CN105475117B - 大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于获得产生具有低亚麻酸水平和适度增加的油酸水平的种子的大豆植物的方法。还公开了用于产生具有低亚麻酸水平、适度增加的油酸水平和低饱和脂肪酸水平的种子的方法。这些方法使提供中油酸水平的转基因与在赋予低亚麻酸表型的大豆基因中包含突变的大豆种质的组合成为必需。这些方法还使提供中油酸水平和低饱和脂肪酸水平的转基因与在赋予低亚麻酸表型的大豆基因中包含突变的大豆种质的组合成为必需。还公开了通过这些方法产生的大豆植物和种子。

Description

大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法
本申请是申请日为2007年3月9日、申请号为200780016763.3、发明名称为“大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法”的发明专利申请的分案申请。
交叉引用相关申请
本发明要求2006年3月10日提交的美国临时专利申请号 60/781,519的优先权，所述临时专利申请通过引用方式将其全文合并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不可应用。
附录
不可应用。
序列表的合并
序列表的纸件拷贝和磁盘上的序列表的计算机可阅读形式(包含命名为“38-77(54449)SEQ LIST”，71,278个字节大小(于MS-DOS中测量)的文件)通过引用合并入本文。该序列表由SEQ ID NO:1至63 组成。
发明背景
1.发明领域
本发明总地说来涉及获得产生具有改变的油的组成的大豆种子的大豆植物的方法，更特别地涉及其中产生具有中油酸、低亚麻酸表型的大豆种子或具有中油酸、低饱和脂肪酸、低亚麻酸表型的大豆种子的方法。
2.相关技术
植物油用于广泛的用途。需要新型植物油组合物和改进的方法以从生物合成或天然植物来源获得油组合物。取决于希望的油用途，需要各种不同的脂肪酸组成。植物，特别是在种子中合成大量油的物种，是用于食品和工业用途的油的重要来源。种子油几乎完全由三酰基甘油组成，其中脂肪酸被酯化至甘油的三个羟基。
大豆油典型地包含大约16-20％的饱和脂肪酸：13-16％的棕榈酸酯和3-4％硬脂酸酯。通常参见Guns tone等人,The Lipid Handbook, Chapman&Hall,London(1994)。已通过多种育种方法改变大豆油，以产生对于特定市场的有益方面。然而，对于主要的大豆油用户例如色拉油、烹饪油和煎炸油的消费者以及工业市场例如生物柴油和生物润滑油(biolube)市场广泛有益的大豆是不可获得的。先前的大豆油太昂贵或缺乏重要的食品质量特性例如氧化稳定性、优良的油炸食品风味或饱和脂肪含量，或缺乏重要的生物柴油特性例如适当的一氧化氮排放或低温耐受性或低温流动(cold flow)。
高等植物通过共同的代谢途径--脂肪酸合成酶(FAS)途径合成脂肪酸，该合成途径位于质体内。β-酮脂酰-ACP合酶是植物细胞的FAS 中的重要的限速酶，其以几种形式存在。β-酮脂酰-ACP合酶I催化棕榈酰-ACP(C16:0)的链延伸，然而β-酮脂酰-ACP合酶II催化硬脂酰 -ACP(C18:0)的链延伸。β-酮脂酰-ACP合酶IV是β-酮脂酰-ACP合酶 II的变体，其也可催化18:0-ACP的链延伸。在大豆中，FAS的主要产物是16:0-ACP和18:0-ACP。18:0-ACP的去饱和形成18:1-ACP由位于质体的可溶性Δ-9去饱和酶(也称为“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化。参见Voelker等人,52Annu.Rev.Plant Physiol.Plant MoI.Biol. 335-61(2001)。
质体FAS(plastidial FAS)和Δ-9去饱和酶的产物16:0-ACP、 18:0-ACP和18:1-ACP被特定的硫酯酶(FAT)水解。基于序列同源性和底物偏爱性，植物硫酯酶可分成两个基因家族。第一个家族FATA包括具有主要对于18:1-ACP的活性的长链酰-ACP硫酯酶。第二个家族FATB 的酶通常利用16:0-ACP(棕榈酰-ACP)、18:0-ACP(硬脂酰-ACP)和 18:1-ACP(油酰-ACP)。植物中，此类硫酯酶在植物中的从头的脂肪酸生物合成期间在确定链的长度中具有重要的作用，因此这些酶用于提供脂肪酰基组成的各种变化，特别地有关存在于种子贮存油中的各种的脂肪酰基基团的相对比例的变化。
FATA和FATB的反应产物游离脂肪酸离开质体并且被转化成它们的各自的酰基辅酶A酯。酰基辅酶A是位于内质网(ER)中的脂质生物合成途径(肯尼迪途径(KennedyPathway))的底物。该途径负责膜脂质的形成以及组成种子油的三酰基甘油的生物合成。在ER中，存在可进一步使18:1去饱和成多不饱和脂肪酸的另外的膜结合去饱和酶。Δ-12 去饱和酶(FAD2)催化双键插入18:1(油酸)，从而形成亚油酸(18:2)。Δ-15去饱和酶(FAD3)催化双键插入18:2，从而形成亚麻酸(18:3)。
已显示通过使用抑制FAD2表达的转基因抑制内源性FAD2基因赋予了希望的中油酸(18:1)表型(即包含按重量计算大约50％和75％油酸的大豆种子)。在美国专利7,067,722中公开了提供对内源性FAD2基因表达的抑制和中油酸表型的转基因和转基因植物。相反地，缺乏FAD2抑制性转基因的野生型大豆植物通常产生具有低于20％的油酸组成的种子。
大豆油通常包含大约8％的导致减少的稳定性和风味的亚麻酸 (18:3)。可通过氢化减少大豆油中亚麻酸(18:3)的水平以提高稳定性和风味(Dutton等人,1951；Lui andWhite,1992)。不幸的是，氢化导致产生增加冠心病的风险的反式脂肪酸(当消费时)(Hu等人, 1997)。
也已使用常规育种产生具有1％至6％范围内的亚麻酸水平的大豆品系(Ross等人Crop Science,40:383；2000；Wilson等人J.Oleo ScL, 50:5,87,2001；Wilson Lipidtechnology Sept.1999)。通过突变、筛选和育种已产生多种低亚麻酸大豆(Fehr等人,1992；Rahman和 Takagi,1997；Ross等人,2000；Byrum等人,1997；Stoisin等人, 1998)。已获得具有大约1％的或更低的亚麻酸含量的某些大豆品种(美国专利5,534,425和5,714,670)。最近，已公开了用于获得具有低水平的亚麻酸水平以及农艺学上优良的大豆品种的产量和生长特征的大豆植物的方法(美国专利申请2006/0107348)。
油酸具有一个双键，但在高温下仍然相对稳定，具有高水平的油酸的油对于其中需要加热的烹饪和其他过程是合适的。最近，已建议增加高油酸的消费，因为油酸似乎降低低密度脂蛋白(“LDL”)的血液水平而不影响高密度脂蛋白(“HDL”)的水平。然而，对油酸水平的一些限制是希望的，因为当油酸在高温下降解时，其产生负面的(negetive) 风味化合物，且消除了通过亚油酸的氧化产生的正面(positive)风味。 Neff等人,JAOCS,77:1303-1313(2000)；Warner等人,J.Agric. Food Chem.49:899-905(2001)。因此优选使用具有按重量计算65-85％或更少的油酸水平的油，以限制食品应用例如煎炸油和油炸食品中的异味。其他优选油具有按重量计算高于55％的油酸水平以提高氧化稳定性。
对于许多油的应用，低于按重量计算8％或甚至低于按重量计算大约2-3％的饱和脂肪酸是希望的。饱和脂肪酸具有在许多应用中是不希望的高熔点。当用作原料或燃料时，饱和脂肪酸在低温下引起混浊 (clouding)，且赋予燃料较差的冷流动性例如流点和低温过滤阻塞点。消费者和食品工业可能偏爱包含低饱和脂肪酸水平的油产品，因为它们被认为更健康和/或可按照FDA指导将其标记为“不含饱和脂肪”。此外，低饱和油减少或消除了使食品应用的油例如色拉油成为冬天不凝固的油的需要。在生物柴油和润滑油应用中，具有低饱和脂肪酸水平的油赋予提高的冷流动性且在低温下不混浊。
产生具有中油酸、低亚油酸含量的种子的大豆品系是非常希望的。不幸的是，通过基因工程方法将中油酸和低亚麻酸性状组合的尝试已碰到了问题。其中Δ-12去饱和酶(FAD2)和Δ-15去饱和酶(FAD3)基因已被抑制的转基因品系具有低亚麻酸水平的种子，但油酸水平通常高于对于中油酸所确定的范围。然而，本文公开的方法使得能够产生也具有在 55至80％的中油酸范围内的油酸水平的低亚麻酸大豆种子。而且，此类方法不使氢化步骤成为必需，从而避免产生不希望的反式脂肪。
产生具有中油酸、低饱和、低亚油酸含量的种子的大豆品系也是非常希望的。本文公开的方法使得能够产生也具有在55至80％的中油酸范围内的油酸水平和低于8％的饱和脂肪酸水平的低亚麻酸大豆种子。
发明概述
考虑到上述问题，开发了本发明。本发明首先涉及产生包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的大豆植物的方法。通过产生一种或多种包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆 FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物的第一步骤，获得至少一粒来自从第一步骤获得的所述大豆植物的种子的第二步骤，对于来自第二步骤的种子确定按重量计算的亚麻酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数的第三步骤，然后鉴定产生具有种子脂肪酸组成(所述种子脂肪酸组成包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量)的种子的大豆植物来实施本发明的方法。
在该方法的其他实施方案中，第一步骤中产生的大豆植物包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变。这些功能损失性突变可位于内源性大豆FAD3-1B和FAD3-1C基因中。在所述方法的该实施方案中，该方法的第三步骤中鉴定的大豆植物包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量。
在该方法的某些实施方案中，转基因还可包括赋予除草剂耐受性的转基因。除草剂耐受性转基因可能赋予对草甘膦的耐受性。在本发明的特定实施方案中，转基因包含位于整合入所述植物的染色体的 pMON68504、pCGN5469、pCGN5471或pCGN5485的T-DNA边界序列之间的序列。
在该方法的第三步骤中，通过脂质分析技术确定按重量计算的亚麻酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数。该脂质分析技术包括一种或多种选自气相色谱/火焰离子化检测、气相色谱/质谱、薄层层析/火焰离子化检测、液相色谱/质谱、液相色谱/电喷雾电离-质谱和液相色谱/电喷雾电离-串联质谱的技术。
可这样产生包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物，即通过将包含转基因的第一大豆植物亲本品系与包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的第二大豆亲本品系杂交，以获得对于转基因是杂合的和对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1 大豆植物，然后使来自杂交的F1后代植物自交以获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2大豆植物来产生。在该方法的某些实施方案中，第二大豆亲本品系包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变。两个内源性大豆FAD3基因可以是FAD3-1B和FAD3-1C。在该方法中，在步骤 (i)中通过将多个F1植物经历至少一种DNA分析技术(该技术允许鉴定对于所述转基因和FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1 植物)来获得对于转基因和FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1大豆植物。类似地，通过在步骤(ii)中将多个F2植物经历至少一种DNA分析技术(所述技术允许鉴定对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2植物)来获得对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2大豆植物。所述DNA分析技术包括一种或多种选自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD分析的技术。在本发明的某些实施方案中，DNA分析技术包括FAD3-1C基因序列中相应于SEQ ID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或 3743的位点上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334上的鸟嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸 385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鸟嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。在本发明的其他实施方案中，DNA分析技术包括大豆FAD3-1 B基因中的单核苷酸多态性(包括FAD3-1b基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换)的检测。在该方法中，转基因还可包括赋予除草剂耐受性的转基因，在步骤(i)中通过将多个F1植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得对于所述转基因是杂合的F1大豆植物。类似地，当所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因时，在步骤(ii)中通过将所述多个F2植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得就对于所述转基因是纯合的F2 大豆植物而富集的多个F2植物。该方法还可包括将来自步骤(ii)的对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2后代植物自交以获得F3大豆植物的步骤iii)。
产生包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物的可选择方法包括用转基因直接转化包含突变的大豆植物或细胞。因此这样产生该大豆植物，即在本发明的第一步骤中通过用减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因转化包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物或植物细胞，以获得具有FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的、对于所述转基因是杂合的R0大豆植物，将来自之前步骤的R0后代植物自交以获得对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的R1大豆植物，从而获得包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物。在该方法的某些实施文案中，转基因还包括赋予除草剂耐受性状的序列。在本发明的其他实施方案中，转基因还包括赋予草甘膦耐受性的序列。
本发明还包括通过本发明的上述方法产生的大豆植物和通过本发明的方法产生的大豆植物的植物部分。产生的大豆植物部分可以是花粉、胚珠、分生组织、叶、茎、根或细胞。本发明也包括来自通过这些方法产生的大豆植物的后代大豆植物。本发明还包括通过本发明的方法产生的大豆植物的种子，其中该种子具有包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。本发明还包括通过方法产生的大豆植物的种子，在所述方法中使用包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变的大豆植物，所述种子具有包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
本发明还提供了获得具有改变的种子油的脂肪酸组成的大豆植物的方法，该方法包括步骤：a)将具有包含低于按重量计算大约3％的总脂肪酸的亚麻酸含量的种子油的脂肪酸组成的第一大豆亲本品系与具有种子油的脂肪酸组成(其中至少一种除了亚油酸外的脂肪酸的含量，当与商品大豆油的相应脂肪酸的含量相比时，改变至少50％)的第二大豆亲本品系杂交，所述第二大豆亲本品系包含改变至少一种除了亚油酸外的脂肪酸的含量的转基因；和b)获得展示包含低于按重量计算3％的总脂肪酸的亚麻酸含量和至少一种除了亚油酸外的脂肪酸的含量(该含量，当与商品大豆油的相应脂肪酸含量相比时，改变了至少50％)的种子油的脂肪酸组成的后代植物，从而获得具有改变的种子油的脂肪酸组成的大豆植物。在该方法中，除了亚麻酸外的脂肪酸选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、十八碳四烯酸、油酸、亚油酸、γ-亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
本发明还涉及产生包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的大豆植物的方法。这样实施本发明的该方法，即通过产生一种或多种包含至少一个减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性FATB基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物的第一步骤，获得至少一粒来自从第一步骤获得的所述大豆植物的种子的第二步骤，确定来自第二步骤的种子的按重量计算的亚麻酸、饱和脂肪酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数的第三步骤，然后鉴定产生具有种子脂肪酸组成的种子的大豆植物，所述种子脂肪酸组成包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量。
在该方法的其他实施方案中，在第一步骤中产生的大豆植物包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变。这些功能损失性突变可位于内源性大豆FAD3-1B和FAD3-1C基因中。在该方法的该实施方案中，在该方法的第三步骤中鉴定的大豆植物可包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量。
在该方法的某些实施方案中，转基因还可包括赋予除草剂耐受性的转基因。转基因可赋予对草甘膦的耐受性。赋予对草甘膦的耐受性的转基因可编码CP4EPSPS基因。
在该方法的第三步骤中，通过脂质分析技术确定按重量计算的亚麻酸、饱和脂肪酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数。该脂质分析技术包括一种或多种选自气相色谱/火焰离子化检测、气相色谱/质谱、薄层层析/火焰离子化检测、液相色谱/质谱、液相色谱/电喷雾电离-质谱和液相色谱/电喷雾电离-串联质谱的技术。
