KR102012993B1 - 니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 및 그의 방법 및 용도 - Google Patents

니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 및 그의 방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102012993B1
KR102012993B1 KR1020147008614A KR20147008614A KR102012993B1 KR 102012993 B1 KR102012993 B1 KR 102012993B1 KR 1020147008614 A KR1020147008614 A KR 1020147008614A KR 20147008614 A KR20147008614 A KR 20147008614A KR 102012993 B1 KR102012993 B1 KR 102012993B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
tobacco
acetyl
isomer
plants
Prior art date
Application number
KR1020147008614A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140067082A (ko
Inventor
니콜라스 바카허
그레고르 니콜라스 빈들러
미셸 필립 블랑
사이먼 고에페르
플로리안 마틴
Original Assignee
필립모리스 프로덕츠 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. filed Critical 필립모리스 프로덕츠 에스.에이.
Publication of KR20140067082A publication Critical patent/KR20140067082A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102012993B1 publication Critical patent/KR102012993B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
    • A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
    • A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
    • A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
    • A24B15/20—Biochemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)

Abstract

본 발명은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 세포에 관한 것으로, (i) 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO:14에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) 상기 폴리뉴클레오티드(들)에 의해 인코딩되는 폴리펩티드; 또는 (iii) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:15에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드; 또는 (iv) 상기 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 구조체, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하고, 선택적으로 여기서 상기 구조체, 벡터 또는 발현벡터는 추가적으로 SEQ ID NO:8에 기재된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 프로모터 또는 거기에 60% 이상의 상동성을 가지는 그것의 변종 또는 분비모 프로모터를 포함한다.

