BR102015006156B1

BR102015006156B1 - Método de produzir planta de soja com composição diferenciada de ácidos graxos na semente, planta de soja, semente de planta de soja e óleo de semente de soja

Info

Publication number: BR102015006156B1
Application number: BR102015006156-0A
Authority: BR
Inventors: André Melro Murad; Elibio Leopoldo Rech Filho; Giovanni Rodrigues Vianna
Original assignee: Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2023-12-05
Also published as: WO2016145502A2; BR102015006156A2; AR103960A1; WO2016145502A3

Abstract

MÉTODO DE PRODUZIR PLANTA DE SOJA COM COMPOSIÇÃO DIFERENCIADA DE ÁCIDOS GRAXOS NA SEMENTE, PLANTA DE SOJA, SEMENTE DE PLANTA DE SOJA E ÓLEO DE SEMENTE DE SOJA A presente invenção pertence ao campo da genética vegetal e descreve um novo e inventivo método de produção de plantas oleaginosas cujas sementes apresentam teor diferenciado de ácidos graxos. A invenção ainda provê moléculas, construções de ácido nucléico e outros elementos que se referem à manipulação coordenada de múltiplos genes que atuam na via de síntese de ácidos graxos. Também é provido método de supressão de genes na mesma via, além de plantas que incorporam tais elementos e, em particular, plantas que exibem composições alteradas de ácidos graxos em suas sementes.

Description

Campo da Invenção

[1] A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico, construções e outros agentes associados à manipulação coordenada de múltiplos genes na via de síntese de ácidos graxos. Em particular, os elementos da presente invenção estão relacionados à supressão da expressão de determinados genes da via de síntese de ácidos graxos com o objetivo da geração de plantas que exibem composição alterada de óleos em sementes permitindo a utilização destes óleos como matéria-prima na produção de biocombustíveis e, em especial na produção de biodiesel.

Antecedentes da Invenção

[2] A preocupação com questões ambientais e necessidades de novos suprimentos energéticos tem aumentado o interesse de vários setores produtivos em fontes de energia renováveis. Nesse panorama, biodiesel proveniente de plantas, bactérias e leveduras emergem como potenciais combustíveis provenientes de fontes não-fóssil. O biodiesel pode ser utilizado tanto na sua forma pura (100%), como misturado com diesel de petróleo, podendo também ser utilizado em motores diesel sem modificação no projeto do motor. As características desejáveis para um bom desempenho como combustível, tais como qualidade de ignição, baixas emissões de óxido de nitrogênio (NOx) e alta estabilidade oxidativa, são encontradas em biodiesel com alto teor de ácidos graxos monoinsaturados.

[3] A maioria dos óleos vegetais é composta, principalmente, por cinco tipos de ácidos graxos: palmitato (16:0), estearato (18:0), oleato (18:1), linoleato (18:2) e linolenato (18:3). O palmitato e o estearato são ácidos graxos saturados, enquanto o oleato é um ácido graxo monoinsaturado, e o linoleato e o linolenato são ácidos graxos polinsaturados. Portanto, a maioria dos óleos vegetais utilizados comercialmente como matéria-prima de biodiesel apresenta um alto nível de ácidos graxos polinsaturados (linoleato e linolenato), o que resulta em queda na estabilidade do óleo, afetando o número de cetanos (CN) e limitando diretamente seu uso como combustível. Para o desenvolvimento de um biodiesel de alta performance busca-se uma maior concentração de ácido oleico associada a baixo índice de ácido palmítico.

[4] A soja, por ser uma planta leguminosa, não exige adubação nitrogenada, um atributo importante como matéria prima para a produção de biodiesel. Tal fato, por sua vez, melhora drasticamente o saldo de energia líquida quando comparado com outras fontes de energia. Sementes de soja contêm aproximadamente 18% do óleo total, com 13% de umidade, um perfil de ácidos graxos composto principalmente de 13% de ácido palmítico (16:0), 4% de ácido esteárico (18:0), 18% de ácido oléico (18:1), 55% de ácido linoléico (18:2) e 10% de ácido linolênico (18:3). A alta proporção de ácidos graxos poliinsaturados compromete sua utilização da soja com opção viável de biocombustível, já que a instabilidade oxidativa pode trazer prejuízos ao desempenho do motor. Para corrigir essa instabilidade, a hidrogenação parcial tem sido abordada historicamente para aplicações em alimentos, entretanto, no caso de seu uso para biodiesel, tal abordagem torna-se falha por ter impacto negativo sobre as propriedades do mesmo em condições de frio. Buscando maximizar as características da soja como biodiesel, tem sido sugerido o desenvolvimento de um óleo rico em ácido oléico e baixo teor de ácidos graxos saturados, de forma a atender simultaneamente ambas as características de estabilidade oxidativa e um bom desempenho sob condições de frio.

[5] Durante o desenvolvimento da planta de soja, o ácido oléico é convertido em ácido linoléico em uma etapa única de dessaturação. Esta reação é catalisada por uma enzima dessaturase codificada pelo gene FAD2. Há dois FAD2 genes em soja, designados como FAD2-1 e FAD2-2. O primeiro é principalmente expresso durante a embriogênese, e o último é constitutivo. Já no caso do ácido palmítico, ácido graxo saturado, sua produção é modulada pela expressão do gene FATB, uma palmitoil tioesterase.

[6] Plantas superiores com teor de óleo modificado têm sido desenvolvidas através de indução de mutação e da tecnologia do DNA recombinante, seguido por cruzamento e seleção em programas de melhoramento genético. Ambas as abordagens requerem triagem para garantir características como expressão gênica aumentada, estabilidade em diversos ambientes de crescimento e desempenho agronômico homogêneo das linhas derivadas. Significativos esforços têm sido realizados para a introgressão de uma elevação de ácido oléico em variedades elites de soja convencional por meio de reprodução, explorando a variação nos níveis desse ácido graxo em germoplasma, no entanto, os resultados até a presente data indicam que, para além do período de tempo necessário para desenvolver variedades avançadas através de cruzamentos sexuais, o principal desafio no desenvolvimento de linhagens comerciais é alcançar as caraterísticas agronômicas adequadas para o mercado, tais como a elevada produção de sementes. Estudos iniciais indicaram que estas limitações poderiam ser devido à pleiotropia ou à segregação de genes ligados após os cruzamentos sexuais.

[7] Manipular o nível de expressão de genes endógenos em plantas é uma importante estratégia biotecnológica, fomentando a busca por óleo de plantas com um melhor desempenho como combustível, apresentando uma estabilidade aumentada e menos emissões de NOx.

[8] É possível detectar, no estado da técnica, trabalhos que se relacionem com o tema da invenção em questão. O documento PI0708748-9 apresenta um trabalho no qual é realizada a redução direta da expressão do FAD2-1 através da indução de mutação em genes FAD3 para obtenção de sementes com composição de ácidos graxos mais interessante para aplicação alimentar. Já o documento US 20110010791A1 descreve uma planta de soja com mutações nos genes FAD2-1A e FAD2-1B com composição alterada de ácidos graxos e seu uso no cruzamento e seleção de linhagens que contenham alto índice de oleato. A patente US6372965 descreve trabalho de manipulação de ácidos graxos em plantas de Arabidopsis thaliana, soja, espécies de Brassica, mamona e milho através da manipulação de seu respectivo gene FAD2, seja por supressão ou por superexpressão.