可这样产生包含至少一个减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性 FATB基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物，即通过将包含转基因的第一大豆植物亲本品系与包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的第二大豆亲本品系杂交，以获得对于转基因是杂合的且对于内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1大豆植物，然后使来自杂交的F1后代植物自交以获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2大豆植物来产生。在该方法的某些实施方案中，第二大豆亲本品系包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变。两个内源性大豆FAD3基因可以是 FAD3-1B和FAD3-1C。在该方法中，在步骤(i)中通过将多个F1植物经历至少一种DNA分析技术(该技术允许鉴定对于所述转基因和FAD3 基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1植物)来获得对于转基因和FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1大豆植物。类似地，可通过在步骤(ii)中将多个F2植物经历至少一种DNA分析技术 (所述技术允许鉴定对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2植物)来获得对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2大豆植物。所述DNA分析技术包括一种或多种选自PCR分析、定量PCR分析、SNP 分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD分析的技术。在本发明的某些实施方案中，DNA分析技术包括FAD3-1C基因序列中相应于SEQ ID NO:62 的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位点上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸 334上的鸟嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鸟嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。在本发明的其他实施方案中，DNA分析技术包括大豆FAD3-1B基因中的单核苷酸多态性(包括FAD3-1b基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸 2021的位点上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换)的检测。在该方法中，转基因还可包括赋予除草剂耐受性的转基因，在步骤(i)中通过将多个F1植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得对于所述转基因是杂合的F1大豆植物。类似地，当转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因时，在步骤(ii)中通过将所述多个F2植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得就对于所述转基因是纯合的F2大豆植物而富集的多个F2植物。该方法还可包括将来自步骤(ii)的对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2后植物自交以获得F3代大豆植物的步骤iii)。
产生大豆植物(所述植物包含至少一个减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性大豆FATB基因和内源性FATB基因的表达的转基因以及内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变)的可选择方法包括用转基因直接转化包含突变的大豆植物或细胞。因此这样产生该大豆植物，即在本发明的第一步骤中通过用一个或多个减少内源性大豆FAD2-1 基因和内源性大豆FATB基因的表达的转基因转化包含内源性大豆FAD3 基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物或植物细胞，以获得具有 FAD3基因中的至少一个功能损失性突变、对于所述转基因是杂合的R0 大豆植物，将来自之前步骤的R0后代植物自交以获得对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的R1大豆植物，从而获得包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物。在该方法的某些实施文案中，转基因还包括赋予除草剂耐受性状的序列。在本发明的其他实施方案中，转基因还包括赋予草甘膦耐受性的序列。
本发明还包括通过本发明的上述方法产生的大豆植物和通过本发明的方法产生的大豆植物的植物部分。产生的大豆植物部分可以是花粉、胚珠、分生组织、叶、茎、根或细胞。本发明也包括来自通过这些方法产生的大豆植物的后代大豆植物。本发明还包括通过本发明的方法产生的大豆植物的种子，其中该种子具有包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和低于按重量计算8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。本发明还包括通过方法产生的大豆植物的种子，在所述方法中使用包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变的大豆植物，所述种子具有包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约 55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
下面，参照附图详细地描述本发明的其他特征和优点以及本发明的不同实施方案的结构和操作。
本发明涉及但不限于以下各项：
第1项.产生大豆植物的方法，所述大豆植物包含总种子脂肪酸的低于按重量计算大约6％的亚麻酸含量和总种子脂肪酸的按重量计算大约55％至大约80％的油酸含量，该方法包括步骤：
a)产生一种或多种包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物；
b)获得至少一粒来自步骤(a)中获得的所述大豆植物的种子；
c)对于步骤(b)的所述种子，确定按重量计算的亚麻酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数；和
d)鉴定产生具有如下种子脂肪酸组成的种子的大豆植物，所述种子脂肪酸组成包含总种子脂肪酸的低于按重量计算大约6％的亚麻酸含量和总种子脂肪酸的按重量计算大约55％至80％的油酸含量。
第2项.第1项的方法，其中步骤(a)中产生的所述大豆植物在至少两个内源性大豆FAD3基因中包含至少两个功能损失性突变。
第3项.第2项的方法，其中所述内源性大豆FAD3基因是FAD3-1 B和FAD3-1C。
第4项.第3项的方法，其中步骤3中鉴定的所述大豆植物包含总种子脂肪酸的低于按重量计算大约3％的亚麻酸含量和总种子脂肪酸的按重量计算大约55％至大约80％的油酸含量。
第5项.第1项的方法，其中通过：
i)将包含所述转基因的第一大豆亲本品系与包含内源性大豆 FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的第二大豆亲本品系杂交以获得对于所述转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1大豆植物；和
ii)使来自(i)的F1后代植物自交以获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2大豆植物，从而获得包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变这两者的大豆植物
在步骤(a)中产生所述大豆植物。
第6项.第5项的方法，其中所述第二大豆亲本品系在至少两个内源性大豆FAD3基因中包含至少两个功能损失性突变。
第7项.第6项的方法，其中所述内源性大豆FAD3基因是FAD3-1 B和FAD3-1C。
第8项.第5项的方法，其中在步骤(i)中通过将多个F1植物经历至少一种允许鉴定对于所述转基因和对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1植物的DNA分析技术来获得对于所述转基因和对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的所述F1大豆植物。
第9项.第5项的方法，其中在步骤(ii)中通过将多个F2植物经历至少一种允许鉴定对于所述转基因是纯合的和对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2植物的DNA分析技术来获得对于所述转基因是纯合的和对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的所述F2大豆植物。
第10项.第8项的方法，其中所述DNA分析技术包括一种或多种选自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD 分析的技术。
第11项.第9项的方法，其中所述DNA分析技术包括一种或多种选自PCR分析、定量PCR分析、SNP分析、AFLP分析、RFLP分析和RAPD 分析的技术。
第12项.第8项的方法，其中所述DNA分析技术包括FAD3-1C 基因序列中相应于SEQID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、 3292、3360或3743的位点上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334上的鸟嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鸟嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。
第13项.第9项的方法，其中所述DNA分析技术包括FAD3-1C基因序列中相应于SEQID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、 3360或3743的位点上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62 的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334上的鸟嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鸟嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。
第14项.第8项的方法，其中所述DNA分析技术包括所述大豆 FAD3-1B基因中的单核苷酸多态性的检测，所述单核苷酸多态性包括 FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换。
第15项.第9项的方法，其中所述DNA分析技术包括所述大豆 FAD3-1B基因中的突变的检测，所述突变包括FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换。
第16项.第1项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因。
第17项.第5项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因且其中在步骤(i)中通过将多个F1植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得对于所述转基因是杂合的所述F1大豆植物。
第18项.第5项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因且其中在步骤(ii)中通过将所述多个F2植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得就对于所述转基因是纯合的F2大豆植物而富集的多个F2植物。
第19项.第16项的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
第20项.第16项的方法，其中所述转基因包含位于被整合入所述植物的染色体中的pMON68504、pCGN5469、pCGN5471或pCGN5485的 T-DNA边界序列之间的序列。
第21项.第1项的方法，在步骤(a)中通过：
a)用减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因转化包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物或大豆植物细胞，以获得具有FAD3基因中的至少一个功能损失性突变、对于所述转基因是杂合的R0大豆植物；
b)将来自步骤(i)的所述R0后代植物自交以获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的R1大豆植物，从而获得包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物
来产生所述大豆植物。
第22项.第21项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性状的序列。
第23项.第22项的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
第24项.第5项的方法，其还包括将来自(ii)的对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的所述 F2后代植物自交以获得F3大豆植物的步骤iii)。
第25项.第1项的方法，其中通过脂质分析技术在步骤(c)中确定按重量计算的亚麻酸和油酸占总种子脂肪酸含量的所述百分数。
第26项.第25项的方法，其中所述脂质分析技术包括一种或多种选自气相色谱/火焰离子化检测、气相色谱/质谱、薄层层析/火焰离子化检测、液相色谱/质谱、液相色谱/电喷雾电离-质谱和液相色谱/电喷雾电离-串联质谱的技术。
第27项.通过第1项的方法产生的大豆植物。
第28项.第27项的大豆植物的植物部分。
第29项.第28项的植物部分，其中所述植物部分是花粉、胚珠、分生组织、叶、茎、根或细胞。
第30项.来自第27项的大豆植物的后代大豆植物。
第31项.通过第1项的方法产生的大豆植物的种子，所述种子具有包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
第32项.通过第4项的方法产生的大豆植物的种子，所述种子具有包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
第33项.获得具有改变的种子油的脂肪酸组成的大豆植物的方法，该方法包括步骤：
a)将具有包含低于按重量计算大约3％的总脂肪酸的亚麻酸含量的种子油的脂肪酸组成的第一大豆亲本品系与第二大豆亲本品系杂交，所述第二大豆亲本品系具有其中至少一种除了亚油酸外的脂肪酸的含量，当与商品大豆油的相应的脂肪酸含量相比时，改变至少50％的种子油的脂肪酸组成，所述第二大豆亲本品系包含改变至少一种除了亚油酸外的脂肪酸的含量的转基因；和
b)获得展示包含低于按重量计算3％的总脂肪酸的亚麻酸含量和至少一种除了亚油酸外的脂肪酸的含量的种子油的脂肪酸组成的后代植物，从而获得具有改变的种子油的脂肪酸组成的大豆植物，当与商品大豆油的相应脂肪酸含量相比时，所述除了亚油酸外的脂肪酸的含量改变至少50％。
第34项.第33项的方法，其中所述除了亚麻酸外的脂肪酸选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、十八碳四烯酸、油酸、亚油酸、γ-亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
第35项.第24项的方法，其中所述除了亚麻酸外的脂肪酸选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、十八碳四烯酸、油酸、亚油酸、γ-亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
第36项.产生大豆植物的方法，所述大豆植物包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量、按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量，该方法包括步骤：
a)产生一种或多种包含至少一个减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性FATB基因两者的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物；
b)获得至少一粒来自在步骤(a)获得的所述大豆植物的种子；
c)对于步骤(b)的所述种子，确定按重量计算的亚麻酸、饱和脂肪酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数；和
d)鉴定产生具有如下种子脂肪酸组成的种子的大豆植物，所述种子脂肪酸组成包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至 80％的总种子脂肪酸的油酸含量。
第37项.第36项的方法，其中步骤(a)中产生的所述大豆植物包含至少两个内源性大豆FAD3基因中的至少两个功能损失性突变。
第38项.第37项的方法，其中所述内源性大豆FAD3基因是FAD3-1 B和FAD3-1C。
第39项.第38项的方法，其中步骤3中鉴定的所述大豆植物包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量。
第40项.第36项的方法，其中通过：
i)将包含所述转基因的第一大豆植物亲本品系与包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的第二大豆亲本品系杂交，以获得对于所述转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1大豆植物；和
ii)使来自(i)的F1后代植物自交以获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2大豆植物，从而获得包含至少一个减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性FATB 基因两者的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物
在步骤(a)中产生所述大豆植物。
第41项.第40项的方法，其中在步骤(i)中通过将多个F1植物经历至少一种DNA分析技术来获得对于转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的所述F1大豆植物，所述DNA 分析技术允许鉴定对于所述转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1植物。
第42项.第40项的方法，其中在步骤(ii)中通过将多个F2植物经历至少一种DNA分析技术来获得对于所述转基因是纯合的且对于 FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的所述F2大豆植物，所述DNA分析技术允许鉴定对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2植物。
第43项.第41项的方法，其中所述DNA分析技术包括FAD3-1C 基因序列中相应于SEQ ID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、 3292、3360或3743的位点上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334上的鸟嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鸟嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。
第44项.第42项的方法，其中所述DNA分析技术包括FAD3-1C 基因序列中相应于SEQ ID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、 3292、3360或3743的位点上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334上的鸟嘌呤、核苷酸364上的胞嘧啶、核苷酸385上的胸腺嘧啶、核苷酸387上的腺嘌呤、核苷酸393上的胞嘧啶、核苷酸729上的鸟嘌呤和核苷酸747上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。
第45项.第41项的方法，其中所述DNA分析技术包括所述大豆 FAD3-1B基因中的单核苷酸多态性的检测，所述单核苷酸多态性包括 FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换。
