KR20200136924A - 식물 내 환원당 함량 조절 - Google Patents

식물 내 환원당 함량 조절 Download PDF

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KR20200136924A
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아우로레 힐피커
루시앙 보베
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필립모리스 프로덕츠 에스.에이.
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Abstract

(i) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드; (iii) 서열번호 2와 적어도 94% 서열 동일성; 또는 서열번호 4와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 6과 적어도 95% 서열 동일성; 또는 서열번호 8과 적어도 96% 서열 동일성; 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 14와 적어도 95% 서열 동일성; 또는 서열번호 16과 적어도 96% 서열 동일성; 또는 서열번호 18와 적어도 89% 서열 동일성; 또는 서열번호 20과 적어도 92% 서열 동일성; 또는 서열번호 22와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 24와 적어도 94% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터;를 포함하고 있는, 식물 세포가 본원에 기재되어 있고, 여기서 상기 식물 세포는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성이 변형되지 않은 대조군 식물 세포와 비교하여 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 조절하는 적어도 하나의 변형을 포함하고 있다.

Description

식물 내 환원당 함량 조절
본 발명은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래 수크로오스 신타아제(sucrose synthase, SUS)를 암호화하는 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체 및 단편을 개시하고 있다. 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열과 그의 변이체, 상동체 및 단편도 개시되어 있다. 식물 또는 그의 일부 내에서 환원당의 수준을 조절하기 위해 하나 이상의 NtSUS 유전자의 발현 또는 그에 의해 암호화된 NtSUS 폴리펩타이드(들)의 기능 또는 활성을 조절하는 것이 또한 개시되어 있다.
에어로졸 및 연기 내의 향미 화합물의 방출이 변경되는 담배 물질을 생산하기 위한 본 기술분야의 계속된 요구가 있다. 또한, 에어로졸 및 연기 내의 아크릴아미드의 방출이 변경되는 담배 물질을 생산하기 위한 본 기술분야의 계속된 요구가 있다.
본 발명은 이들 및 다른 요구를 다루고자 한다.
수크로오스 신타아제(sucrose synthase, SUS)는 수크로오스 합성(sucrose synthesis)에 관여하는 핵심 효소이며 경화된 담배 잎에서 환원당(reducing sugar)- 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스 및 말토오스-의 축적을 유도하는 핵심 효소이다. SUS의 발현을 조절하여, 담배 잎의 경화 동안 및 후에 환원당의 풀(pool)을 조절할 수 있다. 경화된 담배에서 환원당의 변경된 함량은 가열 시 얻어진 담배 향미에 대한 상이한 인식을 초래할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, NtSUS 유전자는 경화 동안 과발현되는 반면, 다른 것들은 그렇지 않고 환원당의 수준을 조절하는 데 기여하지 않을 것이다. 그러나, 이들 유전자는 다른 대사 경로에 관여할 가능성이 있으며 이들의 발현 변화는 농업적으로 해로운 (예를 들어, 느린 생장) 표현형을 초래할 수 있다. 어느 NtSUS 유전자가 경화 동안 과발현되는지 아는 것은 유리하게는 관련된 유전자들에서만 변화를 갖는 식물의 선별을 허용하고 다른 대사 과정에 대한 잠재적인 부정적 영향을 감소시킨다.
NtSUS1 -S (서열번호 1), NtSUS1 -T (서열번호 3), NtSUS2 -S (서열번호 5), NtSUS2-T (서열번호 7), NtSUS3 -S (서열번호 9), NtSUS3 -T (서열번호 11), NtSUS4 -S (서열번호 13), NtSUS4 -T (서열번호 15), NtSUS5 -S (서열번호 17), NtSUS5 -T (서열번호 19), NtSUS6 -S (서열번호 21) 및 NtSUS6 - T (서열번호 23)를 포함한, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 수개의 SUS 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열이 본원에 기술되어 있다. NtSUS1-S (서열번호 2), NtSUS1-T (서열번호 4), NtSUS2-S (서열번호 6), NtSUS2-T (서열번호 8), NtSUS3-S (서열번호 10), NtSUS3-T (서열번호 12), NtSUS4-S (서열번호 14), NtSUS4-T (서열번호 16), NtSUS5-S (서열번호 18), NtSUS5-T (서열번호 20), NtSUS6-S (서열번호 22) 및 NtSUS6-T (서열번호 24)에 대한 대응하는 추론된(deduced) 폴리펩타이드 서열을 또한 개시하고 있다. NtSUS2 -S, NtSUS2 -T, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T, NtSUS4 -S 및 NtSUS4 -T은 경화 동안 당 대사에서 역할을 할 수도 있다. NtSUS2 -S, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T 및 NtSUS4 -S이, 특히, 경화 동안 당 대사에서 역할을 하는 것으로 나타난다. 담배 경화 동안, 열건 담배는 보통 버지니아 담배에서 주로 높은 전분 축적으로 인한 음건된 담배보다 적어도 8배 많은 환원당을 함유하고 있다. 그러나 식물 수확 후 및 노화 과정 동안, 전분의 큰 부분이 먼저 수크로오스로 변환되고, 그런 다음 SUS와 관련된 환원당으로, 뿐만 아니라 수크로오스 대사에 대한 핵심 효소로서, 인버타제로 변환될 가능성이 있다. 따라서, 본 개시내용은 경화된 식물 물질 내의 환원당 함량을 조절하는데 특히 유용하다.
일 측면에서, (i) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에서 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드; (iii) 서열번호 2와 적어도 94% 서열 동일성; 또는 서열번호 4와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 6과 적어도 95% 서열 동일성; 또는 서열번호 8과 적어도 96% 서열 동일성; 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 14와 적어도 95% 서열 동일성; 또는 서열번호 16과 적어도 96% 서열 동일성; 또는 서열번호 18와 적어도 89% 서열 동일성; 또는 서열번호 20과 적어도 92% 서열 동일성; 또는 서열번호 22와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 24와 적어도 94% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에서 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터;를 포함하는 식물 세포가 기재되어 있고, 여기서 상기 식물 세포는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성이 변형되지 않은 대조군 식물 세포와 비교하여 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 조절하는 적어도 하나의 변형을 포함하고 있다.
또한 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 69% 서열 동일성; 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8과 적어도 80% 서열 동일성; 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 74% 서열 동일성; 또는 서열번호 14 또는 서열번호 16과 적어도 76% 서열 동일성; 또는 서열번호 18 또는 서열번호 20과 적어도 68% 서열 동일성; 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24와 적어도 69% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 기재되어 있다.
적절하게는, 상기 식물 세포는 서열번호 5 또는 서열번호 13과 적어도 80% 서열 동일성 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있다.
적절하게는, 상기 식물 세포는 서열번호 6과 적어도 81% 서열 동일성, 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 72% 서열 동일성, 또는 서열번호 14와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드를 포함하고 있다.
적절하게는, 상기 식물 세포는 서열번호 6과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 74% 서열 동일성, 또는 서열번호 14와 적어도 76% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드를 포함하고 있다.
적절하게는, 적어도 하나의 변형은 식물 세포의 게놈의 변형, 또는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터의 변형, 또는 유전자이식(transgenic) 변형이다.
적절하게는, 식물 세포의 게놈의 변형, 또는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터의 변형은 돌연변이 또는 편집이다.
적절하게는, 변형은 대조군 식물 세포와 비교해서 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 증가 또는 감소시킨다.
적절하게는, 식물 세포는 청구항 1(i)의 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA의 적어도 19개의 뉴클레오타이드와 적어도 80% 상보적인 서열을 포함하는 간섭 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있다.
적절하게는, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 조절된 발현 또는 활성은 대조군 식물로부터 유래된 잎의 환원당의 수준과 비교하여, 식물 세포로부터 유래된 잎의 환원당의 수준을 조절하며, 적절하게는 여기서 상기 환원당은 글루코오스 또는 프룩토오스거나 적절하게는, 상기 잎은 경화 초기 또는 경화된 잎이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 식물 세포를 포함하는 식물 또는 그의 일부가 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 식물 또는 그의 일부로부터 유래된, 식물 물질, 경화된 식물 물질, 또는 균질화 식물 물질이 기재되어 있다.
적절하게는, 식물 물질은 본원에 기재된 식물 또는 그의 일부로부터의 바이오매스, 종자, 줄기, 꽃 또는 잎을 포함하고 있다.
적절하게는, 경화된 식물 물질은 열건(flue-cured), 양건(sun-cured) 또는 음건(air-cured) 식물 물질이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 식물 세포, 본원에 기재된 식물의 일부 또는 본원에 기재된 식물 물질을 포함하는 담배 제품이 기재되어 있다.
추가 측면에서, 본원에 기재된 식물을 생산하기 위한 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 (a) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물 세포를 제공하는 단계; (b) 식물 세포를 변형시켜서 대조군 식물 세포와 비교하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 단계; 및 (c) 식물 세포를 식물 내로 번식시키는 단계를 포함하고 있다.
적절하게는, 단계 (c)는 식물 세포를 포함하는 삽목(cutting) 또는 묘목(seedling)으로부터 식물을 재배하는 단계를 포함하고 있다.
적절하게는, 식물 세포를 변형시키는 단계는 게놈 편집 또는 게놈 조작에 의해 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하고 있다.
적절하게는, 게놈 편집 또는 게놈 조작은 CRISPR/Cas 기술, 아연 핑거 뉴클레아제-매개 돌연변이유발, 화학적 또는 방사선 돌연변이유발, 상동성 재조합, 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이유발 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이유발로부터 선택된다.
적절하게는, 식물 세포를 변형시키는 단계는 구성적 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물로 상기 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하고 있다.
적절하게는, 식물 세포를 변형시키는 단계는 청구항 1(i)의 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA와 적어도 80% 상보적인 서열을 포함하는 간섭 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고 있다.
적절하게는, 식물 세포는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA의 적어도 19개의 뉴클레오타이드와 적어도 80% 상보적인 서열을 포함하는 간섭 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 작제물로 형질감염된다.
또 다른 측면에서, 대조군 식물 물질에 비해 환원당의 변경된 양을 갖는 경화된 식물 물질을 생산하기 위한 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 (a) 본원에 기재된 식물 또는 그의 일부 또는 식물 물질을 제공하는 단계; (b) 그로부터 식물 물질을 수확하는 단계; 및 (c) 상기 식물 물질을 경화시키는 단계를 포함하고 있다.
적절하게는, 식물 물질은 경화된 잎, 경화된 줄기 또는 경화된 꽃, 또는 이들의 혼합물을 포함하고 있다.
적절하게는, 경화 방법은 음건, 화건, 훈연 경화 및 열건으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 유리한 점
유리하게는, 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 서열은 경화 동안, 특히 경화 시작에서부터 고도로 발현될 수 있다. 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 것은 경화된 잎 속의 환원당- 예컨대 글루코오스 및 프룩토오스-의 조절된 수준을 초래할 수 있다. 특히, 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드의 발현 증가 또는 감소는 환원당의 증가되거나 감소된 수준 및 가열 시 얻어진 담배에 대한 상이한 인식을 초래할 수 있다.
궐련 연기에서, 환원당은 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세톤, 2-푸푸랄 및 아크롤레인 (The Chemical Components of Tobacco and Tobacco Smoke, 2nd Edition, Rodgman and Perfetti, 2016 참조). 따라서 환원당 함량을 변경하는 것은 이러한 카르보닐 화합물의 방출을 변화시킬 수 있다. 에어로졸 및 연기에서의 향기(aroma) 방출과 관련하여, 글루코오스 및 보다 적은 정도의 프룩토오스가 가열 시 아미노산과 상호작용하는 경우 마이야르(Maillard) 반응을 통해 아마도리(Amadori) 화합물을 생성할 수 있다. 비록 유리 아미노산이 이러한 화학 반응의 제한 인자로서 고려되지만, 환원당의 존재가 아마도리 화합물의 형성을 허용하는데 필요하다. 빵, 견과 또는 팝콘 같은 향미가 프롤린 및 글루코오스 가열로부터 생성되어, 2-아세틸-1-피롤리돈 같은 산물을 생성한다. 프롤린 및 환원당은 열건 담배에서 특히 풍부하므로, 버지니아 담배를 가열하거나 흡연할 때, 견과 향기(note)가 얻어진다. 배합물에서, 아크릴아미드(가열 시 아스파라긴과 글루코오스(프룩토오스)의 상호작용으로부터 기인하는 발암성 화합물)는 통상적으로 버지니아(고 환원당) 담배와 버얼리(고 아스파라긴)의 조합으로부터 기인할 수 있다. 따라서, 환원당 대 아미노산 균형을 변형하면 에어로졸 및 연기에서 향미 화합물과 아크릴아미드 모두의 방출에 영향을 미칠 수 있다.
유리하게는, 가열된 담배의 재조합된 담배 물질은 적절한 캐스트 잎 제조를 위해 환원당을 종종 필요로 한다. 잎 경화 동안 SUS 유전자의 발현을 조절하면 환원당의 함량 및 균형에 영향을 미칠 수 있어서, 캐스트 잎 제조에 영향을 미칠 수 있다. 유리하게는, 소비자에게 더 많이 수용될 수 있는 비-유전적 변형된 식물이 생성될 수 있다.
유리하게는, 본 개시내용은 EMS 돌연변이 식물의 사용에 한정되지 않는다. EMS 돌연변이 식물은 번식 후 농작물에 개선된 특성을 줄 수 있는 가능성이 적을 수 있다. 일단 번식이 시작되면, EMS 돌연변이 식물의 바람직한 특성(들)은 상이한 이유로 손실될 수 있다. 예를 들어, 여러 돌연변이가 필요할 수 있고, 돌연변이는 우성 또는 열성일 수 있으며, 유전자 표적에서 점 돌연변이의 확인은 도달하기 어려울 수 있다. 대조적으로, 본 개시내용은 바람직한 표현형을 가지는 식물을 생성하기 위하여 특이적으로 조작될 수 있는 NtAAT 폴리뉴클레오타이드의 사용을 탐색한다. 본 개시내용은 다양한 식물 품종 또는 작물에 적용될 수 있다.
도 1은 수확 후(숙성), 경화 2일 후 (48시간 경화), 경화 종료 시점에 환원당의 품종 당 함량을 보여주는 막대 그래프이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 단락 앞머리들은 단지 편성을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다.
1. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적인 용어 및 과학적인 용어들은 당업자가 보편적으로 의미하는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충하는 경우, 정의를 비롯한 본 문헌이 좌우할 것이다. 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술되어 있으며, 그렇더라도 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 예들은 단지 예시적일 뿐, 제한하려는 것이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(포함한다)," "수반하다(수반한다)," "가진," "가진다," "할 수 있다," "함유하다(함유한다)" 및 이들의 변형된 표현들은 부가적인 작용 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형의 연결(transitional) 구어, 용어 또는 단어이고자 한다.
단수형("a," "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다.
용어 “및/또는”은 (a) 또는 (b) 또는 (a) 및 (b) 둘 모두를 의미한다.
본 개시내용은 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는," "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는" 다른 구현예들이 명쾌하게 나타나 있거나 나타나 있지 않든지 간에 이러한 다른 구현예들을 고려한다.
본원에서 수치 범위의 언급을 위해, 이들 사이의 각각의 중간 수(intervening number)는 동일한 정밀도를 가지고 있으며 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 있어서, 6 및 9 외에도 수 7 및 8이 고려되고, 6.0 내지 7.0의 범위에 있어서, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.
명세서 및 청구항 전체에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 하기 의미들을 가진다:
“코딩 서열” 또는 “암호화하는 폴리뉴클레오타이드”는 폴리펩타이드를 암호화하는(encode) 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있는 뉴클레오타이드(RNA 또는 DNA 분자)를 의미한다. 코딩 서열은, 폴리뉴클레오타이드가 투여되는 개체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있다.
“상보체” 또는 “상보적”은 왓슨-크릭(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 간의 Hoogsteen 염기 쌍을 의미할 수 있다. "상보성"은, 2개의 폴리뉴클레오타이드들이 서로 역평행하게 정렬된 경우, 각각의 위치의 뉴클레오티드 염기들이 상보적이 되도록, 2개의 폴리뉴클레오타이드들이 사이에 공유된 특성을 지칭한다.
"작제물(construct)"은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이중가닥, 재조합 폴리뉴클레오타이드 단편을 지칭한다. 작제물은 상보적인 "센스 또는 코딩 가닥"으로 염기쌍을 이룬 "주형 가닥(template strand)"을 포함한다. 주어진 작제물은 2개의 가능한 배향으로, 벡터 - 예컨대 발현 벡터 내에 위치한 프로모터의 배향에 대하여 동일한(또는 센스) 배향 또는 반대의(또는 안티-센스) 배향으로 벡터 내에 삽입될 수 있다.
대조군 식물 또는 대조군 식물 세포의 맥락에서 용어 "대조군"은, 하나 이상의 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현, 기능 또는 활성이 변형(예, 증가 또는 감소)되지 않은 식물 또는 식물 세포를 의미하고, 따라서 대조군은 동일한 하나 이상의 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현, 기능 또는 활성이 변형된 식물과의 비교를 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대조군 식물"은, 시험 파라미터를 제외한 모든 파라미터에서 시험 식물 또는 변형된 식물과 실질적으로 동등한 식물이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 도입된 식물을 지칭할 때, 대조군 식물은 이러한 폴리뉴클레오타이드가 도입되지 않은 동등한 식물이다. 대조군 식물은 대조군 폴리뉴클레오타이드가 도입된 동등한 식물일 수 있다. 이러한 경우, 대조군 폴리뉴클레오타이드는 식물에 대해 표현형 효과를 거의 미치지 않거나 전혀 미치지 않을 것으로 예상되는 폴리뉴클레오타이드이다. 대조군 식물은 빈(empty) 벡터를 포함할 수 있다. 대조군 식물은 야생형 식물에 상응할 수 있다. 대조군 식물은 널 분리물(null segregant)일 수 있으며, 여기서, T1 분리물은 이식유전자를 더 이상 갖지 않는다.
"공여자 DNA" 또는 "공여자 주형"은 관심 유전자의 적어도 일부를 포함하는 이중-가닥 DNA 단편 또는 분자를 지칭한다. 공여자 DNA는 전체-기능성 폴리펩타이드 또는 부분-기능성 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
"내인성 유전자 또는 폴리펩타이드"는 유기체의 게놈으로부터 기원하고 유전 물질의 변화, 예컨대 상실, 획득 또는 교환을 받지 않은 유전자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 내인성 유전자는 정상적인 유전자 전파 및 유전자 발현을 수행한다. 내인성 폴리펩타이드는 정상적인 발현을 겪는다.
"인핸서 서열"은 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 서열을 지칭한다. 이들 서열은 전사되는 영역의 상류, 인트론 내 또는 하류에 위치할 수 있다. 전사되는 영역은 프로모터부터 전사 종결 영역까지 엑손 및 개입 인트론으로 이루어진다. 유전자 발현의 증강은 다양한 메커니즘을 통해 달성될 수 있으며, 이러한 메커니즘으로는 전사 효율의 증가, 성숙 mRNA의 안정화 및 번역 증강이 있다.
"발현"은 기능성 생성물의 생산을 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 단편의 발현은 폴리뉴클레오타이드 단편의 전사(예, mRNA 또는 기능성 RNA를 초래하는 전사) 및/또는 전구체 또는 성숙 폴리펩타이드로의 mRNA의 번역을 지칭할 수 있다. "과발현"은, 동일한 실험으로부터 널 분리(또는 비-유전자이식) 유기체에서의 생성 수준을 초과하는, 유전자이식 유기체에서의 유전자 생성물의 생성을 지칭한다.
"기능성" 및 "전체-기능성"은 생물학적 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩타이드를 설명한다. "기능성 유전자"는 mRNA로 전사되어, 기능성 또는 활성 폴리펩타이드로 번역되는 유전자를 지칭한다.
"유전학적 작제물"은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 코딩 서열은, 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
"게놈 편집"은, 내인성 폴리펩타이드를 암호화하는 내인성 유전자를 변화시켜, 절단된 내인성 폴리펩타이드 또는 아미노산 치환을 가진 내인성 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 발현이 수득되도록 하는 것을 지칭한다. 게놈 편집은, 표적화될 내인성 유전자의 영역을 대체하거나, 전체 내인성 유전자를 HDR와 같은 복구 메커니즘을 이용하여 절단 또는 아미노산 치환을 가진 유전자의 복사본으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 게놈 편집은 또한, 내인성 유전자에 이중 가닥 절단부를 발생시킨 다음, NHEJ을 사용하여 복구시킴으로써, 내인성 유전자에 아미노산 치환을 발생시키는 것을 포함할 수 있다. NHEJ는 아미노산 치환을 발생시킬 수 있는 복구 동안에 적어도 하나의 염기쌍을 첨가하거나 결실시킬 수 있다. 게놈 편집은 또한, 2개의 뉴클레아제 표적 부위들 사이에서 절단을 형성하기 위해 동일한 DNA 가닥 상에서 2개의 뉴클레아제를 동시에 작동시킴으로써 유전자 분절을 결실시키고, DNA 절단부를 NHEJ에 의해 복구시키는 것을 포함할 수 있다.
서열과 관련하여 "이종성"은, 외래 종으로부터 기원하거나, 동일한 종으로부터 기원한다면 정교한 인간 개입에 의해 조성물 및/또는 게놈 유전자좌에서 이의 고유한(native) 형태로부터 실질적으로 변형된 서열을 의미한다.
"상동성-지정 복구" 또는 "HDR"은, DNA의 상동성 조각이 핵에서, 대체로 세포 주기 중 G2기 및 S기에 존재할 때, 이중 가닥 DNA 병변을 복구시키기 위한 세포에서의 메커니즘을 지칭한다. HDR은 복구를 가이드하기 위해 공여자 DNA 또는 공여자 주형을 사용하고, 전체 유전자의 표적화된 첨가를 비롯한 특이적인 서열 변화를 게놈에 형성하는 데 사용될 수 있다. 공여자 주형이 부위 특이적인 뉴클레아제와 함께 제공된다면, 세포 머시너리(cellular machinery)는 절단부를 상동성 재조합에 의해 복구시킬 것이며, 이는 DNA 절단의 존재 시 수 자릿수(several orders of magnitude) 증강된다. 상동성 DNA 조각이 부재하는 경우, NHEJ이 대신 발생할 수 있다.
용어 "상동성(homology)” 또는 “유사성(similarity)"은 서열 정렬(sequence alignment)에 의해서 비교되는 두 개의 폴리펩타이드 사이 또는 두 개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 유사성의 정도를 지칭한다. 비교되는 두 개의 별개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 상동성 정도는 비슷한 위치에서 동일하거나, 매칭되는 뉴클레오타이드의 수의 함수이다.
2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 "동일한(identical)" 또는 "동일성(identity)"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일한 잔기들을 명시된 백분율로 가짐을 의미한다. 백분율은, 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 2개의 서열을 명시된 영역에 걸쳐 비교한 다음, 2개의 서열에서 동일한 잔기가 나타나는 위치의 수를 확인하여 매칭된 위치의 수를 수득하고, 매칭된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열의 길이가 상이하거나, 정렬로 인해 하나 이상의 스태거드 말단(staggered end)이 생성되고 비교되는 명시된 영역이 오로지 단일 서열만 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산식의 분자(numerator)가 아니라 분모(denominator)에 포함된다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티미딘(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동적으로 결정되거나, ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman와 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용함으로써 결정될 수 있다. 대중적인 다수의 정렬 프로그램 ClustalW(Nucleic Acids Research (Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882)은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 다수의 정렬을 생성하기 위한 적합한 방법이다. ClustalW에 대한 적합한 매개변수는 다음과 같을 것이다: 폴리뉴클레오타이드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 15.0, 갭 연장 페널티 = 6.66 및 매트릭스 = Identity. 폴리펩타이드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 10. o, 갭 연장 페널티 = 0.2 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에 대하여: ENDGAP = -1 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위해 이들 및 다른 매개변수를 다르게 하는 것이 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 적합하게는, 백분율 동일성의 계산이 이와 같은 정렬로부터 (N/T)로서 계산되며, 여기서 N은 동일한 잔기를 공유하는 서열이 위치한 위치의 수이고, T는 갭을 포함하지만 돌출부를 배제한 비교된 위치의 총 수이다.
용어 "증가하다(increase)" 또는 "증가된(increased)"은, 폴리펩타이드 기능 또는 활성, 전사 기능 또는 활성, 및/또는 단백질 발현과 같지만 이에 한정되지 않는, 양 또는 기능 또는 활성의, 약 10% 내지 약 99%의 증가, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 150%, 또는 적어도 200% 또는 그 이상의 증가를 지칭한다. 용어 "증가된" 또는 구어 "증가된 양"은, 변형되지 않았으며 동일한 방식으로 가공된 동일한 변종 유래의 식물 또는 제품에서 발견될 양보다 많은, 변형된 식물 또는 변형된 식물로부터 생산된 제품에서의 양 또는 기능 또는 활성을 지칭할 수 있다. 따라서, 일부 맥락에서, 동일한 방식으로 가공된 동일한 변종의 야생형 식물은 양의 증가가 수득되는지 여부를 측정하는 대조군으로서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증가하다(increase)" 또는 "증가된(increased)"은, 폴리펩타이드 기능, 전사 기능 또는 폴리펩타이드 발현과 같은 양 또는 기능의 약 10% 내지 약 99%의 감소, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 또는, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 200% 이상의 감소를 지칭한다. 용어 "감소된" 또는 구어 "감소된 양"은, 변형되지 않았으며 동일한 방식으로 가공된 동일한 변종 유래의 식물 또는 제품에서 발견될 양보다 적은, 변형된 식물 또는 변형된 식물로부터 생산된 제품에서의 양 또는 기능을 지칭할 수 있다. 따라서, 일부 맥락에서, 동일한 방식으로 가공된 동일한 변종의 야생형 식물은 양의 감소가 수득되는지 여부를 측정하는 대조군으로서 사용된다.
용어 "저해하다" 또는 "저해되는"은 폴리펩타이드 기능 또는 활성, 전사 기능 또는 활성 및/또는 폴리펩타이드 발현과 같지만 이에 한정되지 않는, 양 또는 기능 또는 활성의 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 적어도 98%, 적어도 99%, 그러나 특히 100%의 감소를 지칭한다.
용어 "도입된"은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 작제물) 또는 폴리펩타이드를 세포 내로 제공하는 것을 의미한다. 도입된다는 것은, 세포의 게놈 내에 폴리뉴클레오타이드가 혼입될 수 있는 진핵 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 혼입을 지칭하는 것을 포함하고, 세포에의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 일시적인 제공을 지칭하는 것을 포함한다. 도입된다는 것은, 안정한 형질전환 방법 또는 일시적인 형질전환 방법, 뿐만 아니라 유성 교배를 지칭하는 것을 포함한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드(예, 재조합 작제물/발현 작제물)를 세포 내에 삽입하는 맥락에서 "도입되는"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 세포의 게놈(예, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA) 내에 폴리뉴클레오타이드가 혼입되거나, 자동 레플리콘(autonomous replicon)으로 전환되거나, 일시적으로 발현(예, 형질감염된 mRNA)될 수 있는 진핵 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 혼입을 지칭하는 것을 포함한다.
용어 "단리된" 또는 "정제된"은, 물질을 이의 고유한 상태로 발견되는 바와 같이 통상적으로 수반하는 구성성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않는 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 전형적으로, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 확인된다. 조제물에 존재하는 우세 종인 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 원하는 유전자를 측면에 위치시키고 원하는 폴리펩타이드 이외의 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 해독 틀로부터 분리된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시킴을 가리킨다. 특히, 이는, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 적어도 85% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수함을 의미한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 이들 폴리뉴클레오타이드가 천연적으로 발생하는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 알려진 종래의 폴리뉴클레오타이드 정제 방법이 사용되어, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 또한, 이러한 용어는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"조절하다" 또는 "조절하는"은 관심 있는 공정, 경로, 기능 또는 활성의 정성적 또는 정량적 변화, 변경 또는 변형을 야기하거나 촉진하는 것을 의미한다. 제한 없이, 이러한 변화, 변경 또는 변형은 관심 있는 상대적 공정, 경로, 기능 또는 활성의 증가 또는 감소일 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현 또는 폴리펩타이드 발현 또는 폴리펩타이드 기능 또는 활성이 조절될 수 있다. 일반적으로, 상대적인 변화, 변경 또는 변형은 대조군과 비교하여 결정될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-상동성 말단 접합(NHEJ) 경로"는 상동성 주형의 필요 없이도, 절단부 말단들을 직접 연결함으로써 DNA에서 이중-가닥 절단부를 복구하는 경로를 지칭한다. NHEJ에 의한 DNA 말단들의 주형-독립적 재-연결은, DNA 절단부 지점에 랜덤 미세-삽입 및 미세-결실(indel)을 도입하는 확률적인 오류-유발(error-prone) 복구 과정이다. 이러한 방법은 표적화된 유전자 서열의 해독 틀을 의도적으로 방해하거나, 결실시키거나 변경하는 데 사용될 수 있다. NHEJ는 전형적으로, 복구를 가이드하기 위해 미세상동성(microhomology)이라고 하는 짧은 상동성 DNA 서열을 사용한다. 이들 미세상동성은 종종 이중-가닥 절단부의 말단 상의 단일-가닥 돌출부에 존재한다. 돌출부가 완벽하게 융화성(compatible)인 경우, NHEJ는 통상 절단부를 정확하게 복구하지만, 뉴클레오타이드의 상실을 초래하는 부정확한 복구 또한 아직 발생할 수 있는데, 그러나, 이러한 부정확한 복구는 돌출부가 융화성이 아닐 때에는 훨씬 더 보편적이다.