[9] Na presente invenção são apresentadas linhagens de soja engenheiradas metabolicamente que apresentaram altos níveis de ácido oléico (entre 80 e 95%) e diminuição dos níveis de ácido palmítico (abaixo de 3%) por supressão da expressão da Δ12 dessaturase (FAD2-F) e da palmitoil tioesterase (FatBld).

[10] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção:

[11] O referido método de produção de planta de soja objetiva a obtenção de plantas cujas sementes apresentam teor de ácido palmítico menor do que de 3% em peso de ácidos graxos totais na semente e teor de ácido oleico de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais na semente, e compreende as seguintes etapas: a) Criar uma ou mais plantas de soja que compreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 e de um gene FATB de soja; b) Obter pelo menos uma semente da referida planta de soja obtida na etapa (a); c) Determinar uma percentagem de teor de ácido graxo de semente total em peso de ácido palmítico e ácido oleico para a referida semente de etapa (b); e, d) Identificar uma planta de soja que produza semente com uma composição de ácido graxo compreendendo um teor de ácido palmítico menor do que 3% de ácidos graxos totais e um teor de ácido oleico de 80 a 95% de ácidos graxos totais.

[12] A invenção ainda se refere a uma semente de planta de soja, produzida pelo método descrito nesta invenção, com composição diferenciada de ácidos graxos da semente cujo teor de ácido palmítico é menor do que de 3% em peso de ácidos graxos totais na semente e o teor de ácido oleico é de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais na semente. A semente de planta de soja da presente invenção possui em seu genoma um fragmento de 20 a 300 nucleotídeos contíguos do gene FAD2-1 e um fragmento de 20 a 300 nucleotídeos contíguos do gene FATB de soja. Preferencialmente, o gene FATB do genoma da semente da invenção é o gene FATBla.

[13] Outro objeto da presente invenção se refere a uma planta de soja produzida pelo método descrito na invenção.

[14] A invenção também se refere a plantas da progénie da planta de soja produzida pelo método descrito na invenção.

[15] A presente invenção se refere também a uma célula de uma semente de soja que apresenta uma composição de ácidos graxos com teor de ácido palmítico menor do que 3% em peso de ácidos graxos totais e um teor de ácido oléico de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais.

[16] A invenção se refere ainda a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Além disso, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Outro objeto da presente invenção se refere a um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90%de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2.

[17] A presente invenção também se refere a um gene quimérico que compreende: a) um polinucleotídeo que se apresenta como i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo, tal molécula, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou iii) fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95- ou, 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2; e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

[18] A presente invenção se refere ainda a uma construção gênica que compreenda um ou mais genes quiméricos, tais genes quiméricos compreendendo: a) um polinucleotídeo que se apresenta como i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo, tal molécula, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ 1D No2, ou ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ 1D Nol ou em SEQ ID No2, ou iii) fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2;e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a). l) Em uma concretização preferencial, a invenção se refere a uma construção gênica que compreende: uma primeira região com (a) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com uma sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID Nol e (b) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com uma sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ 1D No2; m) . uma segunda região com (a) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade de sequência com o complemento de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID Nol e (b) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade de sequência com o complemento de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ 1D No2.

[19] Também é objeto da invenção um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico, tal molécula compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente tal vetor é capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.

[20] Outro objeto da invenção é uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão do vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2.

[21] Também é objeto da invenção uma célula transformada que compreende molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, tal célula é uma célula eucariótica. Ainda mais preferencialmente, tal célula é uma célula de vegetal.

[22] Outro objeto da invenção é uma planta transformada que compreende molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, tal célula é uma célula eucariótica. Ainda mais preferencialmente, tal célula é uma célula de vegetal.

[23] Também é objeto da invenção uma planta transformada que compreendendo uma das construções gênicas supramencionadas. Outro objeto da invenção é uma planta transformada compreendendo, tal planta, uma das construções gênicas supramencionadas sendo tais construções gênicas apresentando sua primeira e segunda região capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, e ainda contendo, além do comprimento total da primeira e da segunda região, uma região espaçadora.

[24] Outro objeto da invenção é um óleo obtido a partir de semente de soja produzida através de método descrito na invenção.

[25] Também é objeto da invenção um óleo de semente de soja cuja composição de ácidos graxos compreenda teor de ácido palmítico menor do que 3% por peso dos ácidos graxos totais e um teor de ácido oléico de 80% a 95% por peso dos ácidos graxos totais.

Breve Descrição das Figuras

[26] Figura 1: Perfil de ácidos graxos por GC-MS. Porcentagem de ácidos graxos de soja nos extratos de óleo de semente transgênica da linhagem 65.

[27] Figura 2: Perfil de ácidos graxos por GC-MS para os extratos de óleo da linhagem transgênica 65 e de suas sublinhagens. Tempos de retenção das diferentes linhagens de soja. Cada cor representa uma linhagem.

[28] Figura 3: Espectros de massa exata MicroQTOF (m/z) a partir do óleo extraído e esterificado da linhagem 65-25.

[29] Figura 4: Rearranjos moleculares dos ácidos graxos metílicos produzidos na câmara de colisão. A) Formação do pico de base de 87 m/z. B) Perda de OCH3 (31 m/z). C) Perda de CH2COHOCH3 (74 m/z).

[30] Figura 5: Padrões de fragmentação de metil éster palmítico. A estrutura molecular deste FAME e a perda de CH2 são mostradas em detalhe. As setas indicam a série de íons de 87 m/z.

[31] Figura 6: Padrões de fragmentação de metil éster linolênico. A estrutura molecular deste FAME e a perda de CH? são mostradas em detalhe. As setas indicam a série de íons de 87 m/z.

[32] Figura 7: Padrões de fragmentação de metil éster linoléico. A estrutura molecular deste FAME e a perda de CH2 são mostradas em detalhe. As setas indicam a série de íons de 87 m/z.

[33] Figura 8: Padrões de fragmentação de metil éster oleico. A estrutura molecular deste FAME e a perda de CFE são mostradas em detalhe. As setas indicam a série de íons de 87 m/z.

[34] Figura 9: Análise de mobilidade iônica dos FAMEs de sementes transgênicas e não-transgênicas. A) Sobreposição do tempo deriva para cada FAME analisado. B) a representação em 3D de as posições das FAMEs do tubo de desvio e os seus isótopos.

Descrição Detalhada da Invenção

[35] A presente invenção descreve um novo e inventivo método de produção de planta de soja cujas sementes apresentam composição diferenciada de ácidos graxos. No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso serão melhor detalhados a seguir.