第46项.第42项的方法，其中所述DNA分析技术包括所述大豆 FAD3-1B基因中的单核苷酸多态性的检测，所述单核苷酸多态性包括 FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换。
第47项.第36项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因。
第48项.第40项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因且其中在步骤(i)中通过将多个F1植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得对于所述转基因是杂合的所述F1大豆植物。
第49项.第40项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因且其中在步骤(ii)中通过将所述多个F2植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得就对于所述转基因是纯合的F2大豆植物而富集的多个F2植物。
第50项.第47项的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
第51项.第47项的方法，其中所述转基因包含CP4EPSPS基因。
第52项.第36项的方法，在步骤(a)中通过：
a)用至少一个减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性大豆FATB基因两者的表达的转基因转化包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物或大豆植物细胞，以获得具有FAD3基因中的至少一个功能损失性突变、对于所述转基因是杂合的R0大豆植物；
b)将来自步骤(i)的所述R0后代植物自交以获得对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的R1大豆植物，从而获得包含所述转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物
来产生所述大豆植物。
第53项.第52项的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性状的序列。
第54项.第53项的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
第55项.第40项的方法，其还包括将来自(ii)的对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的所述F2后代植物自交以获得F3大豆植物的步骤iii)。
第56项.第36项的方法，其中通过脂质分析技术在步骤(c)中确定按重量计算的亚麻酸、饱和脂肪酸和油酸占总种子脂肪酸含量的所述百分数。
第57项.第56项的方法，其中所述脂质分析技术包括一个或多个选自气相色谱/火焰离子化检测、气相色谱/质谱、薄层层析/火焰离子化检测、液相色谱/质谱、液相色谱/电喷雾电离-质谱和液相色谱/电喷雾电离-串联质谱的技术。
第58项.通过第36项的方法产生的大豆植物。
第59项.第58项的任一个的大豆植物的植物部分。
第60项.第59项的植物部分，其中所述植物部分是花粉、胚珠、分生组织、叶、茎、根或细胞。
第61项.来自第58项的大豆植物的后代大豆植物。
第62项.通过第36项的方法产生的大豆植物的种子，所述种子具有包含低于按重量计算大约6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算低于大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
第63项.通过第39项的方法产生的大豆植物的种子，所述种子具有包含低于按重量计算大约3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、低于按重量计算大约8％的饱和脂肪酸含量和按重量计算大约55％至大约80％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
附图简述
以说明书的部分的形式包含的附图举例说明了本发明的实施方案，其与说明书一起用于解释本发明的原理。在附图中：
图1举例说明pCGN5469，用于减少大豆FAD2-1基因的表达的植物载体；
图2举例说明pCGN5471，用于减少大豆FAD2-1基因的表达的植物载体；
图3举例说明pCGN5485，用于减少大豆FAD2-1基因的表达的植物载体；和
图4举例说明用于通过使用来自表1中所列的大豆基因的DNA序列元件减少一个或多个基因的表达的示例性植物载体的结构。
图5举例说明用于通过使用来自表2中所列的大豆FAD2-1基因和/ 或大豆FATB基因的DNA序列元件减少一个或多个基因的表达的示例性植物载体的结构。
图6举例说明用于减少内源性大豆FAD2-1基因和FATB基因的表达的示例性植物载体。
发明详述
核酸序列的描述
SEQ ID NO:1是FAD2-1A内含子1的核酸序列。
SEQ ID NO:2是FAD2-1B内含子1的核酸序列。
SEQ ID NO:3是FAD2-1B启动子的核酸序列。
SEQ ID NO:4是FAD2-1A基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NOs:5和6分别是FAD2-1A 3'UTR和5'UTR的核酸序列。
SEQ ID NOs:7-13分别是FAD3-1A内含子1、2、3A、4、5、3B和 3C的核酸序列。
SEQ ID NO:14是FAD3-1C内含子4的核酸序列。
SEQ ID NO:15是部分FAD3-1A基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NOs:16和17分别是FAD3-1A 3'UTR和5'UTR的核酸序列
SEQ ID NO:18是部分FAD3-1B基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NO:19-25分别是FAD3-1B内含子1、2、3A、3B、3C、4 和5的核酸序列。
SEQ ID NO:26和27分别是FAD3-1B 3'UTR和5'UTR的核酸序列。
SEQ ID NO:28是FATB-1基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NO:29-35分别是FATB-1内含子I、II、III、IV、V、Vl 和VII的核酸序列。
SEQ ID NOs:36和37分别是FATB-1 3'UTR和5'UTR的核酸序列。
SEQ ID NO:38是金凤花(Cuphea pulcherrima)KAS I基因的核酸序列。
SEQ ID NO:39是金凤花KAS IV基因的核酸序列。
SEQ ID NOs:40和41分别是蓖麻(Ricinus communis)和西蒙得木(Simmondsiachinensis)的Δ-9去饱和酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO:42是FATB-2cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO:43是FATB-2基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NOs:44-47分别是FATB-2内含子I、II、III和IV的核酸序列。
SEQ ID NOs:48-60是PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO:61是相应于来自美国专利申请号10/176,149的SEQ ID NO:1的FAD3-1B基因序列。
SEQ ID NO:62是相应于来自美国专利申请号10/176,149的SEQ ID NO:2的FAD3-1C基因序列。
SEQ ID NO:63是相应于来自美国专利申请号10/176,149的SEQ ID NO:3的FAD3-1C启动子序列。
定义
“ACP”是指酰基载体蛋白质部分。“改变的种子油的组成”是指来自本发明的转基因植物或转化的植物的种子油的组成，所述种子油，与来自具有相似的遗传背景但未被转化的植物的种子油相比，在其中具有改变的或变化的脂肪酸水平。“反义抑制”是指通过导入反义RNA分子诱导的基因特异性沉默。
本文使用的“农艺学上优良的(Agronomically elite)”是指具有最佳的许多可区别的性状例如出芽(emergence)、活力、营养势、疾病抗性、结实率(Seed set)、站立能力(standability)和允许生产者收获具有商业价值的产物的脱粒能力(threshability)的基因型。
本文使用的“等位基因”是指基因座的一个或多个可选择形式的任一形式，所有所述等位基因都与性状或特征相关。在二倍体细胞或生物中，给定的基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。
本文所使用的“回交”是指其中育种者反复地将杂交后代例如第一代杂种(F1)往回与杂交后代的亲本之一杂交的方法。回交可用于将来自一个遗传背景的一个或多个单基因座转换(locus conversion)导入另一个遗传背景中。
“一种以上试剂例如mRNA或蛋白质的共表达”是指在重叠的时间范围中和在相同细胞或组织中一种试剂与另一种试剂的同时表达。“一种以上试剂的协同表达”是指当从此类试剂产生转录物和蛋白质时使用共有的或相同的启动子进行的一种以上试剂的共表达。
核酸序列的“互补“是指序列沿着其全长的互补。
“共抑制”是通过表达同源有义构建体导致的特定内源性基因和基因家族的表达水平(通常在RNA的水平上)的减少，所述构建体能够转录与内源性基因的转录物相同的链型(strandedness)的mRNA。Napoli 等人,Plant Cell 2:279-289(1990)；van der Krol等人,Plant Cell 2:291-299(1990)。
“CP4EPSPS”或“CP4 5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶”基因编码能够赋予植物细胞和从其产生的植物充分程度的草甘膦抗性。CP4 EPSPS序列可以是来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp.) CP4的CP4EPSPS序列或其变体或合成形式，如美国专利号5,633,435 中所描述的。代表性CP4EPSPS序列包括，但不限于，美国专利号 5,627,061和5,633,435中所示的序列。
本文所使用的“杂交”是指两个亲本植物的交配。
本文所使用的“异花传粉”是指通过使来自不同植物的两个配子结合而进行的受精。
本文所使用的“F1”或“F1”是指两个植物杂交的第一代后代。
本文所使用的“F1杂种”或“F1杂种”是指两个非相同基因的 (non-isogenic)植物杂交的第一代后代。
本文所使用的“F2”或“F2”是指两个植物杂交的第二代后代。
本文所使用的“F3”或“F3”是指两个植物杂交的第三代后代。
“粗制大豆油”是指已从大豆种子提取的但未进行精炼、加工或混合(尽管可能对其进行了脱胶)的大豆油。
“CTP”是指由“叶绿体转运肽(chloroplastic transit peptide) 编码序列”编码的叶绿体转运肽。
当指本文的蛋白质和核酸时，“衍生的”是指直接(例如，通过着眼于已知蛋白质或核酸的序列，制备具有与已知的蛋白质或核酸的序列相似(至少部分相似)的序列的蛋白质或核酸)或间接(例如，通过从生物获得与已知的蛋白质或核酸相关的蛋白质或核酸)从已知的蛋白质或核酸获得蛋白质或核酸。从已知的蛋白质或核酸“衍生”蛋白质或核酸的其他方法对于本领域技术人员来说是已知的。
双链RNA(“dsRNA”)、双链RNA干扰(“dsRNAi”)和RNA干扰(“RNAi”) 全都是指通过导入能够转录至少部分双链RNA分子的构建体而诱导的基因特异性沉默。“dsRNA分子”和“RNAi分子”都是指包含具有互补核苷酸序列的片段的RNA分子的区域，从而其可相互杂交和形成双链RNA。当导入细胞或生物时，此类双链RNA分子能够至少部分地减少存在于细胞或生物的细胞中的同类mRNA的水平。此外，可通过2005年2月11 日提交的国际申请号PCR/US2005/004681(其通过引用方式将其全文合并入本文)中描述的非常规重组(illegitimate recombination)和位点特异性重组在体内装配合适的DNA片段后产生dsRNA。
“外显子”是指该术语的常规意思，如表示编码表达的蛋白质的部分或全部的核酸分子(通常为DNA)的片段。
“FAD2”是指能够催化双键在从羧基端开始计数的第12个位点上插入脂肪酰基部分的基因或编码的蛋白质。FAD2蛋白也称为“Δ12去饱和酶”或“ω-6去饱和酶”。术语“FAD2-1”用于表示以特异方式在种子组织中天然表达的FAD2基因或蛋白质，术语“FAD2-2”用于表示 (a)与FAD2-1基因或蛋白质不同的和(b)在多种组织(包括种子)中天然表达的FAD2基因或蛋白质。代表性FAD2序列包括但不限于2002年 6月21日提交的美国专利申请号10/176,149和SEQ ID NO:1-6中所示的序列。
“FAD3”、“Δ15去饱和酶”或“ω-3去饱和酶”基因编码能够催化双键在从羧基端开始计数的第15个位点上插入脂肪酰基部分的酶 (FAD3)。术语“FAD3-1、FAD3-A、FAD3-B和FAD3-C”用于表示在多种组织(包括种子)中天然表达的FAD3基因家族成员。代表性FAD3序列包括但不限于2002年6月21日提交的美国专利申请号10/176,149和 SEQ ID NO:7-27中所示的序列。
“FATB”或“棕榈酰-ACP硫酯酶”是指编码能够在棕榈酰-ACP的 panthotheneprosthetic基团中催化碳-硫硫酯键(carbon-sulfur thioester bond)的水解断裂(作为其优选反应)的酶(FATB)的基因。还可用该酶催化其他脂肪酸-ACP硫酯的水解。代表性FATB-1序列包括但不限于2002年6月21日提交的美国临时申请号60/390,185、美国专利号5,955,329、5,723,761、5,955,650和6,331,664以及SEQ ID NO:28-37中所示的序列。代表性FATB-2序列包括但不限于SEQ ID NO: 42-47中所示的序列。
“脂肪酸”是指游离脂肪酸和脂肪酰基。
“基因”是指包括与基因产物的表达相关的5'启动子区域、任何内含子和外显子区域以及与基因产物的表达相关的3'或5'非翻译区的核酸序列。
“基因沉默”是指对基因表达的抑制或基因表达的下调。
“基因家族”是指在生物中编码展示相似的功能属性的蛋白质的两个或更多个基因，“基因家族成员”是在植物的遗传材料中发现的基因家族的任何基因，例如“FAD2基因家族成员”是植物的遗传材料中发现的任何FAD2基因。基因家族的两个成员的实例是FAD2-1和FAD2-2。可通过核酸序列的相似性额外地对基因家族进行分类。例如，基因FAD2 包括在该基因座上的等位基因。优选，基因家族成员在基因的编码序列部分中展示至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％的核酸序列同一性。
本文所使用的“基因型”是指细胞或生物的基因组成。
如本文所使用的，“异源”是指非天然地发生在一起。
如果作为人工操作的结果将核酸分子插入细胞或生物，那么无论如何间接，该核酸分子被认为是“导入的”。导入的核酸分子的实例包括但不限于已通过转化、转染、注射和投射导入细胞的核酸，和通过包括但不限于缀合、内吞和吞噬的方法导入生物的核酸。
“内含子”是指该术语的常规意思，如表示核酸分子(通常为DNA) 的不编码表达的蛋白质的部分或全部的片段，该片段在内源性条件下转录至RNA分子内，但在RNA转录成蛋白质之前被剪接出内源性RNA。“内含子dsRNA分子”和“内含子RNAi分子”都是指当导入细胞或生物时能够至少部分地减少存在于细胞或生物的细胞中的同类mRNA的水平的双链RNA分子，其中双链RNA分子展示与存在于细胞或生物中的基因的内含子的充分同一性，以减少包含该内含子序列的mRNA的水平。
“低饱和”大豆种子油的组成包含按重量计算3.6％至8％的饱和脂肪酸。
“低亚麻酸”油的组成包含低于按重量计算总脂肪酸的大约3％的亚麻酸。
“中油酸大豆种子”是具有按重量计算在55％至85％之间的存在于种子油组合物中的油酸的种子。
术语“非编码”是指核酸分子的不编码表达的蛋白质的部分或全部的序列。非编码序列包括但不限于内含子、启动子区域、3'非翻译区 (3'UTR)和5'非翻译区(5'UTR)。
术语“油的组成”是指脂肪酸的水平。
本文所使用的“表型”是指细胞或生物的可检测的特征，该特征是基因表达的表现。
与一个或多个核酸序列“有效连接的”的启动子能够驱动一个或多个核酸序列(包括多顺反子结构中排列的多个编码或非编码核酸序列) 表达。
“物理连接的”核酸序列是在单个核酸分子中发现的核酸序列。“植物”包括完整的植物、植物器官(例如，叶、芽、根等)、种子和所述植物的植物细胞和后代。术语“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、茎、配子体、孢子体、花粉和小胞子。“植物启动子”包括但不限于能够在植物细胞中发挥功能以促进mRNA的表达的植物病毒启动子、来源于植物的启动子和合成的启动子。
“多顺反子基因”或“多顺反子mRNA”是包含转录的核酸序列的任何基因或mRNA，所述核酸序列相应于一个以上被靶向抑制的基因的核酸序列。应理解，这样的多顺反子基因或mRNA可包含相应于内含子、 5'UTR、3'UTR、转运肽编码序列、外显子或其组合的序列和应理解，重组多顺反子基因或mRNA可以(例如不限于)包含相应于一个或多个来自一个基因的UTR和一个或多个来自第二基因的内含子的序列。
如本文所使用的，术语“R0”、“R0”、“R0代”、“R0代”是指通过再生转化的植物细胞获得的转化的植物。
如本文所使用的，术语“R1”、“R1”、“R1代”、“R1代”是指从自交的转基因R0植物获得的种子。R1植物是从R1种子生长起来的植物。
“种子特异性启动子”是指优先或只在种子中具有活性的启动子。“优先活性”是指在种子中显著大于在植物的其他组织、器官或细胞器中的启动子活性。“种子特异性”包括但不限于在种子的糊粉层、胚乳和/或胚中的活性。
“有义内含子抑制”是指通过导入有义内含子或其片段诱导的基因沉默。例如由Fillatti在PCT WO 01/14538A2中描述了有义内含子抑制。
一种以上试剂例如mRNA或蛋白质的“同时表达”是指试剂与另一种试剂在相同的时间表达。
这样的表达可以只是部分重叠，还可以在不同的组织中或以不同的水平发生。
“总的油水平”是指在不管脂肪酸的种类的情况下的脂肪酸的总累计量。如本文所用的，总的油水平不包括甘油主链(glycerol backbone)。
“转基因”是指与被导入生物的基因的表达相关的核酸序列。转基因包括但不限于生物中的内源性基因或在生物中非天然存在的基因。
“转基因植物”是以通过任何有性或无性方法帮助来自植物的转基因的传递的方式稳定地整合该转基因的任何植物。
“零饱和”大豆种子油的组成包含低于按重量计算3.6％的饱和脂肪酸。
“功能损失性突变”是在基因的编码序列中的突变，该突变引起基因产物(通常为蛋白质)的功能降低或完全消失。功能损失性突变可以例如由基因产物的截短(因为移码或无义突变导致的)引起。与具有功能损失性突变的等位基因相关的表型可以是隐性的或是显性的。
细胞或生物可具有一个以上编码特定酶的基因的家族，基因命名后面的大写字母(A、B、C)用于命名家族成员，即，FAD2-1A是与FAD2-1B 不同的基因家族成员。类似地，FAD3-1A、FAD3-1B和FAD3-1C表示 FAD3-1基因家族的不同成员。不同基因的功能损失性等位基因以后面跟随有减号的小写字母表示(即fad3-1b-和fad3-1c-分别表示FAD3-1B 和FAD3-1C基因的功能损失性等位基因)。
如本文所使用的，除非另外指出，任何所述的范围包含范围的端点。
A.减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因
减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的各种转基因可用于实施本发明的方法。通过抑制，至少部分减少、减少、显著减少或有效消除内源性FAD2基因的表达，植物细胞中可获得的FAD2蛋白的量减少，即FAD2 蛋白的稳定状态水平降低。因此，大豆细胞中FAD2蛋白的表达的减少可导致增加的单不饱和脂肪酸例如油酸(C18:1)的比例。在美国专利号 7,067,722中描述了包含减少内源性大豆FAD2-1的表达的转基因且产生具有增加的油酸的种子的大豆植物。