Description

니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 및 그의 방법 및 용도{ISOPROPYLMALATE SYNTHASE FROM NICOTIANA TABACUM AND METHODS AND USES THEREOF}
본 발명은 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 및 변종으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 유전자, 그의 상동체 및 단편을 개시하고 있다. 특히, 담배 식물과 같은-식물의 수크로오스 에스테르 조성물을 변형하기 위해, 이 유전자의 발현의 변형 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질의 활성이 개시되어 있다.
수크로오스 에스테르는 식물에서 살충성 성질을 가지는 것으로 폭 넓게 인식되어 왔고 그리고 진딧물, 진드기, 배나무진디 및 가루이뿐만 아니라 항생제 활성을 포함해서, 연조직 곤충에 대해 독성을 가지는 것으로 나타났다. 수크로오스 에스테르는 또한 풍미 선구체로서 사료되고 식물의 수명 동안에 잎 표면 위에 축적된다. 그들은 경화되어서 식별될 수 있는 안정한 화합물 및 흡연 재료가다. 에스테르화된 작은 카르복실산은 가열시 수크로오스 에스테르로부터 방출된다. 이러한 작은 카르복실산은 매우 강력한 풍미 분자이고 담배의 오리엔탈 풍미에 대해 부분적으로 원인이 있는 것으로 사료된다. 수크로오스 에스테르는 식물의 선상 분비모 세포에서 생성된다. 선상 분비모 세포는 또한 단백질 (필로플라닌)및 디테르페노이드 (셈브레노이드 및 렙데노이드)와 같은-다른 잎 분비물의 합성을 위한 자리이다. 수크로오스가 수크로오스 에스테르로 에스테르화되는, 수크로오스 및 소분자 카르복실산은 두개의 별개의 대사의 블록을 통해서 생성된다.
담배 종은 잎의 표면 위에 존재하는 수크로오스 에스테르의 그들의 양과 품질이 다르다. 일반적인 규정으로서, 황색종, 버얼리 및 메릴랜드 종은 소량의 수크로오스 에스테르를 최대 5개의 탄소사슬 길이의 아실기로 축적하는 반면, 대부분의 오리엔탈종 및 많은 잎말이종은 최대 8개의 탄소 길이, 및 더 적은 범위의 아실기를 가지는 다량의 수크로오스 에스테르를 축적하고, 7개의 탄소사슬 길이의 아실기를 가지는 에스테르가 관찰될 수 있다. 담배종 중에서 생성되는 수크로오스 에스테르에서 관찰되는 이분법은 그것의 기능적 대립유전자를 위한 BMVSE (수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴) 및 그것의 비기능적인 대립유전자를 위한 bmvse로 불리는 단일의 우세한 자리 (locus)에 연결된다. BMVSE 게놈 지역은 담배의 염색체 A에 연결되었다.
Kroumova 및 Wagner (2009) General and Applied Plant Physiology 35, 3-4, p95-110는 이중 가닥 간섭성 RNA를 사용하는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현을 제거시키기 위해 역유전적 접근법을 이용해서 다양한 식물에서의 수크로오스 에스테르 아실기 함량을 변화시키기 위한 시도를 기재하고 있다. 이 연구에서는, 솔라눔 페넬리로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 유전자는 cDNA로부터 일부 유전자를 증폭하기 위해 사용되었다. 그들은 이때 센스 및 안티센스 배향으로 RNA 이중가닥 간섭성 RNA 구조체로 도입되고 아그로박테리움을 통해서 니코티아나 타바쿰 T.I. 1068, 니코티아나 글루티노사 cv. 24a 및 S. 페넬리로 형질전환된다. 니코티아나 타바쿰 식물을 사용해서 얻은 결과는 비-형질전환된 대조와 비교했을 때 감소된 베타-메틸발레릴 및 증가된 2-메틸부티릴-아실화를 통해서 당 에스테르가 풍부한 아실기에서 약간의 변화를 보인다는 것이다. 그러나 얻은 니코티아나 타바쿰 식물은 표현형으로 손상되었는데, 이것은 백화되고 일부가 말린 잎을 가지기 때문이다. 마찬가지로 형질전환된 니코티아나 글루티노사 및. 페넬리 식물은 표현형으로 손상되었다. 저자는 이소프로필말레이트 합성효소가 중요한 효소이고 그의 손상은 아마도 유해한 식물을 가져온다고 결론지었다.
식물에 대한 원하지 않는 효과를 최소화하면서 수크로오스 에스테르 조성물이 조절되는 식물이 본 분야에 필요하다. 본 발명의 목적은 이러한 필요성을 충족시키는 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로 니코티아나 타바쿰으로부터 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 활성 또는 발현을 조절하는 것으로 인해 식물의 전체의 대사에 대해 원하지 않는 효과를 덜 가지는, 수크로오스 에스테르 조성물에서의 변화를 야기한다는 놀라운 발견에 기초한다. 대부분의 효과는 식물의 분비모 (trichomes) 및 2차 대사에 집중된다. 따라서 니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소의 활성 또는 발현을 조절하는 것은 대조 식물과 비교했을 때 식물의 시각적 외관에서의 변형을 가져온다. 이것은 식물이 다양한 생성물의 상업적인 생성을 위해 사용될 수 있기 때문이고 여기서 시각적 외관의 변형은 산업에서 수용할 수 없거나 또는 수용할 수 없을 정도로 감소된 생산율을 가져올 수 있기 때문에 유리하다. 유리하게는 담배로부터 생성되는 에어로졸의 풍미 프로파일은 변형될 수 있어서 새로운 풍미 프로파일이 개변될 수 있다. 또한 수크로오스 에스테르 프로파일이 개변된 식물의 해충 내성이 변형될 수 있다. 수크로오스 에스테르의 조성물은 약물, 식품 첨가제, 흡연 풍미제 및 유기와 같은 및 유기 살충제 등의 성분으로서-폭 넓은 사용을 위해서 식물로부터 추출될 수 있다.
도1은 잎 분비물에서 측정되는 수크로오스 에스테르 이성질체의 측정된 양을 설명하고 있다. 측정은 bmvse 담배종 Hicks Broadleaf (HBL)로부터 그리고 BMVSE 담배종 Red Russian (RR)로부터 녹색 잎 디스크 (disc)의 아세톤/메탄올 세척에서 수행된다. 외부표준법으로서 수크로오스 옥타아세테이트의 첨가로부터 양을 측정한다. 각 변종당 n=4이다. C2C12:0는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 (포화된)수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=아세틸, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르이다. C2C13:0는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2= 부티릴, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 (포화된) 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르를 포함한다. C2C14:0는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2= 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 (포화된) 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1= 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4= 발레릴 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르를 포함한다. C2C15:0는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 (포화된)수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르를 포함한다; C2C16:0은 도5에 나타낸 일반식을 가지는 (포화된)수크로오스 에스테르이고 그리고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분이고; 또는 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고 그리고 R3는 아세틸, R1는 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분이다. C2C17:0는 도5에 나타낸 (포화된)수크로오스 에스테르를 포함하고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분이다. C2C18:0는 도5에 나타낸 (포화된)수크로오스 에스테르를 포함하고 R3는 아세틸, R1는 헥사노일, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분이다.
도2는 베타-메틸발레릴 에스테르를 함유하는 수크로오스 에스테르를 생성하거나 또는 생성하지 않는, 담배 품종에서의 분자량 및 그들의 발생에 의해서 분류되는, 주요한 수크로오스 에스테르 이성질체를 나타낸다. C5와 C6에 각각 기재된 2 및 3-메틸부티릴 또는 3 및 4 메틸발레릴 에스테르 사이에서 발생한 차이는 없다. 다음의 명명법은 아실 조성물을 정의하기 위해 사용된다. 예를 들어 C2C4C4C5를 참고하면, 이것은 각각 R3, R1, R2 및 R4의 아실기에서 탄소수를 의미한다. C2는 아세틸일 수 있고; C3은 부티릴일 수 있고; C4는 프로피오닐 또는 그의 이성질체 또는 이소부티릴일 수 있고; C5는 발레릴(펜타노일) 또는 그의 이성질체 또는 2-메틸-부티릴 또는 이소발레릴 또는 이소펜테노일 또는 펜테노일일 수 있고; C6는 헥사노일 또는 그의 이성질체 또는 2-메틸발레릴 또는 베타-메틸발레릴 또는 4-메틸발레릴일 수 있다. 아세틸 또는 수소는 R5 (도시하지 않음)에 존재하고, 적절하게는 수소일 수 있다.
도3은 수크로오스에 에스테르화되는, 분지쇄 아미노산 합성경로 및 아실기의 생성을 설명하고 있다. 층계식 (boxed)단계는 코어 분지쇄 아미노산 합성경로를 나타내고, 탄소사슬은 응축 이성질화 및 탈카르복실화의 주기당 하나의 탄소에 의해 확장된다. 1: 아세토락테이트 합성효소 [2.2.1.6]; 2: 아세토히드록시산 이소머환원효소[1.1.1.86]; 3: 3,4-디히드록시산 탈수효소 [4.2.1.9]; 4: 분지쇄 아미노산 아미노기전이효소 [2.6.1.42]; 5: 분지쇄 케토산 탈수소효소 복합물 (BCKD) ([1.2.4.4] [2.3.1.168] [1.8.1.4]); 6: 이소프로필말레이트 합성효소 [2.3.3.13]; 7: 이소프로필말레이트 이성화효소 [4.2.1.33]; 8: 이소프로필말레이트 탈수소효소 [1.1.1.85]; 9: 트레오닌 탈아미노효소 [4.3.1.19]. C4: 이소부타노일 에스테르; iC5: 3-메틸-부티릴 에스테르 (이소발레릴 에스테르); aiC5: 2-메틸-부티릴 에스테르 (안테이소-발레릴 에스테르); iC6: 4-메틸-발레릴 에스테르 (이소-카프로일 에스테르); aiC6: 3-메틸-발레릴 에스테르 (안테이소-카프로일 에스테르), ß-메틸발레릴 에스테르, BMV). 카르복실산은 이름이 가용성 형태를 반영하지만 중성형태로 존재한다. 제안된 IPMS2 촉매화 단계는 순환된다.
도4는 형질전환체 식물의 표면 잎 분비물에서 풍부한 수크로오스 테트라에스테르의 측정을 나타낸다. 잎은 독립적인 형질전환 경우로부터 발생하는, 1개월생의 재생 식물로부터 수집된다. 내부표준물질 (수크로오스 옥타아세테이트)은 2.5 ng/mg의 생중량의 비율로 첨가된다. 각각의 수크로오스 에스테르에 특이한 이온에 대해 기록 (recorded)되는 신호영역은 내부표준물질 영역의 비율로서 측정되고 도시된다. 내부표준물질 신호영역에 대한 비율은 잎 생 (fresh)중량에 대한 신호의 정규화를 허용한다. 여기에 제시되는 수크로오스 에스테르 명명법은 도2에 기재된다. A는 분비모 특이 프로모터 하에서 모체 변종 K326 (황색종, n=3)의 잎 분비물 및 SEQ ID NO:1를 발현시키는 형질전환체의 조성물이고; B는 바이러스성 프로모터의 조절 하에서 모체 변종 K326의 잎 분비물 및 SEQ ID NO:1을 발현시키는 형질전환체의 조성물이고; C는 분비모 특이 프로모터 하에서 모체 변종 Basma (오리엔탈, n=4)의 잎 분비물 및 SEQ ID NO: 9의 RNAi 구조체를 발현시키는 형질전환체의 조성물이고; 그리고 D는 바이러스성 프로모터 하에서 모체 변종 Basma의 잎 분비물 및 SEQ ID NO: 9의 RNAi 구조체를 발현시키는 형질전환체의 조성물이다. C2C14:0는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2= 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 (포화된) 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1= 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4= 발레릴 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르를 포함한다. C2C15:0는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 (포화된) 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르를 포함하고; C2C16:0는 도5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체이고 , R4는 헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분; 또는 도5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분인 수크로오스 에스테르를 포함한다. C2C17:0는 도5에 나타낸 (포화된) 수크로오스 에스테르를 포함하고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일이고 R5는 수소원자 또는아세틸 부분이다. C2C18:0는 도5에 나타낸 (포화된)수크로오스 에스테르를 포함하고 R3는 아세틸, R1는 헥사노일, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 및 R5는 수소원자 또는아세틸 부분이다.
도5는 수크로오스 에스테르 지지체의 구조를 나타낸다. R1 내지 R5는 에스테르 결합에 의해서 연결되는 수소원자 또는 아실부분이다.
도6은 수크로오스 에스테르에서 에스테르화되는 아실사슬을 설명하고 있다. R'는 수크로오스 분자를 나타낸다. 1. 아세틸, 2. 부티릴, 3. 프로피오닐, 4. 이소부티릴, 5. 발레릴 (펜타노일), 6. 2-메틸-부티릴, 7. 이소발레릴, 8. 이소펜테노일, 9. 펜테노일, 10. 헥사노일 또는 그의 이성질체 11. 2-메틸발레릴, 12, 베타-메틸발레릴, 13. 4-메틸발레릴. 이성질체 및 그의 유도체가 또한 고려된다. 그러므로 실시예에 의해서 이성질체는 이소부티릴과 같은-프로피오닐의 이성질체일 수 있다. 추가의 실시예에 의해서, 이성질체는 2-메틸-부티릴 또는 이소발레릴과 같은-발레릴(펜타노일)의 이성질체; 또는 이소펜테노일 또는 펜테노일과 같은-이중결합을 가지는 발레릴(펜타노일)의 이성질체일 수 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 이성질체는 2-메틸발레릴, 베타-메틸발레릴 또는 4-메틸발레릴과 같은-헥사노일의 이성질체일 수 있다. 이성질체는 하나 이상의 이중결합을 포함하거나, 또는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 면 및 구현예는 첨부하는 청구항에 기재하기로 한다.
첫번째 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO:14에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩되는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:15에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조체, 벡터 또는 발현 벡터로서, 선택적으로 상기 구조체, 벡터 또는 발현 벡터는, SEQ ID NO:8에 나타낸 서열 또는 그와 약 60% 이상의 상동성을 가지는 그것의 변종을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 프로모터 또는 분비모 프로모터 또는 자연적 이소프로필말레이트 합성효소 프로모터를 추가적으로 포함한다.
또 다른 태양에서, SEQ ID NO:8 또는 그것에 대해 약 60% 이상의 상동성을 가지는 그의 변종을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 세포 또는 구조체, 벡터 또는 발현 벡터가 제공된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 식물 세포를 포함하는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물이 제공된다.
또 다른 태양에서, 식물의 일부에서의 수크로오스 에스테르의 양을 조절하기 위한 방법이 제공되고, (i) 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하는 단계로서, 바람직하기는 이소프로필말레이트 합성효소는 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열을 포함하고; (ii) 단계 (i)에서 얻은 적어도 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 일부에서의 수크로오스 에스테르의 양을 측정하는 단계; 및 (iii) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 식별하는 단계로서, 여기에서 수크로오스 에스테르의 양은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되지 않은 대조식물과 비교했을 때 변화하였고, 바람직하기는 여기서 상기 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 시각적 외관은 대조 식물과 실질적으로 동일한 단계를 포함한다.
또 다른 태양에서, 이러한 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물이 제공된다.
또 다른 태양에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물이 제공되고, 여기서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질의 활성이 조절되고 적어도 식물의 일부가 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되지 않은 대조 식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르의 조성물에서 변화하고 그리고 여기서 상기 식물의 시각적 외관은 대조 식물과 실질적으로 동일하다.
또 다른 태양에서, 식물에서의 세포 또는 조직을 포함하는 바이오매스, 종자 또는 잎을 포함하는 식물 재료가 제공된다.
또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 식물 또는 식물 재료의 일부를 포함하는 담배 물품이 제공된다.
또 다른 태양에서, 수크로오스 에스테르의 조성물을 생성하기 위한 방법이 제공되고, 본 발명에 따른 적어도 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물, 식물 재료 또는 담배 물품의 일부를 제공하는 단계; (ii) 그로부터 (예를 들어, 하나 이상의) 수크로오스 에스테르를 추출하는 단계; 및 (iii) 선택적으로 추출된 수크로오스 에스테를 정제하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 수크로오스 에스테르의 조성물이 또한 제공된다.
적절하게는, 하나 이상의 수크로오스 에스테르는 도 5에 나타난 구조를 가지고 R3는 아세틸 또는 수소, 바람직하기는 아세틸이고; 하나 이상의 R1, R2 및 R4는 6개의 탄소를 가지는 하나 이상의 아실사슬이고, 바람직하기는 베타-메틸발레릴이고; 그리고 R5는 아세틸 또는 수소, 바람직하기는 수소이다.
적절하게는, 하나 이상의 수크로오스 에스테르는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2= 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르이고; 또는 R3=아세틸, R1= 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4= 발레릴 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르이고; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는수소 또는 아세틸 (C2C14:0)인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르이고; R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르이고; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르이고; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸 (C2C15:0)인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 원자 또는 아세틸 부분 (C2C16:0)인, 수크로오스 에스테르; 또는 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 원자 또는 아세틸 부분 (C2C16:0)인, 수크로오스 에스테르; 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 및 R5는 수소 원자 또는 아세틸 부분 (C2C17:0)인, 수크로오스 에스테르; 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 헥사노일, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 그리고 R5는 수소 원자 또는 아세틸 부분 (C2C18:0) 또는 그의 조합인 수크로오스 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적절하게는, 하나 이상의 수크로오스 에스테르는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사오닐 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사오닐 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸 (C2C15:0)인, 도 5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체, R4는 헥사오닐 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 (C2C16:0)인, 수크로오스 에스테르; 또는 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체, R4는 헥사오닐 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 (C2C16:0)인, 수크로오스 에스테르; 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 발레릴 또는 그의 이성질체, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 및 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 (C2C17:0)인 수크로오스 에스테르; 또는 도 5에 나타낸 일반식을 가지고 R3는 아세틸, R1는 헥사노일, R2는 헥사노일, R4는 헥사노일 및 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 (C2C18:0) 또는 그의 조합인 수크로오스 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 태양에서, (i) 여기에 기재한 바와 같이 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 또는 식물 재료로부터 담배 또는 담배 물품, 식물의 일부, 바람직하기는 잎을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 또는 식물 재료는 니코티아나 속에 속하거나; 또는 (ii) 여기에 기재된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴을 포함하는 조성물을 담배 또는 담배물품에 첨가하는 단계를 포함하는, 담배 또는 담배 물품의 풍미를 조절하기 위한 방법이 제공된다.
적절하게는, 식물의 시각적 외관은 대조 식물과 실질적으로 동일하다. 적절하게는, 식물의 시각적 외관은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물과 실질적으로 동일하고, 바람직하기는 여기서 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물의 줄기 높이와 실질적으로 동일하고 및/또는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물의 엽록소 함량과 실질적으로 동일하다. 다른 구현예에서, 어느 하나 이상의 다음의 특징: 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물에서의 성숙도, 식물당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입 각도, 잎 크기 (폭 및 길이), 마디 거리, 라미나-주맥 비율 및 잎의 착색은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물과 실질적으로 동일하다.
추가적인 태양은 여기에 기재된 식물(들)로부터의 세포 또는 조직을 포함하는 바이오매스, 종자 또는 잎에 관한 것으로, 이것은 담배 물품은 식물의 일부 또는 바이오매스, 종자 또는 잎을 포함하기 때문이다.
이러한 방법에 의해서 식별되거나 또는 식별될 수 있는 담배 재료는 또한 본 개시의 추가적인 면에서 제공된다.
식물의 해충 내성이 조절될 수 있다.
본 발명의 여전히 추가적인 태양을 이하에 기재하였다.
분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 유전자는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드 구조체는 적어도 5-30 뉴클레오티드, 30-50 뉴클레오티드, 50-100 뉴클레오티드, 100-150 뉴클레오티드, 150-200 뉴클레오티드, 200-300 뉴클레오티드, 300-400 뉴클레오티드, 400-500 뉴클레오티드, 500-600 뉴클레오티드, 600-700 뉴클레오티드, 700-1000 뉴클레오티드, 1000-1300 뉴클레오티드, 1300-1500 뉴클레오티드 또는 1500-1900 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
소모성 생성물은 본 발명에 따라 식물 재료, 바이오매스, 종자 또는 잎을 병합하거나 이용한다.
세포 또는 세포주는 본 발명에 따라 분리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구조체, 이중가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현 벡터 등을 포함한다.
이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 세포에서 그에 의해 인코딩되는 단백질의 활성을 조절하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 여기에 기재된 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구조체, 이중가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현벡터를 투여 (administer)하는 것을 포함한다.
이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드를 검출, 분리, 증폭 또는 분석하기 위한 방법으로서, 본 방법은 본 발명에 따라 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계 그리고 상기 폴리뉴클레오티드를 분리된 뉴클레오티드 서열로부터 10 이상의 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자로 혼성화하는 단계를 포함한다.
잎과 같은-적어도 식물의 일부의 수크로오스 에스테르 함량을 조절하기 위해서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질의 활성을 조절하는 시약의 용도.
하나의 구현예에서, 시약은 이소프로필말레이트 합성효소 핵산, 키메릭 이소프로필말레이트 합성효소 유전자, 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체, 안티센스 RNA, 이중가닥 RNA, cDNA, 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드와 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 거기에 공유결합된 비-뉴클레오티드 부분의 컨쥬게이트, 리보자임, 돌연변이원, 아연 집게, 소분자 또는 메가뉴클레아제이거나 그로부터 유도된다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편(들)은 안티센스 핵산, 리보자임, 접합섬-매개 트랜스-컨쥬게이트에 영향을 미치는 RNA, 간섭성 (interfering) RNA (RNAi), 가이드 RNA, 또는 다른 비-번역된 RNA 등을 인코딩한다.
추가적인 태양은 (a) 여기에 기재된 형질전환, 돌연변이 또는 비자연적으로 발생하는 식물로부터 종자를 얻는 단계; (b) 종자를 식물에 이식하고 성장시키는 단계; (c) 식물을 수확하는 단계; 및 (d) 수확된 식물로부터 담배 물품을 제조하는 단계를 포함하는 담배 물품을 생성하는 방법에 관한 것이다.
상기-언급한 구현예는 위에 기재된 각각의 면의 구현예로서 기재되어 있다.
본 발명의 범위 내에 사용되는 기술적 용어 및 표현은 일반적으로 식물의 관련된 분야 및 분자 생물학에서 통상적으로 그들에게 적용되는 의미로 제시된다. 다음의 모든 용어 정의는 본 발명의 전체 내용에 적용된다. 단어 "포함하는"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않고, 그리고 부정관사 "a" 또는 "an" 복수를 배제하지 않는다. 단일 단계는 청구항에 재인용되는 여러 특징의 기능을 만족할 것이다. 주어진 숫자 값 또는 범위에 제시되는 문맥에서의 용어 "약", "필수적으로" 및 "대략"은 제시된 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 또는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내인 값 또는 범위를 의미한다.
용어 "분리된"은 그것의 자연적인 환경으로부터 얻을 수 있는 어떤 개체를 의미하지만, 이 용어는 정제도를 내포하지 않는다.
"벡터"는 핵산, 핵산 구조체 및 핵산 컨쥬게이트 등의 전달을 가능하게 하는 핵산 성분의 조합을 포함하는 핵산 비히클을 의미한다. 적합한 벡터는 원형의, 이중가닥 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥 핵산 플라스미드; 및 어느 기원의 다른 벡터와 같은 염색체의 복제를 할 수 있는 에피솜을 포함한다.
"발현 벡터"는 핵산, 핵산 구조체 및 핵산 컨쥬게이트 등의 발현을 가능하게 하는 핵산 성분의 조합을 포함하는 핵산 비히클이다. 적절한 발현 벡터는 원형의, 이중가닥 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥 핵산 플라스미드; 및 어느 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 염새체외 복제할 수 있는 에피솜을 포함한다. 발현 벡터는 이하에 정의된 핵산, 핵산 구조체 또는 핵산 컨쥬게이트 상류에 위치하고 이에 작동가능하게 연결되는 적어도 프로모터를 포함한다.
용어 "구조체"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥의, 재조합 핵산 단편을 나타낸다. 구조체는 상보적인 "센스 또는 코딩 가닥"으로 염기-쌍된 "주형 가닥"을 포함한다. 제시된 구조체는 발현 벡터와 같은-벡터 내에 위치하는 프로모터의 배향과 관련해서, 두 가지 가능한 배향, 동일한 (또는 센스)배향 또는 역 (또는 안티센스) 배향으로 벡터에 삽입될 수 있다. 예시적인 구조체는 SEQ ID NO: 9에 기재한다.
"프로모터"는 통상적으로 상류에 위치하고 이중가닥의 핵산 단편에 작동가능하게 연결되는 핵산 요소/서열을 의미한다. 프로모터는 목적하는 네이티브 유전자에 근접하는 영역으로부터 전체적으로 유도될 수 있거나, 다른 네이티브 프로모터 또는 합성의 핵산 단편으로부터 유도되는 다른 요소로 구성될 수 있다. 예시적인 프로모터는 SEQ ID NO: 8에 기재한다.
용어 "상동성, 동일성 또는 유사성"은 서열 배열에 의해 비교되는 두개의 폴리펩티드 또는 두개의 핵산 분자에서의 서열 유사도를 의미한다. 비교되는 두개의 별개의 핵산 서열 사이의 상동성 정도는 비교할 수 있는 위치에서 동일하거나, 일치하는 뉴클레오티드의 수의 기능이다. 퍼센트 동일성은 육안 검사 및 수학적 계산에 의해서 측정될 수 있다. 선택적으로, 두 가지 핵산 서열의 퍼센트 동일성은 ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 측정될 수 있다.
용어 "식물"은 수명주기 또는 발달, 및 그의 후손의 어느 단계에서 어느 식물을 의미한다. 하나의 구현예에서, 식물은 담배 식물이며, 이것은 니코티아나 속에 속하는 식물을 의미한다. 담배 식물의 바람직한 종, 재배품종, 혼성체 및 변종은 여기에 기재된다.
"식물 세포"는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 의미한다. 식물 세포는 세포벽이 없는 원특성체, 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포, 또는 이들을 한정하는 것은 아니지만, 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물과 같은 고조직화된 단위의 일부 형태일 수 있다.
용어 "식물 재료"는 바이오매스, 잎, 잎 라미나 (lamina), 주맥, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 열매, 꽃가루, 난세포, 컨쥬게이트체, 종자, 꺾꽂이용 가지, 분비물, 추출물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 어느 다른 부분 또는 생성물을 포함하는, 식물로부터 얻을 수 있는 어느 고체, 액체 또는 기체 조성물, 또는 그의 조합을 의미한다. 하나의 구현예에서, 식물 재료는 바이오매스, 종자 또는 잎을 포함하거나, 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 식물 재료는 잎을 포함하거나, 이로 구성된다.
용어 "변종"은 동일한 종의 다른 식물로부터 구분되는 일정한 특징을 공유하는 식물의 개체를 의미한다. 하나 이상의 뚜렷한 특징을 가지면서, 변종은 이러한 변종 내의 각각에서 아주 작은 전체적인 변종을 더욱 특징으로 한다. 변종은 종종 상업적으로 판매되고 있다.
여기에 사용되는 용어 "계통" 또는 "육종 계통"은 식물 육종 동안에 사용되는 식물군을 나타낸다. 계통은 다른 특징에 대해 각각에서 약간의 변화기 있을 수 있지만,목적하는 하나 이상의 특징에 대해 각각에서 변이를 덜 나타내기 때문에 변종과 구별될 수 있다.
용어 "조절하는"은 폴리펩티드의 활성을 감소, 억제, 증가 또는 다른 한편으로는 영향을 미치는 것을 의미할 수 있다. 용어는 또한 이들을 한정하지는 않지만, 전사 활성 조절을 포함할 수 있는, 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 활성을 감소, 억제, 증가 또는 다른 한편으로는 영향을 주는 것을 나타낼 수 있다.
여기에 사용되는 용어 "감소하다" 또는 "감소되는"은 이들을 한정하지는 않지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단배질 발현과 같은 양 또는 활성에 대해 약 10% 내지 약 99%의 감소, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 감소를 의미한다.
여기에 사용되는 용어 "억제하다" 또는 "억제되는"은 이들을 한정하는 것은 아니지만 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단백질 발현과 같은 양 또는 활성에 대해 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 약 98% 이상, 99% 이상, 그러나 특히 100%의 감소를 의미한다.
여기에 사용되는 용어 "증가하다" 또는 "증가되는"은 이들을 한정하는 것은 아니지만 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단백질 발현과 같은 양 또는 활성에 대해 약 10% 내지 약 99%의 증가, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 또는 200% 이상 또는 그 이상의 증가를 의미한다.
대조 식물 또는 대조 식물 세포의 문맥에서의 용어 "대조"는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 개변 (예를 들어, 증가되거나 또는 감소되는)되지 않는 식물 또는 식물 세포를 의미하므로, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 개변된 식물과의 비교를 제공할 수 있다. 대조 식물은 빈 (empty) 벡터를 포함할 수 있다. 대조 식물은 야생형 식물에 해당할 수 있다.
하나의 면에서, 서열목록에 나타낸 어느 폴리뉴클레오티드를 포함해서, 여기에 기재된 어느 서열에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 뉴클레오티드는 여기에서 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
하나의 면에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:1에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는, 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:10에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:12에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, SEQ ID NO:14에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:8에 대해 적어도 0%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. SEQ ID NO: 8은 바람직한 프로모터를 인코딩한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, 이것은 개변되지 않거나 개변된 디옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 제한 없이, 게놈 DNA, 상보적 DNA (cDNA), mRNA, 또는 안티센스 RNA 또는 그의 단편일 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥의 핵산일 수 있고, 이것은 단일가닥과 이중가닥 영역의 혼합물이고, DNA와 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일가닥과 이중가닥 영역의 혼합물 또는 그의 단편(들)과의 혼합물을 가지는 혼성분자이다. 또한 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 둘다 또는 그의 단편(들)을 포함하는 삼중가닥 영역으로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 포스포티오에이트와 같은 하나 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있고, 그리고 펩티드 핵산 (PNA)일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈DNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 각각의 뉴클레오티드, 또는 상기의 조합의 분리되거나 또는 클론된 단편으로부터 결합될 수 있다. 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 서열로 나타나지만, 서열은 그것의 역보체를 포함하여, 그들의 해당하는 RNA 서열, 및 그들의 상보성 (예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
용어 "이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드"는 니코티아나 타바쿰으로부터 이소프로필말레이트 합성효소 (IMPS)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그리고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 실질적인 상동성 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적인 동일성을 가지는 폴리펩티드; SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 서열에 대해 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변종; SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 단편; 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 해당하는 단편에 대해 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는, 실질적인 동일성 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적인 동일성을 가지는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 단편을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드는 또한 이소프로필말레이트 합성효소로서 작용하는 폴리펩티드를 인코딩하기 위해 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14에 대한 충분하거나 실질적인 동일성 또는 유사성 정도를 포함하는 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용어 "이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드"는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14와 같이 여기에 지정되는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다.
일부 경우에 예를 들어 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포포로아미디티 연결기; 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 구조 및 연결기를 포함하는, 대안의 구조를 가질 수 있는 폴리뉴클레오티드 유사체가 포함될 수 있지만, 여기에 기재되는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 수 있다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드는 양성 구조; 비-이온 구조, 및 비-리보오스 구조를 가지는 것들을 포함한다. 리보오스-포스페이트 구조의 개변은 다양한 이유를 위해서, 예를 들어 생리학적 환경에서 또는 바이오칩 (biochip)에서의 프로브의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 비자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드와 유사체의 혼합물은 제조될 수 있고; 선택적으로, 다른 폴리뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 및 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드오와 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다.
예를 들어 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포포로아미디트 결합 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 구조 및 결합을 포함하는 다양한 폴리뉴클레오티드 유사체가 알려져 있다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드는 양성구조, 비이온 구조 및 비-리보오스 구조를 가지는 것들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 탄소환의 당을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다.
다른 유사체는 펩티드 폴리뉴클레오티드 유사체인 펩티드를 포함한다. 이러한 구조는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드의 고전하된 포스포디에스테르 구조와는 반대로, 실질적으로 중성 조건 하에서 실질적으로 비-이온성이다. 이것은 장점을 가져올 수 있다. 첫째, 펩티드 폴리뉴클레오티드 구조는 개선된 혼성화 반응속도를 나타낼 수 있다. 펩티드 핵산은 불일치 대 완벽히 일치하는 염기쌍에 대해 융점에서의 큰 변화를 가진다. DNA 및 RNA는 통상적으로 간격 불일치에 대해 융점에서의 2-4 ℃의 저하를 나타낸다. 비-이온성 펩티드 폴리뉴클레오티드 구조와 관련해서, 저하는 7-9℃에 근접하다. 유사하게도, 이러한 구조에 결합되는 염기의 비-이온성 성질, 혼성화는 염농도에 비교적 민감하지 않다. 또한, 펩티드 핵산은 세포 효소에 의해 더 적은 범위로 저하되지 않거나, 또는 저하될 수 있기 때문에 더 안정적일 수 있다.
개시된 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편의 조합의 용도 중에서, 핵산 혼성화 분석에서의 프로브 또는 핵산 증폭 분석에서의 프라이머와 같은 단편의 용도가 있다. 이러한 단편은 일반적으로 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 또는 그 이상의, DNA 서열의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, DNA 단편은 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 또는 그 이상의, DNA 서열의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 기술은 또한 BMVSE 및 bmvse 식물을 식별하기 위해 사용될 수 있는데, 이것은 기능적인 이소프로필말레이트 합성효소 유전자가 수크로오스 에스테르의 형성을 위해 필요하다는 것을 여기에 나타내기 때문이다. 유전적 마커 및 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 대립유전자에 의해 폐쇄 (close)는 식물에 의한 수크로오스 에스테르 제조의 선구체로서 사용될 수 있다. 이러한 테스트는 식물 변종을 검색하거나 흡연 품질 또는 배치 타입 상동서을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특정하게 검출하거나 특정하게 증폭시키거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 특정하게 검출하고 그리고 특정하게 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머의 용도를 포함하는, 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 추가의 태양에서, 식물을 식별하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 (a) 목적하는 식물로부터 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 단계로서, 여기서 상기 식물에 있는 상기 폴리뉴클레오티드의 존재는 상기 식물이 수크로오스 에스테르를 제조할 수 있다는 것을 나타내는 단계를 포함하는, 수크로오스 에스테르를 제조할 수 있다. 적어도 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 일부를 검출하기 위한 키트가 또한 제공되고, 이것은 적어도 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 일부를 특정하게 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 프로브를 포함한다. 키트는 중합 연쇄 반응 (PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 시약- 또는 Southern Blots, Northern Blots, in-situ 혼성화, 또는 미세분석과 같은 핵산 프로브 혼성화-검출 기술을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 Western Blots, ELISAs, SELDI 질량분석법 또는 테스트 스트립과 같은 항체 결합-검출 기술을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 DNA 서열을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 수크로오스 에스테르 함량을 측정하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 기재된 하나 이상의 방법을 위한 지침을 포함할 수 있다. 기재된 키트는 유전적 동일성 측정, 계통발생학적 연구, 유전형, 일배체형, 계통분석 또는 특히 공우성 스코어링을 가지는 식물 육종에 유용할 수 있다. 방법 및 키트는 BMVSE과 bmvse 변종 사이의 크로스 및 후손에서 식물의 서열-기재 선택에 의존하는 육종 접근법으로 사용될 수 있다. 통상적으로, BMVSE 생성 변종에 존재하는 기능적인 이소프로필말레이트 합성효소 유전적 영역을 나타내는 식물 또는 bmvse 비생성 변종에 존재하는 역기능적인 이소프로필말레이트 합성효소 유전적 영역을 나타내는 식물이 선택될 것이다.
혼성화 조건의 선별 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 파라미터는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, 및 T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되어 있다. 여기에 기재된 아미노산 서열과 비교했을 때 유전적 코드의 지식을 이용해서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 세트가 생성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR에서 프라이머로서 유용하고, DNA 단편은 분리되고 증폭된다. 특정한 구현예에서, 축퇴성 프라이머는 유전적 라이브러를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러는 이들을 한정하지는 않지만, cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리, 및 전자적 발현 서열 태그 또는 DNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 방법에 의해서 인식되는 상동성 서열은 이때 프로브로서 사용되어서 여기에서 인식되는 서열의 상동성을 인식할 수 있다.
또한 잠재적인 사용은 여기에 기재된 바와 같이 감소된 염격한 조건, 통상적으로 적절하게 엄격한 조건, 및 일반적으로 고도로 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머 또는 프로브)이다. 혼성화 조건의 선별 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본 파라미터는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 에 의해 기재되어 있고 그리고 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 염기 조성물을 기초로 하여 본 분야의 당업자에 의해서 쉽게 측정될 수 있다.