[36] O termo “ácido nucleico” refere-se a uma molécula a qual pode ser fita simples ou fita dupla, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, um fosfato e uma base purina ou pirimidina. Um “fragmento de ácido nucleico” é uma fração de uma dada molécula de ácido nucleico. “Complementariedade” refere-se ao pareamento específico de bases purinas e pirimidinas que consistem de ácidos nucleicos: pares de adenina com timina e pares de guanina com citosina. Então, o “complemento” de um primeiro fragmento de ácido nucleico refere-se ao segundo fragmento de ácido nucleico cuja sequência de nucleotídeos é complementar à primeira sequência de nucleotídeos.

[37] Em organismos mais complexos, o ácido desoxirribonucleico (DNA) é um ácido nucléico que contém a informação do material genético de um dado organismo, enquanto o ácido ribonucleico (RNA) é um ácido nucléico que está envolvido na transferência da informação do DNA em proteínas. Um “genoma” é toda parte principal do material genético contida em cada célula de um organismo. O termo “sequência de nucleotídeo” refere-se às sequências de polímeros de nucleotídeos, formando uma fita de DNA ou RNA, as quais podem ser simples ou dupla-fita, opcionalmente sintéticas, não naturais ou com bases de nucleotídeos alteradas capazes de incorporação dentro de polímeros de DNA ou RNA. O termo “oligômero” refere-se a sequências curtas de nucleotídeos, usualmente até 100 bases de comprimento. O termo “homólogo” faz referência à ligação ancestral entre as sequências de nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucleico ou entre as sequências de aminoácidos de duas moléculas de proteínas. A estimativa de tal homologia é provida através da hibridização de DNA-DNA ou RNA- RNA sob condições de estringência como definido no estado da técnica (como mencionado no documento US20030074685, Hames, B. D. and Higgins, S. J. (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press Oxford, U.K); ou pela comparação de similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou proteína (como mencionado no documento US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).

[38] “Gene” refere-se ao fragmento de nucleotídeo que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedentes (região 5’ não traduzida) e posteriores (região 3’ não traduzida) à região codificadora. “Gene nativo” refere-se a um gene isolado com sua própria sequência reguladora encontrada na natureza. “Gene quimérico” refere-se ao gene que compreende sequências codificadoras, regulatórias e heterogêneas não encontradas na natureza. O gene quimérico da presente invenção compreende moléculas isoladas de ácido nucleicos, na orientação sense ou antisense, ligadas operacionalmente a promotores ativos. Construções gênicas da presente invenção podem conter um ou mais genes quiméricos e podem ou não apresentar introns. “Gene endógeno” refere-se ao gene nativo normalmente encontrado em sua localização natural no genoma e não é isolado. Um “gene exógeno” refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido por transferência gênica. “Pseudogene” refere-se a uma sequência nucleotídica que não codifica uma enzima funcional.

[39] “Sequência codificadora” refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma “sequência codificadora interrompida” significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais introns ligados através de junções). Um “íntron” é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de clivagem e a re-ligação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de introns incluem, mas não são limitados a, intron pdk, íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis thaliana, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40, introns do gene da malato sintase.

[40] “Transcrito de RNA” refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia perfeita da sequência de DNA, ele é referido com transcrito primário ou ele pode ser uma sequência de RNA derivada de um processo pós-transcricional do transcrito primário e é então referido como transcrito maduro. “RNA mensageiro (mRNA)” refere-se ao RNA sem introns. “RNA sense” refere-se a um transcrito de RNA que inclui o mRNA. “RNA antisense” refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a todas as partes de um transcrito primário ou mRNA e que pode bloquear a expressão de um gene alvo através da interferência no processamento, transporte e/ou tradução do seu transcrito primário ou mRNA. A complementaridade de um RNA antisense pode ser com qualquer parte do transcrito gênico específico, isto é, sequência 5’ não traduzida, sequência 3’ não traduzida, introns ou sequência codificadora. Além disso, o RNA antisense pode conter regiões de sequências ribozima que aumentam a eficácia do RNA antisense para bloquear a expressão gênica.

[41] “Ribozima” refere-se ao RNA catalítico e inclui sequências específicas de endoribonucleases.

[42] “dsRNA” ou “double-strand RNA” refere-se a estrutura formada entre a sequência do mRNA ou RNA sense, a sequência de uma região espaçadora e a sequência do RNA antisense, sendo que “Região espaçadora” refere-se à sequência de nucleotídeo que não está relacionada com a sequência do gene alvo, como a sequência de um intron.

[43] O termo “vetor” diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores, mas não limitados, são os vetores pKannibal (Wesley SV, Heliwell CA, Smith NA, Wang M, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green A G, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and highthroughput Gene silencing in plants. Plant J. 27:581590) pGLYP, pAC321, série pCambia (BioForge Co.), pBI121 (Chen, Po-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching; To, Kin-Ying. Complete sequence of the binary vector pB1121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants.. Molecular Breeding vo\. 11 issue 4 May 2003. p. 287-293), pBSK (Addgene Co.), pGEM-T easy (Promega Corporation), pETIOl/ D-TOPO (Invitrogen). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).

[44] Uma forma de produzir o dsRNA é através da inserção, na molécula de DNA, de sequência de nucleotídeos do gene alvo na orientação sense, e uma sequência de nucleotídeos na orientação antisense, podendo haver ou não uma região espaçadora entre as sequências de nucleotídeos sense e antisense. As sequências de nucleotídeos mencionadas podem ser constituídas de cerca de 19nt a 2000nt ou ainda cerca de 5000 nucleotídeos ou mais.

[45] Em um dos aspectos da invenção, a molécula de dsRNA pode compreender uma ou mais regiões tendo uma similaridade de pelo menos 90 a 100% de sequência para as regiões com pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos dos nucleotídeos sense da sequência descrita em SEQ ID No 1 e/ou em SEQ ID No 2, uma ou mais regiões tendo uma similaridade de pelo menos 90 a 100% de sequência para as regiões com pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos do complemento dos nucleotídeos sense do gene alvo, onde essas regiões podem ter pares de bases separando-as uma da outra.

[46] Convenientemente, o dsRNA (RNA de dupla fita) como descrito pode ser introduzido dentro de células hospedeiras pela introdução e possível integração de uma construção gênica contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção, transcrição das mesmas para produção do dsRNA. Portanto, em uma outra concretização, a invenção é também suportada por possuir uma construção gênica que é capaz de ser expressa em células de organismos eucariotos de interesse, operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que quando transcrita produz uma molécula de dsRNA.

[47] “Promotor” refere-se à sequência de DNA em um gene, usualmente localizada a montante da sequência codificadora, a qual controla a expressão da sequência codificadora promovendo o reconhecimento pela RNA polimerase e outros fatores requeridos para a própria transcrição. Em uma construção de DNA artificial, promotores podem também ser utilizados para transcrever dsRNA. Promotores podem também conter sequências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteínas as quais controlam o efeito do início da transcrição em resposta a condições fisiológicas ou de desenvolvimento. “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos do organismo e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimento-específicos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese.

[48] O promotor pode conter elementos “enhancers”. Um enhancer é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido- especificidade de um promotor.