减少内源性大豆FAD2-1和内源性大豆FATB基因的表达的各种转基因可用于实施用于产生具有低亚麻酸、低饱和、中油酸表型的大豆植物的本发明的方法。通过抑制，至少部分地减少、减少、显著减少或有效消除内源性FATB基因的表达，植物细胞中可获得的FATB蛋白的量减少，即FATB蛋白的稳定状态水平降低。当植物细胞中FATB的量减少时，可提供减少的饱和脂肪酸例如棕榈酸和硬脂酸的量。因此，FATB的减少可导致增加的不饱和脂肪酸例如油酸(18:1)的比例。
本发明涉及用于减少:1)内源性大豆FAD2-1基因或2)内源性大豆 FAD2-1和FATB基因两者在大豆植物和种子中的表达的各种方法，包括，但不限于反义抑制、共抑制、核酶、有义和反义(双链RNAi)的组合、启动子沉默以及DNA结合蛋白例如锌指蛋白的使用。在WO98/53083、 WO 01/14538和美国专利5,759,829中描述了关于不同内源性植物基因的这些方法的一般实施。植物中对基因表达的抑制(也称为基因沉默) 在转录水平和转录后水平上发生。这些基因沉默机制中的某些机制在 DNA或RNA水平上与核酸的同源性相关。此类同源性是指相同种内或不同种间DNA或蛋白质序列的相似性。如果导入宿主细胞的DNA序列与内源性基因充分同源,那么基因沉默发生，即导入的DNA序列的转录将诱导内源性基因的转录或转录后基因沉默。为了实施本发明，在大豆 FAD2-1或FATB编码区或非编码区的DNA序列的整个长度上或与大豆 FAD2-1或FATB编码区或非编码区的互补的核酸序列具有至少50％、大约60％或大约70％的同一性的DNA序列，当作为转基因导入大豆植物中时，具有用于抑制FAD2-1或FATB的稳定状态表达水平的充分同源性。本发明的转基因更优选包括在它们的整个长度上与大豆FAD2-1或FATB 编码区或非编码区或与大豆FAD2-1或FATB编码区或非编码区的互补的核酸序列至少80％同一的、至少85％同一的、至少90％同一的、至少95％同一的、至少97％同一的、至少98％同一的、至少99％同一的或100％同一的的DNA序列。具有上面指出的对大豆FAD2-1或FAT基因同一的水平的DNA序列可以是编码序列、内含子序列、3'UTR序列、5'UTR序列、启动子序列、其他非编码序列或上述序列的任何组合。内含子可位于外显子之间或位于植物基因的5'或3'UTR内。编码序列优选是不编码具有FAD2酶促活性的蛋白的蛋白质编码框的部分。然而，应认识到在某些情况下，例如在共抑制的情况下，编码具有酶促活性的FAD2或FATB 蛋白的DNA序列可用于减少内源性大豆FAD2-1或FATB基因的表达。
还应理解，具有上面指定的对大豆FAD2-1基因的同一性水平的用于本发明的方法的DNA序列可来源于任何大豆FAD2基因、大豆FAD2-1 A基因(SEQ ID NO:4)、大豆FAD2-1A内含子(SEQ ID NO:1)、大豆FAD2-1 B内含子(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)、大豆FAD2-2基因、大豆FAD2-1 基因的等位基因、大豆FAD2-2基因的等位基因和来源于得自其他豆科植物例如苜蓿属的种(Medicago sp.)、豌豆属的种(Pisum sp)、蚕豆属的种(Vicia sp.)、菜豆属的种(Phaseolus Sp)和豌豆的FAD2基因。因此很清楚，具有指定的对大豆FAD2-1序列的同一性水平的DNA 序列可得自多个来源。还可通过合成获得具有指定的序列同一性水平的DNA序列。
类似地，也应理解具有上述指定的对大豆FATB基因的同一性水平的用于本发明的方法的DNA序列可来源于任何大豆FATB基因、大豆 FATB-1基因(SEQ ID NO:28)、大豆FATB-1内含子(SEQ ID NO:29-35)、大豆FATB-1 5'UTR(SEQ ID NO:36)、大豆FATB-1 3'UTR(SEQID NO:37)、大豆FATB-2基因(SEQ ID NO:43)、大豆FATB-1的等位基因、大豆FATB-2 基因的等位基因和来源于得自其他豆科植物例如苜蓿属的种、豌豆属的种、蚕豆属的种、菜豆属的种和豌豆属的种的FATB基因。因此很清楚，具有指定的对大豆FAD2-1序列的同一性水平的DNA序列可得自多个来源。还可通过合成获得具有指定的序列同一性水平的DNA序列。
在本发明的方法中，经特定设计以产生与FAD2-1基因具有同源性的双链RNA(dsRNA)分子的转基因还可诱导FAD2-1序列特异性沉默和用于减少内源性大豆FAD2-1基因的表达。可通过间隔区序列，优选促进 dsRNA分子形成的间隔区序列将dsRNA的有义链序列与反义链序列分开。这样的间隔区序列的实例包括Wesley等人,Plant J.,27(6):581 -90(2001),和Hamilton等人,Plant J.,15:737-746(1988)中所示的间隔区序列。在优选方面，间隔区序列能够形成Wesley等人(同上)中举例说明的发夹结构。本说明书中的特别优选间隔区序列是植物内含子或其部分。特别优选的植物内含子是可剪接的内含子。可剪接(Spliceable)的内含子包括但不限于选自PDK内含子、FAD3-1A或 FAD3-1B内含子#5、FAD3内含子#1、FAD3内含子#3A、FAD3内含子#3B、 FAD3内含子#3C、FAD3内含子#4、FAD3内含子#5、FAD2内含子#1和FAD2-2内含子的内含子。任选地，可通过DNA的间隔区片段将有义方向的非编码分子与相应的反义方向的分子隔开。间隔区片段可以是基因片段或人造DNA。可使间隔区片段变短以促进形成发夹dsRNA或使之变长以促进不具有发夹结构的dsRNA。如US2005/0176670A1中所公开的，可通过延长有义或反义分子中的一个分子的长度来提供间隔区。可选择地，如美国专利申请2005/0183170中所公开，可在插入植物基因组后产生右边界-右边界(“RB-RB”)序列。
本发明的转基因通常包含与上述减少内源性大豆FAD2-1或FATB 基因的表达的DNA序列有效连接的在植物细胞中具有功能的启动子或植物启动子。这样的载体的设计通常在本领域技术人员的能力之内(参见，例如，Plant Molecular Biology:A LaboratoryManual,Clark(ed.), Springer,New York(1997))。然而，应认识到，构建体或载体还可包含可在插入后利用内源性启动子的无启动子基因。在文献中描述了许多在植物细胞中具有活性的启动子，例如CaMV 35S和FMV启动子。CaMV 35S 和FMV 35S启动子的增强的或加倍的(duplicated)形式还可用于表达上述减少内源性FAD2-1基因的表达的DNA序列(Odell等人,Nature 313: 810-812(1985)；美国专利号5,378,619)。在例如美国专利5,378,619、 5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,608,144、5,614,399、 5,633,441、5,633,435和4,633,436中描述了可使用的另外的启动子。此外，可将组织特异性增强子与基础植物启动子一起使用。基础启动子通常包含“TATA”盒和mRNA加帽位点但缺少高水平表达所必需的增强子。
用于本发明的转基因的特别优选启动子是在种子或果实中表达减少内源性大豆FAD2-1或FATB基因的表达的DNA序列的启动子。事实上，在优选实施方案中，所用的启动子是种子特异性启动子。此类种子特异性启动子的实例包括来自基因例如油菜籽蛋白(Kridl等人,Seed Sci. Res.1:209-219(1991))、菜豆蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶、7Sα、 7Sα'(Chen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:8560-8564(1986))、 USP、arcelin和油质蛋白的5'调控区。用于在种子中表达的优选启动子是7Sα、7Sα'、油菜籽蛋白和FAD2-1A启动子。
构建体和载体通常还包括与减少内源性大豆FAD2-1和FATB基因的表达的上述DNA序列有效连接的3'转录终止子或3'多腺苷酸化信号。转录终止信号可以是在植物中具有功能的任何转录终止信号或任何植物转录终止信号。优选转录终止信号包括但不限于豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'序列、油菜(Brassica)油菜籽蛋白3'序列、tml 3' 序列和农杆菌(Agrobacterium)肿瘤诱导(Ti)质粒胭脂碱合酶(NOS) 基因3'序列。应理解，该组示例性多腺苷酸化区域是非限定性的，本领域技术人员可在本发明的实施中使用本文未明确引用的其他多腺苷酸化区域。
最后，还应认识到，可将本发明的转基因插入还包含编码选择标记或可评分(scoreable)标记的基团的植物转化载体。选择标记基因可以是编码新霉素磷酸转移酶蛋白、膦丝菌素乙酰转移酶 (phosphinothricin acetyltransferase)蛋白、抗草甘膦的5-烯醇- 丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白、潮霉素磷酸转移酶蛋白、二氢蝶酸合酶蛋白、对磺酰脲类不敏感的乙酰乳酸合成酶蛋白、对阿特拉津不敏感的Q蛋白、能够降解溴苯腈的腈水解酶蛋白、能够降解茅草枯的脱卤酶蛋白、2,4-二氯苯氧乙酯单氧合酶蛋白、对氨甲碟呤不敏感的二氢叶酸还原酶蛋白和对氨乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合酶蛋白的基因。与各基因结合使用的相应的选择试剂可以是：新霉素(用于新霉素磷酸转移酶蛋白选择)、膦丝菌素(用于膦丝菌素乙酰转移酶蛋白选择)、草甘膦(用于抗草甘膦的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS)蛋白选择)、潮霉素(用于潮霉素磷酸转移酶蛋白选择)、磺胺嘧啶(用于二氢蝶酸合酶蛋白选择)、氯磺隆(用于对磺酰脲类不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白选择)、阿特拉津(用于对阿特拉津不敏感的Q蛋白选择)、溴苯腈(用于腈水解酶蛋白选择)、茅草枯(用于脱卤素酶蛋白选择)、2,4-二氯苯氧乙酸(用于2,4-二氯苯氧乙酯一氧化物酶蛋白选择)、氨甲蝶呤(用于对氨甲蝶呤不敏感的二氢叶酸还原酶蛋白选择)或氨乙基半胱氨酸(用于对氨乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合酶蛋白选择)。优选选择标记基因是赋予对除草剂草甘膦的抗性的CP4EPSPS基因。可评分标记基因可以是编码β-葡糖苷酸酶蛋白、绿色萤光蛋白、黄色萤光蛋白、β-半乳糖苷酶蛋白、来源于luc基因的荧光素酶蛋白、来源于 lux基因的荧光素酶蛋白、唾液酸酶蛋白、链霉素磷酸转移酶蛋白、胭脂碱合酶蛋白、章鱼碱合酶蛋白或氯霉素乙酰基转移酶蛋白的基因。
上述核酸分子是实现本发明的目的、特征和优点的实施方案。本发明不意欲限定于举例说明的实施方案。第一和第二组DNA序列在核酸分子内的序列排列不限定于举例说明和描述的排列，可以以本文描述的和在附图中举例说明的适合于达到本发明的目的、特征和优点的任何方式对其进行改变。
B.转基因生物和用于产生所述生物的方法
可将本发明的任何核酸分子和构建体以永久性和短暂性的方式导入大豆植物或植物细胞。用于将DNA导入大豆植物细胞的方法和技术对于本领域技术人员来说是熟知的，事实上可通过其将核酸分子导入细胞的任何方法适合用于本发明。合适的方法的非限定性实例包括：化学方法；物理方法例如显微注射、电穿孔、基因枪、微粒轰击以及真空浸渗；病毒载体；和受体介导的机制。还可使用细胞转化的其他方法，其包括但不限于通过直接将DNA转移入花粉、通过直接将DNA注射入植物的生殖器官或通过将DNA直接注射入未成熟的胚的细胞中然后再水化干燥的胚从而将DNA导入植物。
农杆菌介导的转移是用于将基因导入植物细胞的广泛应用的系统。参见，例如，Fraley等人,Bio/Technology 3:629-635(1985)；Rogers 等人,Methods Enzymol.153:253-277(1987)。通过边界序列确定待转移的DNA的区域，通常将间插DNA插入植物基因组。Spielmann等人, MoI.Gen.Genet.205:34(1986)。现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌中复制，从而允许进行方便的操作。Klee等人, In:Plant DNAInfectious Agents,Hohn和Schell(eds.), Sphnger-Verlag,New York,pp.179-203(1985)。在美国专利号 7,002,058中明确描述了农杆菌介导的大豆的转化。
通常可这样获得转基因植物，即通过将目的基因(即，在这种情况下为减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因或减少FAD2-1基因和FATB基因的表达的转基因)与选择标记基因连接，通过上述方法中的任一方法将连接的转基因导入植物细胞、植物组织或植物，然后在需要所述选择标记基因表达以便植物生长的条件下再生或恢复转基因植物。在本发明说明书的前面部分已描述了示例性选择标记基因和相应的选择试剂。
还可这样获得转基因植物，即通过将目的基因(即在这种情况下为减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因或减少FAD2-1基因和 FATB基因的表达的转基因)与可评分标记基因连接，通过上述方法中的任一种方法将连接的转基因导入植物细胞，然后从就可评分标记基因的表达检测为阳性的转化的植物细胞再生转基因植物。在本发明说明书的前面部分已描述了示例性可评分标记基因。
植物从单个植物原生质体转化体或从各种转化的外植体的再生、发育和培养在本领域内是熟知的。通常参见，Maliga等人,Methods in Plant Molecular Biology,ColdSpring Harbor Press(1995)； Weissbach和Weissbach,In:Methods for PlantMolecular Biology, Academic Press,San Diego,CA(1988)。本发明的植物可以是植物的部分或从育种程序产生的，还可使用无融合生殖对其进行再生。用于产生无性生殖的植物的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，美国专利 5,811,636。
本文涉及的获得低亚麻酸/中油酸大豆植物的特定方法使得必需用减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因直接转化包含内源性大豆 FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆品种。包含内源性大豆 FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆品种的实例包括A5、 C1640、6P248、N98-44、T27111、T27190、T26767、T26830和SoyolaTM大豆(参见美国专利申请20060107348和Burton等人,Crop Sci. 44:687-688,2004)。也涉及，可用减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因直接转化其他大豆品系，所述大豆品系包含内源性大豆FAD3 基因中的至少一个功能损失性突变和具有通过美国专利申请 20060107348中公开的标记辅助育种方法产生的农艺上优良的生长和/ 或生产特征。可选择地，还涉及，可通过美国专利申请号11/239,676 中公开的标记辅助育种方法产生大豆品系，所述大豆品系包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变且易于转化。还可用减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因直接转化大豆植物，所述大豆植物含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变且易于转化。可通过本发明的方法直接转化的三种其他的低亚麻酸大豆包括BARC12 (其为决定子成熟(determinant maturity)组#3品系)、VistiveTM大豆品系(Monsanto,St.Louis,MO.,USA)或为黄色种脐L2NUL品系的0137648/01AHKW-38。
还涉及，在本发明的方法中用转基因直接转化的低亚麻酸大豆植物可来源于包含含有赋予减少的亚麻酸含量的fad3-1b-、fad3-1c-或 fad3-1b-和fad3-1c-等位基因的大豆植物基因组区域的大豆种质。与低亚麻酸大豆表型相关的此类单核苷酸多态性描述于美国专利申请号 11/239,676中。在某些实施方案中，赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征在于FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸 2021的位点上的单核苷酸多态性。在另一个实施方案中，赋予低亚麻酸含量的表型的大豆基因区域的特征在于FAD3-1C基因序列中相应于 SEQ ID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743 的位点上的单核苷酸多态性。在另一个实施方案中，赋予低亚麻酸含量的表型的大豆基因区域的特征在于FAD3-1C启动子中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位点上的单核苷酸多态性。在另一个实施方案中，赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征在于FAD3-1C基因中的缺失。赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征还可在于FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的单核苷酸多态性和FAD3-1c基因序列中的缺失。赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征还可在于 FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的单核苷酸多态性和FAD3-1C启动子中的多态性，例如相应于SEQ ID NO:63的334、364、385、387、393、729或747的位点上的单核苷酸多态性。包含大豆FAD3-1C基因中的缺失的大豆种质用于这些方法的实施中，并且可从包括但不限于大豆品系6P248、T27111、T27190、 T26767、T26830和A5的大豆品系获得所述大豆种质，如美国专利申请号11/239,676中所描述的。
通过任何方法检测单核苷酸多态性，所述方法包括美国专利申请号 11/239,676中所描述的PCR、单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳法、切割片段长度多态性分析和/或DNA测序。可选择地，可通过选自单碱基延伸反应(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、测序、通用PCR、等位基因特异性延伸、杂交、质谱、连接、延伸连接和游离核酸内切酶(Flap Endonuclease)介导的测定的任一个测定法来检测单核苷酸多态性。在美国专利申请号11/239,676中描述了用于检测上述FAD3-1B和MD3-7C的遗传多态性的引物和方法。可通过方法(包括但不限于PCR、杂交、切割片段长度多态性分析和/或基于DNA测序的方法)检测缺失例如FAD3-1C基因中的缺失。
上述直接转化法还可用于获得低亚麻酸/低饱和/中油酸大豆植物。在这些方法中，用减少内源性大豆FAD2-1和内源性大豆FATB基因的表达的转基因直接转化上述低亚麻酸大豆植物，以产生具有低亚麻酸、低饱和、中油酸表型的大豆植物。
可用于植物转化或转染的转基因可以是减少：1)内源性大豆 FAD2-1基因或2)内源性大豆FAD2-1和FATB基因的表达的转基因中的任何基因。还涉及，包含减少：1)内源性大豆FAD2-1基因或2)内源性大豆FAD2-1和FATB基因的表达的转基因的载体还可包含额外的转基因或将其与额外的转基因进行遗传组合。例如，在美国专利申请号 11/239,676中描述了表达影响油的组成、病原抗性、产量、形态学、蛋白质组成、氨基酸组成、淀粉组成和植酸盐水平的其他基因的额外的转基因，所述转基因可与本文描述的转基因和低亚麻酸突变体组合。
本发明不意欲限定于举例说明的实施方案。在详述的部分A中已描述了示例性核酸分子，下面进一步描述非限定性示例性核酸分子并且在图1-4中和实施例中对其进行举例说明。
C.包含转基因的大豆植物的杂交