용어 ‘비-자연발생(non-naturally occurring)’은 자연적으로 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 실체- 예컨대, 폴리뉴클레오타이드, 유전자 돌연변이, 폴리펩타이드, 식물, 식물 세포 및 식물 물질-를 기재한 것이다. 이러한 비-자연발생 실체 또는 인위적인 실체는 본원에 기재된 방법 또는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수 있다. 이러한 비-자연발생 실체 또는 인위적인 실체는 사람에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수 있다. 따라서 예시에 의해서, 비-자연발생 식물, 비-자연발생 식물 세포 또는 비-자연발생 식물 물질은 역교배와 같은 통상적인 식물 육종 기술을 사용해서나 안티센스 RNA, 간섭성 RNA, 메가뉴클레아제 및 기타 등등과 같은 유전자 조작 기술에 의해서 제조될 수도 있다. 추가적인 예시에 의해서, 비-자연발생 식물, 비-자연발생 식물 세포 또는 비-자연발생 식물 물질은 제1 식물 또는 식물 세포로부터 제2 식물 또는 식물 세포(그 자체는 천연적으로 발생할 수 있음)로 하나 이상의 유전자 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 다형성)를 유전자이입 또는 전달하여 제조됨으로써, 그 결과물인 식물, 식물 세포 또는 식물 물질 또는 그의 자손은 천연적으로 형성되지 않거나 또는 천연에 존재하지 않는 유전자 구성(예를 들어, 게놈, 염색체 또는 그의 세그먼트)을 포함할 수 있게 된다. 따라서 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 물질은 인공적이거나 또는 비-자연발생한 것이다. 따라서, 생성된 유전자 서열이 제1 식물 또는 식물 세포로부터의 상이한 유전적 배경을 포함하는 제2 식물 또는 식물 세포에서 자연발생하더라도, 인공적이거나 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 제1 자연발생 식물 또는 식물 세포에서 유전자 서열을 변형하여 제조될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 돌연변이는 유전자 또는 폴리펩타이드 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 자연적으로 존재하는 자연발생 돌연변이가 아니다. 유전적 배경에서의 차이는 표현형 차이에 의하거나 폴리뉴클레오타이드 서열결정, 유전자 마커(예를 들어, 현미부수체(microsatellite) RNA 마커)의 존재 여부와 같은, 본 기술분야에 공지된 분자 생물학 기술에 의해서 검출될 수 있다.
"올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한, 상보적 가닥의 서열을 규정한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 많은 변이체들은 주어진 폴리뉴클레오타이드와 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 및 이의 상보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 주어진 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 또한, 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 서열 및 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, 게놈 DNA 및 cDNA 둘 다, RNA 또는 혼성체일 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 비롯한 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
상보적 단편에 혼성화하는 단일-가닥 DNA의 특이성은 반응 조건의 "엄격성"에 의해 결정된다(Sambrook 외, Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)). DNA 듀플렉스를 형성하는 경향이 감소함에 따라 혼성화 엄격성은 증가한다. 폴리뉴클레오타이드 혼성화 반응에서, 엄격성은 특이적인 혼성화(높은 엄격성)를 선호하기 위해 선택될 수 있으며, 이는 예를 들어, 라이브러리로부터 전장 클론을 동정하는 데 사용될 수 있다. 덜-특이적인 혼성화(낮은 엄격성)는 관련이 있으나 정확하지 않은(상동성이지만 동일하지 않은) DNA 분자 또는 분절을 동정하는 데 사용될 수 있다. DNA 듀플렉스는 (1) 상보적 염기쌍의 수; (2) 염기쌍의 유형; (3) 반응 혼합물의 염 농도(이온 강도); (4) 반응 온도; 및 (5) DNA 듀플렉스 안정성을 감소시키는 특정한 유기 용매, 예컨대 포름아미드의 존재에 의해 안정화된다. 일반적으로, 프로브가 길수록, 적절한 어닐링에 필요한 온도는 더 높아진다. 보편적인 접근법은 온도를 다양하게 하는 것이며; 더 높은 상대 온도는 보다 엄격한 반응 조건을 초래한다. "엄격한 조건" 하에 혼성화하기 위해, 서로 적어도 60% 상동성인 폴리뉴클레오타이드가 혼성화된 채로 남아 있는 혼성화 프로토콜이 기술된다. 일반적으로, 엄격한 조건은, 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적인 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은, 주어진 서열에 상보적인 프로브의 50%가 (규정된 이온 강도, pH 및 폴리뉴클레오타이드 농도 하에) 주어진 서열에 평형 상태에서 혼성화하는 온도이다. 주어진 서열이 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 프로브의 50%는 평형 상태에서 점유된다.
"엄격한 혼성화 조건"은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 이의 특정 서열에만 혼성화할 수 있는 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이할 것이다. 엄격한 조건은 통상적으로, (1) 낮은 이온 강도 및 고온 세척, 예를 들어 15 mM 소듐 클로라이드, 1.5 mM 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 50℃; (2) 혼성화 동안의 변성화제, 예를 들어, 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 50 mM 소듐 포스페이트 완충제(750 mM 소듐 클로라이드, 75 mM 소듐 시트레이트; pH 6.5), 42℃; 또는 (3) 50% 포름아미드를 포함한다. 세척은 통상적으로 또한, 42℃에서 5xSSC(0.75 M NaCl, 75 mM 소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 파이로포스페이트, 5x덴하르트 용액(Denhardt's solution), 소니케이션된 연어 정자 DNA(50 ㎍/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트에 의한 세척, 42℃에서 0.2xSSC(소듐 클로라이드/소듐 시트레이트) 및 55℃에서 50% 포름아미드 중에서의 세척, 후속해서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 고-엄격성 세척을 포함한다. 바람직하게는, 조건은, 서로 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성인 서열들이 통상적으로 서로 혼성화된 채로 남아 있도록 하는 조건이다.
"엄격성이 중간인 조건"은 덜 엄격하여, 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드의 전체, 단편, 유도체 또는 유사체에 혼성화할 세척 용액 및 혼성화 조건을 사용한다. 일례는 55℃에서 6xSSC, 5x덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA에서 혼성화한 다음, 37℃에서 1xSSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 온도, 이온 강도 등은 프로브 길이와 같은 실험 인자에 맞춰서 조정될 수 있다. 다른 엄격성이 중간인 조건은 기술되어 있다(Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, N.Y. (1990); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1988) 참조).
"엄격성이 낮은 조건"은 엄격성이 중간인 조건보다 덜 엄격하여, 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드의 전체, 단편, 유도체 또는 유사체에 혼성화할 세척 용액 및 혼성화 조건을 사용한다. 엄격성이 낮은 혼성화 조건의 비제한적인 예는 40℃에서 35% 포름아미드, 5xSSC, 50 mM Tris HCl(pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA, 10%(wt/vol) 덱스트란 설페이트에서 혼성화한 다음, 50℃에서 2xSSC, 25 mM Tris HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA 및 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 잡종(cross-species) 혼성화에 대한 조건과 같이 엄격성이 낮은 다른 조건들은 잘 기술되어 있다(Ausubel 외, 1993; Kriegler, 1990 참조).
"작동적으로 연결된"은, 유전자의 발현이 이러한 유전자가 공간적으로 연결되어 있는 프로모터의 조절 하에 있음을 의미한다. 프로모터는 이의 조절 하에 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는, 해당 프로모터와, 프로모터가 유래되는 유전자에서 프로모터가 조절하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 이러한 거리의 변화는 프로모터 기능의 상실 없이 맞춰질 수 있다. "작동적으로 연결된"은 단일 단편에서 폴리뉴클레오타이드 단편이 결합되어, 하나의 단편의 기능이 또 다른 단편에 의해 조절되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 폴리뉴클레오타이드 단편의 전사를 조절할 수 있을 때, 폴리뉴클레오타이드 단편과 작동적으로 연결된다.
용어 "식물"은 수명 주기 또는 발생(development) 중 임의의 단계의 임의의 식물, 및 그의 자손을 의미한다. 한 구현예에서, 식물은 "담배 식물"로서, 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물을 의미한다. 상기 용어는 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 주아(propagule), 식물 종자, 식물 세포 및 이들의 자손의 지칭을 포함한다. 식물 세포로는, 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열 조직 영역, 유합 조직, 잎, 뿌리, 싹, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 소포자가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 담배 식물의 적절한 종, 재배종, 혼성체 및 품종은 본원에 기술되어 있다.
"폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드 단편"은, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드 염기를 함유하는, 단일-가닥 또는 이중-가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 뉴클레오타이드(통상 이의 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 하기와 같이 이의 단일 문자로 지칭되는데: "A"는 (각각 RNA 또는 DNA에 대하여) 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트, "C"는 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트, "G"는 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트, "U"는 우리딜레이트, "T"는 데옥시티미딜레이트, "R"은 퓨린(A 또는 G), "Y"는 피리미딘(C 또는 T), "K"는 G 또는 T, "H"는 A 또는 C 또는 T, "I"는 이노신을 지칭하고, "N"은 임의의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 제한 없이, 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), mRNA 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥, 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물, DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물을 가지는 혼성 분자 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 또는 둘 다 또는 이들의 단편(들)을 포함하는 삼중가닥 영역들로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 염기, 예컨대 포스포티오에이트를 함유할 수 있고, 펩타이드 핵산(PNA)일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드, 또는 개별 뉴클레오타이드의 단리된 혹은 클로닝된 단편, 또는 전술한 것들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 DNA 서열로 보이지만, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그의 대응하는 RNA 서열, 및 그의 역보체를 포함해서, 그의 상보성(예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 첨부된 서열 목록에 제시된다.
"폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 서열"은, 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 지칭한다. 상기 용어들은 또한, 글리코실화, 지질 부착, 설페이트화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 변형을 포함한다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 첨부된 서열 목록에 제시된다.
"프로모터"는 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 부여, 활성화 또는 증강시킬 수 있는 합성 또는 자연-유래 분자를 의미한다. 상기 용어는 통상적으로 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 단편의 상류에 위치하고 작동적으로 연결된, 폴리뉴클레오타이드 요소/서열을 지칭한다. 프로모터는 관심 고유 유전자(native gene)에 근접한 영역으로부터 전체적으로 유래될 수 있거나, 다른 고유한 프로모터 또는 합성 폴리뉴클레오타이드 분절로부터 유래되는 다른 요소로 구성될 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 더 증강시키고/거나 공간적인 발현 및/또는 시간적인 발현을 변경하기 위해, 하나 이상의 특이적인 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한, 원위(distal) 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있으며, 이들은 전사의 시작 부위로부터 수천 염기쌍만큼 떨어진 거리에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균류, 식물, 곤충 및 동물을 비롯한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 유전자 구성성분의 발현을, 발현이 발생하는 세포, 조직 또는 기관에 대하여, 발현이 발생하는 발달 단계에 대하여, 또는 외부 자극, 예컨대 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여, 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "조직-특이적 프로모터" 및 "조직-선호적(preferred) 프로모터"는, 하나의 조직 또는 기관에서 주로 발현되지만 본질적으로 독점적으로는 발현되지는 않으며, 그러나 하나의 특정한 세포에서 발현될 수도 있는 프로모터를 지칭한다. "발달적으로 조절되는 프로모터"는, 이의 기능이 발달 사건에 의해 결정되는 프로모터를 지칭한다. "구성적 프로모터"는 대부분의 경우에 대부분의 세포 유형에서 유전자를 발현시키는 프로모터를 지칭한다. “유도성 프로모터”는 작동적으로 연결된 DNA 서열을, 내인성 또는 외인성 자극, 예를 들어 화학적 화합물(화학적 유도자)의 존재에 반응하거나 환경적 신호, 호르몬 신호, 화학적 신호 및/또는 발달 신호에 반응하여 선택적으로 발현한다. 유도성 또는 조절된 프로모터의 예로는, 빛, 열, 스트레스, 홍수 또는 가뭄, 병원체, 식물 호르몬, 상처 또는 화학물질, 예컨대 에탄올, 자스모네이트(jasmonate), 살리실산 또는 완화제(safener)에 의해 조절되는 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "재조합"은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 유전자 조작 기술에 의한 폴리뉴클레오타이드의 단리된 단편들의 조작(manipulation)에 의해, 서열의 2개의 다르게 분리된 단편들의 인공적인 조합을 지칭한다. 상기 용어는 또한, 이종성 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 변형된 세포로부터 유래되는 세포를 지칭하는 것을 포함하나, 자연적으로 발생하는 사건(예, 자발적인 돌연변이, 자연적인 형질전환 또는 형질도입 또는 전위), 예컨대 정교한 인간 개입 없이 발생하는 것들에 의한 세포 또는 벡터의 변경은 포함하지 않는다.
"재조합 작제물"은, 자연에서 통상 함께 발견되지 않는 폴리뉴클레오타이드들의 조합을 지칭한다. 이에, 재조합 작제물은 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연상에서 통상적으로 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 재조합 작제물은 재조합 DNA 작제물일 수 있다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "조절 서열" 및 "조절 요소"는 코딩 서열의 상류(5' 논-코딩 서열), 코딩 서열 내 또는 코딩 서열의 하류(3' 논-코딩 서열)에 위치하며, 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열로는, 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인지 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열" 및 "조절 요소"는 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
"부위-특이적 뉴클레아제"는 DNA 서열을 특이적으로 인지하고 절단할 수 있는 효소를 지칭한다. 부위-특이적 뉴클레아제는 조작될 수 있다. 조작된 부위-특이적 뉴클레아제의 예로는, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas9-기재 시스템 및 메가뉴클레아제가 있다.
용어 "담배"는 종합해서, 본원에 기술된 바와 같이 제조 및/또는 수득되는 담배 작물(예, 현장(field)에서 생장되는 복수의 담배 식물, 즉 수경 재배에 의해 생장되지 않는 담배), 담배 식물, 및 비제한적으로 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 종자를 포함하는 이의 일부를 지칭하는 데 사용된다. "담배"는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물 및 이의 산물을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "담배 제품"은 비제한적으로 흡연 재료(예, 궐련, 엽궐련 및 파이프 담배), 코담배, 씹는 담배, 검 및 로젠지를 포함한 소비자용 담배 제품, 뿐만 아니라 소비자용 담배 제품의 제조를 위한 구성성분, 재료 및 성분을 지칭한다. 적절하게는, 이들 담배 제품은 담배로부터 수확된 다음, 담배 제조의 종래의 기술에 따라 절단, 건조, 경화 및/또는 발효된 담배 잎 및 줄기로부터 제조된다.
"전사 종결자", "종결 서열" 또는 "종결자"는 폴리아데닐화 인지 서열 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 암호화하는 다른 서열들을 비롯하여, 코딩 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화 신호는 통상, mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트(tract)의 첨가에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다.
"유전자이식(transgenic)"은, 초기의 유전자이식 사건 뿐만 아니라 초기의 유전자이식 사건으로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성되는 것들을 비롯하여, 이종성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 재조합 작제물의 존재에 의해 그 게놈이 변경된, 임의의 세포, 세포주, 유합 조직, 조직, 식물 부분 또는 식물을 지칭한다. 상기 용어는, 종래의 식물 육종 방법에 의한, 또는 자연적으로 발생하는 사건, 예컨대 랜덤 교차-비옥화, 비-재조합 바이러스 감염, 비-재조합 박테리아 형질전환, 비-재조합 전위 또는 자발적 돌연변이에 의한 (염색체 또는 염색체-외(extra-chromosomal)) 게놈의 변경을 포함하지 않는다.
"유전자이식 식물"은 식물의 게놈 내에 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물, 즉, 내부에서 통상적으로 발견되지 않고 문제의 식물 내에(또는 식물의 조상 내에) 인간 조작에 의해 도입된 재조합 유전 물질을 함유하는 식물을 지칭한다. 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오타이드는, 폴리뉴클레오타이드가 후속 세대에 대대로 전달되도록 게놈 내에서 안정하게 통합될 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오타이드는 게놈 단독 내에 통합되거나 재조합 작제물의 일부로서 통합될 수 있다. 유전학적으로 개선된 생식질의 상업적인 발달 또한, 다수의 형질을 작물 식물 내에 도입하는 단계까지 나아갔으며, 이는 종종 유전자 적체(gene stacking) 접근법으로 지칭된다. 이러한 접근법에서, 관심의 상이한 특징들을 부여하는 다수의 유전자들이 식물 내에 도입될 수 있다. 유전자 적체는 비제한적으로 공동-형질전환, 재형질전환 및 세포주에 상이한 이식유전자들을 교배시키는 것을 비롯한 많은 수단들에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 재조합 DNA가 형질전환에 의해 도입된 식물 세포로부터 생장된 식물은 유전자이식 식물이며, (유성 생식 또는 무성 생식에 의해 생산된) 도입된 이식유전자를 함유하는 해당 식물의 모든 자손들도 마찬가지이다. 상기 용어 유전자이식 식물은 전체 식물 또는 나무 및 이러한 식물 또는 나무의 일부, 예를 들어 낟알, 종자, 꽃, 잎, 뿌리, 과일, 꽃가루, 줄기 등을 포함하는 것으로 이해된다. 각각의 이종성 폴리뉴클레오타이드는 상이한 형질들을 유전자이식 식물에 부여할 수 있다.
"전사 활성화제-유사 효과기" 또는 "TALE"는 특정 DNA 서열을 인지하고 결합하는 폴리펩타이드 구조를 지칭한다. "TALE DNA-결합 도메인"은 RVD 모듈로도 알려져 있는 탠덤 33개 내지 35개 아미노산 반복부의 어레이를 포함하는 DNA-결합 도메인을 지칭하며, 이러한 RVD 모듈은 각각 DNA의 단일 염기쌍을 특이적으로 인지한다. RVD 모듈은 규정된 서열을 인지하는 어레이를 어셈블리하기 위해 임의의 순서로 배열될 수 있다. TALE DNA-결합 도메인의 결합 특이성은 RVD 어레이 및 후속해서 20개 아미노산의 단일 절단 반복부에 의해 결정된다. TALE DNA-결합 도메인은 12개 내지 27개의 RVD 모듈을 가질 수 있으며, 이러한 RVD 모듈은 각각 RVD를 함유하고 DNA의 단일 염기쌍을 인지한다. 4개의 가능한 DNA 뉴클레오타이드(A, T, C 및 G)를 각각 인지하는 특이적인 RVD가 동정되어 있다. TALE DNA-결합 도메인이 모듈형(modular)이기 때문에, 4개의 상이한 DNA 뉴클레오타이드를 인지하는 반복부는 함께 연결되어, 임의의 특정한 DNA 서열을 인지할 수 있다. 그런 다음, 이들 표적화된 DNA-결합 도메인은 촉매성 도메인과 조합되어, 인공 전사 인자, 메틸트랜스퍼라제, 인테그라제, 뉴클레아제 및 리컴비나제를 비롯한 기능성 효소를 생성할 수 있다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제" 또는 "TALEN"은 뉴클레아제, 예컨대 엔도뉴클레아제 FokI의 촉매성 도메인과, 통상의 DNA 서열에 표적화될 수 있는 디자인된 TALE DNA-결합 도메인의 조작된 융합 폴리펩타이드를 지칭한다.
"TALEN 단량체"는 촉매성 뉴클레아제 도메인 및 디자인된 TALE DNA-결합 도메인을 포함하는 조작된 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 2개의 TALEN 단량체는 TALEN 표적 영역을 표적화하고 절단하도록 디자인된다.
"이식유전자"는 하나의 유기체로부터 단리되었으며 상이한 유기체 내로 도입되는 유전자 서열을 함유하는 유전자 또는 유전 물질을 지칭한다. DNA의 이러한 비-고유의 단편은 유전자이식 유기체에서 RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 능력을 보유할 수 있거나, 유전자이식 유기체의 유전자 코드의 정상적인 기능을 변경할 수 있다. 이식유전자의 도입은 유기체의 표현형을 변화시키는 잠재력을 가진다.
폴리뉴클레오타이드와 관련하여 "변이체"는: (i) 폴리뉴클레오타이드의 부분 또는 단편; (ii) 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 부분의 상보체; (iii) 관심 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보체와 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에서 관심 폴리뉴클레오타이드, 그의 상보체, 또는 그와 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)을 가진 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 최소의 변화를 수반하는 것으로 인지된다.
용어 "품종(variety)"은 동일한 종의 다른 식물로부터 구분되는 일정한 특징을 공유하는 식물의 집단을 의미한다. 하나 이상의 뚜렷한 형질을 가지면서, 품종은 이러한 품종 내의 개체들 사이에서 전체적인 변이가 매우 작은 것을 더욱 특징으로 한다. 품종은 종종 상업적으로 판매된다.
"벡터"는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 작제물 및 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트 등을 수송할 수 있게 하기 위한 폴리뉴클레오타이드 성분들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 비히클을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 원형의, 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 선형의 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 벡터와 같은 염색체-외 복제가 가능한 에피솜을 포함한다. 본원에 사용된 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오타이드(들), 폴리뉴클레오타이드 작제물 및 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트 등의 발현을 가능하게 하기 위한 폴리뉴클레오타이드 성분들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 비히클이다. 적절한 발현 벡터는 원형의, 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 선형의 이중-가닥 뉴클레오타이드 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 염색체-외 복제가 가능한 에피솜(episome)을 포함한다. 발현 벡터는 이하에서 정의된 바와 같이 적어도 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 작제물 또는 폴리뉴클레오타이드 컨쥬게이트(conjugate) 상류에 위치한 프로모터(promoter)를 포함한다.
"아연 핑거"는 DNA 서열을 인지하고 결합하는 폴리펩타이드 구조를 지칭한다. 아연 핑거 도메인은 인간 프로테옴에서 가장 보편적인 DNA-결합 모티프이다. 단일 아연 핑거는 대략 30개의 아미노산을 함유하고, 이러한 도메인은 전형적으로, 1개 염기쌍 당 단일 아미노산 측쇄의 상호작용을 통해 DNA의 3개의 연속 염기쌍에 결함함으로써 작용한다.
"아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "ZFN"은, 완전히 조립되었을 때 DNA를 절단할 수 있는 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 뉴클레아제의 일부에 효과적으로 연결된 적어도 하나의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 분자를 지칭한다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 연결하여 사용된 과학적 용어 및 기술적 용어는 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양 기술, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화와 연결하여 사용된 임의의 명명법은 당업계에 잘 알려져 있으며 보편적으로 사용되는 것들이다. 용어의 의미 및 범위는 분명해야 하지만; 임의의 잠재적 다의성이 존재하는 경우, 본원에서 제공된 정의가 임의의 사전적 정의 또는 외적 정의를 능가하여 우세하다. 나아가, 문맥상 다르게 필요하지 않는 한, 단수형은 복수형을 포함해야 하고, 복수형은 단수형을 포함해야 한다.
2. 폴리뉴클레오타이드
한 구현예에서, 서열목록에 보이는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함해서, 본원에 기재된 임의의 서열에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 가지는, 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공되어 있다. 적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
적절하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)는 서열목록에 나타낸 폴리펩타이드(들)의 기능 또는 활성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 이상을 갖는 활성 폴리펩타이드를 암호화한다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13과 적어도 60% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공되어 있다.
적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
적절하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13과 실질적 상동성 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23의 상응 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는, 실질적 상동성 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23의 단편이 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 상응 단편과 적어도 약 80%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는, 실질적 상동성 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적 동일성을 가지는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 단편이 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, SUS로서 기능하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13과 충분하거나 상당한 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하고 있는 폴리뉴클레오타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23과 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13으로서 본원에서 지정된 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 중합체가 제공되어 있다.
적절하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 SUS 계열의 일원을 암호화한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 비변형되었거나 변형된 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수도 있는, 뉴클레오타이드의 중합체를 포함할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 제한하지 않고, 게놈 DNA, 상보성 DNA(cDNA), mRNA, 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물인 DNA, DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일가닥 및 이중가닥 영역들의 혼합물을 가지는 혼성 분자 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 또는 둘 다 또는 이들의 단편(들)을 포함하는 삼중가닥 영역들로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 염기, 예컨대 포스포티오에이트(phosphothioate)를 함유할 수 있으며, 펩티드 핵산일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드, 또는 개별 뉴클레오타이드의 단리된 혹은 클로닝된 단편, 또는 전술한 것들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 DNA 서열로 보여지지만, 이는 그의 대응하는 RNA 서열, 및 그의 역보체를 포함해서, 그의 상보성(예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
일부 경우에 예를 들면, 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 또는 O-메틸포스포로아미다이트(O-methylphosphoroamidite) 연결을 포함하는 대안적인 골격(backbone); 및 펩티드 폴리뉴클레오타이드 골격 및 연결기를 가질 수도 있는 폴리뉴클레오타이드 유사체가 포함되지만, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 폴리뉴클레오타이드로는 양성 골격; 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 리보오스-인산 골격의 변형은 다양한 이유 때문에 생길 수 있는데, 예를 들면, 생리학적 환경 또는 바이오칩 상 프로브로서의 분자들의 안정성 및 반감기를 증대시키기 위한 이유이다. 자연발생 폴리뉴클레오타이드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오타이드 유사체들의 혼합, 및 자연발생 폴리뉴클레오타이드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다.
예를 들면, 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), O-메틸포스포라미다이트(O-methylphosphoroamidite) 연결기 및 펩티드 폴리뉴클레오타이드 골격 및 연결기를 포함해서, 다양한 폴리뉴클레오타이드 유사체가 공지되어 있다. 다른 유사체 폴리뉴클레오타이드로는 양성 골격, 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 포함된다.
다른 유사체로는 펩티드 폴리뉴클레오타이드 유사체인 펩티드 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 골격은 자연발생 폴리뉴클레오타이드의 고 전하의 포스포디에스테르 골격과 대조적으로, 중성 조건 하에서 실질적으로 비이온성이다. 이것은 이점을 야기할 수도 있다. 첫째, 펩티드 폴리뉴클레오타이드 골격은 개선된 혼성화 동역학(hybridization kinetics)을 보여줄 수도 있다. 펩티드 폴리뉴클레오타이드는 불일치 대비 완전 일치 염기쌍을 위해 더 큰 용융점 변화를 가진다. DNA 및 RNA는 일반적으로 간격 불일치의 경우에 2-4℃의 용융점 강하를 보여준다. 비이온성 펩티드 폴리뉴클레오타이드 골격의 경우, 상기 강하는 7-9℃에 더 가깝다. 마찬가지로, 그의 비이온성 성질 때문에, 이 골격들에 부착된 염기의 혼성화는 염 농도에 상대적으로 민감하지 않다. 또한, 펩티드 폴리뉴클레오타이드는 세포 효소에 의해 변성되지 않을 수도 있고 더 적은 범위로 변성될 수도 있으므로, 더 안정적일 수도 있다.
개시된 폴리뉴클레오타이드, 및 그 단편의 용도 중에는 혼성화 분석에서 프로브로서 또는 증폭 분석에 사용하기 위한 프라이머로서 용도가 있다. 이러한 단편은 일반적으로 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오타이드의 DNA 서열을 포함하고 있다. 다른 구현예들에서, DNA 단편은 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오타이드의 DNA 서열을 포함하고 있다. 따라서, 한 측면에서, 프로브 또는 프라이머 또는 둘 다 사용하는 것을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 방법이 또한 제공되어 있다. 예시적인 프라이머는 본원에 기재되어 있다.
혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되어 있다. 본원에 기재된 폴리펩타이드 서열과 유전 암호의 지식의 조합을 이용해서, 축퇴성 올리고뉴클레오타이드의 세트가 생성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 DNA 단편이 단리되고 증폭되는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 유용하다. 소정의 구현예들에서, 축퇴성 프라이머는 유전자 라이브러리를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리, 및 심지어 전자 발현 서열 태그 또는 DNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 방법에 의해서 식별되는 상동성 서열은 본원에서 인식되는 서열의 상동성을 인식하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
또한 감소된 엄격성 조건, 전형적으로 중간 엄격성 조건, 및 일반적으로 높은 엄격성 조건 하에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드(들)와 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 프라이머 또는 프로브)가 잠재적으로 사용될 수 있다. 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본 매개변수는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되어 있고 그리고 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 염기 조성을 기초로 하여 본 기술분야의 숙련자들에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
중간 엄격성 및 높은 엄격성 조건을 달성하는 한 가지 방식이 본원에서 정의되어 있다. 세정 온도 및 세정 염 농도는, 당업자들에게 공지되고 이하에 더 설명된 바와 같이, 혼성화 반응 및 듀플렉스 안정성을 지배하는 기본적인 원리들을 적용함으로써, 요망되는 엄격성 정도(degree of stringency)를 달성하기 위해 필요한 대로 조정될 수 있음을 이해해야 한다(예를 들어, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y 참조). 미공지된 서열의 폴리뉴클레오타이드에 폴리뉴클레오타이드를 혼성화할 때, 혼성체 길이는 혼성화 폴리뉴클레오타이드의 길이로 추정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오타이드가 혼성화할 때, 혼성체 길이는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 정렬하고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 식별하여 결정될 수 있다. 길이가 50 미만의 염기쌍인 것으로 예상되는 혼성체를 위한 혼성화 온도는 혼성체의 용융점 보다 5℃ 내지 10℃ 적어야 하고, 이때 용융점은 다음의 식에 따라 결정된다. 길이가 18 미만의 염기쌍인 혼성체의 경우, 용융점(℃)=2(A+T 염기 수)+4(G+C 염기 수)이다. 길이가 18 초과의 염기쌍인 혼성체의 경우, 용융점(℃)=81.5+16.6(log10 [[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이고, 이때 N은 혼성체 내의 염기 수이고, [[Na+]는 혼성화 완충액 내의 나트륨 이온의 농도이다(1x 표준 구연산나트륨=0.165M에 대한 [[Na+]). 전형적으로, 각각의 이러한 혼성화 폴리뉴클레오타이드는 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드의 길이의 적어도 25%(일반적으로 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 일반적으로 적어도 80%)인 길이를 가지고, 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 가진다.
당업자에 의해서 이해되는 것처럼, 선형 DNA는 두 가지 가능한 배향: 5'에서 3' 방향과 3'에서 5' 방향을 가진다. 예를 들어, 첫번째 서열이 5'에서 3' 방향에 위치하고, 두번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자/가닥 내에서 5'에서 3' 방향에 위치하면, 이때 첫번째 서열 및 두번째 서열은 동일한 방향으로 배향되거나, 또는 동일한 배향을 가진다. 전형적으로, 주어진 프로모터의 조절 하에 관심 있는 프로모터 서열 및 유전자는 동일한 배향으로 위치한다. 그러나, 5'에서 3' 방향으로 위치하는 첫번째 서열과 관련해서는, 두 번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자/가닥 내에서 3'에서 5' 방향으로 위치하면, 이때 첫번째 서열 및 두번째 서열은 안티센스 방향으로 배향되거나, 안티센스 배향을 가진다. 서로에 대하여 안티센스 배향을 가지는 두 가지 서열은, 첫번째 서열(5'에서 3' 방향) 및 첫번째 서열의 역상보성 서열(5'에서 3' 방향으로 위치하는 첫번째 서열)이 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자/가닥 내에 위치한다면, 동일한 배향을 가지는 것으로 대안적으로 설명될 수 있다. 본원에 기재된 서열은 5'에서 3' 방향으로 도시되어 있다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS1 -S, NtSUS1 -T, NtSUS2 -S, NtSUS2-T, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T, NtSUS4 -S, NtSUS4 -T, NtSUS5 -S, NtSUS5 -T, NtSUS6 -S 및 NtSUS6 -T 중 하나 이상에서 포함될 수 있다. 적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2 -S, NtSUS2 -T, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T, NtSUS4 -S 및 NtSUS4 -T 중 하나 이상에서 포함될 수 있다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2 -S, NtSUS2 -T, NtSUS3 -S, NtSUS3-T, NtSUS4 -S 및 NtSUS4 -T 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1 -S, NtSUS1 -T, NtSUS5 -S, NtSUS5 -T, NtSUS6 -S 및 NtSUS6 -T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2 -S, NtSUS2 -T, NtSUS3 -S, NtSUS3-T, NtSUS4 -S 및 NtSUS4 -T 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1 -S, NtSUS1 -T, NtSUS5 -S, NtSUS5 -T, NtSUS6 -S 및 NtSUS6 -T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2 -S, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T 및 NtSUS4 -S 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1 -S, NtSUS1 -T, NtSUS2-T, NtSUS4 -T, NtSUS5 -S, NtSUS5 -T, NtSUS6 -S 및 NtSUS6 -T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2 -S, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T 및 NtSUS4 -S 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1 -S, NtSUS1 -T, NtSUS2-T, NtSUS4 -T, NtSUS5 -S, NtSUS5 -T, NtSUS6 -S 및 NtSUS6 -T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
3. 폴리펩타이드
또 다른 측면에서, 서열목록에 보이는 임의의 폴리펩타이드를 포함해서, 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 가지는, 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 단리된 폴리펩타이드가 제공되어 있다. 적절하게는, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
한 구현예에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 2와 적어도 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 4와 적어도 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
한 구현예에서, 서열번호 6 또는 서열번호 8과 적어도 80%, 81%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 6과 적어도 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 8과 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
한 구현예에서, 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
한 구현예에서, 서열번호 14 또는 서열번호 16과 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 14와 적어도 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 16과 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
한 구현예에서, 서열번호 18 또는 서열번호 20과 적어도 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 18과 적어도 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 20과 적어도 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
한 구현예에서, 서열번호 22 또는 서열번호 24와 적어도 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 22와 적어도 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 24와 적어도 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
한 구현예에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23; 또는 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 제공되어 있다.
폴리펩타이드는 SUS로서 기능하도록 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22 또는 서열번호 24; 또는 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14와 충분하거나 상당한 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하고 있는 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드(들)의 단편은 통상적으로 전장 서열의 기능 또는 활성의 일부 또는 전부를 보유한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 폴리펩타이드는 또한, 임의의 유형의 변경(예, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3차원 구조 또는 자가결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생성된 돌연변이체를 포함하는데, 이들은 그들의 기능 또는 활성의 일부 또는 전부를 여전히 가지는 경우에 의도적으로 조작되거나 자연적으로 단리된 것일 수 있다. 적절하게는, 이 기능 또는 활성은 조절된다.
결실이란 단백질로부터 하나 이상의 아미노산이 제거되는 것을 의미한다. 삽입이란 폴리펩타이드 내의 소정의 자리 내로 하나 이상의 아미노산이 도입되는 것을 의미한다. 삽입은 단일 또는 다수의 아미노산의 서열-내 삽입을 포함할 수도 있다. 치환이란 폴리펩타이드의 아미노산을 유사한 성질을 가지는 다른 아미노산들로 교체하는 것을 의미한다(예컨대 유사한 소수성, 친수성, 항원성, a-나선 구조 또는 β-시트 구조를 형성 또는 파괴하려는 경향성). 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이지만, 폴리펩타이드 상에 놓인 기능적 제약(functional constraint)에 따라 군집될 수도 있고 약 1개 내지 약 10개 아미노산 범위일 수도 있다. 아미노산 치환은 바람직하게는 이하에서 설명하는 것과 같이 보존성 아미노산 치환이다. 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 펩티드 합성 기술 - 예컨대 고체상 펩티드 합성을 이용하거나 재조합 DNA 조작에 의해서 이루어질 수 있다. 폴리펩타이드의 치환, 삽입 또는 결실 변이체를 생산하기 위한 DNA 서열 조작 방법은 본 기술분야에 주지되어 있다. 변이체는, 침묵(silent) 변화를 생성하여 기능적으로 등가의 단백질을 생성하는 변경을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 물질의 2차 결합이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및 양친매성 성질의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양전하된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 가지는 비전화된 극성 헤드기를 가지는 아미노산은 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존성 치환은, 예를 들어 하기의 표에 따라서 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼의 동일한 블록 내의 아미노산 및 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 선 내의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure pct00001
폴리펩타이드는 성숙 폴리펩타이드 또는 미성숙 폴리펩타이드 또는 미성숙 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드일 수 있다. 폴리펩타이드는 공지의 방법을 이용해서 선형 형태 또는 고리형일 수도 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 또는 적어도 40개의 연결된 아미노산을 포함한다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S, NtSUS4-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상에 포함될 수 있다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S 및 NtSUS4-T 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S 및 NtSUS4-T 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2-S, NtSUS3-S, NtSUS3-T 및 NtSUS4-S 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS2-T, NtSUS4-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
적어도 하나의 변형(예를 들어, 돌연변이)은 NtSUS2-S, NtSUS3-S, NtSUS3-T 및 NtSUS4-S 중 하나 이상에서 포함될 수 있는 반면에 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS2-T, NtSUS4-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상에서는 변형(들)(예를 들어, 돌연변이(들))이 포함되지 않는다.
식물 변형
a. 형질전환
재조합 작제물은 폴리펩타이드 발현, 기능 또는 활성을 조절하기 위해 식물 또는 식물 세포를 형질전환하는 데에 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 암호화하며, 폴리펩타이드를 발현하는데 적절한 조절 영역에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 따라서 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 발현, 기능 또는 활성이 조절되는 식물 또는 식물 세포는 돌연변이체, 비-자연발생, 유전자이식, 인공 또는 유전자 조작 식물 또는 식물 세포를 포함할 수 있다. 적절하게는, 유전자이식 식물 또는 식물 세포는 재조합 DNA의 안정적인 통합에 의해서 변경된 유전체를 포함한다. 재조합 DNA는 유전자 조작되었고 세포의 외부에서 작제된 DNA를 포함하고 자연발생 DNA 또는 cDNA 또는 합성 DNA를 함유하는 DNA를 포함한다. 유전자이식 식물은 처음에 형질전환된 식물 세포로부터 재생된 식물 및 후속 세대 또는 형질전환된 식물의 교배로부터의 후손 유전자이식 식물을 포함할 수 있다. 적절하게는, 유전자이식 변형은 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 기능 또는 활성을 대조군 식물과 비교해서 변경시킨다.
재조합 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 고유한 폴리펩타이드거나 세포와 이형일 수 있다. 일부 경우에, 재조합 작제물은 조절 영역에 작동적으로 연결된, 발현을 조절하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 적절한 조절 영역의 실시예들이 본원에서 설명되고 있다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 골격은 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 또는 박테리오파지 인공 염색체와 같이 본 기술분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 제한 없이, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스(baculoviruse), 및 레트로바이러스로부터 유래되는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 시판 중이다.
벡터는 예를 들어 복제 원점, 지지체 결합 영역(scaffold attachment region) 또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 식물 세포에 대해 선택할 수 있는 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들어, 마커는 항생제(예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신), 또는 제초제(예를 들어, 글리포세이트, 클로술푸론 또는 포스피노트리신)에 대한 저항성과 같은, 살생제 저항성을 부여할 수 있다. 또한, 발현 벡터는 발현된 폴리펩타이드의 조작 또는 검출(예를 들어, 정제 또는 국재화)을 용이하게 하기 위해 고안된 태그 서열을 포함할 수 있다. 루시퍼라아제, 베타-글루쿠로니다아제, 녹색 형광 폴리펩타이드, 글루타티온 S-전이효소, 폴리히스티딘, c-myc 또는 헤마글루티닌 서열과 같은 태그 서열은 전형적으로 암호화된 폴리펩타이드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함해서, 폴리펩타이드 내에 어느 곳에서나 삽입될 수 있다.
식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환되도록 그의 게놈 내로 통합된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 가져서 형질전환될 수 있다. 본원에서 설명한 식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환된다. 안정적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에 도입된 폴리뉴클레오타이드를 보유한다. 식물 또는 식물 세포는 일시적으로 형질전환되어서 재조합 폴리뉴클레오타이드가 그의 게놈 내로 통합되지 않을 수 있다. 일시적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에 도입된 재조합 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 손실함으로써 도입된 재조합 폴리뉴클레오타이드가 충분한 수의 세포분열 후에 딸세포에서 검출될 수 없도록 한다.
입자사출(biolistics), 유전자 총(gene gun) 기술, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스 벡터-매개 형질전환, 동결-융해(freeze-thaw) 방법, 미세입자 충격, 직접 DNA 흡수(direct DNA uptake), 초음파 처리, 미세주입, 식물 바이러스-매개 전달, 및 전기천공을 포함하는 식물 세포를 형질전환시키기 위한 다수의 방법이 본 기술분야에서 이용 가능하다. 외래 DNA를 식물 염색체 내로 통합하기 위한 아그로박테리움 시스템은 식물 유전자 조작을 위해 광범위하게 연구되고, 변형되고 활용되어왔다. 센스 또는 안티센스 배향으로, 조절 서열에 작동적으로 연결된, 정제된 대상 폴리펩타이드에 대응하는 DNA 서열을 포함하는 네이키드 재조합 DNA 분자는 통상적인 방법에 의해서 적절한 T-DNA 서열에 연결된다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜 기술에 의해서나 전기천공법 기술에 의해서 원형질체 내로 도입되는데, 두 기술 모두 표준이다. 대안적으로, 정제된 대상 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 이러한 벡터는 살아있는 아그로박테리움 세포 내로 도입되고, 그런 다음 DNA를 식물 세포 내로 전달한다. T-DNA 벡터 서열을 동반하지 않는 네이키드 DNA에 의한 형질전환은 원형질체와 DNA-함유 리포솜의 융합을 통해서나 전기천공법을 통해서 달성될 수 있다. T-DNA 벡터 서열을 동반하지 않은 네이키드 DNA는 불활성의, 고속의 미세투사물을 통해서 세포를 형질전환하는 데에도 사용될 수 있다.
세포 또는 배양된 조직이 형질전환을 위한 수용체 조직으로서 사용된다면, 원하는 경우에 식물은 당업자에게 공지된 기술에 의해서 형질전환된 배양물로부터 재생될 수 있다.
재조합 작제물에 포함될 조절 영역의 선택은 이에만 한정하는 것은 아니지만, 효능, 선택가능성, 유도성, 바람직한 발현수준, 및 세포- 또는 조직-우선적 발현을 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다. 암호화 서열에 비해 조절 영역을 적절히 선택하고 위치시켜서 암호화 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게 일상적인 일이다. 폴리뉴클레오타이드의 전사는 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 적절한 조절 영역은 소정의 세포 유형에서, 전사를 유일하게 또는 우세하게 개시한다. 식물 게놈 DNA에 있는 조절 영역을 식별하고 특징화하기 위한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다.
적절한 프로모터는 다른 조직 또는 세포 유형(예를 들어, 뿌리-특이적 프로모터, 신초-특이(shoot-specific) 프로모터, 물관-특이(xylem-specific) 프로모터)에 존재하거나, 또는 상이한 발생 단계 동안에 존재하거나, 또는 상이한 환경조건에 반응하여 존재하는 조직-특이적 인자에 의해 인식되는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터는 특정한 유도인자(inducer)를 필요로 하지 않고 대부분의 세포 유형에서 활성화될 수 있는 구성적 프로모터를 포함한다. RNAi 폴리펩타이드 생산을 조절하기 위한 적절한 프로모터의 예시는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터를 포함한다. 당업자라면 재조합 프로모터의 다수 변이를 생성하는 것이 가능하다.
조직-특이적 프로모터는 식물 발생 동안의 특정 시간에 식물 영양조직 또는 생식조직과 같은 세포 또는 조직에서만 활성화되는 전사 조절 요소이다. 조직-특이적 발현은 예를 들어, 특정 조직에서의 폴리뉴클레오타이드의 발현이 선호될 때 유리할 수 있다. 발생의 조절 하에서 조직-특이적 프로모터의 예시는 예를 들어, 뿌리 또는 잎과 같은 식물 영양조직, 또는 열매, 배주, 종자, 꽃가루, 암술, 꽃, 또는 임의의 배 조직과 같은 생식조직과 같은 소정의 조직에서만 (또는 주로) 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 생식조직-특이적 프로모터는 예를 들어, 꽃밥-특이, 배주-특이, 배-특이, 배젖-특이, 외피-특이, 종자 및 종피-특이, 꽃가루-특이, 꽃잎-특이, 꽃받침-특이, 또는 그들의 조합일 수 있다.
적절한 잎-특이적 프로모터는 피루브산, C4 식물(옥수수)의 오르토인산 디키나아제(PPDK) 프로모터, 옥수수의 cab-m1Ca+2 프로모터, 애기장대(Arabidopsis thaliana) myb-관련 유전자 프로모터 (Atmyb5), 잎 및 광-생장(light-grown) 모종에서 발현된 리불로오스 이인산 카복실라아제(RBCS) 프로모터(예를 들어 잎 및 광-육종 모종에서 발현된 토마토 RBCS 1, RBCS2 및 RBCS3A 유전자, 발생중인 토마토 열매에서 발현된 RBCS1 및 RBCS2 또는 고수준으로 잎새 및 잎관에 있는 엽록소 세포에 거의 배타적으로 발현된 리불로오스 이인산 카복실라아제 프로모터)를 포함한다.
적절한 노화-특이적 프로모터는 열매 숙성, 잎의 노화 및 탈리 동안에 활성인 토마토 프로모터, 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자의 옥수수 프로모터, 82E4의 프로모터 및 SAG 유전자의 프로모터를 포함한다. 적절한 꽃밥-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 적절한 뿌리-우선적 프로모터가 선택될 수도 있다. 적절한 종자-우선적 프로모터는 종자-특이적 프로모터(종자 저장 폴리펩타이드의 프로모터와 같은 종자 발생 동안에 활성인 프로모터들) 및 종자-발아 프로모터(종자 발아 동안에 활성인 프로모터들)을 모두 포함한다. 이러한 종자-우선적 프로모터는 Cim1 (사이토키닌-유도 메세지); cZ19B1 (옥수수 19 kDa 제인); milps (myo-이노시톨-1-포스페이트 합성효소); Zm-40로도 공지된 mZE40-2; nuclc; 및 celA(셀룰로오스 합성효소)를 포함한다. 감마-제인은 배젖-특이적 프로모터다. Glob-1은 배낭-특이적 프로모터다. 쌍자엽의 경우, 종자-특이적 프로모터는 콩 베타-파세올린, 나핀, β-콘글리시닌, 콩 렉틴, 크루시페린 등을 포함한다. 단자엽의 경우, 종자-특이적 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인(zein) 프로모터, 22 kDa 제인 프로모터, 27 kDa 제인 프로모터, g-제인 프로모터, 27 kDa 감마-제인 프로모터 (예컨대 gzw64A 프로모터, Genbank 등록번호 S78780 참조), 왁시(waxy) 프로모터, 수축된 1 프로모터, 수축된 2 프로모터, 글로불린 1 프로모터(Genbank 등록번호 L22344 참조), Itp2 프로모터, cim1 프로모터, 옥수수 end1 및 end2 프로모터, nuc1 프로모터, Zm40 프로모터, eep1 및 eep2; lec1, 티오레독신 H 프로모터; mlip15 프로모터, PCNA2 프로모터; 및 수축된 2 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터의 예시는 병원체 공격, 혐기성 조건, 상승된 온도, 광, 가뭄, 저온, 또는 고농도 염에 반응성이 있는 프로모터를 포함한다. 병원체-유도성 프로모터는 병인성-관련 폴리펩타이드 (PR 폴리펩타이드)로부터 유래된 것을 포함하는데, 이는 다음의 병원체 감염에 의해 유도된다(예를 들어, PR 폴리펩타이드, SAR 폴리펩타이드, 베타-1,3-글루카나아제, 키티나아제).
식물 프로모터와 더불어, 다른 적절한 프로모터는 세균 기원, 예를 들어, 옥토핀 합성효소 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터 및 (Ti 플라스미드로부터 유도되는) 다른 프로모터로부터 유래될 수도 있고, 또는 바이러스 프로모터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 및 19S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 기본구성 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 19S 및 35S 프로모터, 또는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터)로부터 유래될 수도 있다.
폴리뉴클레오타이드를 식물 세포 내에 도입하고, 후속하여 식물 게놈 내에 삽입하는 적합한 방법으로는, 미세주사 (Biotechniques (1986) 4:320-334), 전기천공법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:5602-5606), 아그로박테리움-매개 형질전환(US5,981,840 and US5,563,055), 직접 유전자 전달(EMBO J. (1984) 3:2717-2722) 및 볼리스틱 입자 가속화(ballistic particle acceleration) (US4,945,050, US 5,879,918, US5,886,244, US5,932,782; Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995); 및 Biotechnology (1988) 6:923-926)가 있다.
b. 돌연변이
본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에서 돌연변이를 포함하는 식물 또는 식물 세포가 개시되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이는 NtSUS 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 조절된 기능 또는 활성을 초래한다.
(경화된) 식물 또는 (경화된) 식물 물질에서 NtSUS 폴리펩타이드의 수준을 조절하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은, 적어도 하나의 NtSUS 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 상기 식물의 게놈 내에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자는 본 개시내용에 따른 서열로부터 선택된다.
또한, 조절된 환원당 수준을 갖는 식물을 동정하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은, 관심 있는 식물로부터의 폴리뉴클레오타이드 시료를 본 개시내용에 따른 서열에서의 하나 이상의 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝하는 단계, 및 선택적으로 상기 동정된 돌연변이(들)를 환원당의 수준을 조절하는 것으로 공지된 돌연변이(들)와 상관시키는 단계를 포함하고 있다.
또한, 본 개시내용에 따른 NtSUS 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 식물 또는 식물 세포가 개시되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이는 유전자의 발현 또는 그에 의해 암호화된 NtSUS 폴리펩타이드의 기능 또는 활성의 조절을 초래한다.
생식 교배를 포함하는 다수의 접근법들이 하나의 식물에서 돌연변이를 조합하는 데 이용할 수 있다. 유전자의 발현 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능 또는 활성을 조절하는 본 개시내용에 따른 유전자에서 하나 이상의 유리한 이형접합 또는 동형접합 돌연변이를 갖는 식물은, 그 발현 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능 또는 활성을 조절하는 하나 이상의 다른 유전자에서 하나 이상의 유리한 이형접합 또는 동형접합 돌연변이를 갖는 식물과 교배될 수 있다. 한 구현예에서, 교배는 동일한 식물 내에서 본 개시내용에 따른 유전자 내에 하나 이상의 유리한 이형접합 또는 동형접합 돌연변이를 도입하기 위해 수행된다.
식물에서 본 개시내용에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드의 기능 또는 활성은, 폴리펩타이드 기능 또는 활성이 그 폴리펩타이드의 기능 또는 활성을 억제하도록 변형되지 않았으며 동일한 프로토콜을 사용하여 경작되고 수확되고 경화된 식물에서 동일한 폴리펩타이드(들)의 기능 또는 활성보다 낮은 경우에 증가되거나 감소된다.
일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 돌연변이유발 접근법을 이용하여 식물 또는 식물 세포 내로 도입되며, 도입된 돌연변이는 당업자에게 공지된 방법들 - 예컨대 서던 블롯(Southern blot) 분석, DNA 시퀀싱, PCR 분석 또는 표현형 분석을 이용하여 동정되거나 선별된다. 유전자 발현에 영향을 주는 돌연변이 또는 암호화된 폴리펩타이드의 기능을 방해하는 돌연변이는 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 유전자 엑손에서의 삽입성 돌연변이는 일반적으로 결손 돌연변이체를 초래한다. 보존된 잔기에서의 돌연변이는 암호화된 폴리펩타이드의 대사 기능을 억제하는 데 특히 효과적일 수 있다. 예를 들어, 고도로 보존된 영역들 중 하나 이상에서의 돌연변이는 폴리펩타이드 기능을 변경시킬 가능성이 있는 반면, 고도로 보존된 영역들 외부의 돌연변이는 폴리펩타이드 기능에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 가능성이 있는 것으로 이해할 것이다. 또한, 단일 뉴클레오타이드에서의 돌연변이는 정지 코돈을 생성할 수 있으며, 이는 절단된 폴리펩타이드를 생성할 수 있고, 절단 정도에 따라, 기능 손실을 초래한다.
돌연변이체 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드를 수득하기 위한 방법이 또한 개시되어 있다. 식물 세포 또는 식물 물질을 포함해서, 관심있는 임의의 식물은 자리-특이적 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오타이드-특이적 돌연변이 유발, 화학적-유도 돌연변이 유발, 방사-유도 돌연변이 유발, 변형된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 간격 이중체 DNA(gapped duplex DNA)를 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 파괴 돌연변이 유발, 수선-결핍 숙주 균을 이용하는 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, DNA 셔플링(shuffling) 및 기타 동등한 방법들을 포함해서, 돌연변이 유발을 유도하기 위해서 공지된 다양한 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드의 단편들이 또한 개시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드의 단편은 고유의 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 보유하고 이에 따라 식물에서 대사산물 수송 네트워크에 관여하는 폴리펩타이드 단편을 암호화할 수 있다. 대안적으로, 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 유용한 폴리뉴클레오타이드의 단편들은 일반적으로 생물학적 활성을 보유하는 단편 폴리펩타이드를 암호화하지 않는다. 또한, 개시된 폴리뉴클레오타이드의 단편들은 본원에 논의된 바와 같이, 재조합 작제물 내에 조립될 수 있는 것들을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 단편들은 적어도 약 25개 뉴클레오타이드, 약 50개 뉴클레오타이드, 약 75개 뉴클레오타이드, 약 100개 뉴클레오타이드, 약 150개 뉴클레오타이드, 약 200개 뉴클레오타이드, 약 250개 뉴클레오타이드, 약 300개 뉴클레오타이드, 약 400개 뉴클레오타이드, 약 500개 뉴클레오타이드, 약 600개 뉴클레오타이드, 약 700개 뉴클레오타이드, 약 800개 뉴클레오타이드, 약 900개 뉴클레오타이드, 약 1000개 뉴클레오타이드, 약 1100개 뉴클레오타이드, 약 1200개 뉴클레오타이드, 약 1300개 뉴클레오타이드, 또는 약 1400개 뉴클레오타이드 및 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 최대 전장 폴리뉴클레오타이드 범위일 수도 있다. 폴리펩타이드의 단편들은 적어도 약 25개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 및 본원에 기재된 최대 전장 폴리펩타이드 범위일 수도 있다. 돌연변이 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 돌연변이 폴리펩타이드 변이체를 포함하는, 비-자연발생 돌연변이 또는 유전자이식 식물(예를 들어, 돌연변이, 비-자연발생, 유전자이식, 인공 또는 유전자 조작 식물) 또는 식물 세포를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 적절하게는, 돌연변이 폴리펩타이드 변이체는 돌연변이되지 않은 폴리펩타이드의 기능을 보유한다. 돌연변이 폴리펩타이드 변이체의 기능은 돌연변이되지 않은 폴리펩타이드보다 높거나, 낮거나 또는 거의 동일할 수도 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에서의 돌연변이는 인공 돌연변이 또는 합성 돌연변이 또는 유전자 조작 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에서의 돌연변이는 시험관 내 또는 생체 내 조작 단계를 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에서의 돌연변이는 인간에 의한 개입을 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에서 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법은 화학적 돌연변이유발 및 방사선 돌연변이유발을 포함할 수 있다. 화학적 돌연변이유발은 돌연변이를 유도하기 위해 외생적으로 부가된 화학물질들 - 예컨대 돌연변이원성, 기형발생성 또는 발암성 유기 화합물들-의 사용을 포함한다. 화학적 돌연변이원 또는 방사선을 포함해서, 점 돌연변이 및 짧은 결실, 삽입, 미스센스 돌연변이, 단순 서열 반복, 전좌, 및/또는 전이를 일차적으로 생성하는 돌연변이원이 돌연변이를 형성하는 데에 사용될 수도 있다. 돌연변이원은, 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로소우레아, 트리에틸멜라민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 모노머, 멜파란, 질소 머스타드(mustard), 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(자)안트라센, 에틸렌 산화물, 헥사메틸포스포아미드, 바이술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄, 디에폭시부탄, 기타 등등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-(에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함한다.
원하는 표현형을 유발한다면, 돌연변이원에 의해서 직접적으로 야기되지 않은 좌위에서의 자발적 돌연변이가 또한 고려된다. 또한 적절한 돌연변이 유인제는 예를 들어, X-선, 감마선, 고속 중성자 조사 및 UV 방사와 같은 이온화 방사선을 포함한다. 돌연변이유발 화학물질 또는 방사선의 단위용량은 각각의 식물 조직 유형에 대해 실험적으로 결정되어 치사율 또는 생식 불임성을 특징으로 하는 임계 수준 미만인 돌연변이 빈도가 얻어지도록 한다. 당업자에게 공지된 식물 폴리뉴클레오타이드 제조의 임의의 방법이 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
돌연변이 공정은 하나 이상의 식물 교배 단계를 포함할 수 있다.