[49] O termo “expressão” refere-se à transcrição de uma dada sequência de DNA. Mais especificamente nessa invenção, refere-se à transcrição e acumulação estável do dsRNA derivado dos fragmentos de ácidos nucleicos da invenção.

[50] “Inibição por interferência” refere-se à produção de transcritos de dsRNA capazes de prevenir a expressão da proteína alvo.

[51] “Transformação” refere-se a transferência do gene exógeno para dentro do genoma de um organismo hospedeiro e sua consequente inclusão na herança geneticamente estável.

[52] “Plantas” referem-se a organismos pluricelulares, eucariotos, autotróficos e fotossintéticos, pertencentes ao Reino Plantae.

[53] Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Como usado aqui, o termo “promotor expresso em plantas” significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal o qual seja capaz de direcionar a expressão em uma célula vegetal, por exemplo promotores de origem virai ou bacteriana tais como CaMV35S (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hapster et al, 1988 Mol. Gen. Genet. 212, 182-190) e promotores do gene presentes no T-DNA de Agrobacteriunr, promotores tecido-específicos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de patente US20030175783, An et al., 1996 The Plant Cell 8, 15-30), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), promotores específicos de folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotores específicos de estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865); e semelhantes.

[54] O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens, sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes.

[55] A presente invenção também inclui prover moléculas de dsRNA, as quais podem ser obtidas por transcrição das moléculas contidas nas construções gênicas, e que são úteis para os métodos de acordo com a invenção.

[56] Um outro objeto da presente invenção é prover células eucariotas e organismos eucariotas contendo moléculas de dsRNA da invenção, ou contendo os gene quiméricos ou as construções gênicas capazes de produzir moléculas de dsRNA da invenção. As construções gênicas podem estar estavelmente integradas no genoma das células de organismos eucariotas.

[57] As construções gênicas ou genes quiméricos da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA, como descrito em Rech EL, Vianna GR, Aragão FJL (2007) High transformation efficiency by biolistics of soybean, bean and cotton transgenic plants, Nature Protocols, 3 (3): 410-418. Também podem ser introduzidos diretamente dentro do DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas.

[58] Células de plantas transformadas que são derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, consequentemente, o fenótipo esperado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al., Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

[59] O referido método de produção de planta de soja objetiva a obtenção de plantas cujas sementes apresentam teor de ácido palmítico menor do que de 3% em peso de ácidos graxos totais na semente e teor de ácido oleico de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais na semente, e compreende as seguintes etapas: a) Criar uma ou mais plantas de soja que compreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 e de um gene FATB de soja; b) Obter pelo menos uma semente da referida planta de soja obtida na etapa (a); c) Determinar uma percentagem de teor de ácido graxo de semente total em peso de ácido palmítico e ácido oleico para a referida semente de etapa (b); e, d) Identificar uma planta de soja que produza semente com uma composição de ácido graxo compreendendo um teor de ácido palmítico menor do que 3% de ácidos graxos totais e um teor de ácido oleico de 80 a 95% de ácidos graxos totais.

[60] Quando da adoção desse método, a invenção prevê a criação da referida planta de soja na etapa de acordo com as seguintes etapas: I. Transformar eixos embrionários de soja com polinucleotídeos em que a referida sequência de ácido nucléico compreende um fragmento de gene FAD2-1 cuja extensão inclui entre 20 e 600 nucleotídeos e um fragmento de gene FATB cuja extensão inclui entre 20 e 600 nucleotídeos para obtenção de uma primeira linhagem de soja transgene T0; II. Cultivar in vitro os eixos embrionários por um período de 5 a 7 semanas; III. Transferir plantas da linhagem T0 para solo e cultivar dadas plantas em casa de vegetação para obtenção de sementes de linhagem Tl.

[61] Em uma concretização preferencial da invenção, o referido gene FATB de soja é o gene FATBla.

[62] Após a obtenção, tanto de plantas TO na etapa I, quanto de sementes TI na etapa III, é realizada a identificação de plantas que apresentem pelo menos um fragmento correspondente ao polinucleotídeo utilizado na etapa I. Preferencialmente, são identificadas plantas com que apresentem pelo menos um fragmento correspondente a uma região interna da sequência apresentada em SEQ ID No3. A referida identificação de plantas de soja TO obtida na etapa I bem como sementes TI na etapa III é realizada submetendo uma pluralidade de plantas ou sementes a pelo menos uma técnica de análise de DNA. Preferencialmente, a referida técnica de análise de DNA é escolhida dentre as seguintes:os: análise de PCR, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotídeos.

[63] O método de obtenção da planta de soja na etapa (a) da presente invenção contempla, em sua etapa I, o uso de fragmentos do gene FAD2-1 com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol, com o objetivo de suprimir sua expressão. Ele também contempla a adoção de fragmentos do gene FATB, com o objetivo de suprimir sua expressão, que apresentem pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No2.

[64] Preferencialmente, o método de obtenção da planta de soja na etapa (a) da presente invenção contempla, em sua etapa I, o uso de fragmentos do gene FAD2-1 com pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol, com o objetivo de suprimir sua expressão, e também contempla a adoção de fragmentos do gene FATB com o objetivo de suprimir sua expressão que apresentem pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No2.Mais preferencialmente o método de obtenção da planta de soja na etapa (a) da presente invenção contempla, em sua etapa I, o uso de fragmentos do gene FAD2-1 com pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol, com o objetivo de suprimir sua expressão, e também contempla a adoção de fragmentos do gene FATB com o objetivo de suprimir sua expressão que apresentem pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No2.

[65] Em uma concretização ainda mais preferencial da invenção o método de obtenção da planta de soja na etapa (a) da presente invenção contempla, em sua etapa I, o uso de fragmentos do gene FAD2-1 que correspondem à sequência descrita em SEQ ID Nol, com o objetivo de suprimir sua expressão, e também contempla a adoção de fragmentos do gene FATB com o objetivo de suprimir sua expressão que apresentem 100% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No2.

[66] Nesse contexto, no presente método da invenção, tanto o fragmento de FAD2-1, quanto o fragmento de FATB são transcritos em orientações sense e antisense, o que resulta em RNA, pelo menos em parte, dupla fita.

[67] A invenção ainda se refere a uma semente de planta de soja, produzida pelo método descrito nesta invenção, com composição diferenciada de ácidos graxos da semente cujo teor de ácido palmítico é menor do que de 3% em peso de ácidos graxos totais na semente e o teor de ácido oleico é de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais na semente. A semente de planta de soja da presente invenção possui em seu genoma um fragmento de 20 a 300 nucleotídeos contíguos do gene FAD2-1 e um fragmento de 20 a 300 nucleotídeos contíguos do gene FATB de soja. Preferencialmente, o gene FATB do genoma da semente da invenção é o gene FATBla.

[68] Para a obtenção da referida semente são utilizados fragmentos do gene FAD2-1 com o objetivo de suprimir a expressão do gene FAD2-1. Na presente invenção, o fragmento de FAD2-1 utilizado possui pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada em SEQ ID No 1. Preferencialmente o fragmento do gene FAD2-1 utilizado para suprimir a expressão do gene FAD2-1 possui pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 1 Mais preferencialmente o fragmento do gene FAD2-1 utilizado para suprimir a expressão do gene FAD2-1 possui pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 1. Em uma concretização ainda mais preferencial o fragmento do gene FAD2-1 utilizado para suprimir a expressão do gene FAD2-1 corresponde à sequência descrita em SEQ ID No 1.