在另一个方面，可将本发明的植物与另一种转基因或非转基因植物杂交。可将植物与另一种植物杂交，所述另一种植物具有包含改变的水平的脂肪酸的油的组成，例如但不限于，具有拥有更低水平的亚麻酸的油的组成的品种。在优选实施方案中，将本发明的植物与具有低于按重量计算3％的亚麻酸的品种杂交。在本发明的另一个实施方案中，将本发明的植物与具有高于按重量计算20％的硬脂酸的另一种植物杂交。此类具有改变的水平的脂肪酸的植物在本领域内是已知的，且描述于例如 Hawkins和Kridl(1998)Plant Journal13(6):743-752和美国专利号6,365,802中。
特别地，本发明的方法涉及大豆植物(其包含减少内源性大豆 FAD2-1基因的表达或减少内源性大豆FAD2-1和FATB基因的表达的转基因)与包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆品种的杂交。包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆品种的实例包括A5、C1640、6P248、N98-44、T27111、T27190、 T26767、T26830和SoyolaTM大豆(参见美国专利申请20060107348和 Burton等人,Crop Sci.44:687-688,2004)。还涉及，可将其他大豆品系(其包含内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变和具有通过美国专利申请20060107348中公开的标记辅助育种方法产生的农艺学上优良的生长和/或生产特征)与包含减少内源性大豆FAD2-1基因的表达的转基因的大豆植物杂交。可用于本发明的方法的三种其他低亚麻酸杂交亲本包括BARC12(其为决定子成熟组#3品系)、VistiveTM大豆品系或0137648/01AHKW-38(其为黄色种脐L2NUL品系)。
还涉及，用于与转基因杂交的低亚麻酸大豆植物可来源于包含含有 fad3-1b-、fad3-1c-或fad3-1b-和fad3-1c-等位基因(所述基因赋予减少的亚麻酸含量)的大豆植物基因组区域的大豆种质。在美国专利申请号11/239,676中描述了与低亚麻酸大豆表型相关的此类单核苷酸多态性。在某些实施方案中，赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征在于FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的单核苷酸多态性。在另一个实施方案中，赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征在于FAD3-1C基因序列中相应于SEQ ID NO:62的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位点上的单核苷酸多态性。在另一个实施方案中，赋予低亚麻酸含量的表型的大豆基因区域的特征在于FAD3-1C启动子中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位点上的单核苷酸多态性。在另一个实施方案中，赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征在于FAD3-1C基因中的缺失。赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征还可在于FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的单核苷酸多态性和FAD3-1C基因序列中的缺失。赋予低亚麻酸含量表型的大豆基因组区域的特征还可在于FAD3-1B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸2021的位点上的单核苷酸多态性和FAD3-1C启动子中的多态性，例如相应于SEQ ID NO:63的334、 364、385、387、393、729或747的位点上的单核苷酸多态性。包含大豆FAD3-1C基因中的缺失的大豆种质用于这些方法的实施中，并且可从包括但不限于大豆品系6P248、T27111、T27190、T26767、T26830 和A5的大豆品系获得所述大豆种质，如美国专利申请号11/239,676中所描述的。实施例的表3和4描述了特异的多态性与展示低亚麻酸表型的特异大豆种质或大豆品系的关系。
不受限于理论，进一步指出，某些FAD3-1C基因中的某些多态性和缺失潜在地部分促成由携带这些多态性或缺失的大豆植物展示的低亚麻酸表型。SEQ ID NO:61中的2021位点上的SNP是将氨基酸残基从组氨酸改变成酪氨酸的有义突变(sense mutation)。已发现组氨酸残基在许多参与去饱和的基因中是至关重要的。发现的该特定的SNP在低亚麻酸品系中引起基序His-Val-Ile-His-His突变为 His-Val-Ile-His-Tyr。基序与低亚麻酸表型相关且是在具有该多态性的大豆中观察到的减少的亚麻酸表型的可能原因。
可通过任何方法检测单核苷酸多态性，所述方法包括美国专利申请号11/239,676中所描述的PCR、单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳法、切割片段长度多态性分析和/或DNA测序。可选择地，可通过选自单碱基延伸反应(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、测序、通用PCR、等位基因特异性延伸、杂交、质谱、连接、延伸连接和游离核酸内切酶介导的测定的任一测定法检测单核苷酸多态性。在美国专利申请号11/239,676中描述了用于检测上述FAD3-1B和MD3-7的C 遗传多态性的引物和方法。可通过方法(包括但不限于PCR、杂交、切割片段长度多态性分析和/或基于DNA测序的方法)检测缺失例如 FAD3-1C基因中的缺失。
上述杂交方法还可用于获得低亚麻酸/低饱和/中油酸大豆植物。在这些方法中，将上述低亚麻酸大豆植物与包含转基因的大豆植物杂交以产生具有低亚麻酸、低饱和脂肪酸、中油酸表型的大豆植物，所述转基因减少内源性大豆FAD2-1和内源性大豆FATB基因的表达。
还涉及，可通过连接赋予对除草剂的抗性的选择标记来帮助转基因与低亚麻酸大豆品系的杂交。例如，在对于转基因是杂合的大豆植物与对于赋予低亚麻酸性状的等位基因是纯合的或杂合的植物的杂交中，可通过除草剂处理选择对于转基因是杂合的F1后代。此外，可通过将所述多个F2植物经历针对转基因的除草剂选择来就对于所述转基因是纯合的F2大豆植物而富集从对于转基因是杂合的F1植物产生的F2植物。还可将可区分对于转基因是杂合的或纯合的大豆植物的分子标记用于鉴定对于转基因插入是纯合的大豆植物。
可通过天然或机械技术杂交大豆植物(Glycine max L.)。通过自花传粉或通常借助于传粉生物的天然异花传粉在大豆中进行天然传粉。在天然或人工杂交中，开花和开花时间是重要的考虑因素。大豆是短日照植物，但就对光周期的敏感性存在相当多的遗传变异。开花的临界昼长的范围从对于适合于热带纬度的基因型的大约13小时至对于在更高纬度生长的对光周期不敏感的基因型的24小时。大豆似乎在出芽后连续9天对昼长不敏感。比临界昼长更短的光周期需要7至26天来完成开花诱导。
大豆的花通常在花冠开放的当天自花传粉。柱头在开花前大约1 天接受花粉，如果没有除去花瓣在开花后2天内保持接受花粉。9个雄蕊的丝融合在一起，离旗瓣最近的那个是游离的。雄蕊在开花前大约1 天在柱头下面形成环，然后它们的丝开始快速延长并且将花药升高至柱头周围。花药在开花的当天裂开，花粉粒落在柱头上，在10个小时内花粉管到达子房并且完成受精。自花传粉在没有操作花的情况下在大豆中天然发生。对于两种大豆植物的杂交，通常优选(尽管不是必需的) 使用人工杂交。在人工杂交中，在来自花的花粉成熟之前对在杂交中用作雌性的花进行人工杂交传粉，从而防止了自花传粉，或可选择地，使用本领域内已知的技术除去花的雄性部分。用于除去大豆花的雄性部分的技术包括，例如，雄性部分的物理去除、赋予雄性不育的遗伟因子的使用和对雄性部分使用化学杀配子剂。
在对雌花去雄和不去雄的情况下，通过用镊子从雄性亲本的花取下雄蕊和雌蕊，然后用花药轻轻地刷雌花的柱头来进行人工传粉。可通过除去前萼(front sepal)和龙骨瓣(keel petal)，或用闭合的摄子刺穿龙骨，从而允许它们开放，以推开花瓣来接近雄蕊。用花药在柱头上粉刷使它们破裂，当柱头上清晰可见花粉时，获得最高百分比的成功杂交。可通过在粉刷柱头之前轻拍花药来检查花粉脱落。当条件不利时，可能必须使用几个雄花以获得合适的花粉脱落，或可使用相同雄花给几个具有良好的花粉脱落的花传粉。
遗传上的雄性不育在大豆中是可获得的，其可在本发明的上下文中用于帮助杂交，特别地用于轮回选择程序。杂交封闭(crossing block) 的完全隔离所需要的距离不清楚；然而，当雄性不育植物离外源花粉源 12m或更长距离时异型杂交(out-crossing)低于0.5％(Boerma和 Moradshahi,Crop ScL,15:858-861,1975)。杂交封闭的边界上的植物可能与外源花粉保持最高的异型杂交，可在收获时除去其以使污染减少至最少。
在收获后，通常在不高于38℃的温度下风干豆荚直至种子包含13％或更少的水份，然后用手取出种子。如果相对湿度为50％或更低可将种子在大约25℃下满意地贮存直至一年。在潮湿气候中，如果不将种子干燥至7％的水分且在室温下贮存在密闭的容器中，萌发百分率将快速降低。通过将种子干燥至7％的含水量和在10℃或更低的温度下将其贮存在保持50％的相对湿度的房间中或贮存在密闭的容器中来最佳地进行在任何气候下的长期贮存。
F.本发明的产品
本发明的植物可以以完整或部分的形式使用。优选植物部分包括生殖部分或贮藏部分。本文所使用的术语“植物部分”包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉、根、块茎、茎、叶、柄(stalk)、果实、浆果、坚果、树皮、豆荚、种子和花。在本发明的特别优选实施方案中，植物部分是种子。
可加工本发明的任何植物或其部分以产生饲料、粗粉、蛋白质或油制品。用于该目的的特别优选植物部分是种子。在优选实施方案中，饲料、粗粉、蛋白质或油制品经设计用于家畜类动物、鱼或人或任何组合。产生饲料、粗粉、蛋白质和油制品的方法在本领域内是已知的。参见，例如美国专利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、 6,005,076、6,146,669和6,156,227。在优选实施文案中，蛋白质制品是高蛋白制品。这样的高蛋白制品优选具有高于5％w/v，更优选高于 10％w/v和甚至更优选高于15％w/v的蛋白质含量。
在优选油制品中，油制品是具有来源于本发明的植物或其部分的高于5％w/v、更优选高于10％w/v和甚至更优选高于15％w/v的油含量的高油制品。在优选实施方案中，油制品是液体且体积大于1、5、10 或50升。本发明提供从本发明的植物产生的油或通过本发明的方法产生的油。这样的油可展示增强的氧化稳定性。此外，这样的油可以是任何所得产品的少量或主要组分。
此外，可将这样的油与其他油混合。在优选实施方案中，从本发明的植物产生的油或通过本发明的方法产生的油按体积或重量计算构成了大于0.5％、1％、5％、10％、25％、50％、75％或90％的任何产品的油组分。在另一个实施方案中，可将油制品混合，所述油制品按体积计算可构成大于10％、25％、35％、50％或75％的混合物。可将从本发明的植物产生的油与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。
可将植物的种子置于容器中。如本文所使用的，容器是能够盛装此类种子的任何物体。容器优选盛装超过大约500、1,000、5,000或25,000 粒种子，其中至少大约10％、25％、50％、75％或100％的种子来源于本发明的植物。本发明还提供了盛装超过大约10,000粒，更优选大约20,000 粒和甚至更优选大约40,000种子的容器，其中超过大约10％，更优选大约25％，更优选大约50％和甚至，更优选大约75％或90％的种子是来源于本发明的植物的种子。本发明还提供了盛装超过大约10kg，更优选大约25kg和甚至，更优选大约50kg的种子的容器，其中超过大约10％，更优选大约25％，更优选大约50％和甚至，更优选大约75％或90％的种子是来源于本发明的植物的种子。
通过本发明的方法产生的大豆种子可包含不同的油组成。由通过本发明的方法产生的大豆种子产生的油在下面称为“本发明的油”。
本发明的优选油具有低饱和油组成，或零饱和油组成。在其他优选实施方案中，本发明的油具有增加的油酸水平、减少的饱和脂肪酸水平和减少的多不饱和脂肪酸水平。在进一步优选的实施方案中，本发明的油具有增加的油酸水平和减少的饱和脂肪酸水平。在一个优选实施方案中，所述油是大豆油。本文使用的脂肪酸含量或脂肪酸水平的百分数指的是按重量计算的百分数。
在第一实施方案中，本发明的油优选具有为55至80％的油酸、大约12至43％的多不饱和脂肪酸和2至8％的饱和脂肪酸的油组成；更优选具有为55至80％的油酸、大约14至42％的多不饱和脂肪酸和3至6％饱和脂肪酸的油组成；和甚至更优选具有为55至80％的油酸、大约16.5 至43％的多不饱和脂肪酸和2至3.6％的饱和脂肪酸的油组成。
在第二实施方案中，本发明的油优选具有为65至80％的油酸、大约12至33％的多不饱和脂肪酸和2至8％的饱和脂肪酸的油组成；更优选具有为65至80％的油酸、大约14至32％的多不饱和脂肪酸和3至6％饱和脂肪酸的油组成；和甚至更优选具有为65至80％的油酸、大约16.5 至33％的多不饱和脂肪酸和2至3.6％的饱和脂肪酸的油组成。
在第三实施方案中，本发明的油优选具有为大约42至大约85％的油酸和大约8％至1.5％的饱和脂肪酸的油组成。
在第四实施方案中，本发明的油具有为大约42至大约85％的油酸、大约8％至大约1.5％的饱和脂肪酸、按重量计算大约6％至大约15％的亚麻酸的油组成；更优选具有为大约42至大约85％的油酸、大约8％至大约1.5％的饱和脂肪酸、按重量计算低于35％的亚麻酸的油组成；甚至更优选具有为大约42至大约85％的油酸、大约8％至大约1.5％的饱和脂肪酸、按重量计算大约9％的亚麻酸的油组成。
在第五实施方案中，本发明的油具有为大约50％至大约85％的油酸、大约8％至大约1.5％的饱和脂肪酸的油组成；更优选大约50％至大约85％的油酸、大约8％至大约1.5％的饱和脂肪酸、按重量计算大约4％至大约 14％的亚麻酸的油组成；更优选具有为大约50％至大约85％的油酸、大约 8％至大约1.5％的饱和脂肪酸、按重量计算低于35％的亚麻酸的油组成；和甚至更优选具有为大约42％至大约85％的油酸、大约8％至大约1.5％的饱和脂肪酸、按重量计算大约2％至大约45％的亚麻酸的油组成。
在另一个实施方案中，本发明的油具有为大约65-80％的油酸、大约3-8％的饱和脂肪酸和大约12-32％的多不饱和脂肪酸的油组成。在另一个实施方案中，本发明的油具有为大约65-80％的油酸、大约2-3.5％的饱和脂肪酸和大约16.5-33％的多不饱和脂肪酸的油组成。
在特别优选实施方案中，本发明的油具有为大约47-83％的油酸和大约5％的饱和脂肪酸；大约60-80％的油酸和大约5％的饱和脂肪酸；大约50-85％的油酸和大约2-7％的饱和脂肪酸；大约55-85％的油酸和大约 2.5-7％的饱和脂肪酸；大约47-88％的油酸和大约3-7％的饱和脂肪酸；大约43-85％的油酸和大约5-7％的饱和脂肪酸；大约81-85％的油酸和大约5％的饱和脂肪酸；大约74-83％的油酸和大约6％的饱和脂肪酸；大约65-87％的油酸和大约6％的饱和脂肪酸；大约66-80％的油酸和大约6％的饱和脂肪酸；大约42-77％的油酸和大约5-8％的饱和脂肪酸；大约60-77％的油酸和大约6％的饱和脂肪酸；大约70-81％的油酸和大约5-7％的饱和脂肪酸；大约52-71％的油酸和大约5-7％的饱和脂肪酸；大约 44-71％的油酸和大约6％的饱和脂肪酸；大约61-71％的油酸和大约8％的饱和脂肪酸；大约57-71％的油酸和大约7％的饱和脂肪酸；大约23-58％的油酸和大约8-14％的饱和脂肪酸；大约20-70％的油酸和大约6％的饱和脂肪酸；大约21-35％的油酸和大约5-6％的饱和脂肪酸；或大约 19-28％的油酸和大约5％的饱和脂肪酸的油组成。
在另一个实施方案中，油酸的百分数是50％或更大、55％或更大、 60％或更大、65％或更大、70％或更大、75％或更大、或80％或更大、或在 50至80％、55至80％、55至75％、55至65％、60至85％、60至80％、60 至75％、60至70％、65至85％、65至80％、65至75％、65至70％或69 至73％的范围内。本发明的油中油酸含量的适合的百分数范围还可包括其中下限选自下列百分数：百分之50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79或80和上限选自下列百分数：百分之60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90的范围。
在其他实施方案中，本发明的油中的亚麻酸的百分数是10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4.5％或更少、4％或更少、3.5％或更少、3％或更少、3.0％或更少、2.5％或更少或 2％或更少；或在0.5至2％、0.5至3％、0.5至4.5％、0.5％至6％、3至 5％、3至6％、3至8％、1至2％、1至3％或1至4％的范围内。
在其他实施方案中，本发明的油组成中的饱和脂肪酸的百分数为 15％或更少、14％或更少、13％或更少、12％或更少,11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少或3.6％或更少；或在2至3％、2至3.6％、2至4％、2至8％、3至15％、 3至10％、3至8％、3至6％、3.6至7％、5至8％、7至10％或10至15％的范围内。
在其他实施方案中，本发明的油中的饱和脂肪酸包括棕榈酸和硬脂酸的组合。在一个实施方案中，饱和脂肪酸的百分数在大约10％或更少、大约9％或更少、大约8％或更少、大约7％或更少、大约6％或更少、大约 5％或更少、大约4.5％或更少、大约4％或更少、大约3.5％或更少、大约3％或更少、大约3.0％或更少、大约2.5％或更少或大约2％或更少的范围内；或在0.5至2％、0.5至3％、0.5至4.5％、0.5至6％、0.5至7％、 0.5至8％、0.5至9％、1至4％、1至5％、1至6％、1至7％、1至8％、1 至9％、1.5至5％、1.5至6％、1.5至7％、1.5至8％、1.5至9％、2至 5％、2至6％、2至7％、2至8％、2至9％、3至5％、3至6％、3至7％、3 至8％、3至9％、4至7％、4至8％、4至9％、5至7％、5至8％和5至9％的范围内。在这些实施方案中，本发明的油中的饱和脂肪酸含量的适合的百分数范围还包括其中下限选自下列百分数：百分之0.5、1、1.5、 2.、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5和上限选自百分数:百分之11、10、9、8、7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1或 0.5的范围。
G.抑制的调控
本发明的另一个实施方案涉及调控基因抑制水平的方法。基因抑制的调控可导致或更多或更少的基因抑制。可通过将本发明的构建体插入植物基因组引起对基因产物的抑制。类似地，可通过将本发明的构建体插入植物基因组来产生基因抑制的调控。调控基因抑制的方法的其他实例包括，但不限于，反义技术、共抑制、RNA干扰(dsRNAi)、转基因动物、杂交和使用本发明的构建体的核酶。以举例说明的方式提供下列实施例，所述实施例不意欲限定本发明。
可通过改变用于抑制的可转录DNA的长度来调控对基因的抑制，所述序列来源于被靶向抑制的基因。通过使用转录后基因沉默机制，许多方法可用于抑制基因。不受限于理论，这些方法据认为共同具有与另一个RNA分子杂交的RNA分子的表达。令人惊奇地，可有利地使用特定长度的RNA分子以调控或减轻对被靶向的内源性基因的稳定状态的表达水平的抑制。
FAD2-1的基因抑制导致提高的油酸水平和减少的亚油酸水平。当FAD2-1被严重抑制时，油酸的水平可高于65％，这导致棕榈酸和亚麻酸水平减少。例如，当抑制FAD2-1时，油酸水平可达到85％，混合的棕榈酸和硬脂酸水平减少至大约10％。类似地，FATB的下调导致饱和脂肪酸 (主要是棕榈酸)的水平减少。当抑制FAD2和FATB以使油酸水平为大约85％时，饱和脂肪酸水平为大约10％。当抑制FAD2和FATB以使油酸水平高于85％时，饱和脂肪酸水平可下降低于10％。
在本发明的指导下，饱和脂肪酸水平可减少至低于10％而不使油酸增加至超过85％。在一个实施方案中，通过减少导入植物的FAD2-1内含子的长度来调控对FAD2的抑制。对FAD2的较少抑制导致中等水平的油酸，大约40-85％的油酸。对FAD2的抑制随着导入的FAD2-1内含子片段的长度减小而减小。例如，长度减少至少100个连续核苷酸的FAD2-1 内含子可减小对FAD2的抑制和油酸水平的相应增加以及亚油酸水平的相应减小。