적절하게 엄격한 조건을 얻는 한가지 방법은 5x 표준 구연산나트륨, 0.5% 소듐 도데실 설페이트, 1.0 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6x 표준 구연산나트륨을 함유하는 미리세정하는 용액의 사용, 및 약 55℃의 혼성화 온도 (또는 약 42℃의 혼성화 온도로, 약 50%의 포름아미드를 함유하는 것과 같은, 다른 유사한 혼성화 용액) 및 0.5x 표준 구연산나트륨, 0.1% 소듐 도데실 설페이트의 세정조건을 포함한다는 것이다. 일반적으로, 고도로 엄격한 조건은 약 68℃, 0.2x 표준 구연산나트룸, 0.1% 소듐도데실 설페이트로 세정하면서, 위와 같이 혼성화 조건으로서 정의된다. SSPE (1xSSPE는 0.15M 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 및 1.25 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, pH 7.4)는 혼성화 및 세정 완충액에서 표준 구연산나트륨 (1x 표준 구연산나트륨은 0.15M 염화나트륨 및 15 mM 구연산나트륨)으로 치환될 수 있고; 세정은 혼성화가 완료된 후에 15분동안 수행된다. 세정 온도 및 세정 염농도는 본 분야의 당업자에게 알려지고 이하에 더 설명된 바와 같이 (예를 들어, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참고), 혼성화 반응 및 이중 안정성을 조절하는 기본 원리를 적용함으로써, 원하는 엄격한 정도를 얻기 위해 필요에 따라 조절될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 알려지지 않은 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 폴리뉴클레오티드를 혼성화할 때, 혼성체 길이는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 그것으로 추정된다. 공지의 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화할 때, 혼성화 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 배열하고 그리고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 식별함으로써 측정될 수 있다. 길이가 50 미만의 염기쌍으로 예상되는 혼성체를 위한 혼성화 온도는 혼성체의 융점의 5 내지 10℃ 미만이여야 하고, 여기서 융점은 다음의 식에 따라 결정된다. 길이가 18 미만인 염기쌍의 혼성체의 경우, 융점 (℃)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수)이다. 길이가 18 이상인 혼성체의 경우, 융점 (℃)=81.5+16.6(log10 [Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이고, 여기서 N은 혼성체의 염기수이고, 그리고 [Na+] (1x 표준 구연산나트륨=0.165M에 대한 [Na+])는 혼성화 완충액에서 나트륨 이온의 농도이고 . 통상적으로, 각각의 이러한 혼성화 폴리뉴클레오티드는 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 길이의 25% 이상 (일반적으로 50%, 60%, 또는 70% 이상, 가장 일반적으로 80% 이상)인 길이를 가지고, 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 60% 이상 (예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 상동성을 가진다.
본 분야의 당업자에 의해서 이해됨과 같이, 선형 DNA는 두 가지 가능한 배향: 5'-대-3' 방향과 3'-대-5' 방향을 가진다. 예를 들어, 참고 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 5'-대-3' 방향에 위치하고, 그리고 두번째 서열이 5'-대-3' 방향에 위치하면, 이때 참고 서열 및 두번째 서열은 동일한 방향으로 배향되거나, 또는 동일한 배향을 가진다. 통상적으로, 제시된 프로모터의 조절 하에서 목적하는 프로모터 서열 및 유전자는 동일한 배향을 위치한다. 그러나, 5'-대-3' 방향에 위치하는 참고 서열과 관련해서는, 두번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 3'-대-5' 방향에 위치하면, 이때 참고서열 및 두번째 서열은 안티센스 방향으로 배향되거나, 안티센스 배향을 가진다. 서로 안티센스 배향을 가지는 두 가지 서열은 참고서열 (5'-대-3' 방향)및 참고 서열의 역상보성 서열 (5'-대-3'에 위치하는 참고 서열)은 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에 위치하면, 동일한 배향을 가지는 것과 같이 선택적으로 기재될 수 있다. 여기에 기재한 서열은 5'-대-3' 방향으로 나타난다.
여기에 제공되는 재조합 구조체는 식물 또는 식물 세포를 사용하기 위해 형질전환하기 위해 사용될 수 있어서 이소프로필말레이트 합성효소 단백질 발현 수준을 조절할 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구조체는 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드를 인코딩하고, 식물 또는 세포에서 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드를 발현하는데 적절한 조절 영역에 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서 폴리뉴클레오티드는 여기에 기재된 바와 같은 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩되는 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드는 네이티브 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 세포에 이형일 수 있다. 일부 경우에, 재조합 구조체는 조절 영역에 작동가능하게 연결되는, 이소프로필말레이트 합성효소-조절 폴리펩티드의 발현을 감소하거나 억제시키닌 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
여기에 기재된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 구조체를 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 구조는 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BACs, YACs, 또는 PACs와 같이 본 분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 제한 없이, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스, 및 레트로바이러스로부터 유도되는 플라스미드 및 바이러스성 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시줄기은 상업적으로 이용할 수 있다.
벡터는 또한 예를 들어 복제의 기원, 지지체 결합 영역 또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 식물 세포에 대해 선택할 수 있는 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들어, 마커는 항생제 (예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신 또는 하이그로마이신), 또는 제초제 (예를 들어, 글리포세이트, 클로술푸론 또는 포스피노트리신)에 대한 내성과 같은, 살생물제 내성을 부여할 수 있다. 또한, 발현벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출 (예를 들어, 정제 또는 국지화)을 용이하게 하기 위해 고안된 태그 서열을 포함할 수 있다. 루시퍼라아제, 베타-글루쿠로니다아제 (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST), 폴리히스티딘, c-myc 또는 헤마글루티닌 서열과 같은 태그 서열은 통상적으로 인코딩된 폴리펩티드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노말단을 포함해서, 폴리펩티드 내에 어느 곳에서나 삽입될 수 있다.
식물 또는 식물 세포는 안정하게 형질전환되기 위해 그것의 게놈으로 통합된 재조합 폴리뉴클레오티드를 가짐으로써 형질전환될 수 있다. 안정하게 형질전환된 세포는 통상적으로 각 세포분할을 가지는 도입된 폴리뉴클레오티드를 유지한다. 식물 또는 식물 세포는 일시적으로 형질전환될 수 있어서 재조합 폴리뉴클레오티드는 그의 게놈으로 통합되지 않는다. 일시적으로 형질전환된 세포는 통상적으로 각각의 세포분할을 가지는 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 손실해서 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드가 다량의 세포분할 후에 딸세포에서 검출될 수 없도록 한다.
바이오리스틱 (biolistics), 유전자 건 (gun)기술, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스 벡터-매개 형질전환 및 전기천공법을 포함하는 많은 방법은 여기에 모두 포함되어 있는 식물 세포를 형질전환하기 위해 본 분야에 이용할 수 있다. 외부 핵산을 식물 염색체로 통합하기 위한 아그로박테리움계는 식물 유전공학을 위해 광범위하게 연구되고, 개변되고 그리고 채택되어왔다. 센스 또는 안티센스 배향으로, 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 정제된 담배 단백질 대상에 해당하는, 핵산 서열을 포함하는 네이키드 재조합 핵산 분자는 통상적인 방법에 의해서 적절한 T-DNA 서열에 결합된다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜 기술에 의해 또는 전기천공법 기술에 의해서 담배 원특성체로 도입되고, 둘다가 표준이다. 선택적으로, 정제된 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 이러한 벡터는 생 아그로박테리움 세포로 도입되고, 이때 핵산을 식물 세포로 특성변환한다. T-DNA 벡터 서열을 수반함이 없이 네이키드 DNA에 의한 형질전환은 담배 원특성체와 핵산 -함유 리포솜의 융합을 통해서 또는 전기천공법을 통해서 달성될 수 있다. T-DNA 벡터 서열에 의해 수반되지 않은 네이키드 DNA는 불활성의, 고속의 미세투사물을 통해서 담배 세포를 형질전환하기 위해서 사용될 수 있다.
세포 또는 배양된 조직은 형질전환을 위한 수용체 조직으로서 사용되고, 식물은 원한다면 본 분야의 당업자에게 알려진 기술에 의해서 형질전환된 배양물로부터 축퇴될 수 있다. 재조합 구조체에 포함될 조절 영역의 선택은 이들을 한정하지는 않지만, 효율성, 선택성, 유도성, 바람직한 발현수준, 및 세포- 또는 조직-우선적 발현을 포함하는 여러 요인에 따라 다르다. 코딩 서열에 비해 조절 영역을 적절히 선택하고 그리고 배치킴으로써 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 본 분야의 당업자에게 일상적인 일이다. 폴리뉴클레오티드의 전사는 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 적절한 조절 영역은 특정한 세포 유형에서, 유일하게 또는 우세하게 전사를 개시한다. 식물 게놈 DNA에 있는 조절 영역을 인식하고 특징화하기 위한 방법이 본 분야에 알려져 있다.
적절한 프로모터는 다른 조직 또는 세포 유형 (예를 들어, 뿌리-특이 프로모터, 슈트-특이 프로모터, 크실렘-특이 프로모터)에 존재하거나, 또는 상이한 개발단계 동안에 존재하거나, 또는 상이한 환경조건에 대해 존재하는 조직-특이 요인에 의해 인식되는 조직-특이 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터는 특정한 유도체를 필요로 하지 않고 대부분의 세포 유형에서 활성화될 수 있는 구성적 프로모터를 포함한다. 이소프로필말레이트 합성효소 RNAi 폴리펩티드 생성을 조절하기 위한 적절한 프로모터의 예시는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터를 포함한다. 본 분야의 당업자는 재조합 프로모터의 다중 변종을 생성할 수 있다.
조직-특이 프로모터는 식물성 조직 또는 생식 조직과 같은 식물 개발 동안에 특정한 시간에서 특히 세포 또는 조직에서만 활성인 전사 조절 요소다. 조직-특이 발현은 예를 들어, 특정한 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 발현이 바람직할 때 유리할 수 있다. 개발적 조절 하에서 조직-특이 프로모터의 예시는 예를 들어 뿌리 또는 잎과 같은 식물성 조직, 또는 과일, 배주, 종자, 꽃가루, 피스톨 (pistol), 꽃, 또는 배피 조직과 같은 재생성 조직과 같은 특정한 조직에서만 (또는 주로) 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 생식 조직-특이 프로모터는 예를 들어, 꽃밥-특이, 배주-특이, 배낭-특이, 배젖-특이, 외피-특이, 종자 및 종피-특이, 꽃가루-특이, 꽃잎-특이, 꽃받침-특이, 또는 그의 조합일 수 있다.
적절한 잎-특이 프로모터는 피루브산, C4 식물 (옥수수)의 오르토포스페이트 디키나아제 (PPDK) 프로모터, 옥수수의 cab-m1Ca+2 프로모터, Arabidopsis thaliana myb-관련 유전자 프로모터 (Atmyb5), 잎 및 빛-성장한 모종에서 발현된 리불로오스 비포스페이트 카복실라아제 (RBCS) 프로모터 (예를 들어 잎 및 빛-성장한 모종에 발현된 토마토 RBCS 1, RBCS2 및 RBCS3A 유전자, 토마토 과일을 개발하는데 발현된 RBCS1 및 RBCS2 또는 고수준에서 잎새 및 잎관에 있는 엽록소 세포에 거의 배타적으로 발현된 리불로오스 비스포스페이크 카복실라아제 프로모터)를 포함한다.
적절한 노화-특이 프로모터는 과일 숙성 동안에 활성인 프로모터, 잎의 노화 및 절단, 시스테인 프로테아제를 인코딩하는 유전자의 옥수수 프로모터를 포함한다. 적절한 꽃밥-특이 프로모터가 사용될 수 있다. 본 분야의 당업자에게 알려진 적절한 루프-바람직한 프로모터가 선택될 수 있다. 적절한 종자-바람직한 프로모터는 둘다의 종자-특이 프로모터 (종자 저장 단백질의 프로모터와 같은 종자 개발 동안에 활성인 이러한 프로모터들) 및 종자-발아 프로모터 (종자 발아 동안에 활성인 이러한 프로모터들)을 포함한다. 이러한 종자-바람직한 프로모터는 이들을 한정하는 것은 아니지만, Cim1 (시토키닌-유도 메세지 (message)); cZ19B1 (옥수수 19 kDa 제인); milps (myo-이노시톨-1-포스페이트 합성효소); Zm-40로 또한 알려진 mZE40-2; nuclc; 및 celA (셀룰로오스 합성효소)을 포함한다. 감마-제인은 배젖-특이 프로모터다. Glob-1은 배낭-특이프로모터다. 쌍자엽의 경우, 종자-특이 프로모터는 이들을 한정하지는 않지만, 콩 베타-파세올린, 나핀, ß-콘글리시닌, 콩 렉틴, 크루시페린 등을 포함한다. 단자엽의 경우, 종자-특이 프로모터는 이들을 한정하지는 않지만, 옥수수 15 kDa 제인 프로모터, 22 kDa 제인 프로모터, 27 kDa 제인 프로모터, 감마-제인 프로모터, (gzw64A 프로모터, Genbank 접근번호 S78780과 같은) 27 kDa γ-제인 프로모터 ,왁시 (waxy) 프로모터, 수축된 1 프로모터,수축된 2 프로모터, 글로불린 1 프로모터 (Genbank 접근번호 L22344 참고), Itp2 프로모터, cim1 프로모터, 옥수수 말단1 및 말단2 프로모터, nuc1 프로모터, Zm40 프로모터, eep1 및 eep2; lec1, 티오레독신 H 프로모터; mlip15 프로모터, PCNA2 프로모터; 및 수축된-2 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터의 예시는 병원체 공격, 혐기성 조건, 상승된 온도, 빛, 가뭄, 저온, 또는 염의 고농도에 반응하는 프로모터를 포함한다. 병원체-유도성 프로모터는 병인성-관련 단백질 (PR 단백질)로부터 그들을 포함하고, 이것은 병원체에 의해서 다음의 유도된 감염이다 (예를 들어, PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나아제, 키티나아제).
식물 프로모터 외에, 다른 적절한 프로모터는 박테리아성 기원, 예를 들어 옥토핀 합성효소 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터 및 (Ti 플라스미드로부터 유도되는) 다른 프로모터로 유도될 수 있거나, 바이러스성 프로모터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 및 19S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 구성적 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터, 또는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터)로부터 유도될 수 있다.
용어 "이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드"는 니코티아나 타바쿰으로부터 이소프로필말레이트 합성효소 (IPMS)를 인코딩하는 폴리펩티드를 의미하고 그리고 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드 변종에 의해서 인코딩되는 아미노산 서열; 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드(들)의 단편; 및 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO: 15의 해당하는 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO: 15의 단편을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드 변종을 포함한다. 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드는 또한 이소프로필말레이트 합성효소로서 작용을 하는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO: 15에 대해 충분하거나 상당한 동일성 또는 유사성 정도를 포함하는 서열을 포함한다. 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드의 단편은 통상적으로 이소프로필말레이트 합성효소 활성을 유지한다. 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드는 또한 어느 유형의 변형 (예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재접힘, 이성질화, 3차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입함으로써 생성되는 돌연변이를 포함하고, 이것은 그들이 여전이 이소프로필말레이트 합성효소로 제공될 때, 당연히 조작되거나 자연적으로 분리될 수 있다. 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드는 공지의 방법을 이용해서 선형 형태이거나 고리화될 수 있다. 용어 "이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드"는 그곳에 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO: 14에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그곳에 100% 서열 상동성을 가지는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:15에 기재한 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드를 나타낼 수 있다.
또 다른 태양에서, 서열목록에 나타낸 어느 폴리펩티드를 포함해서, 여기에 기재된 어느 서열에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리펩티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 폴리펩티드는 그곳에 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
폴리펩티드는 어느 유형의 변형 (예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글로코실화 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입함으로써 제조될 수 있고, 이것은 당연히 조작되거나 자연적으로 분리될 수 있다. 변종은 사일런싱 변화를 만들고 기능적으로 동등한 단백질을 가져오는 변형을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 기쿼리 2차 결합 활성이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및 양친매성 특성의 유사성을 기초로 하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 음전하된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양전하된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성 값을 가지는 비전화된 극성 헤드기를 가지는 아미노산은 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 구성적 치환체는, 예를 들어 하기의 표에 따라서 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼의 동일한 블록 및 바람직하기는 세번째 컬럼의 동일한 라인에서의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
표
Figure 112014031202074-pct00001
폴리펩티드는 성숙 단백질 또는 비성숙 단백질 또는 비성숙 단백질로부터 유도되는 단백질일 수 있다. 폴리펩티드는 공지의 방법을 이용해서 선형형태 또는 고리화될수 있다. 폴리펩티드는 통상적으로 10 이상, 20 이상, 30 이상, 또는 40 이상의 인접한 아미노산을 포함한다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:11에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:13에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:15에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드가 제공된다.
폴리펩티드 서열의 단편은 또한 여기에 개시되어 있고, 적절하게는 이러한 단편은 전체 서열 길이의 활성을 유지한다.
돌연변이 폴리펩티드는 돌연변이 폴리펩티드를 포함하는 비자연적으로 발생하는 식물인 돌연변이 식물 또는 형질전환 식물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 적절하게는, 돌연변이 폴리펩티드는 돌연변이되지 않은 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 돌연변이 폴리펩티드의 활성은 돌연변이되지 않은 폴리펩티드보다 높거나, 낮거나, 또는 동일할 수 있다.
폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하기 위해서 배양 조건 하에서 형질전환되거나 또는 재조합된 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 생성물인 발현된 폴리펩티드는 이때 공지의 정제 공정을 이용해서 이러한 배양물로부터 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 정제는 폴리펩티드에 결합할 시약을 함유하는 친화성 컬럼; 이러한 친화성 수지에 하나 이상의 컬럼 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 단계; 또는 면역친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드는 또한 정제를 용이하게 하는 형태로 발현될 수 있다. 예를 들면, 말토오스 결합 폴리펩티드, 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 또는 티오레독신의 그들과 같은 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제를 위한 키트는 상업적으로 이용할 수 있다. 폴리펩티드는 에피토프에 태그될 수 있고 이후에 이러한 에피토프에 관련된 특정한 항체를 사용함으로써 정제될 수 있다. 역-상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은- 하나 이상의 액체 크로마토그래피 단계는 이용될 수 있어서 폴리펩티드를 더 정제할 수 있다. 다양한 조합으로, 앞선 정제 단계의 일부 또는 모두는 이용되어서 실질적으로 상동성인 재조합 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 이와 같이 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드로 유리될 수 있고 그리고 "실질적으로 정제된 폴리펩티드"로서 여기에 정의되고; 이러한 정제된 폴리펩티드는 폴리펩티드, 단편, 변종 등을 포함한다. 폴리펩티드와 단편의 발현, 분리, 및 정제는 이들을 한정하지는 않지만 여기에 기재된 방법을 포함해서, 어느 적절한 기술에 의해 달성될 수 있다.
발현된 폴리펩티드를 친화성-정제하기 위해서, 폴리펩티드에 대해 발생한 모노클로날 항체와 같은 친화성 컬럼을 이용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어 고염의 용리 완충액에서, 통상적인 기술을 사용하고, 이때 사용하기 위해 저염 완충액으로 투석되거나 또는 이용되는 친화성 매트릭스에 따라 달라지는 pH 또는 다른 성분을 변화시킴으로써 친화성 컬럼으로부터 제거될 수 있거나, 또는 친화성 부분의 자연적으로 발생하는 기질을 사용헤서 경쟁적으로 제거될 수 있다.
폴리펩티드는 또한 공지의 통상적인 화학적 합성에 의해서 제조될 수 있다. 합성적 수단에 의해서 폴리펩티드 또는 그의 단편을 구성하기 위한 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다. 네이티브 폴리펩티드를 가지는, 1차, 2차 또는 3차 구조적 또는 형태학적 특성을 공유해서, 합성적으로-구성된 폴리펩티드 서열은 생물학적 활성을 포함해서, 여기에 일반적으로 생물학적 특성을 가질 수 있다.
여기에 사용되는 용어 "비자연적으로 발생하는"은 자연에 의해 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 개체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전적 돌연변이, 폴리펩티드, 식물, 식물세포 및 식물 재료)를 기재한다. 이러한 비자연적으로 발생하는 개체 또는 인위적인 개체는 여기에 기재된 방법 또는 본 분야에 알려진 방법에 의해서 제조합성, 개시, 변형, 삽입, 또는 조작될 수 있다. 따라서 예시에 의해서, 비자연적으로 발생하는 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 세포 또는 비자연적으로 발생하는 식물 재료는 역교배와 같은-통상적인 식물 육종 기술을 사용해서 또는 안티센스 RNA, 간섭성 RNA, 메가뉴클레아제 등과 같은-유전적 조작 기술에 의해서 제조될 수 있다. 추가의 예시에 의해서, 비자연적으로 발생하는 식물, 비자연적으로 발생하는 식물세포 또는 비자연적으로 발생하는 식물 재료는 첫번째 식물 또는 식물 세포로부터 두번째 식물 또는 식물 세포 (그자체가 자연적으로 발생할 수 있음)로 하나 이상의 유전적 돌연변이 (예를 들어 하나 이상의 다형성)를 유전자이입 또는 전달함에 의해 제조될 수 있어서, 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그의 후손은 자연에 의해 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 유전적 구성 (예를 들어, 게놈, 염색체 또는 그의 단편)을 포함할 수 있도록 한다. 따라서 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료는 인공적이거나 또는 비자연적으로 발생한다. 따라서, 인공적이거나 또는 비자연적으로 발생하는 식물 또는 식물 세포는 첫번째 인공적이거나 자연적으로 발생하는 식물 또는 식물 세포에서의 유전적 서열을 개변함으로써 제조될 수 있고, 이것은 (i) 인공적이거나; 또는 (ii) 두번째 식물 또는 식물 세포에서 자연적으로 발생하고, 단 두번째 식물 또는 식물 세포는 첫번째 식물 또는 식물 세포로부터의 상이한 유전적 배경을 포함하는, 변형된 유전적 서열을 가져온다. 식물 또는 식물 세포의 유전적 배경의 차이점은 핵산 서열, 유전적 마커 (예를 들어, 마이크로새틀라이트 (microsatellite) RNA 마커)가 있을 때나 없을 때와 같은-표현형 차이점 또는 분자 생물학 기술에 의해 결정될 수 있다.
많은 폴리뉴클레오티드에 기반한 방법은 식물에서 유전자 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
실시예에 의해서, 형질전환될 식물에 적합한 구조체, 벡터 또는 발현벡터가 제조될 수 있고 이것은 식물에서 유전자를 과잉발현시킬 수 있는 상류 프로모터와 함께 목적하는 유전자를 포함한다. 예시적인 프로모터가 여기에 기재되어 있다. 이하의 형질전환을 따르고 적절한 조건 하에서 성장할 때, 프로모터는 식물, 또는 그의 특이적 조직에서 이러한 효소의 수준을 조절 (예를 들어, 증가)하기 위해서 발현을 유도할 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 이소프로필말레이트 합성효소를 운반하는 벡터는 식물에서 유전자를 과잉발현시키기 위해 생성된다. 벡터는 식물의 모든 조직에서 그것의 발현을 유도하는 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 적절한 프로모터 상류를 운반한다. 벡터는 또한 항생제 내성의 유전자를 운반할 수 있어서 형질전환된 calli 및 세포주의 선택을 부여할 수 있다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 식물의 분비모에서 전사 활성을 촉진한다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 식물의 분비모에서 전사활성을 가진다. 또 다른 구현예에서, 프로모터는 특정하게는 식물의 어느 다른 부분에서 활성이 없거나 또는 실질적으로 없는 식물의 분비모에서 전사활성을 가진다. 적절하게는, 프로모터는 SEQ ID NO: 8에 기재된 서열 또는 분비모 프로모터 또는 자연적인 이소프로필말레이트 합성효소 프로모터를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. 자연적인 이소프로필말레이트 합성효소 프로모터는 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 5' 말단에 위치할 것이다. SEQ ID NO:6에서 예를 들어, 내인성 이소프로필말레이트 합성효소 프로모터는 뉴클레오티드 2826앞에 위치할 것이다. 따라서, 이소프로필말레이트 합성효소 유전자는 식물의 분비모에서 과잉 발현될 수 있다. 놀랍게도, 발명자는 구성적 발현이 분비모 특이 발현을 사용해여 얻은 수준과 비교했을 때 수크로오스 에스테르의 고축적을 유발하지 않는다는 것을 발견하였다 (도4 및 그의 설명 참고).
하나의 구현예에 따르면, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성은 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴를 이미 제조할 수 있는 식물에서 증가되고, 따라서 이소프로필말레이트 합성효소의 증가된 측적 및 수크로오스 에스테르 제조를 함유하는 증가된 베타-메틸발레릴을 가져온다. 또 다른 구현예에 따르면, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성은 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴을 이미 제조할 수 없는 식물에서 증가하고, 그에 의해 이소프로필말레이트 합성효소 및 수크로오스 에스테르 생성을 함유하는 베타-메틸발레릴의 축적을 가져온다.
안티센스 RNA, 리보자인 특이 RNA 절단, 후-전사 유전자 사일런싱, 예를 들어 RNA 간섭 및 전사 유전자 사일런싱을 포함하는, 많은 폴리뉴클레오티드계 방법은 식물에서 유전자발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 접근법이 유전자발현을 고전적으로 조절하거나 억제하기 위해 사용되면서, 또한 세포 생성 및 발현되는 단백질의 품질을 증가함으로써 유전자 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 세포사멸-결합 유전자 발현, 단백질 글리코실화-결합 유전자 발현, 세포 대사에 관련된 락테이트 탈수소효소 및 유전자 증폭에 사용되는 디히드로폴레이트 환원효소를 포함할 수 있다. 다른 접근법은 식물 세포에서 유전자 조절을 변화시키기 위한 다른 세포 경로에 포함되는 다중 표적을 감소시키거나 억제시키기 위해 연장될 수 있다.
일부 구현예에서, 총-길이 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편의 보체가 사용될 수 있다. 통상적으로, 단편은 10 이상의 인접한 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오티드이다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편(들)은 발현 또는 활성을 저하시킬수 있고 그리고 예를 들어, 여기에 기재된 안티센스 핵산, 리보자임, 접합섬-매개 트랜스-컨쥬게이트에 영향을 미치는 RNA, 간섭성 RNA, 가이드 RNA, 또는 다른 비-번역된 RNA 등을 인코딩할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편(들)은 간섭성 RNA를 인코딩한다.
이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 조성물은 이들을 제한하지는 않지만, 하나 이상의 내인성 이소프로필말레이트 합성효소 유전자(들)의 전사를 간섭할수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 이소프로필말레이트 합성효소 RNA (예를 들어, 이중가닥 RNA, siRNA, 리보자임)의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 안정성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리펩티드; 기질 또는 조절 단백질과 관련해서 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 효소 활성 또는 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 결합 활성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 특이성을 나타내는 항체; 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 안정성 또는 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 효소 활성 또는 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 결합 활성을 간섭할수 있는 소분자 화합물; 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질; 및 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에 대한 활성을 가지는 메가뉴클레아제를 포함한다.
안티센스 기술은 폴리펩티드의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 억제)하는데 사용될 수 있는 하나의 잘 알려진 방법이다. 억제될 폴리뉴클레오티드는 조절 영역 및 전사 종결 서열에 클론되고 작동가능하게 연결되어서 RNA의 안티센스 가닥이 전사될 수 있도록 한다. 재조합 구조체는 이때 식물로 형질전환되고 그리고 RNA의 안티센스 가닥이 생성된다. 폴리뉴클레오티드는 유전자의 전체 서열이 억제될 필요는 없지만, 통상적으로 억제될 유전자의 센스 가닥의 일부 이상에 실질적으로 상보적일 것이다.
폴리뉴클레오티드는 mRNA의 발현에 영향을 미치는 리보자임, 또는 촉매 RNA로 전사될 수 있다. 리보자임은 사실상 어느 표적 RNA에 특정하게 사실상 쌍을 이루도록 고안되고 그리고 특정 위치에서 포스포디에스테르 구조를 절단할 수 있고, 그에 의해 표적 RNA를 기능적으로 불활성시킬 수 있다. 이형 폴리뉴클레오티드는 특정한 mRNA 전사체를 절단하기 위해서 고안된 리보자임을 인코딩할 수 있으므로, 폴리펩티드의 발현을 방지할 수 있다. 부위-특이 인식 서열을 절단하는 다양한 리보자임이 사용될 수 있지만, 헤머해드 리보자임은 특정한 mRNA를 파괴하는 데 유용하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 측면영역에 의한 위치에서 mRNA를 절단한다.
하나의 요건은 표적 RNA는 5'-UG-3' 뉴클레오티드 서열을 함유한다는 것이다. 해머헤드 리보자임의 구조 및 제조가 본 분야에 알려져 있다. 헤머해드 리보자임 서열은 전달 RNA와 같은 안정한 RNA에 함침될 수 있어서 in vivo 절단 효율성을 증가시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, RNA 전사의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드는 RNA를 간섭한다. RNA 간섭 또는 RNA 사일런싱은 진화적으로 보존되는 공정이고, 이것은 특정한 mRNA가 효소 저하를 목적으로 함을 알 수 있다. 이중가닥 RNA는 세포 (예를 들어, 이중가닥 RNA 바이러스, 또는 간섭성 RNA 폴리뉴클레오티드)에 의해서 도입되거나 또는 생성되어서 간섭성 RNA 경로를 개시할 수 있다. 이중가닥 RNA는 RNases III에 의한 21-23bp길이의 다중 작은 간섭성 RNA 이중체로 변환될 수 있고, 이것은 이중가닥 RNA-특이 엔도뉴클레아제이다. 작은 간섭성 RNA는 ATP-의존 공정을 통해서 작은 간섭성 RNA의 풀림을 촉진하는 RNA-유도 사일런싱 복합체에 의해 이후에 인식될 수 있다. 작은 간섭성 RNA의 풀린 안티센스 가닥은 활성화된 RNA-유도 사일런싱 복합체를 작은 간섭성 RNA 안티센스 가닥에 대해 상보적인 서열을 포함하는 표적 mRNA로 유도한다. 표적 mRNA 및 안티센스 가닥은 A-형 나선을 형성할 수 있고, 그리고 A-형 나선의 주요한 홈 (groove)은 활성화된 RNA-유도 사일런싱 복합체에 의해 인식될 수 있다. 표적 mRNA는 작은 간섭성 RNA 가닥의 5'-말단의 에피토프에 의해 정의되는 하나의 부위에서 활성화된 RNA-유도 사일런싱 복합체에 의해서 절단될 수 있다. 활성화된 RNA-유도 사일런싱 복합체는 또 다른 절단 경우를 촉매화하기 위해서 리사이클될 수 있다.
간섭성 RNA 발현벡터는 mRNA, pre-mRNA, 또는 관련 RNA 변종의 발현 수준을 감소시킴으로써 RNA 간섭 활성을 나타내는 간섭성 RNA 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 간섭성 RNA 구조체를 포함할 수 있다. 발현벡터는 여기에 더 설명된 바와 같이, 상류에 위치하고 그리고 간섭성 RNA 구조체에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함할 수 있다. 간섭성 RNA 발현벡터는 당업자에게 알려진 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호, 및 다양한 선택성 마커와 같은 본 분야의 당업자에게 알려진 다른 서열을 포함해서, 적절한 최소 코어 프로모터, 목적하는 간섭성 RNA 구조체, 상류 (5') 조절 영역, 하류 (3') 조절 영역을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 이중가닥 구조 (즉, 안티센스와 상보성 센스 가닥을 포함하는 이중가닥 RNA 분자), 이중가닥 헤어핀-유사 구조, 또는 단일가닥 구조 (즉, 안티센스 가닥을 포함하는 단일가닥 RNA 분자)를 포함하는, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 구조는 자가-상보성 센스 및 안티센스 가닥을 가지는, 이중체, 비대칭 이중체, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조를 포함할 수 있다. 이중가닥 간섭성 RNA는 이중가닥 작은 간섭성 RNA로 효소적으로 변환될 수 있다. 작은 간섭성 RNA 이중체 중 하나의 가닥은 표적 mRNA 및 관련 RNA 변종 내에서 상보성 서열에 어닐링할 수 있다. 작은 간섭성 RNA/mRNA이중체는 서열-의존 방식으로 다중 부위에서 RNA를 절단할 수 있는 RNA-유도 사일런싱 복합체에 의해 인식되고, 이것은 표적 mRNA 및 관련 RNA 변종의 저하를 야기한다.
이중가닥 RNA 분자는 줄기-루프 구조에서 단일 올리고뉴클레오티드로부터 결합된 작은 간섭성 RNA 분자를 포함할 수 있고, 여기서 작은 간섭성 RNA분자의 자가-사보성 센스 및 안티센스 영역은 폴리뉴클레오티드-계 또는 비-폴리뉴클레오티드-계 결합(들)뿐만 아니라 두개 이상의 루프 구조를 가지는 원형 단일가닥 RNA 및 자가-상보성 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 줄기에 의해서 결합되고, 여기서 원형 RNA는 in vivo 또는 in vitro 중 하나로 처리될 수 있어서 간섭성 RNA를 조절할 수 있는 활성인 작은 간섭성 RNA 분자를 생성할 수 있다.
작은 헤어핀 RNA 분자의 용도가 또한 여기에 고려되고 역상보성 (센스) 서열뿐만 아니라 특정한 안티센스 서열을 포함하고, 이것은 통상적으로 스페이서 또는 루프 서열에 의해서 분리된다. 스페이서 또는 루프의 절단은 단일가닥 RNA 분자 및 그의 역상보성을 제공해서, 그들은 이중가닥 RNA 분자 (선택적으로 하나 이상의 가닥의 3‘ 말단 또는 5’ 말단에서 하나, 두개, 세개 이상의 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 가져올 수 있는 추가적인 처리 단계를 가짐)를 형성할 수 있도록 어닐링할 수 있다. 스페이서는 충분히 길어서 안티센스 및 센스 서열이 이중가닥 구조 (또는 줄기)를 어닐링하고 형성할 수 있도록 하고 이후에 스페이서를 절단할 수 있다 (그리고 경우에 따라서는, 하나 이상의 가닥의 3' 말단 또는 5’말단에서 하나, 두개, 세개, 네개 이상의 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 가져올 수 있는 이후의 처리 단계). 스페이서 서열은 이중가닥 폴리뉴클레오티드로 어닐링할 때, 통상적으로 작은 헤어핀 RNA를 포함하는, 두개의 상보성 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하는 관련되지 않은 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 일반적으로 약 3 내지 약 10의 뉴클레오티드를 포함한다.
목적하는 RNA 폴리뉴클레오티드는 헤어핀 이중체를 생성하기 위해서 적절한 서열 조성물, 루프 크기, 및 줄기 길이를 선택함으로써 제조될 수 있다. 헤어핀 이중체의 줄기 길이를 고안하기 위한 적절한 범위는 약 14-30 뉴클레오티드와 같은- 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 50-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 약 200-300 뉴클레오티드, 약 3000-400 뉴클레오티드, 약 400-500 뉴클레오티드, 약 500-600 뉴클레오티드, 및 약 600-700 뉴클레오티드를 포함한다. 헤어핀 이중체의 루프 길이를 고안하기 위한 적절한 범위는, 헤어핀 이중체의 줄기 길이가 상당하다면 약 4-25 뉴클레오티드, 약 25-50 뉴클레오티드 또는 그 이상의 루프 길이를 포함한다. 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA 분자는 길이가 약 15내지 약 40의 뉴클레오티드이다. 작은 간섭성 RNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 35의 뉴클레오티드 사이의 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA 분자일 수 있다. 작은 간섭성 RNA 분자는 길이가 약 17 내지 약 30의 뉴클레오티드 사이의 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA 분자일 수 있다. 작은 간섭성 RNA 분자는 길이가 약 19 내지 약 25의 뉴클레오티드 사이에 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA 분자일 수 있다. 작은 간섭성 RNA 분자는 길이가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드 사이의 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA 분자이다. 21 뉴클레오티드보다 긴 이중체 영역을 가지는 헤어핀 구조는 루프 서열 및 길이에 관계없이, 효과적인 작은 간섭성 RNA-특이 사일런싱을 촉진할 수 있다.
표적 mRNA 서열은 길이가 약 14 내지 약 50의 뉴클레오티드일 수 있다. 그러므로 표적 mRNA는 길이가 약 14 내지 약 50의 뉴클레오티드의 영역을 스캔 (scanned)할 수 있고, 바람직하기는 표적 서열을 위한 하나 이상의 이하의 기준: 약 2:1 내지 약 1:2의 표적 A+T/G+C 비율, 표적 서열의 5'말단에서의 AA 디뉴클레오티드 또는 CA 디뉴클레오티드; 표적 mRNA에 특이한 10 이상의 연속적 뉴클레오티드의 서열 (즉, 동일한 식물로부터의 다른 mRNA에 존재하지 않는 서열); 및 세개 이상의 연속석 구아닌 (G) 뉴클레오티드 또는 세개 이상의 연속적 사이토신 (C) 뉴클레오티드의 “작용 (run)"이 없음을 충족시킨다. 이러한 기준은 본 분야에 알려진 다양한 기술을 이용해서 측정될 수 있고, 예를 들어 BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램은 선택된 표적 서열이 표적 mRNA에 대한 특이여부를 결정하기 위해 공적으로 이용할 수 있는 데이터베이스를 검색하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 표적 서열 (및 고안된 작은 간섭 굼 서열)은 상업적으로 이용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어 OligoEngine, Target Finder 및 작은 간섭성 RNA Design Tool이 상업적으로 이용할 수 있음)를 사용해서 선택될 수 있다.
표적 mRNA 서열은 하나 이상의 상기 기준을 충족시키는, 길이가 약 14 내지 약 30의 뉴클레오티드에서 선택될 수 있거나, 표적 서열은 하나 이상의 상기 기준을 충족시키는, 길이가 약 16 내지 약 30의 뉴클레오티드에서 선택될 수 있다. 표적 서열은 하나 이상의 상기 기준을 충족시키는 길이가 약 19 내지 약 30의 뉴클레오티드로 선택될 수 있다. 표적 서열은 하나 이상의 상기 기준을 총족시키는, 길이가 약 19 내지 약 25의 뉴클레오티드로 선택된다.
작은 간섭성 RNA 분자는 여기에 기재된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 중의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 상보적인 특이적 안티센스 서열을 포함할 수 있다.
작은 간섭성 RNA 분자에 의해 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 서열의 보체와 동일하거나, 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 작은 간섭성 RNA 분자에 의해서 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA 서열의 보체에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%로 동일할 수 있다. 서열 상동성을 측정하기 위한 방법은 본 분야에 알려져 있고 그리고 University of Wisconsion Computer Group (GCG) 소프트웨어 또는 NCBI 웹사이트에서 제공되는 BLASTIN 프로그램를 사용해서 결정될 수 있다.
작은 간섭성 RNA 분자의 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA의 서열로부터 하나, 두개, 세개, 네개 이상의 뉴클레오티드에서 변형함으로써 (예를 들어, 전이 또는 전환을 포함하는, 뉴클레오티드 치환에 의해서) 가변성을 나타낼 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 치환이 이중가닥 RNA 분자의 안티센스 가닥에 존재하면, 치환체 뉴클레오티드가 전형적으로 수소결합 염기-쌍을 형성하는, 센스 가닥의 상보성 뉴클레오티드는 상응하게 치환될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 치환이 안티센스 가닥이 아닌, 센스 서열에서 일어나는 이중가닥 RNA 분자가 또한 고려된다. 작은 간섭성 RNA 분자의 서열이 위에 설명한 바와 같이, 작은 간섭성 RNA의 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 사이의 하나 이상의 불일치를 포함할 때, 불일치는 안티센스 서열의 3' 말단, 5' 말단 또는 중앙부에서 발견될 수 있다.
작은 간섭성 RNA 분자는 엄격한 조건 하에서 자연적으로 발생하는 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 일부에 선택적으로 혼성화할 수 있는, 특이적 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 본 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이, 혼성화 조건의 엄격성의 변이는 혼성화 및 세척 단계에 사용되는 용액의 시간, 온도 또는 농도를 변경함으로써 얻을 수 있다. 적절한 조건은 또한 부분적으로, 사용되는 특정한 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적 mRNA 또는 유전자의 서열에 의존한다.
식물에서 이중가닥 RNA-사일런싱을 도입하기 위한 하나의 방법은 헤어핀 RNA를 생성하는 유전자 구조체와의 형질전환이다 (Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320 참고). 이러한 구조체는 적절한 스페이서에 의해서 분리되는, 표적 유전자 서열의 역영역을 포함한다. 스페이서 단편으로서 기능적인 식물 인트론 영역의 삽입은 추가적으로 유전자 사일런싱 도입의 효능을 증가시키고, 이것은 인트론 접합 헤어핀 RNA의 생성으로 인한 것이다 (Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590). 적절하게는, 줄기 길이는 길이가 약 50 뉴클레오티드 내지 약 1 킬로 염기다. 인트론 접합 헤어핀 RNA를 생성하기 위한 방법이 본 분야에 잘 기재되어 있다 (예를 들어, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617 참고).
이중체 또는 이중가닥 구조, 예를 들어 이중가닥 RNA 또는 작은 헤어핀 RNA를 가지는 간섭성 RNA 분자는 평활 (blunt)말단을 가지거나 또는 3' 또는 5'오버행 (overhang)을 가질 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, "오버행"은 하나의 RNA 가닥의 3’-말단이 다른 가닥 (3' 오버행), 또는 반대로 (5' 오버행)의 5'-말단 이상으로 확장될 때 이중체 구조로부터 돌출되는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드를 의미한다. 오버행을 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시보뉴클레오티드 또는 그의 개변된 버전일 수 있다. 하나의 구현예에서, 간섭성 RNA 분자의 하나 이상의 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6의 뉴클레오티드로부터 3' 오버행을 가진다. 다른 구현예에서, 3'오버행은 길이가 약 1 내지 약 5의 뉴클레오티드, 약 1 내지 약 3의 뉴클레오티드 및 약 2 내지 약 4의 뉴클레오티드이다.