돌연변이 후에, 스크리닝은 조기 정지 코돈 또는 다른 한편으로는 비-기능적인 유전자를 형성하는 돌연변이를 식별하기 위해서 수행될 수 있다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 증가 또는 감소된 수준에서 발현될 수 있는 기능적 유전자를 형성하는 돌연변이를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 서열결정에 의해서나, 유전자 또는 폴리펩타이드에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 사용해서 수행될 수 있다. 조절된 유전자 발현, mRNA의 조절된 안정성, 또는 폴리펩타이드의 조절된 안정성을 야기할 수 있는, 폴리뉴클레오타이드에서의 특이적인 돌연변이는 또한 형성될 수 있다. 이러한 식물은 "비-자연발생" 또는 "돌연변이체" 식물로서 본원에서 지칭된다. 전형적으로, 돌연변이 또는 비-자연발생 식물은 조작되기 이전에 식물에 존재하지 않았던 외래 또는 합성 또는 인공 뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 외래 뉴클레오타이드는 적어도 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500 또는 그 이상의 연속된 또는 비-연속된 뉴클레오타이드와 같은, 단일 뉴클레오타이드, 2개 이상의 뉴클레오타이드, 2개 이상의 연속된 뉴클레오타이드 또는 2개 이상의 비-연속된 뉴클레오타이드일 수 있다.
c. 유전자이식 및 유전자 편집( transgenics and editing)
돌연변이유발 외에도, NtSUS 폴리뉴클레오타이드 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드 중 하나 이상의 발현 또는 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 조성물은 하나 이상의 내인성 유전자(들)의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오타이드; RNA 전사체(예, 이중-가닥 RNA, siRNA, 리보자임)의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오타이드; 하나 이상의 폴리펩타이드의 안정성을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리펩타이드; 기질 또는 조절 폴리펩타이드와 관련해서 하나 이상의 폴리펩타이드의 효소 기능 또는 하나 이상의 폴리펩타이드의 결합 기능을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오타이드; 하나 이상의 폴리펩타이드에 대한 특이성을 나타내는 항체; 하나 이상의 폴리펩타이드의 안정성 또는 하나 이상의 폴리펩타이드의 효소 기능 또는 하나 이상의 폴리펩타이드의 결합 기능을 간섭할 수 있는 소분자 화합물; 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 아연 핑거 폴리펩타이드; 및 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대한 기능을 가지는 메가뉴클레아제를 포함한다. 유전자 편집 기술, 유전적 편집 기술 및 게놈 편집 기술이 본 기술분야에 주지되어 있다.
d. 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease)
아연 핑거(Zinc finger)는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 발현 또는 기능 또는 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열의 부분 또는 전부를 포함하는 게놈 DNA 서열은 아연 집게 뉴클레아제 매개 돌연변이 유발에 의해 변형된다. 게놈 DNA 서열은 아연 핑거 폴리펩타이드 결합을 위한 특이한 부위로 검색된다. 대안적으로, 게놈 DNA 서열은 아연 핑거 폴리펩타이드 결합을 위한 두 개의 특이한 부위로 검색되며, 여기서 상기 두 부위는 모두 대향하는 가닥에 위치해 있으며 함께 인접해 있는데, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 염기쌍 만큼 떨어져 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 아연 핑거 폴리펩타이드가 제공된다.
아연 핑거 폴리펩타이드는 유전자에서 선택된 표적 부위를 인식하기 위해 조작될 수도 있다. 아연 핑거 폴리펩타이드는 자연적인 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 비-자연적인 아연 핑거 DNA-결합 도메인으로부터 절단(truncation) 또는 확장 또는 선별 방법, 예를 들어, 이에 한정하는 것은 아니지만, 파지 표시 선별, 세균 2-혼성 선별 또는 세균 1-혼성 선별과 연결된 부위-특이적 돌연변이유발 공정에 의하여 유도되는 모티프(motif)의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "비-자연적인 아연 핑거 DNA-결합 도메인"은 표적 폴리뉴클레오타이드 내의 3-염기쌍 서열을 결합하고, 변형될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 유기체에서 발생하지 않는, 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 나타낸다. 표적 유전자에 고유한 특이적 폴리뉴클레오타이드를 결합하는 아연 핑거 폴리펩타이드를 고안하기 위한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다.
다른 구현예들에서, 아연 핑거 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드의 조절 서열에 결합하도록 선택될 수도 있다. 더욱 구체적으로, 조절 서열은 전사 개시 자리, 개시 코돈, 엑손 영역, 엑손-인트론 경계, 종결자, 정지 코돈을 포함할 수도 있다. 따라서 본 발명은 본원에 기재한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 부근 또는 내부에서의 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발에 의해 생성되는, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 식물 세포, 및 아연 핑거 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발에 의해 이러한 식물 또는 식물 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 아연 핑거 폴리펩타이드와 아연 핑거 뉴클레아제를 식물로 전달하기 위한 방법은 메가뉴클레아제의 전달을 위해 이하에 기재된 것들과 유사하다.
e. 메가뉴클레아제 ( meganuclease )
또 다른 측면에서, I-CreI와 같은 메가뉴클아제를 사용해서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 또는 그렇지 않으면 유전적으로 변형된 식물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 자연발생 메가뉴클레아제뿐만 아니라 재조합 메가뉴클레아제는 식물의 게놈 DNA 내의 단일 자리 또는 상대적으로 적은 자리에 구체적으로 이중가닥 파손을 야기하여 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 파괴하는 데에 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 변경된 DNA-인식 성능을 가지는 조작된 메가뉴클레아제일 수도 있다. 메가뉴클레아제 폴리펩타이드는 본 기술분야에 공지된 다양한 상이한 메커니즘에 의해 식물 세포로 전달될 수 있다.
본원은 식물 세포 또는 식물에서 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기재된 이들의 임의의 조합)를 불활성시키는 메가뉴클레아제의 용도를 포함한다. 특히, 본 발명은 메가뉴클레아제를 사용하여 식물에서 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 불활성화시키기 위한 방법을 제공하는데, (a) 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물 세포를 제공하는 단계; (b) 메가뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 암호화하는 작제물을 상기 식물 세포로 도입하는 단계; 및 (c) 상기 메가뉴클레아제가 상기 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)를 실질적으로 불활성화시킬 수 있게 하는 단계를 포함한다.
메가뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드의 암호화 영역 내에 메가뉴클레아제 인식 부위를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절단은 종종 비-상동 말단 결합에 의한 돌연변이 DNA 수선을 따르는 메가뉴클레아제 인식 부위에서 DNA가 결실되는 결과를 가져온다. 유전자 암호화 서열에서의 이러한 돌연변이는 전형적으로 유전자를 불활성화하기에 충분하다. 식물 세포를 변형시키기 위한 이러한 방법은 첫째로 적절한 형질전환 방법을 사용하여 식물 세포로 메가뉴클레아제 발현 카세트를 전달하는 것을 포함한다. 최대 효율을 위해, 메가뉴클레아제 발현 카세트를 선택성(selectable) 마커에 연결시키고 선택제의 존재 하에 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이 접근법은 메가뉴클레아제 발현 카세트를 게놈 내로 통합시키는 결과를 가져올 것이지만, 식물에 조절 승인이 요구되는 경우에는 바람직하지 않을 수도 있다. 이러한 경우에, 메가뉴클레아제 발현 카세트(및 연결된 선택성 마커 유전자)가 통상적인 육종 기술을 사용해서 후속 식물 세대에서 떨어져 나갈 수도 있다.
메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달 이후, 식물 세포는, 처음에는, 사용된 구체적인 형질전환 절차에 대해 전형적인 조건 하에서 생장한다. 이것은 종종 어둠에서 26˚C 미만의 온도에서 매질 위에서 생장하는 형질전환된 세포를 의미할 수도 있다. 이러한 표준 조건은 기간, 바람직하게는 1-4일 동안 사용되어서 식물 세포가 형질전환 공정으로부터 복구될 수 있도록 할 수 있다. 이러한 초기의 복구 기간을 따르는 임의의 지점에서, 생장온도를 올려서, 상기 조작된 메가뉴클레아제의 기능을 자극해서 메가뉴클레아제 인식 부위를 절단하고 돌연변이시킬 수도 있다.
f. TALEN
한 가지 유전자 편집 방법은 세포가 수선 메커니즘에 반응할 수 있는 이중가닥 파단을 유도하는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN)를 사용하는 것을 포함한다. NHEJ은 어닐링을 위한 서열 중첩이 거의 없거나 전무한 경우에 이중-가닥 파단의 각 측으로부터 DNA를 다시 연결한다. 이러한 수선 메커니즘은 삽입 또는 결실, 또는 염색체 재배열을 통해 게놈의 오류를 유발한다. 그러한 임의의 오류는 비-기능성 위치에서 암호화되는 유전자 산물을 제공할 수도 있다. 소정의 적용분야의 경우, NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 식물의 게놈으로부터 정확하게 제거시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 적용분야는 한 쌍의 조작된 메가뉴클레아제를 이용할 수 있는데, 이들 각각은 의도된 결실의 양쪽 면 위에서 메가뉴클레아제 인식 자리를 절단한다. 유전자를 인식하고 그것에 결합하며 게놈 내로 이중-가닥 파단을 도입할 수 있는 TALEN도 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, TAL 효과기 뉴클레아제를 사용해서 본원에 기재된 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 또는 그렇지 않으면 유전자 변형된 식물이 고려된다.
g. CRISPR / Cas
또 다른 유전자 편집 방법은 세균 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 포함한다. 세균과 고세균은 바이러스 및 플라스미드 DNA를 침입하는 것에 대항하는 적응성 면역 시스템의 일부인 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)이라고 불리는 염색체 요소를 보여주고 있다. II 유형 CRISPR 시스템에서, CRISPR RNA(crRNA)는 trans-activating crRNA (tracrRNA) 및 CRISPR-associated (Cas) 폴리펩타이드로 기능해서 표적 DNA의 이중-가닥 파단을 도입한다. Cas9에 의한 표적 절단은 crRNA과 tracrRNA 사이의 염기 쌍 뿐만 아니라 crRNA와 표적 DNA 사이의 염기 쌍이 필요하다. 표적 인식은 NGG 서열을 따르는 protospacer-adjacent motif (PAM)라고 불리는 짧은 모티브의 존재에 의해 촉진된다. 이 시스템은 게놈 편집을 위해 이용될 수 있다. Cas9는 보통 crRNA 및 tracrRNA로 이루어진 이중 RNA에 의해 프로그래밍된다. 그러나, 이들 RNA의 코어 성분은 Cas9 표적화를 위한 단일 혼성체 '가이드 RNA'에 결합될 수 있다. 자리 특이적 절단을 위한 표적 DNA에 대해 비-암호화 RNA 가이드를 사용하면 TALEN 같은 기존의 기술보다 훨씬 더 간단하다는 것을 약속한다. CRISPR/Cas 전략을 사용하여, 뉴클레아제 복합체를 재표적화하는 것은 단지 새로운 RNA 서열의 도입만을 필요로 하며, 폴리펩타이드 전사 인자의 특이성을 재조작할 필요가 없다. CRISPR/Cas 기술은 국제 출원 WO 2015/189693 A1의 방법에서 식물에서 구현되었으며, 이는 식물 종에 걸쳐 광범위하게 적용 가능한 바이러스-매개 게놈 편집 플랫폼을 개시하고 있다. 담배 뿌리 바이러스(TRV)의 RNA2 게놈을 조작해서, 가이드 RNA를 Cas9 엔도뉴클레아제를 과발현하는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물 내로 운반하고 전달하였다. 본 개시내용의 맥락에서, 가이드 RNA는 본원에 개시된 임의의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 서열 및 식물 세포의 게놈을 편집하고 원하는 돌연변이체 식물을 얻기 위해 적용되는 WO 2015/189693 A1의 교시로부터 유래할 수 있다. 기술 개발의 빠른 속도는 식물계에서 광범위한 적용가능성을 갖는 매우 다양한 프로토콜을 생성시켰으며, 이들은 많은 최근의 과학적 검토 논문들(예를 들어, Plant Methods (2016) 12:8; 및 Front Plant Sci . (2016) 7: 506)에서 목록으로 잘 나타나 있다. 구체적인 식물류에서의 적용분야에 중점을 둔 CRISPR/Cas 시스템의 검토는 Biotechnology Advances (2015) 33, 1, p41-52에 있다. Bortesi 및 Fischer 또한 CRISPR/Cas 기술, 징크 핑거 뉴클레아제 및 TALEN 간을 비교하고 있다. 식물 게놈을 조작하기 위한 CRISPR/Cas 사용에 있어서의 보다 최근의 개발은 Acta Pharmaceutica Sinica B (2017) 7, 3, p292-302) 및 Curr . Op. in Plant Biol . (2017) 36, 1-8에서 논의되고 있다. 식물에서 사용하기 위한 CRISPR/Cas9 플라스미드는 비-영리 플라스미드 저장소(addgene.org)인, "addgene"에 나열되어 있으며, CRISPR/Cas 플라스미드는 상업적으로 이용 가능하다.
h. 안티센스 ( antisense ) 변형
안티센스 기술은 NtSUS 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 조절하는 데 사용될 수 있는 다른 주지의 방법이다. 억제될 NtSUS 유전자의 폴리뉴클레오타이드는 클로닝되고 조절 영역 및 전사 종결 서열에 작동적으로 연결되어서 RNA의 안티센스 가닥이 전사될 수 있게 된다. 그런 다음 재조합 작제물은 식물 세포 내로 형질전환되고 RNA의 안티센스 가닥이 생산된다. 폴리뉴클레오타이드는 억제될 유전자의 전체 서열일 필요는 없지만, 전형적으로 억제될 유전자의 센스 가닥의 적어도 일부분에 실질적으로 상보적일 것이다.
폴리뉴클레오타이드는 리보자임, 또는 촉매 RNA 내로 전사될 수도 있는데, 이것은 mRNA의 발현에 영향을 미친다. 리보자임은 사실상 어느 표적 RNA에 특정하게 쌍을 이루도록 고안되고 특정 위치에서 포스포디에스테르 구조를 절단할 수 있고, 그에 의해서 표적 RNA를 기능적으로 불활성시킬 수 있다. 이형 폴리뉴클레오타이드는 특정한 mRNA 전사체를 절단하도록 고안된 리보자임을 암호화함에 따라, 폴리펩타이드의 발현을 막을 수 있다. 부위-특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 다양한 리보자임이 사용될 수 있지만, 망치머리형 리보자임(hammerhead ribozyme)이 특정한 mRNA를 파괴하는 데 유용하다. 망치머리형 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 측면영역(flanking region)에 의해 생긴 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 요건은 표적 RNA가 5'-UG-3' 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 것이다. 망치머리형 리보자임의 구조 및 생산이 본 기술분야에 공지되어 있다. 망치머리형 리보자임 서열은 전달 RNA (tRNA) 같은 안정적인 RNA에 끼어 들어가서 생체 내 절단 효능을 증가시킬 수 있다.
한 구현예에서, RNA 전사체(들)의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이적 폴리뉴클레오타이드는 RNA를 간섭한다. RNA 간섭 또는 RNA 침묵(silencing)은 특이적인 mRNA가 효소 변성을 목표로 삼을 수 있는 진화적으로 보존되는 공정이다. 이중-가닥 RNA(이중가닥 RNA)는 세포 (예를 들어, 이중-가닥 RNA 바이러스, 또는 간섭 RNA 폴리뉴클레오타이드)에 의해서 도입되거나 또는 생산되어서 간섭 RNA 경로를 개시한다. 이중-가닥 RNA는, 이중-가닥 RNA-특이적 엔도뉴클레아제인, RNases III에 의해 21-24 bp 길이의 다중 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 이중체로 변환될 수 있다. siRNA는 ATP-의존 공정을 통해서 siRNA의 풀림을 촉진하는 RNA-유도 침묵 복합체에 의해 후속적으로 인식될 수 있다. siRNA의 풀린 안티센스 가닥은 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체를, siRNA 안티센스 가닥에 대해 상보적인 서열을 포함하는 표적 mRNA로 유도한다. 표적 mRNA 및 안티센스 가닥은 A-형 나선을 형성할 수 있고, A-형 나선의 주된 홈(groove)은 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체에 의해 인식될 수 있다. 표적 mRNA는 siRNA 가닥의 5'-말단의 결합 자리에 의해서 정의되는 하나의 자리에서 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체에 의해서 절단될 수 있다. 활성화된 RNA-유도 침묵 복합체는 또 다른 절단 경우를 촉매하기 위해서 재활용될 수 있다.
간섭 RNA 발현 벡터는 mRNA, pre-mRNA, 또는 관련 RNA 변이체의 발현 수준을 감소시켜서 RNA 간섭을 나타내는 간섭 RNA 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 간섭 RNA 작제물을 포함할 수도 있다. 발현 벡터는 본원에서 더 설명된 바와 같이, 상류에 위치하고 간섭 RNA 작제물에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수도 있다. 간섭 RNA 발현 벡터는 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호, 및 다양한 선택성 마커와 같은 당업자에게 공지된 다른 서열을 포함해서, 적절한 최소 코어 프로모터, 관심있는 간섭 RNA 구성체, 상류 (5') 조절 영역, 하류 (3') 조절 영역을 포함할 수도 있다.
이중-가닥 RNA 분자는 줄기-고리 구조의 단일 올리고뉴클레오타이드로부터 조립된 siRNA, 뿐만 아니라 자가 상보성 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 2개 이상의 고리 구조 및 줄기를 가지는 원형 단일-가닥 RNA를 포함할 수도 있는데, 여기서 siRNA 분자의 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역이 폴리뉴클레오타이드계 또는 비-폴리뉴클레오타이드계 링커(들)에 의하여 연결된 것이고, 여기서 원형 RNA는 생체 내 또는 시험관 내에서 간섭 RNA를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생성하도록 처리될 수 있다.
작은 헤어핀 RNA 분자들의 용도가 또한 고려된다. 그것들은 역상보성 (센스) 서열과 더불어, 특이적인 안티센스 서열을 포함하는데, 전형적으로 스페이서 또는 루프 서열에 의해서 분리되어 있다. 스페이서 또는 루프의 절단은 단일가닥 RNA 분자 및 그의 역보체를 제공해서, 그들이 결합되어 이중가닥 RNA 분자를 형성할 수도 있다(선택적으로 각각 또는 모든 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에서 한 개, 두 개, 세 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 가져올 수도 있는 후속적인 처리 단계들에 의함). 스페이서는 충분히 길어서, 스페이서 절단(그리고, 선택적으로, 각각 또는 모든 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에서 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 가져올 수도 있는 후속적인 처리 단계들) 이전에, 안티센스 및 센스 서열이 이중-가닥 구조(또는 줄기)를 결합하고 형성할 수 있게 한다. 스페이서 서열은 일반적으로 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드로 어닐링될 때, 작은 헤어핀 RNA를 포함하는, 두 개의 상보성 폴리뉴클레오타이드 영역 사이에 위치하는 무관한 폴리뉴클레오타이드이다. 스페이서 서열은 일반적으로 약 3 내지 약 100개의 뉴클레오타이드를 포함하고 있다.
관심있는 RNA 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀 이중체를 생산하기 위해서 적절한 서열 조성, 루프 크기, 및 줄기 길이를 선택하여 생산될 수 있다. 헤어핀 이중체의 줄기 길이를 고안하기에 적절한 범위는 약 14-30 뉴클레오타이드와 같은- 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 뉴클레오타이드, 약 30-50 뉴클레오타이드, 약 50-100 뉴클레오타이드, 약 100-150 뉴클레오타이드, 약 150-200 뉴클레오타이드, 약 200-300 뉴클레오타이드, 약 300-400 뉴클레오타이드, 약 400-500 뉴클레오타이드, 약 500-600 뉴클레오타이드, 및 약 600-700 뉴클레오타이드의 줄기 길이를 포함한다. 헤어핀 이중체의 루프 길이를 고안하기에 적절한 범위는, 헤어핀 이중체의 줄기 길이가 상당하다면 약 4-25 뉴클레오타이드, 약 25-50 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 루프 길이를 포함한다. 소정의 구현예들에서, 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 40의 뉴클레오타이드다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 35의 뉴클레오타이드의 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 17 내지 약 30의 뉴클레오타이드의 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 19 내지 약 25의 뉴클레오타이드의 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 21 내지 약 23 뉴클레오타이드의 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 소정의 구현예들에서, 21 뉴클레오타이드보다 긴 이중체 영역을 가지는 헤어핀 구조는 루프 서열과 길이에 관계없이, 효과적인 siRNA-유도 침묵을 촉진할 수도 있다. RNA 간섭에 대한 예시적인 서열이 본원에 기재되어 있다.
표적 mRNA 서열은 전형적으로 길이가 약 14 내지 약 50의 뉴클레오타이드다. 따라서, 표적 mRNA는 바람직하게는 다음의 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 14 내지 약 50의 뉴클레오타이드 길이의 영역에 대해 스캐닝될 수 있다: A+T/G+C 비율이 약 2:1 내지 약 1:2일 것; 5' 말단에 AA 디뉴클레오타이드 또는 CA 디뉴클레오타이드가 존재할 것; 표적 mRNA에 고유한 적어도 10개의 연속된 뉴클레오타이드의 서열(즉, 동일한 식물로부터의 다른 mRNA에 존재하지 않는 서열); 및 3개 초과의 연속된 구아닌(G) 뉴클레오타이드 또는 3개 초과의 연속된 시토신(C) 뉴클레오타이드가 "배치(run)"되지 않을 것. 이러한 기준은 본 기술분야에 공지된 다양한 기술을 이용해서 측정될 수 있는데, 예를 들어 BLAST 같은 컴퓨터 프로그램을 사용해서, 선택된 서열이 표적 mRNA에 대해 고유한지 여부를 결정하기 위해 공개적으로 이용할 수 있는 데이터베이스를 검색할 수 있다. 대안적으로, 서열 (및 고안된 siRNA 서열)은 시판중인 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어, 시판중인 OligoEngine, Target Finder 및 siRNA Design Tool)를 사용해서 선택될 수 있다.
한 구현예에서, 표적 mRNA 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 14 내지 약 30 길이의 뉴클레오타이드에서 선택된다. 또 다른 구현예에서, 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 16 내지 약 30 길이의 뉴클레오타이드에서 선택된다. 추가적인 구현예에서, 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는 약 19 내지 약 30 길이의 뉴클레오타이드에서 선택된다. 또 다른 구현예에서, 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는, 약 19 내지 약 25 길이의 뉴클레오타이드에서 선택된다.
예시적인 구현예에서, siRNA 분자는 본원에 기재된 임의의 하나의 폴리뉴클레오타이드 중의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오타이드에 대해 상보적인 특이적 안티센스 서열을 포함한다.
siRNA 분자에 포함되는 특이적 안티센스 서열은 상보체와 동일하거나, 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 한 구현예에서, siRNA 분자에 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA 서열의 상보체에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 University of Wisconsion Computer Group (GCG) 소프트웨어 또는 NCBI 웹사이트에서 제공되는 BLASTIN 프로그램을 사용해서 결정될 수 있다.
식물에 이중 가닥 RNA-침묵을 유도하기 위한 하나의 방법은 헤어핀 RNA를 생산하는 유전자 작제물에 의한 형질전환이다(Nature (2000) 407, 319-320 참조). 이러한 작제물은 표적 유전자 서열의 역 영역을 포함하는데, 적절한 스페이서에 의해서 분리되어 있다. 스페이서 단편으로서 기능적인 식물 인트론 영역을 삽입하는 것은 인트론 접합 헤어핀 RNA를 생성시키기 때문에 유전자 침묵 유도의 효능을 추가적으로 증가시킨다(Plant J. (2001), 27, 581-590). 적합하게는, 줄기 길이는 길이가 약 50 뉴클레오타이드 내지 약 1 킬로베이스(kilobase)이다. 인트론 접합 헤어핀 RNA를 생산하기 위한 방법이 본 기술분야에 잘 기재되어 있다(예를 들어, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617 참조).
이중체 또는 이중-가닥 구조, 예를 들어 이중-가닥 RNA 또는 작은 헤어핀 RNA를 가지는 간섭 RNA 분자는 둔단(blunt end)을 가지거나 또는 3' 또는 5' 돌출(overhang)을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는, "돌출(overhang)"은 하나의 RNA 가닥의 3’-말단이 다른 가닥의 5' 말단 위로 확장될 때(3' 돌출), 또는 그 반대일 때(5' 돌출) 이중체 구조로부터 돌출되는, 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들을 의미한다. 돌출을 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 한 구현예에서, 간섭 RNA 분자의 적어도 한 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6 뉴클레오타이드인 3' 돌출을 가진다. 다른 구현예들에서, 3' 돌출은 길이가 약 1 내지 약 5 뉴클레오타이드, 약 1 내지 약 3 뉴클레오타이드 및 약 2 내지 약 4 뉴클레오타이드다.
간섭 RNA 분자가 분자의 하나의 말단에서 3' 돌출을 포함할 때, 다른 말단은 둔단일 수 있거나 또는 돌출(5' 또는 3')을 가질 수 있다. 간섭 RNA 분자가 분자의 양쪽 말단 전부에서 돌출을 포함할 때, 돌출들의 길이는 동일하거나 상이할 수도 있다. 한 구현예에서, 간섭 RNA 분자는 분자의 양쪽 말단 전부에 약 1 내지 약 3 뉴클레오타이드의 3' 돌출을 포함한다. 추가의 구현예에서, 간섭 RNA 분자는 분자의 양쪽 말단 전부에서 2 뉴클레오타이드의 3' 돌출을 가지는 이중-가닥 RNA이다. 그러나 또 다른 구현예에서, 간섭 RNA의 돌출을 포함하는 뉴클레오타이드는 TT 디뉴클레오타이드 또는 UU 디뉴클레오타이드다.
간섭 RNA 분자는 하나 이상의 5' 또는 3'-캡(cap) 구조를 포함할 수 있다. 용어 "캡 구조"는 올리고뉴클레오타이드의 말단 중 하나에서 포함된 화학적 변형을 의미하고, 이것은 분자를 엑소뉴클레아제 변성으로부터 보호하고, 또한 세포 내에서 전달 또는 위치결정을 용이하게 할 수 있다.
간섭 RNA 분자에 적용할 수 있는 또 다른 변형은 간섭 RNA 분자의 기능, 세포 분포, 세포 섭취, 생체이용가능성 또는 안정성을 증강시키는 하나 이상의 부분 또는 접합체의 간섭 RNA 분자에 대한 화학적 연결이다. 폴리뉴클레오타이드는 본 기술분야에 잘 정립되어 있는 방법에 의해 합성되거나 변형될 수도 있다. 화학적 변형은 2' 변형, 비-천연 염기의 도입, 리간드에 대한 공유결합, 및 인산염 결합의 티오인산 결합으로의 대체를 포함한다. 본 구현예에서, 이중체 구조의 온전성은 적어도 하나, 및 전형적으로 두 가지 이상의 화학적 결합에 의해서 강화된다.
두 개의 단일가닥 중 하나 또는 전부의 뉴클레오타이드는 변형되어서 세포 효소, 예를 들어 제한 없이 소정의 뉴클레아제와 같은 것의 활성을 조절할 수도 있다. 세포 효소의 활성을 조절하기 위한 기술은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 2'-아미노 변형, 2'-플루오로 변형, 2'-알킬 변형, 비전하된 골격 변형, 모르폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형, 및 포스포라미데이트를 포함해서 본 기술분야에 공지되어 있다.
리간드는 간섭성 RNA 분자에 접합되어서 예를 들어 그의 세포 흡수를 강화시킬 수도 있다. 소정의 구현예들에서, 소수성 리간드가 분자에 접합되어서 세포막의 직접 침투를 용이하게 한다. 소정의 예들에서, 올리고뉴클레오타이드에 대한 양이온 리간드의 접합은 종종 뉴클레아제에 대한 개선된 내성을 야기한다.
"Targeted Induced Local Lesions In Genomes" (TILLING)은 변형된 발현, 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생성 및/또는 동정하는 데 사용될 수 있는 다른 돌연변이유발 기술이다. 틸링은 또한 이러한 돌연변이체를 운반하는 식물의 선별을 가능하게 한다. 틸링은 고 처리율(high-throughput) 스크리닝 방법과 고밀도 돌연변이유발을 결합한다. 틸링을 위한 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(McCallum 외, (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457 및 Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50 참조).
다양한 구현예는 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 간섭 RNA 작제물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예는 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 작제물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예는 헤어핀 구조를 형성하기 위해 자가-어닐링(annealing)할 수 있는 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 하나 이상의 간섭 RNA 작제물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 작제물은 (a) 본원에서 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드; (b) 헤어핀 구조의 루프를 형성하는, 스페이서 요소를 암호화하는 두번째 서열; 및 (c)　상기 첫번째 서열의 역상보성 서열을 포함하고 상기 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치하는 세번째 서열을 포함하고, 여기서 상기 두번째 서열은 상기 첫번째 서열과 상기 세번째 서열 사이에 위치하고, 그리고 상기 두번째 서열은 상기 첫번째 서열과 상기 세번째 서열에 작동적으로 연결된 것이다.