可通过导入不同长度的DNA经验地确定对内源性基因的抑制的减少与同源DNA的长度的减少之间的关系。例如，可通过缺失、增加被导入的同源DNA的部分，然后就被靶向的基因的表达进行测定来确定可通过减少同源的导入的DNA的长度可获得的对抑制的减少量。
本发明包括用于减轻对FAD2的抑制同时在植物中仍然具有饱和脂肪酸水平的强烈减少的方法。在此类植物中，油酸水平可在40-85％的范围内。类似地，当将组合的3'和5'非翻译区导入时，与当将全长FATB 基因导入宿主细胞时相比，低于对FATB的完全抑制的抑制发生。以类似的方式，当将通常编码叶绿体转运肽的开放阅读框架的5'部分导入宿主细胞时，对FATB的抑制水平减少。在具有通过使用本发明的方法抑制的FAD2和FATB的细胞中，油酸水平可以为40-85％，而饱和脂肪酸水平可在1％至9％之间。
在一个实施方案中，本发明涉及调控基因抑制以减少抑制(相对于来自完整的基因元件的抑制，其中所述完整的基因元件可以是完整的基因、完整的外显子、完整的内含子、完整的信号序列或完整的UTR)，然后构建包含来自基因元件的内源性序列的片段的重组核酸分子；在宿主细胞中起始所述重组核酸分子的表达；然后用重组核酸分子抑制内源性基因的方法。被抑制的基因可以是任何基因，包括FAD2和FATB。在一个实施方案中，本发明涉及调控对FAD2或FATB的抑制的方法，该方法包括：在宿主细胞中表达部分FAD2或FATB基因元件序列(其中FAD2 或FATB基因元件来自宿主细胞中的内源性FAD2或FATB基因，FAD2或 FATB基因元件序列可以是FAD2或FATB基因、FAD2或FATB外显子、FAD2 或FATB内含子、FAD2或FATB转运肽编码区或FAD2或FATB UTR；部分 FAD2或FATB基因元件序列少于完整的FAD2或FATB基因元件序列)；用部分FAD2或FATB基因元件序列抑制内源性FAD2或FATB，其中宿主细胞中的对FAD2或FATB内源性基因的抑制水平低于宿主细胞(所述宿主细胞具有相似的遗传背景和包含FAD2或FATB基因元件的完整FAD2 或FATB基因元件序列的第二FAD2或FATB核酸序列)中的对FAD2或 FATB内源性基因的抑制水平。
在另一个实施方案中，本发明涉及方法，所述方法通过用重组核酸分子(该重组核酸分子包含抑制FAD2、FATB或FAD2及FATB的内源性表达的DNA序列，其中所述DNA序列包含比完整的基因元件的全序列更短的FAD2、FATB或FAD2及FATB的核酸序列，所述完整的基因元件选自基因、外显子、内含子、转运肽编码区、3'-UTR、5'-UTR和开放阅读框架)转化植物细胞；和在其中起始所述DNA序列的转录的条件下培养植物细胞来改变植物细胞的油组成，借此,与具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物细胞相比，油组成发生了改变。FAD2或FATB 的基因元件在长度上可缩短50、75、100、150、175、200、250、300、 350、400、450、500、600、800、1000、2000、3000或4000个核苷酸。 FAD2或FATB的基因元件的长度可以是50、75、100、150、175、200、 220、250、300、320、350、400、420、450、500、550、600、800或1000个核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及在植物种子中增加油酸含量和减少饱和脂肪酸含量的方法，该方法通过：i)缩短外源性FAD2DNA序列在宿主细胞中的长度直至来自转化的植物的对FAD2表达的抑制量，与具有相似遗传背景和完整的外源性FAD2基因DNA序列的宿主细胞中的对FAD2表达的抑制相比，至少部分减少；和ii)培育具有包含缩短的 FAD2DNA序列的核酸分子的植物，其中缩短的FAD2DNA序列至少部分抑制FAD2的内源性表达；和iii)栽培产生种子(所述种子与来自具有相似的遗传背景但缺乏缩短的FAD2DNA序列的植物的种子相比，具有减少的饱和脂肪酸含量)的植物来实现在植物种子中增加油酸含量和减少饱和脂肪酸含量。可通过导入不同长度的DNA在经验上确定外源性 FAD2DNA序列缩短至至少部分减少对内源性FAD2的抑制的量。例如，可通过缺失、增加被导入的同源DNA的部分，然后就被靶向的基因的表达进行测定来确定可通过减少同源的导入的DNA的长度获得的抑制减少的量。对FAD2表达的抑制量可获得为3粒或更多粒、6粒或更多粒、10 粒或更多粒、15粒或更多粒或20粒或更多粒的来自植物的种子的平均数。
在另一个实施方案中，本发明涉及方法，所述方法通过用重组核酸分子(其包含抑制FAD2和FATB的内源性表达的DNA序列，其中所述 DNA序列包含比完整的基因元件的完整序列更短的FAD2的核酸序列，所述完整的基因元件选自基因、外显子、内含子、转运肽编码区和UTR) 转化植物细胞；和培育转化的植物(其中转化的植物产生与来自具有相似遗传背景但缺乏所述重组核酸分子的植物的种子相比，具有减少的饱和脂肪酸含量的种子)产生具有拥有减少的饱和脂肪酸含量的种子的转化的植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及方法，所述方法通过分离长度至少为40个核苷酸、能够在脂肪酸合成途径中抑制内源性基因表达的基因元件；产生一个以上缩短的基因元件片段；将一个以上个缩短的片段中的每一个导入温带油料种子作物的细胞以产生转基因植物；然后选择包含缩短的确定长度和序列的、实现希望的种子油的脂肪酸组成的改变的片段的转基因植物来调控来自温带油料种子作物的种子油的脂肪酸组成。在优选实施方案中，上述方法还包括构建重组DNA构建体，所述构建体具有两个不同的内源性基因的至少两个缩短的片段，所述片段实现不同的希望的种子油的脂肪酸组成的改变；将重组DNA构建体导入温带油料种子作物的植物细胞以产生转基因植物；选择包含至少两个缩短的片段和具有一个以上希望的改变(通过至少两个缩短的片段实现的) 的来自种子油的脂肪酸组成的转基因植物。
在其他实施方案中，本发明涉及展示具有强烈减少的饱和脂肪酸含量和适度增加的油酸含量、具有在宿主细胞中抑制FAD2的内源性表达的DNA序列的大豆种子，其中所述DNA序列具有比完整的基因元件的完整序列更短的FAD2的核酸序列，所述完整的基因元件选自基因、外显子、内含子、转运肽编码区和UTR。
实施例
下列实施例用于示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，遵循本发明者发现的代表性技术的实施例中公开的技术在本发明的实施中良好地发挥作用，因此可被认为组成了用于其实施的优选模式。然而，本领域技术人员在本公开内容的教导下应当认识到，可在公开的特定的实施方案中进行许多改变，但仍然获得相同的或相似的结果而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别地，很明显某些化学和生理学相关的试剂可用于替代本文描述的试剂但仍然可获得相同的或相似的结果。对于本领域技术人员来说是很显然的所有此类相似的替代物和改变被认为在由所附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
实施例1FATB-2序列的分离
从Asgrow大豆品种A3244获得叶组织，将其在液氮中研磨，然后在80℃下贮存直至使用。向2ml冰冻/研磨的叶组织中加入6ml SDS 提取缓冲液(650ml无菌ddH2O,100ml 1MTris-Cl pH 8,100ml 0.25M EDTA,50ml 20％SDS,100ml 5M NaCl,4μlβ-巯基乙醇)，将混合物在65℃下温育45分钟。每隔15分钟摇动样品。向样品中加入2ml 冰冷却的5M醋酸钾，摇动样品，然后在冰上温育20分钟。向样品中加入3ml CHCl3，摇动样品10分钟。
将样品以10,000rpm离心20分钟，收集上清液。向上清液加入2 ml异丙醇并将其混合。然后将样品以10,000rpm离心20分钟，除去上清液。将沉淀重悬浮于200μl RNA酶中并在65℃下温育20分钟。加入300μl醋酸铵/异丙醇(1:7)并进行混合。然后将样品以10,000 rpm离心15分钟，弃去上清液。用500μl 80％的乙醇漂洗沉淀，让其风干。然后将基因组DNA的沉淀重悬浮于200μl T10E1(10mM Tris:1 mM EDTA)中。
将大豆FATB-2cDNA毗连群序列(contig sequence)(SEQ ID NO: 42)用于设计13个横跨基因的寡核苷酸：F1(SEQ ID NO:48)、F2(SEQ ID NO:49)、F3(SEQ ID NO:50)、F4(SEQ ID NO:51)、F5(SEQ ID NO:52)、F6(SEQ ID NO:53)、F7(SEQ ID NO:54)、R1(SEQ IDNO: 55)、R2(SEQ ID NO:56)、R3(SEQ ID NO:57)、R4(SEQ ID NO:58)、 R5(SEQ ID NO:59)和R6(SEQ ID NO:60)。将寡核苷酸成对地用于对分离的大豆基因DNA进行PCR扩增：对1(F1+R1)、对2(F2+R1)、对3(F3+R2)、对4(F4+R3)、对5(F5+R4)、对6(F6+R5) 和对7(F7+R6)。如下进行对5的PCR扩增：1个循环，95℃下进行 10分钟；30个循环：95℃下进行15秒、43℃下进行30秒、72℃下进行45秒；1个循环，72℃下进行7分钟。对于所有其他寡核苷酸对，如下进行PCR扩增：1个循环，95℃下进行10分钟；30个循环：95℃下进行15秒、48℃下进行30秒、72℃下进行45秒；1个循环，72℃下进行7分钟。从引物对1、2、4、5、6和7获得阳性片段。将各片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen)。确认片段2、4、5和6并对其进行测序。将这四个序列进行排列以形成FATB-2基因的基因组序列(SEQ ID NO: 43)。
通过基因组序列与cDNA序列的比较在大豆FATB-2基因中鉴定了4 个内含子：内含子I(SEQ ID NO:44)横跨基因组序列(SEQ ID NO:43) 的碱基119至碱基1333，其长度为1215bp；内含子II(SEQ ID NO:45) 横跨基因组序列(SEQ ID NO:43)的碱基2231至碱基2568，其长度为338bp；内含子III(SEQ ID NO:46)横跨基因组序列(SEQ ID NO:43) 的碱基2702至碱基3342，其长度为641bp；和内含子IV(SEQ ID NO: 47)横跨基因组序列(SEQ IDNO:43)的碱基3457至碱基3823，其长度为367bp。
实施例2抑制构建体
2A.FAD2-1构建体
将FAD2-1A内含子#1(SEQ ID NO:1)以有义和反义方向克隆入表达盒pCGN3892。载体pCGN3892包含大豆7S启动子和豌豆rbcS 3'。然后将两个基因融合物分别连接入pCGN9372(包含由FMV启动子调控的 CP4EPSPS基因的载体)。所得的表达构建体(图1和2中分别描述的 pCGN5469(有义方向)和pCGN5471(反义方向))用于大豆的转化。
将FAD2-1B内含子(SEQ ID NO:2)在质粒pCGN5468(包含融合至 FAD2-1A内含子(有义)的7S启动子和豌豆rbcS 3')或pCGN5470(包含融合至FAD2-1A内含子(反义)的7S启动子和豌豆rbcS 3')中分别以有义和反义方向融合至FAD2-1A内含子#1的3'末端。然后将所得的内含子组合融合物分别连接入pCGN9372(包含受FMV启动调控的 CP4EPSPS基因的载体)。所得的表达构建体(pCGN5485、FAD2-1A和 FAD2-1B内含子(有义方向)和pCGN5486、FAD2-1A和FAD2-1B内含子(反义方向))用于大豆的转化。
2B.FAD3-1构建体
将FAD3-1A内含子#1、#2、#4和#5(分别为SEQ ID NO:7、8、 10和11)、FAD3-1B内含子#3C(SEQ ID NO:23)和#4(SEQ ID NO:24) 全都以有义或反义方向分别连接入pCGN3892。pCGN3892包含大豆7S 启动子和豌豆rbcS 3'。将这些融合物连接入pCGN9372(包含受FMV启动子调控的CP4EPSPS基因的载体)以用于转化入大豆。所得的表达载体(pCGN5455、FAD3-1A内含子#4(有义方向)；pCGN5459、FAD3-1A内含子#4(反义方向)；pCGN5456、FAD3内含子#5(有义方向)；pCGN5460、 FAD3-1A内含子#5(反义方向)；pCGN5466、FAD3-1A内含子#2(反义方向)；pCGN5473、FAD3-1A内含子#1(反义方向))用于大豆的转化。
2C.FatB构建体
使用FATB-1部分基因组克隆作为模板通过PCR扩增大豆FATB-1 内含子II序列(SEQ ID NO:30)。如下进行PCR扩增：1个循环，95℃下进行10分钟；25个循环：95℃下进行30秒、62℃下进行30秒、72℃下进行30秒；1个循环，72℃下进行7分钟。PCR扩增产生为854bp长的产物，该产物在两端包含重新进行基因工程改造产生的限制性位点。通过经基因工程加在PCR引物的5’末端上的XhoI位点，将PCR 产物以有义方向直接克隆入表达盒pCGN3892，从而形成pMON70674。载体pCGN3892包含大豆7S启动子和豌豆rbcS 3'。然后用NotI切割pMON70674，将其连接入pMON41164(包含受FMV启动子调控的CP4EPSPS 基因的载体)。使用农杆菌方法将所得的基因表达构建体pMON70678用于大豆的转化。
2D组合构建体
制备表达构建体，所述表达构建体包含不同排列的：1)单独的 FAD2-1序列(用于低亚麻酸、中油酸大豆生产方法)和2)FAD2-1和FATB DNA序列的组合。所述DNA序列是表2中描述或举例说明的任何序列，或包含有义、反义或有义和反义FAD2和/或FATB非编码或编码区的不同组合的任何其它的DNA序列组，从而以使它们能够形成dsRNA构建体、有义共抑制构建体、反义构建体或上述构建体的不同组合。
图4描述了能够表达本发明的有义共抑制或反义构建体的DNA序列，其非编码序列描述于下面的表1和2中。非编码序列可以是单个序列、序列的组合(例如与3'UTR连接的5'UTR)或上述序列的任何组合。为了表达有义共抑制构建体，所有非编码序列是有义序列，为了表达反义构建体，所有非编码序列是反义序列。为了表达有义和反义构建体，提供有义和反义非编码序列。
图5描述了几个能够表达本发明的dsRNA构建体的第一组DNA序列，其非编码序列描述于下面的表1和2中。图5中描述的第一组DNA 序列包含成对相关有义和反义序列，所述相关有义和反义序列进行排列以使例如由第一有义序列表达的RNA能够与由第一反义序列表达的反义 RNA形成双链RNA。例如，参考图5的最上面的载体和说明性组合1号(表 1的)，第一组DNA序列包含有义FAD2-1序列、有义FAD3-1序列、反义FAD2-1序列和反义FAD3-1序列。两个反义序列相应于有义序列以使第一组DNA序列的表达产物能够相互形成双链RNA。可用间隔区序列(优选促进dsRNA分子形成的间隔区序列)将有义序列与反义序列隔开。此类间隔区序列的实例包括Wesley等人,同上和Hamilton等人,PlantJ., 15:737-746(1988)中所示的间隔区序列。启动子是在植物中具有功能的任何启动子或任何植物启动子。合适的启动子的非限定性实例描述于详述的部分A中。
使用多种DNA操作技术将第一组DNA序列以有义或反义方向插入表达构建体。如果DNA序列中存在方便的限制性位点，则可通过用限制性核酸内切酶消化它们，然后将它们连接入已在一个或多个可获得的克隆位点上被消化的构建体来将它们插入表达构建体。如果DNA序列中没有可获得的方便限制性位点，则以多种方法改造构建体或DNA序列的DNA 以帮助DNA序列克隆入构建体。改造DNA的方法的实例包括通过PCR、合成的连接体或接头连接(adapter ligation)、体外定点诱变、突出的5'或3'末端的填充或短截(cutting back)等。这些和其他操作DNA 的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
表1
表2
实施例3
3A.反义构建体
现参考图6，通过PCR扩增大豆FATB-2非编码序列(SEQ ID NO: 44-47)、FATB-1非编码序列(SEQ ID NO:29-37)和FAD2-1非编码序列 (SEQ ID NO:1和5-6)，从而产生在两端包含通过重新进行基因工程改造产生的限制性位点的PCR产物。以有义和反义方向将PCR产物直接克隆入包含大豆7Sα’启动子和tml 3'终止序列的载体。然后用合适的限制性核酸内切酶切割载体，并将其连接入pMON80612(包含受FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列调控的CP4 EPSPS基因的载体)。所得的基因表达构建体描述于图6的最下面的构建体中，其用于使用本文描述的方法进行的转化。
3B.体内装配
本发明的一个方面包括DNA构建体，所述构建体在植物中装配入植物染色体上的能够形成双链RNA的重组转录单元。此类构建体的装配和用于体内装配用于基因抑制的重组转录单元的方法描述于国际申请号 PCT/US2005/00681，通过引用方式将其全文合并入本文。
pMON95829是用于体内装配的具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA 边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA片段的构建体。第一T-DNA包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1)(其从3'末端减少100个连续核苷酸且连接至FATB-1a 5'UTR的42个连续核苷酸，之后是FATB-1A叶绿体转运肽(“CTP”)编码区)有效连接的大豆7Sα'启动子以及与增强的FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4EPSPS基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB)。在相同的载体上，在侧翼连接另一对RB和LB的第二T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1)(其从3'末端减少100个连续核苷酸且连接至FATB-1a 5'UTR的42个连续核苷酸，之后是FATB-1A叶绿体转运肽(“CTP”)编码区)有效连接的H6 3'终止序列。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体用于转化。
pMON97595是用于体内装配的具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA 边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA片段的构建体。第一T-DNA片段包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a 5'UTR的42 个连续核苷酸，之后是FATB-1a叶绿体转运肽(“CTP”)编码区)有效连接的7Sα'启动子以及与增强的FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4EPSPS基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB)。在侧翼连接另一对RB和LB的第二T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子 1(SEQ ID NO:1)(其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a 5'UTR的42个连续核苷酸，之后是FATB-1A CTP编码区)有效连接的 H6 3'终止序列。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体用于转化。
pMON97581是用于体内装配的具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA 边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA片段的构建体。第一T-DNA片段包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a叶绿体转运肽 (“CTP”)编码区)有效连接的7Sα'启动子以及与增强的FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4EPSPS 基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB)。在相同的载体上，在侧翼连接另一对RB和LB的第二 T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1)(其从3' 末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a CTP编码区)有效连接的 H6 3'终止序列。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体用于转化。