간섭성 RNA 분자가 분자의 하나의 말단에서 3' 오버행을 포함할 때, 다른 말단은 평활-말단일 수 있거나 또는 오버행 (5' 또는 3')일 수 있다. 간섭성 RNA 분자가 분자의 양쪽 말단에서 오버행을 포함할 때, 오버행의 길이는 동일하거나 상이할 수 있다. 하나의 구현예에서, 간섭성 RNA 분자는 분자의 양쪽 말단에 대해 약 1 내지 약 3의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 추가의 구현예에서, 간섭성 RNA 분자는 분자의 양쪽 말단에서 2 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가지는 이중가닥 RNA이다. 그러나 또 다른 구현예에서, 간섭성 RNA의 오버행을 포함하는 뉴클레오티드는 TT 디뉴클레오티드 또는 UU 디뉴클레오티드이다.
표적 mRNA 서열에 대한 하나 이상의 오버행을 포함하는 간섭성 RNA 분자의 퍼센트 동일성을 결정할 때, 오버행(들)은 고려될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 3' 오버행의 뉴클레오티드 및 이중가닥의 5' 또는 3'-말단로부터의 2 뉴클레오티드는 작은 간섭성 RNA 분자의 활성의 상당한 손실 없이 개변형될 수 있다.
간섭성 RNA 분자는 하나 이상의 5' 또는 3'-캡 (cap) 구조를 포함할 수 있다. 간섭성 RNA 분자는 간섭성 RNA 분자의, 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스와 안티센스 가닥 모두에서의 3'말단에서; 또는 센스가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스와 안티센스 가닥의 5'말단에서 캡 구조를 포함할 수 있다. 선택적으로, 간섭성 RNA 분자는 간섭성 RNA 분자의 3'-말단과 5'-말단 모두에서 캡 구조를 포함할 수 있다. 용어 "캡 구조"는 올리고뉴클레오티드의 말단 중 하나에서 병합된 화학적 개변을 의미하고, 이것은 분자를 엑소뉴클레아제 저하로부터 보호하고, 또한 세포 내에서 전달 또는 국지화를 용이하게 할 수 있다.
간섭성 RNA 분자에 적용할 수 있는 또 다른 개변은 하나 이상의 부분 또는 컨쥬게이트의 간섭성 RNA 분자에 대한 화학적 결합이고 이것은 간섭성 RNA 분자의 활성, 세포분할, 세포섭취, 생체이용가능성 또는 안정성을 증가시킨다. 폴리뉴클레오티드는 본 분야에 잘 확립되어 있는 방법에 의해 합성되거나 개변될 수 있다. 화학적 개변은 이들을 한정하는 것은 아니지만, 2' 변형, 비-자연 염기의 도입, 리간드에 대한 공유결합, 및 포스페이트 결합과 티오포스페이트 결합의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 이중 구조의 강성은 하나 이상의, 및 통상적으로 두개 이상의 화학적 결합에 의해서 강화된다. 화학적 결합은 다양한 잘-알려진 기술, 공유성, 이온성 또는 수소 결합; 소수성 상호작용, 반데르발스 또는 적층 상호작용에 의해서; 금속-이온 배위에 의해서, 또는 퓨린 유사체의 사용을 통해서 얻을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 두개의 단일가닥 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 세포 효소, 예를 들어 제한 없이 특정한 뉴클레아제와 같은 것의 활성을 감소시키거나 억제하기 위해 개변될 수 있다. 세포 효소의 활성을 감소시키거나 억제시키기 위한 기술은 이들을 한정하지는 않지만, 2'-아미노 변형, 2'-플루오로 변형, 2'-알킬 변형, 비전하된 구조 변형, 모르폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형, 및 포스포라미데이트를 포함해서 본 분야에 알려져 있다. 따라서 이중가닥 RNA에 대한 뉴클레오티드의 하나 이상의 2'-히드록실기는 화학기에 의해서 치환된다. 또한 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되어서 고정된 뉴클레오티드를 형성하기 위해 개변될 수 있다. 이러한 고정된 뉴클레오티드는 리보오스의 2'-산소와 리보오스의 4'-탄소를 연결시키는 메틸렌 또는 에틸렌 다리를 함유한다. 고정된 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드를 도입하는 것은 상보성 서열에 대한 친화성을 향상시키고 그리고 융점을 수도까지 증가시킨다.
리간드는 예를 들어 그것의 세포흡수를 증강시키기 위해 간섭성 RNA 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 특정한 구현예에서, 소수성 리간드는 분자에 컨쥬게이트되어서 세포막의 직접적 침투를 용이하게 할 수 있다. 이러한 접근은 안티센스 올리고뉴크레오티드의 세포 침투를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 예시에서, 올리고뉴클레오티드의 양이온 리간드의 컨쥬게이트는 종종 뉴클레아제에 대한 개선된 내성을 가져온다. 양이온 리간드의 대표적인 예시는 프로필암모늄 및 디메틸프로필암모늄을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 양이온 리간드가 올리고뉴클레오티드를 통해서 분산될 때 mRNA에 대한 그들의 높은 결합친화성을 유지할 수 있다.
하나의 구현예에서, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성은, 이미 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴을 제조할 수 있어서, 그안에 이소프로필말레이트 합성효소 축적의 저하를 야기하고, 따라서 수크로오스 에스테르 생성을 함유하는 메타-메틸발레릴의 저하를 야기하는 식물에서 감소된다.
여기에 기재된 분자 및 뉴클레오티드는 고체-상 합성의 잘-알려진 기술을 사용해서 제조될 수 있다. 본 분야에 알려진 이러한 합성을 위한 어느 다른 수단은 추가적으로 또는 선택적으로 채택될 수 있다.
다양한 구현예는 여기에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현텍터 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간섭성 RNA 구조체에 관한 것이다.
다양한 구현예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 간섭성 RNA 구조체를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 헤어핀 구조를 형성하기 위해 자가-어닐링할 수 있는 하나 이상의 간섭성 RNA 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는, 하나 이상의 간섭성 RNA 구조체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 구조체는 (a) 여기에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; (b) 접합 (splice)될 때 헤어핀 구조의 루프를 형성하는, 인트론을 포함하는 스페이서 요소를 인코딩하는 두번째 서열; 및 (c)　첫번째 서열의 역상보성 서열을 포함하는 세번째 서열로, 이것은 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치하고, 여기서 두번째 서열은 첫번째 서열과 세번째 서열 사이에 위치하고, 그리고 두번째 서열은 첫번째 서열과 세번째 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 포함한다.
기재된 서열은 헤어핀 구조를 형성하지 않는 다양한 폴리뉴클레오티드를 구성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이중가닥 RNA는 (1) 첫번째 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 DNA의 첫번째 가닥을 전사하고, 그리고 (2) 두번째 프로모터에 작동가능한 연결에 의해 DNA 단편의 첫번째 가닥의 역상보성 서열을 전사함으로써 형성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 각각의 가닥은 동일한 발현벡터, 또는 상이한 발현벡터로부터 전사될 수 있다. RNA 간섭 활성을 가지는 RNA 이중체는 작은 간섭성 RNA로 효소적으로 변환될 수 있어 RNA 수준을 감소시킬 수 있다.
따라서 다양한 구현예는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 또는 자가-어닐링할 수 있는 간섭성 RNA 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 간섭성 RNA 구조체에 관한 것으로, 구조체는 (a) 여기에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치한, 첫번째 서열의 상보성 (예를 들어, 역상보성)을 포함하는 두번째 서열을 포함한다.
다양한 조성물 및 방법은 유전자 발현의 공-억제를 촉진함으로써 이소프로필말레이트 합성효소의 내인성 발현 수준을 감소시키기 위해 제공된다. 공-억제 현상은 식물 숙주 세포로 이식유전자의 다중 복제를 도입하는 결과로 발생한다. 이식유전자의 다중복제의 통합은 이식유전자 및 표적 내인성 유전자의 감소된 발현을 가져올 수 있다. 공-억제의 정도는 이식유전자와 표적 내인성 유전자 사이에 서열 상동서의 정도에 따라 달라진다. 내인성 유전자와 이식유전자의 사일런싱은 전사를 배제시킬 수 있는 사일런싱된 자리 (즉, 목적하는 내인성 프로모터 및 내인성 유전자)의 광범위한 메틸화에 의해 발생할 수 있다. 선택적으로 일부 경우에, 외인성 유전자와 이식유전자의 공-억제는 전사후 유전자 사일런싱에 의해 발생할 수 있고, 전사체는 생성될 수 있지만 저하의 증가율은 전사체의 축적을 방지한다. 전사후 유전자 사일런싱에 의한 공-억제를 위한 메커니즘은 RNA 간섭과 유사한 것으로 사료되고, 이러한 점에서 RNA는 중요한 이러한 공정에서 중요한 개시제 및 표적으로 보이고, 가능하다면 mRNA의 RNA-지시 저하를 통해서 적어도 동일한 분자 구조에 의해서 부분적으로 매개될 수 있다.
핵산의 공-억제는 이식유전자와 같은, 핵산 또는 그의 단편의 다중 복제를 목적하는 식물의 게놈으로 통합함으로써 얻을 수 있다. 숙주 식물은 핵산 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질전환될 수 있다. 다양한 구현예는 폴리뉴클레오티드의 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 내인성 유전자의 공-억제를 촉진하기 위한 발현벡터에 관한 것이다.
보존적 돌연변이 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 얻기 위한 방법이 또한 기재되어 있다. 식물 세포 또는 식물 재료를 포함하는 목적하는 식물은 부위-특이 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드-특이 돌연변이원, 화학적으로 유도된 돌연변이 유발, 조사 유도 돌연변이 유발, 개변된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 갭 (gapped) 이중체 DNA를 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 절단 돌연변이 유발, 리페어 (repair)-부족 숙주 균을 이용하는 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, DNA 셔플링 및 다른 동등한 방법을 포함해서, 돌연변이 유발을 유도하기 위해서 알려진 다양한 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.
선택적으로, 유전자는 트랜스포존 (예를 들어, IS요소)를 목적하는 식물의 게놈으로 도입함으로써 불활성을 표적으로 할 수 있다. 이러한 모바일 유전적 요소는 성 교배-수정에 의해 도입될 수 있고 그리고 삽입 돌연변이는 단백질 활성에서의 손실을 위해 스크리닝될 수 있다. 모체 식물에 있는 분열된 유전자는 다른 식물로 도입될 수 있고, 이것은 모체 식물을 예를 들어 성 교배-수정에 의해서 트랜스포존 유도 돌연변이 유발을 거치지 않은 식물로 교배함에 의한 것이다. 본 분야의 당업자에게 알려진 공지의 표준 육종 기술이 채택될 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 트랜스포존의 삽입에 의해서 불활성될 수 있다. 하나 이상의 유전자가 분열되면, 돌연변이는 하나 이상의 유전자의 동형 분열, 하나 이상의 유전자의 이형 분열, 또는 동형 및 이형 분열의 조합을 유발할 수 있다. 적절한 전이성 요소는 레트로트랜스포존, 레트로포존, 및 SINE-형 요소를 포함한다. 이러한 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.
선택적으로, 유전자는 많은 작은 원형 RNA로부터 유도되는 리보자임을 도입함으로써 불활성을 표적으로 할 수 있고 이것은 식물에서 자가-절단 및 복제할 수 있다. 이러한 RNA는 단독 (바이로이드 RNA) 또는 보조 바이러스 (새틀라이트 RNA) 중 하나로 복제할 수 있다.
적절한 RNA의 예시는 아보카도 선블롯 (sunblotch) 바이로이드 (viroid)로부터 유도되는 것들 및 담배 원형반점 바이러스, 루체른 일시적 줄무늬 바이러스, 벨벳 담배 모틀 바이러스, 솔라눔 노디플로름 모클 바이러스, 및 지하 (subterranean) 클로버 모틀 바이러스로부터 유도되는 새틀라이트 RNA를 포함한다. 다양한 표적 RNA-특이 리보자임은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.
일부 구현예에서, 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드의 발현은 유전자에서의 돌연변이 생성과 같은, 비-이식유전자 수단에 의해서 조절될 수 있다. 유전자 서열에서 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법은 화학적 돌연변이 유발, EMS 돌연변이유발 및 조사 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 표적 돌연변이를 세포로 도입하는 방법은 이들을 한정하지는 않지만, 게놈 에디팅 기술, 특히 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발, 틸링 (tilling) (게놈에서 유도된 국소 병변을 목표로 함), 이형 재조합, 올리고뉴클레오티드-특이 돌연변이 유발, 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이 유발을 포함한다.
돌연변이의 일부 비제한적인 실시예는 하나 이상의 뉴클레오티드, 단일 뉴클레오티드 다형성 및 단일 서열 반복의 결실, 삽입 및 미스센스 돌연변이다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 조기 중지 코돈 다른 한편으로는 비-기능적인 유전자를 형성하는 돌연변이를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 상승된 수준에서 발현될 수 있는 기능적 유전자를 형성하는 돌연변이를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 돌연변이의 스크리닝은 유전자 또는 단백질에 특이한 프로브 또는 프라이머의 서열화 또는 그의 사용에 의해서 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 특정한 돌연변이는 또한 형성될 수 있고, 이것은 감소되거나 증가된 유전자 발현, mRNA의 감소되거나 증가된 안정성, 또는 단백질의 감소되거나 증가된 안정성을 유발할 수 있다. 이러한 식물은 여기에 돌연변이 식물로서 참고된다.
돌연변이 식물은 하나 이상의 돌연변이의 어느 조합을 가질 수 있고 이것은 조절된 폴리펩티드 수준을 가져올 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 식물은 하나의 유전자에서의 하나의 돌연변이; 하나의 유전자에서의 다중 돌연변이; 두개 이상의 또는 세개 이상의 유전자에서의 단일의 돌연변이; 또는 두개 이상의 또는 세개 이상의 유전자의 다중 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서 돌연변이 폴리펩티드 변종을 포함하는 돌연변이 식물이 개시된다.
하나의 구현예에서, 식물의 종자는 돌연변이되고 이후에 첫번째 생성 돌연변이 식물로 성장한다. 첫번째 생성 식물은 이때 자가-수분되도록 허용하고 그리고 첫번째 생성 식물의 종자는 두번째 생성 식물로 성장하고, 이것은 그들의 자리에서의 돌연변이를 위해 스크린된다. 돌연변이된 식물 재료가 돌연변이를 위해서 스크리닝될 수 있지만, 두번째 생성 식물의 스크리닝의 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식 돌연변이에 해당한다는 것이다. 본 분야의 당업자는 이들을 한정하는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함해서, 다양한 식물 재료가 돌연변이 식물을 형성하기 위해 돌연변이되는 것을 이해할 것이다. 그러나 돌연변이된 식물 재료의 유형은 식물 핵산이 돌연변이를 위해 스크린될 때 영향을 줄 것이다. 예를 들어, 꽃가루가 돌연변이를 거친 후에 비-돌연변이된 식물이 수분될 때, 이러한 수분으로부터 발생하는 종자는 첫번째 생성 식물로 성장한다. 첫번째 생성 식물의 각 세포는 꽃가루에서 형성되는 돌연변이를 함유할 것이고; 따라서 이러한 첫번째 생성 식물은 두번째 생성까지 기다리는 대신에 돌연변이를 위해 스크린될 것이다.
화학적 돌연변이 또는 조사를 포함하는, 점 돌연변이, 짧은 결실, 삽입, 전환, 또는 전이를 형성하는 돌연변이는 돌연변이를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 돌연변이는 이들을 한정하는 것은 아니지만, 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로수레아 트리에틸아민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아실아미드 모노머, 멜파란, 질소 머스타드 (mustard), 빈스크리틴, 디메틸니트로스아민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(a)안트라센, 에틸렌산화물, 헥사메틸포스포아미드, 바이술판, 디에폭시알칸 (디폭시옥탄, 디폭시부탄 등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아시리딘 디하이드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함한다.
돌연변이원에 의해서 직접적으로 유도되지 않은 지역에서의 자발적 돌연변이가 또한 고려되고, 단 그들은 원하는 표현형을 가져온다. 적절한 돌연변이 유발제는 또한 예를 들어, X-선, 감마선, 고속 중성자 조사 및 UV 방사와 같은 이온화 방사선을 포함한다.
본 분야의 당업자에게 알려진 식물 핵생산 제조의 어느 방법은 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 핵산을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
각각의 식물, 식물세포 또는 식물재료로부터 제조되는 핵산은 선택적으로 풀링 (pooling)될 수 있어서 돌연변이된 식물조직, 세포 또는 재료로부터 발생하는 식물의 개체의 이소프로필말레이트 합성효소 유전자에서 돌연변이를 위한 스크리닝을 촉진할 수 있다. 하나 이상의 식물, 식물 세포 또는 식물 재료의 연속적 생성이 스크린될 수 있다. 선택적으로 풀링된 그룹의 크기는 사용되는 스크리닝 방법의 민감섬에 따라 다르다.
핵산 샘플이 선택적으로 풀링된 후에, 그들은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드-특이 증폭 기술을 거칠 수 있다. 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 또는 거기에 바로 인접한 서열에 특이한 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 이용될 수 있어서 선택적으로 풀링된 핵산 샘플 내에 서열을 증폭시킬 수 있다. 바람직하기는 하나 이상의 프라이머는 이소프로필말레이트 합성효소의 영역을 증폭시키기 위해서 고안되고 여기서 유용한 돌연변이는 가장 발생하기 쉽다. 가장 바림직하기는, 프라이머는 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 영역 내에서 돌연변이를 감지하기 위해 고안된다. 추가적으로 점 돌연변이를 위한 스크리닝을 완화하기 위해서, 프라이머(들)이 공지의 다형성 부위를 피하는 것이 바람직하다. 증폭 생성물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 어느 통상적인 표지방법을 이용해서 표지될 수 있다. 프라이머(들) 또는 프로브는 본 분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 여기에 기재된 서열을 기초로 하여 고안될 수 있다. 다형성은 본 분야에 알려진 방법에 의해서 확인될 수 있고, 추가적인 면에서 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 기능적인 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 하나 이상의 세포를 제공하는 것을 포함한다. 다음에, 하나 이상의 식물 세포는 효과적인 조건 하에서 처리되어서 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 활성을 조절한다. 하나 이상의 돌연변이 식물세포는 이후에 돌연변이식물로 번식되고, 여기서 돌연변이 식물은 대조 식물의 그것과 비교해서 이소프로필말레이트 합성효소 폴리펩티드의 조절된 수준을 가진다. 돌연변이 식물을 제조하는 이러한 방법의 하나의 구현예에서, 처리단계는 상기 기재된 바와 같은 그리고 하나 이상의 돌연변이 식물 세포를 얻기 위해서 효과적인 조건 하에서 하나 이상의 세포를 화학적 돌연변이 유발제를 거치게 하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 또 다른 구현예에서, 처리단계는 하나 이상의 돌연변이 식물세포를 얻기 위한 조건 하에서 하나 이상의 세포를 조사 그누언을 거치게 하는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이 식물"은 표현형이 유전적 조작 또는 유전적 변형 이외에 수단에 의해서 적절하게는, 대조 식물과 비교해서 변형되는 돌연변이 식물을 포함한다.
특정한 구현예에서, 돌연변이 식물, 돌연변이 식물세포 또는 돌연변이 식물 재료는 또 다른 식물, 식물세포 또는 식물재료에서 자연적으로 발생한 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 그리고 원하는 특성을 부여할 수 있다. 이러한 돌연변이는 거기에 특성을 부여하기 위해서 다른 식물, 식물세포 또는 식물재료 (예를 들어, 돌연변이가 유도되는 식물에 대한 상이한 유전적 배경을 가지는 식물, 식물세포 또는 식물재료)로 통합 (예를 들어, 침투)될 수 있다. 따라서 실시예에 의해서, 첫번째 식물에 자연적으로 발생하는 돌연변이는 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가지는 두번째 식물과 같은-두번째 식물로 도입될 수 있다. 그러므로 당업자는 원하는 특성을 부여하는 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 하나 이상의 돌연변이 대립유전자의 그것의 게놈에서 자연적으로 수행하는 식물을 조사하고 확인할 수 있다. 자연적으로 발생하는 돌연변이 대립유전자(들)은 이소프로필말레이트 합성효소 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 주, 변종 또는 혼성체를 생성하기 위해 육종, 역교배 및 유전자이입을 포함하는 다양한 방법에 의해서 두번째 식물로 전달될 수 있다. 바람직한 특성을 나타내는 식물은 돌연변이 식물의 풀로부터 수행될 수 있다. 적절하게는 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소 뉴클레오티드 서열의 지식을 이용하는 선별이 수행될 수 있다. 결과적으로 대조와 비교했을 때 수크로오스 에스테르 조성물의 변화를 나타내는 유전적 특성을 스크린할 수 있다. 이러한 스크리닝 접근은 여기에 논의된 바와 같은 통상적인 핵산 증폭 및/또는 혼성화 기술의 적용을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 추가적인 태양은 돌연변이 세포를 식별하기 위한 방법에 관한 것으로, 돌연변이 식물은 (a) 식물로부터 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 그리고 (b) 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 핵산서열을 결정하는 단계로, 여기서 대조 식물의 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴크레오티드와 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 서열에서의 차이점이 이소프로필말레이트 합성효소 돌연변이 식물인 것을 포함한다. 또 다른 태양에서 대조식물과 비교했을 때 수쿠로오스 에스테르의 조성물에서의 변화를 가지는 돌연변이 식물을 확인하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 (a) 스크린될 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 식물에서 수크로오스 에스테르의 조성물을 결정하는 단계로서, 여기서 상기 샘플은 대조식물과 비교했을 때 인코딩된 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 그리고 식물의 일부는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 수크로오스 에스테르의 조성물에서 변화를 가지는 돌연변일 식물을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 또 다른 태양에서 대조식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르의 조성물에서 변화를 가지는 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 (a) 샘플을 첫번째 식물로부터 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 거기에 수크로오스 에스테르의 조성물의 변화를 가져오는 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 여부를 결정하는 단계; 그리고 (c) 하나 이상의 돌연변이를 두번째 식물로 전환하는 단계를 포함한다. 돌연변이(들)은 유전적 조작, 유전적 조작, 유전자이입, 식물육종, 역교배 등과 같은-본 분야에 알려진 다양한 방법을 이용해서 두번째 식물로 전환될 수 있다. 하나의 구현예에서, 첫번째 식물은 자연적으로 발생하는 식물이다. 하나의 구현예에서, 두번째 식물은 첫번째 식물에 상이한 유전적 배경을 가진다. 또 다른 태양에서 대조식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르의 조성물에서의 변화를 가지는 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 (a) 샘플을 첫번째 식물로부터 제공하는 단계; (b) 거기에 수크로오스 에스테르의 조성물에서의 변화를 가져오는 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 여부를 결정하는 단계; 그리고 (c) 첫번째 식물로부터의 하나 이상의 돌연변이를 두번째 식물로 유전자이입하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 유전자이입 단계는 경우에 따라서는 역교배 등을 포함하는, 식물 육종을 포함한다. 하나의 구현예에서, 첫번째 식물은 자연적으로 발생하는 식물이다. 하나으 구현예에서, 두번째 식물은 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 하나의 구현예에서, 첫번째 식물은 재배품종 또는 엘리트 재배품종이 아니다. 하나의 구현예에서, 두번째 식물은 재배품종 또는 엘리트 재배품종이다. 추가적인 태양은 여기에 기재된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 (재배품종 또는 엘리트 재배품종 돌연변이 식물을 포함하는) 돌연변이 식물에 관한 것이다. 특정한 구현예에서, 돌연변이 식물은 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 서열 내에서와 같은-식물의 특정한 영역에만 국소화되는 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 이러한 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈의 서열은 돌연변이 유발에 앞서 식물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다.
특정한 구현예에서, 돌연변이 식물은 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 서열 내에서와 같은-그리고 게놈의 하나 이상의 추가의 영역에서-식물의 하나 이상의 영역에 국소화된 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈 서열은 돌연변이유발에 앞서 식물과 동일하지 않거나 실질적으로 동일하지 않을 것이다. 특정한 구현예에서, 돌연변이 식물은 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의, 네개 이상의 또는 다섯개 이상의 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 엑손에서; 또는 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의, 네개 이상의 또는 다섯개 이상의 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 인트론에서; 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 프로모터에서; 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 3' 비번역된 영역에서; 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 5' 비번역된 영역에서 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역에서; 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 비-코딩 영역에서; 또는 두개 이상의, 세개 이상의, 네개 이상의, 다섯개 이상의; 또는 그의 여섯개 이상의 어느 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않는다. 추가적인 면에서 식물을 확인하기 위한 방법이 제공되고, 식물세포 또는 식물재료는 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하는 유전자에서 돌연변이를 포함하고, 이것은 (a) 식물, 식물세포 또는 식물재료가 돌연변이 유발을 거치게 하는 단계; (b) 상기 식물, 식물세포 또는 식물재료 EH는 그의 후손로부터 핵산샘플을 얻는 단계; 그리고 (c) 이소프로필말레이트 합성효소 또는 변종 또는 그의 단변을 인코딩하는 유전자의 핵산서열을 결정하는 단계로, 여기서 상기 서열에서의 차이점은 거기에 하나 이상의 돌연변이를 나타내는 것을 포함한다.
아연 집게 (Zinc finger)는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 부분 또는 전부를 포함하는 게놈 DNA 서열은 아연 집게 뉴클레아제 매개 돌연변이유발에 의해 개변될 수 있다. 게놈 DNA 서열은 아연 집게 단백질 결합을 위한 특이부위로 조사된다. 선택적으로 게놈 DNA 서열은 아연 집게 단백질 결합을 위한 두개의 특이 위치로 조사되고 여기서 두개의 위치는 예를 들어, 떨어진 1,2,3,4,5,6 또는 그 이상의 염기쌍에 대해 반대의 가닥이고 함께 근접하다. 따라서 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질이 제공된다.
아연 집게 단백질은 이소프로필말레이트 합성효소 유전자에서 선택된 표적부위로 인식하기 위해 조작될 수 있다. 아연 집게 단백질은 자연적인 아연 집게 단백질은 자연적인 아연 집게 DNA-결합 도메인 및 비자연적인 아연 집게 DNA-결합 도메인으로부터 유도되는 모티프의 어느 조합을 포함할 수 있고, 이것은 이들을 한정하지는 않지만, 파지표지선택, 박테리아성 두개의-혼성체 선택 또는 박테리아성 하나의-혼성체 선택과 같은 절단 또는 확산 또는 선택방법에 결합된 부위-특이 돌연변이유발에 의한 것이다. 용어 "비자연적인 아연 집게 DNA-결합 도메인"은 표적 DNA 내에서 세개의-염기쌍 서열 내에서 또는변형될 DNA를 포함하는 세포 또는 유기체에서 발생하지 않는, 아연 집게 DNA-결합 도메인을 나타낸다. 표적 유전자에 특이한 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합하는 아연 집게 단백질의 고안을 위한 방법은 본 분야에 알려져 있다.
아연 집게 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질을 위한 첫번째 폴리뉴클레오티드와, 이들을 한정하지는 않지만 유형 IIS 엔도뉴클레아제와 같은 비-특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 두번째 폴리뉴클레오티드의 융합을 함으로써 구성될 수 있다. 징크핑거 단백질과 뉴클레아제와의 융합단백질은 두개의 염기쌍으로 이루어진 스페이서를 포함할 수 있거나 선택적으로, 스페이서는 세개, 네개, 다섯개, 여섯개 또는 일곱개 이상의 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 아연 집게 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드의 게놈 DNA 서열의 조절 영역, 코딩 영역, 또는 비-코딩 영역에서 이중가닥 절단을 도입하고 그리고 폴리뉴클레오티드의 발현수준의 감소, 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질 활성에서의 감소를 가져온다. 아연 집게 뉴클레아제에 의한 절단은 종종 비-동형 말단 결합에 의한 DNA 리페어를 수반하는 절단부위에서 DNA의 결실을 가져온다.
또 다른 구현예에서, 아연 집게 단백질은 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 조절 서열에 결합하기 위해서 선택될 수 있다. 더 특정하게는, 조절 서열은 전사 개시부위, 개시코돈, 엑손영역, 엑손-인트론의 경계, 종결기, 정지 코돈을 포함할 수 있다. 따라서 기재는 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 부근에서 또는 그 안에서 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이유발에 의해 생성되는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환된 식물 또는 식물 세포, 그리고 징크핑거 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발에 의해 이러한 식물 또는 식물세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 아연 집게 단백질과 징크핑거 뉴클레아제를 식물로 전달하기 위한 방법은 메가뉴클레아제의 전달을 위해 이하에 기재된 것들과 유사하다.
또 다른 태양에서, 메가뉴클레아제 I-CreI와 같은-메가뉴클아제를 사용해서, 재조합, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환되거나 또는 다른 한편으로는 유전적으로-개변된 식물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제뿐만 아니라 재조합 메가뉴클레아제는 단일 부위 또는 식물의 게놈 DNA에 상대적으로 적은 부위의 이중가닥 절단이 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 분열하도록 특정하게 야기하기 위해 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 변형된 DNA-인식 특성을 가지는 조작된 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제 단백질은 본 분야에 알려진 다양한 상이한 메커니즘에 의해 식물세포로 전달될 수 있다.
기재는 식물세포 또는 식물에서 여기에 기재된 불활성인 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 대한 메가뉴클레아제의 용도를 포함한다. 면은 또한 메가뉴클레아제를 사용하는 식물에서 폴리뉴클레오티드를 불활성시키기 위한 방법에 관한 것으로, 이것은 (a) 여기에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물세포를 제공하는 단계; (b) 메가뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 인코딩하는 구조체를 상기 식물세포로 도입하는 단계; 및 (c) 메가뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드를 실질적으로 불활성하도록 하는 단계를 포함한다.
메가뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드의 코딩영역 내에 메가뉴클레아제 인식부위를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절단은 종종 비상동성 말단 컨쥬게이트에 의한 돌연변이 DNA 리페어를 따르는 메가뉴클레아제 인식부위에서 DNA의 결실을 유발한다. 유전자 코딩서열에서의 이러한 돌연변이는 통상적으로 유전자를 불활성화할 정도로 충분하다. 식물세포를 개변시키기 위한 이러한 방법은 첫째로 적저한 형질전환 방법을 사용해서 식물 세포에 대한 메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달을 포함한다. 최대효율을 위해, 메가뉴클레아제 발현 카세트를 선택할 수 있는 마커에 연결시키고 그리고 선택제의 존자 하에 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 접근법은 메가뉴클레아제 발현 카세트에서 게놈으로의 통합을 가져오지만, 그러나 식물이 조절 승인을 요구하면 바람직하지 않을 수 있다. 이러한 경우에 메가뉴클레아제 발현 카세트 (및 연결된 선택성 마커 유전자)가 통상적인 육종 기술을 사용해서 이후의 식물 생성에서 분리될 수 있다. 선택적으로, 식물세포는 선택성 마커가 부족한 메가뉴클레아제 발현 카세트로 초기에 형질전환될 수 있고 그리고 선택제가 부족한 매질에서 성장할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 처리된 세포의 부분은 메가뉴클레아제 발현 카세트를 얻을 것이고 그리고 메가뉴클레아제 발현 카세트를 게놈으로 일시적으로 통합함이 없이 조작된 메가뉴클레아제를 발현할 것이다. 이것은 특성전화 효율에 중요하지 않기 때문에. 이러한 후자 형질전환 절차는 스크린될 다량의 처리된 세포가 원하는 게놈 변형을 얻도록 요구한다. 상기 접근법은 또한 아연 집게 단백질 또는 아연 집게 뉴클레아제를 사용할 때 식물세포를 변형하기 위해 적용될 수 있다.
메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달 이후, 식물세포는, 처음에, 사용된 특정한 형질전환 절차에 관해 전형적인 조건 하에서 성장한다. 이것은 종종 어둠에서 26℃ 이하의 온도에서 매질 위에 성장하는 형질전환된 세포를 의미할 것이다. 이러한 표존 조건은 기간, 바람직하기는 1-4일 동안 사용될 수 있어서 식물 세포가 형질전환 공정으로부터 회복될 수 있도록 한다. 이러한 초기의 회복기간을 따르는 어느 지점에서, 성장온도는 메가뉴클레아제 인식부위를 절단하고 돌연변이시키기 위해 조작된 메가뉴클레아제의 활성을 자극하도록 할 수 있다.
특정한 적용을 위해서, 폴리뉴클레오티드를 식물의 게놈으로부터 정확하게 제거시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 적용은 조작된 메가뉴클레아제의 쌍을 이용해서 가능하고, 각각은 의도된 결실의 한쪽 면 위에서 메가뉴클레아제 인식부위를 절단한다. 메가뉴클레아제 및 다른 DNA-수복 전략은 또한 식물에 함유되는 DNA와 표적 DNA의 이형 조합을 유발하기 위해 사용될 수 있다. 표적 DNA는 통상적으로 식물세포에 함유되는 DNA에 동형인 하나 이상의, 바람직하기는 두개 이상의 영역을 포함한다. 세포에 의한 DNA 수복에 따르면, 동형 말단은 결합되어서 표적 DNA의 세포로의 도입을 가져온다.
또 다른 구현예에서, 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현수준은 이소프로필말레이트 합성효소가 식물세포 핵에서 인코딩된 엽록체 단백질이기 때문에 유전자를 엽록체 게놈으로 직접적으로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 유사하게는, 엽록체로 이소프로필말레이트 합성효소 단백질의 전달 또는 유입을 증가시키는 것은 또한 활성패턴을 조절할 수 있다.
한가지 목적은 대조식물과 배교했을 때 실질적으로 동일한 시각적 외관을 유지하면서, 조절된 수크로오스 에스테르 수준을 나타내는 돌연변이의, 형질전환된 또는 비자연적으로 발생하는 식물을 제공하기 위한 것이다. 따라서, 대조세포 또는 대조식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르의 조절된 수준을 가지는 돌연변이, 형질전환 또는 비자연적으로 발생하는 식물 또는 세포가 여기에 기재된다. 돌연변이의, 형질전환되거나 또는 비자연적으로 발생하는 식물 또는 세포는 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소의 합성 또는 활성을 조절하기 위해 변형되어왔고, 이것은 여기에 기재된 포릴뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 조절함에 의한 것이다.
추가적인 태양은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 형질전환된 식물 또는 세포에 관한 것으로, 여기서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성은 조절되고 그리고 식물의 일부는 대조 식물과 비교했을 때 5% 이상의 수크로오스 에스테르 수준의 증가 또는 감소를 가지고, 상기 효소의 발현 또는 활성이 조절되지 않았다. 여전히 추가적이 면은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환된 식물 또는 세포에 관한 것으로, 여기서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질의 활성이 조절되고 여기서 에어로졸에서의 수크로오스 에스테르 수준은 대조식물로부터의 에어로졸과 비교했을 때 5% 이상으로 증가되거나 또는 감소된다.
대조식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르 함량에서의 변화는 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 20% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 100% 또는 그 이상일 수 있다.
식물은 100℃ 이상-예를 들어 125℃ 이상, 150℃ 이상, 175℃ 이상, 또는 200℃ 이상으로 가열되어서 에어로졸을 방출시킬 수 있다.
유전적 변형에 사용하기 위한 적절한 식물은 단자엽식물아강 및 쌍떡잎식물 및 식물세포계를 포함하고, 이것은 다음의 군: 쥐꼬리망초과, 부추과, 알스트로에메리아ceae, 수선화과, 협죽도과, 야자과, 국화과, 매자나무과, Bixaceae, 십자화과, 브로멜리아세아애, 삼과, 석죽과, 개비자나무과, 명아주과, Colchicaceae, 박과, 마과, 마황과, Erythroxylaceae, 대극과, 콩과, 꿀풀과, 아마과, 석송과, 아욱과, 멜란티움과, 파초과, 도금양과, 니사나무과, 양귀비과, 침엽수, 질경이과, 벼과, 장미과, 꼭두서니과, 버드나무과, 무환자나무과, 가지과, 주목과, 차나무과, 또는 포도과중 하나로부터의 종을 포함한다.
적절한 종은 속 오크라, 침엽수, 관상수, 겨이삭, 파속식물, 알스트로에메리아, 아나나스, orrographis, 안드로포곤, 향쑥속, 아룬도, 아트로파, 매자나무, Beta, Bixa, 배추속 식물, 금잔화, 동백나무, Camptotheca, 대마초, 고추, 카르타무스, 일일초, 개비자나무, 국화, 기나나무, 수박, 커피, 콜키쿰, 콜레우스, 오이, 쿠쿠르비타, 우산대바랭이, 흰독말풀, 패랭이속, 디기칼리스, 항염, 오일야자, 마황, Erianthus, Erythroxylum, 유클리티스, Festuca, 야생딸기, 갈란투스, 글리신, 고시피움, 해바라기, 파라고무, 호르데움, 사리풀잎, 자트로파, 상추종, 아마, 롤리움, 루피너스, 토마토, 석송속, 마니호트, 알팔파, 박하, 억새, 바나나, 니코티아나, 벼, 수수속, 양귀비속, 파르테니움, 페니세튬, 피튜니아, 갈풀, 산조아재비, 소나무, 새포아풀, 포인세티아, 포플러스, 라우월피아, 피마자, 장미, 사탕수수, 버드나무, 혈근초, 스코폴리아, 호밀, 가지속, 수수, 스파르티나, 시금치, 타나세튬, 주목, 테오브로마, Tritico호밀, 밀, Uniola, 꽃창포과, 빙카속, 리파리아 및 옥수수의 멤버를 포함할 수 있다.
적절한 종은 수수속 spp., 수수 spp., 억새 spp., 사탕수수 spp., Erianthus spp., 포플러스 spp., 큰파란줄기 (나도기름새), 페니세튬 퍼푸레움 (부들), 갈풀 (리이드케너리그라스), 우산잔디 (버뮤다그래스), 페스투카 아룬디나세아 (넓은잎김의털), 스파르티나 펙티나타 (프레리 코디-잔디), 알팔파 벼종 (알팔파), 아룬도 도낵스 (물대), 호밀 (라이), 버드나무 spp. (버드나무), 유클리티스 spp. (유클리티스), Tritico호밀, 대나무, 해바라기 (해바라기), 카르타무스 홍화 (잇꽃), 자트로파 (자트로파), 피마자 communis (피마자유), 오일야자 (야쟈), 아마 (flax), 배추속 식물 juncea, 사탕무우 (사탕무), 마니호트 자리공 (cassaya), 토마토 (토마토), 상추종 sativa (상추), 바나나 paradisiaca (바나나), 가지속 감자 (감자), 배추속 식물 oleracea (브로콜리, 꽃양배추, 양배추), 동백나무 차나무 (차), 야생딸기 아나나스sa (딸기), 테오브로마 카카오 (코코아), 커피 아라비카 (커피), 리파리아 포도 (포도), 파인애플 (파인애플), 고추 annum (맵고 달콤한 고추), 파속식물 cepa (양파), 오이 melo (멜론), 오이(오이), 쿠쿠르비타 maxima (호박), 쿠쿠르비타 moschata (호박), 시금치 oleracea (spinach), 수박 lanatus (watermelon), 오크라 (오크라), 가지속 melongena (가지), 장미 spp. (장미), 패랭이속 caryophyllus (carnation), 피튜니아 spp. (피튜니아), 포인세티아 (포인세티아), 루피너스 albus (루핀), Uniola paniculata (oats), 겨이삭띠 (겨이삭 spp.), 포플러스 tremuloides (aspen), 소나무 spp. (pine), 침엽수 spp. (fir), 관상수 spp. (maple), 호르데움 vulgare (barley), 왕포아풀 (큰새포아풀), 롤리움 spp. (라이grass) 및 큰조아재비 (티모시), 수수속 버들명아주 (수수속 풀), 수수 싸리나무 (수수, 수수류), 억새 giganteus (억새), 사탕수수 sp. (energycane), 포플러스 balsamifera (포플러), 옥수수 mays (c또는n), 글리신 max (콩), 배추속 식물 나프스 (canola), 밀 aestivum (wheat), 고시피움 hirsutum (cotton), 또는yza sativa (rice), 해바라기 (해바라기), 알팔파 sativa (alfalfa), 사탕무우 (사탕무), 또는 페니세튬 glaucum (진주 기장)를 포함할 수 있다.
다양한 구현예는 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 발현수준을 감소시키기 위해 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 형질전환된 식물에 관한 것으로, 그에 의해 담배식물과 같은-식물을 생성할 수 있고-이소프로필말레이트 합성효소의 발현수준은 대조식물과 비교했을 때 목적하는 식물조직 내에 감소된다. 개시된 조성물 및 방법은 N. rustica 및 N. tabacum (예를 들어, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, K326, Hicks Broadleaf 및 Petico)을 포함해서, 니코티아나 속의 어느 종에 적용될 수 있다. 다른 종은 N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, 및 N. x sanderae. 을 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 식물은 니코티아나 속 또는 니코티아나 타바쿰 종과 같은-담배 식물이다.
담배 재배품종 및 엘리트 (elite) 담배 재배품종의 용도는 또한 여기에 고려된다. 형질전환된, 비자연적으로 발생하거나 돌연변이 식물은 그러므로 하나 이상의 이식유전자, 또는 하나 이상의 유전적 돌연변이 또는 그의 조합을 포함하는, 담배 품종 또는 엘리트 담배 재배품종일 수 있다. 유전적 돌연변이(들) (예를 들어, 하나 이상의 다형성)은 각각의 담배 품종 또는 담배 재배 품종 (예를 들어, 엘리트 담배 재배품종)에서 자연적으로 존재하지 않는 돌연변이일 수 있거나 또는 자연적으로 발생하는 유전적 돌연변이(들)일 수 있고, 단 돌연변이는 각각의 담배 품종 또는 담배 재배품종 (예를 들어, 엘리트 담배 재배품종)에서 자연적으로 발생하지 않는다. 특히 유용한 니코티아나 타바쿰 품종은 버얼리종, dark type, 황색종, 및 오리엔탈형 담배를 포함한다. 품종 또는 재배품종을 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면 BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXF또는D 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, 'Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-M또는), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, PO3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galp Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana이다. 여기에 특정하게 확인되지 않는다면 상기 낮은 converter 아변종이 또한 고려된다. 재배품종 및 엘리트 재배품종은 특정한 구현예에서 바람직하다. 니코티아나 타바쿰종은 특정한 다른 구현예에서 사용될 수 있다. 니코티아나 타바쿰 버얼리종이 사용될 수 있다.
구현예는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 형질전환된 식물을 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 이것은 이소프로필말레이트 합성효소 발현 또는 활성을 조절하기 위해 변형되어왔고, 대조와 비교했을 때 수크로오스 에스테르의 조절된 수준을 가지는 식물 또는 식물 조성물을 가져온다. 식물에서 수크로오스 에스테르의 수준을 조절하는 것은 식물을 생성하는데 사용될 수 있고, 여기서 그로부터 생성된 에어로졸의 풍미 프로파일이 변화된다. 그러므로 본 발명은 새로운 혼합 기회를 제공할 수 있어서 바람직한 담배풍미를 생성할 수 있다. 따라서 실시예에 의해서 식물의 수크로오스 에스테르 함량은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 EH는 활성을 증가시킴으로써 증가되고, 이것은 오리엔탈 담배와 더 유사한 풍미 분자의 증가된 수준을 방출할 수 있는 식물을 가져올 수 있다. 그러므로 추가적인 실시예에 의해서 식물의 수크로오스 에스테르 함량은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 저하시킴으로써 저하되고, 이것은 황색종 담배와 더 유사한, 풍미 분자의 더 낮은 수준을 방출시킬 수 있는 식물을 가져올 수 있다.