개시한 NtSUS 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀 구조를 형성하지 않는 다양한 폴리뉴클레오타이드를 구성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥 RNA는 (1) 첫번째 프로모터에 작동적으로 연결되어 DNA의 첫번째 가닥을 전사하고, (2) 두번째 프로모터에 작동적으로 연결되어 DNA 단편의 상기 첫번째 가닥의 역상보성 서열을 전사하여 형성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 각각의 가닥은 동일한 발현 벡터, 또는 상이한 발현 벡터로부터 전사될 수 있다. RNA 간섭을 가지는 RNA 이중체는 siRNA로 효소적으로 변환되어서 RNA 수준을 조절할 수 있다.
따라서 다양한 구현예는 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 또는 자가-어닐링할 수 있는 간섭 RNA 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 본원에 기재된 간섭 RNA 작제물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 상기 작제물은 (a) 본원에서 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 상기 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치한, 첫번째 서열의 상보성(예를 들어, 역상보성) 서열을 포함하는 두번째 서열을 포함한다.
다양한 조성물 및 방법은 유전자 발현의 공동-억제(co-suppression)를 촉진하여 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리펩타이드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 내인성 발현 수준을 조절하기 위해 제공된다.
다양한 조성물 및 방법은 mRNA의 번역을 조절하여 내인성 유전자 발현 수준을 조절하기 위해서 제공된다. 숙주 (담배) 식물 세포는, 프로모터와 관련해서 안티센스 배향으로 위치하는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되어서, mRNA의 일부분에 서열 상보성을 가지는 RNA 폴리뉴클레오타이드의 발현을 가능하게 하는 프로모터를 포함하는, 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
mRNA의 번역을 조절하기 위한 다양한 발현 벡터는 그 서열이 프로모터와 관련해서 안티센스 배향으로 위치하는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수도 있다. 안티센스 RNA 폴리뉴클레오타이드의 길이는 다양할 수 있으며, 약 15-20 뉴클레오타이드, 약 20-30 뉴클레오타이드, 약 30-50 뉴클레오타이드, 약 50-75 뉴클레오타이드, 약 75-100 뉴클레오타이드, 약 100-150 뉴클레오타이드, 약 150-200 뉴클레오타이드, 및 약 200-300 뉴클레오타이드일 수도 있다.
i. 이동성 유전 인자(Mobile genetic element)
다른 한편으로는, 전위인자(transposon)(예를 들어, IS 요소)를 관심있는 식물의 유전체로 도입하여 유전자가 불활성되도록 표적화될 수 있다. 이러한 이동성 유전 인자는 유성 교배-수정에 의해 도입될 수 있고 삽입 돌연변이는 폴리펩타이드 기능 손실을 위해 스크리닝될 수 있다. 부모 식물에 있는 손상된(disrupted) 유전자는 다른 식물로 도입될 수 있는데, 이것은 부모 식물을, 예를 들어 유성 교배-수정에 의해서, 전위인자-유도 돌연변이 유발을 거치지 않는 식물과 교배함에 의한 것이다. 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 표준 육종 기술이 채택될 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 전위인자의 삽입에 의해서 불활성될 수 있다. 하나 이상의 유전자가 손상되면, 돌연변이는 하나 이상의 유전자의 동형 손상, 하나 이상의 유전자의 이형 손상, 또는 동형 및 이형 손상 전부의 조합을 유발할 수 있다. 적절한 전위성 요소는 역전위인자, 레트로포존, 및 SINE-형 인자를 포함한다. 이러한 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
j. 리보자임 ( ribozyme )
대안적으로, NtSUS 폴리뉴클레오타이드는 식물에서 자가-절단 및 복제할 수 있는 많은 작은 원형 RNA로부터 유도되는 리보자임을 도입하여 불활성을 표적으로 할 수 있다. 이러한 RNA는 단독으로든지(바이로이드 RNA) 또는 보조 바이러스(위성 RNA)로 복제할 수 있다. 적절한 RNA의 예시는 아보카도 선블로치(sunblotch) 바이로이드(viroid)로부터 유래한 것들 및 담배 둥근무늬 바이러스, 루체른 일시적 줄무늬 바이러스, 벨벳 담배 반점 바이러스, 솔라넘 노디플로름 반점 바이러스, 및 지하 클로버 반점 바이러스로부터 유래한 위성 RNA를 포함한다. 다양한 표적 RNA-특이적 리보자임은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
4. 식물
돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 그들의 유전자 또는 그 유전자 산물의 조절된 발현 또는 기능 또는 활성을 야기하는 하나 이상의 NtSUS 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이의 임의의 조합을 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 단일 NtSUS 유전자에서의 단일 돌연변이; 단일 NtSUS 유전자에서의 다수 돌연변이; 2개 이상의 또는 3개 이상의 또는 4개 이상의 NtSUS 유전자에서의 단일 돌연변이; 또는 2개 이상의 또는 3개 이상의 또는 4개 이상의 NtSUS 유전자에서의 다수 돌연변이를 가질 수도 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 폴리펩타이드 또는 그의 일부분의 활성 부위를 암호화하는 NtSUS 유전자에서의 영역과 같은 NtSUS 유전자(들)의 특정한 일부분에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 만약 그들이 NtSUS 유전자(들)의 기능 또는 활성을 조절한다면, 그것이 조절하는 NtSUS 유전자의 상류 또는 하류의 영역에서와 같은 하나 이상의 NtSUS 유전자(들)의 외부의 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 상류에 있는 요소는 프로모터, 인핸서(enhancer) 또는 전사 인자를 포함할 수 있다. 인핸서와 같은 몇몇 요소는 그것이 조절하는 유전자의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 요소(들)은 그것이 조절하는 유전자 가까이에 위치할 필요가 없는데 이것은 그것이 조절하는 유전자의 수십만 염기쌍 상류 또는 하류에서 발견된 적이 있기 때문이다. 돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 유전자(들)의 처음 100개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 200개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 300개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 400개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 500개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 600개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 700개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 800개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 900개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 1000개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 1100개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 1200개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 1300개의 뉴클레오타이드 내에, 유전자(들)의 처음 1400개의 뉴클레오타이드 내에, 또는 유전자(들)의 처음 1500개의 뉴클레오타이드 내에 위치한 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 유전자(들) 또는 그의 조합의 처음, 두번째, 세번째, 네번째, 다섯번째, 여섯번째, 일곱번째, 여덟번째, 아홉번째, 열번째, 열한번째, 열두번째, 열세번째, 열네번째 또는 열다섯번째 세트의 100개의 뉴클레오타이드 내에 위치한 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 돌연변이 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 돌연변이 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-자연발생 돌연변이 또는 유전자이식 식물 또는 식물 세포 기타 등등)가 개시되어 있다.
한 구현예에서, 식물의 종자가 돌연변이되고 나서 1세대 돌연변이 식물로 성장한다. 그런 다음 1세대 식물은 자가-수분되고 1세대 식물의 종자는 2세대 식물로 성장하는데, 그런 다음 이것은 그들의 좌위(loci)에서의 돌연변이를 위해 스크리닝된다. 돌연변이된 식물 물질은 돌연변이를 위해서 스크리닝될 수 있지만, 2세대 식물을 스크리닝하는 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식 돌연변이에 해당한다는 것이다. 당업자라면 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함해서, 다양한 식물 물질이 돌연변이체 식물을 형성하기 위해 돌연변이되는 것을 이해할 것이다. 그러나 돌연변이 유발된 식물 물질의 유형은 식물 폴리뉴클레오타이드가 돌연변이를 위해 스크리닝될 때 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 비-돌연변이된 식물이 수분되기 전에, 꽃가루가 돌연변이 유발을 거친 경우, 이러한 수분으로부터 발생하는 종자는 1세대 식물로 재배한다. 1세대 식물의 모든 세포는 꽃가루에서 형성되는 돌연변이를 함유할 것이고; 따라서 이러한 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신에 돌연변이를 위해 스크리닝될 것이다.
a. 변형된 식물 준비, 스크리닝 및 교배
각각의 식물, 식물 세포 또는 식물 물질로부터 준비되는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이 유발된 식물 조직, 세포 또는 물질에서 기원하는 식물 집단의 돌연변이를 위한 스크리닝을 신속히 처리하기 위하여 선택적으로 풀링(pooling)할 수 있다. 하나 이상의 식물, 식물 세포 또는 식물 물질의 후속 세대가 스크리닝될 수 있다. 선택적으로 풀링된 그룹의 크기는 사용되는 스크리닝 방법의 민감도에 따라 달라진다.
시료들이 선택적으로 풀링된 후에, 그들은 PCR과 같은 폴리뉴클레오타이드-특이적 증폭 기술을 거칠 수 있다. 유전자 또는 유전자에 바로 인접한 서열에 특이적인 임의의 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 선택적으로 풀링된 시료 내에 서열을 증폭시키는 데에 이용될 수 있다. 적합하게는, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 유용한 돌연변이가 가장 발생하기 쉬운 좌위(locus)의 영역을 증폭시키도록 고안되어 있다. 가장 바람직하게는, 프라이머는 폴리뉴클레오타이드의 영역 내에서 돌연변이를 감지하도록 고안되어 있다. 추가적으로, 점 돌연변이를 위한 스크리닝을 쉽게 하기 위해서, 프라이머(들) 및 프로브(들)가 공지의 다형성 자리를 피하는 것이 바람직하다. 증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 임의의 종래의 표지 방법을 이용해서 표지될 수 있다. 프라이머(들) 또는 프로브(들)는 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기술된 서열을 기초로 고안될 수 있다.
증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 프라이머(들) 또는 프로브(들)가 임의의 종래의 표지 방법을 사용해서 표지될 수도 있다. 이들은 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기재되어 있는 서열을 기초로 해서 고안될 수 있다.
다형성은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 식별될 수 있고 일부가 본 문헌에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 식물은 식물, 식물 조직 또는 식물 세포로부터 재생되거나 생장될 수 있다. 식물 세포 또는 식물 조직으로부터 식물을 재생시키거나 생장시키기에 적합한 임의의 방법, 예컨대 비제한적으로, 조직 배양 또는 원형질체로부터의 재생이 사용될 수 있다. 적합하게는, 식물은 형질전환된 식물 세포를 유합 조직 유도 배지, 슈트 유도 배지 및/또는 뿌리 유도 배지 상에서 생장시킴으로써 재생될 수 있다. 예를 들어, McCormick 외, Plant Cell Reports 5:81-84 (1986)을 참조한다. 그런 다음, 이들 식물은 생장될 수 있고, 동일한 형질전환 균주 또는 상이한 균주로 수분될 수 있으며, 요망되는 표현형 특징이 발현되는 생성된 혼성체가 동정될 수 있다. 2개 이상의 세대들은, 요망되는 표현형 특징의 발현이 안정하게 유지 및 유전되는지 보장하기 위해 생장될 수 있고, 그런 다음, 요망되는 표현형 특징의 발현을 보장하기 위해 수확된 종자가 달성되었다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "형질전환된 종자"는 식물 게놈 내에 안정하게 통합된 뉴클레오타이드 작제물을 함유하는 종자를 지칭한다.
이에 따라, 추가적인 측면에서 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되어 있다. 상기 방법은 본원에서 기재된 기능적인 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(또는 본원에서 기재된 그의 임의의 조합)를 암호화하는 NtSUS 유전자를 포함하는 식물의 적어도 하나의 세포를 제공하는 것을 포함한다. 다음에, 식물의 적어도 하나의 세포는 본원에서 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 기능을 조절하기에 효율적인 조건 하에서 처리된다. 그런 다음 하나 이상의 돌연변이 식물 세포는 돌연변이 식물로 번식되며, 여기서 돌연변이 식물은 대조군 식물의 그것과 비교해서 조절된 수준의 기재된 NtSUS 폴리펩타이드(들)(또는 본원에서 기재된 그의 임의의 조합)를 가진다. 돌연변이체 식물을 제조하는 이러한 방법의 일 구현예에서, 처리 단계는 적어도 하나의 세포를, 상술한 바와 같고 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서, 화학적 돌연변이 유발제로 거치게 하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 또 다른 구현예에서, 처리 단계는 하나 이상의 돌연변이 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서 하나 이상의 세포를 방사선원을 거치게 하는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이 식물"은, 적합하게는 유전자 조작 또는 유전자 변형 이외의 수단에 의해서, 대조군 식물과 비교할 때 유전자형이 변형되는 돌연변이 식물을 포함한다.
소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물, 돌연변이 식물 세포 또는 돌연변이 식물 물질은 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 물질에서 자연적으로 발생하였으며 원하는 형질을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 특성을 부여할 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 물질(예를 들어, 돌연변이가 유도되는 식물에 대한 상이한 유전적 배경을 가지는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질)에 통합(예를 들어, 침투)될 수 있다. 따라서 실시예에 의해서, 첫번째 식물에 자연적으로 발생하는 돌연변이는 첫번째 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가지는 두번째 식물과 같은 두번째 식물에 도입될 수도 있다. 그러므로 숙련자는 원하는 형질을 부여하는 본원에 기술된 유전자의 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 게놈에 천연적으로 보유하는 식물을 검색하고 식별할 수 있다. 천연적으로 발생하는 돌연변이체 대립유전자(들)는 육종, 역교배 및 유전자이입을 포함하는 다양한 방법에 의해서 제2 식물로 전달되어서, 본원에 기술된 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 계통, 돌연변이체 또는 혼성체를 생성할 수 있다. 동일한 기술이 또한 제1 식물로부터 제2 식물로의 하나 이상의 비-자연발생 돌연변이(들)의 유전자이입에 적용될 수 있다. 원하는 형질을 보여주는 식물은 돌연변이 식물의 푸울(pool)로부터 스크리닝될 수 있다. 적합하게는, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 지식을 이용하여 선별이 수행된다. 결과적으로 대조군과 비교할 때 유전자 형질을 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝 접근은 본원에서 논의된 바와 같은 통상적인 증폭 및/또는 혼성화 기술의 적용을 포함할 수 있다. 이에, 본 개시내용의 추가 측면은 돌연변이 식물을 동정하기 위한 방법에 관한 것으로, (a) 식물로부터 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시료를 제공하는 단계; 및 (b) NtSUS 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 단계를 포함하고 있고, 여기서 대조군 식물의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에 비해 상기 NtSUS 폴리뉴클레오타이드의 서열에서의 차이는 상기 식물이 돌연변이 식물인 것을 표시한다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물에 비해 환원당(들)의 증가 또는 감소된 수준을 축적하는 돌연변이 식물을 동정하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 스크리닝될 식물로부터 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료가 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 식물의 적어도 하나의 환원당의 수준을 결정하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 상기 적어도 하나의 환원당의 수준은 녹색 잎, 경화 초기 잎 또는 경화된 잎에서 결정된다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물에 비해 적어도 하나의 환원당의 증가 또는 감소된 수준을 갖는 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 제1 식물로부터 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료가 적어도 하나의 환원당의 조절된 수준을 초래하는 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 하나 이상의 돌연변이를 제2 식물로 전달하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 적어도 하나의 환원당의 수준은 녹색 잎, 경화 초기 잎 또는 경화된 잎에서 결정된다. 돌연변이(들)는 당업계에 알려진 다양한 방법 - 예컨대, 유전 공학, 유전자 조작, 유전자이입, 식물 육종, 역교배 등을 사용해 제2 식물 내로 전달될 수 있다. 한 구현예에서, 제1 식물은 자연발생 식물이다. 한 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 또 다른 측면에서, 대조군 식물에 비해 적어도 하나의 환원당의 증가 또는 감소된 수준을 갖는 돌연변이 식물을 제조하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 제1 식물로부터 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료가 적어도 하나의 환원당의 조절된 수준을 초래하는 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 상기 하나 이상의 돌연변이를 상기 제1 식물로부터 제2 식물로 유전자이입하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 적어도 하나의 환원당의 수준은 녹색 잎, 경화 초기 잎 또는 경화된 잎에서 결정된다. 한 구현예에서, 유전자이입하는 단계는 선택적으로 역교배하는 등을 포함하는, 식물의 육종 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 제1 식물은 자연발생 식물이다. 한 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 한 구현예에서, 제1 식물은 재배종 또는 엘리트 재배종이 아니다. 한 구현예에서, 제2 식물은 재배종 또는 엘리트 재배종이다. 추가적인 측면은 본원에 기재된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 (재배종 또는 엘리트 재배종 돌연변이 식물을 포함하는) 돌연변이 식물에 관한 것이다. 소정의 구현예들에서, "돌연변이 식물"은 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 서열 내에서와 같은, 식물의 특정한 영역에만 국소화되는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 이와 같은 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈의 서열은 돌연변이 유발 전의 식물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다.
소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물은 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 서열 내에서와 같은 식물의 하나 이상의 영역, 및 게놈의 하나 이상의 추가의 영역에서 국소화된 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 이러한 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 남은 게놈 서열은 돌연변이 유발 전의 식물과 동일하지 않거나 실질적으로 동일하지 않을 것이다. 소정의 구현예들에서, 돌연변이 식물은 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 한 개 이상의, 두 개 이상의, 세 개 이상의, 네 개 이상의 또는 다섯 개 이상의 엑손에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 한 개 이상의, 두 개 이상의, 세 개 이상의, 네 개 이상의 또는 다섯 개 이상의 인트론에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 프로모터에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 3' 비번역 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 5' 비번역 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 암호화 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 논-코딩 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가지지 않을 수도 있고; 또는 그의 두 개 이상의, 세 개 이상의, 네 개 이상의, 다섯 개 이상; 또는 그의 여섯개 이상의 조합을 가지지 않을 수도 있다.
추가 측면에서, 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 유전자에서 돌연변이를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질을 동정하기 위한 방법이 제공되어 있으며, (a) 식물, 식물 세포 또는 식물 물질이 돌연변이 유발을 거치게 하는 단계; (b) 상기 식물, 식물 세포 또는 식물 물질 또는 그의 자손으로부터 시료를 얻는 단계; 및 (c) 상기 NtSUS 유전자 또는 그의 변이체 또는 단편의 폴리뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함하고 있고, 여기서 상기 서열에서의 차이는 하나 이상의 돌연변이를 표시한다. 이러한 방법은 또한 전사 개시 부위, 출발 코돈, 인트론 영역, 엑손-인트론 경계, 종결자 또는 정지 코돈과 같은, 식물 세포에서 NtSUS 유전자의 발현에 영향을 미치는 게놈 영역에서 발생하는 돌연변이(들)를 갖는 식물의 선별을 가능하게 한다.
b. 식물 과 , 종, 품종, 종자 및 조직 배양
유전자 변형에 사용하기 위한 적절한 식물은 단자엽 및 쌍자엽 식물 및 식물 세포계를 포함하고, 이것은 다음의 과들 중 하나로부터의 종을 포함한다: 쥐꼬리망초과, 부추과, 알스트로에메리아세, 수선화과, 협죽도과, 야자과, 국화과, 매자나무과, 빅사세(Bixaceae), 십자화과, 브로멜리아시에, 삼과, 석죽과, 개비자나무과, 명아주과, 콜키카시에(Colchicaceae), 박과, 마과, 마황과, 에리트록실라시에(Erythroxylaceae), 대극과, 콩과, 꿀풀과, 아마과, 석송과, 아욱과, 멜란티움과, 파초과, 도금양과, 니사나무과, 양귀비과, 침엽수, 질경이과, 벼과, 장미과, 꼭두서니과, 버드나무과, 무환자나무과, 가지과, 주목과, 차나무과, 또는 포도과.
적절한 종은 오크라, 침엽수, 관상수, 겨이삭, 파속식물, 알스트로에메리아, 아나나스, 안드로그라피스, 안드로포곤, 향쑥속, 아룬도, 아트로파, 매자나무, 베타(Beta), 빅사(Bixa), 배추속 식물, 금잔화, 동백나무, 캠토테카(Camptotheca), 대마초, 고추, 카르타무스, 일일초, 개비자나무, 국화, 기나나무, 수박, 커피, 콜키쿰, 콜레우스, 오이, 쿠쿠르비타, 우산대바랭이, 흰독말풀, 패랭이속, 디기칼리스, 항염, 오일야자, 마황, 에리언투스(Erianthus), 에리트록실룸(Erythroxylum), 유클리티스, 페스투카(Festuca), 야생딸기, 갈란투스, 글리신, 고시피움, 해바라기, 파라고무, 호르데움, 사리풀잎, 자트로파, 상추종, 아마, 롤리움, 루피너스, 토마토, 석송속, 마니호트, 알팔파, 박하, 억새, 바나나, 니코티아나, 벼, 수수속, 양귀비속, 파르테니움, 페니세튬, 피튜니아, 갈풀, 산조아재비, 소나무, 새포아풀, 포인세티아, 포플러스, 라우월피아, 피마자, 장미, 사탕수수, 버드나무, 혈근초, 스코폴리아, 호밀, 가지속, 수수, 스파르티나, 시금치, 타나세튬, 주목, 테오브로마, 트리티코세케일, 밀, 우니올라(Uniola), 꽃창포과, 빙카속, 리파리아 및 옥수수 속의 일원을 포함할 수 있다.
적절한 종은 수수속 아종, 수수 아종, 억새 아종, 사탕수수 아종, 에리언투스(Erianthus) 아종, 포플러스 아종, 큰파란줄기(나도기름새), 페니세튬 퍼푸레움(부들), 갈풀(리이드 케너리그라스), 우산잔디(버뮤다 그래스), 페스투카 아룬디나세아(넓은 잎김의털), 스파르티나 펙티나타(프레리 코디-잔디), 알팔파 벼종(알팔파), 아룬도 도낵스(물대), 호밀(라이), 버드나무 아종(버드나무), 유칼립투스 아종(유칼립투스), 트리티코세케일(트리틱 밀 타임스 라이), 대나무, 헬리안투스 안누스(해바라기), 카르타무스 홍화(잇꽃), 자트로파 쿠르카스(자트로파), 피마자 코뮤니스(피마자유), 오일야자(야자), 아마(플랙스), 배추속 식물, 사탕무우 (사탕무), 마니호트 자리공(카사야), 리코페르시콘 에스쿨렌텀(토마토), 렉투카 사티바(상추), 무시클리제 알카(바나나), 가지속 감자(감자), 배추속 식물(브로콜리, 꽃양배추, 양배추), 동백나무 차나무(차), 야생딸기 아나나세 (딸기), 테오브로마 카카오(코코아), 커피 아라비카(커피), 리파리아 포도 (포도), 아나나스 코모수스(파인애플), 캅시쿰 안눔(핫 & 스위트 페퍼), 알리움 세파(양파), 쿠쿠미스 멜로(멜론), 오이(오이), 쿠쿠르비타 맥시마(호박), 쿠쿠르비타 (호박), 스피나세아 올레라세아(시금치), 시트룰루스 라나투스(수박), 아벨모스쿠스 에스쿨렌투스(오크라), 솔라넘 멜로지나(가지), 장미 아종(장미), 패랭이속 카요필러스(카네이션), 피튜니아 아종(피튜니아), 포인세티아 풀체리마(포인세티아), 루피너스 알부스(루핀), 우니올라 파니쿨라타(귀리), 벤트그래스(겨이삭 아종), 포플러스 트레물로이드(아스펜), 소나무 아종(소나무), 침엽수 아종(침엽수), 관상수 아종(단풍나무), 호르데움 불가레(보리), 포아 프라텐시스(큰새포아풀), 롤리움 아종(라이그래스) 및 큰조아재비(티모시), 수수속 버들명아주(수수속 풀), 수수 싸리나무(수수, 수수류), 미스칸투스 기간투스(억새), 사탕수수 종(사탕수수), 포플러스(포플라), 제아 메이즈(옥수수), 글리신 맥스(콩), 배추속 식물 나프스(카놀라), 트리티쿰 애스티븀(밀), 고시피움 허수튬(코튼), 오리자 사티바(쌀), 헬리안투스 안누스(해바라기), 메디카고 사티바(알팔파), 베타 불가리스(사탕무), 또는 페니세튬 글라우쿰(진주 기장)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예는 유전자 발현 수준을 조절하기 위해 변형된 돌연변이 담배, 비-자연발생 담배 또는 유전자전환 담배 식물 또는 식물 세포에 관한 것으로, 그에 따라 폴리펩타이드의 발현수준이 대조군 식물과 비교시 관심있는 조직 내에서 조절되는 담배 또는 식물 세포-예컨대 담배 식물 또는 식물 세포-를 생산할 수 있다. 개시된 조성물 및 방법은 N. 루스티카(N. rustica) 및 N. 타바쿰(N. tabacum)(예를 들어, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 및 Petico)을 포함해서, 니코티아나(Nicotiana) 속의 임의의 종에 적용될 수 있다. 다른 종은 N. acaulis , N. acuminata , N. africana , N. alata , N. ameghinoi , N. amplexicaulis, N. arentsii , N. attenuata , N. azambujae , N. benavidesii , N. benthamiana, N. bigelovii , N. bonariensis , N. cavicola , N. clevelandii , N. cordifolia, N. corymbosa , N. debneyi , N. excelsior, N. forgetiana , N. fragrans, N. glauca , N. glutinosa , N. goodspeedii , N. gossei , N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii , N. knightiana , N. langsdorffii , N. linearis , N. longiflora, N. maritima , N. megalosiphon , N. miersii , N. noctiflora , N. nudicaulis, N. obtusifolia , N. occidentalis , N. occidentalis subsp . hesperis , N. otophora , N. paniculata , N. pauciflora , N. petunioides , N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis , N. raimondii , N. repanda , N. rosulata , N. rosulata subsp . ingulba , N. rotundifolia , N. setchellii , N. simulans , N. solanifolia, N. spegazzinii , N. stocktonii , N. suaveolens , N. sylvestris , N. thyrsiflora, N. tomentosa , N. tomentosiformis , N. trigonophylla , N. umbratica, N. undulata , N. velutina , N. wigandioides , 및 N. x sanderae을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 식물은 N. 타바쿰(N. tabacum)이다.
또한 담배 재배종 및 엘리트(elite) 담배 재배종의 용도도 본원에서 고려된다. 따라서 유전자이식, 비-자연발생 또는 돌연변이 식물은 하나 이상의 유전자이식 유전자, 또는 하나 이상의 유전자 돌연변이 또는 그의 조합을 포함하는, 담배 품종 또는 엘리트 담배 재배종일 수 있다. 개별 담배 품종 또는 담배 재배종(예를 들어, 엘리트 담배 재배종)에서 이 돌연변이가 천연적으로 발생하지 않는다는 가정 하에, 유전자 돌연변이(들)(예를 들어, 하나 이상의 다형성)는 각각의 담배 품종 또는 담배 재배종(예를 들어, 엘리트 담배 재배종)에서 천연적으로 존재하지 않는 돌연변이일 수 있거나 또는 자연발생 유전자 돌연변이(들)일 수 있다.
특히 유용한 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 품종은 버얼리종, 다크종(dark type), 열건형, 및 오리엔탈형 담배를 포함한다. 품종 또는 재배종의 비-제한적인 예로는 다음과 같다: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, ’Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. 본원에서 특정하게 식별되지 않는다고 하더라도 상기한 것들의 로우 컨버터 아변종도 또한 고려된다.
구현예들은 또한 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 발현 또는 기능을 조절하기 위해서 변형된 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 혼성체 식물 또는 유전자이식 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 유리하게는, 얻어진 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 혼성체 식물 또는 유전자이식 식물은 대조군 식물에 대한 전체적인 외관과 유사하거나 또는 실질적으로 동일할 수도 있다. 성숙도, 식물 당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입각, 잎 크기(폭 및 길이), 마디 거리, 및 잎몸-주맥 비율과 같은 다양한 표현형 특성은 경지 관찰에 의해서 평가될 수 있다.
하나의 측면은 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 혼성체 식물 또는 유전자이식 식물의 종자에 관한 것이다. 바람직하게는, 종자는 담배 종자이다. 추가적인 측면은 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 혼성체 식물 또는 유전자이식 식물의 꽃가루 또는 배주에 관한 것이다. 또한, 웅성 불임성을 부여하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 혼성체 식물 또는 유전자이식 식물이 제공된다.
본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 혼성체 식물 또는 유전자이식 식물 또는 그의 일부분의 재생가능한 세포의 조직 배양이 제공되며, 배양은 부모의 모든 형태학적 및 생리학적 특성을 표현시킬 수 있는 식물을 재생한다. 재생가능한 세포는, 잎, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃 및 그의 일부, 밑씨, 순, 자루, 줄기, 중과피 및 포자낭 또는 그로부터 유래되는 캘러스 또는 원형질체를 포함한다.