pMON97596是用于体内装配的具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA 边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA片段的构建体。第一T-DNA片段包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a叶绿体转运肽 (“CTP”)编码区的5’180bp)有效连接的7Sα'启动子以及与增强的 FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4EPSPS基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界 DNA(RB)和左边界DNA(LB)。在相同的载体上，在侧翼连接另一对RB 和LB的第二T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a CTP编码区的 5’180bp)有效连接的H6 3'终止序列。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体用于转化。
pMON97597是用于体内装配的具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA 边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA片段的构建体。第一T-DNA片段包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a叶绿体转运肽 (“CTP”)编码区的5’120bp)有效连接的7Sα'启动子以及与增强的 FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4EPSPS基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界 DNA(RB)和左边界DNA(LB)。在相同的载体上，在侧翼连接另一对RB 和LB的第二T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少320个连续核苷酸且连接至FATB-1a CTP编码区的 5’120bp)有效连接的H6 3'终止序列。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体用于转化。
pMON97598是用于体内装配的具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA 边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA片段的构建体。第一T-DNA片段包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1) (其从3'末端减少340个连续核苷酸且连接至FATB-1a叶绿体转运肽 (“CTP”)编码区)有效连接的7Sα'启动子以及与增强的FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4 EPSPS基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界DNA(RB) 和左边界DNA(LB)。在相同的载体上，在侧翼连接另一对RB和LB的第二T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1)(其从3'末端减少340个连续核苷酸且连接至FATB-1a CTP编码区)有效连接的H6 3'终止序列。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体用于转化。
当将上述构建体(即pMON95829、pMON97595、pMON97581、 pMON97597、pMON97598)中的任一个构建体的两个T-DNA片段以RB至 RB方向插入宿主生物的染色体的单个基因座时，这些装配的转录单元具有与有义和反义方向的大豆FAD2-1A内含子1和FATB-1a DNA片段有效连接的7Sα’启动子。当转录时，有效连接的有义和反义方向的RNA 序列能够形成有效地用于抑制FAD2-1A和FATB的双链RNA。
实施例4植物转化和分析
通过之前描述的方法(包括McCabe等人,Bio/Technology, 6:923-926(1988)的方法或农杆菌介导的转化)将实施例2和3的构建体稳定地导入大豆(例如，Asgrow品种A4922或Asgrow品种A3244或 Asgrow品种A3525)。通过在包含选择试剂或除草剂的培养基上进行选择来鉴定转化的大豆植物。当使用赋予对草甘膦抗性的转基因时，除草剂可以是草甘膦。使用气相色谱分析来自用构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成。
对于一些应用，检测正在发育的种子中的改变的脂肪酸组成，然而在其他情况下例如对于油谱的分析、在FAS途径后期中发生的脂肪酸的变化的检测或对于脂肪酸组成的少量变化的检测，则分析来自成熟种子的脂肪酸或油。此外，个体种子油和/或脂肪酸含量的分析，特别地在分离的R1代种子群体中检测油的变化是希望的。如本文所使用的，R0 代表示由本文描述的转化/再生方案产生的植物，R1代表示在自交的转基因R0植物上生产的种子。R1植物长自R1种子。
确定用实施例3的构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成。使用组织匀浆器(Pro Scientific)单独地研磨各个转基因和对照大豆品系的1至10粒种子以用于油的提取。在1.5ml含有十七烷酸甘油三酯 (0.50mg/ml)的庚烷中从研磨的大豆种子提取油，进行过夜。通过加入 500μl无水乙醇中的甲醇钠使200μl的提取的油的等分衍生成甲酯。使衍生反应在50℃下进行20分钟。通过同时加入500μl 10％(w/v) 氯化钠和400μl庚烷终止反应。在Hewlett-Packard model 6890 GC (Palo Alto,CA)上通过气相色谱(GC)解析所得的庚烷中提取的脂肪酸甲基酯。GC适配有Supelcowax 250柱(30m,0.25mm id,0.25微米的膜厚度)(Supelco,Bellefonte,PA)。注射时柱温度是175℃，温度按照程序以40℃/分钟从175℃至245℃至175℃。注射器和探测器温度分别为250℃和270℃。
实施例5
本实施例举例说明植物转化以产生具有被抑制的基因的大豆植物。
转化载体pMON68537用于将形成内含子/3'UTR双链RNA的构建体导入大豆以抑制Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶和FATB基因。载体 pMON68537还可包含Δ9去饱和酶(FAB2)和CP4基因。pMON68537载体经设计用于植物转化，从而在大豆中抑制FAD2、FAD3和FATB基因并过表达Δ9去饱和酶。特别地，所述构建体包含与大豆有义方向的内含子和3'UTR(即，FAD2-1A内含子#1、FAD3-1A 3'UTR、FATB-1 3'UTR)、形成发夹结构环的可剪接内含子以及大豆反义方向的内含子和3'UTR' (即FATB-1 3'UTR、FAD3-1A 3'UTR和FAD2-1A内含子#1)的互补序列有效连接的7Sα启动子和驱动Δ9去饱和酶的大豆FAD2启动子。通过根癌农杆菌株系ABI(Martinell,美国专利号6,384,301)将载体稳定地导入大豆(Asgrow品种A4922)。CP4选择标记允许通过在包含草甘膦除草剂的培养基上进行的选择来鉴定被转化的大豆植物。
使用气相色谱分析来自用内含子/3'UTR dsRNAi表达构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成。R1混合种子和R1单个种子油的组成显示，与来自未转化的大豆的种子油相比，来自转基因大豆品系的种子油中的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的组成发生了改变，(参见表3)。例如，对FAD2的抑制提供了具有增加量的油酸酯化合物的植物；对FAD3的抑制提供了具有减少的亚麻酸酯化合物的植物；以及对FATB的抑制提供了具有减少的饱和脂肪酸酯化合物例如棕榈酸酯和硬脂酸酯的植物。取决于希望的相对脂肪酸组成对此类品系进行选择。使用气相色谱分析来自用构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成。
表3.来自pMON68537事件的R1单个种子的脂肪酸组成
实施例6转基因大豆中的FAD2-1/FATB dsRNAi构建体
将实施例3D中描述的构建体pMON95829用于将形成FAD2-1内含子、FATB双链RNA的构建体导入大豆以抑制FAD2基因和FATB基因。通过根癌农杆菌株系ABI(Martinell,美国专利号6,384,301)将载体稳定地导入大豆(Asgrow品种A4922)。CP4选择标记允许通过在包含草甘膦除草剂的培养基上进行选择来鉴定被转化的大豆植物。随后，针对第一T-DNA和第二T-DNA的同时串联插入(即以“右边界至右边界”装配)筛选转化的植物的基因组。使用Southern杂交作图法进行筛选。将在它们的基因组中包含优选构型的转化的大豆植物转移至温室中以进行种子生产。
例如，从用构建体pMON95829转化的R0植物摘取叶组织并且进行 Southern分析。选择探针和限制性内切酶消化以鉴定包含两个T-DNA 的右边界-右边界(“RB-RB”)装配的事件。通常，大约25％的所有转化体具有正确装配的RB-RB T-DNA。
使用实施例4中描述的气相色谱分析来自用pMON95829构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成，从而鉴定从种子提取的脂肪酸化合物的甲酯。
首先，收获从用构建体pMON95829转化的大豆植物采集的6粒R1 种子，确定各单个种子的脂肪酸组成。由于各事件的R1植物对于转基因发生分离，因此产生具有常规大豆组成的种子以及改变的形式的种子。将阳性种子混合在一起，对各事件计算平均数。混合的阳性平均值表明，与来自非转化的大豆的种子油相比，来自转基因大豆品系的种子油中的单不饱和和多不饱和脂肪酸的组成发生改变(参见表4)。例如，对FAD2的抑制提供了具有增加量的油酸酯化合物的植物，对FATB的抑制提供了具有减少的饱和脂肪酸酯化合物例如棕榈酸酯和硬脂酸酯的植物。
表4来自pMON95829事件的R1单个种子的脂肪酸组成。
构建体 事件# 16：0 18：0 18：1 18：2 18：3
PMON95829 GM_A94247 2.1 2.8 83.0 6.0 5.5
PMON95829 GM_A94296 2.6 2.9 80.6 7.1 5.8
PMON95829 GM_A93590 2.5 2.8 80.4 7.4 5.8
PMON95829 GM_A93437 2.6 2.8 79.8 7.9 6.0
PMON95829 GM_A93517 2.9 2.8 79.5 7.7 6.0
PMON95829 GM_A93647 2.3 3.0 78.6 9.0 6.5
PMON95829 GM_A93670 3.1 2.9 77.3 10.1 6.2
PMON95829 GM_A92396 2.9 2.6 76.0 11.1 7.0
PMON95829 GM_A92455 3.6 3.1 74.9 12.0 5.5
PMON95829 GM_A93678 2.8 3.4 74.0 11.9 7.4
PMON95829 GM-A93640 2.5 2.7 71.6 14.6 7.6
PMON95829 GM_A94937 4.5 3.3 67.2 17.7 7.1
PMON95829 GM_A92481 4.9 2.8 58.1 25.3 8.1
PMON95829 GM_A94306 3.1 3.2 55.9 29.0 7.9
PMON95829 GM_A94211 3.0 2.7 47.0 38.3 8.7
实施例7
pMON93505是用于体内装配的构建体，其具有两个各自侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件(即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB))的T-DNA 片段。第一T-DNA片段包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO：1) (其从3′末端减少100个连续核苷酸且连接至FATB-1a 3’UTR，之后是FATB-1a5’UTR)有效连接的7Sα′启动子，与油菜油菜籽蛋白启动子和油菜油菜籽蛋白终止序列有效连接的金凤花(C.pulcherrima)KAS IV基因(SEQ ID NO：39)、与大豆7Sα启动子和nos3’终止序列有效连接的蓖麻(Ricinus communis)Δ9去饱和酶基因(美国专利申请2003/00229918 A1)以及与FMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E9 3'终止序列有效连接的CP4 EPSPS基因，其整体侧翼连接农杆菌T-DNA边界元件即右边界DNA(RB)和左边界DNA(LB)。在相同的载体上，在侧翼连接另一对RB和LB的第二T-DNA片段中的是与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO:1)(其从3'末端减少100个连续核苷酸且连接至FATB-1A3’UTR，之后是FATB-1a5’UTR)有效连接的H6 3'终止序列。
通过根癌农杆菌株系ABI(Martinell,美国专利号6,384,301)将构建体pMON93505稳定地导入大豆(Asgrow品种A4922)。CP4选择标记允许通过在包含草甘膦除草剂的培养基上进行选择来鉴定被转化的大豆植物。随后，针对第一T-DNA和第二T-DNA的同时串联插入(即以“右边界至右边界”装配)筛选转化的植物的基因组。使用Southern 杂交作图法进行筛选。将在它们的基因组中包含优选构型的转化的大豆植物转移至温室中以进行种子生产。
例如，从用构建体pMON93505转化的R0植物采集叶组织并且进行 Southern分析。选择探针和限制性内切酶消化以鉴定包含两个T-DNA 的右边界-右边界(“RB-RB”)装配的事件。通常，大约25％的所有转化体具有正确装配的RB-RB T-DNA。
使用实施例4中描述的气相色谱分析来自用pMON93505构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成，从而鉴定从种子提取的脂肪酸化合物的甲酯。首先，收获从用构建体pMON93505转化的大豆植物采集的6粒 R1种子，确定各单个种子的脂肪酸组成。由于各事件的R1植物对于转基因发生分离，因此产生具有常规大豆组成的种子以及改变的形式的种子。将阳性种子混合在一起，计算各事件的平均数。混合的阳性平均值表明，与来自非转化的大豆的种子油相比，来自转基因大豆品系的种子油中的单不饱和和多不饱和脂肪酸的组成发生改变(参见表10)。例如，对FAD2的抑制提供了具有增加量的油酸酯化合物的植物，对FAD3的抑制提供了具有减少的亚麻酸酯化合物的植物，以及对FATB的抑制提供了具有减少的饱和脂肪酸酯化合物例如棕榈酸酯和硬脂酸酯的植物。
表5.来自pMON93505事件的R1单个种子的脂肪酸组成
构建体 事件# 16：0 18：0 18：1 18：2 18：3
PMON93505 GM_A87814 1.3 1.0 84.9 5.5 6.3
PMON93505 GM-A86449 1.5 0.9 84.9 4.9 6.8
PMON93505 GM_A86032 1.5 1.1 83.5 6.3 7.0
PMON93505 GM_A86159 1.5 0.9 82.8 6.7 7.5
PMON93505 GM_A86178 1.7 1.0 82.5 6.7 7.3
PMON93505 GM_A86075 1.4 0.9 81.4 6.6 8.5
PMON93505 GM_A86303 1.0 0.6 81.4 7.4 8.8
PMON93505 GM_A86454 1.4 0.9 79.9 7.4 8.8
PMON93505 GM_A86799 1.4 1.1 79.4 9.6 7.7
PMON93505 GM_A85997 2.2 2.5 79.3 7.7 7.4
PMON93505 GM_A86058 1.8 1.0 76.8 11.3 8.3
PMON93505 GM_A86274 1.2 0.7 74.6 10.2 11.9
PMON93505 GM_A86325 1.1 0.7 72.8 15.4 9.2
PMON93505 GM_A85969 2.0 0.7 70.7 13.6 12.1
PMON93505 GM_A86033 1.7 0.9 69.1 18.2 9.5
PMON93505 GM_A86372 1.7 1.0 65.7 12.6 17.6
PMON93505 GM_A86403 1.5 0.9 64.6 16.8 15.4
PMON93505 GM_A87803 1.1 0.6 57.7 26.0 13.8
PMON93505 GM_A86036 3.1 1.5 54.8 30.4 9.7
PMON93505 GM_A86269 4.9 1.8 51.4 31.9 9.5
实施例8具有改变的脂肪酸组成的转基因大豆
pMON97563包含与大豆FAD2-1A内含子1(SEQ ID NO：1)有效连接的7Sα’启动子，所述大豆FAD2—1A内含子1从3’末端减少100个连续核苷酸且连接至FAD3—1A 5’UTR，之后是与FAD3—1B 5’UTR连接的FAD3—1A 3’UTR，之后是与FAD3—1C 5’UTR连接的FAD3—1B 3’UTR，之后是FAD3-1C 3’UTR，之后FATB-1a CTP编码区，之后与来自FAD3-1A 内含子4的70个核苷酸(与反义方向的FATB-2a CTP编码区有效连接的)有效连接的FATB-2a CTP编码区，之后是与反义方向的FAD3-1C 3′UTR连接的反义方向的FATB-1a CTP编码区，之后是与反义方向的 FAD3-1B 3′UTR连接的反义方向的FAD3-1C 5′UTR，之后是与以反义方向排列的FAD3-1A 3′UTR连接的以反义方向排列的FAD3-1B 5′UTR，之后是反义方向的FAD3-1A 5′UTR，之后是与H63′多腺苷酸化片段有效连接的从3′末端减少400个连续核苷酸的且反义方向的大豆FAD2-1A 内含子1(SEQ ID NO：1)，所述多腺苷酸化片段具有与eFMV启动子和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶E93′终止序列有效连接的CP4 EPSPS基因，在相同的DNA分子上其整体侧翼连接RB和LB。使用本文描述的方法将所得的基因表达构建体转化植物。使用实施例4中描述的气相色谱确定来自用该构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成。表 26提供了代表性种子的组成。18：3的水平减少至大约1％。
表6.来自pMON97563事件的R1单个种子的脂肪酸组成
构建体 事件 16：0 18：0 18：1 18：2 18：3
PMON97563 GM_A109156 2.21 2.78 85.05 8.48 0.69
PMON97563 GM_A109196 2.07 2.31 84.4 9.42 0.97
PMON97563 GM_A109207 2.24 2.78 83.98 9.36 0.82
PMON97563 GM_A103543 2.21 2.63 83.94 10.28 0.95
PMON97563 GM_A103547 2.06 2.47 83.67 10.47 0.89
PMON97563 GM_A109146 1.71 2.34 81.14 13.71 0.91
PMON97563 GM_A109155 2.33 2.7 80.76 12.28 1.11
PMON97563 GM_A109164 2.07 2.61 78.8 14.6 1