추가의 태양에서 혼합 담배를 위한 방법이 제공되고, 이것은 형질전환, 돌연변이 또는 비자연적으로 발생하는 식물로부터 유도되는, 담배 혼합, 담배 (예를 들어, 담배 잎으로부터 유도되거나, 또는 유도될 수 있는 담배잎 또는 조성물)에서 하나 이상의 담배유형을 대체하거나 또는 첨가하는 단계를 포함하고, 식물의 수크로오스 에스테르 함량은 여기에 기재된 바와 같은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절 (바람직하기는, 증가)함으로써 조절 (예를 들어, 증가 또는 감소)될 수 있다. 또 다른 태양에서, 담배를 혼합하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 담배에서 오리엔탈형 담배를 대체, 감소 또는 생략하는 단계 그리고 여기에 기재된 바와 같은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절 (바람직하기는, 증가)함으로써 식물의 수크로오스 에스테르 함량이 조절 (바람직하기는, 증가)된 형질전환, 돌연변이 또는 비자연적으로 발생하는 식물로부터 유도되는 담배 (예를 들어, 담배 잎으로부터 유도되거나, 또는 유도될 수 있는 담배 잎 또는 조성물)를 첨가하는 단계를 포함한다. 오리엔탈 담배와 같은-담배의 대체, 감소 또는 첨가는 대체되거나, 감소되거나, 또는 첨가되는 담배에 대해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에 해당할 수 있다.
추가적인 태양은 여기에 기재된 바와 같은, 담배 (예를 들어, 담배잎으로부터 유도되거나, 또는 유도될 수 있는 담배 잎 또는 조성물) 또는 식물의 수크로오스 에스테르 함량이 조절된 형질전환, 돌연변이 또는 비자연적으로 발생하는 식물로부터 유도되거나, 또는 유도될 수 있는, 담배 물품, 담배를 첨가하는 것을 포함하는 담배 또는 담배 물품의 풍미를 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가적인 태양은 담배 또는 담배 물품의 풍미를 조절하기 위한 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하는 시약의 용도에 관한 것이다.
식물에서 수크로오스 에스테르의 수준을 조절하는 것은 또한 식물의 해충 내성이 변형된 식물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 식물의 해충 내성은 여기에 기재된 바와 같은 수크로오스 에스테르의 수준을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 식물의 해충 내성은 여기에 기재된 바와 같은 수크로오스 에스테르 생성의 수준을 저하시킴으로써 저하될 수 있다.
여기에 기재된 식물에서 생산되는, 물-약물, 식품 첨가물, 흡연 향과 수크로오스 에스테르를 포함하는 유기 살충제 등과 같은-수크로오스 에스테르의 조성물은 추출될 수 있고, 다양한 추가적인 용도를 위해 그들로부터 선택적으로 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 잎 또는 잎의 표면으로부터 추출된다. 따라서 약물, 식품 첨가물, 흡연 풍미제 및 수크로오스 에스테르를 포함하는 유기 살충제와 같은-물품이 이 개시물의 추가적인 태양이다.
본 기재에 따른 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고 여기서 R1, R2, R3, R4 및 R5는 수소 원자 또는 아실사슬 중 하나이다. 수크로오스 에스테르에서 에스테르화될 수 있는 아실사슬은 도6에 기재되어 있다. 특정 수크로오스 에스테르의 일부 실시예는 표1 및 도2에 기재되어 있다.
각각의 하나 이상의 수크로오스 에스테르에서 R1, R2 및 R4의 아실사슬에서의 총 탄소수는, 예를 들면, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18; 적절하게는, 14, 15, 16, 17, 또는 18; 적절하게는 16, 17, 또는 18; 또는 적절하게는 14 또는 15일 수 있다. 총 탄소수가 각각의 수크로오스 에스테르에 존재한다면, 도6에 기재된 것들 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3의 아세틸 및 R5의 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3의 아세틸 및 R5의 수소를 가진다. 적절하게는, 특히 6개의 탄소 아실사슬이 존재할 때, 하나 이상의, 둘 이상의 또는 셋 이상의 아실사슬은 베타-메틸발레릴일 것이다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소 및 위치 R1, R2 및 R4중 어떠한 것에서 3, 4, 5 또는 6 개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가지는 수크로오스 에스테르다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에는 아세틸 및 R5에는 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에는 수소를 가진다. 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소를 가지고, 위치 R1, R2 및 R4 중 어느 것에서 4, 5 또는 6 개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 수소를 가진다. 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 위치 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소 그리고 위치 R1, R2 및 R4 중 어느 것에서 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 수소를 가진다. 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소, R1, 위치 R2 및 R4에서 6개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르를 R3에서 아세틸 그리고 R5에서 수소를 가진다.
하나의 구현예에서,수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소, 위치 R1에서 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬, 위치 R2에서 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬 및 위치 R4에서 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸 및 R5에서 수소를 가진다. 또다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소, 위치 R1에서 4, 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬, 위치 R2에서 4, 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬 및 위치 R4에서 4, 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 수소를 가진다. 또다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소, 그리고 위치 R1에서 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬, 위치 R2에서 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬, 위치 R4에서 5 또는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, 그리고 R5에서 수소를 가진다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소, 그리고 하나 이상의 위치 R1, R2 및 R4에서 여섯 개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, 그리고 R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, 그리고 R5에서 수소를 가진다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3 및 R5에서 아세틸 또는 수소, 위치 R1에서 6개의 탄소를 가지는 아실사슬, 위치 R2에서 6개의 탄소를 가지는 아실사슬, 위치 R4에서 6 개의 탄소를 가지는 아실사슬을 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸, 그리고 R5 에서 수소를 가진다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 수크로오스 에스테르를 함유하는 분지쇄)베타-메틸발레릴이다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, 여기서 R1 내지 R5의 각각은 아세틸, 부티릴, 프로피오닐 또는 그의 이성질체, 이소부티릴, 발레릴 (펜타노일), 2-메틸-부티릴, 이소발레릴, 이소펜테노일, 펜테노일, 헥사노일 또는 그의 이성질체, 2-메틸발레릴, 베타-메틸발레릴 및 4-메틸발레릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 아실사슬 중의 어느 하나이다. 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, R3은 아세틸이고, 각각의 R1, R2, R4 및 R5은 아세틸, 부티릴, 프로피오닐 또는 그의 이성질체, 이소부티릴, 발레릴 (펜타노일), 2-메틸-부티릴, 이소발레릴, 이소펜테노일, 펜테노일, 헥사노일 또는 그의 이성질체, 2-메틸발레릴, 베타-메틸발레릴 및 4-메틸발레릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 아실사슬 중 어느 하나이다. 하나의 구현예에서, 6개의 탄소를 가지는 아실사슬은 분지쇄인 것이 바람직하다. 또다른 구현예에서, 6개의 탄소를 가지는 아실사슬이 베타-메틸발레릴인 것이 바람직하다.
다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, R3은 수소 또는 아세틸이고, R5는 수소 또는 아세틸이고, 각각의 R1, R2 및 R4는 아세틸, 부티릴, 프로피오닐 또는 그의 이성질체, 이소부티릴, 발레릴(펜타노일) 또는 그의 이성질체, 또는 2-메틸-부티릴 , 이소발레릴, 이소펜테노일, 펜테노일, 헥사노일 또는 2-메틸발레릴, 베타-메틸발레릴 및 4-메틸발레릴로 이루어진 군으로부터 선택된 아실사슬 중 어느 하나이다. 각각의 수크로오스 에스테르는 표1 및 도2에 개시되어 있다.
또 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, R3은 아세틸이고, R5는 수소 또는 아세틸이고, 각각의 R1, R2 및 R4은 아세틸, 부티릴, 프로피오닐 또는 그의 이성질체, 이소부티릴, 발레릴 (펜타노일) 또는 그의 이성질체, 2-메틸-부티릴, 이소발레릴, 이소펜테노일, 펜테노일, 헥사노일 또는 그의 이성질체, 2-메틸발레릴, 베타-메틸발레릴 및 4-메틸발레릴로 이루어진 군로부터 선택된 아실사슬 중 어느 하나이다.
또 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, R3은 아세틸이고, R5는 수소 또는 아세틸이고; R1은 부티릴, 프로피오닐 또는 그것의 이성질체, 발레릴 (펜타노일) 또는 그것의 이성질체, 또는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고; R2는 프로피오닐 또는 그것의 이성질체, 발레릴 (펜타노일) 또는 그것의 이성질체, 또는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고; 그리고 R4는 발레릴 (펜타노일) 또는 그것의 이성질체 또는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이다.
또 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, R3은 아세틸이고, R5는 수소 또는 아세틸이고; R1은 프로피오닐 또는 그것의 이성질체, 발레릴 (펜타노일) 또는 그것의 이성질체, 또는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고; R2는 발레릴 (펜타노일) 또는 그것의 이성질체, 또는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고다; 그리고 R4는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이다.
하나의 구현예에서, 조절된 수크로오스 에스테르는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그것의 이성질체, R2=프로피오닐 또는 그것의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그것의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 일반식; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그것의 이성질체, R2=발레릴 또는 그것의 이성질체, R4=발레릴 또는 그것의 이성질체이고 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 그리고 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 바와 같은 수크로오스 에스테르 (C2C14:0)를 가진다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 일반식; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그것의 이성질체, R2=발레릴 또는 그것의 이성질체, R4=발레릴 또는 그것의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸인, 도5에 나타낸 바와 같은 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그것의 이성질체, R4=헥사노일 또는 그것의 이성질체 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸인, 수크로오스 에스테르 (C12C15:0)를 가진다.
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3은 아세틸, R1은 발레릴 또는 그것의 이성질체, R2는 발레릴 또는 그것의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그것의 이성질체 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분인, 도5에 나타낸 일반식을 가진다 (C2C16:0).
하나의 구현예에서, 조절된 수크로오스 에스테르는 R3는 아세틸이고, R1은 프로피오닐 또는 그것의 이성질체, R2 는 헥사노일 또는 그것의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 중 하나인, 도5에 나타낸 일반식을 가진다 (C2C16:0).
하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 R3은 아세틸, R1은 발레릴 또는 그것의 이성질체, R2는 헥사노일 또는 그것의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 중 하나이다 (C2C17:0).
하나의 구현예에서, 조절된 수크로오스 에스테르는 도5에 나타낸 일반식을 가지고, R3는 아세틸이고, R1은 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고, R2는 헥사노일 또는 그것의 이성질체, R4는 헥사노일 또는 그것의 이성질체이고 그리고 R5는 수소원자 또는 아세틸 부분 중 하나이다 (C2C18:0).
또 다른 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 594 달톤 내지 692 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 608 달톤 내지 692 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 622 달톤 내지 692 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 636 달톤 내지 692 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 650 달톤 내지 692 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 650 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다. 또 다른 구현예에서 수크로오스 에스테르는 약 594 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 608 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 622 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 636 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 650 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다. 하나의 구현예에서, 수크로오스 에스테르는 약 664 달톤 내지 678 달톤의 분자량을 가진다.
추가적인 태양은 여기에 기재된 수크로오스 에스테르의 조성물을 첨가하는 것을 포함하는 담배 또는 담배물품의 풍미를 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 식물에서의 수크로오스 에스테르의 농도, 수준 또는 생성이 증가된다. 또 다른 구현예에서, 식물에서의 수크로오스 에스테르의 농도, 수준 또는 생성이 감소된다.
하나의 특정한 구현예에서, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 증가시키기 위해 개변되어온, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 위한 조성물 및 방법이 제공되고, 이것은 수크로오스 에스테르의 농도, 수준 또는 생성이 증가된 식물 또는 식물재료를 가져올 수 있다. 특정하게는, 여기에 기재된 수크로오스 에스테르의 수준 또는 생성은 증가되거나 또는 유도된다.
또 다른 특정 구현예에서, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 감소되거나 억제시키기 위해 개변되어온, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 위한 조성물 및 방법이 제공되고, 이것은 수크로오스 에스테르의 농도, 수준 또는 생성이 감소된 식물 또는 식물재료를 가져올 수 있다. 특정하게는, 여기에 기재된 수크로오스 에스테르의 수준은 감소되거나 제거된다.
유리하게는, 여기에 기재된 방법에 따라 얻어진 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물은 대조식물에 대해 시각적 외관이 유사하거나 또는 실질적으로 동일하다. 하나의 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 예를 들어, 필드이식 뒤 1, 2 또는 3개월 이상 또는 토핑 뒤 10, 20, 30 또는 36일 이상에서 대조식물과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물은 대조식물의 줄기 높이보다 작지 않다. 또 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 대조 식물과 실질적으로 동일하다. 또 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 대조식물과 실질적으로 동일하고 그리고 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 대조식물과 실질적으로 동일하다. 또 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 잎의 크기 또는 형태 또는 수 또는 색은 대조식물과 실질적으로 동일하다. 적절하게는, 식물은 담배 식물이다.
또 다른 태양에서, 적어도 식물의 일부에서- 베타-메틸발레릴 수크로오스 에스테르 함량과 같은-수크로오스 에스테르 함량을 조절하기 위한 방법이 제공되고, 이것은 (i) 바람직하기는, 이소프로필말레이트 합성효소는 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 여기에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하는. 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하는 단계; (ⅱ) 단계 (i)에서 얻어진, 적어도 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환식물의 일부에서 수크로오스 에스테르 함량을 선택적으로 측정하는 단계; 그리고 (iii) 수크로오스 에스테르 함량은 대조식물과 비교해서 조절된, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 확인하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 시각적 외관은 대조식물과 실질적으로 동일하다. 적절하게는, 식물은 담배 식물이다.
또 다른 태양에서, 적어도 식물의 일부 (예를 들어, 잎)에서 베타-메틸발레릴 수크로오스 에스테르 함량과 같은 수크로오스 에스테르 함량을 증가시키기 위한 방법이 제공되고, 이것은 (i) 바람직하기는, 이소프로필말레이트 합성효소는 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 여기에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하는, 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계, (ii) 단계 (i)에서 얻어진, 적어도 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 일부에서 수크로오스 에스테르 함량을 선택적으로 측정하는 단계; 그리고 (iii) 수크로오스 에스테르 함량이 대조식물과 비교해서 증가한 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 태양에서, 적어도 일부의 식물에서- 베타-메틸발레릴 수크로오스 에스테르 함량과 같은-: (i) 바람직하기는, 이소프로필말레이트 합성효소는 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 여기에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함하는, 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 감소시키는 단계, (ii) (i) 단계에서 얻어진, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 일부에사 선택적으로 수크로오스 에스테르 함량을 선택적으로 측정하는 단계; 그리고 (iii) 수크로오스 에스테르 함량은 대조식물과 비교했을 때 감소하는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 확인하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 여기에 개지된 방법은 또한 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써, 오리엔탈 특성을 가지는 식물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 구현예에 따르면, 황색종 또는 버얼리 변종 식물과 같은-비-오리엔탈 식물 변종은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 그안에 증가되도록 조작될 수 있다. 이것은 이로울 수 있는 식물에 오리엔탈 특성을 부여할 수 있는데, 이것은 오리엔탈 풍미를 변화 (예를 들어, 증가 또는 증강)시킬 수 있어서, 새로운 아로마 식물주, 변종 또는 혼성체를 생성할 수 있기 때문이다.
여기에 기재된 방법은 또한 오리엔탈 특성이 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써 감소, 억제 또는 제거되는 식물을 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 이 구현예에 따르면, 오리엔탈 식물 변종은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 그안에 감소되도록 조작될 수 있다. 오리엔탈 특성을 식물에서 감소 또는 제거하는 것은 유리할 수 있는데, 이것은 그것의 오리엔탈 풍미를 변화 또는 감소시킬 수 있어서, 새로운 아로마 식물주, 변종 또는 혼성체를 생성할 수 있기 때문이다.
대조식물과 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소의 발현의 증가는, 약 5%내지 약 100% 이상, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75 이상%, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 100%, 150% 또는 200% 이상 또는 그 이상의 증가일 수 있고, 전사 활성 또는 단백질 발현 또는 둘다의 증가를 포함한다.
대조식물과 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소의 활성의 증가는, 약 5%내지 약 100% 이상, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 적어도 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 100%, 150% 또는 200% 이상 또는 그 이상의 증가일 것이다.
대조식물과 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소의 발현의 감소는 약 5%내지 약 100%, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 100%의 감소일 것이고, 전사 활성 또는 단백질 발현 또는 둘다의 감소를 포함한다.
대조식물과 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소의 활성의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 10% 이상, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98 % 이상, 또는 100% 이상 또는 그 이상의 감소일 것이다.
대조식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르 함량의 증가는 약 5% 내지 약 100%, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98 % 이상, 또는 100%까지의 감소일 것이다.
대조식물과 비교했을 때 수크로오스 에스테르 함량의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%까지의 감소일 것이다.
여기에 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 구조체는 또한 목적하는 식물 종, 적절하게는 담배에서, 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 태양은 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물, 형질전환 식물의 종자이다. 바람직하기는, 종자는 담배 종자다. 또 다른 면은 본 개시물의 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체-식물, 형질전환 식물의 꽃가루 또는 배주이다. 또한 본 발명은 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물, 형질전환 식물을 제공하고, 추가로 웅성불임을 부여하는 핵산을 포함한다.
본 기재는 또한 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성 식물, 또는 형질전환 식물 또는 그것의 일부의 재생가능한 세포의 조직 배양을 제공하고, 배양은 모체의 모든 형태학적 및 생리학적 특징을 발현할 수 있는 식물을 재생한다. 재생가능한 세포는 이들을 한정하는 것은 아니지만, 잎, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃 및 그것의 일부, 밑종자, 싹, 줄기, 줄기대 또는 중과피 및 포자낭 또는 유합 조직 또는 그로부터 유도되는 원형질체를 포함한다.
본 기재에 따르면, 돌연변이 이소프로필말레이트 합성효소의 대립유전자를 운반하는 식물은 유용한 계통, 품종 및 혼성체를 형성하기 위해서 식물 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 특히, 돌연변이 이소프로필말레이트 합성효소 대립유전자는 위에 설명된 상업적으로 중요한 변종으로 유전자이입될 수 있다. 따라서, 식물이 번식시키기 위한 방법이 제공된다. 다른 유전적 동일성, 다른 유전적 배경, 다른 변종, 다른 계통 또는 다른 혼성체를 가지는 식물과 같은-또 다른 식물을 가지는, 여기에 기재된 바와 같은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 교배, 육종 또는 유전자이입하는 것을 포함한다. 하나의 방법은 니코티아나 타바쿰 (예를 들어, 버얼리종)과 같은 니코티아나 속의 재배품종 또는 엘리트 재배품종 또는 식물을 가지는, 여기에 기재된 바와 같은 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 형질전환 식물을 교배, 번식 또는 유전자이입하는 것을 포함한다.
방법은 후손 식물을 다른 식물로 교배하는 것, 그리고 경우에 따라서는 바람직한 유전적 특성 또는 유전적 배경을 가지는 후손가 얻어질 때까지 교배를 반복하는 것을 더 포함한다. 방법은 또한 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되는 식물을 식별할 수 있는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 또한 대조식물과 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되는 식물을 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 육종 방법에 의해서 제공되는 하나의 목적은 바람직한 유전적 특성을 다른 변종, 육종 계통, 혼성체 또는 특히 상업적 관심이 있는 재배품종에 도입하기 위한 것이다. 또 다른 목적은 단일 식물 변종, 계통, 혼성체 또는 재배품종에서 다른 유전자의 유전적 변형의 축적을 용이하게 하기 위한 것이다. 종내뿐만 아니라 종간 교배가 고려된다. 이러한 교배로부터 발생하고 또한 육종 계통으로도 불리는 후손 식물은 개시된 비자연적으로 발생하는 식물의 예이다.
하나의 구현예에서, (a) 후손 담배 종자를 생산하기 위해서 돌연변이 또는 형질전환 식물을 두번째 식물을 교배하는 단계; (b) 비자연적으로 발생하는 식물을 생산하기 위해서, 식물 성장 조건하에서, 후손 담배 종자를 성장하는 단계를 포함하는, 비자연적으로 발생하는 식물을 제공하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되는 식물을 식별하는 선택적 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 대조식물과 비교했을 때 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되는 식물을 선택하는 선택적 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 (c) 후손 담배 종자를 생산하기 위해서 비자연적으로 발생하는 식물과 자체 또는 다른 식물의 이전 세대의 교배; (d) 추가적인 비자연적으로 발생하는 식물을 생산하기 위해서 식물 성장 조건 하에서 단계 (c)의 후손 담배 종자를 성장시키는 단계; 그리고 (e) 비자연적으로 발생하는 식물의 추가적인 세대를 발생시키기 위해 (c) 및 (d)를 여러 번의 교배 및 성장 단계를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 단계 (a) 전에 선택적으로 포함할 수 있고, 이 단계는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 특징으로 하고 그리고 동일하지 않은 유전적 동일성을 포함하는, 모체 식물을 제공한다. 일부 구현예에서, 육종 프로그램에 따라 교배 및 성장 단계는 0 내지 2회, 0 내지 3회, 0 내지 4회, 0 내지 5회, 0 내지 6회, 0 내지 7회, 0 내지 8회, 0 내지 9회, 0 내지 10회 반복해서 비자연적으로 발생하는 식물의 세대를 발생시킬 수 있다. 역교배는 후손가 그것의 모체 또는 그것의 모체와 유전적으로 유사한 또 다른 식물 중 하나로 교배되는 이러한 방법의 예시이고, 이것은 모체 중 어느 하나와 유사한 유전적 동일성을 가지는 다음 세대에서 후손를 얻기 위한 것이다. 식물 육종, 특히 담배 식물 육종을 위한 기술은 잘 알려져 있고 그리고 기재된 방법에 사용될 수 있다. 기재는 이러한 방법에 의해서 얻어지거나, 또는 얻어질 수 있는 생성된, 비자연적으로 발생하는 식물을 더 제공한다.
여기에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 이형 이소프로필말레이트 합성효소 유전자를 위해 육종 및 스크리닝으로부터 발생하는 계통은 표준 필드 절차를 사용하는 필드에서 평가된다. 본래의 돌연변이를 유발하지 않는 모체를 포함하는 조절 유전자형이 포함되고 그리고 개체는 무작위의 완전한 블록 설계 또는 다른 적절한 필드 설계의 필드에 배열된다. 담배의 경우, 경화 전과 그 동안에 화학적 및 다른 일반적인 테스트를 위해 표준 표준 농경법상 관행은 사용되고, 예를 들어 담배가 수확되고, 계량되고, 그리고 샘플화된다. 데이터의 통계학적 분석은 모체 계통에 대한 선택된 계통의 유사성을 확인하기 위해서 수행된다. 선택된 식물의 세포유전학적 분석은 선택적으로 염색체 보체 및 염색체 쌍의 관계를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 위에 설명된 육종, 교배 또는 유전자이입 방법에 의해서 얻어지거나 또한 얻어질 수 있는 식물은 시스-아비에놀을 생산하지 않을 것이고, 시스-아비에놀을 실질적으로 생산하지 않을 것이고, 또한 검출가능한 수준의 시스-아비에놀을 생산하지 않을 것이다. 또 다른 구현예에서, 여기에 기재된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻어질 수 있는 수크로오스 에스테르 조성물 및 수크로오스 에스테르 조성물은 상당한 수준의 시스-아비에놀을 포함하지 않거나 또는 함유하지 않을 수 있고, 상당한 수준의 시스-아비에놀을 포함하지 않거나 또는 함유하지 않을 것이고 또는 검출가능한 수준의 시스-아비에놀을 포함하지 않거나 함유하지 않을 것이다. 따라서 시스-아비에놀 특성은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수도 있다.
DNA 지문분석, 단일 뉴클레오티드 다형성, 마이크로새틀라이트 마커, 또는 유사한 기술은 여기에 기재된 바와 같은, 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 돌연변이 대립유전자를 전달 또는 육종하기 위해서 마커-보조 선택 (MAS) 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종자는 작물학상으로 바람직한 유전자형을 함유하는 유전자형의 혼성화로부터 분리개체를 형성할 수 있다. F2 또는 역교배 세대에서의 식물은 여기에 기재된 기술 중 하나를 이용해서, 이소프로필말레이트 합성효소 게놈서열 또는 그의 단편으로부터 개발되는 마커를 이용해서 스크린될 수 있다. 돌연변이 대립유전자를 가지는 것으로 확인된 식물은 역교배되거나 자가수분되어서 두번째 개체가 스크린되도록 형성할 수 있다. 예상되는 유전 패턴 또는 사용되는 MAS 기술에 따라, 역교배의 각각의 주기 전에 선택된 식물을 자가-수분하는 것이 필요하고 이것은 원하는 각각의 식물의 확인을 보조하기 위한 것이다. 역교배 또는 다른 육종 절차는 반복되는 모체의 원하는 표현형이 회복될 때까지 반복될 수 있다.
본 기재에 따라, 육종 프로그램에서, F1의 성공적인 교배는 수정된 F1 식물을 생산한다. 선택된 F1 식물은 모체 중 하나로 교배될 수 있고, 그리고 첫번째 역교배 세대 식물은 변종 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 발현 (예를 들어, 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 null 버전)을 위한 재검증된 개체군을 생산하기 위해서 자가수분 된다. 역교배, 자가 수분 및 스크리닝의 과정은 예를 들어, 마지막 스크리닝이 반복되는 모체에 생식력이 있고, 합리적으로 유사한 식물을 생산할 때까지 적어도 4번 반복된다. 바람직하다면, 식물은 자가수분되고 후손은 변종 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 발현을 나타내는 식물을 확인하기 위해서 그 이후에 다시 검증된다. 일부 구현예에서, F2 세대의 식물 개체는 변종 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 발현을 위해 스크린되고, 예를 들어, 여기에 기재된 이소프로필말레이트 합성효소에 대한 뉴클레오티드 서열 정보를 기초로 하여 프라이머를 가지는 PCR 방법을 사용해서, 표준 방법에 따라서 이소프로필말레이트 합성효소 유전자의 부재로 인해, 예를 들면, 식물은 이소프로필말레이트 합성효소를 발현하는 것이 실패하는 것으로 확인된다.
혼성체 담배 변종은 첫번째 변종의 교배모수 식물(즉, 종자 모체)의 자가수분을 방지함으로써, 교배모수 식물을 풍부하게 하는 두번째 변종의 웅성 모체 식물로부터의 수분을 허용함으로써, 그리고 F1 혼성체 식물을 교배모수 식물 위에 형성함으로써 제조될 수 있다. 교배모수 식물의 자가수분은 꽃 발생의 초기단계에 꽃을 무력화시킴으로써 억제될 수 있다. 선택적으로, 꽃가루 형성이 웅성불임성의 형태를 통해 교배모수 식물을 방지할 수 있다. 예를 들어, 웅성불임성은 이식 유전자가 소포자 생성 및/또는 꽃가루 형성, 또는 자기 불화합성을 억제하는 세포쿼리 웅성불임성(CMS) 또는 형질전환 웅성불임성에 의해 생성될 수 있다. CMS가 포함된 교배모수 식물은 특히 유용하다. 교배모수 식물이 CMS인 구현예에서, 꽃가루은 웅성가임 식물로부터 수확되고, 교배모수 식물의 암술머리에 수동적으로 적용된다. 그리고 얻어진 F1 종자가 수확된다.
여기에 기재된 변종과 계통은 단일 교배 담배 F1 혼성체를 형성하는데 사용될 수있다. 이러한 구현예에서, 모체 변종의 식물은 웅성 친 식물에서 교배모수 식물로 자연적 교배수분을 촉진시키기 위해 실질적으로 동형인 인접한 단일 개체군으로써 자랄 수 있다. 교배모수 식물에서 형성된 F1 종자는 선택적으로 기존의 방법으로 수확된다. 하나는 대량으로 두 모체 식물 품종을 재배할 수 있고, 교배모수에 의해 형성된 F1 혼성체 종자 및 자가 수분의 결과로 인한 웅성 친에 형성된 종자와의 조합을 수확할 수 있다. 대안으로, 삼원 교혼성체는 단일 교배 F1 혼성체가 교배모수로써 사용되고, 다른 웅성 친과 교배되었던 곳에 수행될 수 있다. 다른 대안으로, 이중-교배 혼성체는 두개의 다른 단일 교배의 F1 후손이 그들 스스로 교배되는 곳에 만들 수 있다.
비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 개체는 원하는 특성이나 표현형을 가지는 개체수를 스크린하거나 또는 선택할 수 있다. 예를 들어, 단일 형질전환 경우의 후손의 개체는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 원하는 수준의 발현을 갖는 식물을 위해 스크린할 수 있다. 물리적, 생화학적 방법은 발현 수준을 식별하는 데 사용될 수 있다. 이것은 폴리뉴클레오티드의 탐지를 위해 서던블롯 또는 PCR 증폭; 노던블롯, S1 RNase 보호, 프라이머 신장법 또는 RNA 전사를 탐지하기 위한 RT- PCR 증폭; 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임을 탐지하기 위한 효소 측정법; 및 폴리펩티드를 검출하기 위한 단백질 겔 전기천공법, 웨스턴블롯, 면역침강법, 및 효소 면역 분석법. 가시적 분자결합화, 효소 염색, 및 면역 염색법과 같은 다른 기술들은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
여기서 설명된 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함된다 - 여기에 기재된 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구조체, 하나 이상의 이중 가닥 RNA, 하나 이상의 콘쥬게이트 또는 하나 이상의 벡터/발현 벡터와 같은-하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
유전자 발현은 예를 들어, RT -PCR, 노던블롯, RNase 보호, 프라이머 신장법, 웨스턴블롯, 단백질 겔 전기천공법, 면역 침강법, 효소-결합 면역분석법, 칩 분석 및 질량 분석을 포함하는 방법들을 사용해서 평가될 수 있다. 이것은 폴리펩티드는 조직 우선적인 또는 넓게 발현하는 프로모터의 제어하에 발현되는 경우, 발현은 식물 전체 또는 선택된 조직으로 평가될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 유사하게, 폴리펩티드가 예를 들면, 발달 또는 유도하는 특정 시간에 발현된다면, 발현은 시기적절하게 선택적으로 평가될 수 있다.
제한 없이, 여기에 기재된 식물은 발현 또는 활성이 조절되기 전후에 다른 목적을 위해서 개변될 수 있다. 하나 이상의 다음 유전자 변형 중 하나 이상은 본 개시물의 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물체에 나타날 수 있다. 하나의 구현예에서, 중금속 흡수 또는 중금속 전달에 관여하는 하나 이상의 유전자는 개변 없이 대조식물 또는 일부보다 낮은 중금속 함유량을 가지는 식물 또는 식물의 일부 (잎과 같은)을 가져옴으로써 개변된다. 비제한적인 예는 양이온 확산 촉진자 (CDF)과, Irt와 같은 단백질(ZIP)인 Zrt과, 양이온 교환체(CAX)과, 구리 운반자(CORT)과, 중금속 P 형 ATP 분해효소(WO2009074325에 설명된 HMAs)과, 자연적 저항성 관련 대식세포 단백질(NRAMP)의 동족체의 패밀리 및 카드뮴 같은 중금속의 수송에 관여하는 ATP 결합(ABC) 수송체의 유전자를 포함한다. 여기서 사용된 중금속의 용어는 전이 금속을 포함한다. 다른 구현예에서, 질소 대사 중간체의 변환에 관여하는 하나 이상의 유전자는, 가열할 때, 대조식물 또는 그 부분보다, 적어도 하나의 담배 특이 니트로사민(4-(메틸니트로사민)-1-(3-피리딜)-1-부타논, N-니트로소노르니코틴, N- 니트로소아나타빈 및 N-니트로소노아나바신)의 저수치를 생성하는 식물 또는 식물의 부분 (잎 같은)에서 얻은 것이 조절된다. 조절될 수 있는 유전자의 비제한적인 예는 니코틴에서 노르니코틴으로의의 전이가 일어나는 CYP82E4 , CYP82E5 및 CYP82E10과 같은 니코틴 탈메틸효소를 코드화하는 유전자를 포함하고, WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 및 PCT/US2011/021088에 설명되어있다.
다른 변형 예는 제초제 저항성을 포함하고, 예를 들면, 글리포세이트는 광범위 스펙트럼 제초제의 활성 성분이다. 글리포세이트 저항성 형질전환 식물은 aroA 유전자(쥐티푸스균 및 대장균에서 글리포세이트 EPSP 합성효소)의 전이에 의해 발달됨으로써 개발되었다. 술포닐우레아 저항성 식물은 애기장대의 돌연변이 ALS (아세토락테이트 합성효소)형질전환됨으로써 생성되었다. 돌연변이 긴털비름에서 광계 II 의 OB 단백질은 아트라진 저항성 형질전환 식물을 생산하는 식물에 전이되었다; 그리고 브로목시닐 내성 형질전환 식물은 박테리아 폐렴간균에서 BXN 유전자를 삽입하여 생산된다. 곤충에 강한 식물의 또 다른 예로 변이를 야기한다. 바실러스 튜링겐시스(BT) 독소는, 피라미드식 crylAc 및 crylC Bt 유전자는 하나의 단일 단백질에 저항성 있는 배추좀나방을 조절하고, 저항하는 곤충의 진화가 실질적으로 지연되는 브로콜리에 나타낸 바와 같이, Bt 저항성 해충의 출현을 지연시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있다. 또 다른 예시적인 변형은 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 곰팡이)로 인한 질병에 저항하는 식물을 야기한다. Xa21 유전자를 발현하는 식물(세균성 마름병에 저항성)과 Bt 융합 유전자 및 키티나제 유전자(노란 줄기 나무좀에 저항성 및 다발에 내성) 둘 다 발현된 식물은 유전자가 조작되었다. 또 다른 예시적인 변형은 웅성불임성과 같은 생식 능력을 바꾸는 결과를 초래한다. 또 다른 예시적인 변형은 무 생물적 스트레스 (예를 들면, 가뭄, 온도, 염도)에 내성이 있는 식물을 야기하고, 내성 형질전환 식물은 애기장대로부터 아실 글리세롤 포스페이트 효소가 전이함으로써 생산된다; 만니톨 및 소르비톨이 합성된 만니톨 탈수소효소 및 소르비톨 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 가뭄 저항성을 향상시킨다. 또 다른 예시적인 변형은 인간의 사용을 위한 유리한 면역 특성을 가지는 단백질을 생산하는 식물을 야기한다. 예를 들어, N- 글리칸에 알파-1,3에 결합된 푸코오스 잔기, 베타-1,2 에 결합된 크실로오스 잔기, 또는 둘 다 실질적으로 부족한 단백질을 생산할 수 있는 식물은 유용할 것이다. 다른 예시적 변형은 저장 단백질과 기름이 증가된 식물, 광합성 효율이 향상된 식물, 저장수명이 늘어난 식물, 탄수화물 함량이 향상된 식물, 및 곰팡이 저항성 식물을 야기할 수 있다; 식물 알칼로이드의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 식물. S-아데노실-L-메티오닌 (SAM) 및/또는 시스타티오닌 감마 합성효소 (CGS)의 발현이 조절된 형질전환 식물이 또한 고려된다.
하나 이상의 이러한 특성은 다른 식물이나 담배 재배품종으로부터 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물에 유전자이입될 수 있거나 그것으로 직접 형질전환될 수 있다. 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 다른 식물이나 담배 재배종 또는 그 안에 변이된 형질전환 식물로의 특성(들)에 유전자이입될 수 있다. 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물로의 특성(들)의 유전자이입은 예를 들어, 계통 육종, 역교배, 이게놈 반수체 육종 등의 분야에서 알려진 식물 육종의 방법에 의해 이루어질 수 있다. (Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp 참고). 위에 설명된 분자 생물학-기반 기술, 특히 RFLP 및 마이크로새틀라이트 서열 마커는 반복 모체와의 고도의 유전적 동일성의 가장 높은 정도를 가지는 후손을 확인하기 위해서 역교배가 사용될 수 있다. 이것은 90% 이상, 바람직하기는 95% 이상, 보다 바람직하기는 99% 이상의 반복 모체의 유전적 동일성, 더 가장 바람직하기는 반복 모체와 유전적으로 동일하거나, 공여친으로부터 침투된 특성을 구성하는 담배 품종의 생산을 가속화시키기 위한 것으로 허용된다. 유전적 동일성의 결정은 본 분야에서 알려진 분자적 마커에 기초될 수 있다.
마지막 역교배 세대는 전이되는 핵산(들)에 대한 후손의 순수교배법으로 번식될 수 있다. 전이 특성 (들) (예를 들면, 하나 이상의 단일 유전자 특성)에 추가적으로, 생성된 식물은 발명의 비자연적으로 발생하는 돌연변이, 또는 형질전환 식물의 형태학적 및 생리학적 특성을 모두 필수적으로 가진다. 정확한 역교배 프로토콜은 적절한 검사 프로토콜을 결정하기 위해 변경되는 특성에 따라 달라진다. 전이되는 특성은 우성 대립 인자일 때 역교배 방법이 단순화되어 있음에도 불구하고, 열성 대립유전자 또한 전이될 수 있다. 이 경우에, 원하는 특성이 성공적으로 전이되었는지 확인하기 위해서 후손의 검사를 도입할 필요가 있다.
식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환되기 위해서 게놈으로 통합된 재조합 폴리뉴클레오티드를 가짐으로써 형질전환될 수 있다. 안정적으로 형질전환된 세포는 통상적으로 각각의 세포분열에서 도입된 폴리뉴클레오티드를 유지한다. 또한 식물 또는 식물 세포는 일시적 재조합 폴리뉴클레오티드가 그것의 게놈에 통합되지 않도록 일시적으로 형질전환될 수 있다. 일시적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드는 충분히 많은 세포 분열 후에, 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드가 딸 세포에서 검출될 수 있도록 하기 위하여, 각각의 세포 분열과 함께 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분을 잃는다.
단백질(예, 항체), 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 중합체 (예, 폴리에틸렌 글리콜), 또는 그것들의 조합과 같은 고분자 화합물을 포함하는 컨쥬게이트 부위는 드러난다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수가 증가하는 잔기에 컨쥬게이트될 것이다. 부분의 비제한적인 예는 항체, 폴리펩티드, 콜레스테롤 잔기같은 지질 잔기, 콜산, 티오에테르 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기인 지방족 사슬, 인지질, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 잔기, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 잔기를 포함하지만, 제한되지는 않는다. 부분은 양전하를 띠는 중합체일 것이다-예를 들면, 길이가 약 1-50개의 아미노산 잔기 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥사이드인 양전하를 띠는 펩타이드 같은. 폴리알킬렌 옥사이드같은 양전하로 하전된 중합체는 방출가능 링커와 같은 링커를 통해서 올리고머에 결합될 수 있다.
폴리펩티드의 발현이 측정되는 경우, 세포에서 폴리펩타이드를 인코딩하는 m RNA의 양을 검출하는 것은 예를 들어 PCR 또는 노던 블롯에 의해 정량화될 수 있다. 샘플의 폴리펩티드의 양의 변화가 측정되는 곳에, 항체를 사용하여 검출하는 것은 알려진 기술을 사용하여 세포에서 폴리펩티드의 양을 정량화하는데 사용될 수있다. 선택적으로, 효소의 생물학적 활성은 본 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드에 면역반응성이 있는 항체는 여기에 제공되었다. 폴리펩티드, 단편, 변종, 융합 폴리펩티드, 여기서 명시된 것 등은 그곳에서 항체 면역반응성을 생산하는 "면역원"으로서 이용될 수 있다. 이러한 항체는 특정하게는 항체의 항원 결합 부위를 통하여 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 특정하게는 결합하는 항체는 특히 폴리펩티드, 상동 기관, 및 변이를 인식하고 결합 하지만, 다른 분자는 그렇지 않다. 하나의 구현예에서, 항체는 여기에 명시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 대해 특이적이고, 다른 폴리펩타이드와 교배 반응하지 않는다.