본원에 기술된 식물 물질은 경화된 담배 물질 - 예컨대 열건- 예컨대 버지니아종- 또는 양건-예컨대 버얼리종 및 다크종- 담배 물질일 수 있다. 본원에 기술된 식물 물질은, 버얼리종(Burley type) 및 다크종(Dark)과 같은 음건된 담배 물질일 수 있다.
담배 경화에 대한 CORESTA 추천이 다음에 기재되어 있다: CORESTA Guide N°17, April 2016, Sustainability in Leaf Tobacco Production.
c. 환원당 함량 조절
한 가지 목적은 식물 물질, 예를 들어, 경화된 잎에서, 적어도 하나의 환원당의 조절된 수준을 보여주는 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 부분을 제공하는 것이다. 적절하게는, 대조군 식물에 비해 적어도 하나의 환원당의 조절된 수준을 보여주는 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 부분. 적절하게는, 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 부분은 대조군 식물과 실질적으로 동일한 외관을 가진다.
따라서, 대조군 세포 또는 대조군 식물에 비해 적어도 하나의 환원당의 수준이 조절된 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 부분 또는 식물 세포가 본원에 기재되어 있다. 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 식물 세포는 본원에 기재된 대응하는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 발현을 조절하여 본원에 기재된 NtSUS 폴리펩타이드 중 하나 이상의 합성 또는 기능을 조절하도록 변형되었다. 적절하게는, 적어도 하나의 환원당의 조절된 수준은 적어도 녹색 잎, 적절하게는 경화 초기 또는 경화된 잎에서 관찰된다. 소정의 구현예들에서, 녹색 잎, 적절하게는 경화 초기 또는 경화된 잎 또는 경화된 담배와 같은 식물 속의 환원당의 수준은 조절될 수도 있다. 소정의 구현예들에서, 녹색 잎, 적절하게는 경화 초기 잎, 경화된 잎 또는 경화된 담배와 같은 식물 속의 환원당의 수준은 조절될 수도 있다.
소정의 구현예들에서, NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S, NtSUS4-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T의 활성 및/또는 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S 및 NtSUS4-T의 활성 및/또는 발현이 조절된다.
소정의 구현예들에서, NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S 및 NtSUS4-T 중 하나 이상의 활성 및/또는 발현은 조절되고 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상의 활성 및/또는 발현은 조절되지 않는다.
소정의 구현예들에서, NtSUS2-S, NtSUS2-T, NtSUS3-S, NtSUS3-T, NtSUS4-S 및 NtSUS4-T의 활성 및/또는 발현은 조절되고 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T의 활성 및/또는 발현은 조절되지 않는다.
소정의 구현예들에서, NtSUS2-S, NtSUS3-S, NtSUS3-T 및 NtSUS4-S 중 하나 이상의 활성 및/또는 발현은 조절되고 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS2-T, NtSUS4-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T 중 하나 이상의 활성 및/또는 발현은 조절되지 않는다.
소정의 구현예들에서, NtSUS2-S, NtSUS3-S, NtSUS3-T 및 NtSUS4-S의 활성 및/또는 발현은 조절되고 NtSUS1-S, NtSUS1-T, NtSUS2-T, NtSUS4-T, NtSUS5-S, NtSUS5-T, NtSUS6-S 및 NtSUS6-T의 활성 및/또는 발현은 조절되지 않는다. 또 다른 측면은, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 세포에 관한 것이며, 본원에 기재된 NtSUS 폴리펩타이드 중 하나 이상의 발현 또는 기능이 조절되고, 식물의 부분(예를 들어, 녹색 잎, 적절하게는 경화 초기 또는 경화된 잎 또는 경화된 담배)은 상기 NtSUS 폴리펩타이드(들)의 발현 또는 기능이 조절되지 않은 대조군 식물에 비해 적어도 5%의 적어도 하나의 환원당의 감소된 수준을 갖는다. 소정의 구현예들에서, 녹색 잎, 적절하게는 경화 초기 또는 경화된 잎 또는 경화된 담배 같은 식물 속 적어도 하나의 환원당의 수준은 예를 들면, 적어도 약 5%까지 감소될 수도 있다.
또 다른 측면은, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 세포로부터 유도되거나 유도가능한 경화된 잎 또는 경화된 담배 같은, 경화된 식물 물질에 관한 것이며, 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 발현 또는 그에 의해 암호화된 NtSUS 폴리펩타이드의 기능이 조절되고, 적어도 하나의 환원당의 수준은, 대조군 식물에 비해 적어도 5% 만큼 조절된다.
적절하게는 상기 식물 또는 그 부분(예를 들어, 잎)의 외관은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 적절하게는, 식물은 담배 식물 또는 커피 식물이다.
또한, 구현예들은, 조절된 환원당 함량을 갖는 식물 또는 식물 성분(예, 잎 - 예컨대, 녹색 잎 또는 경화 초기 또는 경화된 잎 - 또는 담배) 또는 식물 세포를 초래할 수 있는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 또는 NtSUS 폴리펩타이드 중 하나 이상의 발현 또는 기능을 조절하기 위해 변형된 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 식물 세포를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 개시내용에 따라 얻어진 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물은 대응하는 대조군 식물에 대한 시각적인 외관과 유사하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 잎 중량은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 잎 개수는 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 잎 중량 및 잎 개수는 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 한 구현예에서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 줄기 높이는 예를 들어, 현장 이식 뒤 한 달, 두 달, 세 달 이상 또는 토핑 뒤 10일, 20일, 30일 또는 36일 이상에서, 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 줄기 높이는 대조군 식물의 줄기 높이보다 작지 않다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 엽록소 함량은 대조군 식물과 실질적으로 유사하다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 줄기 높이는 실질적으로 대조군 식물과 동일하고 그리고 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 엽록소 함량은 실질적으로 대조군 식물과 동일하다. 다른 구현예에서, 비-자연발생 돌연변이 또는 유전자이식 식물의 잎의 크기 또는 형태 또는 수 또는 착색은 실질적으로 대조군 식물과 동일하다. 적합하게는, 식물은 담배 식물 또는 커피 식물이다.
또 다른 측면에서, 식물의 적어도 일부 내 (예를 들어, 잎-예컨대 경화된 잎- 또는 담배 내)의 적어도 하나의 환원당의 양을 조절하기 위한 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은 (i) 본원에 기재된 NtSUS 폴리펩타이드 (또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 발현 또는 기능을 조절하는 단계로, 적절하게는, 여기서 상기 NtSUS 폴리펩타이드(들)는 본원에 기재된 대응하는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는, 단계; (ii) (i) 단계에서 수득된 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 적어도 일부 내 (예를 들어, 잎-예컨대 경화된 잎- 또는 담배 또는 연기 내)의 적어도 하나의 환원당의 수준을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 적어도 하나의 환원당의 수준이 대조군 식물에 비해 조절된 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물을 동정하는 단계를 포함하고 있다. 적절하게는, 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 시각적인 외관은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 적절하게는, 식물은 담배 식물이다.
또 다른 측면에서, 경화된 식물 물질의 적어도 일부 내 -예컨대 경화된 잎-의 적어도 하나의 환원당의 양을 조절하기 위한 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은 (i) NtSUS 폴리펩타이드 (또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 발현 또는 기능을 조절하는 단계로, 적절하게는, 여기서 상기 NtSUS 폴리펩타이드(들)는 본원에 기재된 대응하는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는, 단계; (ii) 식물 물질 -예컨대 잎 중 하나 이상-을 수확하고 일정 기간 동안 경화시키는 단계; (i) 단계에서 또는 (ii) 단계 동안 수득된 경화된 식물 물질의 적어도 일부 내의 적어도 하나의 환원당의 수준을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 적어도 하나의 환원당의 수준이 대조군 식물에 비해 조절된 경화된 식물 물질을 동정하는 단계를 포함하고 있다.
대조군과 비교하여 발현의 증가는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 또는 그 이상의 증가 - 예컨대, 200%, 300%, 500%, 1000% 또는 그 이상일 수 있으며, 전사 기능 또는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 발현 또는 NtSUS 폴리펩타이드 발현의 증가 또는 이들의 조합을 포함한다.
대조군과 비교하여 기능 또는 활성의 증가는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 또는 그 이상의 증가 - 예컨대, 200%, 300%, 500%, 1000% 또는 그 이상일 수 있다.
대조군과 비교하여 발현의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수 있으며, 전사 기능 또는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 발현 또는 NtSUS 폴리펩타이드 발현의 감소 또는 이들의 조합을 포함한다.
대조군과 비교하여 기능 또는 활성의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 재조합 작제물은 관심있는 식물 종, 적절하게는 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 또는 NtSUS 폴리펩타이드의 발현 또는 기능 또는 활성을 조절하기 위해서 사용될 수 있다.
많은 폴리뉴클레오타이드 기반 방법은 식물 및 식물 세포에서의 유전자 발현을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 실시예에 의해서, 형질전환될 식물과 상용성이 있는 것으로 식물 및 식물 세포에서 유전자를 과발현시킬 수 있는 상류의 프로모터와 함께 관심있는 유전자를 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터가 제조될 수 있다. 예시적인 프로모터는 본원에 기재되어 있다. 형질전환에 이어서 적절한 조건 하에서 성장할 때, 프로모터는 식물 또는 그의 특이적 조직에서의 NtSUS의 수준을 조절하기 위하여 발현을 유도할 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 식물 및 식물 세포에서 유전자를 과발현시키기 위하여 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 (또는 본원에 기재된 이들의 임의의 조합)을 운반하는 벡터가 생성된다. 벡터는 이식유전자의 상류에 식물에서 모든 조직에서의 구성적인 발현을 유도하는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 같은 적절한 프로모터를 가진다. 벡터는 또한 형질전환된 캘리(calli) 및 세포주를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자를 가진다.
프로모터로부터의 서열의 발현은 인핸서, 염색질 활성화 요소, 전사 인자 반응 요소 등을 비롯한 발현 조절 서열들을 포함함으로써 증가될 수 있다. 이러한 조절 서열들은 구성적일 수 있으며, 일반적인 방식으로 전사를 상향조절하거나; 이러한 조절 서열들은 조건적일 수 있으며, 특정한 신호에 반응하여 전사를 상향조절한다. 노화와 관련된 신호, 및 건조 절차 동안 활성적인 신호가 구체적으로 나타나 있다.
따라서, 다양한 구현예들은 NtSUS 폴리뉴클레오타이드의 다중 사본을식물 게놈으로 통합시켜서 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 발현 수준을 조절하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은, 본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 식물 세포 숙주를 형질전환하는 단계를 포함하고 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 고유한 폴리펩타이드거나 세포와 이형일 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용에서 사용하는 식물은, 이러한 식물이 높은 환원당 함량(경화 종료 시 경지 재배시 약 14% 건조 중량 초과)을 갖는 것으로 열건(fire-cured) 식물이다. 열건 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 일부는 경화 종료 시 경지 재배시 약 14% 건조 중량 미만 - 예컨대 경화 종료 시 경지 재배시 약 10% 건조 중량 미만, 또는 경화 종료 시 경지 재배시 약 5% 건조 중량 미만, 또는 경화 종료 시 경지 재배시 약 1% 건조 중량 미만의 환원당 함량을 가질 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용에서 사용하는 식물은, 이러한 식물이 경화 종료 시 경지 재배시 약 6.8% 건조 중량 초과) 환원당 함량을 갖는 것으로 양건되는(sun-cured) 식물이다. 양건되는 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 일부는 경화 종료 시 경지 재배시 약 5% 건조 중량 미만-예컨대 경화 종료 시 경지 재배시 약 2.5% 건조 중량 미만, 또는 경화 종료 시 경지 재배시 약 1% 건조 중량 미만인 환원당 함량을 가질 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용에서 사용되는 식물은 음건되는 식물이다. 이러한 식물은 경화 종료 시 경지 재배시 약 1.7% 건조 중량 초과의 환원당 함량을 갖는다. 양건되는 돌연변이, 유전자이식 또는 비-자연발생 식물 또는 이의 일부는 경화 종료 시 경지 재배시 약 1.5% 건조 중량 미만-예컨대 경화 종료 시 경지 재배시 약 1% 건조 중량 미만, 또는 경화 종료 시 경지 재배시 약 0.5% 건조 중량 미만인 환원당 함량을 가질 수 있다.
소정의 구현예들에서, 열건 또는 양건된 식물의 사용이 바람직하다.
유리 아미노산 함량 측정
아미노산 함량은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법은 Method MP 1471 rev 5 2011, Resana, Italy: Chelab Silliker S.r.l, Merieux NutriSciences Company이다. 경화된 식물 잎에서의 아미노산 결정을 위해, 주맥 제거 후에, 필요하다면, 40℃에서 2-3일 동안 경화된 잎몸을 건조시킨다. 이어서 담배 물질은 아미노산 함량의 분석 전에 미세 분말(~100uM)로 분쇄된다. 식물 물질 내의 아미노산 함량을 측정하기 위한 다른 방법이 UNI EN ISO 13903:2005에 기재되어 있다. 소정의 구현예들에서, 유리 아미노산 함량 측정이 UNI EN ISO 13903:2005에 따라 수행된다.
환원당 함량 측정
환원당 함량은 Skalar Instrument Co (펜실베니아주 웨스트 체스터)에 의해 채택되고, Tobacco Science 20: 139-144 (1976)에 기재된 담배 시료 분석을 위해 개발된 분할-흐름 비색 방법(segmented-flow colorimetric method)을 사용하여 측정될 수 있다. 환원당 함량 측정은 또한 Coresta Recommended Method 38, CRM38, CRM and ISO 15154: 2003에 기재되어 있다. 경화된 식물 잎 내의 환원당 결정을 위해, 주맥 제거 후에, 필요하다면, 40℃에서 2-3일 동안 경화된 잎몸을 건조시킨다. 이어서 담배 물질은 환원당의 분석 전에 미세 분말(~100uM)로 분쇄된다. 소정의 구현예들에서, 환원당 함량 측정이 ISO 15154: 2003에 따라 수행된다.
육종
본원에 기재된 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 돌연변이 대립형질을 운반하는 식물은 유용한 계통, 변이체 및 혼성체를 형성하기 위하여 식물 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 특히, 돌연변이체 대립유전자는 상술한 상업적으로 중요한 돌연변이체로 침투(introgress)된다. 본원에 기재된 비-자연발생 식물 또는 유전자이식 식물을 상이한 유전자 동일성을 포함하는 식물과 교배하는 것을 포함하는 식물 육종 방법이 제공된다. 방법은 추가로 바람직한 유전적 형질 또는 유전적 배경을 가지는 자손이 얻어질 때까지 후손 식물을 다른 식물과 교배시키는 단계 및 선택적으로 반복 교배하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 육종 방법에 의해 작용하는 한가지 목적은 바람직한 유전적 형질을 특히 상업적으로 관심이 있는 다른 품종, 육종 계통, 혼성체 또는 재배종에 도입시키기 위한 것이다. 또 다른 목적은 단일 식물 품종, 계통, 혼성체 또는 재배종에서의 상이한 유전자의 유전자 변형의 적층(stacking)을 용이하게 하기 위한 것이다. 종내 교배뿐만 아니라 종간의 교배가 고려된다. 이러한 교배로부터 발생하는 후손 식물은 또한 육종 계통으로도 지칭되며, 이들은 본 발명의 비-자연발생 식물의 예이다.
한 구현예에서, (a) 후손 담배 종자를 얻기 위해서 돌연변이 또는 유전자이식 식물을 제2 식물과 교배시키는 단계; (b) 비-자연발생 담배 식물을 얻기 위해서 식물 생장 조건 하에서, 후손 담배 종자를 생장시키는 단계를 포함하는, 비-자연발생 담배 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되어 있다. 상기 방법은 (c) 후손 담배 종자를 얻기 위해서 비-자연발생 식물의 이전 세대를 그 자체 또는 또 다른 식물과 교배시키는 단계; (d) 추가적인 비-자연발생 식물을 얻기 위해서 식물 생장 조건 하에서 단계 (c)의 후손 담배 종자를 생장시키는 단계; 및 (e) 비-자연발생 식물의 추가적인 세대를 얻기 위해서 단계 (c)와 (d)를 여러번 계속 교배시키고 생장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 선택적으로 단계 (a) 이전에 특이적이고 돌연변이 또는 유전자이식 식물과 동일하지 않은 유전적 동일성을 가지는 부모 식물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 육종 프로그램에 따라서, 비-자연발생 식물의 세대를 생성하기 위해 교배 및 재배 단계를 0회 내지 2회, 0회 내지 3회, 0회 내지 4회, 0회 내지 5회, 0회 내지 6회, 0회 내지 7회, 0회 내지 8회, 0회 내지 9회, 또는 0회 내지 10회 반복한다. 역교배는 부모 중 하나와 가까운 유전적 동일성을 가지는 다음 세대에서의 후손 식물을 얻기 위해, 후손이 그의 부모 또는 그의 부모와 유전적으로 동일한 또 다른 식물과 교배되는 방법의 예시이다. 식물 육종, 특히 식물 육종을 위한 기술은 주지되어 있고 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은 이러한 방법에 의해서 생성되는 비-자연발생 식물을 추가로 제공한다. 소정의 구현예들은 식물을 선별하는 단계를 배제한다.
본원에서 설명하는 방법의 일부 구현예에서, 육종으로부터 발생하는 계통 및 변이체 유전자를 위한 스크리닝은 표준 현장 절차를 사용해서 현장에서 평가된다. 본래의 돌연변이를 유발하지 않는 부모를 포함하는 대조군 표현형이 포함되고 개체는 무작위의 완전한 블록 설계 또는 다른 적절한 경지 설계로 경지에 배열되어 있다. 담배의 경우, 표준 작물학적인 관행이 사용되는데 예를 들어 담배가 건조 이전과 그 동안의 화학적 및 다른 일반적인 테스트를 위해 수확되고, 계량되고, 샘플링된다. 데이터의 통계학적인 분석을 수행하여 부모 계통에 대한 선택된 계통의 유사성을 확인한다. 선택된 식물의 세포유전학적 분석을 선택적으로 수행하여 염색체 조성 및 염색체 쌍 관계를 확인한다.
DNA 지문분석, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 마이크로새틀라이트 마커, 또는 유사한 기술은 본원에 기재된 바와 같은, 유전자의 돌연변이 대립유전자를 전달 또는 육종하기 위해서 마커-보조 선택(MAS) 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종자는 작물학상 바람직한 유전자형을 가진 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 유전자형을 혼성화하여 분리 개체군들을 형성할 수 있다. F2 또는 역교배 세대에서의 식물은 본원에 기재된 기술 중 하나를 이용해서, 게놈 서열 또는 그의 단편으로부터 나타나는 마커를 이용해서 스크리닝될 수 있다. 돌연변이체 대립유전자를 가지는 것으로 확인된 식물은 역교배되거나 자가수분되어서 스크리닝될 제2 개체군을 형성할 수 있다. 예상되는 유전 패턴 또는 사용되는 MAS 기술에 따라, 원하는 개별 식물의 식별을 보조하기 위하여 역교배의 각각의 주기 전에 선택된 식물을 자가수분하는 것이 필요하다. 역교배 또는 다른 육종 절차는 반복친의 원하는 표현형이 복구될 때까지 반복될 수 있다.
본 기재에 따라, 육종 프로그램에서, 성공적인 교배는 수정된 F1 식물을 생산한다. 선택된 F1 식물은 부모 중 하나와 교배될 수 있고, 첫번째 역교배 세대 식물은 변이체 유전자 발현(예를 들어, 유전자의 null 버전)을 위한 재검증된 개체군을 생산하기 위해서 자가수분된다. 역교배, 자가수분 및 스크리닝의 과정은 예를 들어, 마지막 스크리닝이 반복친에 생식력이 있고, 합리적으로 유사한 식물을 생산할 때까지 적어도 4번 반복된다. 요망되는 경우, 식물은 자가수분되고 자손은 변이체 유전자 발현을 나타내는 식물을 확인하기 위해서 그 이후에 다시 스크리닝된다. 일부 구현예에서, F2 세대의 식물 개체군은 변이체 유전자 발현을 위해 스크리닝되고, 예를 들어, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열 정보를 기초로 하여 프라이머를 가지는 PCR 방법을 사용해서, 표준 방법에 따라서 유전자의 부재로 인해, 예를 들면, 식물은 폴리펩타이드를 발현하는 것이 실패하는 것으로 확인된다.
혼성체 담배 변이체는 첫번째 변이체의 교배모수(female parent) 식물(즉, 종자 부모(seed parent))의 자가수분을 방지함으로써, 교배모수 식물을 수정시키는 두번째 변이체의 웅성 부모 식물로부터의 수분을 허용함으로써, 그리고 F1 혼성체 종자를 교배모수 식물에 형성함시킴으로써 제조될 수 있다. 교배모수 식물의 자가수분은 꽃 발생의 초기단계에 꽃을 제거함으로써 억제될 수 있다. 대안적으로, 웅성불임성의 형태를 통해 교배모수 식물의 꽃가루 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어, 웅성불임성은 세포질 웅성불임성(CMS) 또는 이식유전자가 소포자 생성 및/또는 꽃가루 형성, 또는 자기 불화합성을 억제하는 유전자이식 웅성불임성에 의해 생성될 수 있다. CMS를 함유하는 교배모수 식물은 특히 유용하다. 교배모수 식물이 CMS인 구현예에서, 꽃가루는 웅성가임 식물로부터 수확되고, 교배모수 식물의 암술머리에 수동적으로 적용되고, 얻어진 F1 종자가 수확된다.
본원에 기재된 변이체와 계통은 단일 교배 담배 F1 혼성체를 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 부모 변종의 식물은 웅성 부모 식물에서 교배모수 식물로 천연적 교배수분을 촉진시키기 위해 실질적으로 동형인 인접한 단일 개체군으로써 자랄 수 있다. 교배모수 식물에서 형성된 F1 종자는 선별적으로 기존의 방법으로 수확된다. 대량으로 두 부모 식물 품종을 재배할 수 있고, 교배모수에 의해 형성된 F1 혼성체 종자 및 자가수분의 결과로 인한 웅성 부모에 형성된 종자와의 조합을 수확할 수 있다. 대안적으로, 삼원 교혼성체는 단일 교배 F1 혼성체가 교배모수로써 사용되고, 다른 웅성 부모와 교배되는 경우 수행될 수 있다. 다른 대안으로, 이중-교배 혼성체는 두 개의 다른 단일 교배의 F1 자손이 그들 스스로 교배되는 경우 생성된다.
돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물의 개체는 원하는 특성이나 표현형을 가지는 개체군을 스크리닝하거나 또는 선별할 수 있다. 예를 들어, 단일 형질전환 이벤트의 자손 개체군은, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드(들)의 발현 또는 기능을 원하는 수준으로 갖는 식물에 대해 스크리닝될 수 있다. 물리적, 생화학적 방법은 발현 또는 활성 수준을 식별하는 데 사용될 수 있다. 이것은 폴리뉴클레오타이드의 검출을 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; RNA 전사체를 검출하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머 신장법 또는 RT-PCR 증폭; 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 효소 또는 리보자임 기능을 검출하기 위한 효소 분석법; 및 폴리펩타이드를 검출하기 위한 폴리펩타이드 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 및 효소-연결 면역분석법을 포함한다. 원위치 혼성화, 효소 염색, 및 면역 염색법과 같은 다른 기술들 및 효소 분석법들은 NtSUS 폴리펩타이드 또는 NtSUS 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 발현, 기능 또는 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다.
하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오타이드, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 작제물, 하나 이상의 이중가닥의 RNA, 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 하나 이상의 벡터/발현 벡터를 포함하는 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 세포 및 식물이 본원에 기재되어 있다.
5. 다른 유전자들의 변형
제한 없이, 본원에 기재된 식물 또는 그 일부는 본 개시내용에 따라서 하나 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드 및/또는 NtSUS 폴리펩타이드의 발현, 기능 또는 활성이 조절되기 전후에 변형될 수 있다.
다음과 같은 추가의 유전적 변형 중 하나 이상이 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 그 일부에 존재할 수 있다.
질소 대사 중간체의 변환에 관여하는 하나 이상의 유전자는 조절되어 적어도 하나의 담배 특이 니트로사민(TSNA)의 수준을 더 낮출 수 있다. 이러한 유전자의 비제한적인 예는 니코틴 탈메틸효소 - 예컨대 WO2006/091194, WO2008/070274, WO2009/064771 및 WO2011/088180에 기재된 CYP82E4, CYP82E5 및 CYP82E10 - 및 WO2016/046288에 기재된 니트레이트 환원효소를 암호화하는 것들을 포함한다.
중금속 흡수 또는 중금속 수송에 관여하는 하나 이상의 유전자가 변형되어 중금속 함량을 더 낮출 수 있다. 비-제한적인 예로는 다중약물 내성 연관 폴리펩타이드 계열, 양이온 확산 촉진자(CDF) 계열, Zrt- Irt-유사 폴리펩타이드(ZIP) 계열, 양이온 교환체(CAX) 계열, 구리 운반자(CORT) 계열, 중금속 ATPase 계열 (예를 들어, WO2009/074325 및 WO2017/129739에 기재된 HMAs) 계열, 자연적 저항성 관련 대식세포 폴리펩타이드(NRAMP)의 동족체의 계열, 및 카드뮴 같은 중금속의 수송에 참여하는, WO2012/028309에 기재된, ATP-결합 카세트(ABC) 수송체 계열의 다른 일원(예를 들어, MRP) 내의 유전자를 포함한다.
다른 예시적인 변형은 향미 프로파일을 변경시키는데 사용될 수 있는 수크로오스 에스테르 조성물의 변화를 야기하는 이소프로필말레이트 신타아제(isopropylmalate synthase)의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2013/029799 참조).
다른 예시적인 변형은 메티오날의 수준이 조절될 수 있는 트레오닌 신타아제(threonine synthase)의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2013/029800 참조).
다른 예시적인 변형은 베타-다마스세논 함량을 조절하여 향미 프로파일을 변경하기 위해 네옥산신 신타아제(neoxanthin synthase), 리코펜 베타 사이클리아제(lycopene beta cyclase) 및 9-시스-에폭시카로티노이드 디옥시게나제(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase) 중 하나 이상의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2013/064499 참조).
다른 예시적인 변형은 니트레이트 수준을 조절하기 위해 염화물 통로들 중 CLC 계열의 일원들의 조절된 발현 또는 기능을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2014/096283 및 WO2015/197727 참조).
다른 예시적인 변형은 잎에서의 아스파라긴의 수준을 조절하기 위한 하나 이상의 아스파라긴 합성효소의 조절된 발현 또는 기능 및 잎을 가열하거나 연소할 때 생산된 에어로졸에서의 조절된 아크릴아미드 수준을 갖는 식물을 초래할 수 있다 (WO2017/042162 참조).
다른 변형의 예는 제초제 내성을 조절하는 것을 포함하며, 예를 들면, 글리포세이트는 많은 광범위한 스펙트럼의 제초제의 활성 성분이다. 글리포세이트 저항성 유전자이식 식물은 aroA 유전자(살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)및 E. coli)로부터의 글리포세이트 EPSP 합성효소)를 전이시킴으로써 개발되었다. 술포닐우레아 저항성 식물은 애기장대(Arabidopsis) 유래의 돌연변이체 ALS (아세토락테이트 합성효소)를 형질전환시킴으로써 생성되었다. 돌연변이 긴털비름(Amaranthus hybridus) 유래의 광계 II의 OB 폴리펩타이드는 식물 내에 전달되어 아트라진 저항성 유전자이식 식물을 생산하였으며; 그리고 브로목시닐 저항성 유전자이식 식물은 세균 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 유래의 bxn 유전자를 통합하여 생산된다.
또 다른 예시적인 변형에 의하여 곤충에 저항성인 식물이 생성된다. 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis) (Bt) 독소는, 피라미드식 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자가 각각 단일 폴리펩타이드에 저항성 있는 배추좀나방을 조절하여 저항성 곤충의 진화를 명백히 지연시키는 브로콜리에서 최근에 기술된 바와 같이, Bt 저항성 해충의 출현을 지연시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있다.
또 다른 예시적인 변형은 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균, 곰팡이)로 인한 질병에 저항성인 식물을 야기한다. Xa21 유전자(세균성 마름병에 저항성)를 발현하는 식물과 Bt 융합 유전자 및 키티나제 유전자(노란 줄기 나무좀에 저항성 및 다발에 내성) 둘 모두를 발현하는 식물이 조작된 바 있다.
또 다른 예시적인 변형은 웅성불임성과 같은 생식 능력을 바꾸는 결과를 초래한다.
또 다른 예시적인 변형은 비 생물적 스트레스(예를 들면, 가뭄, 온도, 염도)에 내성인 식물을 야기하고, 내성 유전자이식 식물은 애기장대로부터 아실 글리세롤 포스페이트 효소가 전이됨으로써 생산된다; 만니톨 및 소르비톨의 합성에 관여하는 만니톨 탈수소효소 및 소르비톨 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 가뭄 저항성을 향상시킨다.