[69] Para a obtenção da referida semente da invenção também são utilizados fragmentos do gene FATB com o objetivo de suprimir a expressão do gene FATB. Tal fragmento do gene FATB apresenta pelo menos 90% de similaridade com SEQ ID No 2. Preferencialmente o fragmento do gene FATB utilizado com o objetivo de suprimir a expressão do gene FATB apresenta pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 2. Mais preferencialmente o fragmento do gene FATB utilizado com o objetivo de suprimir a expressão do gene FATB apresenta pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 2. Em uma concretização ainda mais preferencial o fragmento do gene FATB utilizado com o objetivo de suprimir a expressão do gene FA TB corresponde à sequência descrita em SEQ ID No 2.

[70] Ambos fragmentos, tanto do gene FAD2-1, quanto do gene FATB são dispostos de forma que sejam transcritos, cada um, nas orientações sense e antisense, de forma a resultar em RNA, pelo menos em parte, dupla fita. A invenção também se refere a uma semente de soja na qual a referida sequência de ácido nucléico que suprime a expressão de FAD2-1 e FATB é montada como uma unidade funcional de transcrição, após inserção em um cromossomo de planta.

[71] A invenção se refere, ainda a uma semente que, , expressando fragmentos tanto do gene FAD2-1, quanto do gene FATB nas orientações sense e antisense, ainda pode compreender em seu genoma uma sequência de acido nucléico que confere resistência a herbicida. Preferencialmente, esse herbicida é uma imidazolinona selecionada do grupo consistindo de ácido [2-( 4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-] imidiazolin-2-il)- nicotínico, ácido 2-( 4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3- quinolinocarboxílico, ácido [ 5-etil-2-( 4-isopropil-4-metil-] 5-oxo-2- imidazolin-2-il )-nicotínico, ácido 2-( 4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolinl 5 2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-( 4- isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico e uma mistura de 6-( 4- isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila, [2-( 4-] isopropil-4- metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-p-toluato de metila e mistura destes. Em uma concretização preferencial da invenção, o herbicida imidazolinona é ácido [5-etil-2-(4- isopropil-4-metil-] 5-oxo-2- imidazolin-2-il)-nicotínico. Em outra concretização preferencial da invenção, o herbicida é o ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolinl 5 2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico.

[72] Outro objeto da presente invenção se refere a uma planta de soja produzida pelo método descrito na invenção bem como partes da planta de soja produzida pelo método descrito na invenção. Preferencialmente, essas partes podem se referir a diferentes partes da planta selecionadas dentre pólenóvulo meristema folha caule,raiz e célula. A invenção também se refere a plantas da progénie da planta de soja produzida pelo método descrito na invenção.

[73] A presente invenção se refere também a uma célula de uma semente de soja que apresenta uma composição de ácidos graxos com teor de ácido palmítico menor do que 3% em peso de ácidos graxos totais e um teor de ácido oléico de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais.

[74] A invenção se refere, ainda a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ ID No 1 ou SEQ ID No 2. Mais preferencialmente, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ ID No 1 ou SEQ ID No 2. Em uma concretização mais preferencial ainda, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequencia descrita em SEQ ID No 1 ou SEQ ID No 2. Além disso, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 95% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Mais preferencialmente, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Em uma concretização ainda mais preferencial, a invenção de refere a uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ ID No 1 ou SEQ ID No 2.

[75] Outro objeto da presente invenção se refere a um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90%de similaridade com a sequência descrita em SEQ 1D Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, a presente invenção se refere a um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 1 ou em SEQ ID No 2.Mais preferencialmente, a presente invenção se refere a um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No 1 ou em SEQ ID No 2. Em uma concretização ainda mais preferencial, a presente invenção se refere a um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID No 1 ou em SEQ ID No 2.

[76] A presente invenção também se refere a um gene quimérico que compreende: a) um polinucleotídeo que se apresenta como i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo, tal molécula, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ii)uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou iii) fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95- ou, 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2; e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

[77] Preferencialmente, a presente invenção também se refere a um gene quimérico que compreende: a) um polinucleotídeo que se apresenta como i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo, tal molécula, uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou iii) fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2; e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

[78] A presente invenção se refere ainda a uma construção gênica que compreenda um ou mais genes quiméricos, tais genes quiméricos compreendendo: a) um polinucleotídeo que se apresenta como i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo, tal molécula, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ii)uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ 1D Nol ou em SEQ ID No2, ou iii) fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2;e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

[79] Preferencialmente, a presente invenção se refere ainda a uma construção gênica que compreenda um ou mais genes quiméricos, tais genes quiméricos compreendendo: a) um polinucleotídeo que se apresenta como i) uma molécula de ácido nucleico compreendendo, tal molécula, uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ 1D Nol ou em SEQ ID No2, ou ii)uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou iii) fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2; e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

[80] Em uma concretização preferencial, a invenção se refere a uma construção gênica que compreende: I. uma primeira região com (a) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com uma sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID Nol e (b) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com uma sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID No2; II. uma segunda região com (a) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade de sequência com o complemento de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ 1D Nol e (b) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos tendo pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade de sequência com o complemento de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID No2.

[81] Em uma concretização mais preferencial, a invenção se refere a uma construção gênica que compreende: I. uma primeira região com (a) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos que corresponde à sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID Nol e (b) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos que corresponde à sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos sense conforme descrita em SEQ ID No2; II. uma segunda região com (a) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos que corresponde ao complemento de uma sequência de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID Nol e (b) uma sequência de nucleotídeos de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos que corresponde ao complemento de 20 a 300 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID No2.

[82] Preferencialmente, tal construção gênica apresenta sua primeira e segunda região capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, e ainda contem, além do comprimento total da primeira e da segunda região, uma região espaçadora. A referida região espaçadora apresenta, preferencialmente, uma extensão de 80 a 1000 nucleotídeos. Em uma concretização ainda mais preferencial, a referida sequência espaçadora é um íntron.

[83] Também é objeto da invenção um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico, tal molécula compreendendo uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente tal vetor é capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.

[84] Preferencialmente, é objeto da invenção um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico, tal molécula compreendendo uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente tal vetor é capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.

[85] Outro objeto da invenção é uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão do vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2.

[86] Preferencialmente, outro objeto da invenção é uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão do vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2.

[87] Também é objeto da invenção uma célula transformada que compreende molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ 1D No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, tal célula é uma célula eucariótica. Ainda mais preferencialmente, tal célula é uma célula de vegetal.

[88] Preferencialmente, é objeto da invenção uma célula transformada que compreende molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, tal célula é uma célula eucariótica. Ainda mais preferencialmente, tal célula é uma célula de vegetal.