더욱 특정하게는, 폴리펩티드, 단편, 변종, 융합 폴리펩티드 등이 항체 형성을 이끌어내는 항원 결정기 또는 에피토프를 포함한다. 항원 결정기 또는 에피토프는 선형 또는 입체 (불연속적) 중 하나일 수 있다. 입체 또는 불연속적인 에피토프는 폴리펩티드 접힘 시에 아주 근접하게 되는 폴리펩티드 사슬의 다른 부분으로부터의 아미노산 부위로 구성되어 있는 반면, 폴리펩티드의 아미노산의 선형 에피토프는 단일 부위로 구성되어 있다. 에피토프는 알려진 기술적 방법에 의해 식별될 수 있다. 추가적으로, 폴리펩티드의 에피토프는 분석시에 연구 시약으로 사용될 수 있고, 배양된 혼성세포에서 폴리클로날 항체 혈청 또는 상청액과 같은 물질로부터의 특이적 결합 항체를 정제할 수 있다. 이러한 에피토프 또는 변형은 고체상 합성, 폴리펩티드의 화학적 또는 효소적 분해, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하는 것과 같은 본 분야에 알려진 기술을 사용하는 것으로 생산될 수 있다.
폴리펩티드에 대한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 모두 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다. 또한 폴리펩티드에 대해 특이한 단일 클론 항체 특이성을 생산하는 혼성 세포는 여기서 고려된다. 이러한 혼성세포는 제조될 수 있고, 종래의 기술에 의해 식별될 수 있다. 항체 생산의 경우, 다양한 숙주 동물들은 폴리펩티드, 단편, 변이, 또는 이들의 돌연변이가 주입되어 면역력을 가질 수 있다. 이러한 숙주 동물은 포함할 수 있지만, 몇 가지로 지정하기 위해서 토끼, 마우스와 랫트에 국한되지는 않는다. 각종 보조자는 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 숙주 종에 따라, 그러한 보조체가 포함되나, 프로인트(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 리졸레시틴 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다중 음이온, 펩티드, 유유제, 키홀-림펫 헤모사이아닌, 디니트로페놀, 및 BCG 및 코리네박테리움 포자충 같은 잠재적으로 유용한 인간 부관에 한정되지 않는다. 단일 클론 항체는 통상적인 기술에 의해 회수될 수 있다. 이러한 단일 클론 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 및 그곳의 서브클래스를 포함하는 면역글로불린 클래스일 수 있다.
또한 항체는 in vivo 또는 in vitro에서 폴리펩티드 또는 단편의 존재를 검출하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드 또는 단편을 정제하는 데에 이용될 수 있다.
다양한 구현예들은 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 조절하는 바이오매스 뿐만 아니라 비자연적으로 발생하는 돌연변이 식물 또는 형질전환 식물을 제공한다.
그러한 식물, 특히 담배 식물, 더 특정하게 담배식물의 잎몸 및 주맥의 부분은 안에 삽입될 수 있고, 또한 다양한 소모성 생성물을 만들 수 있지만, 에어로졸 형성물질, 에어로졸 형성 장치, 흡연 물품, 흡연에 적합한 물품, 무연의 생성물, 및 담배 생성물에 제한되지는 않는다. 에어로졸 형성 물쿼리 예는 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 대담배, 컷 필러, 건조된 담배, 팽화된 담배, 균질화된 담배, 재생 담배 및 파이프 담배를 포함하지만, 국한되지는 않는다. 흡연 물품 및 흡연에 적합한 물품은 에어로졸 형성 장치의 종류이다. 흡연 물품 및 흡연에 적합한 물품의 예로는 담배, 가는 담배, 및 시가를 포함하지만 한정되지는 않는다. 무연 생성물의 예는 씹는 담배와 코담배를 포함한다. 연소, 담배 조성물 또는 다른 에어로졸 형성 재료보다 특정 에어졸 형성 장치에서, 에어로졸을 생성하기 위한 하나 이상의 전기적 가열 요소에 의해 가열된다. 다른 유형의 가열된 에어로졸 형성 장치에서, 가연성 연료 요소 또는 열원으로부터, 열원 내, 주변 또는 하류에 위치될 수 있는 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 재료로의 열전달에 의해 생성된다. 무연 담배 제품 및 각종 담배 함유 에어로졸 형성 물질은 침전된, 혼합된, 조각, 얇은 막, 캡슐, 거품, 또는 방울 같은 형식에 다른 재료들에 의해 혼합된 것이든, 건조 입자, 조각, 과립, 분말, 또는 슬러리에 포함된 형태의 담배를 포함할 수 있다. 여기서 사용되는, 용어 '연기'는 담배와 같은 흡연물품에 의해 생성되는 에어로졸 종류를 설명하기 위해 사용되고 있다.
하나의 구현예에서, 여기에 기재된 돌연변이, 유전자 변형 및 비자연적으로 발생하는 식물로부터 경화된 재료가 제공된다. 녹색 잎담배 경화 공정은 본 분야의 기술을 가지는 사람들에 의해 알려졌고, 제한없이 음건, 화건, 화력 건조 및 볕말림없이 포함된다. 녹색 잎담배 경화공정은 수확된 담배의 종류에 따라 달라진다. 예를 들어, 버지니아 연도(밝은) 담배는 황색종, 버얼리 및 음건종, 파이프 담배, 씹는 담배 그리고 일반적으로 황색종인 코담배인 특정 어두운 변종이다.
다른 구현예에서, 돌연변이 담배 식물, 형질전환 담배 식물 또는 여기에 기재된 비자연적으로 발생하는 담배 식물로부터 잎, 경화된 잎을 더 선호하여, 구성하는 담배 함유 에어로졸 형성 물질을 포함하는 담배식물이 설명되었다. 여기에 기재된 담배 생성물은 추가로 비 변형된 담배를 포함할 수 있는 혼합 담배 제품 일 수 있다.
이러한 에어로졸 형성 물질이나 담배 조성물의 % 수크로오스 에스테르는, 비 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 비 형질전환 상대 식물에서 파생된 에어로졸 형성 물질이나 담배의 성분을 비교할 때, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%, 150% 또는 200% 또는 그 이상일 수 있다.
이러한 에어로졸 형성 물질 또는 담배 조성물의 % 수크로오스 에스테르는, 비 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 비 형질전환 상대 식물에서 파생된 에어로졸 형성 물질이나 담배의 성분을 비교할 때, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 이하일 수 있다.
비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물은 예를 들면, 농업에서의, 다른 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 여기에 설명된, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물은 동물 사료 및 인간의 식료품을 만드는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 또한 형질전환 식물을 재배하는 것, 및 재배된 식물로부터 종자를 수집하는 것을 포함하는 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 여기에 기재된 식물의 종자는 조절될 수 있고, 제조품을 형성하기 위해 본 분야에서 알려진 수단에 의해 포장재에 넣어질 수 있다. 종이 및 천과 같은 포장재는 본 분야에서 잘 알려져 있다. 종자의 포장물은 예를 들어, 태그 또는 포장재, 포장재로 인쇄된 라벨, 또는 포장 내에 삽입된 라벨로 고정된 라벨인 라벨을 가질 수 있다.
또 다른 태양은 다음의 단계를 포함하는 수크로오스 에스테르를 함유하는 조성물의 생산을 위한 방법에 관한 것이고: (a) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 부분을 제공하는 것; 바이오매스, 종자 또는 잎; 또는 여기에 설명된 담배 제품; 및 (b) 그것으로부터 수크로오스 에스테르를 추출하는 것; (c) 선택적으로 수크로오스 에스테르를 정제하는 것을 포함한다.
또 다른 태양은 다음의 단계를 구성하는 베타-메틸발레르산을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다: (a) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 생성하는 것; 바이오매스, 또는 잎; 또는 여기에 기술된 에어로졸 형성 물질; (b) (a)단계에서 얻어진 재료 또는 그것에서 추출물에서 가수 분해하는 것; 및 (c) 선택적으로 베타-메틸발레르산을 수집하는 것. 베타-메틸발레르산은 폴리하이드록시알카노에이트 및 플라스틱, 유익한 특성을 포함하는 재료를 제공할 수 있는 것 등의 생성물에서 사용될 수 있다. 제조될 수 있는 플라스틱은 생분해될 수 있고, 그리하여 바이오 플라스틱의 제조에 사용될 수 있다. 세균 -대장균 또는 슈도모나스와 같은-은 여기에 기술된 이소프로필말레이트 합성효소를 발현하기 위해서 조작될 수 있다. 적절하게는, 사용되는 세균은 또한 폴리히드록시알카노에이트를 생성하도록 또한 조작될 수 있다. 미생물 시스템을 사용한 폴리히드록시알카노에이트의 생성물을 위한 방법은, 예를 들어, US5,750,848 및 US6,492,134에 설명되어 있다. 따라서, 하나의 태양은 이소프로필말레이트 합성효소를 구성하는 세균 및 선택적으로 폴리하이드록시알카노에이트를 생성하기 위한 하나 이상의 유전자와 관한 것이다. 또 다른 태양은 세균의 사용을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생성 을 위한 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 돌연변이, 형질전환 및 여기에 기술된 비자연적으로 발생하는 식물로부터 제공된 경화된 재료로 또한 생성된다. 예를 들어, 녹색 담배 잎 경화 공정은 당업자에 의해 알려져 있으며, 한계 음건, 화건, 화력 건조 및 볕말림없이 포함한다. 녹색 잎담배 경화공정은 수확된 담배의 종류에 따라 달라진다. 예를 들어, 예를 들어, 버지니아 플루(브라이트) 담배는 황색종, 버얼리 및 음건종, 파이프 담배, 씹는 담배 그리고 일반적으로 황색종인 코담배인 특정 어두운 변종이다.
또 다른 구현예에서, 예를 들면, 여기에 설명된 돌연변이, 형질전환 및 비자연 발생 식물, 또는 여기에 기재된 방법에 의해 생성되는 것으로부터 경화된 잎을 포함하는 담배 제품을 포함한 담배 제품이 설명되어 있다. 여기에 기재된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 식물 재료, 돌연변이, 형질전환 및 여기에 기재된 비자연적으로 발생하는 식물로부터 경화된 잎과 같은 바람직한 잎을 포함하는 담배 생성물이 설명된다. 예를 들어, 식물 재료는 담배 제품의 내부 또는 외부에 첨가될 수 있으며, 좋은 향기는 연소되자마자 방출된다. 본 구현예에 따른 담배 생성물도 담배 또는 변성 담배로 변형될 수 있다. 본 구현예에 따른 담배 생성물도 본 명세서에 개시된 유전자 이외의 하나 이상의 유전자 변형을 가지는 돌연변이, 형질전환 또는 비자연적으로 발생하는 식물로부터 유래 될 수 있다.
또 다른 면은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 수크로오스 에스테르를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 (분리된) 수크로오스 에스테르 조성물에 관한것이다. 수크로오스 에스테르는 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소 총 수는 14인 수크로오스 에스테르일 것이다; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소 총 수는 15인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소 총 수는 16인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소 총 수는 17인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소 총 수는 18인 수크로오스 에스테르일 것이다. 탄소 총 수가 존재한다면, 구성하는 아실사슬은 도6에 명시된 것들 중 하나로부터 선택될 수 있다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서의 아세틸 및 R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸 및 R5에서 수소를 가진다. 적절하게는, 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상의 아실사슬은 베타-메틸발레릴일 것이다. 따라서, 예의 방법에 의해, 수크로오스 에스테르는, R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르일 수 있다; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C14:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C15:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C16:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 프로피오닐 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C16:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C17:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; R3은 아세틸이고, R1은 헥사노일 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C18:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르.
선택적으로, 수크로오스 에스테르는 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 14인 수크로오스 에스테르 일 수 있다; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 15인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 16인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 17인 수크로오스 에스테르; 및 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 18인 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C18:0)로 존재하지 않는다. 탄소 총 수가 존재한다면, 구성하는 아실사슬은 도6에 명시된 것들 중 하나로부터 선택될 수 있다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서의 아세틸 및 R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸 및 R5에서 수소를 가진다. 적절하게는, 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상의 아실사슬은 베타-메틸발레릴일 것이다. 따라서, 예의 방법에 의해, 수크로오스 에스테르는, R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르일 수 있다; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C14:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C15:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C16:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 프로피오닐 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C16:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C17:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; R3은 아세틸이고, R1은 헥사노일 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C18:0)로 존재하지 않는다.
선택적으로, 수크로오스 에스테르는 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 14인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 15인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 16인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 17인 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치로 존재하지 않고; 및 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 18인 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치로 존재하지 않는다. 탄소 총 수가 존재한다면, 구성하는 아실사슬은 도6에 명시된 것들 중 하나로부터 선택될 수 있다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서의 아세틸 및 R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸 및 R5에서 수소를 가진다. 적절하게는, 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상의 아실사슬은 베타-메틸발레릴일 것이다. 따라서, 예의 방법에 의해, 수크로오스 에스테르는, R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르일 수 있다; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C14:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C15:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C16:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 프로피오닐 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분(C2C16:0) 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르; R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C17:0)로 존재하지 않는다; R3은 아세틸이고, R1은 헥사노일 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C18:0)로 존재하지 않는다.
선택적으로, 수크로오스 에스테르는 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 14인 수크로오스 에스테르 일 수 있다; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 15인 수크로오스 에스테르; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 16인 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치로 존재하지 않는다; R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 17인 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치로 존재하지 않는다; 및 R1, R2 및 R4에서 아실사슬의 탄소의 총 수가 18인 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치로 존재하지 않는다. 탄소 총 수가 존재한다면, 구성하는 아실사슬은 도6에 명시된 것들 중 하나로부터 선택될 수 있다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서의 아세틸 및 R5에서 아세틸 또는 수소를 가진다. 적절하게는, 수크로오스 에스테르는 R3에서 아세틸 및 R5에서 수소를 가진다. 적절하게는, 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상의 아실사슬은 베타-메틸발레릴일 것이다. 따라서, 예의 방법에 의해, 수크로오스 에스테르는, R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5는 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르일 수 있다; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C14:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=프로피오닐 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=발레릴 또는 그의 이성질체, R2=발레릴 또는 그의 이성질체, R4=발레릴 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3=아세틸, R1=부티릴, R2=헥사노일 또는 그의 이성질체, R4=헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 또는 아세틸(C2C15:0)로 도5에 나타낸 수크로오스 에스테르; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 발레릴 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C16:0)로 존재하지 않는다; 또는 R3은 아세틸이고, R1은 프로피오닐 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C16:0)로 존재하지 않는다; R3은 아세틸이고, R1은 발레릴 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C17:0)로 존재하지 않는다; R3은 아세틸이고, R1은 헥사노일 또는 그의 이성질체이며, R2는 헥사노일 또는 그의 이성질체이고, R4는 헥사노일 또는 이의 이성질체 및 R5가 수소 원자 또는 아세틸 성분 중 하나로 도5에 나타낸 일반식을 가지는 수크로오스 에스테르는 존재하거나, 많이 존재하지 않거나 또는 검출가능 한 수치(C2C18:0)로 존재하지 않는다.
또 다른 태양은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 여기에 설명된 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 인코딩된 단백질의 활성도는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 코드된 단백질의 활성이 증가 되지 않은 대조식물과 비교됨으로써 증가되고, 말했던 대조식물보다 높은 수치의 내부 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릭을 생산하는 형질전환 식물 (적절하게는, 담배 식물)에 관한 것이다. 또 다른 태양은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 여기에 설명된 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 인코딩된 단백질의 활성도는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 코딩된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조식물과 비교됨으로써 감소되고, 말했던 대조식물보다 낮은 수치의 내부 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릭을 생산하는 형질전환 식물 (적절하게는, 담배 식물)에 관한 것이다.
또 다른 태양은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 여기에 설명된 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 인코딩된 단백질의 활성도는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 코드 된 단백질의 활성이 증가 되지 않은 대조식물과 비교됨으로써 증가 되고, 말했던 대조식물보다 높은 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릭을 생산하는 형질전환 황색종 담배 식물에 관한 것이다.
또 다른 태양은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 여기에 설명된 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 인코딩된 단백질의 활성도는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 코드 된 단백질의 활성이 감소 되지 않은 대조식물과 비교됨으로써 감소 되고, 말했던 대조식물보다 낮은 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릭을 생산하는 형질전환 오리엔탈 담배 식물에 관한 것이다.
비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 여기에 설명된 형질전환 담배 식물은 수확될 수 있고, 이로부터 유도된 담배는 치료 또는 선택된 담배 형태로 알려진 방법을 사용하여 처리되고 경화될 수 있다. 잎 표면 화합물은 수집될 수 있고, 예를 들어 물 또는 유기용매 세척으로 사용되고, 그리고 실질적으로 고갈된다. 얻어진 분말은 흡연 물쿼리 풍미의 특성을 향상시키기 위해 이후에 사용될 수 있다. 세척 후 남아있는 담배 재료는, 확장된 담배의 예를 위한 물질로서 이후에 사용될 수 있다.
추가적 태양에서, 다음의 단계를 포함하는 식물의 적어도 한 부분에서 해충 저항성을 조절하기 위한 방법이 제공된다: (i) 바람직하기는, 이소프로필말레이트 합성효소가 폴리뉴클레오티드 서열 또는 여기에 기재된 폴리펩타이드 서열을 포함하는 식물에서, 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하는 단계; (ⅱ) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 (i)단계에서 얻어진 형질전환 식물의 최소한 한 부분에서 베타-메틸발레릴 수크로오스 에스테르의 양을 선택적으로 측정하는 단계; (ⅲ) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 그곳에 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴의 양이 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되지 않고, 바람직하기는, 말했던 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 외관이 대조식물로써 실질적으로 같은 대조식물에 비교하여 변한 형질전환 식물의 확인; (iv) 그곳에 해충 내성이 조절된 식물의 획득하는 단계를 포함한다.
적절하게는, 다음의 단계를 포함하는 식물의 적어도 한 부분에 해충 내성이 증가하기 위한 방법을 제공한다: (ⅰ) 바람직하기는, 이소프로필말레이트 합성효소가 여기에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩타이드 서열을 구성하는 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 증가하는 단계; (ⅱ) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 (i)단계에서 얻어진 형질전환 식물의 최소한 한 부분에서 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릴의 양을 선택적으로 측정하는 단계; (ⅲ) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 그곳에 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴의 양이 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 증가되지 않고, 바람직하기는, 말했던 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 외관이 대조식물로써 실질적으로 같은 대조식물에 비교하여 증가한 형질전환 식물의 확인하는 단계; (iv) 그곳에 해충 내성이 증가된 식물의 획득하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의해 획득된 또는 획득할 수 있는 식물 또는 식물 재료는 또한 제공되었다.
또 다른 태양은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 인코딩된 단백질의 활성도가 조절되고, 식물의 적어도 한 부분은 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되지 않는 대조식물과 비교된 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릴 구성의 변화를 가지고, 말했던 식물의 외관은 대조식물과 실질적으로 같으며, 그리고 해충 내성이 또한 조절되는 형질전환 식물에 관한 것이다.
적절하게는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 그곳에 코드 되는 단백질의 활성이 증가 되고, 식물의 적어도 일부가 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 증가되지 않은 대조식물과 비교된 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴의 조성의 변화를 가지며, 말했던 식물의 외관은 대조식물과 실질적으로 같으며, 해충 내성이 또한 증가되는 형질전환 식물은 제공된다.
식별, 선택, 또는 육종을 위한 유전자형 식물의 조성물, 방법 및 키트가 포함되고, 샘플에서 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법을 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 특히 이소프로필말레이트 합성효소의 적어도 일부를 증폭하는 것을 위해 하나 이상의 프라이머, 선택적으로 하나 이상의 프로브, 및 유전자 증폭 또는 검출을 수행하기 위한 선택적으로 하나 이상의 시약을 구성하는 것이 설명된다. 유전자 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드에 해당하는 10개 이상의 연속된 폴리뉴클레오티드에 대해 포함하는 프로브에 관한 것이다. 말했던 프라이머나 프로브가 구성하거나 또한 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 혼성체를 만드는 (예를 들어, 특히, 혼성체화, 예를 들면, 엄격한 혼성화 조건) 약 15, 20 , 25, 30, 40, 45 또는 50 이상의 연속된 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 포함 또는 교배 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브가 구성하거나 또는 유전자 식별 (예를 들면, 서던 혼성화) 또는 분리 (세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 현장 혼성화) 또는 유전자 검출 (예를 들어, 핵산 증폭 또는 검출에 하나 이상의 증폭 프라이머와 같은)의 연속적-의존적 방법에 사용되는 약 10에서 50의 연속된 뉴클레오티드, 약 10에서 40의 연속된 뉴클레오티드, 약 10에서 30의 연속된 뉴클레오티드 또는 약 15에서 30의 연속된 뉴클레오티드를 구성한다. 하나 이상의 특정 프라이머 또는 프로브가 지정될 수 있고, 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부를 증폭하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 특정 예로서, 두 프라이머는 예를 들어 DNA 또는 RNA와 같은 이소프로필말레이트 합성효소 핵산을 코딩하는 핵산 단편을 증폭시키기 위한 중합 효소 연쇄 반응 프로토콜에서 사용될 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응은 이소프로필말레이트 합성효소 핵산 서열에서 유래된 첫번째 프라이머 및 이소프로필말레이트 합성효소 프라이머 서열, 3 '말단 mRNA의 전구체, 벡터로부터 유래된 서열 등과 같은 이소프로필말레이트 합성효소 핵산 서열의 상류영역 또는 하류영역의 서열에 혼성체를 만드는 두번째 프라이머를 사용하는 것으로 또한 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 체외 증폭에 유용한 열 및 등온 기술의 예는 본 분야에서 잘 알려져 있다. 샘플은 여기에 설명된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 담배 식물로부터 유래되거나 될 수 있다.
따라서, 추가적 태양에서, 다음의 단계를 구성하는 샘플에서 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 탐지를 위한 방법이 또한 제공된다: (a) 폴리뉴클레오티드를 구성하거나 구성한다고 생각되는 샘플을 제공; (b) 특히 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 적어도 한 부분을 검침하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 하나 이상의 프로브를 가지는 샘플을 접촉; (c) 증폭 산물의 존재가 샘플에서 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 증폭 산물의 존재를 탐지. 또 다른 태양에서, 특히 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 적어도 한 부분을 검출하기 위해 하나 이상의 프라이머 또는 프로브의 사용이 또한 제공된다. 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 적어도 한 부분을 검출하기 위한 키트는, 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드의 적어도 한 부분을 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 프로브를 구성하는 것이 또한 제공된다. 키트는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위한 시약 - 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 - 또는 핵산 프로브 혼성화-검출 기술을 위한 시약 - 서던 블롯, 노던 블롯, in situ 혼성화, 또는 마이크로어레이와 같은 - 을 구성할 수 있다. 키트는 웨스턴 블롯, ELISA, SELDI 질량 분석 또는 테스트 스트립과 같은 항체 결합 검출 기술을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 핵산 서열을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 시약 및/또는 수크로오스 에스테르 함량에 대한 설명을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 설명된 하나 이상의 방법에 대한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 유전적 동일성 결정, 계통발생학적 연구, 유전자형, 단상형, 혈통 분석 또는 특히 공우성 방식을 가지는 식물 육종에서 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 식물, 식물 세포 또한 이소프로필말레이트 합성효소 폴리뉴클레오티드를 구성하는 식물 재료 유전형의 방법을 제공한다. 유전형은 염색체쌍의 특이적 상동체의 방법을 제공하고, 식물 개체군에서 다른 분리 개체에 사용될 수 있다. 분자 마커 방법은 작물 다양성 사이의 유전적 관계를 특성화하는 것, 교배 또는 체세포 혼성체의 동일성, 단일 유전자 특성에 영향을 받은 염색체 단편을 국소화하는 것, 지도기반 복제, 및 양적 유전을 위해 사용될 수 있다. 유전형의 특이적 방법은 증폭 단편 길이 다형성 (AFLPs)을 포함하는 많은 분자 마커 분석 기술 이용할 수 있다. AFLP는 뉴클레오티드 서열의 변화에 의해 야기된 증폭 단편 사이의 대립유전자 다형성의 생산이다. 따라서, 본 발명은 이 유전자 또는 AFLP 분석과 같은 기술을 사용하는 핵산에 유전적으로 연결된 염색체 서열뿐만 아니라, 이소프로필말레이트 합성효소 유전자 또는 핵산의 분리를 수행하기 위한 방법을 제공한다.
더 자세하게 발명을 기술하기 위하여 제공되는 하기 구현예가 더욱더 상세하게 기재되어있다. 발명을 수행하기 위해 고려되는 바람직한 방법이 명시되어 있는 이러한 예는, 발명을 설명하고, 제한하지 않기 위해서 의도된다.
실시예
실시예 1: 황색종의 힉스 브로드리프(HBL) 및 초기의 레드 러시안(RR)의 니코티니아 타바쿰 종에서의 수크로오스 에스테르 분석
담배에서 수크로오스 에스테르 합성을 연구하기 위해, 두 모델의 종이 선택된다: 황색종의 힉스 넓은잎(HBL) 및 초기의 레드 러시안(RR). 국립 유전자원 프로그램 (특성 자원 정보 네트워크 - (GRIN), 국립 특성 자원 연구소, 벨트스빌, 메릴랜드)으로부터 이용가능한 초기 데이터 목록은 이 두 계통 사이의 수크로오스 에스테르의 함량이 포함된 베타-메틸발레릭의 다른 함량을 제시한다.
수크로오스 에스테르에서 HBL 및 RR 잎 분비물의 조성물은 분석되었고, 그 결과물은 도1에 제시되었다. RR 수크로오스 에스테르 조성물은 HBL 수크로오스 에스테르 조성물과 다르다. HBL에서, 수크로오스 에스테르는 주로 RR에서 고 분자량 종- C2C16:0, C2C17:0, C2C18:0 와 같은- 의 존재가 관찰되는 C2C15으로 구성되어있다. 도2에 나타낸 바와 같이, RR 및 HBL 간의 차이는 분자 내의 메틸발레릴 에스테르의 존재 또는 부재에 의해 설명된다. 따라서 RR은 BMVSE종과 HBL bmvse종인 것이 결정된다.
실시예 2: 양적 특성 유전자 위치 분석
잎 분비물에서 수크로오스 에스테르의 조성물은 HBL과 RR 모체의 교배로부터 발생된 136회 번식된 F2 유전자형을 가지는 식물에서 각각 하향의 8 F3 식물의 136 개체군에서 분석된다. 양적 특성 유전자 위치 분석은 미부수체 표지자 및 수크로오스 에스테르 표현형을 포함하는 베타-메틸발레릴의 상관 관계를 수행한다. 데이터는 양적 특성 유전자 위치 칼토그래퍼를 사용하여 분석한다. 수크로오스 에스테르의 특성을 포함하는 베타-메틸발레릴은 담배 게놈에서 단일 유전자 위치 하나에 연결되어있다. 이 위치는 담배의 연쇄군 15 (염색체A)에 있다.
실시예 3: 유전자와 관련된 수크로오스 에스테르를 함유하는 베타-메틸발레릴의 확인
분비모에서 담배 엑손의 전사 수준은 도3에 설명된 기능을 위해 코딩한 모든 잠재적 유전자에서 우위의 유전자 표적을 선택하기 위해 연구되었다. 발현은 마이크로어레이를 사용한 수크로오스 에스테르 생산 프로파일을 함유하는 자신의 베타-메틸발레릴을 위해 선택된 여러 변종에서 연구되었다.
발현은 각 변종의 각 추출물 (R>0.95)에서 측정된 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릴의 측정된 양에 상관 관계가 있기 때문에, 그 결과는 엑손 프로브과 관련된 이소프로필말레이트 합성효소를 식별한다.
네 개의 담배 서열은 토마토 이소프로필말레이트 합성효소 IPMSA 및 IPMSB의 동족체가 코딩된 것이 확인된다. 그것은 MIPMS1A (SEQ ID NO: 10), NtlPMS1Bv1 (SEQ ID NO: 12), NtlPMS1Bv2 (SEQ ID NO: 14) 및 NUPMS2 (SEQ ID NO: 1)으로 명명되었다. EST 데이터베이스에 따라, SEQ ID NO:1은 그 발현의 대부분이 분비모에서 관찰될 수 있기 때문에 선택 후보이다.
BAC 라이브러리는 담배(니코티아나.타바쿰)로부터 구성된다. HBL은 PCR 미끼로써 NtlPMS2의 cDNA를 사용하고, PISOGE로 명명된 BAC를 확인하는 것에서 조사된다. BAC는 샷건 순서이다. 조립은 NtlPMS2와 관련한 서열을 포함하는 pisogel 및 pisoge2인 몇몇의 콘틱을 생성한다.
인트론-엑손 구조는 담배와 토마토로부터 이소프로필말레이트 합성효소에 보호되어있다. NtlPMS1BV1, NtlPMS1Bv2, SIIPMSB 및 SIIPMSA에서, 열두 개의 엑손으로 분리되는 유전자가 관찰된다. NtlPS2는 열두 개의 엑손으로 구성될 것으로 예상되지만, SIIPMSA 첫 번째 엑손이 pisogel에서 두 개의 엑손에 해당하기 때문에 NUPMS2는 열세 엑손이 포함되어 있는 것이 가정된다.
게놈 서열 예측의 신뢰성은 PCR에 의해 검사된다. 세계적으로 pisoge 조립으로부터 예측된 서열은 정제된 PISOGE의 BAC 또는 힉스 브로드리프 또는 레드 러시안 식물 중 하나로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 확인된다. NtlPMS2에 해당하는 하나의 전체 길이 유전자 구조는 식별된다. 또한, 구조 등 두 개의 다른 유전자는 보존되고, 위유전자 복제를 나타낼 가능성이 있다. PISOGE BAC에 의해 제시된 구조는 부분적으로 확인되지만, BAC 구조와 HBL 게놈 DNA 사이에 약간의 불일치가 관찰된다.
PCR은 NtlPMS2의 RR과 HBL 대립유전자를 구별할 수 있는 유전자 마커로 사용된다. IPMS2 마커는 양적 특성 유전자 위치 지도에 사용된 모든 F2 식물의 게놈 DNA에서 PCR 증폭에 사용된다. 수크로오스 에스테르 양적 특성 유전자 위치는 추가 마커로 재검토된다. 양적 특성 유전자 위치 피크는 특성과 마커 사이 관계의 확률이 최대인 위치를 식별한다. 핵산 단기 서열 마커 PT30172와 함께, IPMS2 마커는 수크로오스 에스테르의 특성을 포함하는 베타-메틸발레릴에 대한 효과의 확률이 가장 높은 마커이다.
실시예 4: 수크로오스 에스테르를 포함하는 베타-메틸발레릴의 합성에 중요한 요소로서의 NtlPMS2 활성에 대한 설명
NtlPMS2에 해당하는 발현 유전자 단편의 형태는 다음 형태의 분비모 EST 라이브러리에서 분리된다: GT09L09 (원산지: Galpao [TL 1068] 분비모) 및 OT05C20 (원산지: Orinocco [TI81] 분비모). 두 분자는 뉴클레오티드 서열이 동일하고, 더해서 OT05C20 cDNA는 발현 실험에서 사용된다. RNAi의 구조는 공통서열을 기반으로 한 NUPMS2의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론을 이용하여 생성된다. 두 구조는 CPS2p 프로모터(CPS2는 분비모에서만 일어나는 시스-아비에놀 합성이 포함된 코파릴 합성 2를 의미한다) 또는 MMVp 바이러스성 프로모터(MMV는 미라빌리스 모자이크 바이러스를 의미한다) 중 하나로 구성된 이원매개체에 전이된다. 각각의 이원매개체를 수행하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 AGL1를 사용하는 안정적 전환은 오리엔탈 담배 종 바스마 크산티 및 황색종 K326에서 수행된다.
잎은 개별적인 형질전환 특성정보로 인한 한 달 전에 재분화된 식물로부터 수집된다. 내부 표준(수크로오스 옥타아세테이트)가 생중량 2.5 ng/mg의 비율로 첨가된다. 각 수크로오스 에스테르에 특정한 이온에 대하여 기록된 신호의 면적은 측정되고, 내부 표준 면적의 비율로서 나타난다. 신호 반응은 분자에서 분자에 따라 달라서, 비교는 각각의 분자 사이에서 유효하다. 내부 표준 신호 면적의 비는 잎 생중량에서 신호의 표준화를 허용한다. 도2는 여기에 제시된 수크로오스 에스테르 명명법을 설명한다. 도 4 참고: (A) 모체 변종 K326 (황색종, N=3)의 잎 분비물 성분과 분비모 특이적 프로모터 하에서, NtlPMS2을 발현하는 형질전환체; (B) 모체 변종 K326의 잎 분비물 성분과 바이러스성 프로모터 하에서, NtlPMS2를 발현하는 형질전환체; (C) 모체의 바스마(오리엔탈, n=4)종의 잎 분비물 성분과 분비모 특이적 프로모터 하에서, NtlPMS2 - RNAi 구조를 발현하는 형질전환체; (D) 바스마 모체종의 잎 분비물 성분과 바이러스성 프로모터 하에 NtlPMS2 - RNAi 구조를 발현하는 형질전환체.
제시된 데이터는 NtlPMS2가 수크로오스 에스테르 생성물을 포함하는 베타-메틸발레르산의 주요 유전자임을 입증하기 위해 충분하다. 수크로오스 에스테르 종(오리엔탈)을 포함하는 베타-메틸발레르산의 IPMS2 억제는 수크로오스 에스테르(C 및 D 참고)를 포함하고, 더하여, IPMS2를 생합성 경로의 핵심 요소인 것을 증명하는 베타-메틸발레르산의 생성물을 줄이거나 또한 없앤다. RNA 간섭 구조의 구조적 및 분비모 특이적 발현은 베타-메틸발레르산을 포함할 수 있는 에스테르인 C2C16:0, C2C17:0, C2C18:0 수크로오스 에스테르의 축적의 손실이 발생한다.
bmvse종 (황색종)에서 NtlPMS2의 도입은 수크로오스 에스테르(A 및 B 참고)의 생산을 유도할 수 있다. 이것은 NtlPMS2 cDNA 발현만으로 수크로오스 에스테르의 생성물을 저장하는 것이 충분하다는 것을 증명한다. 여기에 NtlPMS2 cDNA의 구조적 및 분비모 특이적 발현은 베타-메틸발레르산을 포함할 수 있는 에스테르인 C2C16:0, C2C17:0, C2C18:0 수크로오스 에스테르의 새 축적이 일어난다. 흥미롭게도, cDNA (B)의 구조적 발현은, 분비모 특이적 발현이, 예를 들어, 수크로오스 에스테르 종을 포함하는 베타-메틸발레르산이 보존될 수 있는 것에 대해 전환할 수 있는 수치에 수크로오스 에스테르의 축적이 일어난 수크로오스 에스테르의 높은 축적이 일어나지 않았다.
실시예 5: 아연 집게 뉴클레아제 표적 부위의 선택을 위한 검색 프로토콜
이 실시예에서는, 유전자의 발현을 수정하기 위한 도구를 개발하기 위해서, 게놈 데이터베이스에 비교된 관련 유전자 서열 내에 독특한 표적 부위의 발생에 대한 검사를 위해 이소프로필말레이트 합성효소 유전자를 검색하는 방법을 설명한다. 표적 부위는, 본 발명, 서열 모티프, 및 본 발명에 포함되어진 담배와 같은 식물에서 해당하는 유전자 서열을 변경하는 사이트 또는 모티프의 사용 방법에 의해 확인한다.
검색 알고리즘. 컴퓨터 프로그램은 하나의 DNA 데이터베이스 내의 접미사 배열을 사용하여 주어진 간격 크기에 의해 분리된 두 개의 고정 길이 문자열의 DNA 모티프의 발생을 위해 입력 쿼리 (표적) 뉴클레오티드 서열을 검사하기 위해서 하나를 허용하는 것이 개발된다. 접미사 배열 구조 및 검색은, 버로우즈-휠러 변환된 문자열에 바로 문자열 입력을 변환하는 오픈 소스 libdivsufsort 라이브러리 2.0.0 (http://code.google.eom/p/libdivsufsort/)을 사용한다. 이 프로그램은 전체 입력 (표적) 뉴클레오티드 서열을 검사하고 선택한 DNA 데이터베이스에서 선택된 많은 시간보다 적게 발생하는 모든 문자열의 조합을 반환한다.
쿼리 (query) 서열의 아연 집게 뉴클레아제 매개 돌연변이 유발을 위한 표적 부위의 선택. 아연 집게 DNA 결합 도메인은 세 염기쌍 뉴클레오티드 서열을 인식한다. 아연 집게 뉴클레아제는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상의 아연 집게 DNA 결합 도메인, 및 비 특이적 뉴클레아제 IIS형 제한 효소를 포함하는 아연 집게 단백질을 구성한다. 아연 집게 뉴클레아제는 표적 서열에 침투하는 이중 가닥을 도입하는데 사용될 수 있다. 이중가닥 틈, 한 쌍의 아연 집게 뉴클레아제, 하나의 표적 서열의 상위 가닥의 결합 및 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 같은 표적 서열의 하위 가닥을 도입하기 위해 요구된다. 두 개의 고정 길이의 문자열 DNA 모티프 각각 3의 복수형을 사용함으로써, 프로그램은 관련 스페이서 길이에 의해 분리된 두 개의 아연 집게 단백질 표적 사이트를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
프로그램 입력:
1. 대상 쿼리 DNA 서열
2. 조사 대상의 DNA 데이터베이스
3. 첫 번째 문자열 DNA 모티프의 고정된 크기
4. 스페이서의 고정된 크기
5. 두 번째 문자열 DNA 모티프의 고정된 크기
6. 프로그램 입력 2의 선택된 DNA 데이터베이스에서 프로그램 입력 4에 의해 구분된 프로그램 입력 3 및 5의 조합의 발생의 임계 개수
프로그램 출력: 프로그램 입력 6 한계점의 최대를 갖는 DNA 데이터베이스에서 발생한 서열인 각 서열을 위한 뉴클레오티드 서열의 목록.
인용 또는 본 설명서에 언급된 출판물은 본 출원의 출원일 이전에 공개된 관련 정보를 제공한다. 여기 명세서는 발명자가 이러한 발명을 선행하기 위한 자격이 되지 않는 허용으로서 해석되지 않는다. 상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 여기에 참고로 인용된다. 발명의 다양한 변경 및 변형은 본 발명의 범위 및 의미에서 벗어나지 않고 본 분야에서 기술된 것으로 명백할 것이다. 발명이 특정한 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 이는 청구된 본 발명은 이러한 특정 구현예에 지나치게 제한되지 않도록 이해되어야한다. 실제로, 세포, 분자 및 식물 생물학 또는 관련 분야에서 기술된 것이 명백한 본 발명을 실시하기 위해 설명된 형태의 다양한 변형은 다음의 청구범위에 포함되는 것이다.
SEQUENCES
SEQ ID NO:1 (NtIPMS2 뉴클레오티드 서열)
Figure 112014031202074-pct00002
SEQ ID NO:2 (NtIPMS2 아미노산 서열)
Figure 112014031202074-pct00003
SEQ ID NO:3 (보완에 사용되는 NtIPMS2 cDNA 서열)
Figure 112014031202074-pct00004
SEQ ID NO:4 (Red Russian에 관찰되는 바와 같은 엑손 XI, XII 및 XIII을 커버하는 NtIPMS2 영역의 게놈 DNA 서열. cDNA 일치 영역은 밑줄표시된다. 볼드체는 Red Russian 과 Hicks Broadleaf DNA 서열사이에 보존된 DNA 영역을 나타낸다)
Figure 112014031202074-pct00005
SEQ ID NO:5 (Hicks Broadleaf에 관찰된 바와 같은 엑손 XI를 커버하는 NtIPMS2 영역의 게놈 DNA 서열. cDNA 일치 영역은 밑줄표시된다. 볼드체는 Red Russian과 Hicks Broadleaf DNA 서열 사이의 보존된 DNA 영역을 나타낸다.)
Figure 112014031202074-pct00006
SEQ ID NO:6 (BAC 콘티그 서열에 해당하는 NtIPMS2 (총 BAC 길이는 76832bp이다. 14232bp만이 나타난다)
Figure 112014031202074-pct00007
Figure 112014031202074-pct00008
Figure 112014031202074-pct00009
Figure 112014031202074-pct00010
SEQ ID NO:7 (BAC 콘티그 서열에 해당하는 NtIPMS2 (총 BAC 길이는 10082bp))
Figure 112014031202074-pct00011
Figure 112014031202074-pct00012
Figure 112014031202074-pct00013
SEQ ID NO:8 (분비모 특이 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터 서열. 프로모터는 니코티아나 타바쿰으로부터 분리되었고 시스-아비에놀의 합성에 관여하는 코파릴-합성효소를 인코딩하는 유전자의 1.5kb 상류에 위치한다.)
Figure 112014031202074-pct00014
SEQ ID NO:9 (RNAi 메커니즘을 통해서 NtIPMS2 유전자 발현의 억제를 유발하기 위해서 사용되는 합성 구조체. 첫번째 엑손과 NtIPMS2 첫번째 인트론의 단편으로 구성되는, 첫번째 인트론의 단편은 엑손 후에 반대로 반복된다. 이러한 구조체의 번역 및 접합은 이론적으로 헤어핀 구조에서의 이중 가닥 RNA를 유발한다.)
Figure 112014031202074-pct00015
볼드체 및 밑줄: 엑손 1,21-229
볼드체: 접합 보더 (border)
이탤릭체: 접합 위치
이텔릭체 및 밑줄: 인트론 1
SEQ ID NO:10 (NtIPMS1A 뉴클레오티드 서열)
Figure 112014031202074-pct00016
SEQ ID NO:11 (NtIPMS1A 아미노산 서열)
Figure 112014031202074-pct00017
SEQ ID NO:12 (NtIPMS1Bv1 뉴클레오티드 서열)
Figure 112014031202074-pct00018
SEQ ID NO:13 (NtIPMS1Bv1 아미노산 서열)
Figure 112014031202074-pct00019
SEQ ID NO:14 (NtIPMS1Bv2 핵산 서열)
Figure 112014031202074-pct00020
SEQ ID NO:15 (NtIPMS1Bv2 아미노산 서열)
Figure 112014031202074-pct00021
Figure 112014031202074-pct00022
Figure 112014031202074-pct00023