PMON97563 GM_A109170 2.68 1.95 78.78 14.14 1.55
PMON97563 GM_A109277 2.49 3.19 78.19 14.51 0.93
PMON97563 GM_A109194 2.46 2.81 76.62 16.26 0.92
PMON97563 GM_A109177 2.56 2.49 72.64 20.14 1.44
PMON97563 GM_A109201 2.46 2.9 72.21 20.13 1.11
PMON97563 GM_A103550 2.18 2.67 70.84 22.25 1.17
PMON97563 GM_A109203 2.18 2.81 69.93 22.91 0.98
实施例9中油酸转基因大豆与低亚麻酸大豆的杂交
将具有在其油中具有中油酸水平的种子的品系的大豆植物与来自具有正常油酸水平但具有大约2.8％的亚麻酸(18:3)的品系的植物杂交。该杂交导致产生具有组合特性(中油酸和低亚麻酸)的油的大豆品系。
简而言之，如下所述进行植物育种。一个亲本系(转基因大豆品系，标记事件GM_A22234)在染色体中包含质粒pMON68504。pMON68504是具有与有义方向的FAD2-1A内含子#1(SEQ ID NO:2；PCT申请WO 2001014538)有效连接的7S启动子(以部分抑制内源性FAD2基因)以及CP4选择标记基因的2T-DNA构建体。从该品系的种子提取的油包含大约65％的油酸，比常规大豆油高20％(参见表7)。另一个亲本是，与在正常大豆油中发现的常规8-9％的亚麻酸(参见表7)相比，在其种子中具有按总脂肪酸的重量计算大约3％的亚麻酸含量的非转基因品种 6p248-5(C1640品系)。亚麻酸的减少由fad3-1b-/fad3-1c-双突变体引起的。(参见Wilcox,J.R.t J.F.Cavins,Inheritance of low linolenic acid content of theseed of a mutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71:74-78,1985)。
将转基因品系GM_A22234(用作雌性)和突变品系6p248-5(用作雄性)的植物杂交。产生30粒F1种子，将其种植，从而产生2.3lbs 的自交F2种子。通过种子芯片的单个种子的脂肪酸甲基酯(FAME)分析从200粒F2种子鉴定出推定的三纯合型种子(triple homozygousseed)。鉴定了27粒具有大约60％18:1、大约20％18:2和大约2-3％18:3 的种子，种植所述种子以产生自交的F3种子。
关于标记分析，收集F2叶组织样品，将关于FAD3突变等位基因的已建立的分子标记用于鉴定双阳性植物(具有FAD3-1B和FAD3-1C突变的植物)。靶向三个基因型以从该实验回收：1)fad3-1b-/fad3-1c- 双纯合型突变体；2)对于单独的fad3-1c-等位基因的单纯合型植物；和 3)对于单独的fad3-1b-等位基因的单纯合型植物。
以单株植物的方式收获F2植物，分析10个F3种子子样品。从27 粒具有大约60％18:1(油酸)、大约20％18:2(亚油酸)和大约2-3％18:3(亚麻酸)的种子中，5株植物被鉴定为推定的双FAD3突变体，将其混合在一起用于进一步的生长。表7概述了来自120株F2植物的F3种子组成的数据。
表7.中油酸表型/fad3突变stack-F3种子的脂肪酸组成脂肪酸，相对摩尔％
fad3-1b-、fad3-1c-、中油酸三联品系(GM_AA22234)具有1.9％18:3 亚麻酸和74.3％的油酸。fad3-1b-和fad3-1c-突变体与转基因中油酸(GM_AA22234)基因座的组合导致与各自亲本品系相比，亚麻酸的进一步减少和油酸的进一步增加。
为了估计三fad3-1b-、fad3-1c-、中油酸(GM_AA22234)三联品系的田间效应，将breeding stack entries以group block design种植,在区组中对stacks和亲本对照分组和随机化,然后分析种子样品。使用单种子FAME用F4田间生长的种子产生fad3-1b-、fad3-1c-、中油酸(GM_AA22234)三联stacks的脂肪酸谱。F4脂肪酸谱显示大约68％ 18:1、13％总饱和脂肪酸、16％18:2和2.3％18:3。油和蛋白质水平与亲本品系相似。
实施例10中油酸、低饱和脂肪酸转基因大豆与低亚麻酸大豆的杂交
将具有在其油中具有中油酸和低饱和脂肪酸水平的种子的品系的大豆植物与来自具有正常油酸和饱和脂肪酸水平但大约2.8％的亚麻酸(18:3)的品系的植物杂交。该杂交导致产生具有组合特征(中油酸、低饱和脂肪酸和低亚麻酸脂肪酸水平)的油的大豆品系。
简而言之，如下所述进行植物育种。一个亲本品系是具有用于部分抑制内源性基因FAD2-1和FATB的重组DNA和使植物耐受草甘膦的CP4 选择标记基因的转基因大豆品系。从该品系的种子提取的油包含大约 55-85％的油酸，常规大豆油的为20％。其还包含低于8％的饱和脂肪酸 (16:0+18:0)，比常规大豆油的14-16％低。另一个亲本系是与在正常大豆油中发现的常规8-9％的亚麻酸相比，在其种子中具有大约3％的亚麻酸水平的非转基因品种6p248-5(C1640品系)。亚麻酸的减少由 fad3-1b-/fad3-1c-双突变体引起。(参见Wilcox,J.R.和J.F.Cavins, Inheritance of low linolenic acid content of theseed of a mutant of Glycine max.,Theoretical and Applied Genetics 71:74-78,1985.)。
将转基因中-高油酸/低饱和脂肪酸品系的植物与来自突变品系 6p248-5的植物杂交。产生F1种子，将其种植以产生自交的F2种子。通过种子芯片的单粒种子的脂肪酸甲基酯(FAME)分析从F2种子鉴定推定的三纯合型种子。鉴定具有组合的油性状的种子，将其进行种植以产生自交的F3种子。对于标记分析，收集F2叶组织样品，将关于FAD3 突变等位基因的已建立的分子标记用于鉴定双阳性植物(具有两个FAD3 缺失的植物)。选择对于转基因座以及两个FAD3突变表现出纯合子性的 F3种子批次，并将其用于品系建立。
为了评价fad3-1b-、fad3-1c-、中油酸低饱和脂肪酸品系的田间效应，将breedingstack entries以group block design种植,在区组中对stacks和亲本对照分组和随机化,然后分析种子样品。使用单种子FAME用F4田间生长的种子确定fad3-1b-、fad3-1c-、中油酸/ 低饱和脂肪酸三联stack的脂肪酸谱。F4脂肪酸谱显示大约55-85％的 18:1、低于8％的饱和脂肪酸和2-3％的18:3。油和蛋白质水平与亲本品系相似。
实施例11FAD3-1b上的多态性的用途
为了实施本发明的方法，可将与大豆FAD3-1B基因相关的多态性用于鉴定与某些低亚麻酸表型相关的大豆基因组区域的存在。在所有品系当中，在2683bp的全长序列中检测到相应于SEQ ID NO:61的位点 2021的位点上的单核苷酸多态性(表3)，且该多态性与低亚麻酸表型相关。低亚麻酸品系6P248、T27111、T27190、T26767和T26830在该位点携带“C”等位基因，而所有其他品系携带“T”。因此，“C”等位基因的存在可用于鉴定其中使用来源于6P248、T27111、T27190、T26767 和T26830的低亚麻酸种质的杂种中低亚麻酸大豆基因组区域的存在。其他低亚麻酸品系例如A5、Soyola和N98-4445在该基因座上携带野生型等位基因，这表明一个或多个其他基因座促成了A5、Soyola和 N98-4445品系中的低亚麻酸表型。
表8.FAD3-1B基因座上的多态性
实施例12FAD3-1C基因中的多态性的鉴定
为了实施本发明的方法，将与大豆FAD3-1C基因相关的多态性用于鉴定与某些低亚麻酸表型相关的大豆基因组区域的存在。在FAD3-1C 上鉴定了与某些低亚麻酸表型相关的4个SNP和1个indel(插入/缺失) (表4)。相应于SEQ ID NO：62的位点687、2316、3743的SNP和SEQ ID NO:62的位点1129上的indel与低亚麻酸表型相关。低亚麻酸品系 Soyola和N98-4445在位点687和1129上携带与所有其他品系不同的等位基因。
将不能使用某些FAD3-1C基因座特异性引物扩增突变品系 6P248、T27111、T27190、T26767、T26830和A5，因为在这些品系中的FAD3-1C基因座上存在大的缺失。这些区域不能被扩增，配以适当的阳性对照反应(即,使用包含完整的FAD3-1C基因的大豆基因组DNA和来自缺失区域的FAD3-1C引物以及使用针对其他非FAD3-1C基因的引物和来自FAD3-1C缺失的大豆基因组DNA)，用于诊断FAD3-1C的缺失。
表9.FAD3-1C基因座上的多态性
Note：1.NA means no amplification
注释：1.NA表示没有扩增。
实施例13.大豆FAD3-1C启动子多态性的鉴定
为了实施本发明的方法，将与大豆FAD3-1C启动子相关的多态性用于鉴定与某些低亚麻酸表型相关的大豆基因组区域的存在。如表5中所指出的，低亚麻酸品系Soyola和N98-4445在所有7个位置上携带与其他野生型品系不同的等位基因。这些多态性的存在可用于在与野生型种质的杂种中鉴定Soyola或N98-4445种质的存在。
表10.FAD3-1C启动子区域上的多态性
在本公开内容的教导下，可制备和实行本文公开的和所要求保护的所有组合物和/或方法而无需过多的实验。尽管借助优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说显然的是，可对组合物和/或方法和本文描述的方法的步骤中或步骤的顺序进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别地，将明显的是，化学和生理学上相关的某些试剂可用于替代本文描述的试剂，而同时获得相同的或相似的结果。对于本领域技术人员是明显的所有此类相似的替代物和变化被认为在由所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用合并入本文，就如同将每一个别单独的出版物或专利申请特定且单独地被标识为通过引用合并入本文。

Claims (25)

1.产生大豆植物的方法，所述大豆植物包含按重量计算占总种子脂肪酸含量的低于6％的亚麻酸含量、按重量计算占总种子脂肪酸含量的7％或更少的饱和脂肪酸含量和占总种子脂肪酸含量的55％至78％的油酸含量，该方法包括步骤：
a)产生一种或多种大豆植物，具有：
(i)由以下组成的转基因：可操作地与3'端的长度减少至少100个连续核苷酸的SEQ IDNO:1序列的有义和反义大豆FAD2-1内含子#1连接的启动子；SEQ ID NO:28的有义和反义FATB-1 5'未翻译区(UTR)编码序列的长度为至少42个核苷酸的片段；SEQ ID NO:28的FATB-1叶绿体转运肽(CTP)编码区的有义和反义序列的长度为至少40个核苷酸的片段；和降低内源性大豆FAD2-1和FATB-1基因的表达的3’终止或多腺苷酸化区；可操作地与赋予草甘膦抗性的启动子和3’终止或多腺苷酸化区连接的选择性的CP4EPSPS基因；和农杆菌T-DNA边界元件；和
(ii)SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性的突变；
b)获得至少一粒来自步骤(a)中获得的所述大豆植物的种子；
c)对于步骤(b)的所述种子，确定按重量计算的亚麻酸、饱和脂肪酸和油酸占总种子脂肪酸含量的百分数；和
d)鉴定产生具有如下种子脂肪酸组成的种子的大豆植物，所述种子脂肪酸组成包含按重量计算占总种子脂肪酸含量的低于6％的亚麻酸含量、按重量计算占总种子脂肪酸含量的7％或更少的饱和脂肪酸含量和占总种子脂肪酸含量的55％至78％的油酸含量。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中产生的所述大豆植物包含SEQ ID NO:61的内源性大豆FAD3基因中的功能损失性突变和SEQ ID NO:62的内源性大豆FAD3基因中的功能损失性突变。
3.权利要求2的方法，其中通过来自3'端的100个连续核苷酸缩短所述大豆FAD2-1内含子#1。
4.权利要求3的方法，其中步骤(d)中鉴定的所述大豆植物产生包含按重量计算低于3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算6％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的种子。
5.权利要求1的方法，其中所述大豆植物在步骤(a)中通过以下产生：
i’)将包含权利要求1的步骤(a)(i)所示的所述转基因的第一大豆植物亲本品系与包含SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的第二大豆亲本品系杂交，以获得对于所述转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1大豆植物；和
ii’)使来自(i’)的F1后代植物自交以获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的所述功能损失性突变是纯合的F2大豆植物，从而获得包含所述减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性FATB-1基因两者的表达的转基因和内源性大豆FAD3基因中的所述功能损失性突变的大豆植物；从而产生步骤(a)的所述大豆植物。
6.权利要求5的方法，其中在步骤(i’)中通过将多个F1植物经历至少一种DNA分析技术来获得对于转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的所述F1大豆植物，所述DNA分析技术允许鉴定对于所述转基因是杂合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是杂合的F1植物。
7.权利要求5的方法，其中在步骤(ii’)中通过将多个F2植物经历至少一种DNA分析技术来获得对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的所述F2大豆植物，所述DNA分析技术允许鉴定对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的F2植物。
8.权利要求6的方法，其中所述DNA分析技术包括FAD3-1C基因序列中相应于SEQ IDNO:62的核苷酸第687、1129、1203、2316、3292、3360或3743位上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸第334位上的鸟嘌呤、核苷酸第364位上的胞嘧啶、核苷酸第385位上的胸腺嘧啶、核苷酸第387位上的腺嘌呤、核苷酸第393位上的胞嘧啶、核苷酸第729位上的鸟嘌呤和核苷酸第747位上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。
9.权利要求7的方法，其中所述DNA分析技术包括FAD3-1C基因序列中相应于SEQ IDNO:62的核苷酸第687、1129、1203、2316、3292、3360或3743位上的至少一个单核苷酸多态性的检测、SEQ ID NO:62的FAD3-1 C基因中的缺失的检测或大豆FAD3-1C启动子序列中相应于SEQ ID NO:63的核苷酸第334位上的鸟嘌呤、核苷酸第364位上的胞嘧啶、核苷酸第385位上的胸腺嘧啶、核苷酸第387位上的腺嘌呤、核苷酸第393位上的胞嘧啶、核苷酸第729位上的鸟嘌呤和核苷酸第747位上的胞嘧啶的至少一个单核苷酸多态性的检测。
10.权利要求6的方法，其中所述DNA分析技术包括所述大豆FAD3-1 B基因中的单核苷酸多态性的检测，所述单核苷酸多态性包括FAD3-1 B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸第2021位上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换。
11.权利要求7的方法，其中所述DNA分析技术包括所述大豆FAD3-1B基因中的单核苷酸多态性的检测，所述单核苷酸多态性包括FAD3-1 B基因序列中相应于SEQ ID NO:61的核苷酸第2021位上的胸腺嘧啶残基对胞嘧啶残基的置换。
12.权利要求5的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因且其中在步骤(i’)中通过将多个F1植物经历针对所述转基因的除草剂选择来获得对于所述转基因是杂合的所述F1大豆植物。
13.权利要求5的方法，其中所述转基因还包括赋予除草剂耐受性的转基因且其中在步骤(ii’)中通过将所述多个F2植物经历所述转基因的除草剂选择来获得对于所述转基因是纯合的F2大豆植物而富集的多个F2植物。
14.权利要求1的方法，其中所述大豆植物在步骤(a)中通过以下产生：
a’)用所述减少内源性大豆FAD2-1基因和内源性大豆FATB-1基因两者的表达的权利要求1的步骤(a)(i)所示的转基因转化包含SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物或大豆植物细胞，以获得具有FAD3基因中的至少一个功能损失性突变、对于所述转基因是杂合的R0大豆植物；
b’)将来自步骤a’)的所述R0后代植物自交以获得对于转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的R1大豆植物，从而获得包含所述转基因和内源性大豆FAD3基因中的至少一个功能损失性突变的大豆植物，从而产生步骤(a)的所述大豆植物。
15.权利要求5的方法，其还包括将来自(ii’)的对于所述转基因是纯合的且对于FAD3基因中的至少一个功能损失性突变是纯合的所述F2后代植物自交以获得F3大豆植物的步骤iii’)。
16.权利要求1的方法，其中通过脂质分析技术在步骤(c)中确定按重量计算的亚麻酸、饱和脂肪酸和油酸占总种子脂肪酸含量的所述百分数。
17.权利要求16的方法，其中所述脂质分析技术包括一种或多种选自气相色谱/火焰离子化检测、气相色谱/质谱、薄层层析/火焰离子化检测、液相色谱/质谱、液相色谱/电喷雾电离-质谱和液相色谱/电喷雾电离-串联质谱的技术。
18.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的饲料制品，所述种子具有包含按重量计算低于6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
19.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的粗粉制品，所述种子具有包含按重量计算低于6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
20.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的蛋白制品，所述种子具有包含按重量计算低于6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
21.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的油制品，所述种子具有包含按重量计算低于6％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
22.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的饲料制品，所述种子具有包含按重量计算低于3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
23.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的粗粉制品，所述种子具有包含按重量计算低于3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
24.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的蛋白制品，所述种子具有包含按重量计算低于3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
25.来自通过权利要求1的方法产生的大豆植物的种子的油制品，所述种子具有包含按重量计算低于3％的总种子脂肪酸的亚麻酸含量、按重量计算7％或更少的总种子脂肪酸的饱和脂肪酸含量和按重量计算55％至78％的总种子脂肪酸的油酸含量的脂肪酸组成。
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