[89] Outro objeto da invenção é uma planta transformada que compreende molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos com similaridade de pelo menos 90, 95 ou 99% com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que apresenta pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, tal célula é uma célula eucariótica. Ainda mais preferencialmente, tal célula é uma célula de vegetal.

[90] Preferencialmente, outro objeto da invenção é uma planta transformada que compreende molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2, ou ainda um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos que corresponde à sequência descrita em SEQ ID Nol ou em SEQ ID No2. Preferencialmente, tal célula é uma célula eucariótica. Ainda mais preferencialmente, tal célula é uma célula de vegetal.

[91] Também é objeto da invenção uma planta transformada que compreendendo uma das construções gênicas supramencionadas. Outro objeto da invenção é uma planta transformada compreendendo, tal planta, uma das construções gênicas supramencionadas sendo tais construções gênicas apresentando sua primeira e segunda região capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, e ainda contendo, além do comprimento total da primeira e da segunda região, uma região espaçadora.

[92] Outro objeto da invenção é um óleo obtido a partir de semente de soja produzida através de método descrito na invenção.

[93] Também é objeto da invenção um óleo de semente de soja cuja composição de ácidos graxos compreenda teor de ácido palmítico menor do que 3% por peso dos ácidos graxos totais e um teor de ácido oleico de 80% a 95% por peso dos ácidos graxos totais.

Experimentos realizados e resultados obtidos:

[94] Obtenção das sequências de ácidos graxos sintéticos:

[95] Para gerar a construção de RNAi de soja para supressão de ácidos graxos, foram utilizados dois fragmentos de 300 pb específica de genes que correspondem às regions de cDNA codificadoras de SoyFAD2-l (GenBank L43920.1 adesão, nt 272-571) e SoyFatBla (GenBank DQ861997 adesão 0,1, nt 65-364). Estes fragmentos de cDNA foram montados em conjunto para formar um fragmento de 600 pb. Análises de restrição in silico da seqüência de 600 pb indicaram um sítio de Xba\ (TTAGA) na posição 533 do fragmento. A primeira base, T (sublinhada), foi suprimida para remoção do sítio de restrição. O fragmento resultante de 599 pb sintético correspondente a regiões codificadoras dos genes FAD2-1 e FATB flanqueadas por sítios de restrição 5'Xba\/Xho\y e 5'Ájwl/B<7wHI3' foi produzido (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA94025, EUA). O fragmento sintético foi inserido no sentido sense nos locais Xhol/Á/wl e no sentido antisense nos locais BamWX/XbaX de pKannibal para gerar o vetor pSoybiofuell RNAi. No vetor pSoybiofuell, as sequências hairpin totais estavam sob o controle do promotor constitutivo e 35SCaMV e do terminador OCS. O vetor pAC321 transportando o gene mutante ahas de Arabidopsis thaliana, que confere tolerância ao herbicida Imazapyr®, foi utilizado como um marcador seletivo (Rech EL, Vianna GR, Aragao FJL (2008) High-efficiency transformation by biolistics of soybean, common bean and cotton transgenic plants. Nat Protoc 3 (3):410-418.).

[96] Transferência de genes para a soja

[97] Os plasmideos pAC321 e pSoybiofuell foram co-bombardeados em uma proporção de 1:1 na região meristemática apical de 3600 eixos embrionários de sementes de soja madura da cultivar Conquista (Embrapa Soja, Brasil), através de bombardeamento de partículas como descrito em Rech EL, Vianna GR, Aragao FJL (2008) High-efficiency transformation by biolistics of soybean, common bean and cotton transgenic plants. Nat Protoc 3 (3):410-418. As plantas putativas foram cultivadas em meio seletivo de Imazapyr® durante 6 semanas e analisadas por PCR para ambos os transgenes.

|98] Análises de PCR

[99] Um pequeno segmento de aproximadamente lmm de cotilédones de cada semente TI foi excisada para isolamento de DNA. O segmento da semente foi removido a partir do lado oposto ao eixo embrionário para permitir posterior desenvolvimento da semente. O DNA foi isolado de plantas de acordo com a técnica de acordo com Doyle JJ, Doye JL (1987) Rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues. Phytochem Bulletin 19 (1): 11-15. Na reação de PCR foram utilizados 10 mM Tris - HC1 (pH 8,4), KC1 50 mM, MgC12 2 mM, 160 mM de cada dNTP, 2 U de Taq polimerase (Invitrogen), 20 ng de DNA e 200 nM de um dos seguintes pares de sequências iniciadoras: KANNIf (CCATATCTTCGCAAGACC) e PDKr (TAATATTTTATATAAAAGGA) ; PDKf (TTTTAAATAATATTGTAGTT) e KANNIr (CGATCATAGGCGTTCGCAT) ou ahaspl24 (ATAGAGATTCCAGCGTCAC) e ahas500c (GTGGTATACAGATACTGG). O DNA foi pré-desnaturado a 95°C durante 5 minutos e amplificado durante 35 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 73°C durante 1 minuto, com um ciclo final de 72°C durante 7 minutos. Oito linhas de soja TO independentes foram obtidas e apresentadas, tanto a 728 e 835 pb fragmentos correspondentes a duas regions internas do vetor de cassete de expressão pSoybiofuell que foram amplificados usando o KANNIf/PDKr e combinações de iniciadores PDKf/KANNIr, respectivamente. Todas as plântulas transgénicas apresentou o fragmento de 685 pb correspondente à amplificação do 5 ' segmento interno do gene mutado ahas. As plantas T0 PCR- positivas foram transferidas para solo em casa de vegetação, ambientadas e cultivadas até que produzissem sementes. Todas as sementes foram colhidas e usadas individualmente para análises moleculares e bioquímicas.

[100] Preparação das amostras de óleo para espectrometria de massas

[101] O óleo das sementes de soja foi extraído e esterificado tal como descrito em Primomo VS, Falk DE, Ablett GR, Tanner JW, Rajcan I (2002) Inheritance and interation of low palmitic and low linolenic soybean. Crop Sci 42 (1):31-36. Vagens de soja de plantas transgênicas e não-transgênicas TO foram colhidas. As sementes TI foram colhidas e armazenadas individualmente sob temperatura de 4°C. Usando uma lâmina de bisturi, uma lâmina de 1-2 mm de espessura pesando cerca de 10 mg foi excisada a partir dos cotilédones da semente. A secção foi triturada em nitrogênio líquido utilizando um almofariz e um pilão. O pó da amostra foi transferido para um frasco de vidro e seco durante a noite num forno a 90°C. Para cada frasco, 500 μL de uma solução de KOH - metanol a 0,5 N foi adicionada, e a mistura foi agitada em vórtex durante 15 segundos. Em seguida, os frascos foram aquecidos em estufa a 80°C durante 60 minutos. Para cada frasco 2 mL de uma solução de ácido - metanol (6 mL de H2SO4 em metanol) foram adicionados, e as amostras foram agitadas durante 3 minutos e aquecidas num forno a 80°C por mais 60 minutos. As amostras, então, foram resfriadas à temperatura ambiente durante 10 minutos, e foram adicionados 2 mL de hexano, seguido por agitação em vortex durante 3 minutos. As amostras foram deixadas durante 45 minutos para separação de fases. Em seguida, 1 mL do sobrenadante foi recolhido e colocado em um frasco tampado por um amostrador automático de GC. Amostras padrão de ácido palmítico (Sigma - 76119), ácido esteárico (Sigma - 85679), ácido linolénico (Sigma - 62160), ácido linoleico (Sigma - 62230) e ácido oleico (Sigma - 75040) foram também esterificados usando o método acima mencionado e usados para a calibração de um aparelho de espectrometria de massa de cromatografia em fase gasosa (GC-MS).

[102] Análise de GC-MS

[103] A espectrometria de massa de cromatografia em fase gasosa foi realizada utilizando um aparelho Shimadzu GC - 2010 e um aparelho Shimadzu GCMS - QP2010 equipado com um amostrador automático. Dois microlitros foram aplicados a uma coluna capilar OmegaWax 250 (30 m x 0,25 milímetros x 0,25 mm) a partir de Supelco (Sigma - 24136). As seguintes condições cromatográficas foram estabelecidas: temperatura inicial 50°C, temperatura final de 240°C, temperatura de injeção de 250°C, e taxa de 5°C/min até 240°C, em seguida manter a 240°C durante 10 minutos (tempo total de execução = 58 minutos). Um fluxo linear de 2 ml/min com uma pressão de hélio de 117,6 kPa foi utilizado num total de fluxo de 25 mL/min. A velocidade linear foi de 51,3 centímetros/s com uma purga de 3 mL/min e uma razão de divisão de 10. A espectrometria de massa foi operada a uma temperatura de 250°C com uma velocidade de varrimento 833 Hz 100-500 m/z por 58 minutos. Os picos de cromatografia e os dados de fragmentação MS foram pesquisados no banco de dados fragmento FAME. Para a análise de GC-MS de estéres metílicos foi observado que diferentes linhagens TI apresentaram um perfil melhorado para a produção de ácido oleico e uma diminuição do ácido palmítico (Tabela 1). A linhagem de semente 65-25 apresentou o melhor desempenho com 94,58% de ácido oléico e 2,12% de ácido palmítico (Tabela 2). Para verificar a extração e estabilidade ao longo do tempo derivatização, as linhagens 65-25, 65-14 e 122-22 foram injetadas no GC-MS uma vez por semana ao longo das experiências analíticas. Os desvios-padrão (Tabela 2) demonstram que as análises podem ser realizadas com uma semana entre a extração, a derivatização e a análise por CG-MS, sem variação significativa nos resultados. Além disso, a linhagem 65-25 apresentou concentrações mais elevadas de ácido oleico e concentrações mais baixas de ácido palmítico que o óleo extraído das sementes não transgénicos (Figura 1), o que sugere que as características estruturais do petróleo encontradas na linhagem 65-25 cumprem as normas internacionais para a produção de biodiesel, como descrito em Graef G, LaVallee BJ, Tenopir P, Tat M, Schweiger B, Kinney AI, Van Gerpen JH, Clemente TE (2009) A high-oleic-acid and low-palmitic-acid soybean: agronomic performance and evaluation as a feedstock for biodiesel. Plant Biotechnol J 7 (5):411- 421. Tabela 1: Perfil GC-MS a partir de ácidos graxos composição de sementes selecionadas aleatoriamente das linhagens 83, 91, 109, 117 e 122. Os desvios padrões variam de 0,1% a 0,6% de injeção para injeção. Tabela 2: Resultados de GC-MS produzindo a composição do óleo da semente de soja transgênica linhagem 65 e suas sublinhagens. O número da amostra 22 é um evento não transgênico e foi utilizado como uma referência negativa. O desvio padrão varia de 0,1 a 0,6% de injeção.

[104] Espectrometria de massas exatas e espectrometria de massa de mobilidade iônica

[105] As amostras previamente preparadas para o GC-MS foram analisadas em um espetrômetro de micro-TOF Q II massa de ionização eletrospray (Bruker Daltonics) e em um espectrômetro de massa de alta definição Synapt G2 (Waters, EUA). Para a análise G2 Synapt, uma fonte de nanospray (a 600 r| L/min) foi utilizada em modo de ion positivo com as seguintes condições: Analyzer: Resolution Mode, Capillary (kV): 3.0, Sampling Cone: 30.0, Extraction Cone: 6.0000, Source Temperature (°C): 70, Desolvation Temperature (°C): 200, Cone Gas Flow (L/Hr): 0.0, Nanoflow Gas Pressure (Bar): 0.2, Purge Gas Flow (mlVh): 800.0, Desolvation Gas Flow (L/Hr): 800.0, LM Resolution: 4.9 and HM Resolution: 15.0. A espectrometria de massa foi calibrada externamente utilizando séries de ions a partir de uma solução de formato de sódio. As análises dos fragmentos foram realizadas no modo de MS/MS, e os dados foram recolhidos de 10 a 300 m/z ao longo de 5 minutos. A energia de colisão foi aplicado em uma célula armadilha, aumentando de 6 eV a 35 eV, e a resolução LM foi ajustada para 23,9. Mobilidade de ion também foi avaliada no modo de resolução, ajustando a frequência de rádio quadrupolo para selecionar cada FAME com uma resolução de LM de 23,9. O fluxo de gás de IMS foi ajustado para 90 mL/min, e o escoamento de gás de hélio a 180 mlVmin. A velocidade da onda de IMS e altura da onda foram definidas de modo a que as TIC foram observados no centro do tubo de desvio, e estes valores foram mantidos em todas as amostras. Os espectros de ésteres metílicos de ácido palmítico foram obtidos a 270-275 m/z. Os espectros de éster metílico linolénico foram obtidos a 290-297 m/z. Os espectros de éster metílico linoléico foram obtidos a 294 até 300 m/z. Os espectros de éster metílico de ácido oléico foram obtidos a 295-300 m/z. Experimentos de massa exata e MS/MS também foram realizados em um espectrômetro micro-TOF O II usando uma sonda eletrospray padrão e calibração interna para erros de massa sub-ppm no modo de MS. A caracterização estrutural do perfil de ácidos graxos nas sementes transgênicas e não- transgênicas foi realizada utilizando espectrometria de massa de íons high- resolution/accurate e mobilidade -MS. Os espetros de massa exata da linhagem 65-25 (Figura 3) não indicou qualquer alteração das massas de éster metílico de ácido palmítico (271,2 [M + H] m/z), éster metílico linolénico (293,2 [M + H] m/z), éster metílico de ácido linoleico (295,2 [m + H] m/z) e de éster metílico oleico (297,2 [m + H] m/z).