Figure 112014031202074-pct00024

Figure 112014031202074-pct00025

Figure 112014031202074-pct00026
Figure 112014031202074-pct00027
Figure 112014031202074-pct00028
SEQUENCE LISTING <110> Philip Morris Products S.A. <120> Isopropylmalate Synthase from Nicotiana Tabacum and Methods and Uses Thereof <130> 307486-20846 <140> PCT/EP2012/003662 <141> 2011-09-02 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1809 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 atggcttctc tctctgtaaa ttctataatt tccctgagca cttccctttc attacattct 60 aaaaacccac ttattcacag tgtcttcagt ttcacgcctt caaccacaag gcattcagct 120 atatgctgct caaatattcg tcggcggccg gagtataaac atggaaaatt ctctgaccct 180 gattatgttg gtatttttga caccagtctt cgcgatggcg aacaggccgc tggtgctacc 240 atgactagta aagaaaaact ggacattgca cgtcagttgg ctaagcttgg tgttgatgtt 300 attgaggccg gttttccttt tgcctctgaa gctgagttcg agcttgtaaa gttgatagca 360 caggaaattg gtaataacgt agacaaagaa ggatacgtgc cgatgatatg tgccttagct 420 aggtctagta agaaggatat tgaaagagct tgggatgctt taaagtatgc aaagaaacca 480 atgcttcata tgtttattgc gacgagtgat atacatatga agtacaagtt aaagatgagt 540 agagaagaaa ttgtggagac agctaggagt acggtggctt atgcaaaaac cctatttgag 600 gatgttcggt ttagcgctga agatgctgca agatctgata gggagttcct ttatcatatt 660 attggagaag ttatcaaagc tggtgcaaca gtgattggcc tccctgatac agttggatgc 720 aatttgccca gtgaatatgc acaactgatt tctgatataa aagccaatac cccaggaata 780 caagatgcaa acatttcaac acactgtcac aacgatcttg ggcttgctac tgccaactcc 840 ttagctggaa tttgcgcagg cgcaagacta gtagatgtta ccatcaatgg aattggtgaa 900 agagctggaa atgcttctct ggaggagatt gtaatggcct taaaatatcg tggagagcaa 960 gtactaggtg gtatctatac tgggattaat acaaagcata tattcatgac gagcaaaatg 1020 gtagaagagt acagtgggct taagctgcag ccacataagg ccattgttgg agctaatgca 1080 ttttctcatg agagtggcat ccatcaggat ggagtgttaa agaacagaga tacatatgag 1140 tttgtatctc atgaagatgt tgggtatcgt cgtgctaatg aaaacggtat tagtctggga 1200 aagctcagtg gccgccatgc attgaaagcc aaaatggctg agcttggata tgactttgat 1260 ggaaaagaac ttgatgacct ctttcgtcga ttcaagtcac tagctgagag gaaaaagaaa 1320 attacagatg atgacttgag agcacttgta tcagatgacg ttttccagcc tcaagtttcc 1380 tggcaacttg gagatgtaca gattacttgt ggaaatgttg gccgctctac agcaaatgtt 1440 aagcttattg acagcgatgg tcaagagcac actgcctttt ctgttggaac aggacctgtt 1500 gatgcagctt acaaggcagt tgacctcatt gtaaaggtac ctgtaacact cgttgaatat 1560 tcggttaatg caatcacaaa acgtataaat tccacagctt caaccagagt gttagttcgt 1620 gggaatgatg actatgcatc gtttaatact tcaaacgggc aaactgttaa tcgtacagtt 1680 agtggaacag gagcgcatat ggacattgtc gtttcaagtg tccaagccta tgttgaggcg 1740 ttgaacaaaa tattcagtta caaaaaaaca ggtctcgtga acaaatttga aggcagtgcg 1800 caatcgtaa 1809 <210> 2 <211> 602 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Ala Ser Leu Ser Val Asn Ser Ile Ile Ser Leu Ser Thr Ser Leu 1 5 10 15 Ser Leu His Ser Lys Asn Pro Leu Ile His Ser Val Phe Ser Phe Thr 20 25 30 Pro Ser Thr Thr Arg His Ser Ala Ile Cys Cys Ser Asn Ile Arg Arg 35 40 45 Arg Pro Glu Tyr Lys His Gly Lys Phe Ser Asp Pro Asp Tyr Val Gly 50 55 60 Ile Phe Asp Thr Ser Leu Arg Asp Gly Glu Gln Ala Ala Gly Ala Thr 65 70 75 80 Met Thr Ser Lys Glu Lys Leu Asp Ile Ala Arg Gln Leu Ala Lys Leu 85 90 95 Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Phe Pro Phe Ala Ser Glu Ala Glu 100 105 110 Phe Glu Leu Val Lys Leu Ile Ala Gln Glu Ile Gly Asn Asn Val Asp 115 120 125 Lys Glu Gly Tyr Val Pro Met Ile Cys Ala Leu Ala Arg Ser Ser Lys 130 135 140 Lys Asp Ile Glu Arg Ala Trp Asp Ala Leu Lys Tyr Ala Lys Lys Pro 145 150 155 160 Met Leu His Met Phe Ile Ala Thr Ser Asp Ile His Met Lys Tyr Lys 165 170 175 Leu Lys Met Ser Arg Glu Glu Ile Val Glu Thr Ala Arg Ser Thr Val 180 185 190 Ala Tyr Ala Lys Thr Leu Phe Glu Asp Val Arg Phe Ser Ala Glu Asp 195 200 205 Ala Ala Arg Ser Asp Arg Glu Phe Leu Tyr His Ile Ile Gly Glu Val 210 215 220 Ile Lys Ala Gly Ala Thr Val Ile Gly Leu Pro Asp Thr Val Gly Cys 225 230 235 240 Asn Leu Pro Ser Glu Tyr Ala Gln Leu Ile Ser Asp Ile Lys Ala Asn 245 250 255 Thr Pro Gly Ile Gln Asp Ala Asn Ile Ser Thr His Cys His Asn Asp 260 265 270 Leu Gly Leu Ala Thr Ala Asn Ser Leu Ala Gly Ile Cys Ala Gly Ala 275 280 285 Arg Leu Val Asp Val Thr Ile Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn 290 295 300 Ala Ser Leu Glu Glu Ile Val Met Ala Leu Lys Tyr Arg Gly Glu Gln 305 310 315 320 Val Leu Gly Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Asn Thr Lys His Ile Phe Met 325 330 335 Thr Ser Lys Met Val Glu Glu Tyr Ser Gly Leu Lys Leu Gln Pro His 340 345 350 Lys Ala Ile Val Gly Ala Asn Ala Phe Ser His Glu Ser Gly Ile His 355 360 365 Gln Asp Gly Val Leu Lys Asn Arg Asp Thr Tyr Glu Phe Val Ser His 370 375 380 Glu Asp Val Gly Tyr Arg Arg Ala Asn Glu Asn Gly Ile Ser Leu Gly 385 390 395 400 Lys Leu Ser Gly Arg His Ala Leu Lys Ala Lys Met Ala Glu Leu Gly 405 410 415 Tyr Asp Phe Asp Gly Lys Glu Leu Asp Asp Leu Phe Arg Arg Phe Lys 420 425 430 Ser Leu Ala Glu Arg Lys Lys Lys Ile Thr Asp Asp Asp Leu Arg Ala 435 440 445 Leu Val Ser Asp Asp Val Phe Gln Pro Gln Val Ser Trp Gln Leu Gly 450 455 460 Asp Val Gln Ile Thr Cys Gly Asn Val Gly Arg Ser Thr Ala Asn Val 465 470 475 480 Lys Leu Ile Asp Ser Asp Gly Gln Glu His Thr Ala Phe Ser Val Gly 485 490 495 Thr Gly Pro Val Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Val Asp Leu Ile Val Lys 500 505 510 Val Pro Val Thr Leu Val Glu Tyr Ser Val Asn Ala Ile Thr Lys Arg 515 520 525 Ile Asn Ser Thr Ala Ser Thr Arg Val Leu Val Arg Gly Asn Asp Asp 530 535 540 Tyr Ala Ser Phe Asn Thr Ser Asn Gly Gln Thr Val Asn Arg Thr Val 545 550 555 560 Ser Gly Thr Gly Ala His Met Asp Ile Val Val Ser Ser Val Gln Ala 565 570 575 Tyr Val Glu Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ser Tyr Lys Lys Thr Gly Leu 580 585 590 Val Asn Lys Phe Glu Gly Ser Ala Gln Ser 595 600 <210> 3 <211> 2036 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 3 ctcttttctt agggaaaaga ataatggctt ctctctctgt aaattctata atttccctga 60 gcacttccct ttcattacat tctaaaaacc cacttattca cagtgtcttc agtttcacgc 120 cttcaaccac aaggcattca gctatatgct gctcaaatat tcgtcggcgg ccggagtata 180 aacatggaaa attctctgac cctgattatg ttggtatttt tgacaccagt cttcgcgatg 240 gcgaacaggc cgctggtgct accatgacta gtaaagaaaa actggacatt gcacgtcagt 300 tggctaagct tggtgttgat gttattgagg ccggttttcc ttttgcctct gaagctgagt 360 tcgagcttgt aaagttgata gcacaggaaa ttggtaataa cgtagacaaa gaaggatacg 420 tgccgatgat atgtgcctta gctaggtcta gtaagaagga tattgaaaga gcttgggatg 480 ctttaaagta tgcaaagaaa ccaatgcttc atatgtttat tgcgacgagt gatatacata 540 tgaagtacaa gttaaagatg agtagagaag aaattgtgga gacagctagg agtacggtgg 600 cttatgcaaa aaccctattt gaggatgttc ggtttagcgc tgaagatgct gcaagatctg 660 atagggagtt cctttatcat attattggag aagttatcaa agctggtgca acagtgattg 720 gcctccctga tacagttgga tgcaatttgc ccagtgaata tgcacaactg atttctgata 780 taaaagccaa taccccagga atacaagatg caaacatttc aacacactgt cacaacgatc 840 ttgggcttgc tactgccaac tccttagctg gaatttgcgc aggcgcaaga ctagtagatg 900 ttaccatcaa tggaattggt gaaagagctg gaaatgcttc tctggaggag attgtaatgg 960 ccttaaaata tcgtggagag caagtactag gtggtatcta tactgggatt aatacaaagc 1020 atatattcat gacgagcaaa atggtagaag agtacagtgg gcttaagctg cagccacata 1080 aggccattgt tggagctaat gcattttctc atgagagtgg catccatcag gatggagtgt 1140 taaagaacag agatacatat gagtttgtat ctcatgaaga tgttgggtat cgtcgtgcta 1200 atgaaaacgg tattagtctg ggaaagctca gtggccgcca tgcattgaaa gccaaaatgg 1260 ctgagcttgg atatgacttt gatggaaaag aacttgatga cctctttcgt cgattcaagt 1320 cactagctga gaggaaaaag aaaattacag atgatgactt gagagcactt gtatcagatg 1380 acgttttcca gcctcaagtt tcctggcaac ttggagatgt acagattact tgtggaaatg 1440 ttggccgctc tacagcaaat gttaagctta ttgacagcga tggtcaagag cacactgcct 1500 tttctgttgg aacaggacct gttgatgcag cttacaaggc agttgacctc attgtaaagg 1560 tacctgtaac actcgttgaa tattcggtta atgcaatcac aaaacgtata aattccacag 1620 cttcaaccag agtgttagtt cgtgggaatg atgactatgc atcgtttaat acttcaaacg 1680 ggcaaactgt taatcgtaca gttagtggaa caggagcgca tatggacatt gtcgtttcaa 1740 gtgtccaagc ctatgttgag gcgttgaaca aaatattcag ttacaaaaaa acaggtctcg 1800 tgaacaaatt tgaaggcagt gcgcaatcgt aaaagtgatg gtgtgtgctc cagaaacaaa 1860 agcttaaatg ctgcttagtg ctcgatgatc ataaatttat gctctattca tgcatgcatt 1920 actgaagtta attaagaagt aatcttaatt gtataagatg taaacatgtt tctattcatg 1980 cattactatg aaattaatta caatttctga gccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2036 <210> 4 <211> 1585 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> misc_feature <222> (1520)..(1520) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1575)..(1575) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1577)..(1578) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1582)..(1582) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 agcaagatgt caagaagcac acttgccttt tcctgttgga acaggacctg ttgatgcagc 60 ttacaaggca gttgacctca ttgtaaaggt ttataatgaa actgaaaact ctcataatgt 120 ttgtatcttg tcacactagt aggataggta atttaggttt tatatacgct gaaggtataa 180 aaatatttac tcaatcagag cgcttacaag acaattgcag gtaactctat gagtagctta 240 gactaaaaga taaacgtagt aatttcaatg taaatagttt aggagacatg cgaatctttc 300 cttgacaaag aaactaaaaa acttgcgaag cacgcacctc aatcaccccg tctgtgtgaa 360 ttgaacgaac ttaaaagtac aaccagctta aactgatttt ttacctattt tttagtgttc 420 agacggatct gcagcaacca tgatttgatt caccggtcga caaatatcct caccgtgcat 480 tcgaactccc tttctccaca tcctaaaaat cctcttctaa gatgtctttg tttgcaaact 540 ctagccgtca tatcttggtg gaaaacatgt ctcttctaat atgtgtattt atatgttata 600 aatagtattt aggagaatgg caagttaaca gactaattaa cacctattat gaatggatcc 660 aaccgaatag aaatattcca acatttagct aagtaagctg ccaagtcaaa taagactgat 720 agagtaaaaa ctctttcata tagcaatgaa tataacctaa atcctttagt tactgctagc 780 aattttgtag gtataattgc tttgtttggt aaaaacatct atgtaacttt tgttttataa 840 gtaatgttct ttgtcattat gcaggtacct gtaacactcg ttgaatattc ggttaatgca 900 atcacaaaac gtataaattc cacagcttca accagagtgt tagttcgtgg gaatgatgac 960 tatgcatccg tttaatactt caaacgggca aactgttaat cgtacagtta ggtatgaaat 1020 atacatgaag tactgtttcc ctttaattta tccttatttc ccttaataat attctttcat 1080 gcataatgtg ggaacatgaa gatgacagag aagaattaaa acgatttttt cctaaaggag 1140 aaaataatat gtgataggaa tgaaatgttg tcagttttat atagttctca aattttatgg 1200 tactacgggt atctagagcc aacctgagaa tagaaagtat catataagaa atatacacag 1260 cagttagata gagtacattt ttaattattt aattatattt atgcatgcct caacacgttt 1320 actcacctct tagcctaatt tttgttacat gggatcgttc tacattttga gtagctgaga 1380 gatttgaact taggaccttt attttctcta acactatgtt atattgccag tggaacagga 1440 gcgcatatgg acattgtcgt ttcaagtgtc caagcctatg ttgaggcgtt gaacaaaata 1500 ttcagttaca aaaaaacagn tctcgtgaac aaatttgaag gcagtgcgca atcgtaaaag 1560 tgatggtgtg tgctncnnct anaag 1585 <210> 5 <211> 551 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> misc_feature <222> (541)..(541) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 gtcaagagca cactgccttt tctgttggaa caggacctgt tgatgcagct tacaaggcag 60 ttgacctcat tgtaaaggtt tataatgaaa ctgaaaactc tcataatgtt tgtatcttgt 120 cacactagta ggataggtaa tttaagtttt atatacgctg aaggtataaa aatatttact 180 caatcagagc gcttacaaga caattgcagg taactctatg agtagcttag actaaaagtt 240 ttaattattt aattatattt atgcatgcct caacacgttt actcacctct tagcctaatt 300 tttgttacat gggatcgttc tacattttga gtagctgaga gatttgaact taggaccttt 360 attttctcta acactatgtt atattgccag tggaacagga gcgcatatgg acattgtcgt 420 ttcaagtgtc caagcctatg ttgaggcgtt gaacaaaata ttcagttaca aaaaaacagg 480 tctcgtgaac aaatttgaag gcagtgcgca atcgtaaaag tgatggtgtg tgctatctgc 540 naaaaactcg a 551 <210> 6 <211> 14232 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..14232 <223> /note="Description of artificial sequence: NtIPMS2 corresponding BAC contig sequence (total BAC length is 76832bp. Only 14232bp are shown)" <400> 6 tgatgatttc tcattataat tgtaactagt ggtggcaaaa tggtaaaaag aaaacagtta 60 tccatccata ttattcatta aaaaatgggt tgtataatga actttttaaa aaaggatcaa 120 ttatggataa gaaccatatt atccgcttag aaaatggata accaataagt taacttctac 180 acttgtaaag cttcaaattg ggggttcctc aagtttgtga gaagaagaat tctcccaaag 240 tgatcatatt caagaagtct tggataaatg aatatccata ttatccgccg attatctcgt 300 tttaatccgt attaaatatg agtcggttcg aataatttat ctgtttttgt attatctact 360 ttggacatgt ccatacccga cccgaccccg ctcgtttgtc acccctagtt gtaacatata 420 ctgtttgctt acctaacggg ttgagttaag taccatcacg acttggtggg attttggctc 480 ttacaaaact acaattgagc ctgattataa tattttatta taaaattgag gttcggtata 540 atttattttg ctgatcaaat cttggtgatt caaagttcaa ctgaaatatg caatactaaa 600 ttattttctt atttaataaa ttttatgatg agctaatatt tataatttga ataaaaaaaa 660 attcataata ctagtatttt tgagttgaat agaaattgtc agtacagttg aatataacaa 720 ctgtaattat tcataaaata ttttagtttg atataataat aatctttcaa aaaacattct 780 tacagaactt gactgaaacc ataataaagt atctcactac ttttgtgcga caaggtttct 840 tcctaaatga gatcaacaat cattctttta aggattttta tttttatttt tatcacaaat 900 atattactca atatctaagt aatctttaaa aatctgtata ctcattacta taaagcatac 960 atgcaaaacg cgtacaataa aaactaattt ttaaaaaata gggggaagga gaagggatga 1020 acagaaccct cattaataaa gcaaaaattt aaatatccaa caaattgaac tgttaagatt 1080 ataaaaaaaa agaaaaaaga acttcattgt cgaagtaagt caaagtatca ctagccgtaa 1140 aaatttcggc accttttaaa agaatgataa atatactagg gaaagcctaa aacctcttgg 1200 tattaataac tatagtttag aaattaggca aagccgctac tagggtagtt aattattggt 1260 tctgtttata tttatatcat tcgttttgtt gataatgatg agcaacgttc cattacatga 1320 agaaaccacg tcaatgttta ttccctcatt cgttttctaa atttattcga gatgtgagta 1380 aacctccccc cacccccaca cacccccttt tttttttgct gttaaagttt cgacaataag 1440 aacgttcaga gtttcttgaa cttctgtttt atctgcagaa attataaatt ggagtcaacc 1500 actgcatccc aaattgatgc agactttatc tgaataatta atcagtatat aattataata 1560 tctattttct atgtttctaa tttatgtgac acatttctta tccgttagtt taaaaaaaat 1620 gataaattta tatatttcag aataatttaa ctttaaattt ttttatttta tccattttac 1680 ctttaatgag aaacttttgt aaccatacaa atgttataga atatatttag aacaacaagt 1740 ttcaaatatt ttatagtcac ataaatttaa cacacaaata ttagagcaaa tttcaaacta 1800 cttcacataa attgaaacag agggaaaaat aatactccct ccgttccctt ttacttggca 1860 cgttttgact ttttacgccc cttaagaaat aataaatgaa gtgcataatt taccatgata 1920 cccatattaa ttgatgtata ttttattgga tttgaaaaat gatttgaaat gagtaataaa 1980 tatcgtgggt ataacaaaaa aaaaattatc ttctcttgat atgcgtaaag tgacaagcaa 2040 aaatgaaaat ctatttttag tatacatgcc aaataaaagt gaacggtaaa aatgaacgga 2100 gggagtatat attattacta ctaaaacggg aaactgggca tgctaagttt ttcattgcta 2160 tttcaagttc cgattaatag ccataatata atgttttcta gaaacaaaga acaacgccaa 2220 gataaatttt cccaaaaagt agcacaaatg taacaaattc ttacctcaaa ttttaatcta 2280 aacacataaa ttttctttat aattgtttct taaaaactta aactaaattc aaatgccaac 2340 aagtttaaat gagcaaggaa gtattttcag tttctatttc ttgaatttaa taagaatgga 2400 aatattttcc gtttgtttac tgggttctgt ctagtctagc ttaagacgaa aattgtcttg 2460 ttttaagttt tacaaaccgt aaggggtggt aattcaattt tcaattgtag tatgagcaat 2520 taattccaac acaaaatctc acgtgaaata atatactcta gtgtttgttt ggcgtacgaa 2580 aaagaaagtc tacataatta atgcagcgtt ccatagttga tattaaaata atacccgtaa 2640 taaattatat aaaactttat gtgttattct tttgataaaa cagcaaccag acacaccagg 2700 ggctactttg gtcattttct ctccaataaa aacccttgtt tcaccagctt tgtaggtgtt 2760 cgaattcacc aaagcgaaca ttccattaac tccgatccac tctcttttct tagggaaaag 2820 aataatggct tctctctctg taaattctat aatttccctg agcacttccc tttcattaca 2880 ttctaaaaac ccacttattc acagtgtctt cagtttcacg ccttcaacca caaggcattc 2940 agctatatgc tgctcaaata ttcgtcggcg gccggagtat aaacatggaa aattctctga 3000 ccctgattat gttggtattt ttgacaccag tcttcgcgat ggcgaacagg ccgctggtgc 3060 taccatgact agtaaagaaa aactggacat tgcacgtcag ttggctaagc ttggtgttga 3120 tgttattgag gccggttttc cttttgcctc tgaagctgag ttcgagcttg taaagttgat 3180 agcacaggaa attggtaacc tttaatgttt aaccgttcac atttctaata tttacttatt 3240 tgtaacatgt cgtcacgtgt tagtttcatt ctttttatga accaaacatg catgcaaaga 3300 tatttttaga tatttggacg gcgagtgaga tttgaaacta ggaccgtttg cctgatacaa 3360 tattaaaata tgtaaccatt ttatgtacaa gtttaaactg ttgatagtag catatttttt 3420 acttttattt aagtatacta tattccaaca ggtaataacg tagacaaaga aggatacgtg 3480 ccgatgatat gtgccttagc taggtctagt aagaaggata ttgaaagagc ttgggatgct 3540 ttaaagtatg caaagaaacc aatgcttcat agtaagaaaa tatttcaaga tcgaattagg 3600 tcaaaagtgt aatcgtaaaa agtaaaagag agaatctaaa ggtacttatt tgttctggtc 3660 ttttcttttt ttaatataag cggccttgag attataggag gtttgatata gacctctacc 3720 atgtaaattc ttatttattt gctttttgtt tagcttttaa ccttttccct gtactgaaat 3780 agattgtaat ggccttaaaa tatcgtggag agcaagtact aggtggtatc tatactggga 3840 ttaatacaaa gcatatattc atgacgagca aaatggtact ctcatcttaa tcttctagtt 3900 agagatatat tttaccagtt ttaaagctgc ttaatttttt gtgcctttct gttgacacaa 3960 ttgttgctat gtaggtagaa gagtacagtg ggcttaagct gcagccacat aaggccattg 4020 tcggagctaa tgcattttct catgagagtg gcatccatca ggttttgcgt tatttttctc 4080 taaaagtttt acttctacat acactagatt tgttgaaaga ttactgaatt ggcgaccttc 4140 tacactaggt taaattgcaa taaacatttc ataccactac cggttgatat aaaataaatc 4200 ctttctcgtt aagataagat gggtaaaatg aagaattcaa agttgaatta ttttcaatta 4260 tagaaatgta tcattctttt tgtaacagac taataaggaa attgtgtcat ctaaataaca 4320 catgaagtat ttggattcag cccattgccc cttcctcttt cattatcgcc ttaatcagga 4380 ttctctactt ccatagtatc attcagtttt cattcttcct ttttaaattt tttttaatgt 4440 ggtttaggat ggagtgttaa agaacagaga tacatatgaa tttgtatctc ttgaagatgt 4500 tgggtatcgt cgtgctaatg aaaacggtat tagtctggga aagctcaggt atgatttgat 4560 tttcagagtg atcgatttgt tatgttgatg gtttgataga gattattgtt tcaaattctt 4620 tggtctttcc cccatatttt tggatgagtc aaaataattc gactaatata tagtcctacc 4680 aatttggtgt caacatatgt acgaattgaa tatagtcatc aatcaactat gtccaactat 4740 ccatactgta aggtatactc cctttacatt aaaaaataca agtgaactga aaaaaaaaag 4800 acatttttta attaaagtgt gctatctcta accgtttaaa tttttagatt agattatcat 4860 acagttcaaa cactttaaaa ctcgtactat cccctagaat ttcagtacct ccgttgtatt 4920 gaatcaaccc caacccttca tttttctcat ttacattagg cacattgatg tacctctttc 4980 ctttaaggaa tacattttgt aacatggtag aatattttgt gcagtggccg ccatgcattg 5040 aaagccaaaa tggctgaggt aagatacata atctatagta cgatatacta caaatattat 5100 agtatatgga aatggatcaa atcattttat ttttgttaca gcttggatat gactttgatg 5160 gaaaagaact tgatgacctc tttcgtcgat tcaagtcact ggctgagagg aaaaaggtga 5220 ttacgttgct gatatttcat agtgcaacag tcaaatttgt gatcgcacct tttcgttcct 5280 agtgtttgtc catatttttt gagttaattt caaatatgat cactaatttc tactataaca 5340 ataaaattta aattttttta ttcgcattaa agtgactgaa ctaacaatta aaaatatttg 5400 aaaaatatat gaaaaattac ggccaaagaa aaactctttt gactctcgac atccgagcat 5460 caccacatag taataaatga gaaaattatt ttttatcaaa ttaaagtaac tgaattttac 5520 ttattattca taataaaaga aaatcactaa actatacgca ctatagtggc aaaacctatc 5580 catattcaag gtgactttaa gtaccggtct agtaggtaga tttttgtgat tttactgtta 5640 tagtggataa aattaaagtc actttttttg ataaattgga agaatagcct gacagacatc 5700 tcacttattc ggctttgaca tcccggtccc cctactccat ataatttcaa ccaaacactt 5760 aaacttgtat aaaacattag tcttaaacac ctctgatact gtgtgtgttg ttcactcgtg 5820 ctgatataaa ggacacatca gatccacctc agatatatta atgccacatc attatctatt 5880 tttacaaaaa atatttttta ataaaaatat caaactcatc cctttcttct ccaaaaaaaa 5940 aaacaaacct tattcctctc tccaccattc catctctgcc tcttccaccc gtcaccgcca 6000 ctaccaaaca ctgcaccctt cctcttccat gagaaaacac tcaatcaaac ctacttcatc 6060 ttttattttt gtcctaaact tctccattac tacaatctat tcaaccaccc atggtagtct 6120 tgttgccacc atcgccagca accactccaa aaccaccact atatctcctc ttctcttcat 6180 attcatgtca ctctttcaaa acctagacat tgaacgagtt taataaaatc tatccttaaa 6240 ttttctttct agccaaatac ccaaagcaaa accaaaaaaa ttgaaaaaga aagagaagaa 6300 atttttactc aaaattctta ttgacccctc cagcaacgat aaaatttata aaactaacaa 6360 aatcaagctt cggcgttttc aacaaccgat gacgatccaa tttctggctt aaacactatt 6420 ttcaagcttc aatgtctctt aattctccgg cgtcttcatt gtcttcttca gttattttga 6480 gaaaaacaaa aattaaataa ctttgttcct tgactagctg ctctgctaaa ctctattagt 6540 ttggtcttgt tatactgctt ctttttttat ttttatcata gtccagttga ttgctaaaat 6600 tgtaagagaa ataatgtaat gctgtttgag aaaactctac ttgagaaaca aaaatttaat 6660 atagagggtg tggagcgtgt caatttcaat ggcgttttta agagatttgg gggtaagaag 6720 aagcggctgg gatagagagg ggcgagataa tggctagcat tgtttttaat ttttttttct 6780 tttcattttt ctcttttatt attttctaat caaattttgt atagttactc gcttttagga 6840 gcgtgcaatc acttattttg tttgactcac aaaacaaagg ctacataagt ttggtcaatg 6900 gttagatgag tttaaaacta atgtcttata caagttcaag tgcctgattg aaactatgtg 6960 gagtagggtg atcggaatgt caaagccgaa taagtcgagg cagtggcgaa gccaagaaat 7020 tcaacaaggg tattcaaacc tttgccagtg ggctatgtaa gggtgttcaa agcctatttt 7080 taatcaataa caagtaatat tttaccttat acggagtata attttctggc gaagggtagt 7140 cagttgacca cccttgattg cacgtagctt cgcccctgag tcgaggtgtc tcttaggcta 7200 aaatagcgtg ataaatttta taataaaatt tattttatat gagtaaagtt aataaaattt 7260 attttatatg agtaaagtta agtaaattat aatacttaaa gaaaattgaa agcttacata 7320 tgcagaggtc cggtcctcga cccacttatc ttgatccccc tctttcttct tcttcacaat 7380 atgcgtctcc ttgaatagct catcatgact cattggacgc ccatacttct tttcctgaaa 7440 ataaattaat ttagttaata aataaaatag atatacttag aaaagtaaaa taatttaagc 7500 aattacgtac caatcttctt tttattgtcc ctaggctgat cgcacctcta gtgtgcaagg 7560 agcctccctt ctcggatgcg cgagctttct ttcctttttc gctcctctct aagaactttg 7620 cggtaagcca ttgcctttgc aaatcattcc acaaattctc aagtaaccag ccaggcctct 7680 tgttcttctt tctagcatcc gagaaagcat ccgccaatct cttactagct ttgtgatgaa 7740 aatttgcagc cacttccgcg ctatagcggt ctttccatac acacttgctc tgtattttaa 7800 aatttaatta ttagatggaa acatcataaa tataaattat taaactgttt aaaaaaatat 7860 ttatacctta aattgattga aaatttgctc tttcagtgag aatggacaat cagtccaagt 7920 cgtataaggg ccatcataaa gctttctgat ggcattagtg attatcttcg tagtcttatt 7980 acccggcctg aacctacaat ttaataataa aaacacatta atatcttagt aaaaatgtta 8040 caaatcaata gacggaaaaa taatgaataa cacttaccca tcacccttag ggactatgat 8100 gatcctgcca tatcgatcat aatgcactac ctcgtcatca ctattcgaag catgtgtatc 8160 agaggcatgt gaagacggtg taggcgggtc agagctactg cctcgtaggc gaaggcctgc 8220 aatagatgga gtcgataatg aagatggttg tgatccctgt gactacaaca tagctggatg 8280 tgacccaagt ggatgtgata atgctggctg tgacccgagt ggctgtgaca tggatggatg 8340 cgatccatgt ggctgtgata tgtagggatg tgatccatat ggatgtgatg tagatggctg 8400 cgatgcagat ggctgtgagg cagctggact gtatgtcgaa catatagtcc tatggccctg 8460 tgatggaaga cctggtgtct gaacgaaggt gtatgattcg tgatgctgtg gaaactcagt 8520 atagccgtgt ggtggaggat aagacatagg catctctgaa aagggtggac aagagggact 8580 attattttct accctcctct ttcccttcct acccttttct cgaccctgag aactagtagg 8640 gtcattgtta ccttgaccct tgcctgccat ctgtatgata taatgcacat ttagattgaa 8700 acatataaga aactagctat aaaacaagag tgctttaaaa aaccaacttt ttaatcctca 8760 tcgacgtatt gttcctcgtc cgagaattct tcgtcctcat ttgtttgagc ttcatcagtt 8820 gattcttcgt cctcattttc tttaattgtt acttcattta tatcaccttc ttccaatatg 8880 cattcaggat gttccaaatc attttctaac tgatcgtcca ctatttggtg aatattagaa 8940 atatcatttt gatatgcaat atttaacaca ttctcgactt ccaccctacc tacatgctta 9000 gtttttatta caacccacca atcggactta ttccgccgca atggataagg agcataatac 9060 acttgcctaa cgttatgtgc aattatgaaa ggatcatagc gatcatactc cctcgtatga 9120 ttaacctcaa ttatgttgta ttggtggtgt acacttgtac ctcttgttgg atttgggtca 9180 aaccacttgc atataaagag tatcaatttc ttatatggcc aacctgtata ttctagttgt 9240 aatatttctt tgaccacacc ataataatca atatctccaa cttggttgcc atcaccacct 9300 tgaacccaca ccccgctgtt gttactattt ttatttttag agccatcctt tgtatgaaac 9360 ttataaccat tcactacgta cttagacatt gttgtgacct gaagcccagg tccccaagat 9420 atatctttca aaaattgatt tacaccatta tttggattat ttacctacat agtgttaaaa 9480 atattcataa gttagcataa cttataaatc aatttttata cattcattac atatatatat 9540 atatatatat ataactagtg tatatatata tacaaactgt ttgaacacgt atcaaatctc 9600 gtatatacaa catcatggcc aaattgacct acgaagtgac tgtgacacat caaatatttt 9660 tagtagttgc atcaatatgt agtcacagta aattttacat tttgataact aataaatcaa 9720 tacttacttg agaaatggta caacttcgga acaatttagc aacacatgaa gtgtagctga 9780 cttgtactcc atatcactca aacttctctt tctaacatcc ttagaacatc ggcctggttg 9840 attgaatata gatattggtg gatataatgg atcattcaca tattcgaccg tgtgcctatt 9900 gggcctattc ctagaacatg gcacgttatt ctcaaaataa taagaacaaa aatatgcagt 9960 tttctttgca agataggctt cgcatataga tccttcaatc ctattccctg cttaacaaat 10020 tgtttgcatt tgccaattgt cctacataat gtcatgttag ccaagaacat tcaaataaaa 10080 tagaatatta catcaaactt ataatattac ctctcaaagg gatacatcca tctgcattga 10140 acatgccctc caagtcgtgc ctcgtgtaca aggtgtattg gaaggtgttc cattacatca 10200 aagaaaccac atgggaatat tttttccatc ttactagaaa ttacacgaat gttctggtcc 10260 atccgaagta ggttttcttc ccttaatgtg gtagaacaca agcctttgaa aaacaaatta 10320 atctttatga tgggtttcca gattctttca ggcaaaccac aaaatgcaat aggtactaag 10380 gtctccatga aaacatggca gtcatgactt ttcaaatggc tcaacttccc tacctccata 10440 tctatttttt tcaagattcg acgcataacc ctcaggcatc ttcaatttcg taacccaatc 10500 acaaatttgt cgtctttcct ccaaaatgaa tgtgtaactt gctttggact tgaacacctt 10560 accattgttt gctgtctgca agtataattc aggccgcctg caatattctt gtaagtccat 10620 tctagccttc ggggtatctt ttgtcttacc tttaacatcc atcactatgt tgaacaaatt 10680 gtcaaaataa ttcttctcta tatgcatgac atcaaggttg tgtcggagaa gattatcctt 10740 ccaataaggc aactcccaaa atatactttg tttcgtccaa ttatgattaa caccatatcc 10800 gaggaatcta taaggtggag cctcagtaac tttactgaag ttctggaccc tctcccaaat 10860 tttctcacct gaaagtatcg gaggtggaga atcatattcc actttattct ttttgaatgc 10920 atttttcatc cttctaaact catgatcatc aggcaagaat tgacggtgac aatcaaacca 10980 tgattacttt cggccatgtt tcaaagtgaa cgctttacta tttttcatac agtaaggata 11040 agctagcttt ccagcagtca tccacccaga caacattcca tacgcaggaa aatcgttaat 11100 agtccacatt aaattaggac gcaaattgaa attctgcttg gttgatatgt catatgtttc 11160 aacaccatca taccacaatt gttttagctc atcaatcaaa ggttacaaat ataaataaat 11220 caaacctttt ggattacgtg gactgaggat aatataattt cagaatatat atggactagt 11280 catatacaac taaggtggta gattataagg tataagaaag acaggctaac atgagtatgg 11340 tgtcgcagat atagaaaaag gcgtgaagcc atccgcacac agacctaacc gaatgttcct 11400 tgattcacta gcaaaatctg gatatgtcct atcaaagtgt ttccaagctt ctccatctga 11460 aagatgacac ataacaccgg gtggtcttct attttcaaag tgccatctca tatgaggagc 11520 agaactcatc gacgcatata acctttttaa cctaggtata agaagtaaat aatgcatcgc 11580 cttgacaacg gccatattcc cactggaaag cctcttgaaa cgaggatttt cgcaaaattt 11640 acaactgtct aaagttgcat catctttata atataacatg caaccatctt cacaacaatc 11700 aattctcatt gacgaaagtc ctaacttaga aaccaatctc tttgcctcat agaaatcacc 11760 aggtaagttg atattagggt caactagttc actcataagg tcaatgaaag agtccatggc 11820 tgcttgagaa atattccaat cagatttgat acttagtaat ctaactgcaa cagacagctc 11880 agagtgcaga cttccttcac gtagtagatg actagcttcc tctagtgttc ataaaaacat 11940 tttgcgtctt cattaggagt ttgttcaata ttttcattgg gctcaccccc gaagtgcatc 12000 ccaaaagcat ccgcaaccat atcctgaatt ctagaatcaa gatttgtatt ctccaccgac 12060 ctactacttt caccaacaac catgttacga aatatcccac ggctaccatc gatctctcca 12120 tgattagtcc acacaaagta attctctata aaccccttcc tataaagatg aagcttaatt 12180 tcctccgatt ttttaaattt catacaatcg cacctgatac aaggtcacca aattactcct 12240 tcactttggt atggtggaag tgacattgca tgtctaataa agtcatcaac cccttctaca 12300 aaatcctccc gcaatccccg ccgattagga taattcctat tgtacatcca agtacatgtt 12360 ccatctatac aaataaaaca agaacaaatt aatttattct acaattataa attaattata 12420 tcttttttag ttaattcaag ataattattg tttcctaatt ataccaattt atatcctaaa 12480 agttcaattc acacccaaaa ggtccaattc atatcttaaa agtttaattc atatcctaaa 12540 agtttaattc acaagaacaa atcctaaaaa ctaaaatttc aattcatatc ctacgagttt 12600 aaccataaac gaactaaact aaagaaattc aacccatacc ctaaaagttc gattcacaag 12660 aacaaattaa tttattctac aattataaat taattatatt ttttttagtt aattcaagat 12720 aattattttt ttctaattac accaatttat atcctaaaag ttcaattcat atccaaaagg 12780 tccaattcat atcttaaaag ttcaattcat atcctaaaag ttcaattcac tagaacaaat 12840 cctaaaaact aaaatttcaa ttcatatcct acgagtttaa acataaacta actaaactaa 12900 aaaatttcaa cccataccct aaaagtttga ttcacaagaa caaatcataa accctagatt 12960 ctaactaaac tattcaagaa aatacaaagt taataattca attctaacta gactattcaa 13020 gacaatacaa actcaaaatt gaaatactca tcaattaaaa ctaattcata actaattgac 13080 taactaacaa aactaattag ttaataaaac taattaacaa aactaattaa aacaagacct 13140 aaaccctaat cctcaataaa atgcaatgtt caaataattg aaatactaat caattgaaac 13200 taattcataa ctaattaaca aaacctagaa ataataaata aatgggttgt aattcaaacg 13260 tagaattttt aggagatgga gaaggagagg ggcggcagtg gcagtggcag tggcagtggc 13320 agcggcgatg gcgatggcga cggcgcggcg acggtgatgg ctgggcagtg gcgacgcggg 13380 gtggggaatg agatttatgt gagggaaata tagaaggaga ggggaaggtt ttgagtgaga 13440 aaaatagaga aggagagggg aagataagag agaaatgggg gttcccccgt ttttcaattc 13500 tgatttcaga attaccgacc aaagttggtc agtaattttg gtcggtacat taagtgttga 13560 ccgtttgacc aaaaaccgac caacttcggt cggttttttt ttttaaaatt aaactttttt 13620 ttttggtgtg tttttttctt aaaatattat aaactataaa aaatatatta taaactacaa 13680 gcatttattt tatttaacaa tacaattatt ataaataatt ataaactata agtataatat 13740 ttacaaataa ttatattaac tatttaattt taataaatta taatagcatc tatctaagta 13800 aattttctaa gttataatta agtatgtgag taatttctca catacacaca tacactatat 13860 tgtaattgat gctaattact tcttttttca ttcgttcatc actaataatg catgacatag 13920 attaatcgat atataggtcg agacgttttg atgaatcatc gattaatatt catcgataca 13980 tctaagtaag ttataagtcg atgaatcaat ttacaaatag atatatttga tgataaagta 14040 tatatactaa ttagtatctt cccaagtcta tccctaaaag aacccgaccc tatggtccta 14100 gcgcttcgtg ttcttatata tatacggcta tacctatata tatatacaca cacacacaca 14160 cacacaaata cacttcactg taatacttta actatatata tatatatata tatatatata 14220 tatatatata ta 14232 <210> 7 <211> 10082 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..10082 <223> /note="Description of artificial sequence: NtIPMS2 corresponding BAC contig sequence (total BAC length is 10082bp)" <400> 7 taaaacacgc ttcgttgtac tactttaact acatatatag catattatat atagtatatg 60 ttagtgtatt cattatttgt attacaaaag tgttaacgaa ttacatttat attatttaga 120 tagtaaatat aaaagtaatt cgaaagtttg accaatgttg acgtaataac cgaccaactt 180 tggtcggtta ttttacagaa aatatcaatt accgaccaaa gttggtcggt aaatactttc 240 cctgcattaa ccgaccaacg ttggtcgata attttaaata taaattctta aatattataa 300 aatattttaa ataataaaat aattattaaa attttaaaaa ttgggtccag attaccgacc 360 aacgttggtc ggtaatccaa aattttcttg tctgaccagc taggtcaatt cgttgaccaa 420 ttttgccgac caacgttggt cggtatttag ttcaaaaaaa atgtaaaatt ttttgtttcc 480 agttttcgtc caagctggac ggtttttggt cgcttttttt tttaccgacc aacgttggtc 540 ggaaatattt ggtcagtttt tatcagattt ttagtagtgt caaacacttt aaaactcgtt 600 ttatccctta gaatttcagt acctccattg tattgaatca accccaaccc tccatttttc 660 tcatttacat taggcgcatt gatgtacctc tttcctttta aggaatatat tttgtaacat 720 ggtgaatatt ttgtgcagtg gccaccatgc attgaaagcc aaaatggctg aggtaagata 780 cataatctat agtacgatat actacaaata ttatagtata tggacttgga tcaaatcatt 840 ttatttttgt tacagcttgg atatgacttt gatggaaaag aacttgatga cctctttcgt 900 cgattcaagt cactggctga gaggaaaaag gtgattaagt tgctgatctt tcatagtgca 960 atggtcaaac ttgtgatcgc accttttcgt tcctagtgtt tgttcatatt ttttgagtta 1020 attttaagta tgatcactaa tttctattat aataataaaa tttaatttta tttattcaca 1080 ttaaaatgac tgaactaaca attaaaaata tttgaaaaac atatgaaaaa ttacggccaa 1140 agaaaaattt ctttgactct caaacatcca agcatcacca catagtaata aatgaaaaaa 1200 ttatttttta tcacattaaa gtaactgaat tttacttact attcataata aaagaaaacc 1260 actaaacttt acgcactata gtgggaaaac ctatccatat tcaaggtgac tttaagtact 1320 ggtctaatag gtagattttt gtgattttac tgttatagtg gataaaatta agtaactttt 1380 tttgataaat tagcagaata gcctgagtga catctcacta attcggcttt gacatctcgg 1440 tccccttact ccacagtttc aaccaaacac ttgaacttgt ataaaatatt agttttaaac 1500 acctctgata ctgtgtgttg tccactcgcg ctgatataaa tgacacatca gagtcacctc 1560 agatacattt aatgccacgt cattatctat ttttacaaaa aatatttttt taataaaaat 1620 atcaaactca tccctttttc tccaaaaaaa gaaaacaaac cttagttctc tctccaccgt 1680 tccatatctg cctcttccac ccatcaccgc cactaccaaa cactgcaccc ttcctcttcc 1740 atgagaaaac actcaatcaa accactttat cttttttttt gtcctaaatt tctccattac 1800 tacaatctat tcaaccaccc atggaagttc tgttgccacc atcgccagca accactccaa 1860 aaccaccact atatctcctc ttctcttcat attcatgtca ccctttcaaa acctagacat 1920 tgaacgagtt taagaaaatt tatccttcaa ttttctttct agccaaacac ccaaagaaaa 1980 acccaaaaat tgaaaaagaa agagaagaaa tttttactta atatttggta cctcaaaatt 2040 cttattaacc cctctagcta cggcaaaatt tataaaacta acaaaatcaa gcttcgacgt 2100 cttcaacaac cgatgacgac ccaatttttg gcttaaacac tattttcaag cttcaatgtc 2160 tcttaattct ccgacgtctt tattgtcttc ttcagttatt ttgagaaaaa acaaaaatta 2220 aacaactttg ttccttgact agctgctctg ctaagctcta ttagtttgat gttgttatgc 2280 tacacctttt tgttttttat catagtccag ttgattgcta agattgtaag agaaataatg 2340 taatgttatt tgagaaaact ctacttgaga aacaaaaatt taatattaga gggtgtggag 2400 cgtgccaatt tcaatggcgt ttttaaggga tttgggggta agaagaagcg gatgggatag 2460 aggggcgaga taatggctag cattgttttt aattttttaa ttttttattt ttctcttata 2520 ttattttcta atcaaatttt gtatagttac ttgcttttag gagtgtgcaa tcacttattt 2580 tgcttgactc aacaaaacaa aggccgtata agcttggtca atggtcatat gggtttaaaa 2640 ctaatgtctt atacaagttc aagtacctga ttgaaactat gtggagtagg gggatcgtaa 2700 tagcaaagcc gaataagtcg aggtgtctct tagtctaaag tagccttatt ttatagtgag 2760 taaagttatg tcattatatt tatatatgaa attaacccta taggttttcc agttctttgg 2820 tgaagcttac ctaattaaaa ttttacctgt gtcggtataa tgaatatgta tgtccgccta 2880 tttatcttcc ctacatctat ttttcagaaa attacagatg atgacttgag agcacttgta 2940 tcagatgacg ttttccagcc tcaagtttcc tggcaacttg gagatgtaca ggtacatgta 3000 aatactattt catgtgtttt tgcctaagtt gctctgacac ggcagtttag gtgacacgcc 3060 cgtgtcggca agacactagt atgagtgtgg atgtgagatc cgtaccggat ctggtcaaat 3120 aattttgggt actttgaccg cagcgtacga aaaaattaga gataagatac aatttgattc 3180 ccgaaatcag aaccaaagct agggtgaatt tgaacaaaat agcatacatt atctaggaaa 3240 tcaatccttt acttatctac aactcgagaa taaaaaataa atccacacat tacaagttat 3300 acgtaagtat tccacaaaat ttctcgtaat ttagatatat ttttatattt ttatttaatt 3360 gaattatttt tagtcggatc cccgcacccg tatccgtatt aggatcagta tcccaaaatc 3420 ttagaattta catctcgaag gatccgacct ctagatctgc acctgtatcg gatacccgta 3480 cccgtatctg agcaacttag gtttttgcta gtctcactta gttgtggatt gaaaaggaat 3540 taatgttcac ctaaatctaa tgatttgctg tttattgtac agattacttg tggaaatgtt 3600 ggccgctcta cagcaaatgt taagcttatt gacagcgatg gtcaagagca cactgccttt 3660 tctgttggaa caggacctgt tgatgcagct tacaaggcag ttgacctcat tgtaaaggtt 3720 tataatgaaa ctgaaaactc tcataatgtt tgtatcttgt cacactagta ggataggtaa 3780 tttaagtttt atatacgctg aaggtataaa aatatttact caatcagagc gcttacaaga 3840 caattgcagg taactctatg agtagcttag actaaaagtt ttaattattt aattatattt 3900 atgcatgcct caacacgttt actcacctct tagcctaatt tttgttacat gggatcgttc 3960 tacattttga gtagctgaga gatttgaact taggaccttt attttctcta acactatgtt 4020 atattgccag tggaacagga gcgcatatgg acattgtcgt ttcaagtgtc caagcctatg 4080 ttgaggcgtt gaacaaaata ttcagttaca aaaaaacagg tctcgtgaac aaatttgaag 4140 gcagtgcgca atcgtaaaag tgatggtgtg tgctccagaa acaaaagctt aaatgctgct 4200 tagtgctcga tgatcataaa tttatgctct attcatgcat gcattactga agttaattaa 4260 gaagtaatct taattgtata agatgtaaac atgtttctat tcatgcatta ctatgaaatt 4320 aattacaatt tctgagccaa tttttttatt tggttcttaa aatttataca aatctcttta 4380 tttgtatttg actaacagat tttcgggaat tagggcaagt agtccaatca gaatcacatt 4440 aagcttggag agtaaaatca aaatctgcac tcctgaacaa accttgactc aaagtacctt 4500 taacatattt taaaacatga aaaggagcag ccatatgaga agcagccata tgagaagcag 4560 ccatgtgcgg tcctcacatt gcttgagcct gcaggtattc tgtagctgca caatttgatc 4620 tgcagctgca cttcagcttc tacgatcgca caattcatgt gcagtccgca cttctggcaa 4680 ggcttcagtc ttgttcattt tgcacgctct ctgaactttt tgtattcttt tcagtgcaac 4740 tatgttctgc ggccacacaa attgtgtgcg gtctgcaatt ctcttcaatc acttctaggc 4800 ttctacatta gatctatggc cgtagagaga attatatggt ccgcactttc ctctacggcc 4860 acagaaatac ttttgcggac cgcacttctg ctctactgcg ctccttcttg ccttgtgagc 4920 cggaacactc ctttttgagt tgaatttctt cattagagta caaatttcca acattcctgt 4980 aatttgcaga cttttattag ttttgggaac ataaatcaat acttttggac taaaactaaa 5040 gcaagaaggt actaataagt ggtcaaaatc cacacttatc accaatccat acccaaaata 5100 acatcaaaat ctaccatatt aagtaacaaa agattaaccc tagtctcgta gccccaatag 5160 tgacaaaaca agaacaatag acacagtcta ccacaataga atccccaacg ggtgtagaca 5220 cataagtagg agtattgaga gaatcatgag acatatccaa atatgaagaa aagtaggatg 5280 acacatacga atatgtagaa cccagatcaa atcaaactaa tgcctctcta tgacagatca 5340 gaatgatacc tgtgataact gcatctgaag caactgcctc agtcctacca aggaaagaat 5400 aacaacgagc tcggcctcct cctctatgat gacctctacc cgcctgtcct ccacctccag 5460 ctagctgtgc aggtgaagta gcaactggag cgggaactgt agccttagta ccttgctgag 5520 gtccatccat cttaagtctg ggacaatctc tcaccttgtc cctagtatca tcacactcta 5580 aataacctct atgcgagcgt tgctgctggt actgagtttg cccgtgacga ttggaatgac 5640 cactctagga acctcatgca gaaggcacac tgaaatatgt ccggtacgag tgctctaaga 5700 tccatggcta gctggagcac cacaggaaat gtgaggtgca tactgaacta gtcgactgac 5760 aaagcctctg ccataaaggg tctaagctgt atagtaaaaa ccactaaatc ctccagaacc 5820 acgaggcttc ttatcctccc tatcctccct ctcctgacag cggatacgct ctaacatcct 5880 agcaatctcc acaacctgat gaaatgcaat ctcagtctct aactcccgtg ccataccata 5940 tctgaggcta aaggcgagtc cctcaataaa tctacgaact ctctctctat cagtggaaac 6000 caaggaaggt gcatgacgag ataactccgt aaacctcata gcatactcgg acacagtcat 6060 gctcccctgg cgcaactgct caaactcatt gcacaactca tccctgcagg tctaagctcc 6120 atcaagaaaa gatcagagaa tagggaccat gtaaatggtg ttgcgccaac tatcatactc 6180 gcctcataaa tctaccacca tatgtatgcc gaacccgtca actggaaaag tagtaaggtt 6240 gacccccctc gactccacca aacctatggt acgtagaatg cgatgatact aatccaataa 6300 actttgtgca tcctcagaag tccctccact aaactaggga ggatgaaact tcagtaacct 6360 ctccaaacac ctctgtccct cagccgagac aactggccct acctcgggct gaactgccgt 6420 tattggctgc accaacacaa cacccagtgt ctggtaagca tgagtcggct actctggtgt 6480 gcgggctgcg tgagtttgag ctcctccccc agtatatgaa gtagctggtg caaccagaat 6540 caactcttcc tcggccaaac tcacaaacat actcatgaag tatgccaagg tctcctagag 6600 cgccagtgta ggaataggct gctcaggtgc acgctcaacc tgctcgggct cctaatcctc 6660 aactggatct gttggagatc caccgttgct actctagcta tagcatgtgc ccctcctcgg 6720 cctctacctc ggccctggcc tcttgcgact ctaatagcgg gcacttgtgc ctgcttagct 6780 aatttggtag agcgtgtctt cgccatctat gggagaatag aagagtaaag gttcaaactt 6840 tggaataaca aatcgacatg ataaagaatg aaggaaggtg atgtttccta acagttcggt 6900 agcctctcaa agataagtac aaatgtcttt gtaccgatcg gcaagattat actaaacctg 6960 ctcatgacaa ctcgtagaac ttatgaacct agagctataa taccaacttg tcatgatcca 7020 aatctcacca taggggtctt gatggaacct agtctataaa actaggtaag tcgaccactt 7080 aacaatattt aaatcagcaa aacatgatat aataaggcag agtttaatat gaaagcagaa 7140 aatagagtta acatcagcca aaatggcaat actcaaatat ttccccagaa ttaggtagta 7200 caaagtcatg agctctgata gaatacataa ggatgtctta aattacaata ctgtttgaat 7260 atgaaaataa caatataaat atagggaagg gactccaagg gaatgcgccg gtcatgcagg 7320 tctaccttga atccttgcgg tcaatgtaag cctcactgcc taggtccgct gcctccaaca 7380 cctaaatcta cacaaaatat gtagaattat agtatgagta cactactatc gataccagta 7440 agtatcaaga ctaacctcgg tgaagtagtg atgaggttca agtcatttga tactcactag 7500 tcaaataagc tgtacaatat atcaaagact agaaatagaa tgtataatag aaaataatat 7560 caacaatctc tttggaacat atgataacaa ctcaatgcaa gtaaaggttc atcttgacaa 7620 aaagttatca aatagaaaca caaacgtatg atacctcgta acacaataac aatatccatc 7680 tgcatcactc agccctgaca aaataacaat acctaaactt atctcttcgt cctgacacaa 7740 taacaatatc catctgtatc gctctgccct gatataataa caatatccat ctgtattact 7800 ccgccctgac ataacaacaa tatccacccg tgtcgttcca ccctgacaca ataacaatat 7860 ccatctgttt cgctcggcct tgacacaata acaatatcca tatgtatcgc tcagaactgt 7920 cacaataaca atcacaatcg tacgacagaa acctcgtgcc aacacccaaa caatccgcca 7980 acatgtccat atgtgtcaca attataacaa aacaataatg tcaagtttca tcaaatacta 8040 gctcacaatt tatcaacaag gtgcacaagg acatgataac aataaaaatg tggatgggta 8100 ttcaacatat aaagcatgac tacgactaat tcaattgaaa agattatgtt catgtagtca 8160 caaagtgatt aagtatgttt catgtagagg acatttccaa attaaggcat attaatagcc 8220 taaggtctaa tctagtcata agccgtatat aacgcccatg tacacgctcg tcacctcatg 8280 tacacgtcgc ttttcacata acacgaataa taattaagga caaatcataa ggggtattcc 8340 cccaccccac aagattaggc aagatactta cctcaaataa ggcaaatcaa tactttaaaa 8400 agcccttgcc tatcgaatcg gcctccgaaa gggtcaaata tagcctaaaa acaactcaat 8460 aatatcaaat acgactatag aaattgattt caagtaagaa agctctgatc tttatcaaat 8520 atcaaaaatt cactccgaac tcgcctcccg gaacccgata aaatttacaa atctcgagta 8580 cccattcgaa tacgagttca aatgtgcaag ttttatccaa attggactcc gaatcggggt 8640 tcaaatctct attttttatt ttagaatagt tttttccaaa attcccaatt ttctcacttt 8700 gattaaccaa taaaaagcca aattcaagat ggaatcatga acaataatca aatccgagta 8760 aagaacactt acccaatcca agtgggtgaa aatcgcctaa aggatttcct caattcgagc 8820 tttaaatctc aaaatatgat aaaataagtc aaaccttcaa ttaaaatact ctactcagtg 8880 attttcgctt ctgcgtacca tcccatcgca tctgcaatgc cgcttttgtg agcccactct 8940 cgcatatgcg aagttcagtg gctccccgat cctctgcttc tctgatacta ttctcgcttc 9000 tacggagtcg cttctgcacc caaactagca tacctgcgcc caaagttccg tacctacgga 9060 caatgctgcc ttcctcttcc cttcgcatct gtagcccttt tgtctgcatc tgcagactca 9120 aactcgctag tgcgagaaca ctagaatctg aagtgctacc ataatatcaa aataatccaa 9180 aacacacccg aggcctcggg accccatgta atcataccaa tcaatccaaa aatataacac 9240 ggacctactc gagtccgcaa atcacataga ataacatcaa aaccataaat cacacatcaa 9300 ttcaagttta atgaactaac taacttccaa actttcaaca ctcacgccaa aacatatcta 9360 aactacttag aatgacctta aatttcacac acaagtctca aattacataa ttaacctatt 9420 ccaactttca gaataacaat ccagacccga cagcctcaat gtcaactccc ggtaaaacct 9480 atgaaccttc caaaccttta aatttccaac attcgccaaa tagagccaaa taaacctagg 9540 aacctccaaa tctaaatccg gacatacgcc taagtctaaa atcacaatac aaatctattg 9600 gaaccatcaa aataccattc cagaatcatt ttatataaaa gtcaaacatc ggtcaactcc 9660 tataacttaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt accgagctcg 9720 aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 9780 tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 9840 tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagctgaatg 9900 gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgtggtatt tcacaccgca 9960 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag cccccgacac 10020 cccgccaaca cccgctgacg cgaacccctt gcggccgcat cgaatataac ttcgtataat 10080 gt 10082 <210> 8 <211> 1456 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 8 agcttctgca aatctcccaa cattatcacc ttctgccgcc tctgaaagca agtagctaag 60 cattaattaa gaatgaccac acaaaataaa tagtagtagt aaagtagccg aactacatat 120 aattagaccc atcatatagg ttttctagcc aatacttttc caattaagat taggtttcct 180 ttttaaaaat ttgcacaatt cttagagaga tatctaatag tgcaaaacac agaaatatat 240 atccaaacta ccttttctct ctccttaaac attttattta actaacacgg cactagttga 300 aacaatcagg ggatatttgt aaaggtaata aatgactggt tgatttttaa acgttagata 360 tgttgaaata aattcaattt gaaaaaacga ctaataatta aagctggaac gctacgtatt 420 caacactaag aaaatataat gtgctatttg acaatatatg aagtcaagaa ataagaactg 480 gcattatata tgttttcaag taggtttagg ctatggcaaa atactaataa gcaagcactt 540 aattttgcgg tacaaaataa agttttgtat tgttaaataa gaagatatat cacgtaacaa 600 aatagagagt attgcctata gttaatttgc atcgctcgtc ctttgtgagc atttcaatag 660 gcttatgatc acacataaat ttgtgtgtga attgctttag aaaaattaca taatttgaat 720 ttgaggtctt aatatgtgtt caatccagag gagtaggcac cttagctcga gcgatatcgc 780 gtgacaccgc ttcgacaaca tatttcataa atatgtatgt ataaatatta agaaaaataa 840 aaatattgag tataaatata aaagatgaca ttgcacttct ttaaatattg ataccgctta 900 caaaacttct ttgcgcgcac gccattgatt caatctatca tagttcttgt aaatgttatt 960 tcagatcttt aatttaaaat attttaataa agtcaatcat ttttaacatc tagatttctc 1020 gtttttactt tttgtttatt atatcacatt ttggacatag cactaagtcg gtataactaa 1080 ttgtgacttg tgcaagttaa gaaaatacaa tgcaatgctg ctgaaacaac agagcaactc 1140 gtttccagta aaaatctaaa gtttactact ttcacaaaaa ctaataaaag ttttagagtg 1200 cgtttgacaa tttatttcat gcaaagattc gagaacaatc aacacagaat taggctgaag 1260 tgtctaagag aatttaatat ttgcccttca tcaagaggca atatataaat aagcctgcgc 1320 cattgcaaca actcaaacca tttccaatat tgcctcacaa gtcagtagtg cctttcctct 1380 ctcaaacgtt cattgtcttt atctcccttc cccaattctc attggaagaa taaaacaaaa 1440 attaaattag aaaatg 1456 <210> 9 <211> 713 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..713 <223> /note="Description of artificial sequence: Synthetic construct used to trigger the suppression of NtIPMS2 gene expression via the RNAi mechanism." <400> 9 gctaagcttg tcgaccatgg aaattctctg accctgatta tgttggtatt tttgacacca 60 gtcttcgcga tggcgaacag gccgctggtg ctaccatgac tagtaaagaa aaactggaca 120 ttgcacgtca gttggctaag cttggtgttg atgttattga ggccggtttt ccttttgcct 180 ctgaagctga gttcgagctt gtaaagttga tagcacagga aattggtaac ctttaatgtt 240 taaccgttca catttctaat atttacttat ttgtaacatg tcgtcacgtg ttagtttcat 300 tctttttatg aaccaaacat gcatgcaaag atatttttag atatttggac ggcgagtgag 360 atttgaaact aggaccgttt gcctgataca atattaaaat atgtaaccat tttatgtaca 420 agtttaaact gttgatagta gcatattttt tacttttatt taagtatact atattccaac 480 aggtaagtta accaatttcc tgtgctatca actttacaag ctcgaactca gcttcagagg 540 caaaaggaaa accggcctca ataacatcaa caccaagctt agccaactga cgtgcaatgt 600 ccagtttttc tttactagtc atggtagcac cagcggcctg ttcgccatcg cgaagactgg 660 tgtcaaaaat accaacataa tcagggtcag agaatttggc gcgccaattg acc 713 <210> 10 <211> 1824 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 10 atgtcttctc tctgttcaaa ctctgcaact tctcttagtt gtaataactc cttccaatcc 60 aaaaatcctc ttcttcacac catctttaac ttctttcctt caatcaaacc acactcttgt 120 ttcccatata cagttatccg gtgctcaatt caaaagcgac ctgaatatat accgagtaaa 180 atctccgacc acaaatacgt acgcattttc gacacgactc tccgcgatgg agagcaatcc 240 ccgggcgcta cgatgactac gaaagaaaaa ttagatgttg cccgtaaatt agcgaaactc 300 ggagttgaca taatcgaagc tgggtttcca gcttcatctg aagctgattt tgaagctgtg 360 agattaatag cagaggaaat tggtaataat agcgacggtg attatgtgcc ggtgatttgt 420 ggattagcga ggtgcaataa gagggatatt gataaagcgt gggaagctgt gaagtgtgcg 480 aagagaccta gggttcatac gtttatagcg acgagtgaga tacatatgaa gtataagttg 540 aagatgagta aagaagaagt agtggagaaa gcgcggagta tggttgctta tgcgaggagt 600 ttgggatgtg aggatgttga atttagccct gaagatgctg gaaggtctga gcgtgagttc 660 ctttaccata tccttggaga agttatcaaa gctggtgcaa caacccttaa catacctgat 720 actgttggat acactgtgcc cactgaattt ggacaattaa ttgctgacat aaaagccaat 780 accccaggaa ttgaaaatgt gatcatttct acacactgcc agaatgatct tggactttct 840 actgccaaca ctttagctgg agcttgtgca ggggcaagac aagtagaagt gaccatcaat 900 ggcattggtg aaagagctgg aaatgcttct ctggaggagg ttgtaatggc cttaaaatgt 960 cgtggagagc aagtactagg tggcctgtat acaggaatta atacacaaca tatactcatg 1020 tcaagcaaga tggtagagga gtacaccggg cttcatgtgc agccacacaa ggccattgtt 1080 ggagctaatg cttttgctca tgaaagtggc atccatcagg atggaatgtt aaaacacaaa 1140 gatacatatg agattatatc tcctgaagat attgggctta gtcgtgctaa tgaagccggt 1200 attgtccttg ggaagctcag tgggcgccat gcattgaaat ccaaaatgct tgagcttgga 1260 tatgacattg agggaaaaga actggaggac ctcttctggc gatttaagtc ggtggctgag 1320 aagaaaaaga aaattacaga tgatgacata atagcactga tgtcagatga agttttccag 1380 cctcaagttg tttggcaact tgcagatgta cagattgcct gtggaagtct tggcctctct 1440 acagcaactg ttaagcttat tgacagtgat ggtcaagagc atgttgcttg ttctgttgga 1500 accggaccag ttgatgcagc ttataaggca gttgacctca ttgtaaaggt acctataaca 1560 ctcctcgagt attccatgaa tgcagtcaca gaaggtatag atgccatagc ctcaaccaga 1620 gtattaatcc gcggggagga tgaccatgct ataaccaatg gttcaattgg accgactcat 1680 caccgtatat ttagtggaac tggagctgat atggacgttg tcatctctag tgtccgagcc 1740 tatattggtg cattgaacaa aatgttgagt ttcgggaagc tggtttcgag gtacaagaag 1800 cctgaaggta gtgtggtagt ataa 1824 <210> 11 <211> 607 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 11 Met Ser Ser Leu Cys Ser Asn Ser Ala Thr Ser Leu Ser Cys Asn Asn 1 5 10 15 Ser Phe Gln Ser Lys Asn Pro Leu Leu His Thr Ile Phe Asn Phe Phe 20 25 30 Pro Ser Ile Lys Pro His Ser Cys Phe Pro Tyr Thr Val Ile Arg Cys 35 40 45 Ser Ile Gln Lys Arg Pro Glu Tyr Ile Pro Ser Lys Ile Ser Asp His 50 55 60 Lys Tyr Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Ser 65 70 75 80 Pro Gly Ala Thr Met Thr Thr Lys Glu Lys Leu Asp Val Ala Arg Lys 85 90 95 Leu Ala Lys Leu Gly Val Asp Ile Ile Glu Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Ser Glu Ala Asp Phe Glu Ala Val Arg Leu Ile Ala Glu Glu Ile Gly 115 120 125 Asn Asn Ser Asp Gly Asp Tyr Val Pro Val Ile Cys Gly Leu Ala Arg 130 135 140 Cys Asn Lys Arg Asp Ile Asp Lys Ala Trp Glu Ala Val Lys Cys Ala 145 150 155 160 Lys Arg Pro Arg Val His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Glu Ile His Met 165 170 175 Lys Tyr Lys Leu Lys Met Ser Lys Glu Glu Val Val Glu Lys Ala Arg 180 185 190 Ser Met Val Ala Tyr Ala Arg Ser Leu Gly Cys Glu Asp Val Glu Phe 195 200 205 Ser Pro Glu Asp Ala Gly Arg Ser Glu Arg Glu Phe Leu Tyr His Ile 210 215 220 Leu Gly Glu Val Ile Lys Ala Gly Ala Thr Thr Leu Asn Ile Pro Asp 225 230 235 240 Thr Val Gly Tyr Thr Val Pro Thr Glu Phe Gly Gln Leu Ile Ala Asp 245 250 255 Ile Lys Ala Asn Thr Pro Gly Ile Glu Asn Val Ile Ile Ser Thr His 260 265 270 Cys Gln Asn Asp Leu Gly Leu Ser Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gly Ala 275 280 285 Cys Ala Gly Ala Arg Gln Val Glu Val Thr Ile Asn Gly Ile Gly Glu 290 295 300 Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Met Ala Leu Lys Cys 305 310 315 320 Arg Gly Glu Gln Val Leu Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Ile Asn Thr Gln 325 330 335 His Ile Leu Met Ser Ser Lys Met Val Glu Glu Tyr Thr Gly Leu His 340 345 350 Val Gln Pro His Lys Ala Ile Val Gly Ala Asn Ala Phe Ala His Glu 355 360 365 Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Met Leu Lys His Lys Asp Thr Tyr Glu 370 375 380 Ile Ile Ser Pro Glu Asp Ile Gly Leu Ser Arg Ala Asn Glu Ala Gly 385 390 395 400 Ile Val Leu Gly Lys Leu Ser Gly Arg His Ala Leu Lys Ser Lys Met 405 410 415 Leu Glu Leu Gly Tyr Asp Ile Glu Gly Lys Glu Leu Glu Asp Leu Phe 420 425 430 Trp Arg Phe Lys Ser Val Ala Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Asp Asp 435 440 445 Asp Ile Ile Ala Leu Met Ser Asp Glu Val Phe Gln Pro Gln Val Val 450 455 460 Trp Gln Leu Ala Asp Val Gln Ile Ala Cys Gly Ser Leu Gly Leu Ser 465 470 475 480 Thr Ala Thr Val Lys Leu Ile Asp Ser Asp Gly Gln Glu His Val Ala 485 490 495 Cys Ser Val Gly Thr Gly Pro Val Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Val Asp 500 505 510 Leu Ile Val Lys Val Pro Ile Thr Leu Leu Glu Tyr Ser Met Asn Ala 515 520 525 Val Thr Glu Gly Ile Asp Ala Ile Ala Ser Thr Arg Val Leu Ile Arg 530 535 540 Gly Glu Asp Asp His Ala Ile Thr Asn Gly Ser Ile Gly Pro Thr His 545 550 555 560 His Arg Ile Phe Ser Gly Thr Gly Ala Asp Met Asp Val Val Ile Ser 565 570 575 Ser Val Arg Ala Tyr Ile Gly Ala Leu Asn Lys Met Leu Ser Phe Gly 580 585 590 Lys Leu Val Ser Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Gly Ser Val Val Val 595 600 605 <210> 12 <211> 1821 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 12 atggcgtcta tcaccataaa ccattcattt tcccgtaacc ctaacatctc attccatccc 60 caaaatcctc tcattcaaac ccaagctctc ttcaatttca aaccatcaat ctccaaatgt 120 tcccctatta tccactgcgc aatccgccgt cgacccgaat ataccccgag ccacattccc 180 gacccgaact acattcgcat cttcgacacc actctccgcg acggcgaaca atccccaggc 240 gccacaatga ccacaaaaga aaaactcgac gttgcgcgtc agttagctaa gcttggtgtt 300 gacataattg aagccggttt tcctgcttct tctgaagctg atctcgaagc tgtgaaatta 360 atagcgaagg aagttggaaa tggtgtgaat gaagagggac atgttccggt aatttgtgga 420 cttgcgaggt gtaataagag ggatattgat aaggcttggg aggctgtgaa gtatgcgaaa 480 aaaccgagga ttcatacgtt tattgcgact agtgagatac atatgaagtt taagttgaag 540 atgagtagag atgaagttgt ggagaaagct aggagtatgg ttgcttatgc taggagtatt 600 ggttgtgagg atgttgaatt tagcccagaa gatgctggaa gatccgatcc agagttcctc 660 tatcatatcc ttggagaggt catcaaagct ggggcaacaa cccttaacat ccctgatact 720 gttggataca ctgttcccag cgaatttgga aaattgattg ctgatataaa ggccaatacc 780 ccaggaattg gagatgtgat catctcaaca cactgccaga acgatcttgg gctttctact 840 gccaacacct tagctggagc atgcgcaggt gcaagacaag tagaagtgac catcaacgga 900 atcggtgaaa gagctggaaa tgcttctttg gaggaggttg taatggcctt aaaatgtcgt 960 ggagagcaag tactaggtgg cctgtataca ggaattaata cacaacatat actcatgtca 1020 agcaagatgg tagaggagta caccgggctt catgtgcagc cacacaaggc cattgttgga 1080 gctaatgcgt ttgctcatga aagtggcatc catcaggatg gaatgttaaa acacaaagat 1140 acatatgaga ttatatctcc tgaagatatt gggcttaacc gagttaatga atctggcatc 1200 gtccttggga aactcagtgg gcgtcatgct ttgcaagcca aaatgctcga gcttggatac 1260 gatattgagg gaaaagaact tgaggacctc ttttggcgat tcaaatctgt ggccgagaag 1320 aaaaagaaaa ttacagatga tgacctgata gcattaatgt cagatgaagt tttccagcct 1380 caatttgttt ggcaacttga aaatgtacag gttacatgtg gaagtcttgg cctttctacg 1440 gcaactgtta agctcattga cgctgatggt caagagcatg tttcttgttc tgttggaacg 1500 gggccagttg atgcggctta taaggcagtt gatctcattg taaaggtacc tgtagcactc 1560 cttgaatatt ccttgaatgc agtcacggaa ggtatagatg ccatagcttc aaccagagtt 1620 ttaattcgtg gggagaatgg ccatacatca acccatgctt taactggaga gactgtacac 1680 cgttctttta gtggaaccgg agcagatatg gatattgtta tctccagtgt ccgagcctat 1740 attggtgcat tgaataagat gttgagtttc agaaagctgg tatcgaaaca cagcaaacct 1800 gaaggcagtg cagtcgtata g 1821 <210> 13 <211> 606 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 13 Met Ala Ser Ile Thr Ile Asn His Ser Phe Ser Arg Asn Pro Asn Ile 1 5 10 15 Ser Phe His Pro Gln Asn Pro Leu Ile Gln Thr Gln Ala Leu Phe Asn 20 25 30 Phe Lys Pro Ser Ile Ser Lys Cys Ser Pro Ile Ile His Cys Ala Ile 35 40 45 Arg Arg Arg Pro Glu Tyr Thr Pro Ser His Ile Pro Asp Pro Asn Tyr 50 55 60 Ile Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Ser Pro Gly 65 70 75 80 Ala Thr Met Thr Thr Lys Glu Lys Leu Asp Val Ala Arg Gln Leu Ala 85 90 95 Lys Leu Gly Val Asp Ile Ile Glu Ala Gly Phe Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Asp Leu Glu Ala Val Lys Leu Ile Ala Lys Glu Val Gly Asn Gly 115 120 125 Val Asn Glu Glu Gly His Val Pro Val Ile Cys Gly Leu Ala Arg Cys 130 135 140 Asn Lys Arg Asp Ile Asp Lys Ala Trp Glu Ala Val Lys Tyr Ala Lys 145 150 155 160 Lys Pro Arg Ile His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Glu Ile His Met Lys 165 170 175 Phe Lys Leu Lys Met Ser Arg Asp Glu Val Val Glu Lys Ala Arg Ser 180 185 190 Met Val Ala Tyr Ala Arg Ser Ile Gly Cys Glu Asp Val Glu Phe Ser 195 200 205 Pro Glu Asp Ala Gly Arg Ser Asp Pro Glu Phe Leu Tyr His Ile Leu 210 215 220 Gly Glu Val Ile Lys Ala Gly Ala Thr Thr Leu Asn Ile Pro Asp Thr 225 230 235 240 Val Gly Tyr Thr Val Pro Ser Glu Phe Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ile 245 250 255 Lys Ala Asn Thr Pro Gly Ile Gly Asp Val Ile Ile Ser Thr His Cys 260 265 270 Gln Asn Asp Leu Gly Leu Ser Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gly Ala Cys 275 280 285 Ala Gly Ala Arg Gln Val Glu Val Thr Ile Asn Gly Ile Gly Glu Arg 290 295 300 Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Met Ala Leu Lys Cys Arg 305 310 315 320 Gly Glu Gln Val Leu Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Ile Asn Thr Gln His 325 330 335 Ile Leu Met Ser Ser Lys Met Val Glu Glu Tyr Thr Gly Leu His Val 340 345 350 Gln Pro His Lys Ala Ile Val Gly Ala Asn Ala Phe Ala His Glu Ser 355 360 365 Gly Ile His Gln Asp Gly Met Leu Lys His Lys Asp Thr Tyr Glu Ile 370 375 380 Ile Ser Pro Glu Asp Ile Gly Leu Asn Arg Val Asn Glu Ser Gly Ile 385 390 395 400 Val Leu Gly Lys Leu Ser Gly Arg His Ala Leu Gln Ala Lys Met Leu 405 410 415 Glu Leu Gly Tyr Asp Ile Glu Gly Lys Glu Leu Glu Asp Leu Phe Trp 420 425 430 Arg Phe Lys Ser Val Ala Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Asp Asp Asp 435 440 445 Leu Ile Ala Leu Met Ser Asp Glu Val Phe Gln Pro Gln Phe Val Trp 450 455 460 Gln Leu Glu Asn Val Gln Val Thr Cys Gly Ser Leu Gly Leu Ser Thr 465 470 475 480 Ala Thr Val Lys Leu Ile Asp Ala Asp Gly Gln Glu His Val Ser Cys 485 490 495 Ser Val Gly Thr Gly Pro Val Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Val Asp Leu 500 505 510 Ile Val Lys Val Pro Val Ala Leu Leu Glu Tyr Ser Leu Asn Ala Val 515 520 525 Thr Glu Gly Ile Asp Ala Ile Ala Ser Thr Arg Val Leu Ile Arg Gly 530 535 540 Glu Asn Gly His Thr Ser Thr His Ala Leu Thr Gly Glu Thr Val His 545 550 555 560 Arg Ser Phe Ser Gly Thr Gly Ala Asp Met Asp Ile Val Ile Ser Ser 565 570 575 Val Arg Ala Tyr Ile Gly Ala Leu Asn Lys Met Leu Ser Phe Arg Lys 580 585 590 Leu Val Ser Lys His Ser Lys Pro Glu Gly Ser Ala Val Val 595 600 605 <210> 14 <211> 1821 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 14 atggcgtcta tcaccgcaaa ccatacattt tcccgtaacc ctaacatctc attgcatccc 60 caaaatcctc tcattcaaac ccaagctctc ttcaacttca aatcatcaat ccccaaatgt 120 tcccctatta tctgctgcgc aatccgccgt cgacccgact ataccccgag ccacattccc 180 gacccgaaat acatccgcat cttcgacacc actctccgcg acggcgaaca atctccaggc 240 gccacaatga ccacaaaaga aaaactcgac gttgcgcgtc agttagctaa gcttggtgtt 300 gacataattg aagccggttt tcctgcttct tctgaagctg atctcgaagc tgtgaaatta 360 atagcgaagg aagttggaaa tggtgtgtat gaagagggac atgttccggt aatctgtgga 420 cttgcgaggt gtaataagag ggatattgat aaggcttggg aggctgtgaa gtatgcgaaa 480 aaaccgagga ttcatacgtt tattgcgact agtgagatac atatgaagtt taagttgaag 540 atgagtagag atgaagttgt ggagaaagct agaagtatgg ttgcttatgc taggagtatt 600 ggttgtgagg atgttgaatt tagccctgaa gatgctggaa gatctgatcc tgagttcctc 660 tatcatatcc ttggagaggt catcaaagct ggggcaacaa cccttaacat ccctgatact 720 gttggataca ctgttcccag tgaatttgga aaattgatcg ctgatataaa ggccaatacc 780 ccaggaattg gagatgtgat catctcaacg cactgccaga acgatcttgg gctttctact 840 gccaacacct tagctggagc atgtgcaggt gcaagacaag tagaagtgac catcaatgga 900 atcggtgaaa gagctggaaa tgcttctttg gaggaggttg taatggcctt aaaatgtcgt 960 ggagagcaag tactaggtgg cctgtataca ggaattaata cacaacatat actcatgtca 1020 agcaagatgg tagaggagta caccgggctt catgtgcagc cacacaaggc cattgttgga 1080 gctaatgctt ttgctcatga aagtggcatc catcaggatg gaatgttaaa acacaaagat 1140 acatatgaga ttatatctcc tgaagatatt gggcttaacc gagctaatga atctggtatc 1200 gtcctcggga aactcagtgg gcgtcatgct ttgcaagcca aaatgctcga gcttggatac 1260 gatattgagg gaaaagaact tgaggacctc ttttggcgat tcaaatctgt ggctgagaag 1320 aaaaagaaaa ttacagatga tgacctgata gcattgatgt cagatgaagt tttccagcct 1380 caatttgttt ggcaactcga aaatgtacag gttacatgtg gaagtcttgg cctttctacg 1440 gcaactgtta agctcattga cgctgatggt caagagcatg tttcttgttc tgttggaacg 1500 gggccagttg atgcggctta caaggcagtt gatctcattg taaaggtacc tgtagcacta 1560 cttgaatatt ccttgaatgc agtcacggaa ggtatagatg ccatagcttc aaccagagtt 1620 ttaattcgtg gggagaatgg acatacatca acccatgctt taactggaga gactgtacac 1680 cgttcgttta gtggaaccgg agcagatatg gatattgtta tctctagtgt ccgagcctat 1740 attggagcat tgaataagat gctgagtttc agaaagctgg tgtcgaaaca cagcagacct 1800 gaaggcagtg cagtcgtata g 1821 <210> 15 <211> 606 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 15 Met Ala Ser Ile Thr Ala Asn His Thr Phe Ser Arg Asn Pro Asn Ile 1 5 10 15 Ser Leu His Pro Gln Asn Pro Leu Ile Gln Thr Gln Ala Leu Phe Asn 20 25 30 Phe Lys Ser Ser Ile Pro Lys Cys Ser Pro Ile Ile Cys Cys Ala Ile 35 40 45 Arg Arg Arg Pro Asp Tyr Thr Pro Ser His Ile Pro Asp Pro Lys Tyr 50 55 60 Ile Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Ser Pro Gly 65 70 75 80 Ala Thr Met Thr Thr Lys Glu Lys Leu Asp Val Ala Arg Gln Leu Ala 85 90 95 Lys Leu Gly Val Asp Ile Ile Glu Ala Gly Phe Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Asp Leu Glu Ala Val Lys Leu Ile Ala Lys Glu Val Gly Asn Gly 115 120 125 Val Tyr Glu Glu Gly His Val Pro Val Ile Cys Gly Leu Ala Arg Cys 130 135 140 Asn Lys Arg Asp Ile Asp Lys Ala Trp Glu Ala Val Lys Tyr Ala Lys 145 150 155 160 Lys Pro Arg Ile His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Glu Ile His Met Lys 165 170 175 Phe Lys Leu Lys Met Ser Arg Asp Glu Val Val Glu Lys Ala Arg Ser 180 185 190 Met Val Ala Tyr Ala Arg Ser Ile Gly Cys Glu Asp Val Glu Phe Ser 195 200 205 Pro Glu Asp Ala Gly Arg Ser Asp Pro Glu Phe Leu Tyr His Ile Leu 210 215 220 Gly Glu Val Ile Lys Ala Gly Ala Thr Thr Leu Asn Ile Pro Asp Thr 225 230 235 240 Val Gly Tyr Thr Val Pro Ser Glu Phe Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ile 245 250 255 Lys Ala Asn Thr Pro Gly Ile Gly Asp Val Ile Ile Ser Thr His Cys 260 265 270 Gln Asn Asp Leu Gly Leu Ser Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gly Ala Cys 275 280 285 Ala Gly Ala Arg Gln Val Glu Val Thr Ile Asn Gly Ile Gly Glu Arg 290 295 300 Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Met Ala Leu Lys Cys Arg 305 310 315 320 Gly Glu Gln Val Leu Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Ile Asn Thr Gln His 325 330 335 Ile Leu Met Ser Ser Lys Met Val Glu Glu Tyr Thr Gly Leu His Val 340 345 350 Gln Pro His Lys Ala Ile Val Gly Ala Asn Ala Phe Ala His Glu Ser 355 360 365 Gly Ile His Gln Asp Gly Met Leu Lys His Lys Asp Thr Tyr Glu Ile 370 375 380 Ile Ser Pro Glu Asp Ile Gly Leu Asn Arg Ala Asn Glu Ser Gly Ile 385 390 395 400 Val Leu Gly Lys Leu Ser Gly Arg His Ala Leu Gln Ala Lys Met Leu 405 410 415 Glu Leu Gly Tyr Asp Ile Glu Gly Lys Glu Leu Glu Asp Leu Phe Trp 420 425 430 Arg Phe Lys Ser Val Ala Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Asp Asp Asp 435 440 445 Leu Ile Ala Leu Met Ser Asp Glu Val Phe Gln Pro Gln Phe Val Trp 450 455 460 Gln Leu Glu Asn Val Gln Val Thr Cys Gly Ser Leu Gly Leu Ser Thr 465 470 475 480 Ala Thr Val Lys Leu Ile Asp Ala Asp Gly Gln Glu His Val Ser Cys 485 490 495 Ser Val Gly Thr Gly Pro Val Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Val Asp Leu 500 505 510 Ile Val Lys Val Pro Val Ala Leu Leu Glu Tyr Ser Leu Asn Ala Val 515 520 525 Thr Glu Gly Ile Asp Ala Ile Ala Ser Thr Arg Val Leu Ile Arg Gly 530 535 540 Glu Asn Gly His Thr Ser Thr His Ala Leu Thr Gly Glu Thr Val His 545 550 555 560 Arg Ser Phe Ser Gly Thr Gly Ala Asp Met Asp Ile Val Ile Ser Ser 565 570 575 Val Arg Ala Tyr Ile Gly Ala Leu Asn Lys Met Leu Ser Phe Arg Lys 580 585 590 Leu Val Ser Lys His Ser Arg Pro Glu Gly Ser Ala Val Val 595 600 605