또 다른 예시적인 변형은 N-아세틸글루코사미닐전이효소, β(1,2)-자일로실전이효소 및 a(1,3)-푸코실-전이효소와 같은, 하나 이상의 내인성 글리코실전이효소의 활성이 조절되는 식물을 야기한다 (WO2011/117249 참조).
또 다른 예시적인 변형은 경화 동안 형성되는 노르니코틴과 노르니코틴 대사산물의 수준이 조절될 수 있도록, 하나 이상의 니코틴 N-탈메틸효소의 활성이 조절되는 식물을 야기한다 (WO2015169927 참조).
다른 예시적인 변형은 저장 폴리펩타이드와 오일이 개선된 식물, 광합성 효율이 향상된 식물, 저장수명이 늘어난 식물, 탄수화물 함량이 향상된 식물, 및 균류에 저항성인 식물을 야기할 수 있다. S-아데노실-L-메티오닌(SAM) 및/또는 시스타티오닌 감마 신타아제(CGS)의 발현이 조절된 유전자이식 식물이 또한 고려된다.
니코틴 합성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 변형되어서, 경화될 때, 조절된 니코틴 수준을 생산하는 식물 또는 식물의 부분을 생성할 수 있다. 니코틴 합성 유전자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: A622, BBLa , BBLb , JRE5L1, JRE5L2 , MATE1 , MATE 2, MPO1 , MPO2 , MYC2a , MYC2b , NBB1 , nic1 , nic2 , NUP1, NUP2, PMT1, PMT2, PMT3, PMT4 및 QPT 또는 그의 하나 이상의 조합.
하나 이상의 알칼로이드의 양을 제어하는 데 관여하는 하나 이상의 유전자가 변형되어서, 알칼로이드의 조절된 수준을 생산하는 식물 또는 식물의 부분을 야기할 수 있다. 알칼로이드 수준 제어 유전자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다; BBLa , BBLb , JRE5L1 , JRE5L2 , MATE1 , MATE 2, MYC2a , MYC2b , nic1 , nic2 , NUP1 및 NUP2 또는 이들의 둘 이상의 조합.
하나 이상의 이러한 형질들은 다른 재배종으로부터 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물 내로 이입되거나 또는 곧바로 형질전환(transform)될 수 있다.
다양한 구현예들은, 본 개시내용에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준이 조절됨에 따라 그에 의해 암호화되는 폴리펩타이드(들)의 수준을 조절하는 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물 또는 유전자이식 식물, 뿐만 아니라 바이오매스를 제공하고 있다.
6. 소비성 제품
본원에 기재된 식물들의 일부, 특히 그러한 식물들의 잎몸(leaf lamina) 및 주맥(midrib)이 에어로졸 형성 물질, 에어로졸 형성 장치, 흡연 물품, 흡연가능한 물품, 무연(smokeless) 제품, 의료용 또는 화장용 제품, 정맥 주사 제제, 정제, 분말 및 담배 제품을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 소비성 제품의 제조에 도입되거나 사용될 수 있다. 에어로졸 형성 물질의 예는 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 대담배(cut tobacco), 각초(cut filler), 경화된 담배, 팽화 담배(expanded tobacco), 균질화된 담배, 재구성 담배, 및 파이프 담배를 포함한다. 흡연 물품 및 흡연가능한 물품은 에어로졸 형성 장치의 유형이다. 흡연 물품 또는 흡연가능한 물품의 예는 궐련(cigarette), 엽궐련(cigarillos), 및 시가(cigar)를 포함한다. 무연 제품의 예는 씹는 담배류 및 코담배류를 포함한다. 소정의 에어로졸 형성 장치에서, 연소 대신에, 담배 조성물 또는 다른 에어로졸 형성 물질이 하나 이상의 전기 가열 요소에 의해 가열되어 에어로졸을 생성한다. 또 다른 유형의 가열식 에어로졸 형성 장치에서, 가연성 연료 요소 또는 열원으로부터 열원의 내부, 그 주위 또는 그 하류에 위치될 수 있는, 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 물질로의 열 전달에 의해 에어로졸이 생성된다. 무연 담배 제품 및 다양한 담배-함유 에어로졸 형성 물질들은 건조 입자, 세절, 과립, 분말 또는 슬러리의, 다른 물질 상에 증착된, 다른 물질과 혼합된, 다른 물질에 둘러싸인 또는 박편, 필름, 탭, 거품, 또는 구슬과 같은 모든 형상의 다른 물질들과 결합된 담배를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 ‘연기’는 흡연 물품, 예컨대 궐련에 의해서, 또는 에어로졸 형성 물질을 연소시켜 생성되는 에어로졸의 유형을 설명하는 데 사용된다.
한 구현예에서, 본원에서 기술한 돌연변이, 유전자이식 및 비-자연발생 식물의 경화된 식물 물질이 또한 제공된다. 녹색 담뱃잎들을 경화시키는 공정은 음건(air-curing), 화건(fire-curing), 열건(flue-curing) 및 양건(sun-curing)을 비제한적으로 포함하는 당업자에게 공지된 기술이다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 돌연변이 담배 식물, 유전자이식 담배 식물 또는 비-자연발생 담배 식물의 잎, 바람직하게는 경화된 잎을 포함하는 담배-함유 에어로졸 형성 물질을 포함하는 담배 제품이 기술된다. 본원에 기술된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 추가로 포함할 수 있는 혼합 담배 제품일 수 있다.
7. 작물 관리 및 농업용 제품 및 방법
돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물들은 다른 용도들, 예를 들어, 농업에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이, 비-자연발생 또는 유전자이식 식물들은 동물 사료 또는 인간 음식 제품을 만들기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 돌연변이 식물, 비-자연발생 식물, 또는 유전자이식 식물을 재배하고, 재배된 식물들로부터 종자를 채취하는 것을 포함하는 종자의 생산 방법들을 제공한다. 본원에 기술된 식물의 종자는 본 기술분야에 공지된 수단들에 의하여 조절되고 포장 물질에 포장되어 제조품을 형성할 수 있다. 종이 및 천과 같은 포장 물질들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 종자의 포장은 라벨, 예를 들어, 내부의 종자의 유형을 기재한 포장 물질에 고정된 태그 또는 라벨, 포장 위에 프린트된 라벨을 가질 수 있다.
동정, 선발, 또는 교배를 위한 식물의 유전자형 검사(genotyping)를 위한 조성물, 방법 및 키트는 폴리뉴클레오타이드 샘플 내 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)의 존재를 검출하는 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드들의 적어도 일부를 특이적으로 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머들과 선택적으로 하나 이상의 프로브들 및 선택적으로 증폭 또는 검출을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 조성물이 기재되어 있다.
따라서, 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)에 대응하는 약 10 이상의 인접 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머들 또는 프로브들이 개시되어 있다. 상기 프라이머들 또는 프로브들은 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)에 혼성화(예를 들어, 특이적으로 혼성화)하는 약 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 이상의 인접 뉴클레오타이드들을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 프라이머들 또는 프로브들은 유전자 동정(예를 들어, 서던(Southern) 혼성화) 또는 단리(예를 들어, 세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크들의 원위치 혼성화) 또는 유전자 검출(예를 들어, 증폭 또는 검출에서의 하나 이상의 증폭 프라이머들로서)의 서열-의존성 방법들에 사용될 수 있는 약 10 내지 50 인접 뉴클레오타이드들, 약 10 내지 40 인접 뉴클레오타이드들, 약 10 내지 30 인접 뉴클레오타이드들 또는 약 15 내지 30 인접 뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 특이적 프라이머들 또는 프로브들은 폴리뉴클레오타이드(들)의 일부 또는 전체를 증폭하거나 검출하기 위하여 디자인되고 사용될 수 있다. 특정한 예로서, 2개의 프라이머를 PCR 프로토콜에 사용하여 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있다. PCR은 또한 폴리뉴클레오타이드 서열에서 유래된 하나의 프라이머 및 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류 또는 하류의 서열- 예를 들어 프로모터 서열, mRNA 전구체의 3' 말단 또는 벡터로부터 유래된 서열에 혼성화하는 제2 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 시험관 내(in vitro) 증폭에 유용한 열적 및 등온 검사법(thermal and isothermal technique)의 예는 본 기술분야에 주지되어 있다. 시료는 본원에 기재된 식물, 식물 세포 또는 식물 물질 또는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질로부터 유래된 담배 제품 또는 이들로부터 유래된 것일 수 있다.
추가적인 측면에서, 또한 시료에서 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)(또는 본원에 기재된 그의 임의의 조합)을 검출하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 방법은 (a) 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이를 포함하는 것으로 간주되는 시료를 제공하는 단계; (b) NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 하나 이상의 프로브들과 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 증폭 산물의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 존재는 시료 내의 NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 존재를 표시하는 것이다. 추가적인 측면에서, NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 프로브들의 용도가 또한 제공되어 있다. NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머들 또는 프로브들을 포함하는, NtSUS 폴리뉴클레오타이드(들)의 적어도 일부를 검출하기 위한 키트가 또한 제공되어 있다. 키트는 폴리뉴클레오타이드 증폭-예를 들어 중합효소 연쇄반응-을 위한 시약 또는 프로브 혼성-검출 기술-예를 들어 서던 블롯, 노던 블롯, 원위치 혼성화, 또는 마이크로어레이를 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 항체 결합-검출 기술, 예를 들어, 웨스턴 블롯, ELISA, SELDI 질량 분석기 또는 테스트 스트립을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 DNA 서열 분석을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 시약 및 키트를 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, 키트는 기술된 방법들 하나 이상을 위한 설명을 포함할 수 있다. 기술된 키트는 유전적 동일성 측정, 계통발생학적 연구, 유전자형 검사, 하플로타이핑(haplotyping), 계통 분석 또는 식물 교배에서 특히 공우성 스코어링(co-dominant scoring)과 함께 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 NtSUS 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 물질의 유전자형 검사 방법을 제공한다. 유전자형 검사는 염색체 쌍의 상동체들을 구분하는 수단을 제공하며 식물 개체들 내에서 분리 개체(segregant)들을 구분하는데 사용될 수 있다. 분자 마커 방법들은 계통발생학적 연구, 작물의 변이체들 간의 유전적 연관성 분석, 체세포 교잡종 또는 잡종(cross)의 판별, 단일 유전자 특질들에 영향을 미치는 염색체 분절들의 위치 판별, 맵(map)-기반 클로닝, 및 양적 유전 연구에 사용될 수 있다. 유전자형 분석의 구체적인 방법은 증폭산물 길이 다형성(AFLP)을 포함한 모든 분자 마커 분석 기술들이 사용될 수 있다. AFLP는 폴리뉴클레오타이드 다양성에 의해 유발되는 증폭 단편들 사이의 대립유전자 차이의 산물이다. 따라서, 본 개시내용은 AFLP 분석과 같은 기술들을 이용하여 하나 이상의 유전자들 또는 폴리뉴클레오타이드들의 분리(segregation) 및 이들 유전자들 또는 폴리뉴클레오타이드들과 유전적으로 연결된 염색체 서열들의 분리를 따르는 수단을 추가로 제공하고 있다.
본 발명은 발명을 더 상세히 설명하기 위하여 제공되는 하기 실시예에서 추가적으로 설명된다. 본 발명을 수행하기 위하여 현재 고려되는 바람직한 형태를 제공하는 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된 것이다.
실시예
실시예 1: 버얼리 , 버지니아 및 오리엔탈 담배 잎에서 경화 후 주요 수크로오스 대사 유전자의 동정
버얼리, 버지니아 및 오리엔탈 담배 잎의 초기 경화 시간 동안 수크로오스 대사에 기여하는 주요 기능을 식별하기 위해, 수확시 숙성 잎에 비해, 48시간 경화 후 경화된 잎에서 상향조절된 유전자의 기능에 대한 과발현 분석(log2 배수 변화 >2, 조정된 p-값<0.05)을 버얼리, 버지니아 및 오리엔탈 담배에서 수행한다. 경화 유형과 담배 품종과 독립적으로 48시간 경화 후에 활성인 환원당의 생산에 관여하는 유전자들을 동정한다. 환원당의 생산에 관여하는 담배 유전자가 동정된다.
잎에서 초기 경화 동안 환원당의 생산에 직접 관여하는 핵심 유전자는 SUS의 유전자 계열에 속한다. SUS는 경화된 떨어진 잎에서 환원당의 축적을 유도하는 핵심 효소일 가능성이 있다.
담배 게놈은 각 조상으로부터 하나의 S 및 T 사본을 가진 6개 계열에 분포된 12개의 NtSUS 유전자 산물을 갖는 것으로 밝혀져 있다: NtSUS1 -S (서열번호 1), NtSUS1-T (서열번호 3), NtSUS2 -S (서열번호 5), NtSUS2 -T (서열번호 7), NtSUS3 -S (서열번호 9), NtSUS3 -T (서열번호 11), NtSUS4 -S (서열번호 13), NtSUS4 -T (서열번호 15), NtSUS5 -S (서열번호 17), NtSUS5 -T (서열번호 19), NtSUS6 -S (서열번호 21) 및 NtSUS6-T (서열번호 23).
SUS 전사체는 게놈 서열 NtSUS2 -S (서열번호 5), NtSUS3 -S (서열번호 9), NtSUS3-T (서열번호 11) 및 NtSUS4 - S (서열번호 13)로부터 유래한다. 이들 유전자는 표 1에 보이는 바와 같이, 잎 경화(노화) 동안 상향조절된다. 이는 S 사본이 경화 초기 잎의 화학적 변형에 특히 관여하고, 이와 같은 특별한 경우에 글루코오스 및 프룩토오스의 증가를 확인한다.
버지니아 및 오리엔탈과 비교하여, 낮은 양의 환원당 수준이 버얼리종의 경화된 잎에서 발견되지만 (도 1 참조), NtSUS 유전자는 그럼에도 불구하고 버얼리에서 활성화되며(표 1 참조), 이는 또한 초기 경화 단계 동안 아미노산 합성을 위한 이용 가능한 탄소 공급원을 보장하기 위한 구성적 반응으로서 그럴 가능성이 있다.
버얼리(BU) 및 버지니아(FC) 모두에서, 초기 경화 동안 발현되지 않는 NtSUS1-S 및 NtSUS1 -T는(표 1 참조) 특히 뿌리 및 줄기에서 발현되며, 이는 세포벽 합성을 위해 탄수화물을 전달하거나 산소결핍(anoxia) 하에 탄소 자원을 공급하기 위한 이들 조직에서의 가능한 특이적 기능을 표시하는 것이다. 한편, 초기 잎 경화 동안 유도되는, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T, NtSUS4 -S 또한, 모든 기관에서 발현되지만, NtSUS2-S 및 NtSUS2 -T는 미성숙 꽃 및 꽃잎에서 주로 발현된다. NtSUS5 -S, NtSUS5 -T, NtSUS6 -S 및 NtSUS6 -T는 모든 분석된 식물 조직에서 낮은 수준으로 발현된다(표 2 참조).
경화된 잎에서 환원당 풀을 증가시키기 위해, SAG12 또는 E4와 같은 노화 유도된 프로모터를 사용하여 NtSUS2 -S, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T 및/또는 NtSUS4 -S를 과발현하는 것이 고려될 수 있다(구성적 프로모터의 사용은 식물 대사를 강하게 변화시킬 수 있음). 한편, 녹아웃 NtSUS2 -S, NtSUS3 -S, NtSUS3 -T 및/또는 NtSUS4 -S 이 경화된 잎에서 환원당의 함량을 감소시키는 데 기여할 수 있다.
실시예 2 - 버지니아 담배 잎에서의 NtSUS 발현 침묵
버얼리종 담배에서 NtSUS의 침묵은, 이 유전자가 경화된 버지니아 담배 잎에서 환원당 함량을 감소시키는데 기여하는지를 결정하기 위해 조사된다. NtSUS의 코딩 서열 내의 특이적 DNA 단편을 GATEWAY 벡터 내의 강한 구성적 미라빌리스 모자이크 바이러스(MMV) 프로모터로 클로닝한다. NtSUS 유전자 단편을 MMV와 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자의 3’ nos 종결자 서열 사이에 측면 배치한다.
낮은 환원당 함량 식물의 선별을 가능하게 하기 위해서, 독립적인 T0 식물 잎 및 각각의 대조군 계통을 60시간 경화 후에 분석해서 환원당 함량에 대한 영향을 결정한다. 선별된 환원당의 최저 수준을 나타내는 최적의 T0 계통. 최고의 T0 계통으로부터 종자를 수확한다. T1 자손들을 qPCR로 분석해서 환원당 함량 감소에 관한 NtSUS 침묵 이벤트의 효율성을 결정한다.
NtSUS 유전자를 조작함으로써(예를 들어, 구성적 프로모터 또는 특이적 노화 프로모터 - 예컨대 SAG12 또는 E4에 의함) 담배 경화된 잎의 화학을 변화시킬 수 있다. 마찬가지로 유전자 편집 전략-예컨대 CRISPR-Cas 또는 돌연변이 선별을 이용한 녹아웃 NtSUS 유전자는, 상업적 담배의 주요 품종의 아미노산 잎 화학을 변화시킬 수 있다.
본원에 인용되거나 기재된 임의의 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 개시된 관련 정보를 제공한다. 본원에서 언급된 것은, 본 발명자들이 이러한 개시문헌들을 선행할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 상기 명세서에서 언급된 모든 공개문헌은 본원에 참조로 인용된다. 본 발명의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어남이 없이 숙련자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구범위에 기재된 발명은 이러한 특정 구현예에 지나치게 한정되지 않아야 한다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 세포, 분자 및 식물 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 것을 포함하는, 본원 발명을 실시하기 위하여 기술된 모드들의 다양한 변형들이 이하의 청구범위에 포함된다.
표 1
버얼리(BU), 버지니아(FC) 및 오리엔탈(OR)의 초기 경화 중 NtSUS 유전자 발현
Figure pct00002
표 2
경지에서 재배된 버얼리(BU) 및 버지니아(FC) 식물의 뿌리, 줄기, 중간-잎, 미성숙 꽃(imflower), 꽃받침 및 꽃잎에서의 NtSUS 유전자 발현
Figure pct00003
서열 목록
서열번호 1: NtSUS1 -S의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 2: NtSUS1-S의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 3: NtSUS1 -T의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 4: NtSUS1-T의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 5: NtSUS2 -2의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 6: NtSUS2-2의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 7: NtSUS2 -T의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 8: NtSUS2-T의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 9: NtSUS3 -S의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 10: NtSUS3-S의 폴리펩타이드 서열
MANPKFTRVPSMRERVEDTLSAHRNQLVALLSRYVAQGKGILQPHHLIDEFNNAVCDDTACEKLKDGPFSEVLKATQEAIVLPPFVAIAVRPRPGVWEYVRVNVYDLSVEQLTVPEYLHFKEELVDGEGNNHFVLELDFEPFNASVPRPSRSSSIGNGVQFLNRHLSSIMFRSKDSLDPLLDFLRGHCHKGNVLMLNDRIQRISRLESALSKAEDYLSKLSPDTSYNEFEYALQEMGFERGWGDTARRVLETMHLLSDILQAPDPSTLETFLGRLPMVFNVVILSPHGYFGQANVLGLPDTGGQVVYILDQVRALEAEMLLRIKQQGLNFKPRILVVTRLIPDAKGTMCNQRLERISGTEYSHILRVPFRTEKGILHKWISRFDVWPYLEKFTEDVASEMTAELQGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAYKMGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKFEEKYHFSCQFTADLLAMNNSDFIITSTYQEIAGTKNTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMTIYFPYSDKEKRLTSLHGSIEKLLFDPAQNEEHIGNLNDKSKPIIFSMARLDHVKNITGLVECYAKNATLRELANLVVVAGYNDVKKSSDREEITEIEKMHALIKEHKLDGQFRWVSAQTNRARNGELYRYIADQRGIFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCHGGPNEIIEPGVSGFHIDPYHPDKAAELMSEFFQRCKQDPTHWEKISASGLRRILERYTWKIYSERLMTLSGVYGFWKLVSKLERRETRRYLEMFYILKFRELAKSVPLAIDDK
서열번호 11: NtSUS3 -T의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 12: NtSUS3-T의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 13: NtSUS4 -S의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 14: NtSUS4-S의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 15: NtSUS4 -T의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 16: NtSUS4-T의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 17: NtSUS5 -S의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 18: NtSUS5-S의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 19: NtSUS5 -T의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 20: NtSUS5-T의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 21: NtSUS6 -S의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 22: NtSUS6-S의 폴리펩타이드 서열
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서열번호 23: NtSUS6 -T의 폴리뉴클레오타이드 서열
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서열번호 24: NtSUS6-T의 폴리펩타이드 서열
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taatatattt ttacctaggt attttactta taattaaaat aatattaaat tattttattt 540 atctatttta taatatattc atacatttaa ttttttcatg gcaaatcact ttgtttaatc 600 atatttaaac atgaacaaat tttaaatatc aaaaaaataa aaaaataaaa aaaatattta 660 tttgaaataa taacaaacag atttgtttaa caaatgatag ttttttttta tagtcaataa 720 aatttttaaa aaaattcaaa gatatttgtt tttaatatta atatttttaa agctttatct 780 gttaatatta tttatttgaa agtattaatc tgatgtgtca ttgtgttaaa tgtgagtatt 840 ttatttattg gattaatgag tatggcttgg ctgataaaaa gctttgattt tataattttc 900 attaaaaata ttttattaag ctagtacctg acaaatttaa tatcttgaaa attaacgtta 960 agaaaaaatt aaatataaaa atatattata aaaataataa ataaataata tcaagttatt 1020 ttaattataa ataaaataca tggttaaaaa tatattatat agcatataat atagaaggta 1080 ttacataaat gagatgattt aaagggcata atagactttt caggtgaatg atttgtaaaa 1140 tatggttaaa gtgattattg tgataattag agcatagtaa aataattttt atgtaacaaa 1200 agaaaaaaaa aatgactttt gggtaatgaa cataaatttg aataactttt acgtaacaaa 1260 agaataaaat aaattttgga taataaacat aaaattgaat gaccacctat aaaatttatt 1320 atttttttgg 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tcgctaggtg aacacccttc ttttatgttt tttcccctct acgtgtttat 120 gtcaaatttc catgcataat gctaactact tttcttcttt ttgacttcaa aattggatgt 180 gaaaggttca ttgcaatggg aaggaggcta atgaagttga aacatttaac agaagaaata 240 gaagaaacta ttgaagacaa ggcagaaaga accaggattt tggagggttc acttggaaaa 300 attatgagtt ccacacaggt cagcaccatt taaccaactt agttgaacag gaaaaaaaga 360 aaaagcaaaa gagttattgc aaggcgtaac gattttcttt gaaattttca ggaggcagct 420 gttgttccac cttatgttgc ttttgcagta aggcacaatc ctggcttctg ggattatgtc 480 aaagttaacg ctgaaactct ctctgtggaa gctatttcag ccagggaata tctcaaattc 540 aaagagatga tctttgacga agactggtaa gtggaaaatt gtatcatttt aaagagaaac 600 aattttgtaa catacaagaa tagttttgat ggttgaatgt gcaagcaggg caaaggatga 660 taatgcactg gaagtagatt ttggtgcttt tgactactct aatcctcggt tagccctttc 720 ctcttctgtc ggaaatgggc tcaactttat ctcaaaagtt ctgtcttcaa agtttggtgg 780 aaagccagag gacgcccagc ctttgcttga ttacttacta gctcttaatc atcaaggaga 840 ggtatgaaaa tggactacct ttgtttctta aaggtattat ataatgatgc gcgttataaa 900 gttccttttt aaattgaaac tttgcagaat ctaatgatca atgagaatct gaatggtgtt 960 gctaagcttc aagcagcatt gatagtagct gaagtttttg tatcttcctt tcccaaagac 1020 acaccttata aagactttga gcataagtaa gcttctcata tgcttccatt gtcatatgca 1080 gtataccaat gacatgctac cgaaaagttg tttatgtttg tgacttgatt atgaaaactc 1140 taggctcaaa gaatggggct ttgataaagg gtggggtcac aatgcaggaa gagtaagaga 1200 gacaatgaga ctgctttccg agataatcca agcaccagat cccataaata tggagtcctt 1260 tttcagcaag cttcctacta cattcaacat tgttatcttc tccattcatg gttactttgg 1320 ccaagcagat gtccttggtc tgcccgatac tggaggccag gtctacatat acagcaattt 1380 atctcctttt gcctcatatt gcttattagc gacacttgca tcattgaaat cagactttta 1440 cttcacaggt tgtttatatt ctggatcaag taagggcttt agaggaggaa atgttacaaa 1500 gaatcaagca gcaagggcta aacgtgaagc ccaagattct tgtggtgagt tttgcaaaaa 1560 tatgcttaga caggttttga gattgatcgg agaagggatt aagatgatca agatctttgt 1620 ttcctgcttt catgatgtaa acaggtatct cgtctcatac cagatgctcg agggacaaca 1680 tgcaatcagg agatggaacc tattcttaac tcatcccatt ctcacatcct gagaattcca 1740 ttcaggactg agaaaggagt 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ttttcctaat ctaaccattg cttaaatcgt tctgttttta 2640 ccggatgtgt ggtacttatc agtaacattt ttttttggat cagtggattt cttgcagacc 2700 ggaaaaaacc aattatattt tcaatggcga gatttgatac agtgaagaac ctgtcaggct 2760 tgactgagtg gtatgggaag aataagaagt tgcggaactt ggtaaacctt gttattgttg 2820 ggggattctt cgatccatca aaatcaaaag accgggagga agcagctgaa atcaagaaga 2880 tgcatgaatt gattgagaaa taccagctca agggacaaat gagatggata gcagctcaaa 2940 ctgataaata tcgaaatagt gagctatacc gaactattgc tgacactaag ggagcttttg 3000 tccaaccggc tttatatgaa gcttttggac taaccgttat tgaagcaatg gattgtggat 3060 tgcctacgtt tgcaactaat caaggtggac ctgcagaaat cattgttgat ggggtttcag 3120 gtttccatat tgatccttac aatggggacg aatcaagcaa gaaaatagct gatttctttg 3180 agaagtgtaa ggttgattct aaatattgga acaggatatc tgagggaggt ctcaagcgca 3240 ttgaagaatg gtaacaaact agttccaagt ttaaaaaatg gaaaaaatgc ttatcatgtt 3300 atattttcgt ggttttaagt tctgcttcga tgcagttata cgtggaagat ttatgcaaac 3360 aaagtgttga atatgggatc aatctatgga ttttggagac aattcaatgt ggggcaaaag 3420 caggctaagc aaagatactt tgagatgttt tacaatcctc tcttcaggaa attggtaggt 3480 tgtatatgtt gaatacaatt tactaagatc ctcaaaatga ccaagaaata tacattgact 3540 atgctacttt tgtaatttca caggccaaaa gcgtgccgat cccacatgaa gagccattgc 3600 cacttgcaac atcagactct actcaatccc aagaattaaa actaccacta ccagttccag 3660 cagcagtagc taaagttctg ccattaacaa ggcatgcttt taacttaatt acttctctac 3720 ctagagtaac tggtaaagtg gatgtcaagt ga 3752 <210> 18 <211> 840 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 18 Met Ala Ser Thr Val Ala Asp Ser Met Pro Asp Ala Leu Lys Gln Ser 1 5 10 15 Arg Tyr His Met Lys Arg Cys Phe Ala Arg Phe Ile Ala Met Gly Arg 20 25 30 Arg Leu Met Lys Leu Lys His Leu Thr Glu Glu Ile Glu Glu Thr Ile 35 40 45 Glu Asp Lys Ala Glu Arg Thr Arg Ile Leu Glu Gly Ser Leu Gly Lys 50 55 60 Ile Met Ser Ser Thr Gln Glu Ala Ala Val Val Pro Pro Tyr Val Ala 65 70 75 80 Phe Ala Val Arg His Asn Pro Gly Phe Trp Asp Tyr Val Lys Val Asn 85 90 95 Ala Glu Thr Leu Ser Val Glu Ala Ile Ser Ala Arg Glu Tyr Leu Lys 100 105 110 Phe Lys Glu Met Ile Phe Asp Glu Asp Trp Ala 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atggctactg caccagccct aaatagatca gagtccatag ctgatagcat gccagaggcc 60 ttaaggcaaa gccggtacca catgaagaaa tgttttgcca agtacataga gcaaggaaag 120 aggatgatga aacttcataa cttgatggat gagttggaga aagtaattga tgatcctgct 180 gaaaggaacc atgttttgga aggcttactt ggctacatat tatgcactac aatggtatag 240 ctagattcat atgtacttat gatgccctta tattgtttcc tgatgtatta ctcttaaaac 300 cttctttgat caaatttaca ggaggctgca gttgttcctc cctacattgc ctttgccacg 360 agacagaatc ctggattctg ggaatatgtg aaagtgaatg ctaatgatct ttctgttgag 420 ggtattacag ctacagaata cttgaaattc aaggaaatga tagttgatga atgctggtat 480 agtatacgtt gcagcttatc ataccttttg tggttttata acttcaatca gaaaactcat 540 cagagttacc tttgtgtgaa catgaaatgc agggcaaaag atgaatatgc actggaaatt 600 gattttggag cagtagactt ctcaacgcct cgactgaccc tatcctcttc aattggcaat 660 ggtctcagtt atgtttccaa gtttctaact tcaaagctaa atgctacctc cgcgagtgca 720 cagtgtctgg ttgactactt gctcactttg aatcatcaag gagatgtacg tcaacaaaaa 780 tcaaactcca taagtaaact tgtcaactct aagaagaaaa aataggaaaa gaagattcac 840 gtaacaaatt ttctttatgt tcaactgcag aaactgatga tcaatgagac actcagcact 900 gtctcaaagc ttcaggctgc actggttgta gcagaagcat ctatttcctc tttaccaaca 960 gatacaccat atgagagctt tgagctaagg tgatttgttt tttcctctac ttccctccac 1020 ttgtgccatg ctacgtagta ctaagtaact tcaattcttg taaagattca aacagtgggg 1080 ttttgagaaa ggatggggtg atacagctga aagggtcagc gacaccatga gaacactgtc 1140 tgaggtgctt caggcaccag atccattgaa cattcagaag ttctttggaa gggttccaac 1200 tgttttcaat attgtattgt tctctgtcca tggatacttt ggccaagcag atgttcttgg 1260 cttgccagac actggtggtc aggtaagcat ttaatagctt ttacatttaa cttctatgca 1320 ttgacaataa aataattttt aacagtttga ccacttctgc tcttgttcaa caggtagttt 1380 atgttttgga tcaagttgta gcttttgaag aagaaatgct acaaagaatt aaacagcagg 1440 ggctcaatat taagcctcaa attcttgtgg tgagttccta gacaatcgac gtgactatgc 1500 aattatgtag aggctgttta gaaaagttaa tatcatatgt tgattgcaca gttaacccga 1560 ctgattccgg atgcaaaagg aacaaagtgc aaccaggaac tagaaccaat caagaataca 1620 aaacattcac acatcctcag agttccattt aggacagaaa aaggagtgct taatcaatgg 1680 gtttcacgat ttgatatcta tccatatctg gagagatata ctcaggtatg tatttttata 1740 tcaaccttgc tcatcaaaga tgtgttgttt cctcaattcc atttttcccc ttggcaaaag 1800 gatgctgctg acaaaatcgt cgagctaatg gaaggcaaac ctgatctaat cattggtaac 1860 tacactgatg ggaatctagt ggcttcacta atggctagaa aacttgggat aactctggta 1920 acttttctta atcatatttg atgttgcttc ttctccaagt tagttcttaa tctccactga 1980 cctagaccat ctttgcaaca gggaactatt gctcatgctt tggagaagac aaaatatgaa 2040 gactctgaca taaaattgaa ggaactcgat ccgaagtacc acttctcttg ccaattcaca 2100 gctgatttga ttgcaatgaa ttcagcagat ttcattatca ctagcacata ccaagaaata 2160 gctggaaggt aagaattaga gctaataagt aatgcattca tatgtatttc agcatcgctc 2220 tttcaccatc atcgaataca caccactact cagtaaatgt atttgctcaa aagtttgcaa 2280 cttaatggat ctcattcttg aatgcttcaa catatgcagc aaagataaac caggacagta 2340 tgagagccat agtgcattta cccttccagg gctttacaga gttgcttcag gtatcaatgt 2400 ctttgatcca aaatttaata ttgctgcacc tggggcagac cagtcggtgt atttccctta 2460 cacagaaaag cagaagcgtt tgactgcttt ccgccctgcc attgaggaac tgctttttag 2520 taaagtggac aatgacgagc acgtgtaagt ctaagtgtta aacttcagct tagtgcctag 2580 aacatcccac tgctctatgt attgatgttt cacttgtttc aaacagtgga tatttagaag 2640 acagaaagaa acctatcctg tttaccatgg caaggctgga cacagtgaag aacacatctg 2700 gactaacaga atggtatggc aagaacaaga ggctcagaag cttagttaac cttgttgtgg 2760 ttggtggttc ctttgatcct acaaaatcca aggataggga agaagcagct gaaataaaaa 2820 agatgcacat gctgatagag aaataccagc ttaagggtca gattagatgg atagcagctc 2880 agactgacag atacagaaat agtgaactct accgcacaat agcagattcc aaaggagctt 2940 ttgtgcagcc tgcattgtat gaagcatttg gtctaacagt cattgaggca atgaactgtg 3000 gattaccaac ctttgctacc aaccaaggtg gccctgctga gattattgtt gatggggtct 3060 caggctttca tattgatcca aataatgggg atgaatcaag caacaaaatt gccaactttt 3120 tccaaaaatg cagggaggat cctgagtatt ggaacaggat ttcagtccag ggtctaaacc 3180 gtatatatga atggtaactc acagataagc cattcaaatt gcaaagaggc acatatcttg 3240 cagaaaattt cttaatcctt aaatcctaat tttttgcagt tacacatgga agatctatgc 3300 aaacaaggta ttgaatatgg ggtccatcta tactttttgg aggacattgt acagagatca 3360 gaaacaagca aagcaaagat acatcgagac tttctacaat cttgagttta ggaacttggt 3420 atagtgctgc atgacattga cagtatacca caaacatctt tatgagatga attactttta 3480 ataaaattgt ttttaacctt tgcttcctta atggcactta ttgcaggtaa aaaatgtgcc 3540 tatcagaaag gacgaaacac cacaaggacc aaaggagagg gagaaagtta agccacagat 3600 atcacaaagg catgctctaa agcttttgcc tacagttttt caagagaccc tagtatattc 3660 tagtactaaa ttagaattat acagcatgca gcttttgctg ttcacctttc taaatcacca 3720 gttgtgtcaa tcaagttgac aaaatcaata aattgggatt ttccctttcc tatgcttgat 3780 tgttattact cctactttgt ttatggtagt cttccttcat tgttttctcc tgtacttctt 3840 ttactacaac tgtactgaca tactaattat ttctgtgtac caggcgctca caatcaaggt 3900 tgcagaagta agattagata aaattgctac tgcatga 3937 <210> 22 <211> 860 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 22 Met Ala Thr Ala Pro Ala Leu Asn Arg Ser Glu Ser Ile Ala Asp Ser 1 5 10 15 Met Pro Glu Ala Leu Arg Gln Ser Arg Tyr His Met Lys Lys Cys Phe 20 25 30 Ala Lys Tyr Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Met Lys Leu His Asn Leu 35 40 45 Met Asp Glu Leu Glu Lys Val Ile Asp Asp Pro Ala Glu Arg Asn His 50 55 60 Val Leu Glu Gly Leu Leu Gly Tyr Ile Leu Cys Thr Thr Met Glu Ala 65 70 75 80 Ala Val Val Pro Pro Tyr Ile Ala Phe Ala Thr Arg Gln Asn Pro Gly 85 90 95 Phe Trp Glu Tyr Val Lys Val Asn Ala Asn Asp Leu Ser Val Glu Gly 100 105 110 Ile Thr Ala Thr Glu Tyr Leu Lys Phe Lys Glu Met Ile Val Asp Glu 115 120 125 Cys Trp Ala Lys Asp Glu Tyr Ala Leu Glu Ile Asp Phe Gly Ala Val 130 135 140 Asp Phe Ser Thr Pro Arg Leu Thr Leu Ser Ser Ser Ile Gly Asn Gly 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Val Ser Lys Phe Leu Thr Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ser 165 170 175 Ala Ser Ala Gln Cys Leu Val Asp Tyr Leu Leu Thr Leu Asn His Gln 180 185 190 Gly Asp Lys Leu Met Ile Asn Glu Thr Leu Ser Thr Val Ser Lys Leu 195 200 205 Gln Ala Ala Leu Val Val Ala Glu Ala Ser Ile Ser Ser Leu Pro Thr 210 215 220 Asp Thr Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Leu Arg Phe Lys Gln Trp Gly Phe 225 230 235 240 Glu Lys Gly Trp Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Ser Asp Thr Met Arg 245 250 255 Thr Leu Ser Glu Val Leu Gln Ala Pro Asp Pro Leu Asn Ile Gln Lys 260 265 270 Phe Phe Gly Arg Val Pro Thr Val Phe Asn Ile Val Leu Phe Ser Val 275 280 285 His Gly Tyr Phe Gly Gln Ala Asp Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr Gly 290 295 300 Gly Gln Val Val Tyr Val Leu Asp Gln Val Val Ala Phe Glu Glu Glu 305 310 315 320 Met Leu Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Gln Ile 325 330 335 Leu Val Leu Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala Lys Gly Thr Lys Cys Asn 340 345 350 Gln Glu Leu Glu Pro Ile Lys Asn Thr Lys His Ser His Ile Leu Arg 355 360 365 Val Pro Phe Arg Thr Glu Lys Gly Val Leu Asn Gln Trp Val Ser Arg 370 375 380 Phe Asp Ile Tyr Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Thr Gln Asp Ala Ala Asp 385 390 395 400 Lys Ile Val Glu Leu Met Glu Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn 405 410 415 Tyr Thr Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Met Ala Arg Lys Leu Gly 420 425 430 Ile Thr Leu Gly Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Glu 435 440 445 Asp Ser Asp Ile Lys Leu Lys Glu Leu Asp Pro Lys Tyr His Phe Ser 450 455 460 Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ser Ala Asp Phe Ile 465 470 475 480 Ile Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Lys Pro Gly 485 490 495 Gln Tyr Glu Ser His Ser Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val 500 505 510 Ala Ser Gly Ile Asn Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Ala Ala Pro 515 520 525 Gly Ala Asp Gln Ser Val Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Lys Gln Lys Arg 530 535 540 Leu Thr Ala Phe Arg Pro Ala Ile Glu Glu Leu Leu Phe Ser Lys Val 545 550 555 560 Asp Asn Asp Glu His Val Gly Tyr Leu Glu Asp Arg Lys Lys Pro Ile 565 570 575 Leu Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Thr Val Lys Asn Thr Ser Gly Leu 580 585 590 Thr Glu Trp Tyr Gly Lys Asn Lys Arg Leu Arg Ser Leu Val Asn Leu 595 600 605 Val Val Val Gly Gly Ser Phe Asp Pro Thr Lys Ser Lys Asp Arg Glu 610 615 620 Glu Ala Ala Glu Ile Lys Lys Met His Met Leu Ile Glu Lys Tyr Gln 625 630 635 640 Leu Lys Gly Gln Ile Arg Trp Ile Ala Ala Gln Thr Asp Arg Tyr Arg 645 650 655 Asn Ser Glu Leu Tyr Arg Thr Ile Ala Asp Ser Lys Gly Ala Phe Val 660 665 670 Gln Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met 675 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tgttttgcca agtacataga gcaaggcaag 120 aggatgatga aacttcataa cttgatggat gaattggaga aagtaattga tgatcctgct 180 gaaaggaacc atgttttgga aggcttactt ggctacatat tatgtactac aatggtatag 240 ctagattcat atgtacttat gatgtcctta tattgtttcc ggaggcatta ttcttaaatc 300 cttctttgat caaatttgta ggaggctgca gttgttcctc cctatattgc cttcgccacg 360 agacagaatc ctggattctg ggaatatgtg aaagtcaatg ctaatgatct ttctgttgag 420 ggtattacag ctacagatta cttgaaattc aaggaaatga tagttgatga aagctggtat 480 agaatacttt gcagcttatc ataccttttg tggttttata atttcaatca gaaaactcat 540 cagagttacc tttgtgtgaa catgacatgc agggcaaaag atgaatatgc actggaaatt 600 gattttggag cagtagactt ctcaacgcct cgactgaccc tatcctcttc aattggaaat 660 ggtctcagtt atgtttccaa gtttctaact tcaaagctaa atgctacctc agcgagtgca 720 cagtgtctgg ttgactactt gctcactttg aatcaccaag gagatgtacg tcaacaaaaa 780 tcaaactcca taagtaaact tgtcaactct aagaagtaaa aataggaaaa gaagattcat 840 gtaacaaatt ttctttatgt tcaactgtag aaactgatga tcaatgagac actcggcact 900 gtctcaaagc ttcaggctgc actggttgta gcagaagcat ctatttcctc cttaccaaca 960 gatacaccat accagagctt tgagctaagg tgatttgttt tttcctctac ttccttccac 1020 ttttggtgtg ctacatagta ctaagtaact tcaattcttg taaagattca aacagtgggg 1080 ttttgagaaa ggatggggtg atacagctga aagggtccgc gacaccatga gaacactttc 1140 tgaggtactt caggcgccag atccattgaa cattgagaag ttctttggga gggttccaac 1200 tgttttcaat attgtattgt tctctgttca tggatacttt ggccaagcaa atgttcttgg 1260 cttgccagac acaggtggtc aggtaagcat ctaatagctt ttacatttaa cttctatgca 1320 ttgacaataa aataacttct acactaccaa ataatttttg aaagtttgac cacttcggct 1380 cttgttcaac aggtggttta tgttttggat caagttgtag cttttgaaga agaaatgctc 1440 caaagaatta aacagcaggg gctcaatatt aagcctcaaa ttcttgtggt gagctcctag 1500 acaatgacgt gactatgcaa ttaagtagag gctgtttaga aaagttaata tcatatgttg 1560 attgcacagt taacccgact gattccggac gccaaaggaa caaagtgcaa ccaggaacta 1620 gaaccaatca agaatacaaa acattcacac atcctcagag ttccatttag gacagaaaaa 1680 ggagtgctta atcaatgggt ttcacgattt gatatctatc catatctgga gagatatact 1740 caggtgtgta tttttatatc aaccctgctc atcaaagatg tgttgtttcc tcaattccat 1800 ttttcgcctt gacaaaagga cgctgctgac aaaatcatcg agctaatgga aggcaaacct 1860 gatctaatca ttggtaacta cactgatggg aatctagtgg cttctctaat ggctagaaag 1920 cttgggataa ctctggtaac ttttcttatc atatttgatg ttgtttcttc tccaagttgg 1980 ttcttaatgt caactaaccc agaccatctt tgtaacaggg aactattgct catgctctgg 2040 agaagacaaa atatgaagac tctgacatca aattgaagga actcgatccg aagtaccact 2100 tttcttgcca attcacagct gatttgattg caatgaattc agcagatttc attatcacaa 2160 gcacatatca agaaatagcc ggaaggtaag aattggaact acggaagcag agagctaata 2220 agtagtgcac tcatatattt cagcatcgct ctttcgcata atcgaataca caccactact 2280 cagtaaatgt acttgctcaa aagtttacaa gtttatggat cttattcttg aatgcttcaa 2340 catatgcagc aaagataggc caggacagta tgagagccat agtgcattta cccttccagg 2400 gctttacaga gttgcttcag gcatcaatgt ctttgatcct aaatttaata ttgctgcacc 2460 tggggcagac caatcggtgt atttccctta cacagaaaag cagacgcgtt tgactgcttt 2520 ccgccctgcc attgaggaac tgctttttag taaagtggac aatgacgagc acatgtaagt 2580 cttagtgtta aacttcagct ttcagcttag tgcctagaac attccactgg ctctatgtat 2640 taatgtttca cttgtttcaa acacagtgga tatttagaag acagaaagaa acctatcctg 2700 tttaccatgg caaggctgga cacagtgaag aacacatctg gactaacaga atggtatggc 2760 aagaacaaga ggctcagaag cttagttaac cttgttgtgg ttggtggttc ctttgatcct 2820 acaaaatcca aggatagaga agaagcagct gaaataaaaa agatgcacat gctgatagag 2880 aaataccagc ttaagggtca gatcagatgg atagcagctc agactgacag atatagaaac 2940 agtgaactct accgcacaat agcagattcc aaaggagctt ttgtgcagcc tgcattatat 3000 gaagcatttg gtctaacagt cattgaggca atgaactgtg gattaccaac ctttgctacc 3060 aaccaaggtg gccctgctga gattattgtt gatggggtct caggctttca tattgatcca 3120 aataatgggg atgaatcaag caacaaagtt gccaactttt tccaaaaatg cagggaggat 3180 cctgagtatt ggaacaggat ttcagtccag ggtctaaacc gtatatatga atggtaactc 3240 acagataagc cattcaaatt gcaaagaggc acatatcttg ctgaaaattt cttaatcctt 3300 taatcctaaa attttgcagt tacacatgga agatctatgc aaacaaggta ttgaatatgg 3360 ggtccatcta tactttttgg aggacattgt acagagatca gaaacaagca aagcaaagat 3420 acatcgagac tttctacaat cttgagttta ggaacttggt atagtgctgc atgacattga 3480 cagtatacca caaacatctt tatgagatga attactttta ataaaattgt ttttaacctt 3540 tgcctcctta atgacactta ttgcaggtaa aaaatgtgcc tatcagacag gacgaaacac 3600 cacaaggacc aaaggagagg agggagaaag ttaagccaca gatatcacaa aggcatgctc 3660 taaagctttt gcctatagtt tttcaggaga ccctagtata ttctagtact aaattagaat 3720 tatacagcat gcagcttgct tctgctgttc acctttctaa atcaccagtt atgtcaatca 3780 agttgacaaa atcaataaat tcggcttttc cctttcctat gcttgattgt tattactcct 3840 acttcgttta tggtagtctt ccttcattgt tttctcctgt acttctttta ctacaactgt 3900 actga 3905 <210> 24 <211> 913 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 24 Met Ala Thr Ala Pro Ala Leu Lys Arg Ser Glu Ser Ile Ala Asp Ser 1 5 10 15 Met Pro Glu Ala Leu Arg Gln Ser Arg Tyr His Met Lys Lys Cys Phe 20 25 30 Ala Lys Tyr Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Met Lys Leu His Asn Leu 35 40 45 Met Asp Glu Leu Glu Lys Val Ile Asp Asp Pro Ala Glu Arg Asn His 50 55 60 Val Leu Glu Gly Leu Leu Gly Tyr Ile Leu Cys Thr Thr Met Glu Ala 65 70 75 80 Ala Val Val Pro Pro Tyr Ile Ala Phe Ala Thr Arg Gln Asn Pro Gly 85 90 95 Phe Trp Glu Tyr Val Lys Val Asn Ala Asn Asp Leu Ser Val Glu Gly 100 105 110 Ile Thr Ala Thr Asp Tyr Leu Lys Phe Lys Glu Met Ile Val Asp Glu 115 120 125 Ser Trp Ala Lys Asp Glu Tyr Ala Leu Glu Ile Asp Phe Gly Ala Val 130 135 140 Asp Phe Ser Thr Pro Arg Leu Thr Leu Ser Ser Ser Ile Gly Asn Gly 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Val Ser Lys Phe Leu Thr Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ser 165 170 175 Ala Ser Ala Gln Cys Leu Val Asp Tyr Leu Leu Thr Leu Asn His Gln 180 185 190 Gly Asp Lys Leu Met Ile Asn Glu Thr Leu Gly Thr Val Ser Lys Leu 195 200 205 Gln Ala Ala Leu Val Val Ala Glu Ala Ser Ile Ser Ser Leu Pro Thr 210 215 220 Asp Thr Pro Tyr Gln Ser Phe Glu Leu Arg Phe Lys Gln Trp Gly Phe 225 230 235 240 Glu Lys Gly Trp Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Arg Asp Thr Met Arg 245 250 255 Thr Leu Ser Glu Val Leu Gln Ala Pro Asp Pro Leu Asn Ile Glu Lys 260 265 270 Phe Phe Gly Arg Val Pro Thr Val Phe Asn Ile Val Leu Phe Ser Val 275 280 285 His Gly Tyr Phe Gly Gln Ala Asn Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr Gly 290 295 300 Gly Gln Val Val Tyr Val Leu Asp Gln Val Val Ala Phe Glu Glu Glu 305 310 315 320 Met Leu Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Gln Ile 325 330 335 Leu Val Leu Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala Lys Gly Thr Lys Cys Asn 340 345 350 Gln Glu Leu Glu Pro Ile Lys Asn Thr Lys His Ser His Ile Leu Arg 355 360 365 Val Pro Phe Arg Thr Glu Lys Gly Val Leu Asn Gln Trp Val Ser Arg 370 375 380 Phe Asp Ile Tyr Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Thr Gln Asp Ala Ala Asp 385 390 395 400 Lys Ile Ile Glu Leu Met Glu Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn 405 410 415 Tyr Thr Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Met Ala Arg Lys Leu Gly 420 425 430 Ile Thr Leu Gly Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Glu 435 440 445 Asp Ser Asp Ile Lys Leu Lys Glu Leu Asp Pro Lys Tyr His Phe Ser 450 455 460 Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ser Ala Asp Phe Ile 465 470 475 480 Ile Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Arg Pro Gly 485 490 495 Gln Tyr Glu Ser His Ser Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val 500 505 510 Ala Ser Gly Ile Asn Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Ala Ala Pro 515 520 525 Gly Ala Asp Gln Ser Val Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Lys Gln Thr Arg 530 535 540 Leu Thr Ala Phe Arg Pro Ala Ile Glu Glu Leu Leu Phe Ser Lys Val 545 550 555 560 Asp Asn Asp Glu His Ile Gly Tyr Leu Glu Asp Arg Lys Lys Pro Ile 565 570 575 Leu Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Thr Val Lys Asn Thr Ser Gly Leu 580 585 590 Thr Glu Trp Tyr Gly Lys Asn Lys Arg Leu Arg Ser Leu Val Asn Leu 595 600 605 Val Val Val Gly Gly Ser Phe Asp Pro Thr Lys Ser Lys Asp Arg Glu 610 615 620 Glu Ala Ala Glu Ile Lys Lys Met His Met Leu Ile Glu Lys Tyr Gln 625 630 635 640 Leu Lys Gly Gln Ile Arg Trp Ile Ala Ala Gln Thr Asp Arg Tyr Arg 645 650 655 Asn Ser Glu Leu Tyr Arg Thr Ile Ala Asp Ser Lys Gly Ala Phe Val 660 665 670 Gln Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met 675 680 685 Asn Cys Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Asn Gln Gly Gly Pro Ala Glu 690 695 700 Ile Ile Val Asp Gly Val Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn Asn Gly 705 710 715 720 Asp Glu Ser Ser Asn Lys Val Ala Asn Phe Phe Gln Lys Cys Arg Glu 725 730 735 Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Arg Ile Ser Val Gln Gly Leu Asn Arg Ile 740 745 750 Tyr Glu Cys Tyr Thr Trp Lys Ile Tyr Ala Asn Lys Val Leu Asn Met 755 760 765 Gly Ser Ile Tyr Thr Phe Trp Arg Thr Leu Tyr Arg Asp Gln Lys Gln 770 775 780 Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Glu Thr Phe Tyr Asn Leu Glu Phe Arg Asn 785 790 795 800 Leu Val Lys Asn Val Pro Ile Arg Gln Asp Glu Thr Pro Gln Gly Pro 805 810 815 Lys Glu Arg Arg Glu Lys Val Lys Pro Gln Ile Ser Gln Arg His Ala 820 825 830 Leu Lys Leu Leu Pro Ile Val Phe Gln Glu Thr Leu Val Tyr Ser Ser 835 840 845 Thr Lys Leu Glu Leu Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Ala Val His Leu 850 855 860 Ser Lys Ser Pro Val Met Ser Ile Lys Leu Thr Lys Ser Ile Asn Ser 865 870 875 880 Ala Phe Pro Phe Pro Met Leu Asp Cys Tyr Tyr Ser Tyr Phe Val Tyr 885 890 895 Gly Ser Leu Pro Ser Leu Phe Ser Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu 900 905 910 Tyr

Claims (13)

  1. 식물 세포로서,
    (i) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드;
    (ii) (i)에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드;
    (iii) 서열번호 2와 적어도 94% 서열 동일성; 또는 서열번호 4와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 6과 적어도 95% 서열 동일성; 또는 서열번호 8과 적어도 96% 서열 동일성; 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 14와 적어도 95% 서열 동일성; 또는 서열번호 16과 적어도 96% 서열 동일성; 또는 서열번호 18과 적어도 89% 서열 동일성; 또는 서열번호 20과 적어도 92% 서열 동일성; 또는 서열번호 22와 적어도 93% 서열 동일성; 또는 서열번호 24와 적어도 94% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드; 또는
    (iv) (i)에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터;를 포함하고,
    상기 식물 세포는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 또는 활성이 변형되지 않은 대조군 식물 세포와 비교하여 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 조절하는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 식물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물 세포는 서열번호 5 또는 서열번호 13과 적어도 80% 서열 동일성 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 또는
    상기 식물 세포는 서열번호 6과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12와 적어도 93% 서열 동일성 또는 서열번호 14와 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드를 포함하는, 식물 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 상기 식물 세포의 게놈의 변형, 또는 상기 작제물, 벡터 또는 발현 벡터의 변형, 또는 유전자이식 변형이고; 바람직하게는,
    상기 식물 세포의 게놈의 변형, 또는 상기 작제물, 벡터 또는 발현 벡터의 변형은 돌연변이 또는 편집인, 식물 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 대조군 식물 세포와 비교하여 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 증가시키거나 감소시키고; 바람직하게는,
    상기 식물 세포는 제1항 (i)의 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA의 적어도 19개의 뉴클레오타이드와 적어도 80% 상보적인 서열을 포함하는 간섭 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 조절된 발현 또는 활성은 대조군 식물로부터 유래된 잎 내의 환원당의 수준과 비교하여 상기 식물 세포로부터 유래된 잎 내의 환원당의 수준을 조절하고, 적절하게는 상기 환원당은 글루코오스 또는 프룩토오스거나 적절하게는, 상기 잎은 경화 초기 또는 경화된 잎인, 식물 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 식물 세포를 포함하는 식물 또는 그의 일부.
  7. 제6항의 식물 또는 그의 일부로부터 유래된, 식물 물질, 경화된 식물 물질, 또는 균질화 식물 물질로서; 바람직하게는,
    상기 물질은 제6항의 식물 또는 그의 일부로부터의 바이오매스, 종자, 줄기, 꽃 또는 잎을 포함하고; 그리고/또는
    상기 경화된 식물 물질은 열건, 양건 또는 음건된 식물 물질인, 식물 물질, 경화된 식물 물질, 또는 균질화 식물 물질.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 식물 세포, 제6항의 식물의 일부 또는 제7항에 따른 식물 물질을 포함하는 담배 제품.
  9. 제6항의 식물을 생산하기 위한 방법으로서,
    (a) 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물 세포를 제공하는 단계;
    (b) 상기 식물 세포를 변형시켜서 대조군 식물 세포와 비교하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 단계; 및
    (c) 상기 식물 세포를 식물 내로 번식시키는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (c)는 상기 식물 세포를 포함하는 삽목 또는 묘목으로부터 상기 식물을 재배하는 단계를 포함하고; 및/또는
    상기 식물 세포를 변형시키는 단계는 게놈 편집 또는 게놈 조작에 의해 상기 세포의 게놈을 변형시키는 것을 포함하고; 바람직하게는,
    상기 게놈 편집 또는 게놈 조작은 CRISPR/Cas 기술, 아연 핑거 뉴클레아제-매개 돌연변이유발, 화학적 또는 방사선 돌연변이유발, 상동성 재조합, 올리고뉴클레오타이드-특이적 돌연변이유발 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이유발로부터 선택되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 식물 세포를 변형시키는 단계는 구성적 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23과 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 서열; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물로 상기 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하고; 및/또는
    상기 식물 세포를 변형시키는 단계는 제1항 (i)의 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA와 적어도 80% 상보적인 서열을 포함하는 간섭 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고; 바람직하게는,
    상기 식물 세포는 제1항 (i)의 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 RNA의 적어도 19개의 뉴클레오타이드와 적어도 80% 상보적인 서열을 포함하는 간섭 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 작제물로 형질감염되는, 방법.
  12. 대조군 식물 물질에 비해 환원당의 변경된 양을 갖는 경화된 식물 물질을 생산하기 위한 방법으로서,
    (a) 제6항에 따른 식물 또는 그의 일부 또는 제7항에 따른 식물 물질을 제공하는 단계;
    (b) 상기 식물 물질을 수확하는 단계; 및
    (c) 상기 식물 물질을 경화시키는 단계;를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식물 물질은 경화된 잎, 경화된 줄기 또는 경화된 꽃, 또는 이들의 혼합물을 포함하고; 및/또는
    상기 경화 방법은 음건, 화건, 훈연 경화 및 열건으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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