[106] As Figuras 5 a 8 mostram a fragmentação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos (FAMEs). Os resultados indicam não haver diferenças entre os espectros padrão e os espectros dos óleos esterificados da linhagem 65-25. O processo de fragmentação da célula de colisão produz íons que podem ser atribuídos como assinaturas para os FAMEs. A Figura 4 mostra os três rearranjos FAME mais comuns devido ao processo de fragmentação. O rearranjo de McLafferty ocorre frequentemente, formando ions com M + H- 31eM + H-74 (Figs. 4B e 4C). A cadeia de hidrocarboneto possui uma assinatura de M + H - 14, correspondente à ruptura consecutiva de CHi. Uma série de íons foi também detectada com base no ion 87 m/z (fig. 4AC), formando ions com massas de 101, 115, 129 e 143 m/z (CH3OCO [CH?] N) com baixa intensidade. Estas assinaturas podem ser observadas nas Figuras 5 a 8, que ilustram os íons 197 m/z 240 e m/z para o ácido palmítico, 225 m/z 268 e m/z para o ácido esteárico, 223 m/z 266 e m/z para o ácido oleico, 262 m/z e 219 m/z para o ácido linolénico e 264 m/z 221 e m/z para o ácido linoleico, representando m + H- 31eM + H-74, respetivamente. A Tabela 3 contém uma lista de todas as massas relevantes encontradas nos espectros. Foram identificados íons que tem M + H-18, M + H -50 como precursores com duas outras séries que começam com íons de 55 m/z 53 e m/z. Estes íons também foram detectados no espetro de GC-MS (dados não mostrados). Podemos teorizar que M + H- 18 representa a perda de água resultando no composto CH3 (CH2) NCCHOCH2 + H2O. A série M + H - 50 pode ser um rearranjo múltiplo da cadeia de hidrocarbonetos após a perda de água (CHCCC [CH2] NCOCH2 + CH3 C2H5 + 3H + H2O). A série de íons a partir de 55 m/z poderia ser iniciada com um composto modificado a partir da fig. 4B, CH2CH(CH2)NCO. Como a mobilidade do ion de cada éster de metila exibiu apenas uma conformação (Figura 9), o que indica que os fragmentos observados foram obtidos a partir de isolados de íons do quadruplo, as chances de que estes íons possam ter sido formados por qualquer contaminação da fonte de íons ou na amostra é muito baixa.

[107] A mobilidade do ion de cada FAME foi avaliada para várias estruturas e/ou contaminação entre a linhagen 65-25 e uma linhagem não transgénica. Os resultados são fornecidos na Figura 8, com os seguintes tempos de deriva para cada FAME: palmítico = 4,09 ms, linolênico = 3,79 ms, linoléico = 4,13 ms e oleico = 4,44 ms (Figura 9A). A Figura 9B mostra os isótopos de cada FAME com uma distribuição uniforme. Estes dados indicam que uma única conformação estrutural é formada, e não houve diferença observada entre os FAMEs da linhagem 65-25 e aqueles a partir da linhagem não transgénica. Tabela 3: Os valores de massa (m/z) e de íons de série, tal como determinado pelas experiências de espectrometria de massa importantes. A série de ions (M + H-18) corresponde a uma eventual perda de água. Série de íons (M + H-50) corresponde a um possível rearranjo de cadeia carbónica com uma perda de água (3 C2H3 H + H2O). Ion série 87 foi descrito por Mclafferty FW (1959) Mass Spetrometric Analysis - Molecular Rearrangements. Anal Chem 31 (l):82-87 e Mclafferty FW, Gohlke RS (1959) Mass Spetrometric Analysis - Aromatic Acids and Esters. Anal Chem 31 (12):2076-2082. Ion séries 55 e 53 foram

Claims

1. Método de produzir uma planta de soja com composição diferenciada dos ácidos graxos da semente caracterizado por apresentar teor de ácido palmítico menor do que de 3% em peso de ácidos graxos totais na semente e teor de ácido oleico de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais na semente caracterizado por criar a planta de soja na etapa (a) de acordo com as seguintes etapas: I. Transformar eixos embrionários de soja com polinucleotídeos que compreende uma sequência conforme sequência descrita em SEQ ID No 1 e uma sequência conforme sequência descrita em SEQ ID No 2 para obtenção de uma primeira linhagem de soja transgene T0; II. Cultivar in vitro os eixos embrionários por um período de 5 a 7 semanas; III. Transferir plantas da linhagem T0 para solo e cultivar dadas plantas em casa de vegetação para obtenção de sementes de linhagem T1.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a planta de soja T0 obtida na etapa (I) ser submetida a pelo menos uma técnica de análise de DNA permitindo a identificação de uma planta T0 que apresente pelo menos um fragmento correspondente a pelo menos uma região interna do polinucleotídeo utilizado na etapa (I).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a planta de soja T1 que seja heterozigota para o transgene ser obtida na etapa (III) e identificada submetendo uma pluralidade de plantas T1 a pelo menos uma técnica de análise de DNA permitindo a identificação de uma planta T1 que apresente pelo menos um fragmento correspondente a pelo menos uma região interna do polinucleotídeo utilizado na etapa (I).

4. Método de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por a referida técnica de análise de DNA compreender uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo em análise de PCR, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotídeos.

5. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a referida técnica de análise de DNA compreender uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo em análise de PCR, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotídeos.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a referida técnica de análise de DNA compreender uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo em análise de PCR, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotídeos.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a referida técnica de análise de DNA compreender uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo em análise de PCR, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotídeos.

8. O método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as sequências SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2 serem, cada uma, transcritas em orientações sense e antisense, resultando em RNA, pelo menos em parte, dupla fita.

9. Gene quimérico caracterizado por compreender: a) molécula de ácido nucleico contendo polinucleotídeo com sequências conforme sequências descritas em SEQ ID No 1, SEQ ID No 2 e complementos das sequências completas SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2; e b) um promotor ativo heterólogo a (a), operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

10. Construção gênica caracterizada por compreender um ou mais genes quiméricos definidos na reivindicação 9.

11. Construção gênica de acordo com a reivindicação 10 caracterizada por compreender: I. uma primeira região com (a) uma sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID No 1 e (b) uma sequência de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID No 2; II. uma segunda região com (a) uma sequência de nucleotídeos complementares à sequência completa de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID No 1 e (b) uma sequência de nucleotídeos complementares à sequência completa de nucleotídeos conforme descrita em SEQ ID No 2.

12. Construção gênica de acordo com a reivindicação 10 ou 11 caracterizada por a primeira e a segunda região serem capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, e conter, além do comprimento total da primeira e da segunda região, uma região espaçadora.

13. Construção gênica de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por a região espaçadora entre a primeira e a segunda região apresentar uma extensão de 80 a 1000 nucleotídeos.

14. Construção gênica de acordo com a reivindicação 13 caracterizada por a sequência espaçadora ser um íntron.

15. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico contendo polinucleotídeo com sequências conforme sequências descritas em SEQ ID No 1, SEQ ID No 2 e complementos das sequências completas de SEQ ID No 1 e de SEQ ID No 2 operacionalmente ligada a um promotor heterólogo.

16. Vetor de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido vetor ser capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.

17. Óleo extraído de semente de planta produzida por um método conforme definido na reivindicação 1 caracterizado por apresentar teor de ácido palmítico menor do que de 3% em peso de ácidos graxos totais na semente e teor de ácido oleico de 80% a 95% em peso de ácidos graxos totais na semente.