Claims (15)

  1. 분비모 특이 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 구조체를 포함하는 돌연변이 담배 식물 세포, 비자연적으로 발생하는 담배 식물 세포, 또는 형질전환 담배 식물 세포로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 (a) 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하거나; (b) 이소프로필말레이트 합성효소의 발현을 감소시키거나 억제하며;
    상기 이소프로필말레이트 합성효소는 SEQ ID NO:2의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는, 돌연변이 담배 식물 세포, 비자연적으로 발생하는 담배 식물 세포, 또는 형질전환 담배 식물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분비모 특이 프로모터는, SEQ ID NO:8 서열을 포함하거나 이로부터 구성되는 것인, 돌연변이 담배 식물 세포, 비자연적으로 발생하는 담배 식물 세포, 또는 형질전환 담배 식물 세포.
  3. 제1항에 따른 담배 식물세포를 포함하는, 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물.
  4. 적어도 담배 식물의 일부에서 수크로오스 에스테르의 양 또는 유형을 조절하기 위한 방법으로서,
    (i) 분비모 특이 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 구조체로 담배 식물을 형질전환 함으로써, 담배 식물에서 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하는 단계로,
    상기 폴리뉴클레오티드는 (a) 이소프로필말레이트 합성효소를 인코딩하거나; (b) 이소프로필말레이트 합성효소의 발현을 감소시키거나 억제하며;
    상기 이소프로필말레이트 합성효소는 SEQ ID NO:2의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 얻은 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물의 적어도 일부에서 하나 이상의 수크로오스 에스테르의 양을 측정하거나 유형을 결정하는 단계; 그리고
    (iii) 이소프로필말레이트 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되지 않은 대조식물과 비교했을 때, 거기에 하나 이상의 수크로오스 에스테르의 양 또는 유형이 변형된, 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물을 식별하는 단계로, 여기서 상기 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물의 시각적 외관은 대조식물과 동일한 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 수크로오스 에스테르는 하기의 구조식을 갖는 것인 방법:
    Figure 112018102674014-pct00035

    여기서 R3는 아세틸 또는 수소이고, 하나 이상의 R1, R2 및 R4는 6개의 탄소를 가지는 하나 이상의 아실사슬을 포함하고; 그리고 R5는 아세틸 또는 수소이다.
  6. 제4항에 있어서, R3는 아세틸이고; 하나 이상의 R1, R2 및 R4는 베타-메틸발레릴을 포함하고; 그리고 R5는 수소인, 방법.
  7. 제4항에 따른 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는, 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물.
  8. 제3항 또는 제7항에 따른 담배 식물로부터의 세포 또는 조직을 포함하는, 바이오매스, 종자 또는 잎을 포함하는 식물재료.
  9. 제3항 또는 제7항에 따른 담배 식물의 일부를 포함하는 담배물품.
  10. 하나 이상의 수크로오스 에스테르를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    (i) 제3항에 따른 적어도 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물의 일부를 제공하는 단계;
    (ii) 그로부터 수크로오스 에스테르를 추출하는 단계; 그리고
    (iii) 추출된 수크로오스 에스테르를 분리하거나 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 하나 이상의 수크로오스 에스테르를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    (i) 제7항에 따른 적어도 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물의 일부를 제공하는 단계;
    (ii) 그로부터 수크로오스 에스테르를 추출하는 단계; 그리고
    (iii) 추출된 수크로오스 에스테르를 분리하거나 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 여기서 하나 이상의 수크로오스 에스테르는 하기의 구조식을 갖는 것인 방법:
    Figure 112018102674014-pct00036

    여기서 R3은 아세틸 또는 수소이고; 하나 이상의 R1, R2 및 R4는 6개의 탄소를 가지는 아실사슬을 포함하고; 그리고 R5는 아세틸 또는 수소를 포함하는 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, R3는 아세틸이고; 하나 이상의 R1, R2 및 R4는 베타-메틸발레릴을 포함하고; 그리고 R5는 수소인, 방법.
  14. 담배 또는 담배물품의 풍미를 조절하기 위한 방법으로서,
    (i) 제3항 또는 제7항에 따른 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물로부터 담배 또는 담배물품, 식물의 일부를 첨가하는 단계; 또는 (ii) 제10항 또는 제11항의 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 수크로오스 에스테르를 포함하는, 담배 또는 담배물품을 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 베타-메틸발레릭산을 제조하기 위한 방법으로서,
    (i) 제3항 또는 제7항에 따른 돌연변이 담배 식물, 비자연적으로 발생하는 담배 식물, 또는 형질전환 담배 식물의 일부를 제공하는 단계;
    (ii) (i)에서 제공되는 재료 또는 단계 그의 추출물을 가수분해하는 단계; 및
    (iii) 베타-메틸발레릭산을 분리하거나 정제하는 단계를 포함하는 방법.
KR1020147008614A 2011-09-02 2012-08-31 니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 및 그의 방법 및 용도 KR102012993B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11179882A EP2565265A1 (en) 2011-09-02 2011-09-02 Isopropylmalate synthase from Nicotiana tabacum and methods and uses thereof
EP11179882.3 2011-09-02
PCT/EP2012/003662 WO2013029799A1 (en) 2011-09-02 2012-08-31 Isopropylmalate synthase from nicotiana tabacum and methods and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140067082A KR20140067082A (ko) 2014-06-03
KR102012993B1 true KR102012993B1 (ko) 2019-08-21

Family

ID=46832334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147008614A KR102012993B1 (ko) 2011-09-02 2012-08-31 니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 및 그의 방법 및 용도

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10287599B2 (ko)
EP (3) EP2565265A1 (ko)
JP (2) JP2014531200A (ko)
KR (1) KR102012993B1 (ko)
CN (1) CN103958673B (ko)
AU (1) AU2012301349B2 (ko)
BR (1) BR112014004827A8 (ko)
ES (1) ES2742271T3 (ko)
IL (1) IL231101B (ko)
IN (1) IN2014CN01706A (ko)
MX (1) MX365497B (ko)
MY (1) MY172423A (ko)
PL (1) PL2751262T3 (ko)
RU (1) RU2644238C2 (ko)
SG (1) SG11201400209UA (ko)
TR (1) TR201910626T4 (ko)
UA (1) UA116437C2 (ko)
WO (1) WO2013029799A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312805A (zh) * 2017-02-07 2019-10-08 肯塔基大学研究基金会 方法
CN108070594B (zh) * 2017-12-22 2020-10-27 河南农业大学 烟草腺毛ttr1启动子、其表达载体及其应用
CN111801423A (zh) 2018-03-28 2020-10-20 菲利普莫里斯生产公司 调节植物中的氨基酸含量
JP2021519064A (ja) 2018-03-28 2021-08-10 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物体における還元糖含有量の調節
EP3902390A1 (en) 2018-12-30 2021-11-03 Philip Morris Products S.A. Modulation of nitrate levels in plants via mutation of nitrate reductase
CN110610743A (zh) * 2019-08-16 2019-12-24 广东省生态环境技术研究所 一种构建铬还原酶蛋白数据库的方法
EP4041896A1 (en) 2019-10-01 2022-08-17 Philip Morris Products S.A. Modulating reducing sugar content in a plant (inv)
KR20220071260A (ko) 2019-10-01 2022-05-31 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. 식물 내 당 및 아미노산 (sultr3) 함량 조절
US20230136941A1 (en) * 2020-04-07 2023-05-04 Board Of Trustees Of Michigan State University Improving plant nutritional value and growth through enhancement of essential amino acid levels
KR102527102B1 (ko) * 2021-03-05 2023-04-28 씨제이제일제당 주식회사 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
WO2023036691A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2766145A (en) * 1954-07-26 1956-10-09 Reynolds Tobacco Co R Tobacco
JPS5231959B2 (ko) * 1973-10-27 1977-08-18
US5260281A (en) 1992-05-01 1993-11-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Biological pesticide derived from Nicotiana plants
RU2143496C1 (ru) 1993-06-30 1999-12-27 Моген Интернэшнл Н.В. Продуцирование трегалозы в растениях
AU3006095A (en) 1994-07-11 1996-02-09 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture, The Chemically synthesized sugar esters for the control of soft-bodied arthropods
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US6586661B1 (en) 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
DK1161539T3 (da) 1999-03-15 2005-11-28 Univ Laval Fremgangsmåde til at fremstille polyhydroxyalkanoater i rekombinante organismer
US7025066B2 (en) 2002-10-31 2006-04-11 Jerry Wayne Lawson Method of reducing the sucrose ester concentration of a tobacco mixture
WO2006091194A1 (en) 2005-02-23 2006-08-31 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
US20070137663A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-21 R. J. Reynolds Tobacco Company Method of extracting sucrose esters from oriental tobacco
WO2008034648A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
AU2007329776B2 (en) 2006-10-13 2013-05-16 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome P450 genes
RU2324737C1 (ru) * 2006-10-18 2008-05-20 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина
RU2324736C1 (ru) 2006-10-18 2008-05-20 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина
BRPI0820042B1 (pt) 2007-11-12 2020-05-19 North Carolina State University método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana
AP3226A (en) 2007-12-13 2015-04-30 Philip Morris Products Sa Transgenic plants modifier for reducede cadmium transport, derivative products, and related methods
WO2010042575A1 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US7883371B1 (en) 2009-07-22 2011-02-08 Hon Hai Precision Ind. Co., Ltd. Electrical connector with improved contact footprints

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEN FIELD 등, PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 60, no. 5, pages 717 - 727 (2006.03.01.),
KROUMOVA, WAGNER, GENERAL AND APPLIED PLANT PHYSIOLOGY, vol. 35, no. 3-4, pages 95 - 110 (2009)*
M. MAZOUREK 등, PLANT PHYSIOLOGY, vol. 150, no. 4, pages 1806 - 1821 (2009.08.01.)

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201400209UA (en) 2014-03-28
MX365497B (es) 2019-06-05
IL231101B (en) 2018-10-31
CN103958673B (zh) 2021-10-26
EP3578645A1 (en) 2019-12-11
RU2644238C2 (ru) 2018-02-08
US20140352706A1 (en) 2014-12-04
EP2751262A1 (en) 2014-07-09
EP2751262B1 (en) 2019-06-12
UA116437C2 (uk) 2018-03-26
KR20140067082A (ko) 2014-06-03
AU2012301349A1 (en) 2014-03-20
EP2565265A1 (en) 2013-03-06
ES2742271T3 (es) 2020-02-13
WO2013029799A1 (en) 2013-03-07
RU2014112234A (ru) 2015-10-10
JP2018186820A (ja) 2018-11-29
MX2014002497A (es) 2014-12-04
CN103958673A (zh) 2014-07-30
JP2014531200A (ja) 2014-11-27
BR112014004827A2 (pt) 2017-04-04
TR201910626T4 (tr) 2019-08-21
IN2014CN01706A (ko) 2015-05-29
MY172423A (en) 2019-11-25
BR112014004827A8 (pt) 2018-03-13
AU2012301349B2 (en) 2015-09-17
US10287599B2 (en) 2019-05-14
IL231101A0 (en) 2014-04-30
JP7000265B2 (ja) 2022-02-04
PL2751262T3 (pl) 2020-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102012993B1 (ko) 니코티아나 타바쿰으로부터의 이소프로필말레이트 합성효소 및 그의 방법 및 용도
EP2611824B1 (en) Heavy metal reduction in planta
KR102012531B1 (ko) 니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소 및 그의 방법 및 용도
JP6302407B2 (ja) 植物におけるβ−ダマセノンの調節
US11685929B2 (en) Plants with shortened time to flowering
US20210115461A1 (en) Modulating amino acid content in a plant
RU2801948C2 (ru) Модулирование содержания редуцирующих сахаров в растении
RU2792235C2 (ru) Растения с сокращенным периодом времени до наступления цветения
KR20200136924A (ko) 식물 내 환원당 함량 조절
EP2586792A1 (en) Modulating beta-damascenone in plants

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant