
＜213＞ 油菜 (Brassica napus L.)
＜400＞ 3
Met His Asp Phe Cys Phe Thr Ile Pro Tyr Gly Met Leu Leu Ile
5 10 15
Gly Gly Gly Phe Ile Gly Tyr Met Lys Lys Gly Ser Ile Thr Ser
20 25 30
Phe Ala Gly Gly Ala Val Ala Gly Leu Leu Leu Ile Leu Ala Gly
35 40 45
Tyr Leu Ser Leu Lys Ala Phe Glu Met Lys Lys Asn Ser Ser Ile
50 55 60
Ala Val Val Leu Gln Thr Val Ile Ser Ala Ala Leu Thr Leu Val
65 70 75
Met Gly Gln Arg Tyr Leu Leu Thr Gln Lys Val Met Pro Ala Gly
80 85 90
Leu Val Ala Gly Ile Ser Ala Leu Met Thr Cys Phe Tyr Val Tyr
95 100 105
Lys Ile Ala Thr Gly Gly Asn Lys Ile Pro Ser Lys Ala Glu
110 115 119

Claims (4)

1.甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6在提高油菜产量和含油量中的应用，其特征在于，甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的DNA全长序列如SEQ ID No.1所示。
2.甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的cDNA序列在提高油菜产量和含油量中的应用，其特征在于，甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。
3.甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6基因编码的蛋白质在提高油菜产量和含油量中的应用，其特征在于：甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求1或2或3的应用，其特征在于：所述的应用为促进侧芽生长发育，提高油菜产量，增加种子油脂积累，提高种子含油量。
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